BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHIẾT, TINH SẠCH THU CHẾ PHẨM

SAPONIN TRITERPEN TỪ RAU MÁ VÀ KHẢO SÁT
MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2012
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHIẾT, TINH SẠCH THU CHẾ PHẨM

SAPONIN TRITERPEN TỪ RAU MÁ VÀ KHẢO SÁT
MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: GS.TS. ĐẶNG THỊ THU

HÀ NỘI - 2012
 MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………………….….…..v
LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………………….…....vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT………………………………………………. . vii
DANH MỤC BẢNG ……………………………………………………………......viii
DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ…………………………………………….……...x
MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………….…..1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ RAU MÁ:.................................................................... 3
1.1.1. Tên gọi và phân loại............................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................... 4
1.1.3. Phương pháp thu hoạch........................................................................................ 6
1.1.4. Thành phần hóa học của rau má........................................................................... 6
1.1.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam .................................................. 9
1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam. ..................................................................... 9
1.2. HỢP CHẤT SAPONIN TRITERPEN................................................................. 10
1.2.1. Khái niệm và cấu tạo của Saponin ..................................................................... 10
1.2.2. Tính chất hóa lý:................................................................................................. 11
1.2.3 Hoạt tính sinh học ............................................................................................... 12
1.2.4. Phân loại Saponin............................................................................................... 13
1.3. SAPONIN STEROID............................................................................................ 13
1.4. SAPONIN TRITERPEN...................................................................................... 15
1.4.1. Cấu tạo và phân loại........................................................................................... 15
1.4.1.1. Saponin triterpenoid pentacyclic. ................................................................... 16
1.4.1.2. Saponin triterpenoid tetracyclic...................................................................... 18
1.4.3. Tính chất lý hóa của Saponin triterpen. ............................................................. 20

i
1.4.4. Cấu tạo của các hợp chất Triterpen có trong rau má: ........................................ 21
1.4.5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất saponin triterpen....................................... 22
1.4.5.1 Khả năng sản sinh collagen:............................................................................ 22
1.4.5.2 Khả năng kháng khuẩn, nấm và kháng virut: .................................................. 23
1.4.5.3 Chống ung thư: ................................................................................................ 23
1.4.5.4 Một số công dụng khác: ................................................................................... 24
1.4.6. Ứng dụng Saponin triterpen:.............................................................................. 25
1.4.6.1. Ứng dụng trong y tế ........................................................................................ 25
1.4.6.2 Ứng dụng trong dược phẩm và thực phẩm:..................................................... 27
CHƯƠNG II: .........................................................................................................................30
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. .........................................................30
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU........................................................................................... 30
2.1.1. Rau má: .............................................................................................................. 30
2.1.2. Hóa chất: ............................................................................................................ 30
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị:................................................................................................ 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................... 30
2.2.1 Phương pháp chiết tách saponin triterpene........................................................ 30
2.2.1.1 Tách chiết Saponin triterpene thô bằng dung môi ethanol.............................. 30
2.2.1.2 Phương pháp chiết saponin triterpene thô bằng nước cất ............................. 31
2.2.2. Phương pháp tinh sạch saponin triterpen: .......................................................... 31
2.2.2.1 Tinh sạch Saponin triterpen bằng n-Butanol và chlorofom: ........................... 31
2.2.2.2. Phương pháp kết tủa saponin triterpen bằng ete............................................ 32
2.3. PHƯƠNG PHÁP LOẠI BỎ CHẤT MÀU ........................................................... 32
2.3.1 Phương pháp tảy màu bằng than hoạt tính.......................................................... 32
2.3.2 Phương pháp tảy màu bằng silica gel.................................................................. 32
2.4. Phương pháp định tính và định lượng Saponin triterpen ...................................... 33
2.4.1. Phương pháp định tính Saponin triterpen .......................................................... 33
2.4.1.1 Phương pháp định tính Saponin triterpen bằng phản ứng tạo bọt.................. 33

ii
2.4.1.2 Phản ứng Liebermann – Burchard: ................................................................. 33
2.4.1.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng:....................................................................... 33
2.4.2 Phương pháp định lượng Saponin triterpen ........................................................ 34
2.4.2.1. Định lượng Saponin triterpen bằng phương pháp cân khối lượng không đổi 34
2.4.2.2. Định lượng Saponin triterpen bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)34
2.5 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của Saponin
triterpen. ....................................................................................................................... 34
2.5.1 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn: .................................................. 34
2.5.2 Xác định khả năng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH:............................ 35
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................36
3.1. Nghiên cứu, lựa chọn nguyên liệu ........................................................................ 36
3.1.1.Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trên 02 loại rau má............................ 36
3.1.2.Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trong rau má ở các địa phương khác
nhau. ............................................................................................................................. 37
3.1.3. Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trong rau má theo thời vụ:. .............. 38
3.1.4 Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trên các bộ phận của cây rau má: ..... 38
3.1.4 Nghiên cứu thành phần hóa học trong rau má Tây Phi:...................................... 39
3.2. Khảo sát hệ dung môi chiết tách các hợp chất Saponin triterpene ....................... 40
3.2.1.Nghiên cứu chiết tách Saponin triterpen bằng Ethanol ...................................... 40
3.2.2. Nghiên cứu chiết tách Saponin triterpen bằng nước. ......................................... 41
3.2.3. Kết quả định tính Saponin triterpen bằng phương pháp tạo bọt. ....................... 42
3.3. Nghiên cứu lựa chọn dung môi tinh sạch Saponin triterpene trong rau má.......... 43
3.3.1. Tinh sạch saponin triterpen bằng hệ dung môi n- Butanol và chloroform ........ 43
3.3.1.1 Kết quả tinh sạch Saponin triterpen bằng hệ dung môi n-Butanol và
Chlorofom .................................................................................................................... 43
3.3.2. Tinh sạch Saponin triterpen bằng phương pháp kết tinh: .................................. 45
3.3.4 Nghiên cứu phương pháp tảy màu cho sản phẩm Saponin triterpene................. 48
3.3.4.1.Nghiên cứu chất tảy màu là than hoạt tính ...................................................... 48

iii
3.3.4.2. Nghiên cứu chất tẩy màu bằng silicagel......................................................... 50
3.3.4.3. Nghiên cứu phương án tảy màu kết hợp than hoạt tính và silicagel. ............. 51
3.4. Xác định thành phần Saponin triterpen bằng phương pháp HPLC....................... 52
3.5. Nghiên cứu sản xuất Saponin triterpene dạng bột. ............................................... 54
3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch tạo bột.............................................. 54
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lưu lượng dòng khí sấy và áp suất khí nén................ 56
3.5.2.1. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ không khí sấy:........................................... 56
3.5.2.2. Xác định ảnh hưởng của lưu lượng dòng nhập liệu ....................................... 57
3.5.3.3. Xác định ảnh hưởng của áp suất khí nén........................................................ 58
3.6. Kết quả xác định hoạt tính sinh học của cao rau má chứa Saponin triterpen ....... 61
3.6. Kết quả xác định hoạt tính sinh học của cao rau má chứa Saponin triterpen ....... 62
3.6.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của Saponin triterpen: ..................................... 62
3.6.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của Saponin triterpen: .................................. 64
KẾT LUẬN ............................................................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................67

iv
 LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý
kiến của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp.

Nhân đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS Đặng Thị Thu –
Giảng viên Bộ môn Công nghệ vi sinh, Ths. Nguyễn Chí Dũng – Trung tâm Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội người đã có nhiều công sức tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận
văn.

Tôi cũng xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội, các thầy cô đang công tác và làm việc tại Viện Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, tập thể cán bộ Viện Đào tạo Sau đại học
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, các đồng nghiệp tại Trung tâm Công nghệ sinh
học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong
suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ, động viên và giúp
đỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn về mọi sự giúp đỡ!

Hà Nội, ngày 27 tháng 3 năm 2012

Học viên

Phạm Thị Thu Hiền

v
 LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà bản thân tôi đã trực tiếp thực
hiện. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 27 tháng 03 năm 2012

Học viên

Phạm Thị Thu Hiền

vi
 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Str Saponin triterpen

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
IC50 Half maximal inhibitory concentration
HPLC High performance liquid chromatography
B.subtilis Bacillus subtilis
S.aureus Staphylococcus aureus
E.coli Escherichia coli
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

vii
 DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tên gọi của rau má ........................................................................................ 3

Bảng 1.2: Thành phần các Saponin triterpen trong rau má Tây Phi .............................. 7

Bảng 1.3: Thành phần hóa học các hợp chất có trong rau má Việt Nam ...................... 7

Bảng 1.4: Thành phần các hợp chất hưu cơ có trong rau má Ấn Độ............................. 8

Bảng 1.5: Công thức cầu tạo của các hợp chất Saponin triterpen trong rau má. ......... 21

Bảng 1.6: Một số công trình nghiên cứu khả năng chữa bệnh của rau má của các
quốc gia trên thế giới.................................................................................................... 25

Bảng 1.7: Thành phần cao rau má trong các loại thuốc đông y................................... 27

chữa bệnh ..................................................................................................................... 27

Bảng 3.1: Các thành phần chính của rau má Tây Phi ................................................. 39

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến khả năng tẩy màu ................... 48

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dịch đến quá trình tảy màu................................... 49

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dịch đến quá trình tảy màu................................... 49

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ silicagel đến quá trình tảy màu và dịch. .............. 50

Bảng 3.6: Kết quả tảy màu sử dụng than hoạt tính và silicagel................................... 51

Bảng 3.7: Thành phần các Saponin triterpen trong cao rau má ................................... 53

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất độn đến chất lượng cảm quan sản phẩm sấy phun..... 55

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đầu vào đến hiệu suất thu hồi và giá trị
cảm quan của sản phẩm................................................................................................ 56

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của áp suất khí nén đến hiệu suất thu hồi và chất lượng sản
phẩm ............................................................................................................................. 59

viii
Bảng 3.12. Thông kê thông số kỹ thuật cho quá trình sấy phun saponin triterpen...... 60

Bảng 3.13: Khả năng kháng vi khuẩn của Saponin triterpen....................................... 62

Bảng 3.14: Kết quả xác định khả năng ức chế gốc tự do............................................ 64

ix
 DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Thân và rễ cây rau má ......................................................................................5

Hình 1.2: Hoa cây rau má ................................................................................................6

Hình 1.3: Cấu tạo chung của Saponin............................................................................11

Hình 1.4: Khung Olean ..................................................................................................16

Hình 1.5: Khung Ursan ..................................................................................................17

Hình 1.6: Khung Lupan..................................................................................................18

Hình 1.7: Khung Hopan .................................................................................................18

Hình 1.8: Khung Dammaran ..........................................................................................19

Hình 1.9: Khung Lanostan .............................................................................................20

Hình 1.10: Khung Cucurbitan ........................................................................................20

Hình 1.11: Một số sản phẩm từ rau má:.........................................................................28

Hình 1.12: Một số sản phẩm thực phẩm sản xuất từ rau má..........................................29

Hình 3.1: Hàm lượng Saponin triterpen trong một số loại rau má ................................36

Hình 3.2: Hàm lượng Saponin triterpen trong rau má Tây Phi ở các địa phương .........37

Hình 3.3: Hàm lượng Saponin trong rau má theo thời vụ..............................................38

Hình 3.4: Hàm lượng Saponin triterpen trong các bộ phận của cây rau má ..................39

Hình 3.5: Hàm lượng Saponin triterpen chiết bằng ethanol và nước ............................41

Hình 3.6: Hàm lượng Saponin triterpen toàn phần ........................................................42

Hình 3.7: Kết quả định tính Saponin triterpen bằng phương pháp tạo bọt ...................43

Hình 3.8: Hàm lượng Saponin triterpen trong cao n-butanol ........................................44

x
Hình 3.9: Hàm lượng Saponin triterpen sau khi tinh sạch bằng chlorofom ..................45

Hình 3.10: Kết quả tinh sạch Saponin triterpen bằng phương pháp hệ dung môi và
phương pháp kết tinh......................................................................................................46
Hình 3.11: Sắc ký đồ của Saponin triterpen toàn phần..................................................47

Hình 3.12 : Mẫu được tẩy màu bằng hỗn hợp silicagel và than hoạt tính ....................51

Hình 3.13: Kết quả phân tích HPLC cho mẫu nghiên cứu ...........................................53

Hình 3.14: Kết quả phân tích HPLC – mẫu chuẩn.........................................................53

Hình 3.15 : Quy trình công nghệ trên quy mô phòng thí nghiệm..................................61

Hình 3.16: Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của sản phẩm Saponin triterpen ..........63

Hình 3.17: Hoạt tính chống oxy hóa của Saponin triterpen..........................................65

xi
 MỞ ĐẦU
Rau má thuộc họ hoa tán (Apiaceae), có tên khoa học là centella asiatica, có
nguồn gốc ở các vùng nhiệt đới Srilanca, Indonesia, Iran, Ấn Độ và một phần vùng
Đông Nam Á. Rau má chứa khá nhiều chất có hoạt tính sinh học như Saponin
(asiaticosid, axit asiatic, madicassosid, axit madecassic), các phytosterol, tinh dầu
(vallerin, camphor, cineol), các khoáng chất (Ca, Fe, Mg, P, Zn…), các loại vitamin
(B1, B2, B3, C và K), amino axit (glutamic, serin, threonin, alanin, lysin, histidin),
tanin và alkaloid.
Rau má trong lịch sử đã được sử dụng như một loài thảo dược quý, từ nhiều thế
kỷ trước rau má đã được sử dụng làm thuốc ở các nước như Ấn độ, Trung Quốc, Việt
Nam… Rau má còn được người Trung Quốc cổ xưa coi là một phương thuốc diệu kỳ
“trường sinh bất lão”. Ở các nước Đông Nam Á rau má được sử dụng như là một
phương thuốc cải thiện thanh quản, cải thiện hệ trao đổi chất và chữa các bệnh về
đường hô hấp như, hen, suyễn, lao phổi; đuờng tiết niệu, làm lành vết thương, vết bỏng
nhanh chóng, bệnh nhiễm khuẩn vết thương, ung nhọt…. Lợi ích đó có được là nhờ
hợp chất triterpene saponin trong rau má (trong đó có 03 thành phần chính là
asiaticoside, axit madecassic và axit asiatic chiếm khoảng 1- 4%.
Trên cơ sở những nghiên cứu ở nước ngoài và trong nước cho thấy hợp chất
triterpen trong rau má rất được quan tâm, đặc biệt là ở các nước Trung Quốc, Ấn Độ,
Nhật Bản… Các hợp chất của triterpene được ứng dụng trong các sản phẩm y, dược,
thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp. Các nước này không chỉ nghiên cứu chiết xuất ra
các hợp chất triterpen hỗn hợp trong rau má mà còn đi sâu nghiên cứu các thành phần
trong hợp chất triterpene như asiatic, madecassic và asiaticoside để ứng dụng trong các
lĩnh vực khác. Ở Việt Nam việc nghiên cứu vấn đề này đang được bắt đầu. Xuất phát từ
mối quan tâm này chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết, tinh sạch thu chế
phẩm Saponin triterpen từ rau má và khảo sát một số hoạt tính sinh học”.
Để thực hiện đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số nội dụng sau:

1
- Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu rau má chứa Saponin triterpen.
- Nghiên cứu các hệ dung môi tách chiết hợp chất Saponin triterpen
- Nghiên cứu phương pháp tinh sạch Saponin triterpen.
- Khảo sát một số hoạt tính sinh học Saponin triterpen.

2
 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ RAU MÁ:
1.1.1. Tên gọi và phân loại
Rau má là một loài cây một năm thân thảo trong họ Hoa tán. Rau má hay còn
được gọi là Tích tuyết thảo hoặc lôi công thảo. Trên thế giới có khoảng 33 loài rau má,
nhưng ở Việt Nam chỉ có một loài là Centella asiatica.
Tên khoa học: Centella asiatica
Tên khoa học đồng nghĩa:
Hydrocotyle asiatica L, Trisanthus
cochinchinensis Lour

Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Apiales
Họ: Apiaceae
Chi: Centella
Loài: C.asiatica
Có nhiều cách để phân loại rau má. Có thể phân loại theo vùng, theo đặc điểm
thực vật, theo nguồn gốc.
Tên gọi và các tên đồng nghĩa của rau má ở các quốc gia thể hiện trong bảng
1.1 dưới day: [24]
Bảng 1.1: Tên gọi của rau má
STT Ngôn ngữ Tên gọi
1 Trung Quốc Luei Gong Gen, Tungchian
2 Anh Indian pennywort
3 Pháp Hydrocotyle asiatique

3
 4 Đức Asiatischer Wassernabel
5 Indonesia Kaki kuda, Pegagan, Antanan,
Gagan – gagan…
6 Ý Idrocotile
7 Nhật Isubo-kusa
8 Mauritius Bavilacqua
9 Tây Ban Nha Blasteostimulina

- Phân loại theo vùng: có 2 loại

+ Rau má vùng đồi: Lá nhỏ, thân nhỏ cứng bò sát mặt đất.
+ Rau má vùng đồng bằng: Lá to, thân to.
- Phân loại theo đặc điểm thực vật: có 03 loại
+ Rau má cọng tím: Thân tím, phiến là hình răng cưa.
+ Rau má mèo: Cây thấp, lá nhỏ bò sát mặt đất.
+ Rau má mỡ: Thân to, lá to xanh mướt và cây cao.
- Phân loại theo nguồn gốc: có 02 loại
+ Rau má ta: Có nguồn gốc ở Việt Nam từ rất lâu đời: lá nhỏ, thân bò sát mặt
đất.
+ Rau má tây phi: Có nguồn gốc từ Tây Phi, do nước ta mới nhập về: lá to xanh
mướt, cuống lá dài, thân to mượt, mịn và trơn, thường nhiều thân ít lá. [2]
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Rau má là loài cây rất quen thuộc ở Việt Nam, mọc tự nhiên khắp nơi, từ vùng
hải đảo, ven biển đến vùng núi, ở độ cao dưới 1800m. Loài cây này ưa ẩm, hơi chịu
bóng, thường mọc thành đám ở vườn, bờ đê nương rẫy, bờ ruộng, ven rừng. Vào mùa
mưa ẩm, rau má sinh trưởng rất mạnh, nhanh và khỏe. Cây ra hoa quả nhiều vào cuối
mùa hè đầu mùa thu, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Do có khả năng đẻ nhánh khỏe,
cây thường tạo thành từng đám dày đặc.

4
a. Thân
Thân cây rau má gầy và nhẵn, là loại
thân bò lan, màu xanh lục hay lục ánh
đỏ, có rễ ở các mấu. Nó có các lá hình
thận, màu xanh với cuống dài và phần
đỉnh lá tròn, kết cấu trơn nhắn với các
gân lá dưới dạng chân vịt. Lá có cuống
dài mọc từ gốc hoặc từ các mấu. Lá hơi
tròn, có mép khía tai bèo. Phiến lá có
gân dạng lưới hình chân vịt. Các lá mọc
ra từ cuống dài khoảng 5 – 20cm.

Hình 1.1: Thân và rễ cây rau má

b. Hoa
Hoa rau má có màu từ ánh hồng tới đỏ, mọc thành các tán nhỏ, tròn gần mặt đất.
Mỗi hoa được bao phủ một phần trong hai lá bắc mầu xanh. Các hoa lưỡng tính này
khá nhỏ (nhỏ hơn 3mm), với thùy tràng hoa. Hoa có 5 nhị và 2 vòi nhụy. Quả có hình
mắt lưới dày đặc, đây là điểm phân biệt nó với các loài trong chi Hydrocotyle có quả
với bề mặt trơn, sọc hay giống như mụn cơm.

5
 Hình 1.2: Hoa cây rau má

c.Rễ
Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc thẳng đứng. Chúng có màu trắng kem và được
che phủ bằng các lông tơ ở rễ. [2]
1.1.3. Phương pháp thu hoạch
Rau má sau khi trồng được 30 – 35 ngày thu hoạch lứa đầu tiên nhưng năng suất
chưa cao vì cây chưa bò dày. Năng suất cao từ lần thu hoạch thứ 2, thứ 3.
Có hai cách thu hoạch rau má:
Cách thứ nhất: Dùng dao hay liềm sắc cắt ngang cuống lá để lại phần thân (vì
thân bò sẽ phân cành và ra lá mới sau khi các mắt đốt có rễ). Thu hoạch rau má theo
cách này chỉ dùng rau má với mục đích làm nước giải khát.
Cách thứ hai: Thu hoạch hết cả rễ, thân, lá rau má còn gọi là thu hoạch kiểu
cuốn chiếu - nghĩa là thu hoạch đến đâu hết đến đó; vì rau má thường mọc lan theo
những bụi rất lớn, có thể lan rộng và đan xen giữa bụi này và bụi kia. Thu hoạch theo
cách này thường để dùng làm thuốc, cây càng già càng tốt. [11]
1.1.4. Thành phần hóa học của rau má
Về thành phần hóa học, rau má chứa khá nhiều hợp chấp có hoạt tính sinh học
như các saponin triterpen, các phytosterol, tinh dầu (vallerrin, camphor, cineol), các
khoáng chất (Ca, Fe, Mg, Mn, P, Zn…), các loại Vitamin (B1, B2, B3, C và K), amino

6
axit cần thiết (glutamic, serin, threonin, alanin, lysin, histidin), tanin và alkaloid có tên
là hydrocotylin. [3]
Theo kết quả nghiên cứu của Jacinda T.James và cộng sự năm 2008 thành phần
các Saponin triterpen trong rau má Tây Phi như sau: [23]
Bảng 1.2: Thành phần các Saponin triterpen trong rau má Tây Phi
Mẫu Asiatic acid Madecassic Asiaticoside Madecassoside
acid
Dịch huyền 0,16± 0,032 0,28 ± 0,036 1,38 ± 0,02 1,67 ± 0,012
phù tế bào
Mô 0,19±0,016 0,24 ± 0,013 2,46 ± 0,092 2,35 ± 0,089
Lá rau má 1,89 ± 0,08 1,97 ± 0,007 5,23 ± 0,025 4,76 ± 1,342

Theo nghiên cứu của Brinkhaus năm 2000 các saponin triterpen trong rau má
thường chiếm tỷ lệ từ 1% đến 8% tùy nơi trồng và mùa thu hái, trong đó bao gồm các
chất như: Asiaticoside, centelloside, madecassoside, brahmo-side, brahminoside,
thankuniside, sceffoleoside, centellose, and asiatic, brahmic, centellic and madecasic
acids. Tuy nhiên chiếm tỉ lệ lớn nhất vẫn là 04 loại asiatic acid, madecassic acid,
asiaticoside và madecassoside.
Ngoài ra trong rau má còn có các thành phần hóa học sau: Kết quả nghiên cứu
của GS.TS Hà Huy Khôi trên rau má Việt Nam: [3]
Bảng 1.3: Thành phần hóa học các hợp chất có trong rau má Việt Nam
Thành phần Rau má rừng Rau má mỡ
Năng lượng Kcal 2,5 20
Nước (g) 91,1 88,2
Protein (g) 3,1 3,2
Thành phần chính
Glucid (g) 3,1 1,8
Cellulose (g) 1,5 4,5

7
 Tro (g) 1,2 2,3
Muối khoáng Calcium (mg) 172 229
Phospho (mg) 24 20
Sắt (mg) 0,2 3,1
β – Caroten (mcg) 260 1300
VTM C (mg) 20 37
Vitamin
VTM B1 (mg) 0,13 0,15
VTM B2 (mg) 0,26 0,14

Kết quả nghiên cứu từ Dự án Phát triển cây thuốc của Ấn Độ, rau má có các
thành phần cơ bản sau: [22]

Bảng 1.4: Thành phần các hợp chất hưu cơ có trong rau má Ấn Độ
STT Thành phần Đơn vị Hàm lượng (/100gam)
1 Nước g 84,5 (86,9)
2 Năng lượng Kcal 37,0
3 Protein g 2,1
4 Chất béo g 0,5
5 Cacbonhydrat g 6,0
6 Calcium mg 224,0
7 Phospho mg 32
8 Sắt mg 1,32
9 Kẽm mg 3,95
10 Đồng mg 0,55
11 Caroten mcg 87,1

8
1.1.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam
1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Centella asiatica được sử dụng đầu tiên vào năm 1700 sau công nguyên
(Madaus, 1938). Có thể nó đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ thời tiền sử
(Kartnig, 1988) và được dùng như phương thuốc cho thời kỳ sinh nở với tên gọi là
“manduk – parni” (Madaus, 1938). Khoảng 500 năm sau công nguyên, Centella
asiatica đã được ghi lại bằng mật hiệu trong y học Sanskrit của người Ấn Độ. Rau má
cũng có tên trong phương thuốc chữa bệnh của người Java, quốc đảo Indonesia,
Madagascar và Trung Quốc (Kan, 1986).
Năm 1887, rau má được sử dụng làm thuốc chữa bệnh hủi (Wolfram, 1965).
Năm 1940, Bontemp đã chiết tách và tinh sạch được asiaticosid có trong rau má,
chứng minh được dược lý quan trọng và khả năng chữa bệnh của rau má là từ chất này;
tiếp theo là hàng loạt các nghiên cứu vào năm 1945 (Kartning, 1986) và nhóm nghiên
cứu Polonsky đã lần lượt tìm ra được cấu trúc phân tử của các hợp chất triterpenoids
trong rau má vào năm 1953-1959 (steingger and Hansel, 1992).
Ngày nay, các hợp chất triterpen được chiết từ rau má đã xuất hiện nhiều trong
các dược phẩm của nhiều quốc gia trên thế giới. Tuy nhiên, ở các nước châu Âu
thường đưa vào dưới dạng kết hợp cùng nhiều hợp chất khác, thường các hợp chất
triterpen chiếm tỉ lệ từ 2-4 %; nhưng ở các nước Đông Á con người sử dụng ở dạng
tươi hoặc được sấy khô rồi chiết thành dạng cao hoặc chế thành kem bôi.
1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam.
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về tính chất, công dụng của rau má đối với
sức khoẻ của con người. Ở Việt Nam từ thập kỷ 70, trường Đại học Dược đã nghiên
cứu chiết suất hỗn hợp triterpen từ rau má và bào chế một số sản phẩm có chứa cao rau
má để làm thuốc chống viêm, chống loét; Giáo sư y học nổi tiếng Việt Nam Tôn Thất
Tùng đã sử dụng chế phẩm này để điều trị cho các bệnh nhân mắc bệnh lao.
Năm 1982 GS. Đặng Hồng Vân (Đại học Dược Hà Nội) đã có những nghiên cứu
về hàm lượng saponin triterpen có trong rau má giữa miền Bắc và miền Nam.

9
 Năm 1990, nghiên cứu của dược sỹ Trần Việt Hưng về rau má và căn bệnh ung
thư.
Năm 2007, đề tài nghiên cứu của nhóm tác giả thuộc Khoa Sinh, Đại học Đà Lạt
về công dụng của rau má “Nghiên cứu giải độc lá ngón bằng rau má”.
Năm 2008, đề tài nghiên cứu của Thạc sỹ Đỗ Thị Thanh Huyền và cộng sự thuộc
Viện Công nghiệp thực phẩm là “nghiên cứu công nghệ sản xuất một số thực phẩm
chức năng và chế phẩm saponin từ cây rau má phục vụ cho công nghiệp dược phẩm”.
Năm 2010, nghiên cứu của Thạc sỹ Nguyễn Chí Dũng và cộng sự thuộc Trung
tâm CNSH & CNTP Hà Nội về nghiên cứu quy trình tách chiết và sản xuất viên nang
chức năng từ hợp chất Saponin trong rau má.
Ngoài ra những ứng dụng của rau má chỉ được nghiên cứu và ứng dụng ở Việt
nam chủ yếu dưới dạng cao rau má (dược Hậu Giang).
Thực tế trên cho thấy ở Việt Nam hiện nay mới bắt đầu có những nghiên cứu đi
sâu vào việc tách chiết các hợp chất triterpen từ rau má, hợp chất có lợi cho việc cải
thiện sức khoẻ cũng như ngăn ngừa bệnh lây nhiễm cho bệnh nhân trong thời gian hồi
sức. Cũng qua tìm hiểu trên thị trường công nghệ và sản phẩm của Việt Nam, Ấn Độ,
Trung Quốc, Mỹ, các nước Đông Âu, cho thấy với điều kiện của Việt Nam hiện nay,
chúng ta chỉ có thể nghiên cứu tách chiết các hợp chất triterpen từ rau má dưới dạng
hỗn hợp các hợp chất triterpen. Những điều tra về thị trường công nghệ và sản phẩm
cho thấy với những nghiên cứu về rau má và hợp chất triterpen trong rau má công
nghệ tuy đơn giản nhưng khi đi sâu vào việc tinh chế, làm sạch tạo ra được một sản
phẩm được thị trường chấp nhận là một vấn đề không đơn giản, cần có sự nghiên cứu
chi tiết và sâu sắc hơn.
1.2. HỢP CHẤT SAPONIN TRITERPEN
1.2.1. Khái niệm và cấu tạo của SaponinH
Khái niệm: Saponin là một glycoside tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực
vật và có trong một số động vật như hải sâm, cá sao. Theo tiếng Latinh “sapo” có nghĩa

10
là xà phòng và thực tế thường gặp là từ “saponification” có nghĩa là sự xà phòng hóa
trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp.
Cấu tạo: Saponin được cấu tạo từ sapogenin và phần đường. Phần đường có thể
gồm một hay một số phân tử monose (thường là D-Glucoza, D-Galactoza, L-Arabioza,
L-Rammoza) thông qua liên kết glucosid. [ 7, 8]

Hình 1.3: Cấu tạo chung của Saponin

1.2.2. Tính chất hóa lý:

Trong tự nhiên saponin từ các nguồn thực vật khác nhau, có sự đa dạng về tính
chất lý học, hóa học và đặc điểm sinh học, nhưng đa số chúng đều có những đặc điểm
cơ bản sau:
Khi tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch, tạo
nhiều bọt, gây tiêu huyết, ly giải hồng huyết cầu do làm tăng độ thấm qua màng
plasma, do vậy chúng có độc tính cao khi tiêm vào mạch máu. Nhưng một số Saponin
không độc hại có trong một số thực phẩm giá trị như đậu nành, đậu xanh, rau chân vịt,
kiểu mạch…

11
 Đa số các hoạt chất saponin có liên quan đến vị đắng, dễ gây kích ứng niêm
mạc. Tan trong nước, trong ethanol, methanol loãng, rất ít tan trong aceton, hexan.
Các saponin đều là chất hoạt quang, điểm nóng chảy của các saponin thường rất
cao (khoảng 2000C).
Tính tan là nhân tố quan trọng đối với hoạt tính sinh học và quá trình tách chiết
của saponin. Tính tan phụ thuộc vào cấu trúc của monose của saponin và tỷ lệ thành
phần, nồng độ của bidesmosit saponin. Dạng monodesmosid bản thân ít tan trong nước
(dạng tinh chế) và có thể được tách chiết dễ hơn do tác động lên tính tan của các hoạt
chất đi kèm. Ngoài ra, tính tan của saponin cũng bị ảnh hưởng bởi đặc tính của dung
môi chiết tách, nhiệt độ, pH, nước. Ví dụ: với nồng độ ethanol từ 30%-100%, tính tan
của soyasaponin Bb đạt giá trị cực đại (tại ethanol 60%).
Các Saponin triterpenoid khi tác dụng với antimoin triclorua trong dung dịch
chloroform phát huỳnh quang màu xanh dưới tia UV.
Trong quá trình chế biến, cấu trúc phức tạp của saponin có thể có sự biến đổi
hóa học, nó thậm chí còn có thể biến đổi một số đặc tính. Do dưới tác dụng của nhiệt
độ kiên kết glycosid bị đứt tạo thành các aglycone và glycone, các mạch đường oligo
hay đường đơn tùy thuộc vào phương pháp thủy phân hay điều kiện thủy phân.
Dưới tác dụng của enzim có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axit loãng,
Saponin bị thủy phân tạo thành genin (sapogenin) và phần đường gồm một hoặc nhiều
phân tử đường…Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogenin steroid hoặc
sapogenin triterpenoid dạng β-amirin (acid olenoic), dạng α-amirin (acid asiatic), dạng
lupol (acid buletinie) hoặc triterpen bốn vòng.
Saponin có loại axit, kiềm hoặc trung tính. Trong đó, triterpen saponin thường
trung tính hoặc axit. Steroid saponin nhóm spirostan furostan thuộc loại trung tính, còn
nhóm glicoancaloid thuộc loại kiềm. [ 9]
1.2.3 Hoạt tính sinh học
Ban đầu người ta sử dụng dịch chiết thô từ các cây có saponin để đánh giá hoạt
tính sinh học, với sự phát triển của công nghệ tách chiết, tinh chế, người ta ngày càng

12
phát hiện chính xác hoạt tính sinh học có liên quan đến những cấu trúc cụ thể của
saponin.
Saponin có khả năng làm căng, trương, vỡ hồng cầu gây ra hiện tượng giải
phóng hemoglobin là một trong những đặc điểm quan trọng nhất được phát hiện từ
saponin.
Saponin có độc tính với côn trùng, giun ký sinh, động vật thân mềm, kháng nấm,
virus và vi khuẩn. Độc tính của saponin với động vật máu nóng phục thuộc và nguồn,
thành phần, nồng độ của hỗn hợp saponin. Độc tính saponin dường như thể hiện mạnh
đối với đường tĩnh mạch và yếu hơn nhiều khi qua con đường tiêu hóa. Điều này được
cho rằng do khả năng cơ thể hấp thu saponin kém và hoạt tính phân hủy hồng cầu thấp
khi có mặt trong thành phần huyết tương.
Saponin có khả năng làm giảm nồng độ cholesterol, triterpen và các steroid
saponin có tác dụng chống ung thư. [ 7, 8]
1.2.4. Phân loại Saponin
Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc của aglycone có thể chia Saponin thành 02
loại: Saponin triterpenoid và Saponin steroid.
1.3. SAPONIN STEROID
Các saponin steroid có rất nhiều trong các cây Một lá mầm như cây họ Củ nâu,
thủy tiên, Hành, Râu hùm.
Trong thực vật, các saponin này ở dạng glycosid, chứa các aglycon steroid, gắn
với các phần đường (glucose, galactose…). Khi thủy phân bằng acid loãng hay bằng
enzym thì sẽ nhận được các aglycon steroid được gọi là các sapogenin steroid. Các
saponin steroid được chia thành các nhóm sau: [ 7, 8]
a. Nhóm spirostan:
Ta xét 3 chất sapogenin làm ví dụ: sarsasapogenin, smilagenin, tigogenin.
Những chất này có 27 carbon như cholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 20-27 tạo thành
2 vòng có oxy (16, 22 và 22, 26 diepoxy), một vòng là hydrofuran (vòng E) và một

13
vòng là hydropyran (vòng F). Hai vòng này nối với nhau bởi 01 carbon chung ở C-22.
Mạch nhánh này được gọi là mạch nhánh spiroacetal.
Ba chất trên là 3 đồng phân. Smilagenin và tigogenin khác nhau do cấu hình ở
C-5. Còn sarsasapogenin và smilagenin thì khác nhau do cấu hình ở C-25.
Sarsasapogenin có nhóm methyl ở C-25 hướng axial có cấu hình tuyệt đối 25S,
smilagenin thì nhóm methyl ở C-25 hướng equatorial có cấu hình tuyệt đối 25R.
Các sapogenin nhóm này có nối vòng C và D trans (khác với glycosid tim). Còn
vòng A và B có thể là cis như ở chất sarsasapogenin và smilagenin hoặc có thể là trans
như ở chất tigogenin. Công thức lập thể của 3 chất sarsasapogenin Smilagenin và
tigogenin.
Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng
để bán tổng hợp các thuốc steroid. Hai sapogenin quan trọng nhất là diosgenin (có chủ
yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave).
Ở dạng glycosid phần đường được nối vào OH ở C-3, một số ít trường hợp ở C1.
Mạch đường thường phân nhánh và phức tạp. Ví dụ digitonin là một saponosid có trong
cây digital, có mạch đường gồm 5 đơn vị đường và phân nhánh:
b. Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ khác
là vòng F bị biến đổi. Trường hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm alcol bậc một ở C-26
được nối với đường glucose. Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzym hoặc bởi acid) thì
xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm
spirostan. Ví dụ sarsaparillosid dưới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở
C-26 sẽ chuyển thành parillin.
Trường hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy ví dụ
avenacosid có trong yến mạch (Avena L. Họ Lúa - Poaceae) Avenacosid A cũng có 2
mạch đường . Khi thủy phân cắt đường glucose ở C-26 thì cũng chuyển thành dẫn chất
nhóm spirostan.
Sarsaparillosid và avenacosid A đều có 2 mạch đường. Người ta gọi đây là các
bidesmosid (desmos = mạch).

14
 c. Nhóm aminofurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid nói
ở trên nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2. Ví dụ jurubin, là saponin có trong Solanum
paniculatum
d. Nhóm spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của
vòng F được thay bằng NH. Một điểm cần chú ý là ở đây có isomer ở C-22 (khác với
nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc (= cà lá xẻ ) Solanum laciniatum
có cấu trúc (25R) 22a còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc
(25S) 22b.
e. Nhóm solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này. Ở đây 2
vòng E và F cùng chung 1C và 1N.
Những chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có chứa N
vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất
glycoalcaloid.
Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin
steroid có cấu trúc mạch nhánh khác ví dụ polypodosaponin và oslandin được Jizba
phân lập 1971 từ thân rễ cây Polypodium vulgare L. Oslandin là một bidesmosid có vị
ngọt. a-spinasterol glycosid có trong cây chè Camelia sinensis (L.) O. K.tze (Thea
sinensis L.). [8, 10]
1.4. SAPONIN TRITERPEN
1.4.1. Cấu tạo và phân loại.
Các saponin triterpenoid là các glycoside mà phần sapogenin có cấu trúc
triterpen với 30 nguyên tử cacbon. Chúng rất khác nhau về cấu trúc hóa học và được
chia thành hai loại dựa vào số lượng vòng hydrocacbon. Đó là các saponin triterpenoid
pentacyclic và các saponin triterpenoid tetracyclic.
Các saponin triterpenoid khi dehydrogen hóa với selen thì cho hỗn hợp các dẫn
xuất naphatalen và phenanthren, chủ yếu là sapotalen (1,2,7 trimethyl naphtalen).
Ở thực vật, các nhóm saponin triterpenoid được sinh tổng hợp trên nguyên tắc
vòng qualen. Người ta tìm thấy chúng trong khoảng 70 họ thực vật, phần lớn là loài hai

15
lá mầm và chúng tồn tại ở dạng hòa tan trong dịch tế bào. Tỉ lệ các saponin triterpenoid
trong thực vật rất cao. Ví dụ: rễ cam thảo có từ 2 – 12%, hạt Aescullus hippocastanum
có 13%, ngoài ra còn có nhiều ở vỏ cây Quillaia và nhân sâm.
1.4.1.1. Saponin triterpenoid pentacyclic.
Phần aglycone của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân thành các nhóm
nhỏ olean, ursan, lupan, hopan.
a - Nhóm olean (I) : Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc
nhóm này. Phần aglycon thường có 5 vòng và là dẫn chất của 3-β hydroxy olean 12-
ene, tức là β-amyrin. Một vài aglycon làm ví dụ (công thức A):
- Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = -CH3, R3 = -COOH
- Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CH2OH , R3 = -COOH
- Gypsogenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CHO , R3 = -COOH.
Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào
C-28 theo dây nối ester. Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 10-11 đơn
vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường
29 30

19 20 21

12
13 22
18
11
25 26
28
14 16
1 9
2 10 8
15
3 27
5
4 6 7

23 24

Hình 1.4: Khung Olean

b - Nhóm ursan (II): Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean
chỉ khác là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19.

16
Các sapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3-β hydroxy ursan 12-ene,
tức là α-amyrin. Những saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean. Cinchona
glycosid A, Cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na, asiaticosid, madecassoside
có trong rau má là những saponin của nhóm này.
30

29
20
19
E

25 26
D 28
C

A B 27

23 24

VD: Asiaticosid (trong rau má)

Hình 1.5: Khung Ursan

c - Nhóm lupan (III): Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống như
các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thường có nối
đôi ở vị trí 20-29. Lấy một ví dụ là saponin có trong rễ cây Ô rô Acanthus iliciformis
Linn.: [α-L - arabinofuranosyl (1-4) β-D glucoropyranosid (1-3)]-3-β-hydroxy-lup-
20(29) ene (IIIa). Một số saponin có trong cây ngũ gia bì chân chim cũng thuộc nhóm
này

17
 29

20
30

25 26
C D 28

A B 27

23 24

Hình 1.6: Khung Lupan

d - Nhóm hopan (IV): Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D giống
như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và nhóm
methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17. Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin
A có trong cỏ thảm Mollugo hirta L.

30
25 26 22
C D
29

A B 27

23 24

Hình 1.7: Khung Hopan

1.4.1.2. Saponin triterpenoid tetracyclic
Phần aglycone có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammaran,
lanostan, cucurbitan

18
 a - Nhóm dammaran (V): Ðại diện là các saponin của nhân sâm. Phần aglycon
gồm 4 vòng và một mạch nhánh. Khi tác dụng với acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo
thành vòng tetrahydropyran. Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người
ta đã thu được các genin thật. Hai genin chính là: protopanaxadiol và protopanaxatriol.
Phần đường nối vào OH ở cabon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào OH
ở mạch nhánh.
Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong hạt táo (Ziziphus
jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst.
22 24
21 20 27
25
12 23
13 17
11
19 18 26
14 16
1 9
2 10 8
15
3 5 30
4 6 7

28 29

Hình 1.8: Khung Dammaran

b - Nhóm lanostan (VI): Holothurin A, một trong những saponin có trong các
loài hải sâm - Holothuria spp. là một ví dụ của nhóm này.
Một nhóm phụ của nhóm lanostan là nhóm cycloartan có cấu trúc 9,19 cyclo
(9b) lanostan. Các saponin abrusosid A, B, C, D có trong cam thảo dây Abrus
precatorius là những saponin thuộc nhóm này.

19
 22 24
21 20 27
25
18
12 23
13 17
11
19 26
14 16
1 9
2 10 8
15
3 5 30
4 6 7

28 29

Hình 1.9: Khung Lanostan

c/ Nhóm cucurbitan (VII). Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ
Cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí C10 lại đính ở C9.
22 24
21 20 27
25
12 23
13 17
11
H 26
14 16
1 9
2 10 8
15
3 5 30
4 6 7

28 29

Hình 1.10: Khung Cucurbitan

1.4.2. Tính chất lý hóa của Saponin triterpen.
Nhóm Triterpen mang khá đầy đủ tính chất của nhóm Saponin như:

20
 Có vị đắng, dễ gây kích ứng niêm mạc, có tác dụng phá huyết và có khả năng
tạo bọt nhiều và bền vững trogn môi trường acid.
Tan tốt trong nước, trong ethanol, methanol loãng, rất ít tan trong aceton,
hecxan. Khi thủy phân các saponin (bằng dung dịch acid loãng và nóng bằng enzym)
thì sẽ được các phần đường và phần aglycon hay genin.
Phản ứng mầu Liebermann – Burchard: Saponin triterpen được hòa tan trong
chlorofom và cho vào hỗn hợp dung dịch anhydrid acetic acid sulfuric thấy phản ứng
đổi màu từ xanh da trời, lục, hồng đến đỏ.
Phản ứng Rosenheim: Các saponin triterpen cho mầu tím, chuyển sang mầu
xanh lơ sau 20 phút khi tác dụng với hỗn hợp chlorofom và acid tricloracetic. [8, 10]
1.4.3. Cấu tạo của các hợp chất Triterpen có trong rau má:
Trong rau má các Saponin triterpen chiếm chủ yếu là: Asiaticoside,
Madecassoside, Asiatic axit và Madecassic acid. [8, 10]
Bảng 1.5: Công thức cầu tạo của các hợp chất Saponin triterpen trong rau má.

Asiaticoside Tên hóa học: Urs-12-en-28-

oic acid, 2,3,23-trihydroxy-, O-6-deoxy-
.alpha.-L-mannopyranosyl- (1.fwdarw.4)-
O-.beta.-D-glucopy ranosyl-(1.fwdarw.6)-
.beta.-D-
glucopyranosyl ester, (2.alpha., 3.beta.,4
.alpha.)-
Công thức: C48H78O19
Trọng lượng phân tử: 959.12

Madecassoside Tên hóa học: O-6-Deoxy-alpha-L-

mannopyranosyl-(1.4)-O-beta-D-
glucopyranosyl-(1.6)-beta-D-
glucopyranosyl (2alpha,3beta,4alpha,6b
eta)-2,3,6,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-
oate
Công thức: C48H78O20
Trọng lượng phân tử:
975.12

21
Asiatic acid Tên hóa học: Urs-12-en-28-
oic acid, 2,3,23-trihydroxy-
, (2alpha,3beta,4alpha)-
Công thức: C30H48O5
Trọng lượng phân tử: 488.70

Madecassic acid Tên hóa học: 8,10,11-trihydroxy-9-

(hydroxymethyl)-1,2,6a,6b,9,12a-
hexamethyl-
2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-
tetradecahydro-1H-picene-4a-
carboxylic acid
Công thức: C30H48O6
Trọng lượng phân tử: 504.70

1.4.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất saponin triterpen
Cho đến nay trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu, thử nghiệm
trên động vật và nghiên cứu in vitro về công dụng của Saponin triterpen trong rau má,
cụ thể như sau:

1.4.4.1 Khả năng sản sinh collagen:

Năm 1978, Poizot và Dumez đã nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp
asiaticosides lên da, thử nghiệm được tiến hành trên chuột và thỏ; Kết quả cho thấy
hỗn hợp asiaticosides góp phần làm mau liền vết thương.
Theo nghiên cứu của các nhóm F.Bonte (1994, 1995), R.Tenni (1988) và FX
Maquart (1990) từ các dịch chiết Saponin triterpen cho thấy có tác động mạnh mẽ lên
việc duy trì làn da khỏe mạnh và ngăn chặn có hiệu quả hiện tượng lão hóa:
Asiaticosid và madecassosid, cả hai triterpen này đều có khung ursenoic và đều có tính
kích thích fibroblast tiết ra collagel trả lại đầy đặn và săn chắc cho da. Bonte cho biết

22
cả asiaticosid và madecassosid đều kích thích sự hình thành collagen I, trong khi đó
một mình madecassosid chỉ giúp tiết ra loại Collagen III. Maquart sử dụng công thức
gồm 30% acid asiatic, 30% acid madecassic và 40% asiaticosid, kết quả nghiên cứu
của ông và đồng nghiệp cho thấy cả 3 hoạt chất đều tạo ra gian bào (làm cho da đầy
đặn và nõn nà, bóng bẩy), nhưng chỉ một mình axit asiatic có khả năng kích thích
fibroblast tiết ra collagen (làm cho da có khả năng đàn hồi tốt, không thể xay ra hiện
tượng gấp nếp và chảy nhão) [14, 27]
1.4.4.2 Khả năng kháng khuẩn, nấm và kháng virut:
Năm 1965, Tschesche và Wulff đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn, nấm của
asiaticoside trên 07 loại vi sinh vật khác nhau: Kết quả cho thấy asiaticoside có khả
năng kháng Pseudomonas pyocyaneus và Trichoderma mentagrophytes ở nồng độ là
1000µg asiaticosid/ml canh trường.
Năm 2009, M.Obayed Ullah và cộng sự đã thử nghiệm khả năng kháng khuẩn,
kháng nấm trên 16 chủng khác nhau bao gồm: Bacillus cereus, Bacillus megaterium,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger …
Kết quả cho thấy dịch chiết Saponin triterpen từ rau má đều có khả năng kháng 16 loài
trên ở nồng độ từ 300 – 5000 µg/ml. [23]
Năm 1989, Zheng và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết
asiaticosid từ rau má lên HSV -2 (Herpes simplex virus) là loại vi rút gây viêm màng
não, kết quả cho thấy asiaticosid có khả năng chống lại hoạt động của HSV-2. [24]
Theo Giáo sư, Dược sỹ Bửu Hội, Rakoto Ratsimamanga và Boiteau, Rau má
chứa một glycoside gọi là asiaticosid với công thức C55H88O23. Chất glycoside này có
tinh thể tan trong rượu, độ nóng chảy 230 – 2330C, có thể cho dẫn xuất tan trong nước
gọi là oxyasiaticoside có tác dụng điều trị được bệnh lao.
1.4.5.3 Chống ung thư:
Nghiên cứu của Dalton và Ehrlich cũng đã ghi nhận phần các hợp chất Saponin
triterpen của rau má diệt được các tế bào ung thư loại lymphoma, nhưng đã không xác
định được chính xác loại terpenoid nào; trong khi đó hoạt tính diệt bào của các

23
triterpenoids loại ursane như axit ursolic và oleanolic rất có thể giống cơ chế của các
axit asiaticoside. Các nghiên cứu “in vitro” về axit ursolic va oleanolic ghi nhận các
axit này có khả năng ngăn chặn sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư ở các
nồng độ từ 1 đến 20 microM. (Anticancer Research số 16 – 1996 và Cancer letter số
10 – 1996). Mặt khác cả axit oleanolic và ursolic đều làm giảm sự sinh sản của tế bào
nội mạc ở nồng độ từ 5 đến 20 microM (Planta Medica số 64 – 1998). Do đó các
triterpenoid này rất có thể sẽ hữu dụng để trị ung thư bằng cách ngăn chặn tiến trình
angiogenesis (tiến trình tăng trưởng của các mạch máu nhân tạo để nuôi dưỡng tế bào
mới sinh) cần đến sự sinh sản của các tế bào nội mạc để tạo ra các mạch máu mới. Các
axit oleanolic và ursolic cũng có các tác động chống u bướu.
Trong nghiên cứu về khả năng chống ung thư của rau má, kết quả ghi nhận là
liều cho uống một dịch chiết rau má chứa lượng cao terpenoid 1g/kg trong 5 ngày,
uống cách nhật, ức chế được sự tăng trưởng của bướu ung thư và kéo dài được thêm
thời gian sống của chuột bị chích tế bào ung thư lymphoma vào cơ thể. Sự ức chế rõ
rệt hơn khi chuột được cho dùng dịch chiết Rau má trước khi bị chích tế bào ung thư
và cơ thể, kết quả không rõ rệt khi bắt đầu cho chuột dùng dịch chiết rau má 10 ngày
sau khi bị chích tế bào ung thư. Liều tương đương để áp dụng đối với người vào
khoảng 4,8 g/ngày. [12]
1.4.4.4 Một số công dụng khác:
Điều hòa miễn dịch: Qua hai nghiên cứu của Dicarlo et al (1964) trên chuột và
nghiên cứu in vitro của Labadie et al (1989).
Có khả năng chống co thắt: được chứng minh bằng nghiên cứu in vitro thử
nghiệm trên lợn của Dhar et al (1968). [26]
Trong rau má chứa hoạt tính sinh học quan trọng như madecassol, asiatic acid,
saponin asiaticosid, thankunisid, isothankunisid giúp sinh cơ. Tính sinh cơ của rau má
đã được chứng minh là sinh cốt giao (gelatin), đặc biệt là sinh sợi myosin và elastin là
2 chất cốt giao cơ bản trong việc tham gia cấu tạo da, cơ, xương, sinh hồng cầu, bổ

24
máu, lọc máu, liền sẹo, chống nhăn và giải độc gan, chống xơ gan, tăng trí nhớ, an
thần, chống stress… [12, 16]
1.4.5. Ứng dụng Saponin triterpen:
1.4.5.1. Ứng dụng trong y tế
Một số công trình nghiên cứu của thế giới trong những năm gần đây một phần
nào đã cho thấy xu hướng sử dụng các sản phẩm từ thảo mộc trong việc bảo vệ, bồi bổ
sức khoẻ đã được nghiên cứu từ rất lâu và Saponin triterpen trong rau má được sử
dụng làm thuốc chữa khá nhiều, điều này được thể hiện rõ trong các công bố ở bảng
1.7, 1.8. [23, 26]
Bảng 1.6: Một số công trình nghiên cứu khả năng chữa bệnh của rau má của các
quốc gia trên thế giới.
Tên bệnh Quốc gia Tác giả nghiên cứu
Viêm Ấn Độ Burkill (1966)
cuống phổi Fiji Singh (1986)
Ỉa chảy Ấn Độ Saklani (1989)
Philippin Velazco (1980)
Thái Lan Anderson
Bệnh lỵ Banglades Alam (1992)
Ấn Độ Burkill (1966), Saklani (1989), Rao (1982),
Pushpangadan (1984), Deka (1982), Boisya
(1980)
Động kinh Ấn Độ Ramaswamy (1970)
Malaysia Burkill (1966)
Sốt Guam Haddock (1974)
Ấn Độ Shah (1971), Sahu (1984)
Nepal Bhattarai (1989)
Thái Lan Mokkasmit (1971)
Viêm dạ Nepal Manandhar (1986)
dày
Viêm gan Ấn Độ Pushpangada (1984)
Đài Loan Yanfg (1987), Lin (1990)
Viêm Guam Hackdock (1974)
Ấn Độ Rastoni (1960)
Thái Lan Panthong (1986)
Tonga Singh (1984)
Bệnh Trung Quốc Shishkin (1973)

25
phong Ấn Độ Singh (1980), Jain (1984), Sahu (1989),
Ikram (1981), John (1984)
Madagascar Voigtlander (1984)
Nepal Suwal (1970)
Bệnh bạch Ấn Độ Ramaswamy (1970), Rastogi (1960)
da
Bệnh tâm Ấn Độ Chopra (1949), Tiwari (1979), Rastogi
thần (1960)
Fuji Singh (1986)
Nigeria Adesina (1982)
Dưỡng não Ấn Độ Ramaswamy (1970), Rastogi (1960), John
(1984), Singh (1980), Shah (1971),
Sebastian (1984), Sahu (1989), Ikram
Nepal (1981)
Nigeria Suwal (1970)
Thái Lan Adesina (1982)
Wasuwar (1967), Mokkhasmit (1971ab)
Giảm đau Nigeria Adesina (1982)
Papua New Holsworth (19830
Guinea
Thấp khớp Ấn Độ Chopra (1949)
Nepal Suwal (1970)
Bệnh giang Ấn Độ Chopra (1949), Ikram (1981)
mai Nepal Suwal (1970)
Thuốc bổ Banglades Alam (1992)
Trung Quốc Shishkin (1973)
Ấn Độ Chopra (1949), Sebastian (1984), Ikram
(1981)
Malaysia Burkill (1966)
Nepal Suwal (1970)
Thái Lan Anderson (1986), Mokkhasmit (1971)
Lành vết Fiji Singh (1986)
thương Ấn Độ Holdsworth (1983), Jain (1984)
madagascar Voigtlander (1984)
Malaysia Burkill (1966)
Papua New Holdsworth (1983)
Guinea
Ấn Độ Jain (1984), Sebastian (1984)

26
 Bảng 1.7: Thành phần cao rau má trong các loại thuốc đông y
chữa bệnh
Tên bệnh Thành phần của cao rau má
(%)
Bệnh nhiễm trùng
Sốt 11
Kích thích ăn uống 10
Giang mai 11,5-37
Ho gà 100
Viêm phế quản 100
Bệnh lao 16,6
Bệnh phong 50
Thuốc giải độc 100
Chứng loạn thần kinh 5
Căng thẳng thần kinh 30
Động kinh 50
Chống béo phì 17
Mất ngủ 100
Chảy máu cam 28,5
Nhiệt miệng 65
Mụn trứng cá 90
Bệnh trĩ 40
Đái tháo đường 26
Hen suyễn 90
Vô sinh 14
Tăng sinh lực cho nam 8
Lọc huyết thanh 13

1.4.6.2 Ứng dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm:

Các nghiên cứu chuyên sâu về từng hoạt chất Saponin từ rau má đã giúp các
thương hiệu mỹ phẩm lớn như Guerlan, Estee Lauder, Givenchy, Orlanne, Clinique…
nhanh chóng hình thành nhiều loại mỹ phẩm cao cấp mới chứa chất chiết xuất từ rau
má dưới dạng creame, lotion gel chống lão hóa, chống nhăn và dưỡng da. Ngoài ra,
người ta cũng đưa ra hoạt chất rau má vào các dạng mặt nạ chăm sóc mặt và toàn thân,
vào các loại dầu massage, các loại xà bông, sữa tắm để điều trị chàm, mụn nhọt và một
số bệnh viêm da.

27
 Qua các công trình đã công bố của Trung Quốc và Ấn độ là hai quốc gia phát
triển mạnh nhất trong việc chiết xuất các hợp chất triterpen (đặc biệt là 3 hợp chất axit
asiatic, madecassic và asiaticoside) và đã sản xuất dưới dạng sản phẩm thương mại bán
cho khắp các nước trên thế giới phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt là lĩnh
vực dược.

Hình 1.11: Một số sản phẩm từ rau má:

28
 Hiện nay, ở nước ta rau má chủ yếu được sản xuất dạng trà tan và nước uống
đóng hộp.

Hình 1.12: Một số sản phẩm thực phẩm sản xuất từ rau má

29
 CHƯƠNG II:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Rau má:
Rau má mua ở chợ, nguồn từ Văn Giang – Hưng Yên, Hà Đông – Hà Nội, Vĩnh
Phúc. Rau má tươi → rửa sạch → sấy khô → nghiền mịn.
Rau má khô nguồn từ Vĩnh Phúc, Bắc Giang….
2.1.2. Hóa chất:
- Hóa chất: Etanol 400 nhà máy rượu Hà Nội, n-butanol, chlorofom của J.T
Barker (Pittsburgh, Mỹ), silicagel 60 F254 của Merck…
- Các chủng vi sinh vật thử nghiệm do bệnh viện Quân y 103 cung cấp
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị:
Thiết bị thí nghiệm gồm: Tủ sấy, máy cất quay, thiết bị sấy phun, máy HPLC
(Shimadzu, Nhật)… của Phòng Thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm Hà Nội, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường
Đại học Bách khoa
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp chiết tách saponin triterpene
2.2.1.1 Tách chiết Saponin triterpene thô bằng dung môi ethanol
Áp dụng quy trình chiết trong Dược điển Anh năm 2009, dung môi để chiết
triterpen là ethanol 400.
Rau má tươi được đem sấy đạt độ khô 12%, sau đó nghiền nhỏ thành bột; cho
bột này vào bình thủy tinh miệng rộng cùng với một lượng ethanol 400 vừa đủ, tiến
hành trộn đều, ủ trong 2 giờ cho nguyên liệu ngấm đều dung môi. Tiếp đó tiến hành
cho bột rau má đã ủ vào bình ngấm kiệt, và bổ sung 400 ngập phần nguyên liệu 2 –
4cm, ngâm 24 giờ tiến hành mở van cho chảy nhỏ giọt để thu dịch chiết và tiếp tục bổ
sung ethanol 40% để đạt được tỉ lệ chiết rau má/ethanol là 1:8. Dịch chiết được cô cách

30
thủy bằng thiết bị bốc hơi chân không, sau đó sấy khô ở 800C đến khối lượng không
đổi và thu được cao có chứa saponin triterpene, cao này được gọi là cao cồn có chứa
saponin. [8, 26]
2.2.1.2 Phương pháp chiết saponin triterpene thô bằng nước cất
Lấy 1000g rau má tươi sau khi đưa vào máy ép nghiền trục vít thu được một
lượng dịch là 573,8 g, và 421g bã. Lượng bã được bổ sung thêm 842 ml nước cất và
đun khối dịch lên nhiệt độ 600C trong thời gian 2h, khối dịch được làm nguội và tiếp
tục cho vào ép trục vít loại bỏ bã được 382,5g bã. Dich ép lần 2 được trộn với dịch
ép lần 1, sau đó cô đặc 10 lần và sấy phun thu được bột Saponin triterpen thô. [8]
2.2.2. Phương pháp tinh sạch saponin triterpen:
2.2.2.1 Tinh sạch Saponin triterpen bằng n-Butanol và chlorofom:
Theo nguyên tắc các Saponin triterpen tan trong n-Butanol mà không tan trong
chloroform. Vì vậy, đầu tiên dùng n-Butanol để chiết triterpene có trong cao Saponin
triterpen thô, sau đó dùng chloroform để loại tạp chất.
Bước 1: chiết nóng bằng n-Butanol hai lần.
+Lần 1: Tỉ lệ cao Saponin ethanol: n-Butanol là 1:8, đun hồi lưu trong 1h ở
1000C (có khuấy từ). Lọc dịch chiết và thu được dịch chiết lần 1, còn phần cao thu
được đem chiết lần 2.
+ Lần 2: Với tỉ lệ cao cồn: n-butanol là 1: 5, đun hồi lưu trong 1h ở 1000C (có
khuấy từ). Lọc nóng dịch chiết và thu được dịch chiết lần 2, bỏ bã cao.
Dịch chiết lần 1 và 2 đem cô đặc máy cô chân không. Đem dịch chiết đã cô sấy
ở 800C đến khối lượng không đổi và thu hồi được cao saponin butanol (cao có chứa
hỗn hợp các saponin). Dung môi n-butanol được thu hồi.
Bước 2: Cao Saponin butanol tiếp tục đem tinh sạch bằng chloroform 2 lần.
+ Lần 1: Với tỉ lệ là cao thô saponin: chloroform là 1: 7. Cho chloroform vào
cao thô và khuấy đều, để trong vòng 15- 20 phút cho chloroform hòa tan hết tạp chất
cho trong cao thô, gạn bỏ dịch chlorofom ở trên thu được cao saponin lần 1.

31
 + Lần 2: Cao saponin thu được ở lần 1 tiếp tục cho chloroform vào với tỉ lệ 1:5
để tinh sạch lần 2. Cho chloroform vào cao, khuấy đều, để trong thời gian 15 – 20 phút
sau đó chiết lấy dịch và sấy khô đến khối lượng không đổi. Cao thu được là cao
saponin toàn phần, cao này có chứa hỗn hợp các saponin. [8, 26]
2.2.2.2. Phương pháp kết tủa saponin triterpen bằng ete
Theo các tài liệu đã công bố cho biết hợp chất Saponin có thể bị kết tủa dạng
tinh khiết trong ete khi được tinh sạch sơ bộ. Chúng tôi tiến hành lấy cao cồn Saponin
triterpen đem chiết nóng 2 lần bằng n-Butanol (các bước tương tự như trên) thu được
dịch n-Butanol đem cô dịch rồi bổ sung ete etylic khan theo tỉ lệ 1:10 thu được các hạt
tinh thể mầu trắng. Các hạt tinh thể trắng được tách ra khỏi dịch đem sấy khô đến khối
lượng không đổi thu được Saponin triterpen toàn phần. [8]
2.3. PHƯƠNG PHÁP LOẠI BỎ CHẤT MÀU
Cao Saponin triterpen thu được bằng phương pháp chiết suất tuy đã qua nhiều
giai đoạn loại tạp nhưng vẫn chưa thật sự tinh khiết, nhất là vẫn còn một lượng lớn các
chất màu, chất nhựa và các chất màu tạo thành trong quá trình chiết tách có sử dụng
nhiệt vì vậy cần phải loại bỏ các hợp chất này để cho sản phẩm tinh sạch hơn.
2.3.1 Phương pháp tảy màu bằng than hoạt tính
Than hoạt tính – là một chất gồm chủ yếu là nguyên tố carbon ở dạng vô định
hình (bột), một phần nữa có dạng tinh thể vụn grafit (ngoài carbon thì phần còn lại
thường là tàn tro, mà chủ yếu là các kim loại kiềm). Than hoạt tính có diện tích bề mặt
ngoài rất lớn, nếu tính ra đơn vị khối lượng là từ 500 đến 2500 m2/g, do vậy nó là một
chất lý tưởng dùng để lọc hút nhiều loại hóa chất.
Tiến hành cho dịch chiết Saponin triterpen đã qua các công đoạn tách và sạch
chạy qua cột được nhồi than hoạt tính. [8]
2.3.2 Phương pháp tảy màu bằng silica gel
Silica gel thực chất là điôxit silic. Công thức hóa học đơn giản của nó là
SiO2.nH2O (n<2), nó được sản xuất từ natri othosilicat (Na2SiO4) hoặc Silic
TetraClorua (SiCl4). Silica gel là dạng hạt, có cấu trúc rỗng của Silica được tổng hợp

32
từ oxyt silic. Nó có dạng cục hoặc viên hình cầu tuỳ thuộc phương pháp tạo hạt khi
điều chế, có loại trong suốt như thuỷ tinh, có loại đục. Độ xốp thay đổi trong giới hạn
20 - 60%, đường kính lỗ xốp khoảng 3 - 10 nm, bề mặt riêng 200 - 800 m2/g.
Tiến hành cho dịch chiết Saponin triterpen đã qua các công đoạn tách và tinh
sạch chạy qua cột được nhồi Silicagel. [20]
2.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TRITERPEN
2.4.1. Phương pháp định tính Saponin triterpen
2.4.1.1 Phương pháp định tính Saponin triterpen bằng phản ứng tạo bọt.
Dựa vào tính chất dễ tạo bọt của saponin để có thể phát hiện sơ bộ Saponin, đối
với đa số các Saponin triterpen tạo bọt bền trong môi trường axit.
Cách tiến hành: lấy hai ống nghiệm cao 25cm, ống thứ nhất cho 5ml dung dịch
NaOH 0,1N (pH 13), ống thứ hai cho 5ml dung dịch HCl 0,1N (pH 1). Cho vào mỗi
ống 5ml dung dịch Saponin trong hòa tan trong cồn 400C. Lắc mạnh 2 ống, nếu có bọt
nhiều và bền vững ở môi trường kiềm (ống 1) là Saponin steroid, có bọt nhiều và bền
vững ở môi trường acid (ống 2) là saponin triterpen. [8]
2.4.1.2 Phản ứng Liebermann – Burchard:
Người ta còn có thể xác định saponin thuộc nhóm triterpenoid hay nhóm steroid
bằng phản ứng cổ điển được áp dụng nhiều nhất là phản ứng Lieberman Buchard hay
còn gọi là phản ứng tạo mầu. Theo lý thuyết nếu là saponin triterpenoid phản ứng sẽ
cho mầu nâu đỏ, còn nếu là saponin steroid phản ứng sẽ cho màu xanh lá cây.
Cách tiến hành: lấy 1ml anhydrid acetic + 1ml chlorofom đã để lạnh ở 00C, sau
đó thêm 1 giọt acid sulfuric. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch saponin toàn
phần, lắc mạnh chờ phản ứng xảy ra. [8]
2.4.1.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng:
Chạy trên bản mỏng là Silicagel 60F254 của Merck
Mẫu thử là cao saponin triterpen toàn phần của rau má được hòa tan bằng
ethanol 400 và mẫu chuẩn là Saponin triterpen của Pháp.
Tiến hành chấm sắc kí và chạy sắc kí với hệ dung môi là:

33
 Ethanol : Methanol = 6:4

Bản sắc kí sau khi chạy cách mép trên khoảng 1cm thì lấy ra ra để khô trong
không khí và soi dưới đèn tử ngoại để quan sát các vết. Dưới đèn tử ngoại thì saponin
triterpenoid có huỳnh quang màu xanh. Tiếp đến, sử dụng thuốc thử andehyt acetic và
H2SO4 với tỉ lệ 9:1 để phun và bản mỏng, sau đó sấy ở nhiệt độ 1200C, thời gian 15
phút lấy ra quan sát kết quả (các vệt có mầu xanh đậm). [16, 30]
2.4.2 Phương pháp định lượng Saponin triterpen
2.4.2.1. Định lượng Saponin triterpen bằng phương pháp cân khối lượng không đổi
Cân chính xác lượng bột rau má khô, đem chiết bằng dung môi cồn hoặc nước.
Dịch chiết thu được đem cô chân không đến nồng độ dịch chiết giảm 10 lần. Tiếp tục
sấy ở nhiệt độ 800C đến khối lượng không đổi đem cân xác định trọng lượng của cao
Saponin triterpen. [4]
2.4.2.2. Định lượng Saponin triterpen bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
(HPLC)
Mẫu thử là cao saponin triterpen toàn phần của rau má được hòa tan bằng
ethanol 400 và mẫu chuẩn là Saponin triterpen của Pháp.
Các điều kiện tiến hành HPLC: Máy HPLC LC-10AD (Shimadzu, Nhật). Cột
Supelcosil LC18 (250 x 4,6 mm), kích thước hạt 5 µm, kèm cột bảo vệ Supelguard (20
x 4,6 mm). Pha động: acetonitril - metanol - nước (25: 20: 55). Tốc độ dòng:
0,7ml/phút. Mẫu thử: cân chính xác khoảng 10 mg saponin toàn phần, hòa tan trong 5
ml pha động, lọc qua lọc 0,45 µm trước khi bơm vào máy HPLC. Thể tích bơm: 10 µl.
Dectector PDA, bước sóng phát hiện: 203 nm, nhiệt độ cột 300C. [22]
2.5 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của Saponin
triterpen.
2.5.1 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn:
Tiến hành xác định khả năng kháng khuẩn của chế phẩm Saponin triterpen theo
Phương pháp khuếch tán đĩa thạch theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam 3.

34
 Đĩa thạch Muller-Hinton được đổ dày 7mm được môi trường đặc hiệu và đục lỗ
đường kính 9mm, sau đó cấy ria trên bề mặt thạch chủng vi khuẩn có nồng độ 108 tế
bào/ml (mỗi chủng cấy ria lên một đĩa thạch), để 15 phút se mặt thạch, sau đó mỗi
giếng thạch cho 400µl (nồng độ 0,5g/ml) dịch Saponin triterpen.
Số chủng thử nghiệm: 04 chủng gồm: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
E.coli, Pseudomonas aeruginosa.
Tất cả các đĩa thạch được đặt trong tủ ấm 370C, sau 24 giờ lấy ra đo đường kính
vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch tẩm thuốc thử. [23]
2.5.2 Xác định khả năng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH:
Chế phẩm Saponin triterpen được xác định khả năng chống oxy hóa theo
phương pháp DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). [29]
Nguyên tắc: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế ức chế
gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác định khả năng này bằng cách đo
độ hấp thu ở bước sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm.
Cách tiến hành: Dùng 0.5 mg dung dịch chất cần khảo sát (nồng độ 200µg/ml, 150
µg/ml, 100µg/ml, 50µg/ml, 10µg/ml pha trong methanol) cho vào 2.5 ml dung
dịch DPPH (nồng độ 50µg/ml pha trong methanol). Hỗn hợp được lắc đều và để ở nhiệt
độ phòng. Đo độ hấp thu sau 5, 10, 20, 30 phút ở bước sóng 517 nm, mỗi lần đo 3 lần lấy giá
trị trung bình. Mẫu trắng được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng
Saponin triterpen. Khả năng ức chế gốc tự do (S%) được tính theo công thức sau:
S (%) = [1 – (Ats – Atc)] x 100
Trong đó:
Ats: Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm t = 5 phút, 10 phút, 20 phút, 30 phút.
Atc: Độ hấp thu của mẫu trắng

35
 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN NGUYÊN LIỆU
3.1.1.Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trên 02 loại rau má
Dựa vào diện tích trồng nhiều của một số loại rau má ở Việt Nam, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu trên hai loại rau má phổ biến được trồng hiện nay là rau má Tây Phi
và rau má Việt Nam. Cây rau má trong điều kiện khí hậu tốt có chu kỳ thu hái từ 20 -
25 ngày đối với giống rau má Tây Phi, và 25 – 30 ngày đối với giống rau má Việt nam.
Tiến hành lấy các mẫu rau má Tây Phi và rau má Việt Nam có độ tuổi là 25
ngày ở tại 3 vùng của Hà Nội (Đông Anh, Thường Tín, Hà Đông). Các mẫu thu nhận
với lượng như nhau đem sấy sơ bộ và chiết với dung dịch etanol 400 sau 24h, sau đó
cô đặc và phân tích hàm lượng saponin. Kết quả thu nhận được thể hiện bằng biểu đồ
hình 3.1 dưới đây:

3.5
3
2.5
2
1.5 Hàm lượng
Saponin(%)
1
0.5
0
Tây phi Việt
Nam

Hình 3.1: Hàm lượng Saponin triterpen trong một số loại rau má
Từ kết quả của hình 3.1 cho thấy hàm lượng các hợp chất Saponin triterpen
trong các mẫu rau má Tây Phi và Việt Nam chênh lệch không đáng kể trong đó rau má
Việt Nam cao hơn 0,22%. Tuy nhiên, vì rau má Tây Phi khi trồng có năng suất gấp hai

36
lần so với rau má Việt Nam, do vậy chúng tôi chọn rau má Tây Phi làm nguyên liệu
cho mục đích nghiên cứu.
3.1.2.Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trong rau má ở các địa phương
khác nhau.
Nhằm thu hiệu suất Saponin triterpen cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một
số loại rau má Tấy Phi được trồng ở các vùng, miền khác nhau: Vùng đồng bằng Hà
nội (HN), Bắc Ninh (BN), Hà Nam (HN), Thừa Thiên Huế (TT) và các loại ra má ở
các vùng núi và Trung du, vùng cao như: Vĩnh Phúc (VP), Lâm Đồng (LĐ), Phú
Thọ(PT), Bắc Giang (BG) với các loại rau má được thu hái với cùng độ tuổi, cùng
chủng loại, được sấy khô đến độ ẩm nhất định, chiết bằng etanol 400C và xác định hàm
lượng Saponin triterpen. Kết quả được biểu diễn ở hình 3.2.

4
3.53 3.4 3.4
3.31 3.27 3.31 3.37
3.5 3.23
Hàm lượng Saponin (%)

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
HN BN HNa VP PT BG TT LĐ Tên tỉnh

Hình 3.2: Hàm lượng Saponin triterpen trong rau má Tây Phi ở các địa phương
Kết quả hình 3.2 cho thấy hàm lượng Saponin triterpen tại thời điểm thu nhận
không có sự khác biệt lớn giữa các vùng. Lượng Saponin thu nhận từ nguồn rau má
trên vùng đất đồng bằng và miền núi như: Lâm Đồng, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Giang,
Thừa Thiên Huế cũng không có sự khác biệt lớn so với một số vùng đồng bằng ngoại
thành như Hà Nội, Bắc Ninh, Hà Nam. Như vậy sự tích lũy Saponin triterpen rau má

37
không phụ thuộc nhiều vào điều kiện đất đai thổ nhưỡng. Vì thế, các nhà sản xuất sau
này có thể chọn vùng nguyên liệu thuận tiện cho việc cung ứng. Trong các nghiên cứu
tiếp theo chúng tôi chọn rau má được trồng tại các vùng ngoại thành Hà Nội.
3.1.3. Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trong rau má theo thời vụ:.
Tiến hành lấy các mẫu rau má theo hai mùa (mùa khô và mùa mưa), kết quả
khảo sát được trình bày trong hình 3.3.

3.5
3
2.5
2
1.5 Hàm lượng
Saponin (%)
1
0.5
0
Mùa Mùa
khô mưa

Hình 3.3: Hàm lượng Saponin trong rau má theo thời vụ

Kết quả hình 3.3 cho thấy hàm lượng Saponin triterpen trong rau má ở mùa khô
(tháng 11-12) cao hơn so với hàm lượng thu nhận trong mùa mưa 0.26%. Điều này có
thể lý giải Saponin triterpen có khả năng hòa tan trong nước, vì thế vào mùa mưa hàm
lượng nước trong rau má cao đã làm giảm bớt thành phần của một số chất trong rau
trong đó có Saponin.
3.1.4 Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trên các bộ phận của cây rau má:
Để đánh giá sơ bộ về hàm lượng Saponin triterpen trong các bộ phận của cây rau
má chúng tôi đã thu mua rau má Tây Phi và phân chia riêng các bộ phận: Lá, thân, rễ,
hoa. Mẫu được sấy đến hàm ẩm là 14% và chiết bằng dung môi etanol 400, cô tách cồn
và phân tích hàm lượng Saponin. Kết quả được trình bày ở hình 3.4 dưới đây:

38
 6 5.12
5
3.84
4 3.18
3 Hàm lượng
STri (%)
2 1.23
1
0
Lá Thân Rễ Hoa

Hình 3.4: Hàm lượng Saponin triterpen trong các bộ phận của cây rau má
Qua hình 3.4 chúng tôi thấy hàm lượng Saponin triterpen có trong các bộ phận
của cây khác nhau. Trong đó, lá rau má Saponin triterpen đạt cao nhất 5,12%, sau đó
giảm dần trong thân, rễ lần lượt là 3,84%, 3,18%, hoa của rau má có hàm lượng thấp
nhất 1,23%. Tuy nhiên, rau má thường được thu hoạch vào chính vụ chưa có hiện
tượng ra hoa và để giảm bớt công đoạn phân loại các bộ phận của cây rau má nên
chúng tôi vẫn sử dụng cả ba bộ phận này trong quá trình nghiên cứu.
3.1.4. Nghiên cứu thành phần hóa học trong rau má Tây Phi:
Để đánh giá chất lượng nguyên liệu, định hướng việc xử lý nguyên liệu và kỹ
thuật chiết tách. Chúng tôi tiến hành phân tích các thành phần của nguyên liệu rau má.
Kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.1: Các thành phần chính của rau má Tây Phi
STT Thành phần Hàm lượng (%)
1 Protein 3,2
2 Tinh bột 1,6
3 Đường 6,52
4 Hàm lượng chất khô 15,28
5 Độ ẩm 70,0

39
 6 Saponin triterpen 3,4

Từ bảng kết quả 3.5 cho thấy: Trong nguyên liệu rau má ngoài saponin còn chứa
protein, đường, tinh bột và tạp chất. Các chất protein, tinh bột và tạp chất sẽ hòa tan
một phần trong quá trình chiết, cần phải có giai đoạn trích ly loại bỏ các tạp chất trên ra
khỏi sản phẩm. Ngoài ra, sự có mặt của tinh bột có ảnh hưởng nhất định tới quá trình
chiết làm tăng độ nhớt của dung dịch khi bị hồ hóa và có ảnh hưởng đến màu sắc của
dịch chiết dưới tác dụng của nhiệt độ. Đây là trở ngại lớn cho việc thu nhận và tinh chế
sản phẩm.
Kết quả phân tích thành phần các chất trong rau má sẽ giúp cho chúng tôi lựa
chọn được các phương pháp tách chiết và tinh sạch Saponin triterpen đạt kết quả tốt
hơn.
3.2. KHẢO SÁT HỆ DUNG MÔI CHIẾT TÁCH SAPONIN TRITERPEN
3.2.1.Nghiên cứu chiết tách Saponin triterpen bằng Ethanol .
Tiến hành lấy 1000g rau má tươi sấy bằng nhiệt đạt độ ẩm 12% thu được 100
gam rau má khô. Tiếp theo đem ngâm với 400ml etanol 400 (trộn đều) ủ trong 2 giờ.
Sau đó cho nguyên liệu đã được ủ vào bình chiết ngấm kiệt ở đáy có van điều chỉnh tốc
độ chảy và bổ sung thêm etanol 400 cho ngập phần nguyên liệu 2-4cm, để ngâm 24 giờ.
Sau 24 giờ mở van cho chảy nhỏ giọt (01ml/giây) để thu dịch chiết và bổ sung thêm
dung môi cho đến khi thu được 800 ml dịch chiết (tỉ lệ 1:8). Dịch chiết được bốc hơi
(cô đặc) bằng máy cất quay có áp suất giảm, sau đó đem sấy khô ở 800C đến khối
lượng không đổi và thu được cao cồn có chứa hỗn hợp Saponin triterpen. Kết quả được
thể hiện trong hình 3.5.

40
 40 35.4
35
30 25.23
25
20 Trọng lượng
15 (%)
10
5
0
etanol nước

Hình 3.5: Hàm lượng Saponin triterpen chiết bằng ethanol và nước
Từ kết quả thể hiện trên biểu đồ hình 3.5 cho thấy khối lượng cao ethanol thu
hồi sau khi sấy đến khối lượng không đổi là 25,23g tương đương với hiệu suất thu hồi
là 25,23% tính theo lượng rau má sau khi sấy khô và chiếm tỷ lệ là 2,5% so với lượng
rau má tươi ban đầu.
3.2.2. Nghiên cứu chiết tách Saponin triterpen bằng nước.
Tiến hành lấy 1000g rau má tươi sau khi đưa vào máy ép nghiền trục vít thu
được một lượng dịch là 573,8 g, và 421g bã. Lượng bã được bổ sung thêm 842 ml
nước cất (tỉ lệ 1: 2) và đun khối dịch lên nhiệt độ 600C trong thời gian 2 giờ, khối dịch
được làm nguội và tiếp tục cho vào ép trục vít loại bỏ bã được 382,5g bã. Dịch ép lần 2
được trộn với dịch ép lần 1, sau đó được cô đặc gấp 10 lần và đem đi sấy phun thu
được 35,4 gam bột (saponin thô) tương đương với tỷ lệ thu hồi là 3,54%. Kết quả được
trình bày trong Hình 3.5.

Kết quả từ hình 3.5 cho thấy khối lượng cao Saponin triterpen thô chiết bằng
nước cho kết quả cao hơn hẳn chiết bằng ethanol (10,2%). Kết quả này được lý giải
như sau: Nước là dung môi hòa tan saponin rất tốt nhưng có nhược điểm ngoài saponin
nước còn hòa tan rất nhiều tạp chất trong dược liệu như chất màu, nhựa, tinh bột,
tanin, đường, muối vô cơ… Vì vậy, để đánh giá chính xác hàm lượng Saponin
triterpen chiếm tỉ lệ ở dịch chiết nào cao hơn, chúng tôi tiếp tục thực hiện chiết tinh

41
bằng n-Butanol và chlorofom, định lượng bằng phương pháp cân đến khối lượng
không đổi để xác định hàm lượng Saponin toàn phần kết quả thể hiện trong hình 3.6.

3.75
4
3.03
3
Trọng lượng
2 (g/100g)

0
etanol nước

Hình 3.6: Hàm lượng Saponin triterpen toàn phần

Kết quả trong hình 3.6 cho thấy hàm lượng Saponin triterpen trong cao chiết
bằng ethanol chiếm tỉ lệ cao hơn nước 0,72%. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn ethanol 40%,
cũng là dung môi phân cực mạnh có khả năng hòa tan hầu hết nhóm tecpen. Ngoài ra
ethanol có một số ưu điểm: hòa tan ít các tạp chất nên có khả năng hòa tan chọn lọc,
nhiệt độ sôi thấp nên khi cô đặc dịch chiết các hoạt chất sinh học trong thảo mộc ít bị
phân hủy.

3.2.3. Kết quả định tính Saponin triterpen bằng phương pháp tạo bọt.
Dựa vào tính chất dễ tạo bọt và bền bọt trong môi trường axit của nhóm
Triterpen, chúng tôi sử dụng tính chất này để định tính nhanh Saponin triterpen có
trong cao Saponin triterpen ethanol và nước.
Tiến hành lấy hai ống nghiệm cao 25cm, ống thứ nhất cho 5ml dung dịch NaOH
0,1N (pH 13), ống thứ hai cho 5ml dung dịch HCl 0,1N (pH 1). Cho vào mỗi ống 5ml
dung dịch Saponin trong hòa tan trong cồn 400C. Lắc mạnh 2 ống trong 30 giây. Kết
quả thể hiện trong hình 3.7.

42
 M1: Mẫu đối chứng
M2: Mẫu chứa cao Saponin
M1 M2 triterpen
Hình 3.7: Kết quả định tính Saponin triterpen
bằng phương pháp tạo bọt

Kết quả hình 3.7 cho thấy tại mẫu M2 cho bọt nhiều và có độ bền bọt trong 20
phút. Như vậy xác định rằng trong cao rau má có chứa Saponin triterpen.
3.3. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN DUNG MÔI TINH SẠCH SAPONIN
TRITERPEN.
3.3.1. Tinh sạch saponin triterpen bằng hệ dung môi n- Butanol và chloroform
3.3.1.1 Kết quả tinh sạch Saponin triterpen bằng hệ dung môi n-Butanol và
Chlorofom
Từ cao ethanol có chứa saponin thu được, tiến hành chiết nóng bằng n-Butanol
hai lần với tỉ lệ lần lượt là 1:8 và 1:5. Cao Saponin thô chiết nóng với n-Butanol, lớp n-
Butanol sẽ chứa một lượng lớn saponin, còn lớp nước sẽ chứa các tạp chất phân cực
mạnh như đường tự do, muối vô cơ… sau đó lọc thu dịch chiết và đem cô bằng máy
cất quay có áp suất giảm. Tiếp theo dịch chiết đã cô đem sấy ở 800C đến khối lượng
không đổi thu được cao n –Butanol. Kết quả được trình bày trong hình 3.8.

43
 30 25.23
25
20
13.61
15 Hàm lượng
9.23
10 STri (%)
5
0
STri thô Lần 1 Lần 2

Hình 3.8: Hàm lượng Saponin triterpen trong cao n-butanol

Từ biểu đồ hình 3.8 cho thấy kết quả của quá trình tinh sạch bằng n-Butanol
lượng tạp chất giảm sau khi chiết lần 1 là 11,6% (tương đương với 11,6g/100g), lần 2
là 4,38% (tương đương với 4,38g/100g). Với lượng rau má khô ban đầu đưa vào 100g
sau khi tinh chế cho ra 9,23g cao saponin triterpene (chiếm 9,23%), lượng tạp chất
giảm được 16%. Như vậy n-butanol thích hợp là dung môi tinh sạch cao Saponin
triterpen từ rau má.

Để loại các tạp chất kém phân cực như các hợp chất màu, các hợp chất phenolic
bổ sung chlorofom 02 lần với tỉ lệ lần lượt là 1:7 và 1:5 để trong vòng 15- 20 phút cho
chloroform hòa tan hết tạp chất cho trong cao thô, gạn bỏ dịch thu được cao saponin
toàn phần. Kết quả được thể hiện trên hình 3.9.

44
 ạ g

10 9.23
9
8 7.21
7
6
5 3.92 Hàm lượng
4 STri (%)
3
2
1
0
STri thô Tinh sạch bằng Chl Tinh sạch bằng Chl
lần 1 lần 2

Hình 3.9: Hàm lượng Saponin triterpen sau khi tinh sạch bằng chlorofom
Từ biểu đồ 3.9 cho thấy lượng cao Saponin triterpen tinh sạch lần 1 còn 7,21g
(giảm 2,02%), lần 2 còn 3,92g (giảm 3,29%), lượng tạp chất giảm 5,31% khi chiết
bằng chlorofom. Lượng cao Saponin tritepen toàn phần thu được là 3.92% (tương
đương với 3,92 g/100g rau má khô), hiệu suất thu hồi là 3,92% so với rau má khô.
Đem phân tích thành phần Saponin triterpen trong cao Saponin chlorofom cho kết quả
chiếm 78%.
3.3.2. Tinh sạch Saponin triterpen bằng phương pháp kết tinh:
Lấy 100g rau má khô chiết bằng etanol 400C thu được cao cồn Saponin
triterpen, tiếp tục đem chiết nóng 2 lần bằng n-Butanol với tỉ lệ lần lượt là 1:8 và 1:5
thu được dịch n-Butanol đem cô dịch rồi bổ sung ete etylic khan theo tỉ lệ 1:10 xuất
hiện các hạt tinh thể mầu trắng đục, lọc thu hạt tinh thể còn dịch lọc tiếp tục bổ sung
ete etylic với tỉ lệ 1:10 tiến hành như trên 02 lần. Các hạt trắng được tách ra khỏi dịch
đem sấy chân không đến khối lượng không đổi thu 1,27g (chiếm 1,27%) được Saponin
triterpen toàn phần, với hiệu suất thu hồi là 1,27% so với rau má khô. Đem phân tích
thành phần các Saponin tritepen trong thành phẩm cho kết quả chiếm 80%.

45
 90

80

70
P.P kết
60
tinh
50 P.P Hệ
dung môi
40

30

20

10

0
độ tinh sạch H/s thu hồi khối lượng

Hình 3.10: Kết quả tinh sạch Saponin triterpen bằng phương pháp hệ dung môi
và phương pháp kết tinh
So sánh hai kết quả thông qua hình 3.10 cho thấy sử dụng tinh sạch Saponin
triterpen bằng phương pháp kết tinh cho độ tinh sạch cao hơn so với phương pháp sử
dụng hệ dung môi n-Butanol và chlorofom là 2%, tuy nhiên hiệu suất thu hồi của
phương pháp này lại giảm đi ½, điều này có thể thấy sử dụng phương pháp tạo tinh thể
thu được hàm lượng các Saponin triterpen thấp hơn. Vì thế, chúng tôi lựa chọn hệ dung
môi n-Butanol và chlorofom.
3.3.3. Kết quả định tính saponin triterpen bằng phương pháp TLC
Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng Silicagel 60F254 của Merck. Chấm 10µl mẫu
thử là cao Saponin triterpen toàn phần của rau má được hòa tan bằng ethanol 400 và
mẫu chuẩn là Saponin triterpen của Pháp. Tiến hành chấm sắc kí và chạy sắc kí với hệ
dung môi là Ethanol : Methanol = 6:4. Bản sắc kí sau khi chạy còn cách mép trên
khoảng 1cm thì lấy ra ra để khô trong không khí và soi dưới đèn tử ngoại để quan sát
các vết. Dưới đèn tử ngoại thì saponin triterpenoid có huỳnh quang màu xanh. Tiếp

46
đến, sử dụng thuốc thử andehyt acetic và H2SO4 với tỉ lệ 9:1 để phun và bản mỏng, sau
đó sấy ở nhiệt độ 1200C, thời gian 15 phút lấy ra quan sát. Kết quả được thể hiện trong
hình 3.11.

Asiatic acid

Madecasic acid

Asiaticoside
Madecassoside

M1 M2
Mẫu 1: Mẫu cao Saponin toàn phần của rau má.
Mẫu 2: Mẫu chuẩn: Madecasol của Pháp
Hình 3.11: Sắc ký đồ của Saponin triterpen toàn
phần

Từ kết quả hình 3.11 với mẫu cao Saponin triterpen toàn phần xuất hiện có
05 vệt trong đó có 04 vệt trùng với vệt trong mẫu chuẩn. Điều đó có thể kết luận có
sự có mặt của các Saponin triterpen trong chế phẩm. Căn cứ vào khoảng cách của
các vệt so với điểm xuất phát mẫu chuẩn bao gồm 4 chất: Asiatic acid, Madecassic
acid, Asiaticoside, Madecassoside. Kết quả đã cho kết luận trong mẫu rau má chúng
tôi nghiên cứu có chứa các saponin triterpen là Madecassoside, Asiatic acid,
Madecassic acid và Asiaticoside.

47
3.3.4 Nghiên cứu phương pháp tảy màu cho sản phẩm Saponin triterpene.
Cao rau má sau quá trình tinh sạch vẫn còn chứa một lượng các tạp chất trong
đó có các hợp chất màu, muốn được hỗn hợp Saponin triterpen có độ tinh sạch cao và
loại bỏ các hợp chất màu cho sản phẩm chúng tôi tiến hành khảo sát trên hai chất là
than hoạt tính và silicagel.
3.3.4.1. Khảo sát khả năng tảy màu của than hoạt tính
a. Xác định tỷ lệ than hoạt tính dùng để tẩy màu
Để xác định lượng than thích hợp cho quá trình tảy màu, các mẫu được tiến
hành tẩy màu với các tỷ lệ than hoạt tính khác nhau 1%, 2%, 3%, 4% và nồng độ chất
khô của dịch là 15%. Quá trình tẩy màu được tiến hành ở 800C trong 30 phút. Sau đó
xác định cường độ màu của mẫu thông qua đo độ hấp thụ quang (Abs) ở bước sóng
230nm và cảm quan. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến khả năng tẩy màu
Nồng độ than
Abs đo tại = 230nm Nhận xét
(% )
1 0,431 vàng đậm
2 0,303 vàng
3 0,221 vàng nhạt
4 0,195 vàng nhạt

Như vậy, khi tăng lượng than hoạt tính sử dụng từ 2 - 4% thì cường độ màu của
dịch giảm mạnh. Tuy nhiên giữa tỉ lệ 3% và 4% cường độ màu chênh lệch không đáng
kể nên chúng tôi lựa chọn tỷ lệ than cho tẩy màu là 3% để tiết kiệm lượng than và
giảm giá thành.
b. Xác định nồng độ dịch chiết phù hợp cho quá trình tảy màu và lọc
Nồng độ dịch có liên quan đến độ nhớt của nó vì vậy có ảnh hưởng đến khả
năng tảy màu và lọc. Với tỷ lệ than là 3% so với chất khô, quá trình tẩy màu được tiến

48
hành với các mẫu dịch sau chiết tách có nồng độ chất khô khác nhau (thay đổi nồng độ
dịch bằng cách pha loãng) thu được kết quả trong bảng 3.3 dưới đây.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dịch đến quá trình tảy màu
OD
Nồng độ chất
= 230nm Khả năng lọc Màu sắc
khô (0Bx)
14 0,150 Dễ lọc Vàng nhạt
16 0,187 Dễ lọc Vàng nhạt
18 0,191 Dễ lọc Vàng nhạt
20 0,389 Lọc chậm Vàng đậm
>22 0,523 Khó lọc Vàng đậm

Kết quả bảng 3.3 cho thấy với nồng độ chất khô của dịch chiết càng cao thì khả
năng lọc càng chậm và mầu sắc của dịch lọc cũng đậm hơn. Nếu nồng độ chất khô thấp
sẽ kéo dài thời gian lọc. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nồng độ chất khô là 180Bx vì ở
nồng độ này cho kết quả lọc tốt và mầu sắc đạt yêu cầu.
c. Xác định tốc độ dòng chảy của cột lọc cho quá trình tảy màu và lọc
Tốc độ dòng chảy của cột lọc ảnh hưởng đến thời gian hấp thụ của chất tẩy màu
với dịch chiết. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ở 05 tốc độ dòng chảy khác nhau là
2ml/giây, 1,5ml/giây, 1ml/giây, 0,5ml/giây, 0,2ml/giây với chiều cao cột lọc là 20cm,
đường kính cột 5cm, nồng độ dịch chiết 180Bx. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.4
dưới đây.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dịch đến quá trình tảy màu
OD
Tốc độ dòng
= 230nm Màu sắc
chảy (ml/giây)
2 0,533 Vàng đậm
1,5 0,429 Vàng đậm
1 0,211 Vàng

49
 0,5 0,167 Vàng nhạt
0,2 0,140 Vàng nhạt

Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy tốc độ dòng chảy càng nhanh thì màu sắc của dịch
chiết càng đậm. Với tốc độ dòng chảy từ 0,5ml/giây đến 0,2ml/giây dịch chiết đã có
màu vàng nhạt và có sự chênh lệch màu không đáng kể. Để tiết kiệm thời gian tảy màu
chúng tôi lựa phương án là 0,5ml/giây.
3.3.4.2. Nghiên cứu chất tẩy màu bằng silicagel
Silicagel cũng là chất có khả năng hấp phụ cao và được sử dụng nhiều trong
loại bỏ các hợp chất mầu. Song song với quá trình nghiên cứu tảy màu bằng than hoạt
tính chúng tôi cũng nghiên cứu loại bỏ các hợp chất màu bằng silicagel.
Dịch chiết được pha loãng đến độ khô 180Bx bằng dung môi ethanol, tốc độ
dòng chảy 0,5ml/s sau đó cho chạy qua cột chứa silicagel dạng bột. Kết quả được trình
bày trong bảng 3.5 dưới đây.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ silicagel đến quá trình tảy màu và dịch.
Nồng độ OD Màu sắc Khả năng lọc
silicagel (%) λ= 230nm

1 0,462 Vàng sẫm Dễ lọc

2 0,289 Vàng Dễ lọc
3 0,193 Vàng nhạt Dễ lọc
4 0,097 Trắng Dễ lọc
5 0,095 Trắng Dễ lọc

Kết quả bảng 3.5 cho thấy ở nồng độ silicagel 4%, màu của dịch chiết đã
chuyển từ vàng sẫm sang trắng và ở nồng độ chất khô 18% quá trình lọc đều tốt.

50
3.3.4.3. Nghiên cứu phương án tảy màu kết hợp than hoạt tính và silicagel.
So sánh việc sử dụng các chất hấp phụ để tẩy màu sản phẩm cho thấy sử dụng
silicagel có khả năng tẩy màu tốt hơn (dịch chiết sau khi tẩy màu bằng than hoạt tính
cho màu vàng nhạt và silicagel cho màu trắng). Tuy nhiên việc sử dụng hoàn toàn
silicagel giá thành sản phẩm cao (giá của bột silicagel cao gấp 10 lần giá của than hoạt
tính). Vì thế chúng tôi nghiên cứu kết hợp sử dụng cả silicagel và than hoạt tính để tẩy
mầu cho sản phẩm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6: Kết quả tảy màu sử dụng than hoạt tính và silicagel
STT Tỉ lệ Màu sắc
Abs đo tại
than hoạt tính: silicagel
λ= 230nm
1 1:1 0,107 Trắng ngà
2 1,5: 1 0,124 Trắng ngà
3 2:1 0,129 Trắng ngà
4 2,5: 1 0,221 Vàng nhạt
5 3:1 0,261 Vàng nhạt
6 3,5:1 0,267 Vàng nhạt

Mẫu 1: Tỉ lệ T:S = 1:1

Mẫu 2: Tỉ lệ T:S = 2:1
Mẫu 3: Tỉ lệ T:S = 2,5:1
Mẫu 4: Tỉ lệ T:S = 3:1
Mẫu 5: Tỉ lệ T:S = 3,5:1
Mẫu 6: Dịch chiết tách Saponin triterpen chưa tẩy
màu

Hình 3.12 : Mẫu được tẩy màu bằng

hỗn hợp silicagel và than hoạt tính

51
 Từ kết quả bảng 3.6 cho thấy nếu sử dụng kết hợp chất hấp thụ than hoạt tính và
silicagel với tỉ lệ 2:1 cho hiệu quả tảy màu tốt. OD từ 0,107 – 0,129 cho màu trắng ngà
từ tỉ lệ 1:1, tuy nhiêu để đạt mục tiêu giảm giá thành chúng tôi chọn tỉ lệ than hoạt tính
và silicagel là 2:1.
3.4. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN SAPONIN TRITERPEN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP HPLC
Nghiên cứu xác định thành phần và hàm lượng Saponin triterpen trong sản
phẩm Saponin triterpen thu được là rất cần thiết, bởi đây là một trong những tiêu chí
đánh giá chất lượng sản phẩm Saponin triterpen. Chúng tôi tiến hành phân tích định
lượng chế phẩm Saponin triterpen bằng HPLC.
Mẫu thử là cao saponin triterpen toàn phần của rau má được hòa tan bằng
ethanol 400 và mẫu chuẩn là Saponin triterpen của Pháp. Cân chính xác khoảng 10mg
saponin toàn phần, hòa tan trong 5 ml pha động, lọc qua lọc 0,45 µm trước khi bơm
vào máy HPLC, thể tích bơm 10 µl, Dectector PDA, bước sóng 203 nm, nhiệt độ cột
300C. Mẫu được chạy Cột Supelcosil LC18 (250 x 4,6 mm), kích thước hạt 5 µm, kèm
cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm). Pha động: acetonitril - metanol - nước (25: 20:
55). Tốc độ dòng: 0,7ml/phút. Kết quả được trình bày trong hình 3.13.

52
500 500

4.335

6.422

4.35

6.44
450 450

400 400

350 350

300 300

250 250

11.692
11.685

18.020
18.823
200 200

150 150

100 100
14.503
12.237
9.865

50 50

0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Hình 3.13: Kết quả phân tích HPLC cho mẫu Hình 3.14: Kết quả phân tích HPLC – mẫu
nghiên cứu chuẩn

Bảng 3.7: Thành phần các Saponin triterpen trong cao rau má
STT Tên chất Hàm lượng các chất so
với rau má khô (%)
1 Madecassoside 29
2 Asiaticoside 32
3 Madecassic acid 11,5
4 Asiatic acid 12,1

Kết quả phân tích định lượng chế phẩm Saponin triterpen bằng HPLC cho thấy
trên sắc ký đồ hình 3.13 xuất hiện 9 peak, các sản phẩm được định tên dựa trên cơ sở
mẫu phân tích chất chuẩn và so sánh thời gian lưu mẫu với chất chuẩn là asiaticoside,
madecassoside, asiatic acid, madecassic acid. Trong đó, peak 1 là sản phẩm
Madecassoside, peak 2 là Asiaticoside, peak 4 là Madecassic acid, peak 7 là Asiatic

53
acid có thời gian lưu lần lượt là 4,335, 6,422, 11,635, 18,823. Ngoài các sản phẩm
Saponin triterpen đã được định tên, chúng tôi nhận thấy trên sắc ký đồ còn xuất hiện
nhiều peak với thời gian lưu khác nhau, dự đoán đó là các tạp chất còn trong sản
phẩm.
Kết quả trên cũng cho thấy sau quá trình tảy màu sản phẩm có độ tinh sạch cao
hơn từ 78% lên 84%.
Kết quả phân tích định lượng bằng HPLC thành phần các Saponin triterpen
trong sản phẩm như sau: asiaticoside 32%, madecassoside 29%, asiatic acid 12,1%,
madecassic acid 11,5% (bảng 3.7). Hàm lượng các Saponin triterpen chiếm 84,6%
trong chế phẩm, còn lại khoảng 15,4% là các chất tan chưa loại bỏ được hoàn toàn. So
sánh với sản phẩm Gotu Kola của Trung Quốc có hai loại: loại chứa 70% Saponin
triterpen và loại chứa 90% Saponin triterpen trong đó có 40% Asiaticoside và 50% là
madecassoside, asiatic acid, madecassic acid thấy sản phẩm của ta tương đối tốt.
3.5. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT SAPONIN TRITERPEN DẠNG BỘT
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng các chất phụ gia tạo chế phẩm Saponin triterpen dạng
bột.
Từ dịch chiết saponin triterpene đã tinh chế chúng tôi tiến hành sấy phun theo
một chế độ định tính và thu được sản phẩm saponin triterpene dạng bột. Tuy nhiên sau
khi sấy xong sản phẩm bị hút ẩm rất nhanh, dính bết nhiều ở bình làm khô và dính
chảy. Nguyên nhân của hiện tượng này là do hàm lượng chất khô của dịch chiết có
nồng độ thấp hơn 15%. Do vậy để đảm bảo được chất lượng sản phẩm đầu ra tốt và đủ
tiêu chuẩn chúng ta phải bổ sung thêm một số chất phụ gia để hàm lượng chất khô của
dịch chiết khi đưa vào nghiên cứu đạt nồng độ 10-20%, khi đó dịch sấy phun tạo ra có
hiệu suất cao, sản phẩm không bị nhanh hút ẩm, dễ bảo quản. Theo một số tài liệu công
bố trong và ngoài nước chúng tôi sử dụng một số chất độn như: maltodextrin, lactose,
glucose, tinh bột biến tính… được sử dụng với các tỷ lệ khác nhau và tiến hành sấy
phun ở cùng một chế độ cho kết quả sau:

54
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất độn đến chất lượng cảm quan sản phẩm sấy phun

Mẫu Malto Lactoza Glucoza Tinh bột Chất lượng cảm quan
dextrin biến tính
1 20% Bột khô, vón nhanh, hút ẩm
mạnh, màu sáng, độ hòa tan
kém.
2 20% Bột vón khô cứng, hút ẩm
nhanh, màu vàng nhạt.
3 10% 10% Khó sấy do đầu kim phun hay
bị bết, tắc.
4 5% 5% Bột khô, xốp, hút ẩm chậm
màu trắng ngà, dễ lấy sau
khi sấy phun. Độ hòa tan tốt
5 10% Bột khô, xốp, hút ẩm chậm
màu ngả vàng, dễ lấy, độ hòa
tan chậm
6 10% 10% Bột khô, xốp, ít hút ẩm, độ
hòa tan kém, không trong
7 5% 15% Bột khô, xốp, ít hút ẩm, độ
hòa tan kém, không trong.
Qua kết quả bảng 3.8 cho thấy với các:
− Mẫu 1,2,3 các sản phẩm tạo thành khó bảo quản, hiệu suất thấp.
− Mẫu 6,7 cho sản phẩm nhiều, hiệu suất cao tuy nhiên lại có nhược điểm độ hòa
tan kém, màu đục, màu sắc sản phẩm kém (vàng nhạt)
− Mẫu số 5 cho chất lượng sản phẩm tốt tuy nhiên tốt nhất vẫn là mẫu số 4. Mẫu
số 4 chất lượng bột xốp, độ hòa tan nhanh, dịch hòa tan nhanh, hút ẩm kém,
màu sắc trắng.

55
 Do vậy chúng tôi chọn công thức phối trộn với dung dịch Saponin triterpen trước
khi sấy phun là đường lactoza 5% và maltodextrin 5% vào cho chế phẩm có độ hòa tan
tốt, chậm hút ẩm bảo quản được lâu, mầu sắc, hương vị dễ chịu.
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lưu lượng dòng khí sấy và áp suất khí nén.
3.5.2.1. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ không khí sấy:
Khảo sát nhiệt độ dòng khí đầu vào là 180, 200, 220, 240 và 2600C, nhiệt độ đầu
ra lớn hơn 900C. Các thông số còn lại của thiết bị sấy phun cố định ở áp suất khí nén 10
bar, lưu lượng dòng nhập liệu là 5lit/h, nồng độ chất khô 20%. Kết quả về hiệu suất thu
hồi sản phẩm, hàm lượng Saponin triterpen và giá trị cảm quan của sản phẩm được thể
hiện ở bảng 3.9 dưới đây.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đầu vào đến hiệu suất thu hồi và giá
trị cảm quan của sản phẩm
Nhiệt độ Hiệu suất Hàm lượng Nhận xét, đánh giá cảm quan
không khí thu hồi Saponin triterpen
(oC) (%) (% so với rau má khô)
180 0 Trong buồng sấy xuất hiện hơi
nước sau khi sấy 20 phút
200 83,6 70,72 Ban đầu bột màu vàng sáng, mịn,
tuy nhiên sau thời gian sấy
khoảng 1-2h cho thấy có hiện
tượng sản phẩm có độ ẩm cao
hơn ban đầu.
220 85,8 72,6 Bột màu trắng ngà, xốp, mịn,
dễ hòa tan trong nước
240 76,8 65 Bột có mầu vàng sẫm, tơi xốp,
mịn, dễ hòa tan trong nước
260 77,3 65,4 Bột có mầu vàng sẫm, xốp, mịn
khó hòa tan trong nước

56
 Kết quả bảng 3.9 cho thấy nhiệt độ quá thấp hay quá cao đều không mang lại
những tác động tích cực cho quá trình sấy, cụ thể là: Khi nhiệt độ tác nhân sấy thấp
1800C, trong buồng sấy xuất hiện sương ẩm, điều đó cũng dễ hiểu, lượng nhiệt cấp vào
và lượng ẩm thoát ra chưa đạt đến điểm cân bằng do vậy hàm ẩm vẫn chiếm nhiều
trong sản phẩm. Khi tăng nhiệt độ không khí đầu vào lên 200oC, hiện tượng này có
giảm đi, tuy nhiên sau thời gian 1h đến 2 h làm việc cho thấy các sản phẩm tạo thành
có độ ẩm tăng lên rõ rệt và làm giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm sau sấy (chỉ đạt
83,6%). Mặt khác, nhiệt độ không khí sấy quá cao (260oC) lại là nguyên nhân làm phá
hủy cấu trúc, biến đổi tính chất các hạt bột, làm giảm chất lượng của sản phẩm .
Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ không khí sấy 2200C là thích hợp nhất cho quá trình sấy,
ứng với hiệu suất thu hồi sản phẩm là 85,8%; hàm lượng Saponin triterpen 72,6%, màu
sắc của bột trắng ngà, tơi xốp, mịn, khả năng hòa tan tốt.
3.5.2.2. Xác định ảnh hưởng của lưu lượng dòng nhập liệu
Với lưu lượng nạp liệu thay đổi từ 4 – 7 lit/h, các thông số khác của chế độ sấy
phun cố dịnh là nhiệt độ không khí đầu vào 220oC, áp suất không khí nén là 10 bar,
nghiên cứu cho các kết quả về hiệu suất thu hồi, hàm lượng Saponin triterpene, giá trị
cảm quan của sản phẩm được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của lưu lượng dòng sấy phun đến chất lượng và
hiệu suất thu hồi sản phẩm.
Lưu lượng Hiệu suất Hàm lượng Đánh giá cảm quan
nhập liệu thu hồi (%) Saponin triterpen
(lít/h) (% so với rau má khô)
4 89,4 75,6 Bột màu trắng ngà, mịn, tơi
xốp, tan hơi chậm
5 91,2 77,2 Bột màu trắng ngà, mịn, tơi
xốp, dễ hòa tan
6 82,1 69,5 Bột màu trắng ngà, mịn, dễ

57
 hòa tan
7 72,5 61,3 Bột màu trắng ngà, mịn, xuất
hiện vành dịch xung quanh
thành thiết bị

Theo kết quả ở bảng 3.10 trên thì khi lưu lượng dòng nhập liệu tăng 6 đến 7
lit/h, hiệu suất thu hồi lại không cao (82,1 và 72,5% tương ứng). Lý giải cho nguyên
nhân này, một số tác giả cho rằng tốc độ nhập liệu làm tăng thể tích của các hạt chất
lỏng và khi lưu lượng dịch nguyên liệu tăng nhưng lưu lượng của tác nhân nhiệt không
tăng, đó là nguyên nhân của sự mất cân bằng về nhiệt lượng. Do vậy tạo ra sản phẩm
có hiệu suất thu hồi thấp. Hiệu suất thu hồi sản phẩm cao hơn ở lưu lượng nhập liệu là
4 lit/h (89,4%) nhưng ở chế độ này thời gian sấy dài và hiện tượng quá khô của sản
phẩm do sự cân bằng nhiệt vẫn bị lệch về phía tác nhân sấy. Khi lưu lượng dòng nhập
liệu là 5 lit/h. Với tốc độ này, hiệu suất thu hồi sản phẩm đạt 91,2%, hàm lượng
Saponin triterpen 77,2%, sản phẩm tạo thành có chất lượng tốt, thời gian thực hiện
ngắn.
3.5.3.3. Xác định ảnh hưởng của áp suất khí nén
Áp suất khí nén là yếu tố cơ bản ảnh hưởng trực đến vận tốc đĩa quay (tuoc bin
khí) trong thiết bị sấy phun, áp suất khí nén càng tăng thì đĩa quay cành nhanh, tuy
nhiên khi đến một áp suất tới hạn thì tốc độ vòng quay đạt cực đại. Tốc độ quay của đĩa
li tâm càng cao khả năng tơi xốp của nguyên liệu trong buồng trao đổi nhiệt càng lớn.
Nghiên cứu với áp suất khí nén từ 7-11bar (các thông số về nhiệt độ không khí đầu
vào, tốc độ nhập liệu được cố định là 2200C và 5 lit/h, nồng độ ban đầu, chất độn của
nguyên liệu là như nhau), kết quả được trình bày ở bảng 3.11 dưới đây.

58
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của áp suất khí nén đến hiệu suất thu hồi và chất lượng sản
phẩm
Áp suất khí Hiệu suất Hàm lượng Đánh giá cảm quan
nén (bar) thu hồi (%) Saponin triterpen
(% so với rau má khô)
7 80,2 67,8 Bột màu trắng ngà, mịn, không
tơi, có cục vón trong bình đựng
sản phẩm
8 82,4 69,7 Bột màu trắng ngà, mịn, tạo
vành ẩm trên thành thiết bị sấy
phun sau khi sấy 2h.
9 93,5 79,1 Bột màu trắng ngà, mịn, tơi xốp
10 80,6 68,2 Bột trắng ngà, mịn, tơi xốp
11 80,9 68,4 Bột trắng ngà, mịn, tơi xốp

Từ kết quả bảng 3.9, có thể nhận thấy áp suất khí nén có ảnh hưởng lớn đến hiệu
suất thu hồi sản phẩm của quá trình sấy phun. Khi áp suất khí nén tăng từ 8-9 bar, hiệu
suất thu hồi tăng từ 82,4 – 93,5%. Kết quả này hoàn toàn phù hợp vì khi áp suất nén
tăng sẽ làm đĩa phun quay nhanh hơn, khả năng làm tơi xốp nguyên liệu nhiều hơn, do
vậy diện tích tiếp xúc với tác nhân nóng tăng, các hạt sấy phun tạo ra nhẹ và khô sẽ ít
bị dính lại trên thành buồng sấy, hạt sản phẩm tơi xốp làm cho khả năng hút ra ngoài
cyclon được thuận tiện hơn, hiệu suất thu hồi cao hơn.
Khi tăng áp suất khí nén lên 10-11bar hiệu suất thu hồi sản phẩm tăng đáng kể,
trong khi đó thiết bị nén khí ở áp suất này luôn phải làm việc liên tục gây ảnh hưởng
không nhỏ đến giá thành và gây tiếng ồn, ngoài ra ở áp suất làm việc cao ảnh hưởng
lớn đến độ ổn định của đĩa quay, liên quan trực tiếp tới độ bền của thiết bị sấy phun.
Do vậy, chúng tôi lựa chọn áp suất khí nén bằng 9 bar.

59
 Từ các kết quả nghiên cứu khảo sát trên chúng tôi đã thu được một số điều kiện
thích hợp để sản xuất chế phẩm Saponin triterpen dạng bột như sau:
Bảng 3.12. Thông kê thông số kỹ thuật cho quá trình sấy phun saponin triterpen

TT Tên thông số kỹ thuật Đơn vị Thông số

tính kỹ thuật
1. Tỷ lệ chất độn Lactoza : Maltodextrin(1:1) % 10
trong nguyên liệu sấy
2. Áp suất khí nén đĩa quay bar 9
0
3. Nhiệt độ tác nhân sấy C 220 -240
0
4. Nhiệt độ không khí ẩm thoát ra sau cyclon C > 95
5. Lưu lượng cấp nguyên liệu Lít/h 5
6. Hàm lượng saponin triterpen có trong sản phẩm % 47-61
sau khi sấy
7. Lưu lượng gió hút qua cyclon m3/h 35 -40

Các thông số này chỉ có thể áp dụng cho sản phẩm saponin triterpen chiết tách
từ rau má và được thực hiện trên quy mô vừa và nhỏ, trong thực tiễn sản xuất lớn cần
có sự điều chỉnh cho phù hợp với thực tế và điều kiện của thiết bị.
Từ các quá trình nghiên cứu trên chúng tôi đưa ra quy trình tách chiết Saponin
triterpen trong rau má ở quy mô phòng thí nghiệm như sau:

60
Hình 3.15 : Quy trình công nghệ trên quy mô phòng thí nghiệm

61
3.6. Kết quả xác định hoạt tính sinh học của Saponin triterpen từ rau má.
3.6.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của Saponin triterpen:
Kiểm tra tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với
nồng độ Saponin triterpen 0,5mg/lỗ thạch có chứa một số chủng gây bệnh cho thấy sau
24 giờ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ đĩa thạch. Kết quả của thí nghiệm
này được trình bày qua bảng 3.13 và hình 3.16.
Bảng 3.13: Khả năng kháng vi khuẩn của Saponin triterpen

STT Chủng VSV thử nghiệm Đường kính vòng vô

khuẩn (mm)
1 Bacillus subtilis 20
2 Staphylococcus aureus (ATCC 29213) 30
3 Escherichia coli ((ATCC 25922) 23
4 Pseudomonas aeruginosa 22
(ATCC 27853)

Mẫu thử Đối chứng

62
Hình 3.16: Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của sản phẩm Saponin triterpen

63
 Kết quả bảng 3.13 và hình 3.16 cho thấy cả 04 dòng vi khuẩn đã được kiểm tra
bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch đều xuất hiện vòng đường kính kháng khá rõ
nét (từ 20 – 30cm). Trong đó, Saponin triterpen có khả năng kháng mạnh nhất với
Staphylococcus aureus, tiếp đến E.Coli, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis
(đường kính vòng kháng là: 30mm, 23mm, 22mm, 20 mm). So sánh với kết quả
nghiên cứu của M.Obayed Ullah và cộng sự thử khả năng kháng trên 16 chủng vi
khuẩn và nấm trong đó có 04 chủng Staphyloccus aureus, E.Coli, Pseudomonas
aeruginosa và Bacillus subtilis cho kết quả lần lượt là 16mm, 14mm, 13mm và 12mm
thì Saponin triterpen của chúng tôi cho kết quả kháng khuẩn cao hơn, mở ra triển vọng
khả năng ứng dụng có tính khả thi cao.
3.6.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của Saponin triterpen:
Kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa của Saponin triterpen bằng phương pháp
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ở các nồng độ 200µg/ml, 150µg/ml, 100µg/ml,
50µg/ml, 10µg/ml; đo độ hấp thụ sau 5, 10, 20 phút ở bước sóng 517 nm. Mẫu trắng được tiến
hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng Saponin triterpen. Kết quả được trình
bày trong bảng 3.14 dưới đây.
Bảng 3.14: Kết quả xác định khả năng ức chế gốc tự do

Nồng độ Atc A0s S(%) A5s S(%) A10s S(%) A20s S(%)
(µg/ml)
200 0.488 0.415 14.959 0.409 16.189 0.404 17.213 0.401 17.828
150 0.488 0.437 10.451 0.429 12.09 0.424 13.115 0.42 14.155
100 0.488 0.444 9.016 0.437 10.451 0.432 11.475 0.43 10.365
50 0.488 0.465 4.713 0.46 5.738 0.456 6.557 0.453 7.172
10 0.488 0.486 0.236 0.481 1.434 0.477 2.254 0.473 3.073

64
 ◊ Saponin triterpen
 Đường Stri

Nồng độ

Hình 3.17: Hoạt tính chống oxy hóa của Saponin triterpen
Qua kết quả bảng 3.14 khảo sát khả năng chống oxy hóa ta thấy Saponin
triterpen từ rau má có khả năng chống oxy hóa từ nồng độ 10 – 200µg/ml . Khả năng
chống oxy hóa của các Saponin triterpen cao nhất là 17.828% ở nồng độ 200µg/ml. Như
vậy Saponin triterpen có khả năng kháng các gốc tự do DPPH.
Sau khi vẽ đồ thị, xác định được phương trình đường thẳng, từ đó xác định được
nồng độ ức chế 50% IC50 = 0.529µg/ml của mẫu Saponin triterpen trong rau má. So
sánh với kết quả nghiên cứu của M.Obayed Ullah và cộng sự (năm 2009) thử khả năng
chống oxy hóa với sản phẩm Saponin triterpen từ được tinh sạch bằng chlorofom có
nồng độ ức chế 50% (IC50 = 0,626µg/ml). Điều này cho thấy Saponin triterpen sau tinh sạch
cũng có hiệu quả chống oxy hóa tương đối tốt.

65
 KẾT LUẬN
1. Đã lựa chọn được loại rau má Tây Phi làm nguyên liệu cho quá trình chiết tách hợp
chất Saponin triterpene và thành phần hóa học của nó.
2. Dung môi thích hợp để chiết tách các hợp chất saponin triterpene hiệu suất cao là
ethanol nồng độ 40%.
3. Tinh sạch và loại hợp chất mầu cho sản phẩm saponin triterpene bằng n- butanol hai
lần với tỉ lệ 1: 8 và 1: 5, chlorofom hai lần với tỉ lệ 1:5 và 1:7 và tẩy màu cho sản
phẩm bằng than hoạt tính: silicagel với tỉ lệ 2:1.
4. Bước đầu đề xuất được quy trình sản xuất Sapoin triterpen dạng bột với tỉ lệ phụ
gia phối trộn là: lactose và maltodextrin tỷ lệ 1:1 và tổng các chất độn chiếm 10%
dịch trước sấy, nhiệt độ sấy phun 2200C với lưu lượng dịch cấp là 5lit/h, áp suất khí
nén 9bar.
5. Saponin triterpen ở nồng độ 0.5mg có khả năng kháng với 04 chủng vi khuẩn
Staphylococcus aureus, E.Coli, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis và có
hoạt tính chống oxy hóa với nồng độ từ 10 - 200µg/ml (3,0 - 17,828%), trong đó đạt
cao nhất ở nồng độ 200µg/ml (17,828%).

66
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bùi chí Hiếu, 150 cây thuốc Nam, NXB Y học, TP Hồ Chí Minh, 1981
2. Đỗ Tất Lợi, Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 1962.
3. GS. TS Hà Huy Khôi, Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam NXB
Y Học- Hà Nội, 2000.
4. Võ văn Chi, Tự điển cây thuốc Việt nam, NXB Y học, 1997, 1255-1257 Bùi
Long Biên, Phân tích hóa học định lượng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.
1995.
5. Đào hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần thị Mỹ Linh, Phạm Hùng Việt, các
phương pháp Sắc ký, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà nội, 1985.
6. Nguyễn Quang Khánh, Nghiên cứu góp phần xây dựng quy trình chiết xuất hỗ
hợp Saponin, Flavonoid từ khô dầu hạt Camellia SP, trường Đại học Bách Khoa
Hà Nội, 2006 .
7. Nguyễn Phương và các cộng sự, Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sấy phun để
thiết kế, chế tạo thiết bị sản xuất bột đậu tương uống liền và bột nấm men giàu
protein và khoáng chất, Trung tâm CNSH&CNTP Hà Nội, 2007.
8. Phạm Kim Mẫn, Nghiên cứu Saponin và Sapogenin trong một số cây thuốc Việt
Nam, Viện Dược liệu, 1992.
9. Phan Quốc Kinh, Bài giảng chiết suất dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội,
55-63, 2006.
10. Phan Quốc Kinh, Giáo trình các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học,
NXB Giáo Dục Việt Nam (2011) 41-60.
11. Dược sỹ Trần Việt Hưng, Rau má và Ung thư, http://www.yduocngaynay.com.
12. Beljanski, M. and Vapaille, N., Role of triterpenes in the binding of Lamino
acids by template RNA. Rev. Eur. Etud. Clin. BioL, 16, 897-905 (1971).

67
13. Bonte, F., Dumas, M., Chaudagne, C., and Meybeck, A., Asiaticoside and
madecassoside comparative activities on human fibroblast type I and III
collagen secretion. Ann. Pharm. Fr., 53, 38-42 (1995).
14. Bontems, J. E., A new heteroside, asiaticoside, isolated from Hydrocotyle
asiatica L (Umbelliferae) Bull. Sci. Pharmacol., 49, 186-191 (1941).
15. Hunt, T. K., Ehrlich, H. P., Garcia, J. A., and Dunphy, J. E., Effect of vitamin A
on reversing the inhibitory effect of cortisone on healing of open wounds
in animals and man. Ann. Surg., 170, 633-641 (1969).
16. Inamdar, P. K., Yeole, R. D., Ghogare, A. B., and de Souza, N. J.,
Determination of biologically active constituents in Centella asiatica. J.
Chromatography, 742, 127-130 (1996).\
17. Jew, S. S., Yoo, Jo H., Lim, D. Y., Kim, H., Mook-Jung, I., Jung, M., Choi, H.,
Jung, Y.-h., Kim, H., and Park, H.-G, Structure- activity relationship study of
Asiatic acide derivatives against 13, amyloid (Al3)-induced neurotoxicity.
Bioorg. & Med. Chem. Lett., 10, 119-121 (2000).
18. Lawrence, J. C., The effect of asiaticoside on guinea pig skin. J. Invest.
Dermatol., 49, 95-96 (1967a).
19. Lawrence, J. C., The morphological and pharmacological effects of
asiaticoside upon skin in vitro and in vivo. Eur. J. Pharmacol., 414-424
(1967b).
20. Pointel, J. P., Boccalon, H., Cloarec, M., and Ledevehat, J. M., l trated
extract of Centella asiatica (TECA) in the treatment of venous insufficiency of
the lower limbs. Angiology, 38, 46- 50 (1987).
21. Poizot, A., Dumez, D. C. R., Modification of the kinetics of healing after
iterative exeresis in the rat. Action of a triterpenoid and its derivatives on
the duration of healing. Acad. Sci. [D], 286, 789-792 (1978).

68
22. 1. Soon-Sun Hong, Jong-Ho Kim*, Hong Li, and Chang-Koo Shim Advanced
Formulation and Pharmacological Activity of Hydrogel of the Titrated
Extract of C. Asiatica, Archives of pharmacal research 28 (4) (2006) 502-508.
23. M.Obayed Ullah, Shapna Sultana, Afroza Haque, Saira Tasmin, Antimicrobial,
Cytotoxic and Antioxidant Activity of Centella asiatica, European Journal of
Scientific Research 30 (2) (2009) 260-264.
24. Byeong-SeonJeong, Structure-Activity Relationship Study of Asiatic Acid
Derivatives for New Wound Healing Agent, Archives of pharmacal research 29
(7) (2006) 556-562.
25. Brinkhaus, B., Lindner, M., Schuppan, D. and Hahn, E.G.. Review Article:
Chemical, pharmacological and clinical profile of the East Asian medical plant
Centella asiatica. Phytomedicine, 7(5) (2000) 427-448. .
26. British pharmacopoeia, monographs, Herbal drugs and herbal drug
preparations 3, (2009) 3389-3390
27. Sapa D. Desai, Dhruv G. Desai, Harmeet Kaur, Saponins and their Biological
Activities. Pharma Time-Vol 41-No.3- March 2009
28. Pil-Jong Shim, Jae-Ho Park, Min-Sun Chang, Min-Jung Lim, Asiaticoside
mimetics as wound healing agent. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters
Volume 6, Issue 24, (1996) 2937–2940
29. M.Burits and F.Bucar, Antioxidant activity of Nigella sativa esential oil,
Phytotherapy Reaseach 14 (2000), 323-328
30. Merce Bonfill, Susana Mangas, Rosa M Cusido, Indentification of triterpenoid
compouds of Centella asiatica by thin-layer chromatography and mass
spectrometry, Biomedical chromatography 20 (2006) 151-153

69
70