Professional Documents
Culture Documents
223053859 SẮC KÝ CỘT
223053859 SẮC KÝ CỘT
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 3
NỘI DUNG …………………………………………………………….…………...4
Chương 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ …………………………………… 4
1. Lịch sử sắc ký …………………………………………………………………. 4
2. Định nghĩa sắc ký……………………………………………………………… 4
3. Các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật sắc ký …………………………………… 5
4. Phân loại sắc ký………………………………………………………………... 6
4.1. Phân loại theo bản chất của hai pha sử dụng ……………………………… 6
4.2. Phân loại theo bản chất tương tác………………………………………….. 7
4.3. Phân loại theo cấu hình ……………………………………………………. 8
Chương 2: SẮC KÝ CỘT HỞ ………………………………………...………….... 10
1. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT …………………………………………………….. 10
1.1. Cột…………………………………………………………………………...10
1.2. Các loại pha tĩnh dùng nhồi cột ……………………………………………. 10
1.2.1. Silica gel ……………………………………………………………... 10
1.2.2. Alumina …………………………………………………………….... 14
1.2.3. Kieselguhr – Celite …………………………………………………... 14
1.2.4. Gel …………………………………………………………………….14
1.3. Dung môi …………………………………………………………………... 15
1.3.1. Các dung môi thường dùng cho sác ký cột ………………………….. 15
1.3.2. Cách chọn dung môi thích hợp……………………………………….. 15
1.4. Mẫu sắc ký …………………………………………………………………. 15
2. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH ……………………………………………………. 16
2.1. Chuẩn bị cột ……………………………………………………………….. 16
2.2. Nạp mẫu cần tách lên cột sắc ký ……………………………………………17
2.2.1. Nạp mẫu dạng dung dịch …………………………………………….. 17
2.2.2. Nạp mẫu dạng bột khô ……………………………………………….. 18
2.3. Giải ly chất ra khỏi cột …………………………………………………….. 19
2.3.1. Các phương pháp giải ly ……………………………………………... 19
2.3.2. Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải
ly …………………………………………………………………………………… 20
1
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
2
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
MỞ ĐẦU
Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, hàng trăm
nghìn các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra và được nghiên cứu để phục vụ cho
nhiều lĩnh vực của cuộc sống. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp
các hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp các chất dẫn đường để
tổng hợp ra các loại thuốc mới. Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các
nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hợp chất có khả năng trị bệnh rất cao.
Vì vậy việc tách chiết, cô lập hợp chất thiên nhiên là công việc thật sự cần thiết.
Có nhiều phương pháp để tách chiêt, cô lập các hợp chất thiên nhiên từ cây cỏ. Một
trong những phương pháp thường hay dùng nhất là phương pháp sắc ký. Phương pháp
sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanh
chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là hóa học
các hợp chất thiên nhiên. Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho
phép ta ứng dụng nó ở mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện. Ngày nay, phương pháp sắc ký
được sử dụng để tách tất cả mọi hợp chất dù có màu hay không màu, dù trọng lượng
phân tử nhỏ hay lớn.
Do các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn
nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều ít khác nhau nên không thể nào có một kỹ thuật
sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. Trong bài báo cáo này, tôi xin giới thiệu
một phương pháp sắc ký thường dùng trong phòng thí nghiệm đó là Phương pháp Sắc
ký cột. Đối với người nghiên cứu về hóa học hợp chất thiên nhiên thì việc tìm hiểu sơ
bộ về sắc ký cột cũng như việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột là một việc vô cùng cần
thiết, có thể sử dụng hiệu quả vào trong công tác nghiên cứu của mình.
3
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
NỘI DUNG
Chương 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ
1. Lịch sử sắc ký
Từ ngữ sắc ký trong tiếng Anh là “chromatography” có xuất xứ từ chữ “chroma”
trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu. Năm 1903 nhà thực vật học người Nga
Mikhail Semyonovich Tsvett đã dùng cột nhôm oxit (có tài liệu nói cột canxi
cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ lá
cây. Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt
tên phương pháp này là phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi
màu vì đã tách được những chất có màu.
Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu
nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách
khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện
sắc ký cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau. Sự phát
triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không còn đúng theo ý nghĩa
ban đầu của nó. Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký đều có những nét chung
nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn hợp chất phân tích qua lớp chất
bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng mang trên chất rắn hoặc giấy và sự
chuyển dịch đó được thực hiện bằng một chất khí hoặc chất lỏng (pha động).
Trong những năm 1930, hàng loạt các nhà hóa học đã được vinh danh bằng giải
thưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ vào những thành công trong
việc sử dụng kỹ thuật sắc ký cột hấp phụ:
- 1937, P. KARRER (Thụy Sĩ) về hóa học Carotenoid đặc biệt là vitamin A và
vitamin B.
- 1938 R.KUHN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin.
- 1939 L.RIZICKA (Thụy Sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid.
- 1940 MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớp
silica gel và về sau phát triển sang sắc ký giấy. Hai ông được giải thưởng Nobel năm
1952 về sắc ký phân bố.
- 1948 TISLIUS (Thụy Điển) được giải Nobel về kỹ thuật điện di và sắc ký hấp
phụ.
4
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Hệ số phân chia là sự phân bố thí dụ: của 2 loại hợp chất ( ) và ( ) trong một hệ thống
gồm có hai pha: pha động và pha tĩnh
Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả
năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.
5
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống trơ về mặt hóa học đối với các chất
trong quá trình sắc ký, cột có thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng đứng gọi là “cột”
với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy
qua chất hấp phụ .
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxid nhôm, silica gel, CaCO3, than
hoạt tính, polyamid, các loại có gắn nhóm ion,… Các chất này phải được tiêu chuẩn
hóa.
Dung môi dùng có thể là một hoặc hỗn hợp nhiều loại dung môi có tỉ lệ thích
hợp. Quy trình rửa giải nói chung là sử dụng dung môi có tính chất hướng về một phía
hoặc tăng hoặc giảm về tính chất. Với các chất hấp phụ pha thuận cổ điển, dung môi
sử dụng có độ phân cực tăng dần.
Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt kết quả tốt hay không là tùy thuộc
vào hệ số phân chia (partition coeffiicient). Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vào
một hệ thống gồm có 2 pha (thí dụ: hai pha lỏng-lỏng hoặc rắn-lỏng), lúc đạt đến trạng
thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ
này thay đổi tùy vào các tính chất động học của các hợp chất và của cả hai pha
Hệ số phân chia K được biểu diễn như sau:
Cs Noàng ñoäcuû
a caù
c hôïp chaá t trong phatónh
K= =
Cm Noà
ng ñoäcuû
a hôïp chaát trong pha ñoäng
Mỗi hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha, vì thế sẽ có tương tác
mạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi hợp chất sẽ di chuyển ngang qua
pha tĩnh với một vân tốc khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại
hợp chất.
4. Phân loại sắc ký
4.1. Phân loại theo bản chất hai pha sử dụng
Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh và pha động, người ta phân biệt một số kỹ
thuật sắc ký khác nhau.
- Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh tách riêng các hợp chất
trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp phụ của nó.
+ Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumina hoặc silica gel đã được xử lý, có thể
được nạp nén vào trong một cột hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề
mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa.
6
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất
mang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn lên trên chất mang rắn.
- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký khí
+ Pha động là chất lỏng: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc
ký cột.
4.2. Phân loại theo bản chất tương tác
Sắc ký phân chia:
* Pha động: chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
* Pha tĩnh là chất lỏng, đó là một lớp chất lỏng với chiều dài thật mỏng, chất
lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn, có trơ.
Sắc ký hấp phụ:
* Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
* Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi
trong một cái ống. Những hạt rắn trơ này cũng giống như những hạt rắn trong sắc ký
phân chia, nhưng không có phủ chất lỏng bên ngoài, bản thân hạt rắn là pha tĩnh.
Tiêu biểu của sắc ký hấp phụ. Pha tĩnh rắn là những hạt rắn, nhuyễn, trơ
7
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
8
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
9
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường thì hợp chất không hoặc
kém phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau.
Còn trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha đảo thì những hợp chất phân cực sẽ
giải ly ra khỏi trước và những chất phân cực kém sẽ giải ly sau.
10
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
11
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Silica gel
Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cổ điển có đường kính hạt trung bình khoảng
40-200µm, các lỗ rỗng có đường kính trung bình khoảng 40-300A°, diện tích bề mặt
khoảng 100-800 m2/g.
Các vị trí hoạt động trên bề mặt của hạt silica gel là các nhóm silanol, mỗi nhóm
cách nhau 5A°. Đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với
những hợp chất được sắc ký. Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những
hợp chất phân cực (có mang nhóm chức -OH, -NH 2, -COOH...) có khả năng tạo nối
hydro mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly ra chậm hơn so với những
chất khác có tính kém phân cực như alkan, terpen (là những hợp chất không chứa
những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột
sớm.
- Muốn điều chỉnh hoạt tính bề mặt của silica gel chỉ cần thêm hoặc loại bỏ
nước. Khi silica gel hấp phụ nước, các phân tử nước sẽ che khuất những vị trí hoạt
động trên bề mặt của hạt silica gel làm hạt bị giảm hoạt tính; muốn silica gel hoạt tính
trở lại, chỉ cần đun nóng để loại bỏ nước. Đây là quá trình thuận nghịch, muốn làm
giảm hoạt tính silica gel thì chỉ cần cho thêm nước vào. Tuy nhiên, khi đun nóng
khoảng 400-500°C, quá trình thuận nghịch biến mất, silica gel bị mất vĩnh viễn hoạt
tính bề mặt, do hai nhóm silanol kề bên mất một phân tử nước, tạo thành nối eter,
không còn tính sắc ký.
12
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
- Có thể hiệu chỉnh tính của silica gel bằng cách cho silica gel kết hợp với
những hợp chất khác như base, các dung dịch đệm ở mức pH xác định. Cũng có thể
thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả năng tách các hợp chất, nhất là alken.
Tuy nhiên cũng cần nhớ là với một hợp chất nào đó đang bị silica gel giữ lại
trong cột, giải ly chất đó ra khỏi cột được hay không cũng còn tùy vào việc sử dụng
dung môi giải ly có độ phân cực mạnh hay yếu. Dung môi nào có thể tạo nối hydrogen
mạnh sẽ là dung môi thích hợp để giải ly các hợp chất phân cực mạnh ra khỏi cột silica
gel. Hơn nữa, muốn đuổi hết các hợp chất phân cực thí dụ các flavonoid, triterpen
glycosid nên dùng 1-2% acid axetic trong metanol.
* Silica gel chế hóa: được điều chế bằng cách cho các nhóm chức silanol của
silica tác dụng với nhiều loại clorur silil khác nhau để tạo thành những loại chất hấp
phụ mới, với các đặc tính vật lý đổi khác, được gọi là silica gel-tạo nối. Có thể chế hóa
thành silica gel-tạo nối dùng cho pha thường hoặc pha đảo.
- Silica gel tạo nối dùng cho pha đảo: Cho silica gel tác dụng với
clorodimetylalkylsilan R-Si(CH3)2-Cl để tạo silica gel mới có tính không phân cực.
Dây alkyl R thường là C-1, C-2, C-4, C-6, C-8, và C-18. Tuy nhiên, thường hay chế
tạo dây C-8 và C-18. Silica gel pha đảo có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực
và giữ chặt các hợp chất này lại trong cột. Pha động thường là nước, sau đó thêm vào
các dung môi hữu cơ để làm giảm độ phân cực của dung môi giải ly, như thế chất phân
cực sẽ giải ly ra khỏi cột trước, và những chất kém phân cực sẽ ra sau.
13
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Cấu trúc và tên gọi một số loại silica gel-tạo nối dùng cho pha thường
- Silica gel tạo nối dùng cho sắc ký thủ tính:
Hoạt tính sinh học của những hợp chất thủ tính đặc trưng tùy theo hóa học lập
thể của chúng. Có đối phân có hoạt tính chữa bệnh trong khi đối phân còn lại không có
được tính đó, mà lại có khi còn độc hại, vì thế nhất thiết phải tách riêng chúng. Nhưng
hai đối phân có đặc tính vật lý giống nhau, cùng độ hòa tan vào cùng một loại dung
môi nào đó, nên không thể sử dụng sắc ký để tách chúng được, cho dù sử dụng silica
gel pha thường hay pha đảo, cột thường hay cột hiệu năng cao HPLC.
Có nhiều loại silica gel thương phẩm sử dụng cho sắc ký thủ tính với cơ chế lưu
giữ chất khác nhau, một số những chất đó sử dụng silica gel làm chất nền.
Bảng 1: Phân loại một vài pha tĩnh thủ tính
Loại pha thủ tính Cơ chế bắt giữ chất của pha tĩnh
Pirkle Tương tác qua ba điểm
Polymer hình xoắn ốc - thủ tính
Các nối kỵ nước (hydrophobic bond)
(polysaccarid)
Tương tác giữa chủ-khách (tương tác giữa chất
Cyclodextrin và eter vòng
tan đối với lỗ rỗng có tính thủ tính của chủ là
(Crown ether)
cyclodextrin)
Enzym bị giữ cố định Ái lực thủ tính
14
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
(Immobilised)
Phức amino acid kim loại Phức xuyên lập thể phân
1.2.2. Alumina
Alumina là oxid aluminium Al2O3, được điều chế qui trình tương tự như silica
gel nhưng trên nguyên liệu là hydroxid aluminium, hơn thế nữa có thể điều chỉnh độ
pH của dung dịch phản ứng để sản xuất ra hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính
kiềm hay trung tính.
- Alumina base: chứa khoảng 0,1-0,5% NaOH bám trên mặt alumina ở dạng
natri aluminat, có pH ≈ 10.
- Alumina trung tính: pH từ 6,5-7
- Alumina axit: pH ≈ 4
Alumina
Nhiệt độ lúc hoạt hóa trong quá trình điều chế là đặc điểm khác nhau giữa
alumina và silica gel. Muốn có alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun nóng alumina ở
400-450oC trong 12-16 giờ. Muốn giảm hoạt tính alumina, thêm nước vào.
1.2.3. Kieselguhr-Celite
Kieselguhr và Celite là loại đất sét diatomit. Nguyên liệu này có các lỗ rỗng
lớn, diện tích bề mặt lớn và có tính hấp phụ rất yếu. Khả năng hấp phụ còn có thể giảm
hơn nữa bằng cách cho tác dụng với dung dịch HCl 3%, rửa sạch clor và sấy khô ở
80oC. Với các tính chất trên, nó được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân chia.
1.2.4. Gel
Gel là tên gọi chung cho các loại pha tĩnh được điều chế từ tinh bột, agar
(polysaccarid) hoặc polyacrylamid, trong đó các chuỗi dây dài được nối mạng ngang
để tạo thành mạng không gian 3 chiều.
15
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
16
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Mẫu thử trước khi phân tích phải được loại tạp chất bằng phương pháp thích
hợp. Mẫu thử có thể ở 2 dạng:
- Dạng dung dịch khá đậm đặc: hòa tan mẫu trong dung môi không quá phân
cực so với hệ dung môi pha động. VD: Pha động là benzen-EtOAc thì tốt nhất là hòa
tan mẫu trong benzene, nếu mẫu không tan trong benzene thì dùng dung môi phân cực
hơn benzene một chút.
- Dạng bột khô: hòa tan mẫu trong dung môi như etyl axetat hoặc methanol,
thêm vào silica gel hạt lớn vừa đủ, cô quay hỗn hợp để đuổi hết dung môi thu được
mẫu ở dạng bột mịn tơi xốp.
Mẫu dạng dung dịch đậm đặc Mẫu dạng bột khô
2. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH
2.1. Chuẩn bị cột: Yêu cầu là chất rắn làm cột phải phân tán đồng đều ở mọi điểm
trong cột thành một khối đồng nhất.
- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). Kẹp cột thẳng
đứng trên giá.
- Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột. Có 2 cách nhồi cột: nhồi
cột ướt và nhồi cột khô.
+ Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được nạp vào cột ở dạng sệt, được chuẩn bị như
sau:
Trong 1 becher có chứa sẵn dung môi, cho chất hấp phụ
từng lượng nhỏ và đều đặn vào becher, vừa cho vừa khuấy đều.
Đặt lên đầu cột một phễu lọc đuôi dài, rót hỗn hợp sệt vào
cột, mở nhẹ khóa bên dưới cột cho dung môi chảy qua, hứng
dung môi vào một becher trống, dung môi này được sử dụng lại
để rót lên đầu cột.
17
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng 1 thanh cao su
gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp phụ nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài lần để việc
nạp cột được chặt chẽ cho đến khi thấy chất hấp phụ trong cột có dạng đồng nhất và
mặt thoáng chất hấp phụ ở đầu cột phải nằm ngang. Không được để đầu cột bị khô,
nghĩa là dung môi phải luôn phủ trên phần đầu cột.
- Nhồi cột khô: Cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều
cao cột.
Cho chất hấp phụ ở dạng bột khô vào thẳng trong cột qua phễu lọc đuôi dài, đều
đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp chất hấp phụ
đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột thì mở nhẹ khóa cho dung môi chảy ra,
hứng dung môi và 1 becher trống, dung môi được sử dụng lại để rót trở lại lên đầu cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần đến khi thấy
chất hấp phụ trong cột có dạng đồng nhất.
Lưu ý: Quá trình nhồi cột phải thực hiện một cách cẩn thận, nếu quan sát thấy
có nhiều bọt khí hoặc có những bất thường trong cột thì phải xả hết cột và nạp lại từ
đầu.
18
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
- Đóng khóa lại, dùng pipette hút dung dịch mẫu chất và nạp vào đầu cột. Muốn
nạp mẫu đặt đầu của pipette gần sát với mặt thoáng của chất hấp phụ trong cột, vừa
bóp vừa rây pipette dọc quanh thành trong của cột, cho dung dịch chất chảy ra dọc
theo thành trong của cột chạm xuống bề mặt của chất hấp phụ .
- Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm
cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp phụ trên đầu
cột.
- Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu
cột, dùng dung môi này để rửa sạch dung dịch mẫu chất đã dính
trên thành cột. Tiếp tục mở khóa cho dung môi chảy qua. Lặp
lại vài lần như thế để dung dịch mẫu thấm sâu vào phần chất
hấp phụ ở phần đầu cột và phần dung môi trên đầu cột trở nên
trong suốt.
- Cho một lớp cát (hoặc bông gòn) dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt
thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ mặt cột.
Sau khi nạp mẫu xong cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
19
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu cần sắc ký (Xg) được hoà tan trong
dung môi như etylaxetat hoặc metanol (50Xg) cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn
(10Xg). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ
mẫu sắc ký đã được tẩm đều lên bề mặt của những hạt silica gel.
Đặt mẫu bột khô này lên trên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại chọn để bắt
đầu quá trình sắc ký cột) thấm ướt phần bột silica gel. Cho một lớp cát dầy khoảng 3-6
mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ bề mặt. Cuối cùng cho
dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
2.3. Giải ly chất ra khỏi cột
2.3.1. Các phương pháp giải ly
- Giải ly nhờ vào trọng lực: các hạt gel nạp cột phải có kích thước lớn hơn
60µm. Nếu sử dụng những hạt gel có kích thước nhỏ hơn, dung môi ra khỏi cột rất
chậm và cần phải nhờ đến một lực để có thể ra khỏi cột.
- Giải ly sử dụng lực đẩy: dùng máy bơm tạo áp lực để đẩy dung môi đi ngang
qua pha tĩnh. Sử dụng hạt gel có kích thước 40-63 µm và cột sắc ký phải có thành dầy
với lớp bao lưới che chắn bên ngoài để tránh khi sử dụng áp suất cao, cột có thể bị nổ
vỡ.
Hai loại dụng cụ giúp đẩy dung môi vào đầu cột cho sắc ký chớp nhoáng
- Giải ly sử dụng lực hút: dùng máy bơm hút tạo chân không ở đầu ra của cột.
Kỹ thuật này cũng cho kết quả tương tự như trên, nhưng việc thu lấy dung môi giải ly
có phần kém thuận tiện vì phải ngưng tạo chân không, tháo thiết bị để rót dung môi ra.
Tuy vậy kỹ thuật này an toàn hơn.
20
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
21
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Hằng số Độ tan
Nhiệt độ sôi Chỉ số Độ nhớt
Dung môi điện môi ε ở trong nước
(oC) phân cực (mN.S.m-2)
25oC (%w/w)
22
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Vận tốc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân
bằng với chất hấp phụ) cũng không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời
gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấu quá
trình tách.
Thông thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly khoảng 5-50 giọt/phút hoặc
1-2 cm/phút.
Ví dụ: “Chiết dịch từ lá xanh” Dung môi sử dụng là dung môi nào? Vận tốc chảy
của dung môi?
Lấy 10g lá rau muốn còn tươi (khoảng 30 lá) cắt nhỏ cho vào cối sứ (bỏ gân lá),
trộn thêm 2g bột CaCO3 để trung hòa dịch axit của tế bào. Nghiền các lá đến khi thành
một thể đồng nhất. Cho 10 -15ml aceton 80% hoặc cồn etylic 90% vào cối sứ và khuấy
đều, để 5 phút rồi lọc bằng bông và bằng phễu thuỷ tinh, dung dịch thu được trộn với
2ml toluen rồi chiết bằng phễu chiết, lấy phần trên được dịch mẫu. Tiến hành sắc ký
cột.
Sau khi nạp silica gel vào buret đạt chiều cao cột khoảng 10-20cm, bột đường
glucozơ 20-30cm, bột canxi cacbonat nạp khoảng 15-20cm.
Dung môi sử dụng là các hệ: ete dầu hoả-aceton; toluen-aceton; toluen-cồn
etylic; aceton-HCl đặc; NH4NO3 4M - NH3 4M; CH3COOH 1,5M - CH3COONH4
1,5M.
Vận tốc chảy của dung môi giải ly khoảng 15- 20 giọt/phút.
2.3.4. Theo dõi quá trình giải ly cột
- Với mẫu có màu: quan sát bằng mắt thường ta thấy các dãy lớp có màu sắc
khác nhau đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly
khỏi cột.
Các chất có màu sắc khác nhau tách xa nhau trong cột
23
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Sử dụng sắc ký bản mỏng để kiểm tra mỗi dãy màu có một hay nhiều chất
- Với các mẫu không màu: hứng dung dịch giải ly trong những hủ bi có thể tích
như nhau và đánh số thứ tự. Dung dịch trong những hủ bi hứng được sẽ được sắc ký
lớp mỏng trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có sắc ký bản mỏng giống nhau sẽ
được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém các
phân đoạn này sẽ cho cao của các phân đoạn đó. Chỉ ngưng cột khi thu được lượng cao
các phân đoạn bằng 70-80% trọng lượng mẫu đã nạp vào đầu cột.
2.3.5. Ghi nhận kết quả sắc ký
- Phân đoạn thu được là một chất tương đối sạch tuy vẫn có chứa một ít tạp
chất: khi trên bản mỏng có một vết chính chiếm 80%, ngoài ra còn một số vết mờ.
- Phân đoạn thu được là hỗn hợp nhiều chất: khi trên bản mỏng có nhiều vết,
các vết có độ đậm như nhau.
- Để kiểm tra xem một hợp chất có tinh khiết hay không ta sử dụng sắc ký lớp
mỏng lần lượt với 3 hệ dung môi giải ly hoàn toàn khác hẳn nhau (không dùng một hệ
dung môi với 3 tỉ lệ khác nhau). Nếu chất chỉ cho hiện ra một vết duy nhất thì có thể
kết luận là chất tinh khiết. Nếu chất không tinh khiết thì sẽ cho thấy bên cạnh vết chính
có thêm vết khác. Muốn khảo sát rõ hơn thì dùng HPLC.
2.4. Xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất
Chỉ nên tìm cách xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất tinh khiết sau khi
đã kết tinh nhiều lần trong dung môi phù hợp (độ tinh khiết 95%).
Kết quả khảo sát cấu trúc hóa học của một hợp chất theo các chi tiết sau:
- Mô tả hình dạng, màu sắc và mùi của sản phẩm.
- Sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi gì, thuốc hiện hình gì, giá trị Rf của vết,
hình chụp bản mỏng.
- Điểm nóng chảy.
- Năng lực triền quang.
- Khối phổ.
24
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
25
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
26
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
+ Nạp mẫu dạng ướt: mẫu được hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi,
dùng ống nhỏ giọt đặt dung dịch mẫu phủ lên trên đầu cột và để yên một lúc cho dung
môi bay đi.
+ Nạp mẫu dạng khô: hòa tan mẫu trong một dung môi dễ bay hơi như dietyl
ete hoặc diclorometan vào một becher, cho vào một lượng chất hấp phụ loại dùng cho
sắc ký cột với trọng lượng gấp năm lần lượng mẫu, trộn đều rồi cô quay thu hồi dung
môi sẽ có được bột rắn khô. Phủ lớp bột này lên trên đầu cột đã nhồi lúc nãy. Sau cùng
phủ một lớp cát (hoặc bông gòn) lên trên đầu cột để bảo vệ mặt thoáng của cột.
27
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
28
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
cổ điển, đầu cột được ráp nối với một hệ thống bơm nén có áp lực trung bình, áp lực
có thể điều chỉnh. Hơi nén từ trên đầu cột đẩy dung môi xuyên xuống lớp chất hấp phụ
nhanh hơn.
29
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
trong10-15 phút. Có thể tách rất tốt hỗn hợp có khoảng 4 chất.
- Thiết bị đơn giản, rẻ tiền so với HPLC.
₪ Nhược điểm:
- Độ phân giải trung bình (lớn hơn 0.15).
- Không tách được hỗn hợp phức tạp hay tách riêng chất cần phân lập mà chỉ
thu được các phân đoạn chứa chất cần phân lập.
- Để thực hiện cần phải có máy bơm nén khí và mộ tbộ phận gồm những cột và
những nắp vặn kín chuyên dụng, có kích thước từ nhỏ đến lớn. Những bộ phận này
tương đối đắt tiền nếu so với sắc ký cổ điển.
Ứng dụng: Sắc ký cột nhanh được sử dụng để tách các phân đoạn đơn giản từ
hỗn hợp phức tạp. Sau đó đưa các phân đoạn này lên sắc ký cột cổ điển để tách thành
các phân đoạn tinh khiết.
3. Sắc ký nhanh - cột khô (Dry-column flash chromatography; Vacuum liquid
chromatography – VLC)
- Dụng cụ: Phễu lọc xốp bằng thủy tinh, bình tam giác, hệ thống tạo chân
không nhẹ bằng vòi nước.
30
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
Lưu ý: lớp silica gel chỉ dày tối đa 5 cm (gia tăng theo đường kính, không
tăng theo chiều cao).
Bảng 4: Mối liên quan giữa lượng mẫu và kích thước phễu trong sắc ký nhanh-cột
khô
Đường kính trong Chiều cao Phân đoạn dung
Lượng mẫu
của phễu (cm) Lớp hấp phụ (cm) dịch giải ly (ml)
< 100 mg 0,5 – 1,0 4 10 – 15
0,5 – 1,0 g 2,0 – 3,0 4 15 – 20
1,0 – 10,0 g 5 5 30 – 50
10,0 – 20,0 g 10 5 50
- Cân bằng cột sắc ký:
+ Đặt một lớp bông gòn dày lên bề mặt pha tĩnh để bảo vệ lớp mặt.
+ Cho một lượng lớn dung môi (loại dung môi ít phân cực nhất) lên đầu cột,
cho hệ thống tạo áp suất kém hoạt động, dung môi được hút xuống đi qua cột và được
hứng vào bình tam giác. Lượng dung môi này được sử dụng để cho lại lên đầu cột.
Thực hiện vài lần đến khi thấy chất hấp phụ trong cột đồng nhất.
- Nạp mẫu lên đầu cột: tháo miếng bông gòn bảo vệ bề mặt
+ Nạp mẫu ướt: cột được hút khô tương đối, tắt máy áp suất kém. Hòa tan
mẫu trong dung môi ít phân cực sau đó phủ đều lên khắp bề mặt silica gel. Gắn máy áp
suất kém.
+ Nạp mẫu khô: cho lượng mẫu khô lên đầu cột, gõ nhẹ và trải đều mẫu thành
một lớp mỏng.
Sau khi nạp mẫu lên đầu cột, lấy lớp bông gòn phủ lại lên trên mặt cột.
- Giải ly: Cho máy bơm tạo áp suất kém hoạt động. Rót một thể tích dung môi
nhất định lên bề mặt phễu (bảng 4), dung môi được hút xuống bình tam giác bên dưới.
Chờ cho phễu khô tương đối, ngắt áp suất, rót phần dung dịch vừa giải ly vào các lọ có
đánh số thứ tự. Tiếp tục cho dung môi giải ly vào phễu và lặp lại các thao tác như trên.
Mỗi lần phải hút khô phễu rồi mới cho dung môi mới. Dung môi giải ly được sử dụng
lần lượt từ không phân cực đến phân cực.
Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký nhanh-cột khô
₪ Ưu điểm:
- Dụng cụ dễ tìm.
- Thời gian sắc ký nhanh nhờ lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly.
31
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
- Thuận tiện cho người thao tác: quá trình thực hiện có thể bị gián đoạn mà
không bị ảnh hưởng.
₪ Nhược điểm:
- Không tách ngay thành chất tinh khiết được (trừ những hỗn hợp đơn giản hay
các vết cách xa nhau).
- Phải có dụng cụ thích hợp (phễu lọc xốp; hệ thống hút).
Ứng dụng:
- Tách hỗn hợp thành vài phân đoạn có độ phân cực khác nhau, mỗi phân đoạn
gồm ít chất hơn để dễ dàng phân lập tiếp bằng sắc ký cột cổ điển.
- Hoạt động đơn giản nên được ứng dụng rộng trong lĩnh vực hợp chất thiên
nhiên. Thích hợp đối với dịch chiết dược liệu thô.
- Giúp định hướng trong thử nghiệm sinh học một cách tập trung và ít lãng phí.
32
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
KẾT LUẬN
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế
giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện
cuộc sống ngày càng cao nên đòi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để
đáp ứng nhu cầu.
Ngày nay, phương pháp sắc ký là phương pháp chủ đạo để phân lập các hợp
chất tự nhiên cũng như tổng hợp. Nó đã có những đóng góp to lớn trong quá trình
phân lập các dược chất từ dược liệu. Qua đó chứng minh được dược tính và giúp bào
chế ra các thuốc có hoạt chất từ dược liệu với độ tinh khiết cao góp phần làm tăng
hiệu quả điều trị cũng như giảm các tác dụng phụ. Ngoài ra, kỹ thuật sắc ký càng có
vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu
cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất…
Vì vậy, với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương pháp sắc ký
phù hợp để phân tích mẫu tương ứng./.
33
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
34