laboratoriji
Validacija analitičkih
metoda – osnovna načela
Katica Lazarić
Validacija analitičkih metoda po-
stupak je kojim dokazujemo da na-
ša metoda služi svrsi, a zahtijeva je
i regulativa i analitička profesija.
Validirane metode u najvećoj će
mjeri osigurati pouzdanost i toč-
nost analitičkih podataka.
A nalitičke metode trebaju biti validirane kako bi se osigurala pouzdanost
i točnost analitičkih podataka. Tako kaže »regulativa koja to i zahtijeva«
zadnjih dvadesetak godina. Slažu se i analitičari koji su temeljna načela vali-
dacije metoda primjenjivali i puno prije pojave regulative jer je to jednostav-
no sastavni dio struke. U međuvremenu objavljeno je puno radova, članaka,
osvrta, provedeno bezbroj različitih eksperimenata. U nekim su laboratoriji-
ma validacije metoda postale rutina, dok se u drugima one tek počinju pro-
voditi. U ovome će članku biti predstavljene osnovne postavke za validaciju
analitičkih metoda nužne analitičarima koji počinju, ali i koristan podsjetnik
za one koji su već ušli u rutinu validacija analitičkih metoda.
Osnovna načela validacije
analitičkih metoda
Što je to validacija analitičkih metoda? Najjednostavnija definicija kaže da je
to postupak kojim dokazujemo da naša metoda služi svrsi koju smo joj
namijenili, a najjednostavnija logika kaže da je prije svega uistinu potrebno
znati/definirati svrhu metode. Nakon toga se, po struci i logici posla, utvrđu-
ju postupci, tj. planiraju i provode eksperimenti čije rezultate treba prikupiti
i prikazati kao dokaze o validnosti metode. Sigurno je da se isti postupci ne-
će primjenjivati na sve metode – različito se pristupa validaciji kvalitativnih i
kvantitativnih metoda; razlikuju se postupci validacije metode kojom se odre-
đuje analit koji preteže u uzorku i one kojom se određuju tragovi u komplek-
snoj matrici. Svakoj se metodi pristupa individualno, procjenjuje se što treba
napraviti za dokaz svrhovitosti. I struka i regulativa i zakonodavstvo prihva-
tili su osam osnovnih parametara, tj. izvedbenih značajki validacije:
• specifičnost /selektivnost
• linearnost
• područje
• preciznost
– ponovljivost, eng. repeatability
– međupreciznost (eng. intermediate precision)
– obnovljivost (eng. reproducibility)
• istinitost (eng. trueness)
• granica kvantifikacije
• granica detekcije
• postojanost.
Kombinacijom tih parametara oblikuje se plan validacije za svaku metodu.
Specifičnost /selektivnost svojstvo je metode da točno i specifično odredi
željeni analit u prisutnosti ostalih komponenata u matrici uzorka pod
utvrđenim uvjetima ispitivanja. Iako se u praksi često poistovjećuju, speci-
fičnost i selektivnost dva su različita svojstva metode. Specifična metoda je
ona kojom se može odrediti samo jedan specifični analit. Metoda kojom se
može određivati više komponenata istodobno, ali pod uvjetom da te kompo-
nente pri određivanju ne smetaju jedna drugoj, naziva se selektivnom.
61
 Selektivnost je nezaobilazan parametar za validaciju većine
metoda. U praksi se dokazuje usporedbom odziva metode na
referencijski materijal i analit u uzorku. Kod kromatografskih
laboratoriji
metoda, osim usporedbe kromatograma referencijskog ma-
terijala i uzorka, potrebno je dokumentirati i parametre koji
određuju razdvojenost i simetriju pikova, a kod određenih
metoda i prikupiti dokaze o čistoći pikova.
Linearnost je određena kao mogućnost metode da unutar
određenog područja daje ispitne rezultate proporcionalne
koncentraciji analita u uzorku.
U praksi se linearnost određuje mjerenjem odziva metode na
različite poznate koncentracije referencijskog materijala (pre-
poručuje se najmanje pet koncentracijskih razina uz tri ponav-
ljanja). Procjenjuje se matematički i grafički. Matematički se
preko linearne regresije izrazi jednadžba pravca (y = ax + b) i
izračuna koeficijent korelacije (k). Nagib pravca (a) parametar
je koji izravno ukazuje na osjetljivost metode. Odsječak pravca
(b) može ukazivati na sustavnu pogrešku. Za koeficijent kore-
lacije uobičajeno se postavlja kriterij k ≥ 0,99. Za vrlo niske
koncentracije prihvaća se i kriterij k ≥ 0,98. Grafički prikazi
ovisnosti signala o koncentraciji analita važni su zbog moguć-
nosti vizualnog nadzora. Najčešće se upotrebljavaju dva načina
grafičkog prikaza:
• Grafički prikaz odstupanja od regresijskog pravca pre-
ma koncentraciji ili logaritmu koncentracije – za line-
arna područja odstupanja jednoliko raspoređena izme-
đu pozitivnih i negativnih vrijednosti (slika 1a).
• Grafički prikaz relativnih signala (omjer signala i odgo-
varajuće koncentracije) na osi y i odgovarajućih kon-
centracija na osi x log skale. Dobivena linija treba biti
vodoravna u cijelome linearnom području, a područje
linearnosti prestaje pri koncentracijama gdje linija re-
lativnog odziva siječe paralelne linije koje odgovaraju
95 postotnoj ili 105 postotnoj koncentraciji (slika 1b).
Područje je raspon između gornje i donje koncentracijske
granice analita (granice su uključene) u uzorku koje se
mogu kvantificirati uz odgovarajuću preciznost, istinitost
i linearnost. Za određivanje tog parametra nije potrebno
provoditi zasebne eksperimente, nego se zaključci izvode iz
studije linearnosti.
U puno slučajeva područje je određeno svrhom metode i ne-
ma potrebe za ispitivanjem krajnjih mogućnosti metode. Na-
protiv, sužavanjem područja na koncentracijski raspon uzo-
raka postižu se bolja točnost i preciznost metode. Međutim,
detektora / koncentracija
Odziv detektora
Odziv
Koncentracija
Slika 1. Dva načina grafičkog prikaza linearnosti
62
kad se očekuju uzorci sa širokim rasponom koncentracija,
isplati se definirati maksimalno područje metode.
Preciznost se određuje kao izraz slaganja između niza mje-
renja izvedenih iz istog homogenog uzorka pod propisa-
nim uvjetima. Ovisno o uvjetima u kojima se određuje ra-
zlikujemo:
• preciznost pod uvjetima ponovljivosti ili ponovljivost –
pri čemu uvjeti uključuju jedan laboratorij, istog ana-
litičara, istu aparaturu, kratko razdoblje.
• međupreciznost – preciznost koja se ostvaruje unutar
istog laboratorija u duljem razdoblju uz očekivane
promjene nekih uvjeta (različiti analitičari, instru-
menti, kolonereagensi iz različitih boca i različitih do-
bavljača).
Preciznost pod uvjetima obnovljivosti ili obnovljivost – promjen-
ljivi uvjeti uključuju različite laboratorije. Taj se parametar
određuje u svrhu normiranja metode i rijetko je sastavni dio
validacije koju provodi sâm laboratorij. Eksperimentima pre-
ciznosti kvantificiraju se slučajne pogreške metode, a nume-
rički je pokazatelj standardna devijacija, koeficijent varijacije
ili varijanca. Kod eksperimenata međupreciznosti iznimno je
važno mjerenja koja se ponavljaju provoditi u uvjetima koji
su što sličniji onima pri rutinskoj uporabi metode. U slučaju
rezultata koji ne zadovoljavaju treba otkriti najvažniji izvor
pogreške i pokušati ga ukloniti.
Važno je naglasiti da se eksperimenti preciznosti rade na ho-
mogenom autentičnom uzorku, odnosno umjetno pripre-
mljenom uzorku, a postupak se ponavlja prema propisu u
metodi upravo onako kako će se ubuduće raditi u praksi. Broj
ponavljanja treba zadovoljiti zahtjeve statistike. Najčešće se
radi po tri ponavljanja na nekoliko koncentracijskih razina
koji se, naravno, poklapaju s područjem linearnosti. Kriteri-
ji prihvatljivosti ovise o vrsti analize, matrici uzorka i koncen-
traciji analita koji se određuje.
Istinitost metode definira se kao stupanj podudaranja iz-
među stvarne, tj. prihvaćene referencijske vrijednosti, i
srednje vrijednosti dobivene primijenjenim postupkom
određeni broj puta. Numerički pokazatelj istinitosti ekspe-
rimentalno je utvrđeno sustavno odstupanje (eng. bias) me-
tode, dobiven je kao razlika aritmetičke sredine rezultata i
referencijske vrijednosti ili kao njihov odnos, što se posebno
primjenjuje kod određivanja iskorištenja. Eksperimenti se
provode nakon određivanja selektivnosti, linearnosti i preci-
znosti, najmanje tri puta za najmanje tri koncentracijske ra-
Logaritam
zine raspoređene unutar radnog područja metode. Raspon
koncentracija treba odgovarati stvarnom uzorku, ali treba
uključiti i koncentraciju na granici kvantifikacije (GK) kada
je ona bitna.
Istinitost metode moguće je procijeniti na nekoliko načina:
• usporedbom rezultata ispitivane metode s rezultatima
dobivenim uhodanom referencijskom metodom
• analizom uzorka poznate koncentracije, npr. certifici-
ranoga referencijskog materijala i usporedbom izmje-
renih rezultata i certificiranih vrijednosti
• cijepljenjem matrice ili uzorka poznatom koncentra-
cijom referencijskog materijala.
Rezultati se mogu prikazati grafički kao odnos teorijske (oče-
kivane) vrijednosti prema izmjerenoj koncentraciji, ali obve-
zatno kao srednje iskorištenje. Relativna standardna devija-
cija i ovdje može poslužiti kao pokazatelj preciznosti.
Nekoliko praktičnih napomena povezanih s istinitošću:
• matrica ili uzorak cijepe se dodavanjem (uvagivanjem)
referencijskog materijala na samom početku postupka
tako da cijepljeni uzorak bude podvrgnut cjeloku-
pnom postupku od pripreme uzorka do mjerenja
• iskorištenje ovisi o matrici uzorka, postupku uzorko-
vanja i koncentraciji analita
• kod kromatografskog određivanja više komponenta
treba odrediti »čimbenike odziva« za svaku kompo-
nentu ako se sve određuju preko istoga referencijskog
materijala
Granica detekcije/kvantifikacije najmanja je količina ana-
lita u uzorku koja se može detektirati/kvantificirati uz od-
govarajuću preciznost i točnost. Određuje se razrjeđivanjem
osnovne otopine.
Procjena može biti vizualna, s pomoću omjera signal/šum ili
statistička. Vizualna se procjena može primijeniti i kod nein-
strumentnih i instrumentnih metoda, uglavnom samo za gra-
nicu detekcije, a procjenjuje se najmanji signal koji se ned-
vojbeno može prepoznati. Omjer signal/šum može se
primijeniti samo na analitičke postupke s baznom linijom, a
prihvatljivi su omjeri 3 : 1 za granicu detekcije i 10 : 1 za gra-
nicu kvantifikacije. Statistički se granice detekcije i kvantifi-
kacije mogu odrediti na bazi standardne devijacije signala i
nagiba prema jednadžbama: GD = 3.3 σ/a, odnosno Kg = 10
s/a pri čemu je a nagib, a s standardna devijacija regresijskog
pravca.
NEPRECIZNO I PRECIZNO ALI PRECIZNO I
NETOČNO NETOČNO TOČNO
Slika 2. Prikaz preciznosti i istinitosti
Ako se zahtijeva da metoda ima zadanu preciznost na grani-
ci kvantifikacije, pripremi se više uzoraka poznate koncentra-
cije u području oko moguće granice kvantifikacije, svaki se
laboratoriji
izmjeri 5–6 puta i izračunaju se relativne standardne devija-
cije za svaku koncentraciju. Zatim se grafički prikaže odnos
RSD-a prema koncentraciji i iz grafa odredi koncentracija na
granici kvantifikacije s točno određenom preciznošću kako
se vidi na 3. slici. U praksi se obično pripremi uzorak tako
određene koncentracije i potvrdi preciznost višekratnim mje-
renjem.
Parametar granice kvantifikacije iznimno je važan kod meto-
da kojima se određuju analiti u tragovima koji i u vrlo niskim
koncentracijama mogu štetno djelovati na zdravlje ljudi i
okoliš.
Slika 3. Određivanje granice kvantifikacije sa zadanom preciznošću
Robusnost se određuje kao mjera otpornosti analitičkog
postupka na male, namjerne promjene radnih uvjeta me-
tode.
Ispitivanje robusnosti provodi se kako bi se odredilo kako
male promjene radnih uvjeta i provedbe metode utječu na
rezultat analize. Važan su dio razvoja metode jer pomažu ot-
kriti optimalne uvjete izvedbe metode te upućuju na to što
treba nadzirati. Tijekom eksperimenta mijenjaju se radni
uvjeti unutar stvarnih granica i prati kvantitativna promjena
rezultata. Na primjer kod tekućinske kromatografije ispituju
se utjecaji sastava i pH mobilne faze, temperature, protoka te
različite šarže ili dobavljači kolona. Stabilnost otopine tako-
đer je tipičan parametar ispitivanja robusnosti metode. Ako
promjena nekog radnog uvjeta ne utječe bitno na rezultat,
kaže se da je on u području robusnosti metode. Uvjete za ko-
je je utvrđeno da utječu na rezultat treba držati pod nadzo-
rom i to jasno naznačiti u opisu metode. Primjeri utjecaja
promjene parametara temperature kolone i pH mobilne faze
prikazani su na 4. slici.
Prema podacima o robusnosti postavljaju se parametri za is-
pitivanje prikladnosti sustava.
Pri provedbi validacije nije potrebno za svaku metodu odre-
diti sve parametre. Njihov odabir ovisi o namjeni metode,
kako što je to prikazano u 1. tablici.
Razumijevanje značenja pojedinih parametara i načina na
koji se izvode u laboratoriju, poznavanje značajka metode i
regulatornih zahtjeva osnova su za postavljanje kriterija pri-
63
 Tablica 1. Validacijski parametri potrebni za validaciju analitičkih me-
toda različitih namjena

Analiza tragova
laboratoriji

Identifikacijski
Sadržaj
testovi kvantitativna Limit Test
istinitost ne da ne da
preciznost
ponovljivost ne da ne da
međupreciznost ne da ne da
selektivnost da da da da
GD ne ne da ne
GK ne da ne ne
linearnost ne da ne da
područje ne da ne da
Prema: ICH Harmonised Tripartite Guideline – Validation Of Anal-
4. slika Postojanost metode – utjecaj ytical Procedures: Text And Methodology Q2(R1)
temperature kolone i pH mobilne faze

hvatljivosti za svaki parametar, što je također neizostavni dio

validacije. Postavljeni kriteriji uspoređuju se s dobivenim re-
zultatima eksperimenata, a zadnji je korak validacije pisanje
izvješća s jasno naznačenim zaključkom o potvrdi da metoda
odgovara namijenjenoj svrsi.
Zaključak
Validacijom analitičke metode dobit će se obavijesti o nje-
zinoj točnosti i preciznosti, o odnosu između koncentracije
uzorka i odziva metode, o mogućim interferencijama iz ma-
trice uzorka, o najmanjim koncentracijama koje će se moći
utvrditi ili kvantificirati tom metodom i doznat će se njezi-
ne najslabije, ali i najjače strane. Validacija analitičkih me-
toda je regulatorni zahtjev kao i profesionalna odgovornost
analitičara. Vrijeme i novac uloženi u validaciju investicija
su koja će se višestruko isplatiti tijekom korištenja metode
pružajući sigurnost analitičarima i vjerodostojnost njihovim
rezultatima.

Literatura
[1] The European Community Guidelines: CPMP – Committee for Proprietary Medicinal Products (http://
www.eudra.org)
[2] USA Guidelines: US Food and Drug Administration (http://www.fda.gov)
[3] USP (http://www.usp.org)
[4] cGMP (http://www.cgmp.com)
[5] International Committee for Harmonisation (http://www.ich.org) ICH – Guidance for Industry Q2(R1) –
Validation of Analytical Procedures – Methodology
[6] Eurachem (http://www.vtt.fr/ket/eurachem) The Fitness for Purpose of Analytical Methods
[7] AOAC How to Meet ISO 17025 Requirements for Method Verification Prepared by AOAC INTERNATI-
ONAL 481 N. Frederick Ave, Suite 5002007
[8] IUPAC Technical Report: Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis,
Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835‫855, 2002
[9] NATA: Technical Note #17 – Guidelines for the Validation and Verification of Chemical Test Methods, April
2009

64