Debrecen Egyetem

Tananyag címe: Fény- és fluoreszcenciás mikroszkópia

Intézet: Biofizika és Sejtbiológia Intézet

Biofizika gyakorlat

Szerzők: Csomós István, Papp Ferenc és Varga Zoltán

Dátum: 2015. március 15.

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1
 Mikroszkópia az orvostudományban I.
Vérkenet vizsgálatok
Humán melanóma vizsgálatok

Sarlósejtes anémia
Dermatoszkóp

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 Mikroszkópia az orvostudományban II.
Beteg minták patológiai analízise
Bazális membrán invázió Méhnyakrák szűrés (Papanicolau-kenet)

alacsony grádiensű intraepitél lézió

Onkológiai elváltozások összehasonlító analízise

beteg és kontroll mintákon

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 Mikroszkópia a modern biofizikában és sejtbiológiában
Kolokalizáció – domén szintű korrelációs vizsgálatok Morfológiai vizsgálatok

Akceptor fotoelhalványításon alapuló FRET

– molekuláris asszociációk vizsgálata
donor akceptor FRET
Fluoreszcencia-korrelációs spektroszkópia

MT-2

β2m MHC I nehéz lánc

(A546-L368) (A647-W6/32) -100 0 100
FRET (%) TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
A mikroszkóp felépítése

élesség állító

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 A mikroszkóp képalkotása I.
Gyűjtőlencsék képalkotása

1. A tárgy a lencse fókusztávolságán kívül: 2. A tárgy a lencse fókusztávolságán belül:

A keletkezett kép (I): A keletkezett kép (I):

• valódi • látszólagos
• fordított állású • egyenes állású
• nagyítás (N) függ a tárgy • nagyított
pozíciójától (O):
O>2F: N<1,
O=2F:N=1,
2F>O>F: N>1
O=F, nincs kép

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 A mikroszkóp képalkotása II.
Gyűjtőlencsék kombinációja

MIKROSZKÓP

F1 F2 F2
2F1 I1

objektív I2 A keletkezett kép (I2):

okulár • látszólagos
• fordított állású
• nagyított (N1xN2)

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 A fluoreszcens mikroszkóp felépítése I.

okulár
emissziós szűrő

dikroikus tükör

fényforrás

gerjesztési szűrő
objektív

dikroikus tükör működésének sematikus ábrázolása minta

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
A fluoreszcens mikroszkóp felépítése II.
Tipikus filter elrendezés mikroszkópban:

kibocsátott fény

gerjesztő fény

minta
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
A fluoreszcens mikroszkóp felépítése III.
Optikai szűrők:

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 A fluoreszcens festékek spektrális tulajdonságai
Az AlexaFluor 647 gerjesztési (szaggatott vonal) és emissziós (telt függvény) spektruma

A látható fény hullámhossz tartománya

 Elvégzendő feladatok I.
Az okulárskála kalibrációja

1 OSE= ? μm
1 OSE= ? μm

10 µm 10 µm 10 µm

tárgymikrométer skála tárgymikrométer skála

tárgymikrométer skála okulárskála

okulárskála okulárskála

számolt tárgymikrométer egység x10 µm

1 OSE = = ? μm
számolt okulárskála egység

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 Elvégzendő feladatok II.
Kecskebéka vörösvértest-hosszú tengelyek meghatározása

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 Elvégzendő feladatok III.
A mikroszkóp feloldásának számítása

• A mikroszkóp feloldásának számítása:

λ
d = 0,61 ×
NA
d: feloldás (1/d=D a feloldóképesség)
𝛌 : legrövidebb detektálható emittált hullámhossz (a szűrőkészletek adatait tartalmazó táblázat alapján)
NA: az objektív numerikus apertúrája (leolvasható az objektívről)

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
 Elvégzendő feladatok IV.
A mikroszkópban rendelkezésre álló
szűrőkészletek vizsgálata

450-490 nm 515-560 nm

515 nm felett
átengedő

590 felett
átengedő

Excitációs szűrők transzmissziós átfedései a gyöngyök Emissziós szűrők transzmissziójának átfedése a gyöngyök
abszorpciós spektrumaival emissziós spektrumaival

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001