KLTN - Sudan Trong Thuc Pham

GVHD: PGS.TS.
Nguyễn Thị Xuân Mai Khóa luận tốt nghiệp
TỔNG QUAN
SVTH: Trần Thanh Tâm 1

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Mai Khóa luận tốt nghiệp
1. Giới thiệu sơ lược về phẩm màu trong thực phẩm. [1]
Trong thực phẩm, màu giữ một địa vị rất quan trọng. Nó làm cho sản phẩm bắt mắt
hơn, gây chú ý cho người mua và gây ảnh hưởng tốt về phẩm chất của món hàng.
Có hai loại màu: màu tổng hợp và màu thiên nhiên.
Màu thiên nhiên được trích từ các mô của cây cỏ. Việc sử dụng loại màu này nảy sinh
ra nhiều vấn đề như: màu không cố định có thể thay đổi hay biến dạng theo thời gian,
nhiệt độ, ánh sáng và nhất là có thể làm biến dạng phẩm chất của thực phẩm được nhuộm
màu.
Màu tổng hợp thường tan trong nước và ổn định hơn. Trên thị trường, màu tổng hợp
có dưới dạng hạt, bột, dung dịch, hay dạng dẻo. Màu tổng hợp tác dụng với hydroxid
nhôm Al(OH)3 để cho ra một dung dịch gọi là hồ (lakes) sẵn sàng để nhuộm màu trong
thực phẩm.
Ưu điểm của màu tổng hợp là màu rất bền không bị tác dụng do thời gian, nhiệt độ
hay ánh sáng. Các nhà sản xuất thực phẩm rất thích dùng loại màu tổng hợp này.
Ví dụ hai màu tổng hợp căn bản là màu tartrazine có màu vàng và màu carmine màu đỏ
ngã qua cam. Đứng về phương diện độc hại, màu rất nhạy cảm cho da, có thể làm nứt da,
tạo ra những vảy nến, hay làm dị ứng cũng như nghẹt mũi căn cứ theo báo cáo của Ủy
ban Khoa học Thực phẩm cho con người của EU (CSAH).
Tuy nhiên trên thị trường thực phẩm gần đây ở Việt Nam cũng như ở các quốc gia
châu Âu và Bắc Mỹ đã xuất hiện nhiều mặt hàng thực phẩm có chứa một loại phẩm màu
dùng trong kỹ nghệ. Đó là phẩm màu có tên Sudan.
2. Giới thiệu về Sudan:
Sudan là những phẩm màu tổng hợp hữu cơ thuộc họ azo, có chứa vòng naphtols và
các gốc methyl di động. Chúng được chia thành nhiều loại tùy theo công thức hóa học,
như Sudan I, II, III và IV. Sự thay đổi màu sắc của các Sudan là do sự chuyển đổi vị trí
của các gốc methyl. [2]

Trong công nghiệp các phẩm màu Sudan thường được sử dụng để nhuộm da giày, vải
vóc, các đồ dùng đồ chơi bằng plastic, pha màu dầu nhớt kỹ nghệ… Sudan tan trong dầu
mỡ và định màu trong đó. [1]
Trong công nghiệp thực phẩm, nhằm mục đích cảm quan, thu hút người tiêu dùng,
một số nhà sản xuất gia vị thực phẩm (bột ớt khô, bột cà-ri, bột nghệ, tương ớt, tương
cà…) sử dụng Sudan như là chất tạo màu sắc, vì độ bền màu cao, giá thành rẻ. [3]
Gần đây, một số nhà chăn nuôi Trung Quốc đã cho các phẩm màu Sudan vào thức ăn
gia cầm được nuôi công nghiệp, nhằm làm cho màu của lòng đỏ trứng đạt được màu đỏ
cam tươi.
Sudan được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có thể
định lượng đến độ chính xác 10 ppb.
Sự hiện diện của các phẩm màu azo trong thực phẩm có ảnh hưởng trực tiếp đến sức
khỏe con người. Theo kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới thì Sudan,
sau khi định màu trong các mô mỡ, sẽ bị phân đoạn do phản ứng azo-khử để cho ra
aniline và amino-naphtol là hai độc chất cho con người.
Kể từ năm 2003, tại Pháp, Sudan I được xếp vào loại hóa chất có thể gây chuyển đổi
các nhiễm sắc thể di truyền và thuộc loại có nguy cơ gây ung thư loại 3. [1]
 Lịch sử Sudan I trong thực phẩm: [1]
Mặc dù phẩm màu Sudan đã được tổng hợp từ lâu, nhưng chỉ được dùng trong kỹ
nghệ mà thôi. Mãi đến năm 2003, Cơ quan An toàn Thực phẩm Pháp mới khám phá ra sự
hiện diện của Sudan I trong các lô hàng phẩm màu nhập cảng từ Ấn Độ và Trung Quốc.
Tin tức này được lan truyền đến Cộng đồng Âu Châu và kể từ ngày 20 tháng 6 năm 2003,
tất cả các sản phẩm lương thực nhập cảng từ các quốc gia đang phát triển đều bị kiểm soát
sự hiện diện của Sudan rất kỹ.
Cũng trong năm nầy, Cơ quan Tiêu chuẩn Thực phẩm Anh Quốc (BFSA) đã lên danh
sách 419 sản phẩm thực phẩm của Trung Quốc có khả năng nhuộm màu Sudan I.
Vào ngày 5 tháng 3 năm 2005, các sản phẩm của công ty Heinz ở Quảng Đông và công ty
Hienz Meiweiyuan Food Co. ở Quảng Châu bị thu hồi vì có chứa Sudan I. Đó là các loại
tương ớt, tương cà dưới danh hiệu Heinz’s Golden Mark.
Tại Canada, một luật định ký ngày 5 tháng 9 năm 2003 đã cấm sử dụng Sudan I trong
thực phẩm, vì đây là một tác nhân gây ra ung thư cho con người. Luật này đã được Cơ
quan Kiểm soát Thực phẩm Canada bảo trợ (ACIA).
2.1. Sudan, danh pháp, công thức phân tử, tính chất vật lý:
2.1.1. Sudan I. [4]
Colour Index Danh pháp và tên gọi khác

Sudan I 12055 1-phenylazo-2-naphthol
1-phenylazo-ß-naphthol
2-hydroxy-1-phenylazonaphthalene
2-hydroxynaphthyl-1-azobenzene
Solvent Yellow 14
Sudan Gelb
Dispersol Yellow PP
Ölorange E
Scharlach B
- Công thức phân tử: C16H12ON2.

- Công thức cấu tạo: HO
N N
Sudan I (Solvent Yellow 14)
Tính chất vật lý

- Khối lượng phân tử: 248.3 g.mol-1.
- Nhiệt độ nóng chảy: 138-139 oC.
- Tinh thể hình kim màu vàng.
- Hòa tan trong benzen, ether cho dung dịch màu vàng cam. Không tan trong các dung
dịch kiềm, tan trong H2SO4 cho màu đỏ đậm.

2.1.2. Sudan II. [4]

Sudan II 12140 1-(2,4-dimethylbenzolazo)-2-naphthol
Solvent Orange 7
D&C Red No. 14. Ext.
Sudan orange
CEN-C2
- Công thức phân tử: C18H16ON2.
- Công thức cấu tạo: CH3 HO
H3C N N
Sudan II (Solvent Orange 7)

- Nhiệt độ nóng chảy: 161-163 oC.
- Tinh thể hình kim, sáng ánh, màu đỏ nâu.
- Không tan trong nước, kiềm và acid yếu, tan ít trong ethanol. Hòa tan trong ether cho
dung dịch màu cam.
- Tan tốt trong ligroin, benzen, H2SO4, dầu, mỡ.
2.1.3. Sudan III. [4]

Sudan III 26100 1-[94-benzolazo)-benzolazo]-2-naphthol
Solvent Red 23
D&C Red No. 17
Ölrot 3G
C-Ext. Rot 56
- Công thức phân tử: C22H16N4O.

- Công thức cấu tạo: HO
N N N N
Sudan III (Solvent Red 23)

- Nhiệt độ nóng chảy: 195oC.
- Là chất bột màu nâu có ánh xanh lá cây.
- Không tan trong nước, tan tốt trong chloroform cho dung dịch màu cam.
- Tan vừa phải trong ethanol, ether, acetone, glycerine, dầu mỡ và tinh dầu.
2.1.4. Sudan IV. [5]

Sudan IV 26105 2',3-dimethyl-4-(2-hydroxy-1-naphthylazo)-azobenzene
o-tolylazo-o-tolylazo-ß-naphthol
Solvent Red 24
Ölrot 2B
Scharlachrot
CEN-C5
- Công thức phân tử: C24H20N4O.

- Công thức cấu tạo:
CH3 CH3 HO
N N N N
Sudan IV (Solvent Red 24)


- Nhiệt độ nóng chảy: 181-188o C.
- Phân hủy hoàn toàn ở 206o C.
- Là chất bột màu nâu sẫm.
- Không tan trong nước, tan trong acetonitrile, chloroform, ethanol, benzen, acetone…
- Tan tốt trong dầu, mỡ và chất béo.
2.2. Tính chất hóa học. [6]
Sudan I và II thuộc monoazo, Sudan III và IV thuộc diazo, tất cả đều thuộc họ azo bao
gồm những tính chất sau:
 Tính oxy hóa: dưới tác dụng của các chất khử yếu như Na2S, FeCl2 không thể khử
được nhóm azo, nhưng với các chất khử mạnh như Na2Sx, Sn, Zn, Fe (trong HCl), SnCl2,
TiCl3 + HCl, VSO4 +H2SO4 có thể khử nhóm azo trong phân tử các hợp chất Sudan tạo
thành các amin. [2]
[H]
Ar – N = N – Ar/ - N = N – Ar// Ar – NH2 + Ar/ - NH2 + Ar// - NH2
NH2
[H]: Chất khử mạnh.

 Tác dụng với Halogen: Br2 và Cl2 đều có tác dụng phân hủy Sudan. [2]
Cl2
Ar – N = N – Ar/ Ar – N+ = N- Cl + Ar/Clx
 Tác dụng nhiệt: các hợp chất Sudan phân hủy dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Đặc
biệt khi trong dung dịch có acid hoặc kiềm. [2]
 Tác dụng với acid: H2SO4 đậm đặc cho phản ứng sunfo hóa. [2]

2.3. Hoạt tính sinh học. [3]
Theo tài liệu nghiên cứu của Cơ quan Quốc tế nghiên cứu về ung thư (International
Agency for Research on Cancer, IARC), các phẩm màu Sudan I, II, III và IV khi đi vào
cơ thể qua đường tiêu hóa tạo thành amin thơm là một chất rất độc được xếp vào nhóm 3
các hợp chất gây ung thư.
Trong phản ứng khử azo:
 Sudan I sẽ tạo thành aniline và 1-amino-2-naphtol.
 Sudan II sẽ tạo thành 2,4-xylidine và 1-amino-2-naphtol.
 Sudan III sẽ tạo thành 4-aminoazobenzene, p-phenylenediamine, 1-amino-2-
naphtol, 1-((4-aminophenyl)azo)-2-naphtol và aniline.
 Sudan IV sẽ tạo thành o-aminoazotoluene, 1-((4-aminophenyl)azo)-2-naphtol,
1-amino-2-naphtol, 2,5-diaminotoluene và o-toluidine.
Tuy nhiên, hiện nay chưa có bằng chứng cụ thể về việc trực tiếp gây ung thư cho con
người do các hợp chất trên. Ngoài ra, Sudan I, II, III và IV gây ra chứng
Methemoglobinemia (do Hemoglobin ở trạng thái oxy hóa, nhóm amin oxy hóa ion Fe
(II) thành Fe (III) trong Hemoglobin từ đó làm gãy liên kết với oxygen) và các bệnh về
thần kinh, gan, thận. Vì vậy, sự hiện diện của chúng là không được phép trong thực phẩm
cho bất kỳ mục đích tại bất cứ mức nào.
3. Các phương pháp xác định phẩm màu Sudan.
3.1. Phương pháp điện di mao quản. [7]

Việc xác định các phẩm màu Sudan (I, II, III và IV) được tiến hành bằng phương
pháp điện di mao quản kết hợp với đầu dò UV trong chất điện ly nền chứa 5 mM Borate
(pH = 9.3), 20 mM Sodium dodecyl sulfate và 20% Acetonitrile.
Thời gian phân tích ngắn, phương pháp phân tích đơn giản với giới hạn phát hiện
trong khoảng 96 - 610 μg L-1 (S/N > 3). Phương pháp này đã ứng dụng thành công trong
việc xác định hàm lượng Sudan có trong mẫu thực phẩm như bột ớt từ Ấn độ, Pakistan,
Mexico, Mỹ, Canada và Trung Quốc.

3.2. Phương pháp điện hóa. [8]
Một phương pháp phân tích điện hóa mới được đề nghị cho việc xác định Sudan I
trong bột ớt. Trước tiên Sudan I được tích góp bằng cách hấp phụ trên điện cực glassy
carbon đã được hoạt hóa. Khoảng tuyến tính đạt được của dòng khử theo nồng độ Sudan I
trong khoảng 2.4 x 10-6 mol.L-1 – 1.8 x 10-5 mol.L-1, với một hệ số tương quan 0.9981.
Giới hạn phát hiện khoảng 7.1 x 10-7 mol L-1.
3.3. Phương pháp sắc ký.
3.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đầu dò UV-VIS. [9]
Phương pháp sắc ký pha đảo, cột C18 kết hợp với đầu dò UV-VIS được tiến
hành xác định các phẩm màu Sudan (I, II, III và IV) trong trứng. Pha động sử dụng
acetonitrile (0.1% acid formic)/ H2O (0.1% acid formic). Detector đặt tại 478 nm cho
Sudan I và 520 nm cho Sudan II, III và IV.
Kết quả, hiệu suất thu hồi của các phẩm màu Sudan trong trứng dao động giữa
79.8 và 95.7%, độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 5%, giới hạn phát hiện (LOD) trong
khoảng 4.0–4.8 μg.kg−1, giới hạn định lượng (LOQ) trong khoảng 12.3–13.8 μg.kg−1.
3.3.2. Phương pháp sắc ký khí đầu dò khối phổ (GC-MS). [9]
Những mẫu trứng được dẫn xuất với N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoro-acetamide
và xác định bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trong EI. Khối phổ của dẫn xuất
trimethylsilyl được xây dựng trong mode EI. Khả năng phát hiện và định danh có giá trị
trong khoảng 2.0–4.2 μg.kg−1. Phương pháp phù hợp cho sự kiểm tra, phát hiện và định
danh các phẩm màu Sudan trong trứng.
4. Các phương pháp xử lý mẫu thực phẩm có chứa Sudan.
4.1. Trường hợp mẫu đơn giản.
Các mẫu như tương ớt, tương cà, ớt bột, được đồng nhất, cân lượng chính xác, hòa
tan trong một thể tích dung môi chiết acetone, methanol, dichlomethane, hay hỗn hợp

giữa chúng. Sau đó, siêu âm, ly tâm rồi lọc. Dung dịch qua lọc thổi khô, định mức bằng
pha động rồi tiêm vào HPLC. [10]
4.2. Trường hợp mẫu phức tạp.
Mẫu trứng (lòng đỏ trứng) có thành phần phức tạp, hàm lượng béo, protein cao.
[2]
Các hợp chất Sudan hòa tan với béo, protein. Do đó cần phải chiết các hợp chất Sudan
ra khỏi nền trứng bằng cách xử lý mẫu với một dung môi hữu cơ thích hợp có khả năng
hòa tan tốt các hợp chất Sudan mà không hòa tan các phân tử protein và hidrocacbon.
Dung môi thường sử dụng là acetonitrile, metanol hoặc metanol.
Các cách loại béo để làm sạch mẫu:
Chiết SPE pha đảo C18: mẫu sau khi được chiết loại các hợp chất không tan trong
dung môi hữu cơ, lọc, dịch qua lọc đem cô quay, hòa tan bằng một dung môi thích hợp
đưa lên cột sao cho các hợp chất Sudan được lưu giữ trên cột. Sau đó dùng một hệ dung
môi thích hợp để rửa giải chọn lọc Sudan. Dung môi rửa giải thường là acetonitrile, ethyl
acetate hoặc hỗn hợp giữa chúng. [2]
Chiết SPE pha thuận Silicagel: để tăng khả năng loại béo, dựa trên tính hấp phụ
các hợp chất Sudan cần phân tích trên Silicagel. Với cách xử lý mẫu tương tự SPE pha
đảo nhưng dung môi hòa tan và rửa giải có tính chất ngược lại. Dung môi hòa tan có độ
phân cực thấp thường là n-hexan, etyl acetat hay hỗn hợp các dung môi. Dung môi rửa
giải thường là chloroform, dichlorometan, acetonitrile hoặc hỗn hợp giữa chúng.
Phương pháp xà phòng hóa: phản ứng xà phòng hóa thường dùng dung dịch KOH
trong etanol hay metanol. Phần không bị xà phòng hóa trong đó có Sudan được chiết lên
pha hữu cơ, còn các muối acid béo và các tạp chất còn lại trong dung dịch kiềm. Dung
môi chiết thường là diethyl ether, ethyl acetate, n-hexane. Phương pháp cho khả năng mất
các hợp chất Sudan cao trong khi xà phòng hóa. [2]

5. Sơ lược về phương pháp sắc ký bản mỏng.
5.1. Nguyên tắc.
Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng sắc ký lớp mỏng xảy ra khi cho pha động di
chuyển qua pha tĩnh. Pha tĩnh được rải đều trên tấm kính hoặc tấm kim loại. Mẫu là chất
lỏng hoặc được hòa tan trong dung môi dễ bay hơi được chấm thành vết trên pha tĩnh. Sau
đó đặt thẳng đứng bản mỏng vào bình chứa dung môi là pha động và dung môi sẽ chạy
lên bản mỏng nhờ lực mao quản. Trong quá trình chuyển qua pha tĩnh nhờ các quá trình
hấp phụ và giải hấp phụ được lập đi lập lại và do hệ số phân bố giữa pha tĩnh và pha động
khác nhau, các cấu tử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng di chuyển của pha động
với những tốc độ khác nhau.
5.2. Các đại lượng đặc trưng.
5.2.1. Hệ số di chuyển Rf.
Trong sắc ký lớp mỏng đại lượng đặc trưng quan trọng về mức độ tách là hệ
số di chuyển Rf.
Rf = Lo/L
Lo: khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký.
L: khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi.
0 ≤ Rf ≤ 1
Khi Rf = 0 có nghĩa là chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm nguyên ở điểm
xuất phát, còn khi Rf = 1 có nghĩa là chất tan di chuyển cùng với tốc độ của dung môi.
Rf phụ thuộc vào hàng loạt các yếu tố sau: chất hấp phụ, bề dày của bản mỏng, độ
tinh khiết của dung môi, độ bão hòa của dung môi, tốc độ di chuyển của pha động, đoạn
đường dung môi đi, ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng chất đưa lên bản, ảnh hưởng của pH,..
Để ổn định pH của dung môi sắc ký, người ta sử dụng các hệ đệm: acid formic,
acid acetic…

Vì việc ổn định giá trị của Rf nhiều khi gặp khó khăn về kĩ thuật, nên có cách khác
để xác định vị trí vệt trên sắc đồ: so sánh vị trí của chất cần định phân với vị trí của chất
chuẩn cũng được sắc ký trong cùng điều kiện, nghĩa là trên cùng một bản mỏng.
Rx = Rf chất định phân / Rf chất chuẩn.
5.2.2. Hệ số tách.
Để đánh giá khả năng tách vệt trên sắc đồ, người ta sử dụng hai đại lượng sau:
a. ∆Rf là hiệu giá trị Rf của 2 cấu tử lận cận. ∆Rf càng lớn, độ chọn lọc của lớp
mỏng càng tốt. Tuy nhiên, đại lượng này nhiều khi không phản ánh đúng khả năng tách
thực tế vì cùng một giá trị ∆Rf nhưng nếu vệt bị giãn rộng thì mức độ chồng chập 2 vệt
lớn hơn. Khoảng cách giữa 2 vệt sắc ký còn phụ thuộc vào đoạn đường đi được của các
chất.
b. Hệ số tách k:
K = KA / KB
Trong đó KA, KB là hệ số phân bố của 2 cấu tử A và B ứng vơi 2 vệt lân cận.
5.2.3. Số đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H:

N = 16 (dR / W)2
Trong đó dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử
W là chiều của peak
H = dR / N
5.3. Pha tĩnh (chất hấp phụ): [12]
Có nhiều loại chất hấp phụ được dùng trong sắc ký lớp mỏng như silical gel, nhôm
oxyd, cellulose, Kieselgur (cát biển), polyamid, Sephadex. Sau đây giới thiệu một vài loại
thông dụng :
 Silicagel : Là chất hấp phụ thông dụng nhất. Cũng như các chất hấp phụ khác,
silicagel có những “trung tâm hoạt năng” hợp thành bởi các góc, cạnh những lỗ xốp hay

điểm khuyết ở bề mặt, ở những nơi đó, ion dễ lộ ra ngoài. Mặt khác silicagel được điều
chế từ tủa keo acid silisic ngưng tụ, keo này có chứa các phân tử nước trong khe của các
mạng tinh thể. Khi được sấy, một phần nước bốc hơi, bị loại ra khỏi mạng tinh thể nhưng
cấu trúc vẫn giữ nguyên, nước bốc hơi tạo thành những lỗ hổng có tác dụng hút rất mạnh
các phân tử nước hay phân tử các chất phân cực khác vào khung cấu trúc của nó.
Kích thước hạt ảnh hưởng tới tốc độ dịch chuyển, kích thước lỗ hổng ảnh hưởng
nhiều đến khả năng hấp phụ. Silicagel dùng cho TLC trên thị trường thường có kích
thước hạt từ 5 - 40m và đã được loại tạp chất như sắt, nhôm… Hơn nữa, trên bề mặt của
silicagel có các nhóm OH tự do làm cho lớp mỏng có tính acid nhẹ (pH 4-5), do đó, khi
phân tích các chất có tính base cần chú ý vì các chất này thường bị giữ lại ở đường khởi
điểm. Để khắc phục, người ta dùng các pha động có tính kiềm hoặc thêm một lượng KOH
hoặc dung dịch đệm calci hydroxyd hoặc sodium citrate vào silicagel khi tráng bản mỏng.
Để mở rộng phạm vi áp dụng cho TLC, người ta còn gắn các mạch hydrocarbon (có từ 2-
18 cacbon) vào nhóm OH trên bề mặt của silicagel (silan hóa) để tạo ra các pha tĩnh
không phân cực dùng trong sắc ký lớp mỏng pha đảo (RPTLC - Reversed phase thin layer
chromatography) như RP-2, …, RP- 18. Có trường hợp, người ta còn cho tẩm silicagel
với 20% bạc nitrate và có hoặc không có 10% chất dính calci sulffate. Loại này dùng tách
các chất chứa liên kết đôi (đồng phân cis- trans và mức độ bão hòa).
Tóm lại, khả năng hấp phụ của silicagel phụ thuộc cỡ hạt, trạng thái bề mặt và hoạt
năng của nó.
Silicagel có loại không có chất dính, có loại có thêm chất dính để cố định bản
mỏng. Chất dính thông dụng là calci sulfat (thạch cao) với tỷ lệ 5 - 15%. Ngoài ra còn cho
thêm các chất chỉ thị huỳnh quang như kẽm silicat ở bước sóng 254nm hoặc muối natri
của acid hydroxypurene - sulfonic ở 366nm, silicagel loại này dược ký hiệu là F254 hoặc
F366. Đôi khi người ta còn cho thêm 1 số acid như acid oxalic, acid sulfuric vào silicagel
khi tráng bản mỏng để tách các hợp chất acid hoặc tẩm bản mỏng với dầu parafin,
silicon…để tách các chất ưa dầu.
Các loại bản được tráng silicalgel có bán sẵn trên thị trường.

 Nhôm oxyd: Sau silicagel, nhôm oxyd là loại chất hấp phụ hay được dùng .Nhôm
oxyd là loại chất hấp phụ có hoạt tính cao. Người ta sản xuất nhôm oxyd ở 3 dạng nhôm
oxyd kiềm, acid và trung tính dể tách các loại hợp chất khác nhau. Khi dùng nhôm oxyd,
để có kết quả lặp lại tốt, cần phải kiểm soát được tỷ lệ nước trong nhôm để đảm bảo được
hoạt độ của nó. Muốn vậy, cần hoạt hóa bản mỏng ở 75 – 110 oC trước khi dùng. Loại
thường dùng là nhôm oxyd trung tính, nó có thể tách các hợp chất terpen, alcaloid, chất
béo và nhân thơm. Nhôm oxyd mất hết hoạt tính được dùng để phân tích các chất phân
cực như acid amin.
Cũng như silicagel, nhôm oxyd cũng được trộn chất dính hay không trộn chất dính,
có hoặc không có chất chỉ thị huỳnh quang và cũng có các ký hiệu như silicagel. Ví dụ
nhôm oxyd G (có chất dính), GF (có chất dính và chất chỉ thị huỳnh quang). Ngoài ra còn
có nhôm oxyd loại T (có chất dính, không có chỉ thị huỳnh quang) dùng để tách các
peptid, steroid.
Các bản mỏng nhôm oxyd tráng sẵn trên kính cũng được bán trên thị trường
 Cellulose: Silicagel và nhôm oxyd là 2 chất hấp phụ vô cơ chủ yếu để tách các
chất béo hoặc những chất hòa tan trong dung môi hữu cơ. Cellulose lại là một chất hấp
phụ hữu cơ chủ yếu dùng tách các chất thân nước như đường, amino acid, ion vô cơ, dẫn
xuất acid nucleic. Lớp mỏng cellulose được gắn trên tấm kính, nhựa , nhôm không khác
nhiều so với sắc ký giấy. Dung môi khai triển, thuốc thử phát hiện dùng cho lớp mỏng
cellulose giống như sắc ký giấy. Quá trình tách xảy ra trên cellulose chủ yếu là quá trình
phân bố. Có 2 loại bột cellulose phù hợp với TLC là cellulose dạng sợi tự nhiên và
cellulose vi tinh thể . Việc áp dụng đối với 2 loại cellulose này đôi khi không giống
nhau.Một số loại cellulose đã được xử lý hóa học dùng cho TLC được bán trên thị trường
như: Cellulose dạng sợi “Cellulose 300”, Microcrystalline, tên thương mại là Avicel,
DEAE (Diethylaminoethyl), carboxymethyl (CM)... là những chất hấp phụ trao đổi ion
được dùng rộng rãi để tách các chất có phân tử lượng lớn. Acetylated cellulose dùng cho
sắc ký pha đảo.

5.4. Pha động. [12]
Khi chọn dung môi pha động phải chú ý tới các yếu tố sau:
- Dung môi hòa tan tuơng đối tốt tất cả các cấu tử phân tích.
- Bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh.
- Không phản ứng hóa học với chất tan cũng như chất hấp phụ.
Ngoài ra trong sắc ký bản mỏng người ta còn chú ý đến tốc độ di chuyển của dung
môi. Theo phương pháp sắc ký đi lên, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào độ nhớt, sức căng
bề mặt, góc bờ thấm ướt của dung môi, kích thước hạt, kích thước lỗ, bề dày lớp mỏng và
nhiệt độ.
5.5. Các thông số ảnh hưởng đến quá trình tách của sắc ký bản mỏng [13].
F.Geiss đã nêu ra 25 thông số ảnh hưởng đến quá trình tách của TLC (tầm quan
trọng được giảm dần theo thứ tự từ 1 đến 25) :
1. Pha tĩnh.
2. Pha động (dung môi giải ly).
3. Loại bình triển khai sắc ký.
4. Độ hấp phụ của dung môi.
5. Độ ẩm tương đối, hoặc
6. hoạt tính của pha tĩnh.
7. Độ bão hòa của bình triển khai sắc ký và pha tĩnh với hơi dung môi giải ly.
8. Kích thước của các hạt trên bề mặt pha tĩnh.
9. Kích thước của vết chấm.
10. Khoảng cách giữa vị trí bắt đầu của chất khảo sát và mức dung môi giải ly
trong bình triển khai sắc ký.

11. Gradient dung môi giải ly.
12. Sự dao động chất lượng của pha tĩnh.
13. Tốc độ của dòng dung môi giải ly.
14. Giá trị Rf.
15. Nhiệt độ.
16. Thể tích mẫu khảo sát.
17. Thành phần chất gắn với pha tĩnh.
18. Sự không đồng nhất về độ dày của chất hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.
19. Quy trình sản xuất của pha tĩnh.
20. Độ dày của lớp chất hấp phụ trên bế mặt pha tĩnh.
21. Dòng hơi đối lưu trong không gian của bình triển khai sắc ký.
22. Hướng phát triển dung môi (đi lên, đi xuống, trực tiếp ngang qua sự di chuyển
của dung môi giải ly).
23. Độ tinh khiết của dung môi pha động.
24. Khoảng cách tách ly.
25. Giá trị pH.
[11]
5.6. Kỹ thuật tiến hành sắc ký bản mỏng.
5.6.1. Đưa mẫu lên bản.
Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản có ý nghĩa quan trọng đối với kết quả
tách sắc ký, đặc biệt ảnh hưởng tới giá trị Rf. Lượng chất lớn quá làm cho vệt sắc ký lớn
và thường kéo dài, các vệt của các chất có giá trị Rf gần nhau bị chồng chập. Lượng chất
nhỏ quá có thể không phát hiện.
Đối với dung dịch nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trước khi đưa lên bản bằng
cách chấm nhiều lần ở đúng một vị trí, chờ chấm trước khô mới chấm chấm sau.
5.6.2. Khai triển sắc ký bằng phương pháp sắc ký đi lên. [11]
Là quá trình tách các cấu tử trên lớp mỏng khi cho dung môi thấm vào lớp mỏng
theo chiều từ dưới lên trên nhờ tác dụng của lực mao quản. Khi đặt bản mỏng vào bình
dung môi trong bình phải ngập bản 0.5 cm, tối đa 0.7 cm. Đoạn đường dung môi thấm
vào lớp bản mỏng không quá 10 – 12 cm vì sau đó tốc độ chuyển động của dung môi rất
chậm, vệt bị khuếch tán rộng và giá trị Rf bị dao động nhiều.
Trong quá trình di chuyển của pha động, xảy ra sự phân bố và khuếch tán các chất
giữa pha tĩnh và pha động, đây là một quá trình cân bằng động tuân theo định luật phân
bố Nernst. Quá trình này xảy ra liên tục trong suốt thời gian phát triển sắc ký để đảm bảo
hệ số phân bố luôn luôn là một hằng số (quá trình phát triển sắc ký thường tiến hành trong
điều kiện đẳng nhiệt). Chính sự phân bố và khuếch tán này của các chất làm cho độ lớn
chấm sắc ký tăng lên khi di chuyển cùng với pha động (có sự lan rộng của các chất ra
xung quanh).
Sự lan rộng này càng rõ ràng khi nồng độ hay lượng chất mà ta chấm bản càng lớn.
Điều này được giải thích: khi ta chấm mẫu lên bản, vết chấm của dung dịch mẫu sẽ khô
làm cho lượng mẫu trở nên đậm đặc lại. Sự chấm nhiều lần tại cùng một tâm càng làm
cho nồng độ mẫu tại điểm xuất phát tăng lên đáng kể. Khi pha động di chuyển qua điểm
xuất phát, sự khuếch tán và sự phân bố xảy ra làm cho kích thước vệt sắc ký bắt đầu tăng
lên. Do đó, tốc độ của quá trình phát triển sắc ký ảnh hưởng rất nhiều đến kích thước và
hình dạng của vết sắc ký.
Nếu tốc độ di chuyển quá nhanh thì vết sắc ký sẽ bị kéo dài ra thành dạng vệt.
Nếu tốc độ di chuyển quá chậm thi vết sắc ký sẽ lan rộng ra xung quanh.
Cả 2 trường hợp trên đều không thể định lượng các chất một cách chính xác. Vì
vậy chúng ta phải lựa chọn một tốc độ di chuyển của pha động cho phù hợp. Tốc độ di
chuyển của pha động tuỳ thuộc vào ái lực của nó với pha tĩnh.

Ái lực này càng lớn thì tốc độ càng chậm.
Ái lực này càng nhỏ thì tốt độ càng nhanh.
Do đó việc lựa chọn pha động và pha tĩnh phù hợp là yếu tố quan trọng để tách hỗn
hợp các chất.
5.6.3. Hiện sắc ký đồ.
Đối với những chất được sắc ký không màu hoặc màu rất nhạt thì sau khi khai
triển ta phải hiện sắc đồ bằng phương pháp hóa học hoặc quang học.
 Phương pháp hóa học:
Phun lên bản một hoặc một vài thuốc thử tạo màu đặc trưng với các chất
được tách.
 Phương pháp quang học:
Đối với các chất có khả năng huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại lên bản ta
thu được các vệt sáng màu khác nhau.
Cũng có thể nhận biết các chất hấp thu tia tử ngoại bằng cách phun dung
dịch thuốc thử tạo ra hợp chất huỳnh quang. Khi chiếu tia tử ngoại vào các bản đó
ta thấy các vệt tối ứng với các chất hấp thu tia tử ngoại ở bước sóng đã chọn.
5.6.4. Phân tích định tính. [11]
Để nhận biết các chất trên sắc đồ có thể có 2 cách:
a. Nhận biết trực tiếp theo màu sắc đặc trưng của vệt sắc ký.
Phương pháp này thường dùng cho các chất vô cơ vì giá trị R f rất
khó ổn định, hơn nữa có nhiều thuốc hiện thích hợp để tạo các màu đặc
trưng với các ion vô cơ khác nhau.
b. Dựa vào giá trị Rf.
Vì đối với mỗi chất trong một hệ sắc ký nhất định có một giá trị Rf
đặc trưng.
4.6.5. Phân tích định lượng.
Có các cách sau:
a. So màu bằng mắt:
So sánh cường độ màu của vệt của dung dịch chuẩn với cường độ màu của
vệt của dung dịch phân tích.
 Ưu điểm: nhanh, đơn giản, rất tiện lợi cho bán định lượng.
 Khuyết điểm: đánh giá chủ quan, độ chính xác không cao.
b. Phương pháp Densitometry.
Nguyên tắc của phương pháp là quét các vệt màu trên sắc đồ bằng một
chùm sáng. Hiệu số giữa cường độ ánh sáng tới và ánh sáng đi qua hoặc phản xa
được đo dưới dạng tín hiệu điện và ghi ra peak. Chiều cao peak tỉ lệ với cường độ
màu ở tâm vệt và chiều rộng peak tỉ lệ với chiều dài vệt theo hướng quét. Lượng
chất tỉ lệ với diện tích peak hoặc chiều cao peak. Tất cả vệt phải nằm trên một sắc
đồ.
c. Phương pháp huỳnh quang.
Nguyên tắc của phương pháp huỳnh quang cũng giống như phương pháp
Densitometry nhưng ở đây người ta đo cường độ của các vệt huỳnh quang trên nền
tối không huỳnh quang khi quét bằng ánh sáng tử ngoại (tương ứng với ánh sáng
kích thích) hoặc đo độ tắc huỳnh quang của các chất hấp thu tia tử ngoại (vệt tối
trên nền phát huỳnh quang) khi quét ánh sáng tử ngoại.
Phương pháp huỳnh quang nhạy hơn phương pháp Densitometry.
Để định lượng trực tiếp với kết quả chấp nhận được cần thực hiện đúng các
qui tắc sau:
+ Các thể tích dung dịch phân tích và dung dịch chuẩn đưa lên bản phải đồng
nhất. Kích thước vệt chấm ở điểm xuất phát phải như nhau.

+ Dung dịch chuẩn và dung dịch phân tích phải cùng điều kiện chuẩn bị như
nhau.
+ Các dung dịch chuẩn và dung dịch phân tích phải được đưa lên cùng một bản,
chấm cạnh nhau.
+ Chọn hệ sắc ký để các vệt của các chất lạ không chồng chập đến vệt phân
tích.
6. Hệ thống quang học của máy Densitometer. [11]
Máy Densitometer CS9301 Shimadzu
Máy này được hoạt động với các nguồn sáng sau:
Đèn Deuterium là nguồn sáng liên tục cho vùng tử ngoại (200 - 370 nm).
Đèn Halogen là nguồn sáng liên tục cho vùng thấy được (370 – 700 nm).
Các đèn trên được sử dụng cho các phép đo mật độ hấp thu và mật độ phản xạ của
các bản mỏng trong suốt và không trong suốt.
Ngoài hai nguồn đèn trên máy được trang bị đèn Xenon hay đèn Thuỷ ngân để đo
mật độ huỳnh quang của các bản không trong suốt. Như ta đã biết, phép đo mật độ huỳnh
quang đòi hỏi phải có nguồn sáng càng mạnh càng tốt, chỉ có đèn Xenon hay đèn Thuỷ
ngân mới đáp ứng được yêu cầu này.
Đèn Thuỷ ngân vẫn thường được dùng để đo mật độ huỳnh quang bằng mắt
thường là loại đèn phát sáng mạnh tại một số bước sóng như : 315, 365, 405, 546 nm.

Đèn Xenon là loại đèn có phổ phát xạ liên tục trong vùng từ 200-700 nm. Như vậy
đèn Xenon có ưu điểm hơn đèn Thuỷ ngân trong các phép đo cường độ huỳnh quang nói
chung.
Sơ đồ quang học của máy có thể được mô tả như sau: (xem hình trên)
M1: Gương quay. F: Kính lọc phụ trợ.
M2: Gương trực chuẩn. G: Cách tử nhiễu xạ.
M3: Gương cầu. PMM: Nhân quang điện kiểm soát.
M4: Gương phẳng. PMR: Nhân quang điện đo phản xạ.
SFIX: Khe ra (Cố định). PMT: Nhân quang điên đo truyền suốt.
SR: Khe ra (Quay). QP: Bản thạch anh.
W: Đèn Halogen SENT: Khe vào.
D2: Đèn deteurium.
Nguồn sang phát ra từ đèn Xenon được gương quay M1 dẫn qua khe vào SENT, tại
vị trí khe này có đặt thêm hai kính lọc phụ trợ F. Sau đó chùm tia được chiếu vào gương
tự chuẩn trực để chuyển thành chum tia song song chiếu vào cách tử G. Cách tử G có 600
rãnh/1mm rồi đi qua khe ra có kích thước cố định SFIX. Bên cạnh khe Sfix còn có một đĩa
quay SR, đĩa này cho phép điều chỉnh kích thước của khe ra và lựa chọn kiểu đo tuyến

tính hoặc kiểu đo Ziczac trên bản mỏng. Sau khi ló ra khỏi khe ra, chùm tia song song
được rọi vào gương cầu M3 rồi đến gương phẳng M4. Sau khi ló ra khỏi gương phẳng M4
chùm tia đi qua một bản thạch anh QP. Bản này có chức năng phản xạ một phần cường độ
của chùm tia và rọi vào ống nhân quang PMM (photomultiplier for monitor). Phần còn lại
của chùm tia đi qua bản thạch anh rồi chiếu vào bản mỏng đo.
Trong phép đo ánh sáng phản xạ thì bản đo là bản không trong suốt, ánh sáng phản
xạ từ bản này được chiếu vào nhân quang điện phản xạ PMR (photomultiplier for
reflection).

THỰC NGHIỆM

Nội dung thực nghiệm

Phần I: Khảo sát qui trình xác định đồng thời Sudan I, Sudan II, Sudan III, Sudan IV
bằng sắc ký bản mỏng kết hợp với thiết bị Densitometer.
1.1. Khảo sát điều kiện tách Sudan I-IV bằng sắc ký bản mỏng:
1.1.1. Khảo sát dung môi pha động.
1.1.2. Khảo sát tỉ lệ thành phần dung môi trong hệ.
1.2. Khảo sát thông số tối ưu cho phép đo trên máy Densitometer:
1.2.1. Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại.
1.2.2. Khảo sát độ lặp lại của vết chấm.
1.2.3. Xây dựng đường chuẩn.
1.2.4. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
Phần II: Áp dụng trên mẫu thực.
Xác định Sudan I-IV trong bột cà ri trên thị trường.

1. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất.

1.1. Dụng cụ và thiết bị:
- Bình triển khai sắc ký.
- Bản Silica gel tráng sẵn (Merck), pha thường và pha đảo C18, kích thước
20x20 cm.
- Micropipet (Australia): 0.2-10 µL.
- Máy quang phổ UV - Vis Spectrophotometer 1800 Shimadzu.
- Máy Densitometer Shimadzu CS 9301 có bước sóng hoạt động từ 200-
700 nm, với hai chức năng: dùng cho ánh sáng phản xạ và ánh sáng
huỳnh quang.
- Các dụng cụ thủy tinh.
1.2. Hóa chất:
- Acetonitrile (ACN): Uni-chem.
- Methanol (MeOH): Hwandong - Trung Quốc.
- Ethanol (EtOH): Hwandong - Trung Quốc.
- Acetone: Hwandong - Trung Quốc.
- Benzene: Hwandong - Trung Quốc.
- n- Propanol: Merck - Đức.
- Glacial Acetic acid (AcOH): Trung Quốc. ( d = 1.049 g cm-3)
- Toluene: Uni-chem.
- Tetrachlorur carbon: Uni-chem.
- Dichloromethane: Hwandong - Trung Quốc.
- Chloroform: Hwandong - Trung Quốc.
- n- Hexane: Hwandong - Trung Quốc.
- Ethyl Acetate: Hwandong - Trung Quốc.
- Diethyl Eter: Uni-chem.
- Dung dịch chuẩn Sudan I-IV: 1000 µg g-1 (pha trong ACN).

2. Thực nghiệm:
2.1. Khảo sát hệ dung môi pha động:
 Qui trình thực nghiệm:
 Nguyên tắc:
Chấm riêng biệt các dung dịch chuẩn lên bản mỏng, khai triển với từng hệ dung
môi động, lấy ra để khô. Quan sát và xác định giá trị Rf.
 Cách làm:
- Chuẩn bị bản mỏng:
Loại bản sử dụng là bản Silicagel tráng sẵn RP C18 (gắn với một mạch octa
decylsilyl)
Hoạt hóa bản mỏng bằng cách sấy bản mỏng ở nhiệt độ 110 oC trong vòng 90
phút. Sau đó lấy ra và bảo quản trong bình hút ẩm (chú ý tránh để bị nhiễm hơi
acid).
- Chuẩn bị bình khai triển sắc ký:
Bình khai triển phải khô, sạch và có nắp đậy kín. Mỗi lần khai triển đều phải
pha dung môi mới. Cho dung môi vào bình, đậy nắp kín để bão hòa dung môi
trong khoảng 10 phút (nên cho một tấm giấy lọc vào để dung môi bão hòa tốt hơn).
- Chấm bản mỏng:
Đánh dấu vạch xuất phát cách mép dưới khoảng 1.5 cm và đường cận trên cách
mép trên khoảng 1 cm. Chọn các điểm để chấm trên đoừng xuất phát cách mép 1.5
cm. Chấm lần lượt theo thứ tự từ trái sang phải Sudan I đến Sudan IV lên vạch
xuất phát mỗi điểm cách nhau 1 cm.
Khi chấm bản cần phải chờ chấm trước khô mới chấm chấm sau để vết chấm
không bị loang rộng. Sau khi vết chấm khô đặt vào bình khai triển sao cho vạch
xuất phát không bị ngập trong dung môi.
Tiến hành triển khai sắc ký ở nhiệt độ phòng, đến khi dung môi đi đến cận trên
(dung môi đi được khoảng 7 cm), đánh dấu vị trí dung môi đi đến. Lấy bản mỏng
ra khỏi bình sắc ký, để khô tự nhiên trong khoảng 7 phút. Đo Rf, rồi đo trên
Densitometer.
- Khảo sát các hệ dung môi pha động: [14]
+ Hệ 1: MeOH - H2O - AcOH (70:20:10, v/v/v).
+ Hệ 2: EtOH - H2O - AcOH (80:10:10, v/v/v).
+ Hệ 3: BuOH - H2O - AcOH (90:5:5, v/v/v).
Kết quả thu được biểu diễn ở bảng sau:

Bảng 1: Kết quả giá trị Rf của Sudan I, II, III, IV trong các hệ dung môi
khác nhau:
Giá trị Rf Rf Thời gian

Hệ dung
Sudan Sudan Sudan Sudan chạy sắc ký
môi động Rf12 Rf23 Rf34
I II III IV (phút)
Hệ 1 0.15 0.07 0.04 0.02 0.08 0.03 0.02 20
Hệ 2 0.41 0.40 0.37 0.35 0.01 0.03 0.02 17
Hệ 3 0.54 0.53 0.52 0.52 0.01 0.01 0.00 22
Với: Rf1: giá trị Rf của Sudan I.

Rf2: giá trị Rf của Sudan II.
Rf3: giá trị Rf của Sudan III.
Rf4: giá trị Rf của Sudan IV.
Rf12 = Rf1 - Rf2.
Rf23 = Rf2 - Rf3.
Rf34 = Rf3 - Rf4.

MeOH-H2O-AcOH EtOH-H2O-AcOH BuOH-H2O-AcOH

70:20:10 80:10:10 90:5:5
Nhận xét:
Trong ba hệ dung môi trên, hệ chứa BuOH là hệ ít phân cực hơn nên liên kết giữa
pha động và các Sudan tốt hơn do đó các Sudan di chuyển lên cao nhất, Rf cao nhất.
Trong hai hệ dung môi còn lại trên sắc ký đồ chúng tôi nhận thấy hệ 1 có khả năng tách ly
bốn loại Sudan tốt nhất.
Mặc dù thời gian chạy sắc ký ở hệ 2 là nhanh nhất nhưng hình dạng vệt sắc ký ở hệ
1 tròn, gọn hơn bên cạnh đó cường độ của vệt sắc ký ở hệ 1 là rõ nhất. ∆Rf ở hệ 1 lớn hơn
hệ 2 và hệ 3 nên khả năng tách hỗn hợp các Sudan là tốt nhất. Vì vậy chúng tôi chọn hệ 1
làm hệ dung môi pha động để chạy sắc ký.
2.2. Khảo sát thành phần pha động:
Tiến hành chấm dung dịch chuẩn Sudan I 25 µg. g-1, Sudan II 25 µg. g-1, Sudan III
20 µg. g-1, Sudan III 20 µg. g-1 lên bản mỏng, làm khô, chạy sắc ký, để khô, đem đi đo để
xác định Rf. Để tìm thành phần hệ pha động MeOH:H2O:AcOH thích hợp chúng tôi thay
đổi tỉ lệ của chúng. Kết quả chỉ ra ở bảng sau:

Bảng 2: Kết quả khảo sát tỉ lệ MeOH:H2O:AcOH ở thời gian 20 phút.

MeOH:H2O:AcOH Giá trị Rf Rf
STT
(v/v/v) Sudan I Sudan II Sudan III Sudan IV Rf12 Rf23 Rf34
1 70:20:10 0.15 0.07 0.04 0.02 0.08 0.03 0.02
2 70:15:10 0.19 0.11 0.06 0.03 0.08 0.05 0.03
3 70:10:10 0.20 0.12 0.08 0.04 0.08 0.04 0.04
4 80:15:10 0.20 0.11 0.07 0.03 0.09 0.04 0.04
5 90:15:10 0.18 0.10 0.05 0.02 0.08 0.05 0.03
6 85:15:10 0.19 0.12 0.07 0.04 0.07 0.05 0.03
7 80:15:5 0.30 0.18 0.11 0.05 0.12 0.07 0.06
8 80:15:15 0.26 0.16 0.09 0.04 0.10 0.07 0.05
MeOH-H2O-AcOH MeOH-H2O-AcOH
70:20:10 70:15:10

70:10:10 80:15:10
90:15:10 85:15:10

80:15:5 80:15:15
Nhận xét:
Khi tăng dần tỉ lệ H2O thì giá trị Rf của các Sudan giảm dần do độ phân cực của hệ
dung môi pha động tăng lên, tương tác giữa pha động và các Sudan giảm xuống trong
khi tương tác giữa các Sudan với pha tĩnh (C18) tăng lên.
Khi tăng dần tỉ lệ MeOH độ phân cực của hệ dung môi giảm, sự tương tác giữa các
Sudan với pha tĩnh càng tăng do đó giá trị Rf của các Sudan ngày càng nhỏ lại.
Khi tăng tỉ lệ AcOH thì cường độ của 4 vệt giảm đi rõ rệt, bên cạnh đó khi tăng
AcOH (tức là nồng độ H+ tăng) khả năng tạo thành phân tử mang điện tích dương của
các Sudan càng tăng làm các cấu tử chuyển vào pha hữu cơ không hoàn toàn, do đó
thời gian chạy sắc ký cũng tăng lên đôi chút. Tuy nhiên tại tỉ lệ 80:15:5 ta thu được
sắc ký đồ 4 vệt tròn và cường độ khá rõ. Vì vậy, tỉ lệ này được chọn để khảo sát các
điều kiện tối ưu cho phép đo trên máy Densitometer.

Qua khảo sát trên chúng tôi chọn hệ dung môi MeOH-H2O-AcOH (80:15:5, v/v/v)
làm hệ dung môi động Vì hệ này cho hình dạng các vệt sắc ký tương đối gọn và Rf
đủ lớn để tách các Sudan ra khỏi nhau.
Sau khi lựa chọn dung môi và tỉ lệ thành phần trong hệ thích hợp, chúng tôi tiến
hành khảo sát các điều kiện tối ưu cho phép đo trên máy Densitometer.
2.3. Khảo sát các điều kiện tối ưu cho phép đo trên máy Densitometer:
2.3.1. Khảo sát bước sóng kích thích:
Tiến hành quét phổ UV của các dung dịch chuẩn Sudan I 25 µg. g-1, Sudan II 25
µg. g-1, Sudan III 20 µg. g-1, Sudan III 20 µg.g-1 trên máy quang phổ UV - Vis
Spectrophotometer 1800 Shimadzu từ 350 - 600 nm.
Kết quả được biểu diễn trên hình sau:
Hình 1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thu và bước sóng.
1.400 A 502 nm
1.300
474 nm
1.200
1.100 487 nm
1.000
513 nm
0.900
0.800
Sudan I
0.700 Sudan II
0.600 Sudan III
0.500 Sudan IV
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000 λ (nm)
350.00 400.00 450.00 500.00 550.00 600.00

2.3.2. Các thông số chạy trên máy Densitometer:
Qua quá trình khảo sát chúng tôi chọn được các thông số tối ưu cho phép đo
trên máy Densitometer để xác định đồng thời các Sudan như sau:
Bảng 2: Bước sóng hấp thu cực đại của các Sudan trong phép đo trên Densitometer.
Sudan λmax(nm)
I 474
II 487
III 502
IV 513
Hình 2: Các thông số trên máy Densitometer

2.4. Khảo sát độ lặp lại và cường độ của vết chấm:

2.4.1. Sudan I:
Hình 3: Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của Sudan I
Cchuẩn Diện tích peak S

STT V chấm (µL) -1
(µg.g )
1 2 60 529.146
2 2 60 501.600
3 2 60 522.593
4 2 60 567.267
 Tính RSD:
RSD là độ lệch chuẩn tương đối:
100 × Sn
RSD =
𝒙

Với Sn là độ lệch chuẩn:
𝒏
𝒊=𝟏(𝒙𝒊 − 𝒙)
𝑺𝒏 =
𝒏−𝟏
Độ lặp lại: RSD = 0.987 (%)

2.4.2. Sudan II:
Hình 4: Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của Sudan II

(µg.g )
1 2 50 592.132
2 2 50 490.723
3 2 50 655.887
4 2 50 744.741

Độ lặp lại: RSD = 1.665(%)

2.4.3. Sudan III:
Hình 5: Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của Sudan III

(µg.g )
1 2 30 490.901
2 2 30 504.847
3 2 30 569.865
4 2 30 534.199

2.4.4. Sudan IV:

Hình 6: Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của Sudan IV

(µg.g )
1 2 10 216.670
2 2 10 203.905
3 2 10 183.211
2 10 183.055

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ lặp lại cùa các Sudan
Sudan Giá trị RSD (%)
I 0.99
II 1.67
III 1.13
IV 2.07
Kết quả trên cho thấy độ lặp lại của phép đo chưa thật tốt, tuy nhiên dao động này
không lớn lắm vẫn có thể chấp nhận được.
2.5. Xây dựng đường chuẩn và áp dụng trên mẫu:
Chấm 7 điểm hỗn hợp chuẩn gồm Sudan I, II và III, mỗi điểm 2 µL cách nhau 1
cm lên bản mỏng với nồng độ mỗi Sudan trong hỗn hợp như sau:
CSudan I CSudan II CSudan III

STT (µg.g-1)
(µg.g-1) (µg.g-1)
1
10.6987 10.7568 5.3853
2
14.9786 15.0600 7.5396
3
19.9097 20.0179 10.0217
4
25.2207 25.3578 12.6950
5
29.6026 29.7635 14.9007
6
35.0515 35.2420 17.6434
7
40.0047 40.2222 20.1367

Chấm 5 điểm chuẩn gồm Sudan IV mỗi điểm 2 µL cách nhau 1 cm lên bản mỏng
với nồng độ như sau:
STT 1 2 3 4 5
CSudan IV
(µg.g-1) 5.3853 7.5396 10.0217 12.6950 14.9007
Khai triển dung môi, để khô, đem đo trên Densitometer.

2.5.1. Sudan I: (pha từ Sudan I 100.0704 µg.g-1)
Lượng Tổng Sudan I

STT cân (g) (g) (µg.g-1) Speak1
1 0.1072 1.0027 10.6987 141.362
2 0.1570 1.0489 14.9786 159.931
3 0.2021 1.0158 19.9097 209.275
4 0.2546 1.0102 25.2207 231.162
5 0.3020 1.0209 29.6026 284.684
6 0.3592 1.0255 35.0515 352.760
7 0.4094 1.0241 40.0047 373.027
Hình 7: Sắc ký đồ đường chuẩn của Sudan I

Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ của Sudan I
400
373.027
350 Speak
300
284.684
250
200 209.275 y = 7.8996x + 54.1721

150 R² = 0.9990
141.362
100
50
μg.g-1
0
10 15 20 25 30 35 40 45
Phương trình tuyến tính có dạng :
A = a + b*C
Trong đó:
C: nồng độ tính theo μg g-1.
a, b là các hệ số hồi quy.
 Tính các hệ số a,b.
n C i Ai   C i  Ai
n Ci  ( C i ) 2
b = 2 = 7.8996
C  A  C C A
2
i i i i i
a= = 54.1716
n Ci  ( C )
2 2
i
 Tính phương sai dư: Với n là số điểm trên đường chuẩn.
Sre2=
A i
2
 a Ai  b Ai Ci
= 15.525
n2

 Tính độ lệch chuẩn cho các hệ số hồi quy:
S a  S re
C i
2
= 4.9318
n C  ( C )
i
2
i
2
n
S b  S re
n Ci2  ( Ci ) 2
= 0.1805
 Khoảng tin cậy : Với bậc tự do f = n – 2 = 2, 𝑡0.95,𝑓 = 4.30

𝑆𝑎
𝜀𝑎 = 𝑡0.95,𝑓 × = 10.603
𝑛
𝑆𝑏
𝜀𝑏 = 𝑡0.95,𝑓 × = 0.388
𝑛
Phương trình hồi quy:
 A = (a   a ) + (b   b ) C
A = (54.2 ± 10.6) + (7.9 ± 0.4)C.
Tính LOD, LOQ:
𝑆𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑒 𝑁 + 𝑚
𝐿𝑂𝐷 = 𝑡0.95,𝑓 ×
𝑏 𝑁×𝑚
10
𝐿𝑂𝑄 = × 𝐿𝑂𝐷
3
Trong đó:
N: số điểm trên đường chuẩn.
m: số lần đo lặp lại để lấy tín hiệu trung bình của mẫu thử. (m=3)
f = N + m -2.
LOD = 0.98 μg.g-1 .

LOQ = 3.27 μg.g-1.

2.5.2. Sudan II: (pha từ Sudan II 100.6144 µg.g-1)
Lượng Tổng Sudan II

1 0.1072 1.0027 10.7568 171.436
2 0.1570 1.0489 15.0600 216.569
3 0.2021 1.0158 20.0179 281.525
4 0.2546 1.0102 25.3578 304.574
5 0.3020 1.0209 29.7635 355.005
6 0.3592 1.0255 35.2420 415.663
7 0.4094 1.0241 40.2222 422.551
Hình 9: Sắc ký đồ đường chuẩn của Sudan II

Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ của Sudan II.
450
Speak 415.663
400
y = 9.7719x + 65.5898
350 R² = 0.9968 355.005
300 304.574
250
216.569
200
171.436
150
μg.g-1
100
10 15 20 25 30 35 40
A = a + b*C
Trong đó:
C: nồng độ tính theo μg. g-1.
n Ci  ( C i ) 2
b = 2 = 9.7719
C  A  C C A
2
i i i i i
a= = 65.5901
n Ci  ( C )
2 2
i
Sre2=
A i
2
= 43.3801
n2

S a  S re
C i
2
= 8.079
n C  ( C )
i
2
i
2
n
S b  S re
n Ci2  ( Ci ) 2
= 0.324

𝑆𝑎
𝜀𝑎 = 𝑡0.95,𝑓 × = 11.5
𝑛
𝑆𝑏
𝜀𝑏 = 𝑡0.95,𝑓 × = 0.5
𝑛
 A = (a   a ) + (b   b ) C
A = (65.6 ± 11.5) + (9.8± 0.5)C.
Tương tự ta có giá trị LOD và LOQ như sau:
LOD = 1.21 μg.g-1

LOQ = 4.03 μg.g-1

2.5.3. Sudan III: (pha từ Sudan III 50.372 µg.g-1)
Lượng Tổng Sudan III

1 0.1072 1.0027 5.3853 127.321
2 0.1570 1.0489 7.5396 158.552
3 0.2021 1.0158 10.0217 192.033
4 0.2546 1.0102 12.6950 237.687
5 0.3020 1.0209 14.9007 267.500
6 0.3592 1.0255 17.6434 323.392
7 0.4094 1.0241 20.1367 331.580
Hình 11: Sắc ký đồ đường chuẩn của Sudan III

Hình 12: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ của Sudan III.
350
Speak 323.392
300
y = 15.7476x + 38.7870
267.500
250 R² = 0.9955
237.687
200
192.033
150 158.552
127.321
μg.g-1
100
5 7 9 11 13 15 17 19
A = a + b*C
Trong đó:
C: nồng độ tính theo μg.g-1.
n Ci  ( C i ) 2
b = 2 = 15.748
C  A  C C A
2
i i i i i
a= = 38.786
n Ci  ( C )
2 2
i
Sre2=
A i
2
= 29.476
n2

S a  S re
C i
2
= 6.393
n C  ( C )
i
2
i
2
n
S b  S re
n C  ( C i ) 2
2 = 0.528
i

𝑆𝑎
𝜀𝑎 = 𝑡0.95,𝑓 × = 7.3
𝑛
𝑆𝑏
𝜀𝑏 = 𝑡0.95,𝑓 × = 0.6
𝑛
 A = (a   a ) + (b   b ) C
A = (38.9 ± 7.3) + (15.7± 0.6)C.
LOD = 0.56 μg.g-1

LOQ = 1.87 μg.g-1

2.5.4. Sudan IV: (pha từ Sudan IV 99.9069 µg.g-1)
Lượng Sudan IV
STT Tổng (g) Speak
cân (g) (µg.g-1)
1 0.1053 2.0605 5.1057 99.072
2 0.1578 2.1114 7.4668 131.596
3 0.2160 2.1598 9.9916 166.441
4 0.2581 2.0617 12.5071 209.798
5 0.3034 2.0186 15.0162 241.695
Hình 13: Sắc ký đồ đường chuẩn của Sudan IV

Hình 14: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ của Sudan IV.
250
Speak 241.6950
230
210 209.7980
y = 14.6218x + 23.2464
190
R² = 0.9981
170 166.4410
150
130 131.5960
110
99.0720
90
70
μg.g-1
50
4 6 8 10 12 14 16
A = a + b*C
Trong đó:
C: nồng độ tính theo μg g-1.
n Ci  ( C i ) 2
b = 2 = 14.622
C  A  C C A
2
i i i i i
a= = 23.245
n Ci  ( C )
2 2
i
Sre2=
A i
2
= 8.408
n2

S a  S re
C i
2
= 3.915
n C  ( C )
i
2
i
2
n
S b  S re
n Ci2  ( Ci ) 2
= 0.369

𝑆𝑎
𝜀𝑎 = 𝑡0.95,𝑓 × = 5.6
𝑛
𝑆𝑏
𝜀𝑏 = 𝑡0.95,𝑓 × = 0.5
𝑛
 A = (a   a ) + (b   b ) C
A = (23.2 ± 5.6) + (14.6± 0.5)C.
LOD = 0.35 μg.g-1 .

LOQ = 1.17 μg.g-1 .
Nhận xét:
Do phương pháp này phụ thuộc vào quá trình chấm bản mỏng, khai triển sắc ký và
scan đo trên máy nên độ tuyến tính không cao lắm. Tuy nhiên giá trị R vẫn nằm trong
khoảng có thể chấp nhận được 0.99 < R <1.

Hình 15: Sắc ký đồ đường chuẩn của Sudan I, II, III.
Hình 16: Sắc ký đồ đường chuẩn của Sudan IV.

 Áp dụng trên mẫu bột càri:

Quá trình ly trích mẫu: [15]
Cân 2.5 g mẫu

vào ống ly tâm
50 mL Acetone
Ly tâm
trong 15 phút
Lọc
Cô cạn (60oC)
Định mức
Lấy 2 µL
chấm lên bản mỏng
Hình 17: Sắc ký đồ mẫu cari bột.

Hình 18: Sắc ký đồ đường chuẩn Sudan I và đo trên mẫu bột cari
Peak xuất hiện khi

thêm vào mẫu thật
Sudan I 10 µg.g-1.
 Qua tín hiệu thu được và qua vệt sắc ký trên bản mỏng thì trong mẫu bột càri trên
thị trường không phát hiện được sự hiện diện của các Sudan.

Kết luận:
Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc ký bản mỏng và
bản mỏng sử dụng là bản pha đảo kết hợp với Densitometer để xác định đồng thời Sudan
I - IV trong mẫu thực phẩm.
Trong phạm vi đề tài chúng tôi đã khảo sát và tối ưu hoá phương pháp xác định
đồng thời Sudan I – IV bằng sắc ký bản mỏng như sau:
- Điều kiện tối ưu cho việc tách bốn loại Sudan bằng sắc ký bản mỏng: hệ dung
môi giải ly sử dụng: MeOH – H2O – AcOH (80:15:5, v/v/v). Với hệ dung môi này tất cả
các Sudan đều được tách tốt. Thời gian khai triển là 20 phút, giá trị Rf của Sudan I, Sudan
II, Sudan III, Sudan IV lần lượt tương ứng là 0.30, 0.18, 0.11, 0.05.
- Các thông số chạy trên Densitometer là:
Sudan λmax(nm)
I 474
II 487
III 502
IV 513
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của bốn chất như sau:
Sudan LOD (µg.g-1) LOQ (µg.g-1)

I 0.98 3.27
II 1.21 4.03
III 0.56 1.87
IV 0.35 1.17

Qua đề tài cho thấy ngoài việc định tính nhanh một chất nào đó bằng sắc ký bản
mỏng, thì sắc ký bản mỏng khi kết hợp Densitometer còn có thể định lượng rất tốt với độ
nhạy và độ chính xác khá cao.
Tuy nhiên hạn chế của đề tại này là khi chấm lên bản mỏng là sử dụng một lượng
thể tích nhất định, nhưng khi pha các dung dịch chuẩn là định mức bằng cách cân, nên khi
chấm lên bản mỏng thì vệt sắc ký chỉ thể hiện được một phần của nồng độ trong dung
dịch, điều này gây ra khó khăn cho việc qui đổi ra khối lượng chất chuẩn trên mỗi vệt sắc
ký, vì vậy độ nhạy của phương pháp bị giảm đi nhiều lần.
Tóm lại, chúng tôi mong muốn đề tài này sẽ là một kinh nghiệm để cho những đề
tài sau tiếp tục những bước cải tiến, khắc phục những thiếu sót để hoàn thiện hơn một qui
trình phân tích dựa vào sắc ký bản mỏng kết hợp với thiết bị Densitometer.

Tài liệu tham khảo

[1] TS. Mai Thanh Truyết, Phẩm màu trong thực phẩm, Bài trao đổi trên đài
VOA, 2007.
[2] GS. Chu Phạm Ngọc Sơn, Phân tích phẩm màu Sudan trong trứng gia cầm,
Trung tâm đào tạo và phát triển sắc ký TP Hồ Chí Minh, 2007.
[3] Niltsu. K, Dyes Sudan I to IV in food, Federal Institute for Risk Assessment,
19 November 2003.
[4] Nguyễn Trọng Biểu; Từ Văn Mặc, Thuốc thử hữu cơ, NXB Khoa học và Kỹ
thuật Hà Nội, 1995.
[5] Material Safety Data Sheet Sudan IV MSDS, http://www.sciencelab.com,
2009.
[6] Cao Hữu Trượng; Hoàng Thị Lĩnh, Hoá học thuốc nhuộm, NXB Khoa học và
Kỹ thuật Hà Nội, 2002.
[7] Eric Mejia; Tongsheng Ding; Maria F. Mora; Carlos D. Garcia,
Determination of banned sudan dyes in chili powder by capillary electrophoresis, Food
Chemistry, 2007, 102, (4), 1027-1033.
[8] Du Meiju; Han Xiaogang; Zhou Zihao; Wu Shouguo, Determination of
Sudan I in hot chili powder by using an activated glassy carbon electrode, Food
Chemistry, 2007, 105, 883–888.
[9] Limin He; Yijuan Su; Binghu fang; Xiangguang Shen; Zhenling Zeng,
Yahong Liu, Determination of Sudan dye residues in eggs by liquid chromatography and
gas chromatography-mass spectrometry, Analytical Chimica Acta 594, 2007, 139-146.
[10] Erdal Ertas; Hayrethin Ozer; Cesarettin; Alasalvar, A rapid HPLC method for
determination of Sudan dyes and Para Red in red chilli pepper, Food Chemistry, 2007,
105, 756–760.
[11] Chu Thị Ngọc Anh, Khảo sát qui trình xác định Morin, Quercetin và Rutin
bằng phương pháp sắc ký bản mỏng - Fluorodensitometer trên hoa hòe và một số mẫu
thực phẩm, Luận văn thạc sĩ hóa học, 2008.

[12] Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐHQG
TPHCM, 2007.
[13] Karin Bauer; Leo Gros; Werner Sauer, Thin Layer Chromatography – Merck,
An introduction, 1990.
[14] S. Guffogg; P. A. Brown; S. G. Stangroom and C. A Sutherland, The
detection of Sudan I, II, III and IV in palm oil by thin layer chromatography, Food
Standards Agency, No. 52, December, 2004.
[15] Fabio Mazzotti; Leonardo Di Donna; Loredana Maiuolo; Anna Napoli;
Raffaele Salerno; Ashiff Sajjad; Giovanni Sindona, Assay of the Set of All Sudan Azodye
(I, II, III, IV, and Para-Red) Contaminating Agents by Liquid Chromatography-Tandem
Mass Spectrometry and Isotope Dilution Methodology, J. Agric. Food Chem. 2008, 56,
63–67.

KLTN - Sudan Trong Thuc Pham

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

KLTN - Sudan Trong Thuc Pham

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

GVHD: PGS.TS.

Nguyễn Thị Xuân Mai Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trần Thanh Tâm 1

1. Giới thiệu sơ lược về phẩm màu trong thực phẩm. [1]

2. Giới thiệu về Sudan:

SVTH: Trần Thanh Tâm 2

2.1.1. Sudan I. [4]

Colour Index Danh pháp và tên gọi khác

- Công thức phân tử: C16H12ON2.

Sudan I (Solvent Yellow 14)

Tính chất vật lý

SVTH: Trần Thanh Tâm 4

2.1.2. Sudan II. [4]

Colour Index Danh pháp và tên gọi khác

Sudan II (Solvent Orange 7)

2.1.3. Sudan III. [4]

Colour Index Danh pháp và tên gọi khác

- Công thức phân tử: C22H16N4O.

SVTH: Trần Thanh Tâm 5

- Công thức cấu tạo: HO

Sudan III (Solvent Red 23)

2.1.4. Sudan IV. [5]

Colour Index Danh pháp và tên gọi khác

- Công thức phân tử: C24H20N4O.

Sudan IV (Solvent Red 24)

SVTH: Trần Thanh Tâm 6

Tính chất vật lý

2.2. Tính chất hóa học. [6]

[H]: Chất khử mạnh.

SVTH: Trần Thanh Tâm 7

2.3. Hoạt tính sinh học. [3]

3. Các phương pháp xác định phẩm màu Sudan.

3.1. Phương pháp điện di mao quản. [7]

SVTH: Trần Thanh Tâm 8

3.2. Phương pháp điện hóa. [8]

3.3. Phương pháp sắc ký.

4. Các phương pháp xử lý mẫu thực phẩm có chứa Sudan.

4.1. Trường hợp mẫu đơn giản.

SVTH: Trần Thanh Tâm 9

4.2. Trường hợp mẫu phức tạp.

SVTH: Trần Thanh Tâm 10

5. Sơ lược về phương pháp sắc ký bản mỏng.

5.1. Nguyên tắc.

5.2. Các đại lượng đặc trưng.

5.2.1. Hệ số di chuyển Rf.

SVTH: Trần Thanh Tâm 11

Rx = Rf chất định phân / Rf chất chuẩn.

5.2.3. Số đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H:

SVTH: Trần Thanh Tâm 12

SVTH: Trần Thanh Tâm 13

SVTH: Trần Thanh Tâm 14

5.4. Pha động. [12]

- Bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh.

2. Pha động (dung môi giải ly).

3. Loại bình triển khai sắc ký.

4. Độ hấp phụ của dung môi.

5. Độ ẩm tương đối, hoặc

6. hoạt tính của pha tĩnh.

8. Kích thước của các hạt trên bề mặt pha tĩnh.

9. Kích thước của vết chấm.

SVTH: Trần Thanh Tâm 15

11. Gradient dung môi giải ly.

12. Sự dao động chất lượng của pha tĩnh.