Professional Documents
Culture Documents
Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler
Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler
2016
1 2
Rekombinant DNA
Farklı organizmalardan elde edilen DNA parçalarının birleştirilmesi ile
oluşturulan DNA moleküllerine rekombinant DNA denir. Bedensel hücre çekirdeği aktarımı (nüklear
transfer): Moleküler klonlamadan farklıdır.
Rekombinant DNA teknolojisi
• Doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan genellikle farklı
Burada bedensel hücre çekirdeği, yumurta
biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin genetik çekirdeğine transfer edilir.
mühendisliği teknikleriyle kesilmesi ve birleştirilmesi işlemlerini
kapsayan bir teknolojidir. Moleküler klonlama (gen klonlaması) da
denir.
• Restriksiyon enzimleri, DNA ligaz, PCR in vitro Eğer DNA genomik kaynaklı ise, ilk olarak uygun büyüklükte
rekombinasyonda kullanılan önemli öğelerdir. parçalar karışımı elde etmek için restriksiyon enzimleri ile
kesilir.
5 6
1
6.4.2016
7 8
9 10
Diğer vektörler
Plazmitlerin klonlama vektörü olarak Faj λ
kullanılmalarının nedenleri: • Plazmit vektörlerden daha büyük fragmentleri
klonlamak için kullanılır.
3) Çoklu kopya halinde bulunmaları, hücrede birkaç Yapay maya kromozomlar (YAC)
kopya halinde bulunabilirler. • 200-3000kb’lık DNA’ları klonlamakta kullanılır
Bakteriyel yapay kromozomlarıı (BAC)
• Genom projelerinde kullanılır
4) antibiyotik direnç geni gibi seçilebilir işaretlerinin Ti Plazmiti (Agrobacterium tumefaciens’e ait
bulunması, plazmit içeren klonların plazmit) bitkilere gen transferinde kullanılır.
saptanmasını ve seçilmesini kolaylaştırır
11 12
2
6.4.2016
Bakteriyel transformasyon
3) Klonlanmış DNA’nın bir konak organizmaya transferi (transformasyon) bakterilerdeki transformasyon yöntemleri
• Test tüpü içinde içinde hazırlanmış rekombinant DNA bir konak organizmaya aktarılır ve orada • Konak hücre Ca2+ iyonları ile muamele edilerek yabacı DNA’yı (vektör)
replike olur. hücre içeni alma yeteneği kazanır.
Klonlama vektörleri için konakl mikroorganizmaların sahip olması gereken özellikler
• Elektroporasyon: Hücrede düşük akımda elektrik şoku uygulanır. Hücre
• Yüksek miktarlarda klonlanmış DNA elde etmek için ideal bir konak pahalı olmayan bir kültür zarında delikler oluşur ve yabancı DNA’yı içine alır.
ortamında hızlı bir şekilde büyüyebilmelidir.
• Patojenik olmamalıdır.
• Klonlama için en uygun konaklar, kolay çoğalabilen ve yapıları iyi bilinen mikroorganizmalardır.
13 14
15 16
17 18
3
6.4.2016
19 20
• Biyoteknolojinin ilk başarısı insülin hormonunun • İnsülinden başka diğer memeli proteinleri de genetik
üretilmesidir. mühendisliği yöntemleriyle üretilmektedir. Bunlar
arasında özellikle kan pıhtılaşma mekanizması ve diğer kan
• Geçmişte ticari olarak sığır veya domuz pankreasından işlemlerinde kullanılan çeşitli hormonlar ve proteinler
izole edilen insülinin kullanılmasıyla insan diyabeti bulunmaktadır.
tedavi ediliyordu.
Örneğin,
• Ancak, insana ait olmaya bu insülin yeteri kadar etkili • TPA (doku plazminojen aktivatörü) kan pıhtılarını çözen
olmamakta ve izolasyon yöntemi de karışık ve pahalıdır. protein ve kan pıhtılaşmasını sağlayan proteinler (kan
pıhtılaşma faktörleri), geçmişte toplanan kanlardan izole
• Günümüzde insan insülin geninin bakterilere ediliyordu. Artık rek DNA teknolojisi ile üretilmektedir.
klonlanmasıyla bu sorun çözülmüştür.
21 22
23 24
4
6.4.2016
25 26
27 28
29 30
5
6.4.2016
• Çeşitli uygulamalarda (kızartma gibi) istenen özelliklerden biri • Fotosentez için gerekli bir pigment olan β-karoten bitkinin sadece yeşil
dokusunda bulunur, bitkinin fotosentez yapmayan tohumlarında
oleik asit miktarının linoleik ve linolenik asitten fazla olmasıdır. bulunmaz
Soya fasulyesinin doymuş yağ asit içeriği azaltılıp, oleikasit
içeriği arttırılmış ve böylece soya yağına başka işlemlere gerek • Tohum hücrelerinin β-karoten üretebilmesi için pirinç bitkisinin
genomuna B- karoten sentezinde görev alan 3 gen aktarılmış ve pirinçte
kalmadan daha iyi kızartma stabilitesi kazandırılmıştır . β- karoten üretimi gerçekleştirilmiş.
31 32
• Böylece bu hastalıkların az gelişmiş ülkelerde yayılmasının • Ayrıca atıklar üzerinden değerlendirildiğinde atıkların biyobozunur
önlenmesi mümkün olabilecek hem de yüksek maliyetli geniş olması nedeniyle m.o’lar ekolojik açıdan da kimyasal yöntemlere
ölçekli aşı kampanyalarına gerek duyulmayacaktır. göre avantaj sağlamaktadır.
33 34
35 36
6
6.4.2016
• Rek DNA teknolojisi ile üretilen ilk enzim 1988’de onay alan kimozin
enzimidir.
• Bunun dışında gıda sanayinde fırıncılık ürünleri, alkollü
• Buzağı şirdeninden elde edilen bu enzimin bulunabilirliğinin zor ve içecekler, glikoz şurubu, ve diğer nişastalı ürünlerin üretiminde
maliyetinin yüksek olması nedeniyle günümüzde Rek DNA
teknolojisiyle bovin prokimozin geni aktarılmış m.o’lar tarafından kullanılan a-amilaz, katalaz, lipaz, proteaz, ksilanaz gibi çok
üretilmektedir. çeşitli enzimler rekombinant mikroorganizmlardan saf bir
şekilde elde üretilebilmektedir.
• Bu genin E.coli, Kluyveromyces marxianus gibi m.o’lara klonlanması
ve biyoreaktörde üretilmelerinin ardından salgıladıkları enzimin
ekstraksiyonu ve saflaştırılması sonucu kimozin elde edilmektedir.
37 38
• Laktik asit bakterilerinin genetik modifikasyonu ile farklı süt • Ekmek üretiminde kullanılan S. Cerevisiae’ da
ürünleri elde edilebilmekte, ürünlerin organoleptik
özelliklerinin yanında besin değerleri de arttırılabilmektedir. yapılan modifikasyonlarla maltaz ve maltoz
permeaz enzimleri üretimi gerçekleştirilerek
• Substratlardan yüksek oranda dönüşüm sağlanması, doğal nişasta kullanımı arttırılmış
inhibitör maddelerin (bakteriyosin) ve proteolitik enzimlerin
üretimi laktik asit bakterilerinin modifikasyonu ile
sağlanabilmektedir.
39 40
• Hayvanların üreme performanslarının arttırılması • İnsan sağlığına yönelik olarak antikorlar ve bazı proteinler de
hayvanlar vasıtasıyla üretilebilmektedir.
• Büyüme hızının arttırılması • Trangenik olarak yetiştirilen sığır, koyun ve keçilere önemli
proteinlerin genleri aktarılarak bunları sütlerinde fazla
• Hayvansal ürünlerin miktar ve kalitesinin arttırılması miktarda üretmeleri sağlanır
(sütün kazein, yağ, laktoz miktarlarının
modifikasyonu) • Balıklarda da büyüme hormonu geni aktarılarak hızlı büyüme
gösteren balıklar elde edilmiştir.
41 42