Dr Cemile SÖNMEZ

Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları
Daire Başkanlığı
Ankara
 Serolojik testlerin önemi?
 Hangi amaçla
kullanıyoruz?
 Kullanımda olan testler?
 Son gelişmeler?
 1965-1975: Minyatürize biyokimyasal testlerin gelişimi
 1975-1985: İmmünolojik testlerin gelişimi
 1985-1995: Moleküler sistemlerin ve PCR’ın uygulanması
 1995-….Biyosensör ve mikroarray gibi sistemlerin
gelişimi
 Etkenin görülmesi  Etkeningenetik
(mikroskobik yöntemler) materyalinin
gösterilmesi
 Etkenin üretilmesi (moleküler yöntemler)
(kültür yöntemleri)

 Etkenin antijenik
yapısının veya ona
karşı oluşmuş
spesifik antikorların
saptanması (serolojik
yöntemler)
 Ag-Ab birleşmesi
tepkimelerinin görülebilir,
gözlemlenebilir,
ölçülebilir hale
getirilmesi temelli tanısal
yöntemlerdir.
 Her pozitif test sonucu
hastalığı kesinlikle
gösteremeyebileceği gibi
her negatif sonucu da
hastalığı tamamen ekarte
ettirmez.
 Kolay ve pratik
 Kısa sürede sonuç verirler
 Ekonomik
 Etkeni tanımlamak  Bağışıklık durumunu
 Tanıyı doğrulamak saptamak
 Hastalığın gidişi,  Serogrup, serotip ve
prognozu ve tedavisini immünotip tayininde
izlemek kullanılabilir.
 DİREKT YÖNTEMLER İNDİREKT YÖNTEMLER

Etkene özgü antijenin

Etkene özgü antikorun
saptanması saptanması

RSV, Influenza, Sifiliz,

Parainfluenza, HCV,HBV, HIV,
Adenovirüs, HSV, Kızamık, kızamıkçık,
Varicella-zoster, HSV…
CMV, Rotavirüs, HBV…
 KLASİK TEKNİKLER YENİ TEKNİKLER

 Kompleman fiksasyon
testi  ELISA
 Aglütinasyon
 Western blot
 Hemaglütinasyon
 Dot blot, immünoblot
inhibisyon testi
 İmmünofloresan
 Nötralizasyon testi
 Hızlı testler
 Counter immün
 İmmüno-PCR
elektroforez
 Mikro-boncuk yöntemi
Özgül antijen-antikor
reaksiyonunu göstermek
amacıyla enzimle işaretli
konjugat ve enzim substratı
kullanılarak reaksiyonun
renklendirilmesi esasına
dayanmaktadır.

14
 Hepatit virüsleri,  Antijen veya antikor
Rotavirüs, EBV, tespitinde
Adenovirüs, Herpes  Kalitatif veya
virüsler, CMV, HIV, kantitatif sonuç verir.
Rubella, Neisseria
gonorrhoeae, Chlamydia
trachomatis, Entamoeba
histolytica, T. gondii
 Direkt  Yeni geliştirilen
 İndirekt sistemlerde katı faz
mikroboncuk
 Kompetetif
sistemleri
 Nonkompetetif
kullanılmaktadır.
 Sandviç
 Makro ve mikro
 Avidin-biyotin ekli
Duyarlılığı yüksek
Test süresi kısa
ELISA, kullanılan substrat
özelliğine göre;

Kolorimetrik
Floresan
Kemilüminesan

17
 Katalitik reaksiyon sonucunda renk geliştiren
kromojenik substratlar kullanılarak gerçekleştirilir.
 Kromojen sonucun optik dansitesi spektrofotometre
ile ölçülür.

18
 Floresan substratlar  Otoantikorların, bakteri,
kullanılır. Enzim virüs ve bazı parazitlere
karşı oluşturulan
reaksiyonu sonucu antikorların ve bazı
florofor oluşmaktadır. antijenlerin (hepatit virüs
 Duyarlılık %98.1, antijenleri)
özgüllük %97 saptanmasında kullanılır.
 Viral antijen, antikor ve
dışkıda Clostridium
difficile toksin, Listeria
spp, Salmonella spp
saptamasında kullanılır.

VIDAS (Biomerieux)
19
1 pg/mL’deki antijeni saptayabilecek kadar
duyarlıdır.
RIA ‘dan 10 kat duyarlı ve daha basittir.
Katı faz olarak genellikle manyetik
mikropartiküller kullanılır.
Kimyasal reaksiyonun oluşturduğu ışık
ölçülmektedir.

20
 Access (Beckman Coulter)
 IMMULITE (Diagnostic Products)
 Cobas 6000 (Roche Dianostics)
 Vitros ECQ (Ortho Diagnostics)
 ARCHITECT ci4100 (Abbott)

21
 Hız
Kullanım kolaylığı
Yüksek performans
Yüksek duyarlılık

22
Kaset ELISA
Dot Blot ELISA
PCR ELISA
Elispot test

23
 Kaset testlerdir
 Hızlı, basit, ekonomik
ve güvenilir
 Membran, boya,
spesifik antijen veya
antikor
 Sonuçlar görsel olarak
değerlendirilir
 Pozitif testte renkli
çizgiler veya yuvarlak
şekiller elde edilir.
 Acil sonuç gereken ve az  RSV, influenza virus
numunenin çalışılacağı ve HIV antikorları
durumlarda,
 Düşük örnek kapasiteli
için, visceral
merkezlerde, klasik leishmaniasis,
ELISA’ya iyi bir filariasis, Legionella
alternatiftir. pneumophila serogrup
 Avantajı:Tecrübeli 1 üriner antijeni
eleman,
spektrofotometre ve
benzeri cihazlar
gerektirmez.

25
 Hasta örneğinin birtakım liganda karşı test
edilmesini sağlayan hızlı yöntemlerdir.
 Katı faz olarak nitrosellüloz veya naylon şeritler Pozitif kontrol

ve kağıtlar kullanılır.
Negatif kontrol

Rotavirus antijenleri, HIV virüsü (hücre

kültüründe amplifikasyonu sonrasında) H.pylori Totla ANA
ve EBV, CMV, HCV antikorlarının ve
otoantikorların saptanmasına yönelik dot blot ds DNA

ELISA testleri bulunmaktadır. RNP/Sm

SS-A/SS-B

26
 Poliakrilamid jel  Treponema pallidum,
elektroforezi ile  Chlamydia trachomatis,
molekül ağırlıklarına
göre ayrıştırılan  HIV,
antijenler, bandlar  Borrelia burgdorferri
halinde nitroselüloz serolojisinde
kağıt membranlara
geçirilir ve bu
memranlar şeritler
(strip) şeklinde
hazırlanır.
 Hasta serumunda özgül
antikor varlığı konjugat
ve substratın
eklenmesiyle saptanır.
 Sonuçlar görsel olarak
değerlendirilebilir.
 Western blot’a benzer
mekanizmaya dayanır.
 Rekombinant antijenler kullanılır.
 Kalitatif olarak değerlendirilir.
 Bu mekanizmaya dayanan testler
arasında "Lineimmunoassay(LIA)"
ve "Rekombinant immunoblot assay
(RIBA)" sayılabilir.
 HIV zarf ve çekirdek proteinleri ve
bunlara karşı özgül antikorların
saptanmasında kullanılmaktadır.
 Avantajları:
 Konjugatın işaretlendiği  Kolay uygulanabilir
madde bir florokrom  Özgül antijenlerin
boyasıdır ve lokalizasyonunun
değerlendirme floresans belirlenmesine de olanak
mikroskobu ile yapılır. sağlarlar.

Dezavantajları:
 Zaman alıcı,
 Pahalı floresan mikroskobu
 Değerlendirme için
eğitimli ve deneyimli
personele gereksinim
göstermesidir.
 KULLANILAN İŞARETLERİN HASSASİYET

KARŞILAŞTIRMASI

Kolorimetrik

Floresans
Teşhis Metodu

Zaman çözünürlüğü floresans

Radyoaktivite

Kemilüminesans

Enzim Lüminesans

Vıtros EC

-14 -15 -16 -17 -18 -19

10 10 10 10 10 10

Minimum Teşhis Düzeyi ( İşaret Mol. Sayısı)

30
 Real time PCR’a göre  Streptococcus , HIV ve
daha ucuz bir rotavirüsün gibi birçok
alternatiftir. infeksiyoz ajanın yüksek
 Klasik ELISA ile PCR duyarlılıkla
yöntemlerinin tanımlanmasında
birleştirilmesi sonucu
ortaya çıkmış yeni bir kullanıldığı
yöntemdir. bildirilmektedir.
 Gelecekte infeksiyon  Rotavirüs tanısında 100
hastalıklarının viral partikül /ml tespit
tanısında giderek edebilir.HIV-1’e ait p24
artan oranda antijen yükünü tespit
uygulama alanı edebilmektedir.
bulacaktır.
 PCR ürünlerini  İşaretli problar
kantitatif olarak (digoxigenin), PCR
değerlendirmektedir. ürünlerinin katı faza
immobilize
edilmesinde
kullanılmaktadır.
 Konjugat (Anti-
digoxigenin-AP-
konjuge antikorlar) ve
substrat
(paranitrophenyl)
eklenerek,
 Optik dansite
herhangi bir ELISA
okuyucusunda
okunmaktadır.

32
 Sandviç ELISA
tabanlı test
 Antijen-antikor
birleşmesine
dayanır.
 Spesifik antijene
karşı
antikor/protein
üreten T/B
lenfositlerin
kantitasyonu için
geliştirilmiş bir
testtir.

33
Avantajları:
 ELISA’dan 20-200 kat
daha duyarlıdır.
 İn vitro koşullarda in
vivo koşullara yakın
sonuç vermesidir.

 Aşı çalışmalarında, Tb
tanısında aktif
infeksiyonu aşılı
olanlardan ve Tb’yi Tb
dışı mikobakterilerden
ayırt eder, tedavinin
takibinde
 Çok analiz avantajlı
sistemler
 Antijen ya da
antikorlar ELISA’daki
gibi bir zemine
sabitlenirse planar
array,
 Mikrokürelere
sabitlenirse
süspansiyon ya da
bead array (Luminex
ve Xmap)
Avantaj: Avantaj:
 Kompleks setler  Esneklik
oluşturulabilir Dezavantaj?
Dezavantaj:
 Antijen üç boyutlu
yapısının
bozulabilmesi

Hastalık profillerinin çıkarılmasında

güçlü bir tanısal araç
Avantajları: • Serotip tayininde, aşı
 Tek örnekte en fazla 100 çalışmalarında
analitin eş zamanlı • Luminex, xMAP
ölçümü ve biribiri ile teknolojileri
kıyaslanmasına
 Sadece düşük örnek hacmi
ile en fazla 100 analitin
ölçümü
 Her bir test için maliyet
düşük
 Hızlı
Ağı nereye atacağınızı
bilmeniz dileğiyle…