Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 3
NỘI DUNG …………………………………………………………….…………...4
Chương 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ …………………………………… 4
1. Lịch sử sắc ký …………………………………………………………………. 4
2. Định nghĩa sắc ký……………………………………………………………… 4
3. Các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật sắc ký …………………………………… 5
4. Phân loại sắc ký………………………………………………………………... 6
4.1. Phân loại theo bản chất của hai pha sử dụng ……………………………… 6
4.2. Phân loại theo bản chất tương tác………………………………………….. 7
4.3. Phân loại theo cấu hình ……………………………………………………. 8
Chương 2: SẮC KÝ CỘT HỞ ………………………………………...………….... 10
1. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT …………………………………………………….. 10
1.1. Cột…………………………………………………………………………...10
1.2. Các loại pha tĩnh dùng nhồi cột ……………………………………………. 10
1.2.1. Silica gel ……………………………………………………………... 10
1.2.2. Alumina …………………………………………………………….... 14
1.2.3. Kieselguhr – Celite …………………………………………………... 14
1.2.4. Gel …………………………………………………………………….14
1.3. Dung môi …………………………………………………………………... 15
1.3.1. Các dung môi thường dùng cho sác ký cột ………………………….. 15
1.3.2. Cách chọn dung môi thích hợp……………………………………….. 15
1.4. Mẫu sắc ký …………………………………………………………………. 15
2. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH ……………………………………………………. 16
2.1. Chuẩn bị cột ……………………………………………………………….. 16
2.2. Nạp mẫu cần tách lên cột sắc ký ……………………………………………17
2.2.1. Nạp mẫu dạng dung dịch …………………………………………….. 17
2.2.2. Nạp mẫu dạng bột khô ……………………………………………….. 18
2.3. Giải ly chất ra khỏi cột …………………………………………………….. 19
2.3.1. Các phương pháp giải ly ……………………………………………... 19
2.3.2. Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải
ly …………………………………………………………………………………… 20

1
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

2.3.3. Vận tốc giải ly ……………………………………………….………. 21

2.3.4. Theo dõi quá trình giải ly cột …………………………………………22
2.3.5. Ghi nhận kết quả sắc ký ………………………………………………23
2.4. Xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất ……………………………… 23
3. ƯU, NHƯỢC ĐIỂM VÀ ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ CỘT HỞ …………… 24
3.1. Ưu điểm ……………………………………………………………………. 24
3.2. Nhược điểm ………………………………………………………………... 24
3.3. Ứng dụng …………………………………………………………………... 24
Chương 3: MỘT VÀI KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT KHÁC ……………………….. 25
1. Sắc ký cột khô ………………………………………………………………… 25
2. Sắc ký cột nhanh ………………………………………………………………. 27
3. Sắc ký nhanh cột khô ………………………………………………………….. 29
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………………..... 33

2
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

MỞ ĐẦU
Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, hàng trăm
nghìn các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra và được nghiên cứu để phục vụ cho
nhiều lĩnh vực của cuộc sống. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp
các hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp các chất dẫn đường để
tổng hợp ra các loại thuốc mới. Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các
nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hợp chất có khả năng trị bệnh rất cao.
Vì vậy việc tách chiết, cô lập hợp chất thiên nhiên là công việc thật sự cần thiết.
Có nhiều phương pháp để tách chiêt, cô lập các hợp chất thiên nhiên từ cây cỏ. Một
trong những phương pháp thường hay dùng nhất là phương pháp sắc ký. Phương pháp
sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanh
chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là hóa học
các hợp chất thiên nhiên. Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho
phép ta ứng dụng nó ở mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện. Ngày nay, phương pháp sắc ký
được sử dụng để tách tất cả mọi hợp chất dù có màu hay không màu, dù trọng lượng
phân tử nhỏ hay lớn.
Do các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn
nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều ít khác nhau nên không thể nào có một kỹ thuật
sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. Trong bài báo cáo này, tôi xin giới thiệu
một phương pháp sắc ký thường dùng trong phòng thí nghiệm đó là Phương pháp Sắc
ký cột. Đối với người nghiên cứu về hóa học hợp chất thiên nhiên thì việc tìm hiểu sơ
bộ về sắc ký cột cũng như việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột là một việc vô cùng cần
thiết, có thể sử dụng hiệu quả vào trong công tác nghiên cứu của mình.

3
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

NỘI DUNG
Chương 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ
1. Lịch sử sắc ký
Từ ngữ sắc ký trong tiếng Anh là “chromatography” có xuất xứ từ chữ “chroma”
trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu. Năm 1903 nhà thực vật học người Nga
Mikhail Semyonovich Tsvett đã dùng cột nhôm oxit (có tài liệu nói cột canxi
cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ lá
cây. Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt
tên phương pháp này là phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi
màu vì đã tách được những chất có màu.
Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu
nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách
khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện
sắc ký cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau. Sự phát
triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không còn đúng theo ý nghĩa
ban đầu của nó. Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký đều có những nét chung
nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn hợp chất phân tích qua lớp chất
bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng mang trên chất rắn hoặc giấy và sự
chuyển dịch đó được thực hiện bằng một chất khí hoặc chất lỏng (pha động).
Trong những năm 1930, hàng loạt các nhà hóa học đã được vinh danh bằng giải
thưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ vào những thành công trong
việc sử dụng kỹ thuật sắc ký cột hấp phụ:
- 1937, P. KARRER (Thụy Sĩ) về hóa học Carotenoid đặc biệt là vitamin A và
vitamin B.
- 1938 R.KUHN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin.
- 1939 L.RIZICKA (Thụy Sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid.
- 1940 MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớp
silica gel và về sau phát triển sang sắc ký giấy. Hai ông được giải thưởng Nobel năm
1952 về sắc ký phân bố.
- 1948 TISLIUS (Thụy Điển) được giải Nobel về kỹ thuật điện di và sắc ký hấp
phụ.

4
 Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

2. Định nghĩa sắc ký

- Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906): sắc ký là một phương pháp tách trong
đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống
đang chảy.
- Định nghĩa của IUPAC (1993): sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu
tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn
pha kia chuyển động theo một hướng xác định. Trong sắc ký cột, pha tĩnh được giữ
trong một cột ngắn và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hoặc do
trọng lực.
- Hiện nay: sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự
phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh.
3. Các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật sắc ký
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn
hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.
§
Pha tĩnh Pha động
(Stationar phase) (Mobile phase)

Lúc khởi đầu

Các thành phần của hỗn hợp

phân bố khác nhau vào hai
pha

Nhận xét:Hợp chất ( ) có ái Trạng thái cân bằng, các

lực mạnh hơn đối với pha tĩnh thành phần của hỗn hợp đã
phân bố giữa hai pha theo
một tỉ lệ nhất định

Hệ số phân chia là sự phân bố thí dụ: của 2 loại hợp chất ( ) và ( ) trong một hệ thống
gồm có hai pha: pha động và pha tĩnh

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả
năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.
5
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống trơ về mặt hóa học đối với các chất
trong quá trình sắc ký, cột có thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng đứng gọi là “cột”
với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy
qua chất hấp phụ .
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxid nhôm, silica gel, CaCO3, than
hoạt tính, polyamid, các loại có gắn nhóm ion,… Các chất này phải được tiêu chuẩn
hóa.
Dung môi dùng có thể là một hoặc hỗn hợp nhiều loại dung môi có tỉ lệ thích
hợp. Quy trình rửa giải nói chung là sử dụng dung môi có tính chất hướng về một phía
hoặc tăng hoặc giảm về tính chất. Với các chất hấp phụ pha thuận cổ điển, dung môi
sử dụng có độ phân cực tăng dần.
Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt kết quả tốt hay không là tùy thuộc
vào hệ số phân chia (partition coeffiicient). Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vào
một hệ thống gồm có 2 pha (thí dụ: hai pha lỏng-lỏng hoặc rắn-lỏng), lúc đạt đến trạng
thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ
này thay đổi tùy vào các tính chất động học của các hợp chất và của cả hai pha
Hệ số phân chia K được biểu diễn như sau:
Cs Noàng ñoäcuû
a caù
c hôïp chaá t trong phatónh
K= =
Cm Noà
ng ñoäcuû
a hôïp chaát trong pha ñoäng

Mỗi hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha, vì thế sẽ có tương tác
mạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi hợp chất sẽ di chuyển ngang qua
pha tĩnh với một vân tốc khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại
hợp chất.
4. Phân loại sắc ký
4.1. Phân loại theo bản chất hai pha sử dụng
Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh và pha động, người ta phân biệt một số kỹ
thuật sắc ký khác nhau.
- Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh tách riêng các hợp chất
trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp phụ của nó.
+ Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumina hoặc silica gel đã được xử lý, có thể
được nạp nén vào trong một cột hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề
mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa.

6
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

+ Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất
mang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn lên trên chất mang rắn.
- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký khí
+ Pha động là chất lỏng: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc
ký cột.
4.2. Phân loại theo bản chất tương tác
 Sắc ký phân chia:
* Pha động: chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
* Pha tĩnh là chất lỏng, đó là một lớp chất lỏng với chiều dài thật mỏng, chất
lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn, có trơ.
 Sắc ký hấp phụ:
* Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
* Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi
trong một cái ống. Những hạt rắn trơ này cũng giống như những hạt rắn trong sắc ký
phân chia, nhưng không có phủ chất lỏng bên ngoài, bản thân hạt rắn là pha tĩnh.

Tiêu biểu của sắc ký hấp phụ. Pha tĩnh rắn là những hạt rắn, nhuyễn, trơ

7
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

 Sắc ký trao đổi ion:

Tiêu biểu của sắc ký trao đổi ion

* Pha động là chỉ có thể là chất lỏng
* Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học gọi là
polyme, nên được gọi là các hạt nhựa. Bề mặt của các hạt mang nhóm chức ở dạng
ion.
 Sắc ký lọc gel:
* Pha động chỉ có thể là chất lỏng
* Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polyme, trên bề mặt của các
hạt có nhiều lỗ rỗng. Mỗi loại nhựa có một kích cỡ nhất định, biết trước.

Tiêu biểu của sắc ký lọc gel

8
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

4.3. Phân loại theo cấu hình

 Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng:
Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp
phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt
phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một
dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí
nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Chế phân tách của sắc ký giấy chủ yếu là phân bố, trong đó pha tĩnh (thường là
nước) được thấm trên một tờ giấy thấm đặc biệt gọi là giấy sắc ký. Nhờ các xoang
rỗng trong sợi cellulose của tờ giấy sắc ký khác nhau, phân biệt theo độ thấm dung
môi và mức độ dày mỏng của giấy, với các mã hiệu tùy thuộc vào hãng sản xuất. Khi
tiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp.
 Sắc ký cột
Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ,
được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa, dụng cụ này giống
như cái buret định phân trong phòng thí nghiệm.
Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký giấy hoặc sắc ký lớp mỏng nhưng
ở đây pha tĩnh được nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai một cách liên tục với nhiều
hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.
Trong sắc ký cột pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột. Tùy theo tính chất
của chất dùng làm cột mà sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột
hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố).
Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất
khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước
tương đối lớn (50-150μm), được nạp trong một cột
bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt phía
trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên
bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt. Dung môi giải ly
được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới
cột, rồi đem cô quay đuổi dung môi, dùng sắc lý lớp
mỏng để theo dõi quá trình giải ly.

9
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường thì hợp chất không hoặc
kém phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau.
Còn trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha đảo thì những hợp chất phân cực sẽ
giải ly ra khỏi trước và những chất phân cực kém sẽ giải ly sau.

10
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Chương 2: SẮC KÝ CỘT HỞ

1. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT
1.1. Cột
Cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh dài
30-70 cm, đường kính 1-5 cm, đầu dưới có một
vòi thủy tinh và 1 khóa để điều chỉnh tốc độ
chảy.
Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu
chất cần phân tách
- Trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 25-
50 lần trọng lượng mẫu cần sắc ký. Tuy nhiên
với những hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng
thì cần sử dụng số lượng chất hấp phụ nhiều hơn
(lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp
phụ ít hơn.
- Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp phụ và đường kính trong của cột vào khoảng
10:1
Muốn biết lượng chất hấp phụ có phù hợp với cột thì cho chất hấp phụ khô vào
cột để quan sát.
1.2. Các loại pha tĩnh dùng nhồi cột
1.2.1. Silica gel
* Silica gel pha thường: được chế tạo bằng cách thủy giải silicat natri (cho tác
dụng với acid sulfuric) để thành polysilisic, tiếp theo là ngưng tụ và polyme hóa để đạt
các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt,
diện tích bề mặt, … như yêu cầu.

11
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Silica gel
Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cổ điển có đường kính hạt trung bình khoảng
40-200µm, các lỗ rỗng có đường kính trung bình khoảng 40-300A°, diện tích bề mặt
khoảng 100-800 m2/g.
Các vị trí hoạt động trên bề mặt của hạt silica gel là các nhóm silanol, mỗi nhóm
cách nhau 5A°. Đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với
những hợp chất được sắc ký. Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những
hợp chất phân cực (có mang nhóm chức -OH, -NH 2, -COOH...) có khả năng tạo nối
hydro mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly ra chậm hơn so với những
chất khác có tính kém phân cực như alkan, terpen (là những hợp chất không chứa
những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột
sớm.
- Muốn điều chỉnh hoạt tính bề mặt của silica gel chỉ cần thêm hoặc loại bỏ
nước. Khi silica gel hấp phụ nước, các phân tử nước sẽ che khuất những vị trí hoạt
động trên bề mặt của hạt silica gel làm hạt bị giảm hoạt tính; muốn silica gel hoạt tính
trở lại, chỉ cần đun nóng để loại bỏ nước. Đây là quá trình thuận nghịch, muốn làm
giảm hoạt tính silica gel thì chỉ cần cho thêm nước vào. Tuy nhiên, khi đun nóng
khoảng 400-500°C, quá trình thuận nghịch biến mất, silica gel bị mất vĩnh viễn hoạt
tính bề mặt, do hai nhóm silanol kề bên mất một phân tử nước, tạo thành nối eter,
không còn tính sắc ký.

Mô tả bề mặt hạt silica gel

- Hoạt tính của silica gel là khả năng hấp phụ nước, được đo bởi số Brockmann.
Silica gel có số Brockmann càng lớn thì bề mặt càng kém hoạt tính.

12
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

- Có thể hiệu chỉnh tính của silica gel bằng cách cho silica gel kết hợp với
những hợp chất khác như base, các dung dịch đệm ở mức pH xác định. Cũng có thể
thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả năng tách các hợp chất, nhất là alken.
Tuy nhiên cũng cần nhớ là với một hợp chất nào đó đang bị silica gel giữ lại
trong cột, giải ly chất đó ra khỏi cột được hay không cũng còn tùy vào việc sử dụng
dung môi giải ly có độ phân cực mạnh hay yếu. Dung môi nào có thể tạo nối hydrogen
mạnh sẽ là dung môi thích hợp để giải ly các hợp chất phân cực mạnh ra khỏi cột silica
gel. Hơn nữa, muốn đuổi hết các hợp chất phân cực thí dụ các flavonoid, triterpen
glycosid nên dùng 1-2% acid axetic trong metanol.

* Silica gel chế hóa: được điều chế bằng cách cho các nhóm chức silanol của
silica tác dụng với nhiều loại clorur silil khác nhau để tạo thành những loại chất hấp
phụ mới, với các đặc tính vật lý đổi khác, được gọi là silica gel-tạo nối. Có thể chế hóa
thành silica gel-tạo nối dùng cho pha thường hoặc pha đảo.
- Silica gel tạo nối dùng cho pha đảo: Cho silica gel tác dụng với
clorodimetylalkylsilan R-Si(CH3)2-Cl để tạo silica gel mới có tính không phân cực.
Dây alkyl R thường là C-1, C-2, C-4, C-6, C-8, và C-18. Tuy nhiên, thường hay chế
tạo dây C-8 và C-18. Silica gel pha đảo có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực
và giữ chặt các hợp chất này lại trong cột. Pha động thường là nước, sau đó thêm vào
các dung môi hữu cơ để làm giảm độ phân cực của dung môi giải ly, như thế chất phân
cực sẽ giải ly ra khỏi cột trước, và những chất kém phân cực sẽ ra sau.

13
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Cấu trúc bề mặt silica gel pha đảo

- Silica gel tạo nối dùng cho pha thường: Điều chế tương tự như silica gel tạo
nối dùng cho pha đảo với R thường là: phenyl, cyano, amino, diol,…Ưu điểm của nó
là bền đối với tất cả các loại dung môi kể cả các dung môi có tính phân cực mạnh nên
có thể sử dụng dung môi phân cực mạnh để giải ly ra khỏi cột tất cả các hợp chất có
tính phân cực mạnh, trong khi đó silica gel thường sẽ giữ rất mạnh các hợp chất có
tính phân cực, nhiều khi hợp chất bị dính luôn trong cột, không thể giải ly ra khỏi cột.

Cấu trúc và tên gọi một số loại silica gel-tạo nối dùng cho pha thường
- Silica gel tạo nối dùng cho sắc ký thủ tính:
Hoạt tính sinh học của những hợp chất thủ tính đặc trưng tùy theo hóa học lập
thể của chúng. Có đối phân có hoạt tính chữa bệnh trong khi đối phân còn lại không có
được tính đó, mà lại có khi còn độc hại, vì thế nhất thiết phải tách riêng chúng. Nhưng
hai đối phân có đặc tính vật lý giống nhau, cùng độ hòa tan vào cùng một loại dung
môi nào đó, nên không thể sử dụng sắc ký để tách chúng được, cho dù sử dụng silica
gel pha thường hay pha đảo, cột thường hay cột hiệu năng cao HPLC.
Có nhiều loại silica gel thương phẩm sử dụng cho sắc ký thủ tính với cơ chế lưu
giữ chất khác nhau, một số những chất đó sử dụng silica gel làm chất nền.
Bảng 1: Phân loại một vài pha tĩnh thủ tính
Loại pha thủ tính Cơ chế bắt giữ chất của pha tĩnh
Pirkle Tương tác qua ba điểm
Polymer hình xoắn ốc - thủ tính
Các nối kỵ nước (hydrophobic bond)
(polysaccarid)
Tương tác giữa chủ-khách (tương tác giữa chất
Cyclodextrin và eter vòng
tan đối với lỗ rỗng có tính thủ tính của chủ là
(Crown ether)
cyclodextrin)
Enzym bị giữ cố định Ái lực thủ tính

14
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

(Immobilised)
Phức amino acid kim loại Phức xuyên lập thể phân
1.2.2. Alumina
Alumina là oxid aluminium Al2O3, được điều chế qui trình tương tự như silica
gel nhưng trên nguyên liệu là hydroxid aluminium, hơn thế nữa có thể điều chỉnh độ
pH của dung dịch phản ứng để sản xuất ra hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính
kiềm hay trung tính.
- Alumina base: chứa khoảng 0,1-0,5% NaOH bám trên mặt alumina ở dạng
natri aluminat, có pH ≈ 10.
- Alumina trung tính: pH từ 6,5-7
- Alumina axit: pH ≈ 4

Alumina
Nhiệt độ lúc hoạt hóa trong quá trình điều chế là đặc điểm khác nhau giữa
alumina và silica gel. Muốn có alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun nóng alumina ở
400-450oC trong 12-16 giờ. Muốn giảm hoạt tính alumina, thêm nước vào.
1.2.3. Kieselguhr-Celite
Kieselguhr và Celite là loại đất sét diatomit. Nguyên liệu này có các lỗ rỗng
lớn, diện tích bề mặt lớn và có tính hấp phụ rất yếu. Khả năng hấp phụ còn có thể giảm
hơn nữa bằng cách cho tác dụng với dung dịch HCl 3%, rửa sạch clor và sấy khô ở
80oC. Với các tính chất trên, nó được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân chia.
1.2.4. Gel
Gel là tên gọi chung cho các loại pha tĩnh được điều chế từ tinh bột, agar
(polysaccarid) hoặc polyacrylamid, trong đó các chuỗi dây dài được nối mạng ngang
để tạo thành mạng không gian 3 chiều.

15
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

1.3. Dung môi:

1.3.1. Các dung môi thường dùng cho sắc ký cột: hexan, benzene, chloroform,
aceton, etanol, methanol, butanol, nước.
Thứ tự độ phân cực tăng dần: Ete dầu hỏa < hexan < xiclohexan < CCl 4,<
benzen < toluen < diclometan < CHCl 3 < dietyl ete < etyl axetat < axeton < pyridin <
propanol < etanol < nước < axit axetic
1.3.2. Cách chọn dung môi thích hợp
Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò
tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước tuần tự như sau:
Bước 1: Mẫu cần sắc kí được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, với
nồng độ 10mg/ml gọi là dung dịch mẫu (A).
Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5 x 10 cm. Chấm lên những tấm bản này
mỗi tấm 1 chấm khoảng 2-5µl dung dịch (A).
Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với 1 loại dung môi giải ly khác nhau,
kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc bằng các thuốc thử. Với đơn dung
môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào là phù hợp. Từ kết quả đó, cố gắng tìm một
hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực.
Bước 4:
- Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của phản ứng tổng hợp hữu cơ, ta chọn hệ
dung môi có thể đẩy hợp chất cần quan tâm lên ở vị trí trên bản với Rf = 0,2-0,3.
- Với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ, chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung
môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bản với Rf = 0,5 và chọn
dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết
lên vị trí ở bản với Rf = 0,2.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho
sắc ký cột. Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực
cho dung môi giải ly.
Lưu ý:
- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau.
- Phải chỉnh tỉ lệ dung môi giải ly cột sao cho có tính kém phân cực 1 ít so với
hệ dung môi đã chọn bằng sắc ký lớp mỏng.
1.4. Mẫu sắc ký

16
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Mẫu thử trước khi phân tích phải được loại tạp chất bằng phương pháp thích
hợp. Mẫu thử có thể ở 2 dạng:
- Dạng dung dịch khá đậm đặc: hòa tan mẫu trong dung môi không quá phân
cực so với hệ dung môi pha động. VD: Pha động là benzen-EtOAc thì tốt nhất là hòa
tan mẫu trong benzene, nếu mẫu không tan trong benzene thì dùng dung môi phân cực
hơn benzene một chút.
- Dạng bột khô: hòa tan mẫu trong dung môi như etyl axetat hoặc methanol,
thêm vào silica gel hạt lớn vừa đủ, cô quay hỗn hợp để đuổi hết dung môi thu được
mẫu ở dạng bột mịn tơi xốp.

Mẫu dạng dung dịch đậm đặc Mẫu dạng bột khô
2. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH
2.1. Chuẩn bị cột: Yêu cầu là chất rắn làm cột phải phân tán đồng đều ở mọi điểm
trong cột thành một khối đồng nhất.
- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). Kẹp cột thẳng
đứng trên giá.
- Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột. Có 2 cách nhồi cột: nhồi
cột ướt và nhồi cột khô.
+ Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được nạp vào cột ở dạng sệt, được chuẩn bị như
sau:
Trong 1 becher có chứa sẵn dung môi, cho chất hấp phụ
từng lượng nhỏ và đều đặn vào becher, vừa cho vừa khuấy đều.
Đặt lên đầu cột một phễu lọc đuôi dài, rót hỗn hợp sệt vào
cột, mở nhẹ khóa bên dưới cột cho dung môi chảy qua, hứng
dung môi vào một becher trống, dung môi này được sử dụng lại
để rót lên đầu cột.

17
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng 1 thanh cao su
gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp phụ nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài lần để việc
nạp cột được chặt chẽ cho đến khi thấy chất hấp phụ trong cột có dạng đồng nhất và
mặt thoáng chất hấp phụ ở đầu cột phải nằm ngang. Không được để đầu cột bị khô,
nghĩa là dung môi phải luôn phủ trên phần đầu cột.
- Nhồi cột khô: Cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều
cao cột.
Cho chất hấp phụ ở dạng bột khô vào thẳng trong cột qua phễu lọc đuôi dài, đều
đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp chất hấp phụ
đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột thì mở nhẹ khóa cho dung môi chảy ra,
hứng dung môi và 1 becher trống, dung môi được sử dụng lại để rót trở lại lên đầu cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần đến khi thấy
chất hấp phụ trong cột có dạng đồng nhất.
Lưu ý: Quá trình nhồi cột phải thực hiện một cách cẩn thận, nếu quan sát thấy
có nhiều bọt khí hoặc có những bất thường trong cột thì phải xả hết cột và nạp lại từ
đầu.

Cột sau khi được nạp silica gel

2.2. Nạp mẫu cần tách lên cột sắc ký
2.2.1. Nạp mẫu dạng dung dịch
- Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống
sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp phụ trong cột.

18
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

- Đóng khóa lại, dùng pipette hút dung dịch mẫu chất và nạp vào đầu cột. Muốn
nạp mẫu đặt đầu của pipette gần sát với mặt thoáng của chất hấp phụ trong cột, vừa
bóp vừa rây pipette dọc quanh thành trong của cột, cho dung dịch chất chảy ra dọc
theo thành trong của cột chạm xuống bề mặt của chất hấp phụ .
- Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm
cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp phụ trên đầu
cột.
- Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu
cột, dùng dung môi này để rửa sạch dung dịch mẫu chất đã dính
trên thành cột. Tiếp tục mở khóa cho dung môi chảy qua. Lặp
lại vài lần như thế để dung dịch mẫu thấm sâu vào phần chất
hấp phụ ở phần đầu cột và phần dung môi trên đầu cột trở nên
trong suốt.
- Cho một lớp cát (hoặc bông gòn) dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt
thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ mặt cột.
Sau khi nạp mẫu xong cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.

Cột sau khi đã nạp mẫu

2.2.2. Nạp mẫu dạng bột khô:
Nếu mẫu chất không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá
trình sắc ký cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực thay vì phải hoà tan mẫu trong
dung môi phân cực có thể ảnh hưởng đến quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.

19
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu cần sắc ký (Xg) được hoà tan trong
dung môi như etylaxetat hoặc metanol (50Xg) cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn
(10Xg). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ
mẫu sắc ký đã được tẩm đều lên bề mặt của những hạt silica gel.
Đặt mẫu bột khô này lên trên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại chọn để bắt
đầu quá trình sắc ký cột) thấm ướt phần bột silica gel. Cho một lớp cát dầy khoảng 3-6
mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ bề mặt. Cuối cùng cho
dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
2.3. Giải ly chất ra khỏi cột
2.3.1. Các phương pháp giải ly
- Giải ly nhờ vào trọng lực: các hạt gel nạp cột phải có kích thước lớn hơn
60µm. Nếu sử dụng những hạt gel có kích thước nhỏ hơn, dung môi ra khỏi cột rất
chậm và cần phải nhờ đến một lực để có thể ra khỏi cột.
- Giải ly sử dụng lực đẩy: dùng máy bơm tạo áp lực để đẩy dung môi đi ngang
qua pha tĩnh. Sử dụng hạt gel có kích thước 40-63 µm và cột sắc ký phải có thành dầy
với lớp bao lưới che chắn bên ngoài để tránh khi sử dụng áp suất cao, cột có thể bị nổ
vỡ.

Hai loại dụng cụ giúp đẩy dung môi vào đầu cột cho sắc ký chớp nhoáng
- Giải ly sử dụng lực hút: dùng máy bơm hút tạo chân không ở đầu ra của cột.
Kỹ thuật này cũng cho kết quả tương tự như trên, nhưng việc thu lấy dung môi giải ly
có phần kém thuận tiện vì phải ngưng tạo chân không, tháo thiết bị để rót dung môi ra.
Tuy vậy kỹ thuật này an toàn hơn.

20
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Giải ly sử dụng lực hút

Như vậy, các kỹ thuật sắc ký khác nhau là việc sử dụng kích thước khác nhau
của hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột.
Cột áp suất thấp, sử dụng cột làm bằng thuỷ tinh: thường sử dụng hạt có kích cỡ
40 – 200 µm, sử dụng áp suất bình thường của bầu khí quyển.
Cột áp suất trung bình, sử dụng cột làm bằng thuỷ tinh dầy: thường sử dụng hạt
có kích thước cỡ 25 – 40 µm; thực hiện ở áp suất 75 – 600 psi (tức 5 – 40 bar).
HPLC sử dụng cột bằng thép không rỉ: hạt nạp có kích cỡ 3 – 10 µm; thực hiện ở
áp suất 500 – 3000 psi.
2.3.2. Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly
- Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn
hợp dung môi nhưng trong hỗn hợp tỉ lệ giữa các thành phần không thay đổi để giải ly
cho đến khi việc tách chất hoàn tất.
- Giải ly sử dụng dung môi có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang: Việc sử dụng
một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định và một số cấu tử
khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Vì thế muốn đuổi chúng ra khỏi cột,
phải dùng một dung môi có ái lực mạnh hơn.
Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nên cho thêm từ từ mỗi
lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào dung môi cũ đã sử
dụng. Không nên tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột.
Ví dụ: Đang giải ly với hexan, muốn chuyển sang benzen, sẽ pha benzen vào
hexan theo tỉ lệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50%, 100% benzen.
Bảng 2: Các dung môi thường dùng trong sắc ký cột, được sắp xếp theo chỉ số phân
cực tăng dần

21
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Hằng số Độ tan
Nhiệt độ sôi Chỉ số Độ nhớt
Dung môi điện môi ε ở trong nước
(oC) phân cực (mN.S.m-2)
25oC (%w/w)

Pentan 36 1,8 0,0 0,23 0,004

Hexan 69 1,9 0,0 0,33 0,001
Heptan 98 - 0,0 0,39 0,0003
Ciclohexan 81 2,0 0,2 1,00 0,01
Tetraclorur 77 2,2 1,6 0,97 0,08
Toluen 111 2,38 2,4 0,59 0,51
Xylen 139 - 2,5 0,61 0,018
Benzen 80 2,3 2,7 0,65 0,18
Diethyl ether 35 4,34 2,8 0,32 6,89
Diclorometan 41 8,9 3,1 0,44 1,6
Isopropanol 82 18,3 3,9 2,3 100
n-Buthanol 118 - 3,9 2,98 7,81
Tetrahydrofuran 65 7,58 4,0 0,55 100
n-Propanol 92 20,1 4,0 2,27 100
Acetate butyl 125 - 4,0 0,73 0,43
Chloroform 61 4,87 4,1 0,57 0,815
Acetate ethyl 77 6,0 4,4 0,45 8,7
Methyl ethyl 80 - 4,7 0,45 24
Dioxan 101 2,2 4,8 1,54 100
Aceton 56 20,7 5,1 0,32 100
Methanol 65 33,6 5,1 0,6 100
Ethanol 78 24,3 5,2 1,2 100
Acetonitryl 82 37,5 5,8 0,37 100
Acid acetic 118 6,2 6,2 1,26 100
Dimethyl 189 4,7 7,2 2,0 100
Nước 100 78,5 9,0 1,0 100
- Giải ly sử dụng dung môi với nồng độ tăng dần tuyến tính: Dung môi giải ly
có độ phân cực tăng dần đều.
2.3.3. Vận tốc giải ly

22
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Vận tốc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân
bằng với chất hấp phụ) cũng không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời
gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấu quá
trình tách.
Thông thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly khoảng 5-50 giọt/phút hoặc
1-2 cm/phút.
Ví dụ: “Chiết dịch từ lá xanh” Dung môi sử dụng là dung môi nào? Vận tốc chảy
của dung môi?
Lấy 10g lá rau muốn còn tươi (khoảng 30 lá) cắt nhỏ cho vào cối sứ (bỏ gân lá),
trộn thêm 2g bột CaCO3 để trung hòa dịch axit của tế bào. Nghiền các lá đến khi thành
một thể đồng nhất. Cho 10 -15ml aceton 80% hoặc cồn etylic 90% vào cối sứ và khuấy
đều, để 5 phút rồi lọc bằng bông và bằng phễu thuỷ tinh, dung dịch thu được trộn với
2ml toluen rồi chiết bằng phễu chiết, lấy phần trên được dịch mẫu. Tiến hành sắc ký
cột.
Sau khi nạp silica gel vào buret đạt chiều cao cột khoảng 10-20cm, bột đường
glucozơ 20-30cm, bột canxi cacbonat nạp khoảng 15-20cm.
Dung môi sử dụng là các hệ: ete dầu hoả-aceton; toluen-aceton; toluen-cồn
etylic; aceton-HCl đặc; NH4NO3 4M - NH3 4M; CH3COOH 1,5M - CH3COONH4
1,5M.
Vận tốc chảy của dung môi giải ly khoảng 15- 20 giọt/phút.
2.3.4. Theo dõi quá trình giải ly cột
- Với mẫu có màu: quan sát bằng mắt thường ta thấy các dãy lớp có màu sắc
khác nhau đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly
khỏi cột.

Các chất có màu sắc khác nhau tách xa nhau trong cột

23
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Sử dụng sắc ký bản mỏng để kiểm tra mỗi dãy màu có một hay nhiều chất
- Với các mẫu không màu: hứng dung dịch giải ly trong những hủ bi có thể tích
như nhau và đánh số thứ tự. Dung dịch trong những hủ bi hứng được sẽ được sắc ký
lớp mỏng trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có sắc ký bản mỏng giống nhau sẽ
được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém các
phân đoạn này sẽ cho cao của các phân đoạn đó. Chỉ ngưng cột khi thu được lượng cao
các phân đoạn bằng 70-80% trọng lượng mẫu đã nạp vào đầu cột.
2.3.5. Ghi nhận kết quả sắc ký
- Phân đoạn thu được là một chất tương đối sạch tuy vẫn có chứa một ít tạp
chất: khi trên bản mỏng có một vết chính chiếm 80%, ngoài ra còn một số vết mờ.
- Phân đoạn thu được là hỗn hợp nhiều chất: khi trên bản mỏng có nhiều vết,
các vết có độ đậm như nhau.
- Để kiểm tra xem một hợp chất có tinh khiết hay không ta sử dụng sắc ký lớp
mỏng lần lượt với 3 hệ dung môi giải ly hoàn toàn khác hẳn nhau (không dùng một hệ
dung môi với 3 tỉ lệ khác nhau). Nếu chất chỉ cho hiện ra một vết duy nhất thì có thể
kết luận là chất tinh khiết. Nếu chất không tinh khiết thì sẽ cho thấy bên cạnh vết chính
có thêm vết khác. Muốn khảo sát rõ hơn thì dùng HPLC.
2.4. Xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất
Chỉ nên tìm cách xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất tinh khiết sau khi
đã kết tinh nhiều lần trong dung môi phù hợp (độ tinh khiết 95%).
Kết quả khảo sát cấu trúc hóa học của một hợp chất theo các chi tiết sau:
- Mô tả hình dạng, màu sắc và mùi của sản phẩm.
- Sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi gì, thuốc hiện hình gì, giá trị Rf của vết,
hình chụp bản mỏng.
- Điểm nóng chảy.
- Năng lực triền quang.
- Khối phổ.

24
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

- Phân tích nguyên tố.

- Phổ hồng ngoại IR.
- Phổ tử ngoại: λmax (chỉ đo khi hợp chất có chứa nối đôi liên hợp)
- Phổ 1H –NMR.
- Phổ 13C-NMR.
Sau khi biện luận các tín hiệu của các loại phổ, so sánh với các số liệu trong tài
liệu sẽ đề xuất cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được. Cấu trúc này phải đáp ứng
tất cả các chỉ tiêu hóa lý đã nêu trên.
3. ƯU, NHƯỢC ĐIỂM VÀ ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ CỘT HỞ
3.1. Ưu điểm
- Có thể sử dụng trong cả hai lĩnh vực phân tích và điều chế.
- Sắc ký cột không những dùng để xác định số lượng các thành phần của hỗn
hợp mà nó còn có thể được dùng để tách và tinh chế những thành phần phân tích.
- Pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; có thể triển khai với một
lượng lớn mẫu chất.
3.2. Nhược điểm
- Khi chạy cột sắc ký đòi hỏi sự theo dõi liên tục để duy trì mức dung môi vì
nếu không sẽ dễ gây xuất hiện các bọt khí làm tắc cột, nứt cột, biến dạng đường đi của
dung môi.
- Quá trình chạy cột mất thời gian.
- Quá trình tách chậm và hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp.
3.3. Ứng dụng
- Phân lập các alkaloid, kháng sinh, hormon tăng trưởng steroid, hormon sinh
dục và các hợp chất liên quan.
- Tách các chất lipid, các hợp chất chứa nitro từ các hydrocarbon, các hợp chất
vòng thơm từ hỗn hợp mạch thẳng – vòng thơm.
- Rửa giải và tách các thuốc trừ sâu.
- Làm tinh khiết dược liệu.
- Phân tích các vitamin.
- Khử màu dầu, chất béo và sáp bằng phương pháp thấm lọc.

25
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Chương 3: MỘT VÀI KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT KHÁC

1. Sắc ký cột khô (Dry column chromatography – DCC)
- Chất hấp phụ: sử dụng alumina hoặc silica gel loại dùng cho sắc ký lớp
mỏng, có thể trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang. Liều lượng sử dụng: 1g mẫu
chất cần 300g chất hấp phụ khô.
- Mô tả hệ thống: sử dụng một ống Celophan có đường kính 2-5cm được dựng
thẳng đứng. Đáy ống được hàn lại, tạo dáng hình trụ và đầu đáy này có đặt một lớp
bông thủy tinh. Đáy ống được soi thủng nhiều lỗ nhỏ bằng cây kim may.

Chuẩn bị ống sắc ký

- Nạp chất hấp phụ vào ống: chất hấp phụ được nạp khô vào ống. Đầu tiên cho
chất vào 1/3 cột, gõ nhẹ ống lên mặt ghế hay mặt bàn để nén chất cho chặt chẽ, tiếp tục
nhồi để có 1 ống thẳng cứng có thể cầm trên tay (trong suốt quá trình nhồi, đầu trên
được để hở).

Nạp chất hấp phụ vào ống

- Nạp mẫu vào đầu cột:

26
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

+ Nạp mẫu dạng ướt: mẫu được hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi,
dùng ống nhỏ giọt đặt dung dịch mẫu phủ lên trên đầu cột và để yên một lúc cho dung
môi bay đi.
+ Nạp mẫu dạng khô: hòa tan mẫu trong một dung môi dễ bay hơi như dietyl
ete hoặc diclorometan vào một becher, cho vào một lượng chất hấp phụ loại dùng cho
sắc ký cột với trọng lượng gấp năm lần lượng mẫu, trộn đều rồi cô quay thu hồi dung
môi sẽ có được bột rắn khô. Phủ lớp bột này lên trên đầu cột đã nhồi lúc nãy. Sau cùng
phủ một lớp cát (hoặc bông gòn) lên trên đầu cột để bảo vệ mặt thoáng của cột.

Nạp mẫu vào cột

- Triển khai sắc ký: ống được dựng đứng và dung môi được cho chảy từ trên
đầu ống xuống dưới cuối ống nhờ vào trọng lực. Cho dung môi vào đầu cột, giữ sao
cho có một lớp dung môi dày 3-5cm trên đầu cột.

Triển khai sắc ký

- Hiện hình sắc ký: Đặt ống trụ nằm ngang trên một tấm kiếng và quan sát
bằng đèn UV, đánh dấu các đoạn. Lấy ống ra ngoài và dùng lưỡi dao lam để cắt ống
thành những khúc thích hợp. Dùng dung môi để trích chất trong mỗi đoạn.

27
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Cắt ống trụ để trích chất

Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký cột khô
₪ Ưu điểm:
- Phương pháp sắc ký cột khô là phương pháp bắt cầu giữa phương pháp sắc
ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột điều chế cổ điển. Áp lực chi phí về thiết bị ít hơn
so với phương pháp sắc ký lỏng điều chế.
- Cũng như các phương pháp sắc ký cột nói chung, DCC dùng được cả trong
phân tích và điều chế.
- DCC nhanh, dễ dàng và hiệu quả cao trong việc tách hoặc tinh chế các chất
với số lượng lớn.
- Giống như TLC, DCC là một phương pháp "không rửa giải" sử dụng ống
nilon như là vật hỗ trợ và có thể dùng UV-254 để nhận biết. Cũng như các loại sắc ký
cột, các cột với hầu hết mọi kích cỡ chứa đầy pha tĩnh trong sắc ký cột khô có thể
dùng để tách, hoặc làm sạch một lượng rất lớn các chất.
₪ Nhược điểm:
- Để thiết lập cột đòi hỏi kĩ thuật, sự khéo léo và cần thời gian.
- Đòi hỏi sự chú ý liên tục trong suốt quá trình tiến hành.
Ứng dụng: Cũng như các phương pháp sắc ký cột nói chung, sắc ký cột khô
dùng được cả trong phân tích và điều chế. Sắc ký cột khô được dùng để xác định số
lượng thành phần chất trong hỗn hợp, phân tách và làm tinh khiết những thành phần
này để dùng cho những phân tích sau đó. Sắc ký cột khô đã áp dụng thành công cho
những chất như thuốc nhuộm, alkaloids, và những hợp chất dị vòng khác, mặc dù có
thể tách bằng các loại cột sắc ký khác nhưng sẽ gặp nhiều khó khăn đáng kể. Lipid
cũng có thể được tách bằng sắc ký cột khô.
2. Sắc ký cột nhanh (Flash column chromatography-FCC)
- Chất hấp phụ: sử dụng silica gel có cỡ hạt 40-63µm cho kết quả tốt nhất.
- Mô tả hệ thống: Hệ thống gồm cột sắc ký bằng thủy tinh như hệ thống sắc ký

28
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

cổ điển, đầu cột được ráp nối với một hệ thống bơm nén có áp lực trung bình, áp lực
có thể điều chỉnh. Hơi nén từ trên đầu cột đẩy dung môi xuyên xuống lớp chất hấp phụ
nhanh hơn.

Hệ thống sắc ký cột nhanh

- Lượng mẫu và kích thước cột: nên sử dụng cột ngắn, đường kính khoảng 1-
10 cm và chiều dài không quá 40 cm.
Bảng 3: Một số thông số cho sắc ký cột nhanh

Lượng mẫu cho vào (mg) Thể tích hứng

Đường kính Thể tích giải ly
một lọ
cột (mm) (ml) ∆Rf ≥0,2 ∆Rf ≥0,1
(ml)
10 100 100 40 5
20 200 400 160 10
30 400 900 360 20
40 600 1600 600 30
50 1000 2500 1000 50
- Vận tốc giải ly: mực dung môi hạ xuống trong ống với tốc độ 5 cm/phút.
Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký cột nhanh
₪ Ưu điểm:
- Nhờ khí nén đẩy dung môi giải ly nên thời gian triển khai nhanh hơn sắc ký
cột cổ điển (thời gian triển khai nhỏ hơn 20 phút). Cho phép phân lập mẫu 0.01-10g

29
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

trong10-15 phút. Có thể tách rất tốt hỗn hợp có khoảng 4 chất.
- Thiết bị đơn giản, rẻ tiền so với HPLC.
₪ Nhược điểm:
- Độ phân giải trung bình (lớn hơn 0.15).
- Không tách được hỗn hợp phức tạp hay tách riêng chất cần phân lập mà chỉ
thu được các phân đoạn chứa chất cần phân lập.
- Để thực hiện cần phải có máy bơm nén khí và mộ tbộ phận gồm những cột và
những nắp vặn kín chuyên dụng, có kích thước từ nhỏ đến lớn. Những bộ phận này
tương đối đắt tiền nếu so với sắc ký cổ điển.
Ứng dụng: Sắc ký cột nhanh được sử dụng để tách các phân đoạn đơn giản từ
hỗn hợp phức tạp. Sau đó đưa các phân đoạn này lên sắc ký cột cổ điển để tách thành
các phân đoạn tinh khiết.
3. Sắc ký nhanh - cột khô (Dry-column flash chromatography; Vacuum liquid
chromatography – VLC)
- Dụng cụ: Phễu lọc xốp bằng thủy tinh, bình tam giác, hệ thống tạo chân
không nhẹ bằng vòi nước.

Hệ thống sắc ký nhanh cột khô

- Nạp chất hấp phụ vào cột:
Hệ thống gồm: phễu lọc xốp gắn trên bình tam giác, bình này nối với một máy
bơm hút tạo chân không.
Cho máy bơm chân không hoạt động, cho từng muỗng silica gel khô (loại cỡ
hạt 15-40 µm) vào phễu đến tận đáy. Dùng nút thủy tinh có đáy bằng phẳng để nén
silica gel xuống đáy phễu tạo thành một khối rắn đồng nhất có bề mặt phẳng.

30
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

Lưu ý: lớp silica gel chỉ dày tối đa 5 cm (gia tăng theo đường kính, không
tăng theo chiều cao).
Bảng 4: Mối liên quan giữa lượng mẫu và kích thước phễu trong sắc ký nhanh-cột
khô
Đường kính trong Chiều cao Phân đoạn dung
Lượng mẫu
của phễu (cm) Lớp hấp phụ (cm) dịch giải ly (ml)
< 100 mg 0,5 – 1,0 4 10 – 15
0,5 – 1,0 g 2,0 – 3,0 4 15 – 20
1,0 – 10,0 g 5 5 30 – 50
10,0 – 20,0 g 10 5 50
- Cân bằng cột sắc ký:
+ Đặt một lớp bông gòn dày lên bề mặt pha tĩnh để bảo vệ lớp mặt.
+ Cho một lượng lớn dung môi (loại dung môi ít phân cực nhất) lên đầu cột,
cho hệ thống tạo áp suất kém hoạt động, dung môi được hút xuống đi qua cột và được
hứng vào bình tam giác. Lượng dung môi này được sử dụng để cho lại lên đầu cột.
Thực hiện vài lần đến khi thấy chất hấp phụ trong cột đồng nhất.
- Nạp mẫu lên đầu cột: tháo miếng bông gòn bảo vệ bề mặt
+ Nạp mẫu ướt: cột được hút khô tương đối, tắt máy áp suất kém. Hòa tan
mẫu trong dung môi ít phân cực sau đó phủ đều lên khắp bề mặt silica gel. Gắn máy áp
suất kém.
+ Nạp mẫu khô: cho lượng mẫu khô lên đầu cột, gõ nhẹ và trải đều mẫu thành
một lớp mỏng.
Sau khi nạp mẫu lên đầu cột, lấy lớp bông gòn phủ lại lên trên mặt cột.
- Giải ly: Cho máy bơm tạo áp suất kém hoạt động. Rót một thể tích dung môi
nhất định lên bề mặt phễu (bảng 4), dung môi được hút xuống bình tam giác bên dưới.
Chờ cho phễu khô tương đối, ngắt áp suất, rót phần dung dịch vừa giải ly vào các lọ có
đánh số thứ tự. Tiếp tục cho dung môi giải ly vào phễu và lặp lại các thao tác như trên.
Mỗi lần phải hút khô phễu rồi mới cho dung môi mới. Dung môi giải ly được sử dụng
lần lượt từ không phân cực đến phân cực.
Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký nhanh-cột khô
₪ Ưu điểm:
- Dụng cụ dễ tìm.
- Thời gian sắc ký nhanh nhờ lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly.

31
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

- Thuận tiện cho người thao tác: quá trình thực hiện có thể bị gián đoạn mà
không bị ảnh hưởng.
₪ Nhược điểm:
- Không tách ngay thành chất tinh khiết được (trừ những hỗn hợp đơn giản hay
các vết cách xa nhau).
- Phải có dụng cụ thích hợp (phễu lọc xốp; hệ thống hút).
Ứng dụng:
- Tách hỗn hợp thành vài phân đoạn có độ phân cực khác nhau, mỗi phân đoạn
gồm ít chất hơn để dễ dàng phân lập tiếp bằng sắc ký cột cổ điển.
- Hoạt động đơn giản nên được ứng dụng rộng trong lĩnh vực hợp chất thiên
nhiên. Thích hợp đối với dịch chiết dược liệu thô.
- Giúp định hướng trong thử nghiệm sinh học một cách tập trung và ít lãng phí.

32
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

KẾT LUẬN
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế
giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện
cuộc sống ngày càng cao nên đòi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để
đáp ứng nhu cầu.
Ngày nay, phương pháp sắc ký là phương pháp chủ đạo để phân lập các hợp
chất tự nhiên cũng như tổng hợp. Nó đã có những đóng góp to lớn trong quá trình
phân lập các dược chất từ dược liệu. Qua đó chứng minh được dược tính và giúp bào
chế ra các thuốc có hoạt chất từ dược liệu với độ tinh khiết cao góp phần làm tăng
hiệu quả điều trị cũng như giảm các tác dụng phụ. Ngoài ra, kỹ thuật sắc ký càng có
vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu
cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất…
Vì vậy, với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương pháp sắc ký
phù hợp để phân tích mẫu tương ứng./.

33
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1986), Phương pháp nghiên cứu hóa học
cây thuốc, Nhà xuất bản Y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Ngọc Hạnh (2002), Giáo trình tách chiết và cô lập hợp chất hữu cơ, Viện
công nghệ Hóa học Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất
bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
4. http://www.sorbtech.com/chromatography/dry-column-chromatography-dcc/
5. http://www.saiadsorbents.com/dcc.htm
6. http://www.wfu.edu/chem/courses/organic/CC/index.htm
7. http://orgchem.colorado.edu/Technique/Procedures/Columnchrom/Procedure.html
8. http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/column.html
9. http://www.chemistryviews.org/details/education/2040151/Tips_and_Tricks_ for
_ the_Lab_ Column_Packing.html

34