VI NấM

HọC Mục tiêu:

1. Nêu các đặc điểm của vi nấm;
2. Mô tả hình thể vi nấm;
3. Trình bày cấu trúc tế bào vi nấm
4. Phân loại vi nấm: hình thể, bệnh học,…
5. Trình bày lợi ích và tác hại của vi nấm
6. Tóm tắt các kỹ thuật áp dụng trong phát
hiện, định danh vi nấm.
1
7. Tóm tắt các kỹ thuật ứng dụng trong thử
hoạt tính kháng nấm
VỊ TRÍ CỦA VI NẤM / HT PHÂN LOẠI

Vi nấm được xếp vào:

1. Ngành Thực vật
Không có chlorophyll
Không biệt hoá thành thân, lá, rễ
2. Ngành Nấm (Mycota):
Gồm hơn 100.000 loài
Khoảng 300 loài gây bệnh cho người
Hơn ¾ vi nấm gây bệnh gây nhiễm chủ yếu ở
2
da và mô dưới da.
ĐặC ĐIểM CủA VI NấM

 Eukaryote: Vi sinh vật có nhân thật, nhân có

màng nhân, Nhiễm sắc thể đơn bội hoặc
lưỡng bội.
 Không có diệp lục tố, dị dưỡng
 Thành tế bào chứa chitin và chitosan
 Sinh sản vô tính lẫn hữu tính
 Sterol ở màng sinh tế bào chất: Ergosterol
3
HÌNH THể

 Nấm sợi: nấm mốc (filamentous fungi/mould)

 Sợi nấm (hyphae) hệ sợi (mycelium)
 Sinh sản bằng bào tử (BT vô tính, BT hữu tính)
 Phát triển ở đầu sợi nấm.
o Nấm men: yeast
 Sinh sản bằng cách nẩy chồi
 SS bằng cắt đôi
4
 Nấm lưỡng hình: sợi men
Khóm nấm mốc (mould) Khóm nấm men (yeast)

Penicillium sp Saccharomyces cerevisiae

CấU TRÚC Tế BÀO NấM SợI
 Đa bào, các tế bào nối
nhau dài như sợi chỉ, sợi
nấm nhỏ, mảnh, phân
nhánh.
 Tế bào nấm hình trụ,
đường kính sợi nấm: 2 –
18 µm, có thành tế bào
bao quanh;
 Giữa các tế bào Có vách
ngăn (septate) hoặc
không có vách ngăn
(coenocytic)
6
 Mỗi tế bào có từ 1 đến 2
nhân.
CấU TRÚC Tế BÀO NấM SợI
Gồm các thành phần sau:
• Thành tế bào (g)
• Màng tế bào (i)
Tế bào chất:
a. Không bào, b. Nhân,
c. Bộ golgi,
d. Lưới nôi sinh chất ,
e. Ti thể, f. Hạt lipid,
7
h. Thể woronin.
CấU TRÚC Tế BÀO NấM MEN

 Đơn bào;
 Một số nấm men lưỡng hình, tạo thành sợi
hoặc sợi giả do ảnh hưởng của môi trường
(nhiệt độ)
 Mỗi tế bào có 1 nhân, nhiều cơ quan;
 Không bào lớn;
 Sinh sản bằng cách nẩy chồi ở một cực hay
8
nhiều cực.
 Cấu trúc tế bào nấm men

Thành tế bào (11):

Màng tế bào chất (10):
- ergosterol và zymosterol.
Tế bào chất:
nhân (1),
nhiễm sắc chất (3) ,
ti thể (5),
lưới nội sinh chất (6) ,
bộ Golgi (7), không bào (8), 9

hạt lipid (9).

 THÀNH Tế BÀO VI NấM (CELL
WALL)
Chiếm khoảng 15-30% trọng lượng khô TB nấm.
Cấu tạo bởi một số chất :
+ Carbohydrat: chiếm khoảng 80%.
Các polysaccharid: chitin, chitosan, cellulose,
β glucan, α glucan và mannan.
+ Protein và glycoprotein: chiếm khoảng 10%
Protein giàu sulfur
Enzym: (1,3)-β-D-glucan synthase (GS)
10
chitin synthase…
NHÂN

 Chứa hệ gen của tế bào eukaryote;

 ADN nucleosome chromosome
 Màng nhân có các lỗ để chuyên chở protein và
acid nucleic vào nhân;
 Protein ribosom được STH ở TB chất và được
chuyên chở vào nhân kết hợp với ARN
ribosome tạo thành tiểu đơn vị lớn và TĐV nhỏ.
11
PHÂN BIệT NấM SợI VÀ NấM MEN
Đặc điểm Nấm sợi Nấm men
Kích thước tế bào 5-30 µm ≈4 µm
Hình thức phát triển Hệ sợi nấm Nẩy chồi
Thành phần thành TB Chitin, glucan Chitin, glucan
Bào tử Có màu Phần lớn không màu
protein 10% 6%
glucosamin 28% 33%
Nhân Phần lớn đơn bội Đơn bội/lưỡng bội
12
SINH SảN ở VI NấM

 Sinh sản vô tính

- Nấm men: nẩy chồi

- Nấm sợi: bào tử

 Sinh sản hữu tính

Bào tử hữu tính đóng vai trò để nấm sống sót

hay ở dạng ngủ

13
SINH SảN ở NấM MEN

14
SINH SảN VÔ TÍNH ở NấM SợI

15
SINH SảN HữU TÍNH ở NấM SợI

16
 PHÂN LOẠI VI NẤM
 Theo hình thể:
» Nấm men
» Nấm sợi
» Nấm lưỡng hình
 Theo bệnh nhiễm gồm 4 nhóm lớn:
 Bệnh nhiễm nấm ngoại biên (the superficial fungal
infection)
 Bệnh nhiễm nấm cố định dưới da (cutaneous mycoses):
 Bệnh nhiễm nấm nội tạng (systemic mycoses)
17
 Bệnh nấm cơ hội (opportunistic mycoses)
THEO CÁCH SINH SảN
 Zygomycota: sợi tơ nấm thông suốt; sinh sản bằng trứng
(Mucor, Rhizopus,…)

 Nấm túi (Ascomycota): sợi nấm có vách ngăn, sinh sản bằng
túi (Neurospora, Saccharomyces,..)

 Nấm đảm (Basidiomycota): sợi nấm có vách ngăn

sinh sản bằng đảm

 Nấm khuyết (Deuteromycota): Không có bộ phận SS hữu

tính (Alternaria, Aspergillus, Cladosporium,
Geotrichum, Penicillium, Fusarium, Trichoderma,… 18
LợI ÍCH DO VI NấM MANG LạI CHO
NGƯờI

o Chuyển hóa sinh học: bánh mì, rượu, bia, bán

TH Steroid
o Cho các chất biến dưỡng
o Enzym vi nấm: sản xuất phô mai, kỹ nghệ
enzym
o Sinh khối: probiotic từ nấm men
Saccharomyces boulardii
o Đấu tranh sinh học: diệt côn trùng, diệt giun
sán
o Nông nghiệp, lâm nghiệp: hệ nấm cộng sinh ở 19
rễ cây
SảN XUấT NHữNG CHấT BIếN DƯỡNG
CÓ LợI

• Acid hữu cơ
• Kháng sinh
• Enzym
• Vitamin
• Alcohol
• Alkaloid

20
ACID HữU CƠ Từ VI NấM
Acid hữu cơ Vi nấm sản xuất

Acid gallic Penicillium glaucum

A. citric Aspergillus niger

A. gluconic A. niger, Penicillium

perfurogenum

A. oxalic A. niger, Sclerotenium sp.

A. fumaric Mucor spp., Rhizopus spp.

A. lactic Rhizopus oryzae 21

KHÁNG SINH DO VI NấM SảN XUấT
Kháng sinh Vi nấm sản xuất

Penicillin Penicillium chrysofulvum

Griseofulvin P. griseofulvum

Cephalosporin Achrimonium spp.

Acid fuschidic Fuschidium coccinium

Mucor ramanneanus

22
CÁC CHấT KHÁC DÙNG TRONG TRị LIệU
Chất dùng trị Vi nấm sản xuất Tác dụng
liệu
Cyclosporin Tolypocladium inflatum ức chế miễn dịch
Aspergillus spp.
Lovastatin Aspergillus terreus ức chế STH
cholesterol
Pravastatin Penicillium citrinum ức chế STH
cholesterol
Vitamin B12, Saccharomyces
vitamin khác cerevisiae
S. cerevisiae, Ashbya
Hallucinogen Psylocybe Điều hòa sinh nở 23
steroid Rhizopus spp.
ENZYM
 Enzym từ nấm được sản xuất và sử dụng cho
nhiều mục đích khác nhau: thực phẩm, chất
tẩy, vải sợi, len dạ, giấy/bột giấy, khác,…
 Một số enzym chính nguồn gốc từ nấm

Enzym Vi nấm

Cellulase Trichoderma koninji

Proteinase Aspergillus niger, A. oryzae,

A. flavus, A. sojae

Glucoamylase A. niger, A. oryzae 24

……
ứNG DụNG MớI Từ NấM
Sử dụng nấm làm vật chủ biểu hiện cho các
protein trị liệu:
Ưu điểm:
 So với E. coli: Có hệ lưới nội mô và bộ golgi để
glycosyl hóa protein.
 So với eukaryote khác (nuôi cấy tế bào): Có
thể nuôi cấy và duy trì dễ dàng trên các môi
trường rẻ tiền.
Nhược điểm:
 Các enzym glycozyl hóa ở nấm không có ở
người , làm thay đổi thời gian bán hủy và tính 25
sinh miễn dịch của protein
MộT Số PROTEIN TÁI Tổ HợP Từ NấM
Đã có hơn 120 protein tái tổ hợp của ĐVCV được
biểu hiện bởi nấm men:
 Từ Saccharomyces cerevisiae : insulin, kháng thể
bề mặt của virut Hepatitis B, urat oxidase,
glucagon,…
 Từ Pichia pastoris (nấm men sử dụng được các hợp
chất 1C như methanol, methan-methylotrophic
yeast): angiostatin, endostatin, Elastabe, yếu tố 1
giống insulin,…
Bởi nấm sợi:
 Sản xuất protein tái tổ hợp: A. niger, A. nidulans,
Trichoderma reesi
 Sản xuất kháng thể: A. niger 26
MộT Số TÁC HạI CủA VI NấM
• Gây hư hoại: thực phẩm, thuốc, mỹ phẩm,
vật dụng,…
• Gây bệnh cây trồng
• gây bệnh cho thú

• Gây bệnh cho người

27
Sự NHIễM NấM ở CÁC SảN PHẩM
THUốC, Mỹ PHẩM,…
Thuốc & mỹ phẩm nhiễm nấm:
 Là lý do của các sản phẩm bị thu hồi;

 Làm hư hỏng sản phẩm;

 Ảnh hưởng đến sản xuất.

Tác hại:
 Giảm thời gian lưu trữ thuốc

 Ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân

Nguyên nhân:
 Thiếu kiểm soát

 Các test kiểm soát không thích hợp

28
Sự NHIễM NấM ở CÁC DƯợC PHẩM

 Gây hư hỏng thuốc

 Gây biến đổi hoạt tính của thuốc

+ ảnh hưởng đến hoạt chất của thuốc: sinh

chất biến dưỡng lạ.

+ thay đổi về cảm quan

 ảnh hưởng sức khỏe bệnh nhân: mức độ ảnh
hưởng tùy bệnh nhân, tùy sản phẩm, tùy loài
29
nấm nhiễm, tùy sức đề kháng của bệnh nhân.
NGUồN NHIễM NấM CHO CÁC SảN
PHẩM THUốC

 Vật dụng trong phòng pha chế: túi, hộp, thiết

bị, bánh xe,…
 Nguyên liệu dùng trong pha chế
 Người : vẩy da, tóc,…
 Phải tuân thủ các qui định về phòng sạch
trong pha chế (bụi, VSV, hóa chất, ẩm):
- Không khí: lọc HEPA, ULPA
- Bề mặt: Sử dụng các chất diệt trùng
30
- Hệ thống chống ẩm
CHọN CHấT SÁT TRÙNG

Tác động của các chất sát trùng trên vi nấm:

 Thay đổi tùy loại nấm (nấm men và nấm sợi)
 Tế bào nấm và bào tử nấm đề kháng với chất sát
trùng hơn vi khuẩn, ít đề kháng hơn bào tử vi khuẩn.
 Vi nấm có sự đề kháng tự nhiên với chất sát trùng:

+ Có hàng rào ngăn một số chất diệt trùng thấm

qua TB nấm.
+ Sản xuất enzym bất hoạt chất sát trùng
Phải chọn chất sát trùng và test thử khả
năng diệt nấm
31
 32

Sự đề kháng với chất sát trùng của các VSV

Sự đề kháng với chất sát trùng nhóm phenolic của A. niger
33
ĐốI VớI SảN PHẩM
Kiểm tra mức độ nhiễm:
 Sản phẩm qua tiệt trùng: phải không bị
nhiễm
 Sản phẩm không qua tiệt trùng: Thử giới hạn
mức độ nhiễm

34
VI NấM GÂY BệNH CHO NGƯờI
 Bệnh nấm ngoại biên: bệnh nấm da, bệnh lang ben,
….
 Bệnh nấm dưới da: bệnh do nấm lưỡng hình
Sporothrix schenckii, bệnh bướu nấm.
 Bệnh nấm nội tạng: vi nấm gây bệnh nội tạng
(Aspergillus fumigatus), vi nấm cơ hội (Candida
albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus
flavus,…)
 Bệnh độc tố nấm. 35
THUốC DÙNG TRONG ĐIềU TRị BệNH
NHIễM NấM

Thời gian Thuốc

Trước 1950 Chưa có thuốc (KI)

từ 1951 Nystatin, amphotericin B

1970 Flucytosin
Imidazol: clotrimazol, miconazol,
ketoconazol
Gần đây Triazol: itraconazol, fluconazol, voriconazol
allylamin
Amphotericin B – liposom 36
Caspofungin, echinocandin
THử GIớI HạN VI NấM TRONG THUốC
 Phương pháp pha loãng trong thạch (đếm khóm
nấm phát triển trên môi trường, xác định CFU -
colony forming unit)
• Phương pháp chuẩn trong kiểm định vi sinh trong
thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm.
• Phương pháp thích hợp cho vi khuẩn và nấm men
• Nấm mốc
 Kết quả xác định CFU chịu ảnh hưởng bởi
37
mức độ tạo bào tử ở vi nấm.
38
MộT Số PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐịNH
MứC Độ NHIễM NấM KHÁC

 sử dụng các môi trường nuôi cấy chọn lọc dựa

vào đặc điểm sinh thái của từng nhóm nấm
 xác định sinh khối của nấm
◦ Phương pháp huyết thanh học
◦ Định lượng chitin
◦ Định lượng ergosterol…
◦ Phát hiện chất bay hơi do VN sản sinh
39
 Kỹ thuật phân tử
KIểM SOÁT PHÒNG SạCH VÀ MÔI
TRƯờNG

 Mục đích: xác định mức độ nhiễm VSV ở vị trí

nhất định trong suốt tiến trình pha chế và
đóng gói
 Phương pháp kiểm soát bề mặt :*

+ Đặt đĩa thạch tiếp xúc,

+ Lấy mẫu bằng que bông vô trùng,…

 Kiểm soát không khí: đặt đĩa thạch, máy
40
 MộT Số Kỹ THUậT XÁC ĐịNH HOạT
TÍNH CủA CÁC CHấT KHÁNG NấM *

Kỹ thuật Đặc điểm

Sử dụng cho nấm men Chuẩn, lập lại, tương quan tốt giữa
NCCLS – M27 A2 in vitro và in vivo.
- Kỹ thuật pha loãng
- Kỹ thuật vi pha loãng
Kỹ thuật pha loãng trong môi Dùng / sàng lọc,
trường rắn (agar dilution) Tương quan tốt với kỹ thuật pha loãng

Kỹ thuật khuếch tán qua đĩa Ít liên thông giữa các phòng thí nghiệm.
giấy
Sử dụng cho nấm sợi: Liên thông kết quả giữa các phòng thí
NCCLS M38-A nghiệm, tương quan giữa in vitro 41và in
vivo.
ĐỊNH DANH VI NẤM

1. Ly trích: thạch Sabouraud, thạch máu, thạch bột bắp…

2. Quan sát:
• Hình thái sợi nấm
• Màu sắc của khóm nấm
• Tốc độ phát triển (đường kính khóm nấm).
3. Xác định loại sợi nấm:
• Sợi nấm có vách ngăn,
• Không có vách ngăn,
• Có màu, không màu.
4. Bào tử vô tính và bào tử hữu tính
5. Các tính chất sinh lý. 42

6. Kỹ thuật sinh học phân tử.

43