Activitat 9: Tècniques immunològiques de tipus secundari

Tècniques d’aglutinació
Són proves que es realitzen per comprovar si hi ha aglutinació a la sang amb l’ajuda de la
reacció Antigen-Anticòs.
Tècniques d’aglutinació directe
Són tècniques que consisteixen en provocar aglutinació de partícules artificialment
recobertes amb antígens, a través de la reacció d’anticossos presents a la mostra.

o Prova ràpida d’aglutinació en placa

La prova ràpida d’aglutinació en placa serveix per a comprovar la presència
d’anticossos en la sang, per investigar problemes amb el SI i per detectar infeccions.
Utilitzem aquesta tècnica per identificar un microorganisme patogen i com l’individu
pot actuar en front d’aquest.
S’enfronten les partícules microbianes en suspensió amb el sèrum del pacient. Si el
sèrum del pacient posseeix anticossos per poder enfrontar al bacteri, es formen
agregats visibles al fons de la placa.

Fig. 1 Resultats d’una prova d’aglutinació en placa

o Hemaglutinació directe
És l’aglutinació dels hematies. Es tracta d’una resposta biològica en front a
determinats microorganismes.
• Antígens ABO
Utilitzarem aquesta tècnica per saber quins anticossos tenen les persones
implicades.
→ Funcionament: Agafar sèrum del pacient i afegir antígens. El sèrum del pacient
només ha de presentar anticossos per combatre els antígens que no estan presents.
Es separa el sèrum en diferents portaobjectes i s’afegeix una gota de cada antigen
per veure la reacció. Si es produeix una aglutinació, vol dir que el cos té anticossos
contra aquell antigen. (Martínez, 2015)
 Fig. 2 On veiem aglutinació hi ha presència d’anticòs.
Aquest pacient pertany al grup AB.
(Martínez D. M., 2015)

• Rh
Aquesta tècnica serveix per determinar el grup Rh. Es realitza per saber si es
posseeix el factor Rh en la superfície dels glòbuls vermells, i empra un mètode
similar al de la determinació del grup ABO.
Utilitzem aquesta tècnica quan una dona està embarassada, per saber si hi ha perill;
ja que si la mare és positiva i el nadó negatiu, o a la inversa, pot haver problemes
de compatibilitat i que els glòbuls vermells ataquin.
→ Funcionament: posar diferents gotes de sang en un portaobjectes i afegir una
gota d’anticòs D.
→ Resultats de la tècnica:
· Rh +: presència de proteïnes en la superfície cel·lular.
· Rh -: no presenta proteïnes en la superfície cel·lular. (Richard LoCicero, MD,
private practice specializing in hematology and medical oncology, Longstreet
Cancer Center, Gainesville, GA. Review provided by VeriMed Healthcare
Network. Also reviewed by David Zieve, MD, MHA, Medical Director, Brenda
Conaway, Edit, 2018)

Fig. 3 Pacient Rh-, perquè no hi ha aglutinació.

Tècniques d’aglutinació indirecte
Consisteix en provocar l'aglutinació de partícules artificialment recobertes amb antígens
(procés anomenat "sensibilització") mitjançant la reacció dels anticossos presents a la
mostra d'estudi (generalment sèrum sanguini) amb aquests antígens davant dels que són
específics. Per tant, es basa, com tota tècnica immunològica, en la demostració de la
reacció antigen-anticòs. Les cèl·lules marcadores actuen com a portadors passius dels
antígens o anticossos fixats.

o Aglutinació de làtex en placa

La prova d'aglutinació en làtex és un mètode de laboratori per examinar certs
anticossos o antígens en una varietat de fluids corporals com la saliva, l'orina, el líquid
cefalorraquidi o la sang.

→ La mostra s'envia a un laboratori on es barreja amb gotes de làtex cobertes amb un

anticòs o un antigen específic. Aquest mètode està dissenyat per a la detecció de
microalbuminúria. La determinació qualitativa i semiquantitativa d'albúmina per
aglutinació en làmina es basa en una reacció immunoquímica on les partícules de làtex
sensibilitzades amb anticossos anti-albúmina humana, reaccionen amb l'albúmina
present a la mostra, produint una aglutinació visible macroscòpicament.
Aquesta prova ve amb un KIT, on normalment hi ha la targeta d’aglutinació,
homogeneïtzadors i els reactius; a més a més, es necessita la mostra. En la targeta hi
ha diferent cercles: un pel control +, un pel control –, i un tercer per la mostra. En els
3 es posen els reactius, es barreja cada un d’ells amb un homogeneïtzador diferent i
s’observen els resultats.
Els resultats de l'aglutinació en làtex demoren aproximadament de 15 minuts a 1h. És
una de les tècniques d’aglutinació més utilitzades.

Aquesta prova és una manera ràpida de determinar l'absència o presència d'un antigen
o anticòs. El metge basarà qualsevol decisió respecte al tractament, almenys en part,
en els resultats d'aquesta prova.(Cristóbal González-Losada, 2018)

La prova més coneguda és la de la identificació de Streptococcus grups A, B, C, D, F

i G a través dels anticossos antiestreptolisina O; però també es poden fer per: Neisseria
meningitidis, Haemophilus influenzae,…
 Fig.4 Prova d’aglutincació del làtex en placa

→ Resultats: En aquesta imatge s’observa el següent: El reactiu consisteix en

partícules de làtex de poliestirè que s'han recobert amb anticossos monoclonals
específics de l'antigen del meningococ del grup B. Aquestes partícules de làtex
s'aglutinen si hi ha present suficient antigen homòleg. I en aquest cas, el pacient dóna
negatiu. (https://www.fishersci.es, 2019)
Els resultats poden realitzar-se sobre portaobjectes, tubs d’assaig o kits.

o Hemaglutinació indirecte (HAI)

Es una tècnica de diagnòstic clínic de laboratori in vitro que empra hematies o
eritròcits (d'origen humà o animal) com partícules marcadores. Aquest tipus
d'aglutinació es porta a terme utilitzant eritròcits recoberts d'antígens, o anticossos
acoblats de manera espontània (adsorció passiva) o mitjançant un acoblament químic,
utilitzant diverses substàncies per a aquesta finalitat, com Àcid tànnic Bencidina
bisdiazoada (BDB), Clorur cròmic (CrCIs), glutaraldehid, Clorur Cianúric, entre
d'altres. (Aguilar-García, 2014)
Hi ha una variant, anomenada hemaglutinació indirecta inversa, en què són els
anticossos els que es fixen a les partícules marcadores (els hematies), sent aquesta
vegada detectats els antígens solubles presents a la mostra.
Es diferencia fonamentalment de l'hemaglutinació directa (la qual és emprada, per
exemple, en la determinació de grups sanguinis), en què els hematies-marcadors han
estat sensibilitzats o units de forma artificial a l'antigen o anticòs.
És un prova altament sensible i específica. (Ronchi, 2015)

Fig. 5 Prova d’Hemaglutinació indirecte (HAI)

representada gràficament

Fig. 6 Explicació gràfica del funcionament de

la Hemaglutinació indirecte
 → Resultats: Es realitza la prova en plaques de poliestirè amb Ag solubles del paràsit
enganxats. Es col·loca sèrum de pacients que, si tenen Anticossos, s’uniran als Ag
enganxats, formant aglutinació els glòbuls vermells.
A continuació s’agrega un reactiu constituït per: Ac antiimmunoglobulines humanes
marcat amb un enzim (peroxidasa o fosfatasa alcalina) i, posteriorment s’afegeix un
substrat de l’enzim que, si en la fase sòlida es troba el doble complexe antigen -Ac del
pacient- Ac marcat, desenvoluparà un color la intensitat del qual és proporcional a la
concentració d’Anticossos del pacient i a l’afinitat d’aquests. (LAPIERRE, 2016)

o Inhibició de la hemaglutinació (IHA)

La inhibició de l'aglutinació dels eritròcits recoberts amb antigen per l'antigen
homòleg és un mètode sensible i específic per a la identificació de petites quantitats
d'antigen soluble a la sang o en altres líquids dels teixits. El principi d'aquesta anàlisi
és que, l'anticòs incubat prèviament amb antígens homòlegs solubles o de reacció
creuada, és «inactivada» quan s'incuba amb eritròcits recoberts d'antigen. Aquest
mètode d'inhibició de la hemaglutinació ha resultat molt útil per a la identificació de
HBsAg a la hepatitis i per a la identificació de l'antigen factor VIII a l'hemofília i
trastorns afins de la coagulació. (Aguilar-García, 2014)

Fig. 7 Prova de la Inhibció de la Hemaglutincació (IHA)

→ Resultats: Es fan servir plaques microliter de 96 pous (8 files i 12 columnes) en

què es poden analitzar 8 sèrums (un per cada fila) que es van diluint de forma seriada
al llarg de les 12 columnes. A cada pou s’han afegit les mateixes quantitats de PBS,
 antigen i glòbuls vermells. L'antigen utilitzat ha de tenir entre 4 o 8 unitats
d’hemoaglutinants (UHA). El títol del sèrum serà el de la dilució de l'últim pou en què
hi hagi una completa inhibició de la hemoaglutinació. (Joaquín Girón)

o Prova de Coombs
També coneguda com a prova de l’antiglobulina, és un examen de sang que es fa
servir en immunologia i hematologia. Aquesta anàlisi pot detectar la presència
d'anticossos en sèrum que reaccionen amb antígens en la superfície dels glòbuls
vermells.
Per tant, les proves de Coombs es fan per detectar certs anticossos que ataquen els
glòbuls vermells. Normalment, els anticossos s'adhereixen a substàncies estranyes,
com bacteris i virus, i fan que siguin destruïdes.

Les següents condicions provoquen que es formin anticossos:

- Reacció a una transfusió
- Sensibilització a l’antígen factor Rhesus
- Una anèmia hemolítica autoimmunitària (Healthwise, 2018)
Ambdues proves de Coombs (directe i indirecte) empren un antisèrum anomenat
reactiu de Coombs, que conté anticossos d'animals immunitzats dirigits contra IgG,
IgM, i/o complement humà.

Aquests anticossos s'uneixen als anticossos dels antígens que són a la superfície dels
glòbuls vermells, causant aglutinació de les cèl·lules. Aquesta aglutinació observada
correspon a un resultat positiu, i l'absència d'aglutinació és un resultat negatiu.
(Wikipedia, 2018)

• Prova de Coombs directe

Detecta anticossos ja units a la superfície dels glòbuls vermells. Aquesta prova es
fa servir per determinar si hi ha complement o anticossos ja fixats als eritròcits
presos directament del pacient.
 Fig. 8 Representació gràfica de la Prova de Coombs directa

→ Resultats: Aquestes cèl·lules, obtingudes d'una venopunció, es renten i s'agrega

el reactiu de Coombs. Els anticossos del reactiu s'uneixen a IgG, IgM, o
complement que està unit a la superfície dels glòbuls vermells. Aquests s'aglutinen,
produint grups de cèl·lules que indiquen un resultat positiu.

• Prova de Coombs indirecte

Detecta anticossos lliures que poden reaccionar in vitro amb glòbuls vermells que
tenen antígens específics.

Fig. 9 Representació gràfica de la Prova de Coombs indirecta

 → Resultats: Si es barreja sèrum pres d'un pacient que conté aquests anticossos
amb glòbuls vermells que sí que mostren aquests antígens específics, els glòbuls
vermells es cobriran amb anticòs. Un cop cobertes, les cèl·lules s’aglutinen després
d'una exposició al reactiu de Coombs.

En el diagnòstic d’eritroblastosis fetal, el sèrum pres de la mare Rh- no reacciona amb la seva
pròpia sang, sinó amb la del seu fetus Rh+. El sèrum de la mare, que conté anticossos específics
del factor Rh, es barreja amb glòbuls vermells Rh+. Els anticossos del sèrum s'uneixen a les
cèl·lules. Després, s'agreguen anticossos antihumans per aglutinar els glòbuls vermells.

Fig. 10 Representació gràfica de la Eritroblastosi Fetal (Ovalles, 2016)

Tècniques de precipitació
Tècniques de precipitació en medi líquid
Per a la realització d'aquestes tècniques es requereix que tant el Ac com el Ag es trobin
en un mitjà fluid en el qual sigui possible la precipitació del complex Ag-Ac. El
complex Ag-Ac precipita espontàniament o per centrifugació.
Precipitació màxima: quan la proporció d'Ags i Acs de la barreja és equivalent. Però va
disminuint a mesura que predomini el Ac o el Ag, precipita de manera diferent en funció
de les concentracions relatives d'un antigen i anticòs. Aquest tipus de reacció no és molt
utilitzat en requerir grans concentracions d'antigen i d'anticòs per poder mesurar el
precipitat que s'ha format.(Animal, 2010)

Fig. 11 Corba de precipitació obtinguda barrejant concentracions creixents

d’antigen amb una quantitat constant d’anticòs (roca, 2018)

o Turbidimetria
La turbidimetria mesura la reducció de la intensitat de la llum a través d’una suspensió,
a causa de las partícules presents en aquesta, y quantifica la llum residual transmesa.
(Perez, 2014)
S’utilitza per mostres que contenen grans concentracions de partícules dispersants, es
a dir, solucions concentrades (per a que hi hagi una bona disminució de la llum
transmesa). (Valle)
→ Aplicacions:
- En anàlisi de rutina en bacteriologia, pel control de creixement bacterià.
- En instruments automatitzats que mesuren la sensibilitat d’antibiòtics.
- En anàlisi bioquímic per:
● Determinació d’aminoàcids.
 ● Determinació de vitamines.
● Determinació de proteïnes totals en sèrum , LCR i orina (fent que les
proteïnes precipitin amb TCA o àcid sulfosalicílic).
● Per determinar la velocitat de sedimentació de partícules de diferents
tamanys.
● Per l’anàlisi d’enzims que actuen sobre determinats substrats (la
suspensió estable es mescla amb la mostra que conté l’enzim, per
exemple: sèrum, LC i orina; la turbidessa es relaciona amb la concentració
de l’enzim a la mostra.

La imatge següent explica com funciona aquesta tècnica:

Fig. 12 Funcionament de la tècnica immunoturbidimetria (Morales, 2015)

o Immunonefelometria
Es un procediment analític que es basa en la dispersió de la radiació que travessen les
partícules de la matèria. (Muhye) (IAC Internacional)
La nefelometria mesura la llum desviada en diversos angles (entre 15º y 90º) per les
partícules presents en aquesta suspensió. (camarillo, 2014)
S’utilitza en l'anàlisi de solucions mes diluïdes, quan la mostra conté petites
concentracions de partícules petites s’aplica aquesta tècnica.
La utilitzem per mesurar concentracions específiques de colònies de bactèries en algun
medi de cultiu, o de moltes proteïnes, utilitzant el principi de dispersió lluminosa
molecular. (Diana Carolina)
→ Aplicacions:
- Anàlisi de proteïnes
- Per la determinació de glucogen y globulines en sèrum o plasma sanguini
- Determinació de ribonucleasa, sulfats en orina
En hematologia:
- en analitzadors de coagulació
- en comptadors de cèl·lules sanguínies per distingir els diferents tipus de
cèl·lules en la sang
En immunoquímica:
- S’han fabricat kits per: IgA, IgG, IgM, complements: C3, C4, i factor
reumatoide, albúmina transferrina, ⲁ 1-Glicoproteïna àcida o
orosomucoide (diagnòstic de malalties reumàtiques, proteïna típica de
fase aguda. etc.
- Determinació d’alguns fàrmacs

Quin és el funcionament de la tècnica?

Fig. 13 Tècnica d’immunonefelometria

Fig. 14 Dispersió de la radiació que travessen

les partícules en la matèria amb un
fotodetector
Fig. 15 Esquema explicatiu de la mesura nefelomètrica amb el fotodetector amb un angle de 90º

Tècniques de precipitació en gel

Un dels primers descobriments en quant a la reacció antigen-anticòs, va ser la seva
capacitat per donar lloc a precipitats quan es combinen en proporcions iguals o
pròximes al punt d’equivalència.
Quan aquestes reaccions es duen a terme en gels d’agarosa és possible provar diversos
antígens en una sola mostra de sèrum.
Aquestes tècniques es basen en l’aparició d’un precipitat visible quan s’enfronten
antígens solubles amb els seus anticossos específics.

o Doble difusió o reacció de Ouchterlony

Per a que aquesta difusió es realitzi de manera satisfactòria ens hem de fixar molt bé
en: - la concentració del gel
- la concentració de reactants
- el tamany de les molècules Ag i Ac
La immunodifusió doble es basa en la difusió del Ag i el Ac en un medi semisòlid (gel
d'agar), formant bandes de precipitació on els reactants estan en proporcions
equivalents. Aquests complexos són insolubles i poden ser analitzats visualment.
La tècnica es basa en preparar un gel uniforme d'agar en una placa Petri o
portaobjectes. En l'agar es practiquen perforacions d'un diàmetre i esquema
prèviament establerts. Les solucions que conté l'antigen i l'anticòs es col·loquen en
perforacions adjacents i es deixa difondre fins formar línies o bandes de precipitació.
La intensitat, nitidesa i posició d'aquestes bandes és dependent de la concentració del
Ag i Ac.
La immunodifusió doble s'utilitza per a anàlisi d'antígens i anticossos. Permet
determinar la relació immunoquímica entre dos antígens a través de components
idèntics o de reactivitat creuada.
Es distingeixen tres patrons de reactivitat: reacció d'identitat, de no identitat i
d'identitat parcial o creuada. També pot utilitzar-se per determinar monoespecificitat
d'un antisèrum i per conèixer el títol dels anticossos.

Fig. 16 Immunodifusió doble. Reaccions de precipitació en agar que

il·lustren reaccions d'identitat, identitat parcial i no identitat

o Immunodifusió radial o tècnica de Mancini

És un mètode de quantificació d’antígens, útil en la immunologia clínica per a
quantificar diverses proteïnes plasmàtiques, com: Immunoglobulines, Igs, G, A,
M, Fraccions del complement C3 i C4 i Factors de coagulació.

La immunodifusió radial és una tècnica de precipitació en gel, en que l'agar s'ha

barrejat amb un antisèrum monoespecífic sobre un portaobjectes o placa de Petri.
Es fan perforacions cilíndriques que s'omplen amb volums fixos de solucions de
referència d'antigen per al qual el antisèrum és específic i amb solucions o mostres
problemes.
La difusió del Ag en l'agar permet la formació d'anells de precipitació; l'àrea és
proporcional a la concentració inicial de l'Ag. En el període de 16 a 48 hores de
difusió en càmera humida i temperatura constant, es llegeixen els diàmetres de
l'halus de precipitació.
 Es construeix un gràfic o s'obté l'equació de la recta amb les concentracions de
referències versus àrea o diàmetre de l'anell i s'interpola la lectura de la mostra
problema.
Aquest procediment ha estat àmpliament adaptat per a mesurar molts antígens, com
per exemple, immunoglobulines en diversos líquids biològics i la seva sensibilitat
pot arribar a 0,1 mg/ml i el seu coeficient de variació és menor al 20%.
Aquí podem veure una imatge que mostra el funcionament de la tècnica:

Fig. 17 Quantificació de IgG humana per Immunodifusió radial

Fig. 18 Corba de referència IgG (pous 1 al 4) i mostres de

sèrum de pacient (pous 5 al 8)

o Immunoelectroforesis
És un mètode combinat. Per una banda es duu a terme l’electroforesi de barreja
d’antígens d’acord amb la seva càrrega i, per l’altre costat, es realitza la difusió de
proteïnes separades, que reaccionen amb anticossos específics i precipiten.
Aquesta tècnica s’utilitza per:
- Diferenciar fraccions antigèniques específiques
- Determinar anticossos monoclonals clàssics en mielomes, limfomes, etc.
 En primer lloc es sembra l’antigen en un gel d’agarosa i buffer pH alcalí. Després
es duu a terme l’electroforesi de l’antigen i es pot observar la migració d’antígens
per càrrega. Quan ha corregut l’electroforesi es forma un canal i es sembra
l’anticòs. Això dóna com a resultat la difusió d’Ag i Ac i la formació de la banda
pp.

Fig. 19 Resultats de la tècnica d’Immunoelectroforesis

En aquesta fotografia podem observar els resultats d’aquesta tècnica on s’utilitza

l’electroforesi i immunoelectroforesi del sèrum d'un pacient (p) amb gammapatía
monoclonal IgG, sèrum control (c), sèrum anti-IgG (a), sèrum anti IgA humana (_),
sèrum anti-IgM humana (μ), sèrum anti-kappa lliure humana (g) i sèrum anti-
lambda lliure humana (h).

o Immunofixació
La immunodifusió és un procediment que utilitza, en una primera etapa,
l’electroforesi de proteïna en gel d’agarosa i després, la immunoprecipitació.
Sobre la placa d’agarosa en que s’ha separat les proteïnes per electroforesi
s’apliquen antisèrums monoespecífics i la presència de l’antigen complementari
forma complexos antigen-anticòs que precipiten. La formació d’un precipitat
estable Ag-Ac fixa la proteïna en el gel.

S’utilitza essencialment en la caracterització d’immunoglobulines monoclonals.

La immunofixació i la immunoelectroforesi són tècniques complementàries en la
identificació d’una gammapatia monoclonal.
La immunofixació hauria de ser utilitzada en front proteïnes anòmales que són
difícils de caracteritzar per immunoelectroforesis.
 Fig. 20 Electroforesi i immunofixació del sèrum
d’un pacient amb gammapatía monoclonal IgG

En els pous hi trobem:

- Sèrum antiIgG humana - Sèrum anti-kappa lliure humana
- Sèrum anti-IgA humana - Sèrum anti-lambda lliure humana
- Sèrum anti-IgM humana

o Contraimmunoelectroforesis
La contraimmunoelectroforesi es realitza en gel agar, on el pH del tampó
d'electroforesi permet que l’anticòs es carregui positivament i l'antigen
negativament. La sensibilitat del mètode és aproximadament 20 vegades més gran
que la doble difusió.
Actualment l'ús més important és en el diagnòstic de malalties infeccioses, en el
que els antígens migren cap al pol positiu en l'agar.

Fig. 21 Contraimmunoelectroforesi per a la determinació d'antigen

de superfície del virus de l'hepatitis B

Pous a: Sèrums de conill anti-antigen de superfície del virus de l'hepatitis B.

Pous b: Sèrums humans + i - a antigen de superfície del virus de l'hepatitis B.
o Electroimmunodifusió
Aquesta tècnica es fonamenta en la separació de proteïnes per electroforesi i quan
les proteïnes estan separades se’ls hi afegeix un sèrum d’anticossos. Així es formen
els precipitats amb els que s’identifiquen les immunoglobulines.
Normalment s’utilitza un gel d’agarosa a l’1% amb un gruix proper al mil·límetre
i un pH que ronda el 8,6.

Fig. 22 Resultats d’una tècnica d’Electroimmunodifusió

Resultats:
✓ IgG alta → Associat a malalties hepàtiques cròniques i melanomes
✓ IgG baixa → Associat a cèl·lules malignes
✓ IgA alta → Associat a infeccions, malalties hepàtiques i melanomes
✓ IgA baixa → Indueix a una pèrdua de proteïnes
✓ IgM alta → Associat a hepatitis i melanomes
✓ IgM baixa → Deficiència d’anticossos
Tècniques de fixació del complement
Serveix per detectar anticossos en el sèrum, quan no es poden detectar amb altres tècniques per
que no mostren reaccions visibles.
Aquesta tècnica es realitza quan un antigen es posa en contacte amb un anticòs específic davant
un complement.
Normalment per al diagnòstic serològic de Brucelosis, Histoplasmosis i Coccidiomicosis.

És una prova molt complexa, on es destaquen els següents factors:

▪ S’ha de destruir la hemolisina escalfant la mostra a 56º
▪ Afegir la quantitat exacta del complement, per evitar falsos negatius.
▪ Afegir la quantitat adequada dels antígens, si n’hi ha una quantitat baixa pot donar
falsos negatius.

El sistema del complement

El sistema del complement és un mecanisme de defensa on la seva funció principal és
eliminar agents patògens de la circulació.
Té tres vies d’activació: clàssica, alternativa i lectines. Aquest sistema destaca per la
importància d’absència d’anomalies en algun component que poden causar patologies
greus o fins i tot, letals.

Utilitzem aquesta tècnica quan el complex Ag-Ac es fixa a una globulina del sistema.
A partir d’això comença l’activació en cascada de les proteïnes del complement, que
produeixen la formació de proteases per produir porus i així eliminar els
microorganismes.

→ Aplicacions:
- Opsonització de patògens per facilitar la fagocitosi
- Neutralització de virus
- Iniciar respostes inflamatòries
- Facilitar el reclutament de cèl·lules immunitàries
- Lisar agents patògens i cèl·lules infectades amb la formació de porus a les
membranes
Fig. 23 Esquema del Sistema del Complement, a partir de les tres vies d’activació: alternativa, clàssica i
lectina

Reacció de fixació del complement

Aquesta tècnica serveix per facilitar la capacitat del complement per unir-se als
complexes antígens-anticòs.

És el mètode d’elecció per realitzar el diagnòstic indirecte de malalties infeccioses

importants en medicina veterinària: brucel·losi, paratuberculosi, etc. degut a la seva alta
sensibilitat i precisió.

La tècnica consta de dues fases: la primera fase és una reacció Ag-Ac en un medi líquid;
i la segona és a partir de l’addició de complement. Quan es produeix la reacció Ag-Ac,
és per que el sèrum analitzat contenia anticossos davant antígens, llavors el complement
queda fixat i no pot activar la hemòlisis dels glòbuls vermells.

Fig. 24 Procediment que segueixen els complexes Ag-Ac durant la tècnica de fixació del complement
A part heu de triar una tècnica (aglutinació, precipitació i fixació) i escriure un protocol
de d’aquesta.

PROTOCOL Tècnica de Coombs:

➢ COOMBS INDIRECTE:
1) Extracció de sang al pacient (2ml). Posar-la a un tub amb el seu etiquetatge i
deixar coagular per obtenir el sèrum.
2) Per altra banda, obtenir sang “0” Rh+, i ficar-la a un tub amb anticoagulant.
3) Preparar una suspensió al 2% en solució salina isotònica d’eritròcits prèviament
rentats amb solució salina.
4) En un tub de 12x75 col·locar 2 gotes del sèrum del pacient i 2 gotes de la
suspensió d’eritròcits i barrejar.
5) Incubar aquesta mescla entre 30-120min. en bany termostàtica a 37º. (Observar
si n’hi ha presencia d’aglutinació)
6) Si no n’hi ha presencia d’aglutinació, rentar 3 cops els glòbuls vermells amb
solució isotònica i decantar tot el sobrenedant.
7) Afegir 2 gotes de solució salina i 2 gotes de sèrum antihumà i barrejar.
8) Deixar reposar durant 5min. a Tª ambient, centrifugar durant 1min. a 1500 rpm o
15seg. a 3400 rpm. Observar si n’hi ha presència d’aglutinació macro o
microscòpicament.
9) Afegir una gota de cèl·lules de reactiu de Coombs i barrejar.

➢ COOMBS DIRECTE:
1) Obtenció de sang del pacient amb anèmia hemolítica.
2) Prendre 4 gotes de la mostra i realitzar 3 rentats amb solució salina.
3) Després dels 3 rentats, fer una suspensió al 5% (1 gota del rentat i 19 de solució
salina)
4) Agafar una gota de suspensió al 5% i col·locar-lo en un altre tub.
5) A aquest últim tub, afegir 2 gotes de reactiu de Coombs (color verd).
6) Centrifugar 1min. a 2500-3000 rpm.
7) Després de centrifugar, observar el botó al fons del tub i amb lleugers moviments
desprendre el botó i homogeneïtzar en busca d’aglutinació.
8) Si n’hi ha presència d’aglutinació, la prova és positiva.
Bibliografia MENDELEY:

(s.f.). Obtenido de http://hemaisabel.blogspot.com/2015/03/practicadeterminacion-serica-

del-grupo.html
Aguilar-García, V. (3 de noviembre de 2014). medigraphic. Obtenido de
http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043p.pdf
Animal, D. S. (2010). Obtenido de
http://webs.ucm.es/info/saniani/troncales/inmunologia/documentostemas/Tema%201
3.pdf
camarillo, E. s. (22 de octubre de 2014). blogspot. Obtenido de
http://quimicabasica2014.blogspot.com/2014/10/nefelometria-y-turbidimetria.html .
Cristóbal González-Losada, *. M.-G.-C. (Julio de 2018). SciELO. Obtenido de SciELO:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-028X2018000200005
Diana Carolina, M. C. (s.f.). Prezi. Obtenido de Prezi:
https://prezi.com/v1fsfwc3a8b7/turbidimetria-nefelometria/
Healthwise, E. p. (25 de junio de 2018). NorthShore. Obtenido de NorthShore:
https://www.northshore.org/healthresources/encyclopedia/encyclopedia.aspx?Docum
entHwid=hw44015&Lang=es-us
https://www.fishersci.es. (2019). Obtenido de https://www.fishersci.es:
https://www.fishersci.es/shop/products/remel-wellcogen-test-neisseria-meningitidis-b-
e-coli-kl/11474089
IAC Internacional. (s.f.). Obtenido de http://mat12.com/iac/productos/turbopro/fundamentos-
del-metodo/
Joaquín Girón, M. A. (s.f.). Obtenido de http://www.wpsa-
aeca.es/aeca_imgs_docs/_uso_practico_e_interpretacion_de_serologia_en_campo_
-_giron,_j.pdf
LAPIERRE, D. A. (2016). SlidePlayer. Obtenido de SlidePlayer:
https://slideplayer.es/slide/5427286/
Martínez, A. I. (20 de marzo de 2015). http://hemaisabel.blogspot.com. Obtenido de
http://hemaisabel.blogspot.com:
http:/hemaisabel.blogspot.com/2015/03/practicadeterminacion-serica-del-grupo.html
Martínez, D. M. (27 de abril de 2015).
http://deliamm96cuadernopracticashema14.blogspot.com/. Obtenido de
http://deliamm96cuadernopracticashema14.blogspot.com/:
http://deliamm96cuadernopracticashema14.blogspot.com/2015/05/practica-
determinacion-serica-del-grupo.html
Morales, S. R. (12 de octubre de 2015). Prezi. Obtenido de Prezi:
https://prezi.com/xgvavlqdurhg/nefelometria-y-turbidimetria/
Muhye, A. (s.f.). lifeder.com. Obtenido de
https://www.lifeder.com/nefelometria/#Aplicaciones
Ovalles, Y. (2016). SlidePlayer. Obtenido de SlidePlayer:
https://slideplayer.es/slide/4249572/
Perez, L. U. (19 de octubre de 2014). blogspot. Obtenido de
http://lauraucros.blogspot.com/2014/10/turbidimetria.html
Richard LoCicero, MD, private practice specializing in hematology and medical oncology,
Longstreet Cancer Center, Gainesville, GA. Review provided by VeriMed Healthcare
Network. Also reviewed by David Zieve, MD, MHA, Medical Director, Brenda
 Conaway, Edit. (19 de enero de 2018). MedlinePlus. Obtenido de MedlinePlus:
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003345.htm
roca, a. a. (21 de Noviembre de 2018). Prezi. Obtenido de Prezi:
https://prezi.com/p/zjum_92v9mz0/immunoturbidimetria/
Ronchi, G. D. (2015). SlidePlayer. Obtenido de SlidePlayer:
https://slideplayer.es/slide/158205/release/release/woothee
Valle, D. D. (s.f.). scribd.com. Obtenido de scribd.com:
https://es.scribd.com/document/140531118/Tecnicas-de-Precipitacion
Wikipedia. (2 de abril de 2018). Obtenido de Wikipedia:
https://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_de_Coombs#Prueba_de_Coombs_directa