11/4/2013

Ekstrakcije

Metode razdvajanja komponenata iz smeše u cilju prečišćavanja,

a radi lakše identifikacije ili određivanja sadržaja.
Može biti izuzetno komplikovano zbog velike sličnosti
komponenata i složenosti sastava uzorka.

Kod prirodnih uzoraka postupak

dodatno komplikuje osetljivost
komponenata na uticaj svetlosti,
temperature, pH ekstraktanata,
različitih oksidansa i dr.

1
 11/4/2013

Iz perspektive analitičara, priprema uzorka treba da bude:

jednostavna,

iz minimalne količine uzorka,

uz minimalnu količinu rastvarača,

brza,

precizna i

isplativa.

no--tečna ekstrakcija - LLE

Tečno

Zasniva se na particiji ili distribuciji analizirane supstance iz jedne

tečne faze u drugu tečnu fazu.
Tečne faze međusobno se ne mešaju
npr. voda i hidrofobni organski rastvarač, alkohol i etar

Ukoliko se analit nalazi u

matriksu koji može da utiče na
njegovu analizu potrebno ga je
ekstrahovati rastvaračem u kome
se on dobro rastvara, a matriks se
pritom slabo ili uošte ne rastvara u
tom rastvaraču.

2
 11/4/2013

Primenjuje se za:
pre-koncentrovanje uzorka ili
izolovanje analita iz ispitivanog uzorka pre primene odgovarajuće
metode farmaceutske analize.
npr. ekstrakcija analita iz biološkog materijala pre HPLC analize

Prednosti:
☺ jednostavna i jeftina metoda za uklanjanje interferencija

Nedostaci:
mala selektivnost, ograničeni broj rastvarača koji se međusobno
ne mešaju, upotreba velikih zapremina rastvarača

Raspodela supstance u
određenom binarnom sistemu ima
konstantnu vrednost i izražava se
kao podeoni ili distribucioni
koeficijent (Kp).
Kp NE ZAVISI od količine
supstance i zapremine rastvarača,
ali zavisi od temperature.

Faktori koji utiču na Kp mogu biti:

a) hemijski: priroda rastvarača, jonska jačina, pH i
b) fizički: temperatura, prisustvo interferirajućih supstanci.

Ekstrakcija se može izvesti odmah sa celokupnom zapreminom

rastvarača (jednokratna) ili više puta sa manjim zapreminama
(višekratna), što zavisi od efikasnosti postupka.

3
 11/4/2013

Efikasnost LLE zavisi od:

Količine uzorka.
Podeonog koeficijenta.
Stepena međusobnog mešanja rastvarača uzorka i ekstraktanta
(manji bolja efikasnost).
Zapremine upotrebljenog ekstraktanta (povećava se efikasnost
nekih ekstrakcija).
Broja ekstrakcija (veći broj, bolja efikasnost).

Dužine i načina mućkanja 5 -10 min. (ne

jako i ne predugo da se ne stvore
emulzije).
NH4(SO4)2 se dodaje da spreči nastajanje
emulzija kod npr. ekstrakcija jonskih
jedinjenja organskim rastvaračima iz
vodenih uzoraka (rastvarači se mešaju
acetonitril i 2-propanol pa nastaje
emulzija).
Za kvantitativnu analizu potrebno je da
efikasnost ekstrakcije bude najmanje 97%.

4
 11/4/2013

Faktori koji utiču na LLE:

Fizički:
temperatura,
veličine uzorka i
prisustvo drugih supstanci u uzorku.
Hemijski:
vrsta upotrebljenog rastvarača,
vrsta uzorka i
mogućih hemijskih reakcija između aktivnih supstanci i
rastvarača (aceton kao keton stvara sa 1°aminima Šifove
baze; aldehidi i ketoni sa alkoholima poluacetale i acetale)
Polarnost rastvarača, po principu „slično se u sličnom rastvara”.
pH rastvora.
Jonska jačina.

Izbor rastvarača

Najvažniji faktor čiji izbor zavisi od fizičko-hemijskih osobina

ispitivane supstance.
Binarni sistem čine rastvarači koji se međusobno ne mešaju, tj.
rastvarači različite polarnosti.
npr. ukoliko je voda rastvarač kao ekstraktant bira se nepolarni
organski rastvarač (hloroform, cikloheksan, dietiletar, itd).
Novinu predstavlja primena superkritičnih tečnosti – striktnim
povećanjem pritiska ugljen-dioksid se prevodi u tečno stanje.
Prednost je što lako i brzo isparava sa sniženjem pritiska, a
ekstrahovana supstanca zaostaje uparena. Ovakav ekstraktant ne
ostavlja onečišćenja.

5
 11/4/2013

Izbor rastvarača zavisi i od tehnike koja će se koristiti za dalju

analizu.
Za UV/VIS analizu ne sme apsorbovati u toj oblasti.
Za HPLC analizu mora biti HPLC čistoće.
Ukoliko je potrebno uparavanje rastvarača potrebno je upotrebiti
lako isparljiv i sl.

Faktori koje treba razmotriti prilikom izbora rastvarača :

Selektivnost.
Distribucioni koeficijent (poželjan veći – manje rastvarača).
Rastvorljivost u drugom rastavraču (nepoželjna).
Mešanje dva rastvarača (nepoželjno mešanje ekstraktanta i rastvora
uzorka).
Razlika gustine između tečnih faza (mora da postoji).
Površinski napon (manji, jer je manja mogućnost za nastajanje emulzija).
Hemijska reaktivnost (poželjan inertan rastvarač).
Regeneracija nakon ekstrakcije (laka).
Cena koštanja (niska).
Viskoznost (niska, važno za rukovanje).
Pritisak isparavanja (mali).
Nezapaljiv, netoksičan.

6
 11/4/2013

Uticaj gustine na razdvajanje:

7
 11/4/2013

Rastvorljivost ekstraktanata u vodi:

LLE zasnovana na raspodeli između dva rastvarača primenjuje se za

ekstrakciju analita iz uljanih nosača.
npr. ekstrakcija kortikosteroida iz masti i kremova
Najčešče se za ekstrakciju koristi sistem metanol/heksan,
etanol/heksan ili acetonitril/heksan.
Uljana faza se rastvora u heksanu, a analit kao polarniji prelazi u
metanolni sloj.
Upotreba internog standarda je obavezna.
Kao IS koristi se supstanca strukturno slična sa analitom.

8
 11/4/2013

Jonska jačina

Dodatkom neorganske soli u rastvor neelektrolita smanjuje se

njegova rastvorljivost. Podešavanje jonske jačine (primenjuju se 2M
– 4M rastvori neorganskih soli) u cilju smanjenja rastvorljivosti naziva
se efekat „isoljavanja”. Posledica ovog efekta je potiskovanje
neelektrolita iz vode u ekstraktant – organski rastvarač.
Uticaj katjona i anjona na efekat „isoljavanja” prikazan je liotropnim
nizom:
katjoni: Mg2+ > Ca2+ > Sr2+ > Ba2+ > Li+ > Na+ > K+ > Rb+ > Cs+
anjoni: citrati > tartarati >SO42- > acetati > Cl- > NO3- > ClO3- > J- > SCN-
Efekat značajan i u slučaju primene ekstraktanta koji se delimično
rastvara u vodi (etar, aceton). Podešavanjem jonske jačine
dodatkom npr. MgCl2, CaCl2 ili KCl dolazi do smanjenja rastvorljivosti
organskog rastvarača u vodi. U ovom slučaju efekat isoljavanja je
dvojak, potiskuje i ispitivanu supstancu i organski rastvarač iz vode.

Uticaj pH vrednosti

Aktivne farmaceutske supstance su

najčešće slabe kiseline ili slabe baze, kao
i njihove odgovarajuće soli.
U zavisnosti od stepena disocijacije u
vodenoj fazi biće prisutan i molekulski
oblik (ima veći afinitet prema nepolarnom
rastvaraču) i jonski oblik (ima veći afinitet
prema vodenoj fazi). U takvoj situaciji
nemoguće je izvesti kvantitativnu
ekstrakciju.

Promenom pH vodene faze jonski oblik prevodi se u molekulski i

postiže se kvantitativnost ekstrakcije.

9
 11/4/2013

Kontrola i održavanje pH postiže se dodatkom odgovarajućih

pufera.
pH vodenog rastvora analiziranog jedinjenja kiselih osobina
podešava se da bude 2 pH jedinice ispod pKa vrednosti tog
jedinjenja.
pH vodenog rastvora analiziranog jedinjenja baznih osobina
podešava se da bude 2 pH jedinice iznad pKa vrednosti tog
jedinjenja.
Kontrolom i održavanjem pH moguće je razdvojiti smešu kiselina –
baza, ali se tada pH mora smanjivati, odnosno povećavati za 3 pH
jedinice u odnosu na pKa vrednost analiziranih jedinjenja.

Čvrsto-
vrsto-tečna ekstrakcija

Čvrsto-tečna ekstrakcija (eng. solid

phase extraction – SPE) je nova i široko
primenjivana tehnika pripreme uzorka
koji se dalje analizira nekom
instrumentalnom metodom.

Princip
Analit se obavezno rastvara u
rastvaraču koji ima malu eluacionu moć
(gledano u odnosu na čvrsti nosač).
Analit se zbog velikog afiniteta
zadržava na čvrstom nosaču.
Eluiranje se vrši malom zapreminom
rastvarača velike eluacione moći.

10
 11/4/2013

Prednosti u odnosu na LLE:

☺ Ne javlja se problem loše separacije faza ili mešanja faza.
☺ Mogu se koristiti hemijski različiti sorbensi, a time se podešava i
selektivnost.
☺ Prevaziđen problem niskih Recovery vrednosti kod LLE. To znači
da su SPE ekstrakcije kvantitativnije.
☺ Smanjena je potrošnja skupih organskih rastvarača.
☺ Lakše se i brže izvodi, a može se i automatizovati.

Nedostaci
Iako su Recovery vrednosti daleko bolje nego kod LLE,
preporučljivo je koristiti IS koji mora biti strukturno sličan sa analitom.
Sorbensi čija je osnova silika gel nisu stabilni u jako alkalnoj sredini.

Primenjuje se za:
Koncentrovanje uzorka
Često je slučaj da analit bude prisutan u veoma niskoj
koncentraciji. Primenom SPE moguće je izvršiti
koncentrovanje uzorka do nivoa prihvatljivog za
kvantitativnu analizu.
Ekstrakciju i prečišćavanje uzorka
Prisustvo interferirajućih komponenti matriksa (biološki
materijal) može onemogućiti kvantitativnu analizu
ispitivanog jedinjenja. Primenom SPE uklanjaju se
komponente matriksa – uzorak se prečišćava, a iz uzorka
se ekstrahuje ispitivana supstanca.

11
 11/4/2013

SPE se zasniva na raspodeli analita između čvrste faze (sorbensa) i

tečne faze (eluenta). Postupak zavisi od:
strukture i osobina analita koji treba ekstrahovati,
prirode organskog rastvarača u kome je analit rastvorljiv,
pH vrednosti uzorka,
jonske jačine i
uticaja matriksa na analit.

SPE protokol može se postaviti

tako da se analit:

Zadrži na čvrstoj fazi

Primenjuje se kada je:
1) analit u uzorku prisutan u
niskoj koncentraciji,
2) treba ekstrahovati više analita
različite polarnosti.

Ne zadrži na čvrstoj fazi

Primenjuje se jedino kada je
analit u uzorku prisutan u visokoj
koncentraciji.

12
 11/4/2013

SPE postupak obuhvata četiri faze:

Kondicioniranje
Izvodi se propuštanjem rastvarača ili
smeše rastvarača kroz kolonu napunjenu
sorbensom – čvrstom fazom (kertridž).
Kondicionira se rastvaračem koji će biti
korišćen za eluiranje.
Omogućava aktiviranje čvrste faze.

Adsorpcija
Rastvor analita, biološki materijal, i sl,
propušta se kroz kertridž.
Rastvor analita priprema se u
rastvaraču koji ga ne može eluirati sa
kolone (male je eluacione moći
posmatrano u odnosu na sorbens).
Sve komponente (analit, nećistoće,
komponente matriksa i sl) adsorbuju se
na čvrstu fazu.

13
 11/4/2013

Ispiranje
Vrši se rastvaračem koji će odstraniti
komponente matriksa i nečistoće, dok
analit ostaje vezan za čvrstu fazu.
Izbor rastvarača je od presudnog
značaja.
Vrši se na osnovu fizičko-hemijskih
karakteristika analita i sorbensa.

Eluiranje analita
Vrši se pogodnim rastvaračem.
Rastvarač ima veliku eluacionu moć
posmatrano u odnosu na sorbens.

14
 11/4/2013

Mehanizam zadržavanja analita na čvrstoj fazi

Reverznih faza Normalnih faza Izmene jona
nepolarni ili slabo
Polarnost analita polarni polarni - jonizovani
polarni
Polarnost sorbensa nepolaran polaran polaran
Vrsta veza koja se van der Valsove vodonične, izmena jona –
uspostavlja na (hidrofobne, dipol-dipol interakcije, elektrostatičke
međufazi particione) π-π interakcije interakcije
polaran nepolaran ili slabo polaran
Matririks iz koga se
(voda, pufer, biološki polaran (toluen, (dejonizovana
vrši ekstrakcija
materijal) CH2Cl2, heksan) voda, pufer)
nepolarniji od pufer
polarniji od matriksa
matriksa odgovarajućeg
Eluent (etil-acetat, aceton,
(voda-metanol, sastava, jonske
acetonitril)
voda-acetonitril) jačine i pH

najpolarnija se eluira najnepolarnija se slabo jonizovana

Redosled eluiranja
prva eluira prva se eluira prva

Lipofilni adsorbensi

Lipofilni adsorbensi se koriste za ekstrakciju mehanizmom

reverznih faza.
Van der Valsovim silama vrše retenciju lipofilnih nejonizovanih
analita.

15
 11/4/2013

Za ekstrakciju analita kiselog karaktera najpre je potrebno

rastvor iz kog se analit ekstrahuje zakiseliti - prevesti u molekulski
nejonizovani oblik.
Za ispiranje se koristi kiseli pufer, voda ili smeša metanola i
razblažene kiseline.
Eliuranje se vrši metanolom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom ili
alkalnim puferom.

Za ekstrakciju neutralnih jedinjenja nije potrebno kontrolisati pH.

Za ispiranje se koristi alkalni pufer ili razblažena kiselina
(uklanjaju se nečistoće koje jonizuju) ili smeša metanola i vode.
Eliuranje se vrši metanolom, etanolom ili hloroformom.

Amini se takođe mogu

ekstrahovati primenom ovih
sorbensa.
Interakcija amina sa
sorbensom je preko
slobodnih silanolnih grupa -
polarne interakcije.

Za ekstrakciju analita baznog karaktera najpre je potrebno

rastvor iz kog se analit ekstrahuje zaalkalisati (pH 10 je
odgovarajući za većinu baza) - prevesti u molekulski nejonizovani
oblik.
Za ispiranje se koristi alkalni pufer, voda ili smeša metanol-alkalni
pufer.
Eliuranje se vrši kiselim puferom, metanolom ili etanolom.

16
 11/4/2013

Polarni adsorbensi

Polarni adsorbensi se koriste za

ekstrakciju mehanizmom normalnih
faza.
Retencija se zasniva na građenju
vodoničnih veza, ostvarivanju dipol-
Silika gel dipol interakcija ili π-π
π interakcija preko
polarnih grupa sorbensa i analita.
Koriste se za ekstrakciju polarnih
jedinjenja.

Aminopropil
Za eluiranje polarnih jedinjenja
baznog karaktera koristi se smeša
metanol - kiseli pufer.
Za eluiranje polarnih jedinjenja
kiselog karaktera koristi se smeša
Diol metanol - alkalni pufer.

Jono-izmenjivački adsorbensi

U osnovi sadrže silika-gel modifikovan radikalima koji na

terminalnom kraju imaju naelektrisane jone.
U zavisnosti od naelektrisanja dele se na katjonske i anjonske.

Retencija se zasniva na ostvarivanju elektrostatičkih privlačenja

između funkcionalnih grupa jedinjenja i adsorbensa.
Funkcionalne grupe analita i adsorbensa moraju biti u jonskom
obliku, a to se postiže podešavanjem pH vrednosti matriksa u
zavisnosti od pKa jedinjena i adsorbensa.
Za eluiranje se koristi rastvarač koji ima takvu pH vrednost da
neutrališe aktivirane grupe adsorbensa ili analita – prestaje
elektrostatičko privlačenje i analit se eluira.
Drugi način za eluiranje je primena rastvarača koji ima toliku
jonsku jačinu da dislocira vezano jedinjenje – dolazi do razmene
analita i jona prisutnih u rastvaraču.

17
 11/4/2013

Katjonski
Silika modifikovana sulfonskom
kiselinom.
Jaki katjonski izmenjivač. Ima
natrijumov jon koji se menja sa
pozitivno naelektrisanom grupom
analita.
Moguća primena u širokom opsegu
pH.

Silika modifikovana karbonskom

kiselinom.
Slab katjonskim izmenjivač.
Primena moguća u užem opsegu
pH, jedna pH jedinica iznad ili
ispod pKa vrednosti analita.

Anjonski

Silika modifikovana kvaternernim

aminima.
Jak anjonski izmenjivač koji se
koristi u širokom opsegu pH
vrednosti.

Silika modifikovana aminopropil

radikalima kao slab anjonski
izmenjivač primenjuje se za
ekstrakciju polarnih jedinjenja.

18
 11/4/2013

Interakcije između analita i jakih jonoizmenjivača

Protokol ekstrakcije mehanizmom reverznih faza

Kondicioniranje najpre metanolom

R
ili acetonitrilom, a zatim vodom ili
-(CH3)2 C18H37
puferom. Sorbens NE SME da se
-C18H37
osuši. -(CH3)2 C8H17

Adsorpcija -C2H5

Ispiranje veoma polarnim

rastvaračem
Eluiranje
Prva se eluira najpolarnija
komponenta iz smeše primenom
odgovarajućeg rastvaraća koji je
manje polaran od rastvarača koji
je korišćen za pripremu uzorka.
Postepenim povećanjem
nepolarnosti eluenta eluiraju se i
ostale komponente (red eluiranje
je red rastuće nepolarnosti).

19
 11/4/2013

Primer: Oralna suspenzija hlorpromazina

Sadrži: hlorpromazin, metilparaben, neutralnu hidrofilnu boju, Na-

laktatni pufer, lipofillni korigens ukusa.

U 5ml uzoraka doda se 0,5ml amonijačnog pufera pH 9,5.

Kondicioniranje sorbensa: amonijačnim puferom.

Hlorpromazin se nalazi u formi slobodne baze i adsorbuje se

na ODS SPE adsorbens.
Sve komponente rastvorljive u vodi pri baznom pH se ispiraju
sa adsorbensa.
Uzorak hlorpromazina se eluira smešom 0,5 M fosfatni pufer
pH 2,0 : metanol (95 : 5) i dopuni volumen potreban za UV
spektrofotometriju.

Protokol ekstrakcije mehanizmom normalnih faza

Kondicioniranje nepolarnim R
rastvaračem – najčeščće rastvarač -(CH2)3 NH2

u kome je pripremljen uzorak. -(CH3)2 (CH2)3 CN

-(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH
Adsorpcija
Ispiranje nepolarnim rastvaračem
Eluiranje
Prva se eluira najnepolarnija
komponenta iz smeše primenom
odgovarajućeg rastvaraća
polarnijeg od rastvarača koji je
korišćen za pripremu uzorka.
Postepenim povećanjem
polarnosti eluenta eluiraju se i ostale
komponente (red eluiranje je red
rastuće polarnosti).

20
 11/4/2013

Protokol ekstrakcije mehanizmom jonske izmene

Ekstrakcija na anjonskim izmenjivačima

Kondicioniranje puferom čiji je pH blizak uzorku (0,01 – 0,1 M) i

koji sadrži lako izmenjive jone (C2H5COO-, CH3COO-, F-). Joni
kao što su Cl-, Br-, NO3-, HSO4- ili citratni anjon nisu lako izmenjivi
joni i treba ih izbegavati.
Adsorpcija: pH rastvora uzorka mora biti 1-2 pH jedinice iznad
pKa analita.
Ispiranje dejonizovana voda ili organski rastvarač
Eluiranje rastvorom pufera koji sadrži jon koji može kompetitivno
da istisne adsorbovani analit. Vrlo često se mora dodati i
organski rastvarač.

Primer: Ekstrakcija meticilina

Relativno jaka kiselina pa se može ekstrakovati na primenom i

jakih i slabih anjonskih jonoizmenjivača.
Uzorak: Rastvor u puferu (pH 3.8-4.8)
Eluiranje: pufer koji sadrži visoku koncentraciju jona koji
kompetitivno istiskuju meticilin (1 M NaCl ili citrat).

21
 11/4/2013

Ekstrakcija na katjonskim izmenjivačima

Kondicioniranje puferom čiji je pH blizak uzorku (0,01 – 0,1 M) i

koji sadrži lako izmenjive jone (K+, Na+, NH4+). Joni kao što su
Ca2+ ili Mg2+ nisu lako izmenjivi joni i treba ih izbegavati.
Adsorpcija: pH rastvora uzorka pH 1-2 pH jedinice ispod pKa
analita.
Ispiranje istim puferom, dejonizovanom vodom ili organskim
rastvaračem.
Eluiranje rastvorom pufera koji sadrži jon koji može kompetitivno
da istisne adsorbovani analit. Vrlo često se mora dodati i
organski rastvarač.

Primer: Ekstrakcija adrenalina

Uzorak: rastvor u puferu pH 8,3.

Eluiranje: pufer koji sadrži visoku koncentraciju jona koji
kompetitivno istiskuju adrenalin (1 M NH4Cl).

22