Repte 3_Fase 5_A7

Què està fallant? - Creem les nostres hipòtesis

Després de la informació que heu obtingut en seminaris, activitats i espai d’habilitats, és hora
que reviseu tot el procés experimental i les discrepàncies en els resultats de l’auditoria (veure
carta del director i informe de l’auditoria). La fonamentació teòrica que heu construït durant
la fase 4 (protocols, manuals d’equips, articles científics) us seran de gran ajuda per tal de
pensar, fonamentar i aprofundir en aquells fets que podrien estar causant els mals resultats.
Us aconsellem que agafeu, pas per pas, tot el procés experimental (figura 2 auditoria) i que
penseu possibles errors en cada un d’aquests passos. A més, heu de tenir en compte que les
fonts d’errors poden ser molt diverses!

COM HO COMPROVARIES? QUÈ

HIPÒTESI
Què està fallant? Què està causant
els resultats erronis?
La proteïna AT es degrada durant la La degradació de la proteïna
purificació, i això que fa que recombinant en sistemes com E. coli
l’activitat inhibidora d’AT sigui més és un obstacle que, sovint, afecta la
baixa.
El gen d’interès no s’ha inserit bé.
Després dels talls dels enzims, molts
plasmidis s’haurien tornat a unir i
per tant el nombre de bacteris
funcionals amb el plasmidi i el gen
ha disminuït.
La transformació del plasmidi a la
soca d’ E. coli, i això fa que el
nombre de colònies amb el plasmidi
més el gen disminueixi i
conseqüentment, la producció d’AT
també baixarà.
La incubació del cultiu bacterià,
E.coli BL21, no ha sigut eficient i
conseqüentment la producció de la
proteïna AT es veurà afectada.
FONAMENTACIÓ TEÒRICA
Breu explicació de com hem elaborat
la hipòtesi tenint en compte la
informació (protocols, manuals,
articles) que hem trobat.
producció de la nostra proteïna
d’interès. E. coli té proteases
endògenes que poden degradar la
nostra proteïna i que cal inhibir en tot
moment mantenint la proteïna en fred
i fent servir inhibidors de proteases.
El procés de clonatge del gen dins
d’un plasmidi presenta algunes
dificultats. En ocasions, fins i tot, cal
afegir els extrems cohesius generats
en el plasmidi quelcom per evitar que
es tornin a tancar i afavorir l’obtenció
de plasmidis amb el gen.
Una de les metodologies per
transformar els bacteris és
l’electroporació. Aquest permet crear
microporus que facilitan l’entrada del
plasmidi dins el bacteri.
La incubació del cultiu bacterià no ha
sigut eficient i conseqüentment la
producció de la proteïna AT es veurà
afectada.
L’expressió recombinant d’alguns gens
heteròlegs poden interferir amb la
ESPERARIES?
Com comprovaries si aquesta hipòtesi és
certa o falsa? Quins experiments faries i
quins resultats esperaries? Faries servir
algun tipus de control positiu o negatiu?
La degradació de la nostra proteïna d’interès
(AT) ja purificada es pot observar mitjançant
un gel desnaturalitzant SDS-PAGE. Si hi ha
degradació, esperaríem veure bandes de
menor pes molecular que AT, corresponents
a productes de la seva degradació. De forma
opcional es podria fer un Western Blot per
detectar específicament fragments de
degradació.
D’altra banda, si la degradació fos de pocs
aminoàcids, es podria fer una seqüenciació
del N-terminal amb espectrometria de
masses.
Hauriem de comprobar si el nombre de
bacteris amb plasmidi vs plasmidi+gen és
l’esperat segons estudis previs o no. Per fer-
ho existeixen diferents metodologies tals
com: extracció, amplificació per PCR i
detecció del fragment desitjat o bé tallar
amb els enzims de restricció i fer un gel per
comprovar la presència del gen.
Revisió tècnica de l’aparell i revisió del
protocol de electroporació.
Revisió tècnica de l’estufa a 37 ºC.
Realitzar una corba de creixement i un cultiu
quantitatiu de la soca i determinar si
correspon a l'inòcul esperat.
 Repte 3_Fase 5_A7
La inducció no ha sigut eficient i
l’expressió del gen ha estat
incorrecta.
El procés de purificació requereix,
primer, la lisi de la membrana
cel·lular, si aquest procés no es
desenvolupa bé no aconseguirem
alliberar la quantitat de proteïnes
desitjades.
El coagulòmetre no està ben
calibrat, per tant no ens donarà bé
el temps de coagulació.
La transcripció inversa no es fa
correctament, per tant no tenim el
nostre ARNm madur (sense introns).
fisiologia i fins i tot resultar tòxica per
l’hoste originant una afectació
significativa del creixement i fins i tot
la mort del cultiu.
Per l’expressió del gen clonat en el L’electroforesi desnaturalitzada en gel de
bacteri, cal induir la seva síntesi. poliacrilamida es por comprovar el grau
Aquesta és fa afegint IPGT a certa d’expressió de la proteïna.
concentració, per això cal fer assajos Comprovar la concentració de l'inductor, i en
d’screning d’expressió. cas de dubte el millor seria llençar les
La proteòlisis és un efecte indesitjable alíquotes preparades d’aquest producte i
observable durant l’expressió i la preparar-ne de nou.
purificació.
E.coli té un gran nombre de proteases Es podria comprovar fent un gel d’SDS-PAGE
localitzades en el citoplasma, i visualitzar els diferents fragments generats
periplasma y membrana interna i deguts a la degradació de la proteïna.
externa, que participan en acitivats
metabòliques i en l’eliminació
selectiva de proteïnes anormals. Una
proteïna com l’AT podria ser
reconeguda com a anormal y ser
degradada.
El temps de tromboplastina parcial Comprovar la calibració del coagulòmetre
activada, és una indicació de que la amb l'estàndard.
proteÏna AT funciona correctament i
té una valors de normalitat entre 24-
36 segons.
La clonació de cert gens implica Determinar que la mida del fragment d’ADN
utilizar l’ARNm per tal d’obtenir la correspon a l’esperat amb un gel d’agarosa.
proteïna neta. Cal utilitzar la
transcriptasa inversa per obtenir
ADNc que serà el que s’inseria al
plasmidi.
 Repte 3_Fase 5_A7

Rúbrica d’avaluació

Ítem 5 punts 4 punts 3 punts 2 punts 1 punt

d’avaluació
Hipòtesis Més de set hipòtesis 5-7 hipòtesis 3-5 hipòtesis 2 hipòtesis 1 o cap
científicament científicament científicament científicament hipòtesis
rellevants. rellevants. rellevants rellevants científicament
rellevant
Fonamentaci La fonamentació teòrica La fonamentació La La La
ó teòrica de les hipòtesis és sòlida teòrica de la major fonamentació fonamentació fonamentació
científicament i es basa part de les hipòtesis teòrica de la teòrica d’una teòrica de les
en els materials de és científicament meitat de les quarta part de hipòtesis no és
consulta i context sòlida i es basa en els hipòtesis és les hipòtesis és rellevant i no
facilitats. materials de científicament científicament sustenta les
consulta facilitats. sòlida i es basa sòlida i es basa hipòtesis
en els materials en els materials emeses.
de consulta de consulta
facilitats. facilitats.

(≥5 hipòtesis)* (≥ 4 hipòtesis)*

(≥ 3 hipòtesis)* (≥2 hipòtesis)* (≥1 hipòtesis)*
Comprovació En tots els casos es En la major part dels En la meitat dels En la quarta No es plantegen
i resultats plantegen experiments i casos es plantegen casos es part dels casos experiments,
esperats controls, i es descriuen experiments i plantegen es plantegen controls i es
possibles resultats que controls, i es experiments i experiments i descriuen
permeten discernir si les descriuen possibles controls, i es controls, i es possibles
hipòtesis són vàlides o resultats que descriuen descriuen resultats, que
falses. permeten discernir si possibles possibles permeten
les hipòtesis són resultats que resultats que discernir si les
vàlides o falses. permeten permeten hipòtesis són
discernir si les discernir si les vàlides o falses.
hipòtesis són hipòtesis són
vàlides o falses. vàlides o falses.

(≥5 hipòtesis)* (≥ 4 hipòtesis)* (≥ 3 hipòtesis)* (≥ 2 hipòtesis)* (≥1 hipòtesis)*

*Per accedir a aquesta puntuació cal haver escrit, com a mínim, el número d’hipòtesis que
s’indica.