ELEKTROFOREZA

Osnovna načela

Elektroforeza je proces u kojemu otopljena tvar ili čestica efektivnog naboja Q

putuje u viskoznom puferu pod djelovanjem električnog polja prema jednoj od
elektroda ovisno o prirodi njenog naboja. Sila putovanja koja djeluje na česticu koja
putuje stalnom brzinom jednaka je otporu trenja, f, koji čestica mora svladati u
viskoznom puferu.
X.Q=f
gdje je X jakost električnog polja koja je jednaka omjeru između napona E (V) i
udaljenosti između elektroda d (cm), a Q je naboj čestice. U gelovima je otpor trenja
složena funkcija gustoće gela i veličine čestice.
Elektroforetska pokretljivost ovisna je o brojnim činiteljima kao što su:
 velična, oblik, koncentracija, električni naboj, stupanj hidracije i disocijacije
čestice
 viskoznost, pH, temperatura i ionska jakost pufera
 jakost električne struje i
 vrijeme putovanja
Odnos između elektroforetske pokretljivosti, brzine pokretljivosti, jakosti električnog
polja, pH i ionske jakosti pufera jednako se odnosi i na slobodnu elektroforezu u
viskoznom puferu i na zonsku elektroforezu.

Zonska elektroforeza
Zonska elektroforeza označava putovanje nabijenih čestica unutar granica čvrstog
elektroforetskog nosača, a naziv je dobila po tome što je svaka nabijena čestica nakon
odvajanja izolirana u pojedinačnu zonu na elektroforetskom nosaču. Na
elektroforetsku pokretljivost čestice i oštrinu odvajanja djeluju različiti činitelji,
ovisno i o vrsti elektroforetskog nosača. To su: adsorpcija, nehomogenost i kapacitet
elektroforetskog nosača, elektroendoosmoza, protok pufera mostićima i dr.
Zonska se elektroforeza provodi u elektroforetskoj kadi koja sadrži dva puferska
odjeljka spojena anodom i katodom. Kao izvor električne struje služi ispravljač niskog
ili visokog napona. Dodatni dio, kod visokonaponskih elektroforeza, je ploča koju je
moguće hladiti.
U zonskoj elektroforezi koriste se razni nosači kao što su filtar papir, acetat celuloza,
agar, agaroza, škrob i akrilamid. Filtar papir u elektroforezi služi jedino kao potporni
elektroforetski nosač koji ne prenosi toplinu i ima mali učinak na sam proces
odvajanja nabijenih čestica. Stoga se nabijene čestice u takvom elektroforetskom
nosaču odvajaju uglavnom prema gustoći naboja. Nasuprot tomu, agar, agaroza, škrob
i akrilamid se odlikuju velikom viskoznošću i velikim otporom trenja. Oni, osim što
spriječavaju prijenos topline i smanjuju difuziju, aktivno sudjeluju u postupku
odvajanja djelujući na elektroforetsku pokretljivost nabijenih čestica, što je ovisno o
njihovoj veličini. Rezultat ovog djelovanja je da se čestice u agaru, agarozi, škrobu i
akrilamidu odvajaju i prema gustoći naboja i prema veličini. Svojstvo
elektroforetskog nosača da razlikuje molekule prema njihovoj veličini pripisuje se
njegovom kapacitetu prosijavanja zbog čega je ovaj učinak dobio naziv “učinak
molekularnog prosijavanja”. On nije jednako izražen u svim vrstama elektrofretskih
nosača. Dok je neznatno izražen u agaru, u škrobu i akrilamidu ima glavnu ulogu.
Elektroforeza na acetat-celulozi
Odvajanje nabijenih čestica na acetat-celulozi također se osniva na razlici u gustoći
naboja. Acetat-celuloza je elektroforetski nosač glatke površine i jedinstvene
veličine pora pa adsorpcija, elektroendoosmoza i protok pufera mostićima
djeluju na odvajanje nabijenih čestica u znatno manjoj mjeri nego kod nosača
poput filter papira, pa je i razdvajanje bolje.
Acetat-celuloza nastaje obradom hidroksilnih skupina celuloze anhidridom octene
kiseline. Svojstva elektroforetskog nosača od acetat-celuloze ovisna su o
stupnju acetilacije, postupku predpranja prigodom same izrade, vrsti aditiva,
veličini pora i debljini nosača.
Acetat-celuloza kao nosač koristi se za elektroforetsko razdvajanje proteina u serumu,
mokraći, likvoru kao i za razdvajanje različitih varijanti hemoglobina.
Elektroforeza proteina u serumu ja dobar test pretraživanja, prvenstveno za otkrivanje
monokonskih proteina. Također je dobar pokazatelj funkcije jetre, bubrega i
imunološkog sustava.
Po završetku elektroforeze razdvojene proteinske frakcije se oboje, suvišak boje
ispere, trake učine prozinima i denzitometrijski odredi relativni brojčani udio
pojedinih proteinskih frakcija (slika 1.).

Slika 1.: Elektroforeza proteina u serumu na acetat-celulozi :

1. slika monoklonske gamapatije
2. i 4. slike poliklonske hipergamaglobulinemije
3. slika normogamaglobulinemije

Elektroforeza na akrilamidnom gelu (PAG, SDS-PAG)

Akrilamidni gel je sličan agaroznom gelu ali sadrži pore koje zbog svoje veličine
usporavaju elektroforetsku pokretljivost većih molekula. Zbog toga na odvajanje,
osim gustoće naboja, djeluje i učinak “molekularnog prosijavanja”. Obrada proteina s
natrij-dodecilsulfatom (SDS) uklanja učinak električnog naboja na elektroforetsku
pokretljivost. Kako se molekule bjelančevina i SDS vežu u stalnom težinskom
odnosu, naboj po jedinici mase je stalan i elektroforetska pokretljivost postaje
funkcija molekulske mase proteina.
Tehnika SDS-PAGE u kombinaciji s vrlo osjetljivom metodom bojenja proteina
srebrom omogućuje identifikaciju proteinskih frakcija u biološkim tekućinama s
niskim koncentracijama proteina (likvor, urin, suze), ali se isto tako može
koristiti u istraživačke svrhe (istraživanja proteinskog sastava homogenata tkiva
i stanica, medija staničnih kultura i td. (slika 2.).
Slika 2.: SDS elektroforeza proteina u mokraći uz bojenje srebrom

Izoelektrično fokusiranje
Izoelektrično fokusiranje (IEF) je elektroforetska tehnika u kojoj se odvajanje
proteina provodi na osnovi razlike u njihovim elektroforetskim točkama. Izoelektrična
točka proteina jednaka je pH vrijednosti otopine kod koje su proteini električki
neutralni. Ona je ovisna o sastavu proteina i prema tome je fizikalno-kemijska
konstanta za svaki protein. Kako je odnos aminokiselina i njihov broj različit za svaki
protein, raspon izoelektričnih točaka je vrlo širok.
Elektroforeza se provodi u gelu poliakrilamida u kojem je prethodno uspostavljen
postojan pH gradijent između dviju elektroda. Gradijent se uspostavlja pomoću
smjese nosećih amfolita (organske baze i kiseline) koji se rasporede u gelu prema
njihovim izoelektričnim točkama kad se gel podvrgne djelovanju električne struje
(prefokusiranje).
U fazi fokusiranja ispitivani proteini putuju prema anodi ili katodi, ovisno o njihovom
naboju odnosno prema zoni koja ima pH vrijednost jednaku njihovoj izoelektričnoj
točki. Kako su u toj točki proteini električki neutralni, oni gube elektroforetsku
pokretljivost i fokusiraju se u uskoj zoni. Izoelektrično fokusiranje je prema tome
ravnotežna tehnika u kojoj ne postoji učinak difuzije i stoga je izuzetno osjetljiva
tehnika.
Tehnika izoelektričnog fokusiranja koristi se u laboratorijskoj dijagnostici za
razdvajanje raznih varijanti hemoglobina, određivanje fenotipova α-1antitripsina,
razdvajanje oligoklonskih IgG i td.
Izoelektrično fokusiranje izvodi se na gotovim, komercijalnim PAG pločama
različitog pH raspona koji se postiže dodatkom raznih amfolina. Gel pričvršćen na
GelBond film pomoću par kapi vode prilijepi se na ploču s hlađenjem u kadi za
elektroforezu. Mostiće od debelog filtar papira uronjene u anodnu i katodnu otopinu
postavi se na rubove gela i spoje elektrode. Nakon prefokusiranja, nanesu se uzorci u
željeno područje pH. Po završetku izoelektričnog fokusiranja na gelu, fiksiranja
razdvojenih proteina izvodi se bojenje bilo srebrom bilo bojom kao što je Coomassie-
Blue (slika 3.)

Slika 3.: Izoelektrično fokusiranje seruma i likvora uz bojenje s Coomassie-Blue