Đánh Giá Quy Trình Chiết Và Làm Sạch Tinh Dầu Từ Hạt Gấc Bằng Phương Pháp Phổ UV Và Sắc Kí Lỏng Hiệu Năng Cao HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

----------------------
KIỀU THỊ LAN
ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH TINH

DẦU TỪ HẠT GẤC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV VÀ
SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Hóa học phân tích

----------------------
Hà Nội – 2018
----------------------
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH TINH
DẦU TỪ HẠT GẤC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV VÀ
SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC
Sinh viên thực hiện: Kiều Thị Lan

Ngành học: Hóa học phân tích
Cán bộ hướng dẫn: ThS. Vũ Thị Kim Thoa
Hà Nội – 2018
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Vũ Thị Kim Thoa, người đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận của mình.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Hóa Học của
trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ về mọi cơ sở vật chất và
chỉ bảo em trong quá trình tiến hành thí nghiệm.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn những đóng góp ý kiến của các bạn
sinh viên lớp K40C – Sư phạm Hóa học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã giúp
đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình và sự
động viên, khích lệ của bạn bè, người thân đặc biệt là gia đình đã tạo niềm tin giúp
em phấn đấu học tập và hoàn thành khóa luận này.
Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã cố gắng hết sức
nhưng chắc chắc không thể tránh khỏi thiếu sót.Vì vậy em kính mong nhận được ý
kiến đóng góp, chỉ bảo của quý thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Kiều Thị Lan
Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới
sự hướng dẫn khoa học của ThS. Vũ Thị Kim Thoa.Các kết quả và số liệu trong
khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên
Kiều Thị Lan

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC ....................................................................................... 3
1.1.1.Đặc điểm thực vật học .............................................................................................. 3
1.1.1.1. Khái quát ................................................................................................................ 3
1.1.1.2. Mô tả thực vật ........................................................................................................ 3
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái ................................................................................................. 4
1.1.2. Thành phần hóa học của quả gấc.......................................................................... 5
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DẦU THỰC VẬT ............................. 5
1.2.1. Chọn dung môi chiết. ............................................................................................ 5
1.2.2. Quá trình chiết ......................................................................................................... 8
1.2.3. Phương pháp chiết................................................................................................... 8
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN ........................................ 10
1.3.1. Định nghĩa về chiết pha rắn. ................................................................................ 10
1.3.2. Các cơ chế chiết pha rắn. ..................................................................................... 10
1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ................................................... 11
1.4.1. Khái niệm. ...................................................................................................... 12
1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc kí ................................................................... 12
1.4.3. Phân loại sắc kí hấp phụ ...................................................................................... 13
1.4.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc kí đồ. .............................................................. 14
1.4.5. Hệ thống HPLC ..................................................................................................... 17
1.4.5.1. Bình đựng dung môi ............................................................................................ 18
1.4.5.2. Bộ phận khử khí ................................................................................................... 18
1.4.5.3. Bơm cao áp. ......................................................................................................... 18
1.4.5.4. Bộ phận tiêm mẫu. .............................................................................................. 18
1.4.5.5. Cột sắc kí khí. ...................................................................................................... 18

1.4.5.6. Đầu dò. ................................................................................................................. 19

1.4.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu. ........................................................................................... 20
1.4.5.8. Thiết bị in dữ liệu. ............................................................................................... 20
1.4.6. Các bước tiến hành sắc kí. ............................................................................. 20
1.4.6.1. Chuẩn bị dụng cụ, máy móc. ............................................................................. 20
1.4.6.2. Chuẩn bị dung môi pha động. ........................................................................... 20
1.4.6.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC. .................................................................................... 21
1.4.6.4. Cách vận hành thiết bị. ....................................................................................... 21
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ....................................................... 22
2.1. Đánh giá qui trình chiết từ hạt gấc .......................................................................... 22
2.1.1. Phổ hấp thụ các chất chứa gốc với 3 nối liên hợp ............................................ 22
2.1.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang A của dầu hạt gấc với nồng độ của dầu gấc
(mg/ml). ............................................................................................................................... 22
2.1.3. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào các dung môi ........................................... 23
2.1.4. Chiết tinh dầu hạt gấc bằng các dung môi hữu cơ............................................ 24
2.2. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH LÀM SẠCH TINH DẦU GẤC ............................... 30
2.2.1. Nghiên cứu quá trình làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn .................. 31
2.2.1.1. Nghiên cứu quá trình hấp phụ của dầu trên cột chiết silicagel .................... 31
2.2.1.2. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ của dầu .................................................... 33
2.3. ĐÁNH GIÁ THÀNH PHẦN TRIGLIXERIT TRONG DẦU HẠT GẤC ................ 40
2.3.1. Định tính các triglixerit trong dầu hạt gấc ........................................................ 40
2.3.2. Định lượng các triglixerit trong dầu hạt gấc ..................................................... 44
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 49

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu Tên Tiếng Anh Tiếng Việt
SPE Solid – Phase Extraction Chiết pha rắn
 Wavelength Bước sóng
UV-VIS Ultraviolet-Visible Phổ tử ngoại khả kiến
High Performance Liquid Phương pháp sắc kí lỏng hiệu

HPLC
Chromatography năng cao
Reverse Phase
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu
RP-HPLC High Performance Liquid
năng cao pha đảo
Chromatography
Normal Phase
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu
NP-HPLC High Performance Liquid
năng cao pha thường
Chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các thành phần trong màng tươi của quả Gấc chín. ...................................5
Bảng 1.2. Dung môi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ dược
liệu (Houghton và Raman, 1998) .................................................................7
Bảng 2.1. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc (tại = 270nm) .....22
Bảng 2.2. Kết quả xác định khối lượng dầu hạt gấc qua mỗi lần chiết bằng dung môi
n-hexan với thể tích dung môi mỗi lần chiết là 10ml. ...............................25
Bảng 2.3. Kết quả xác định khối lượng dầu hạt gấc qua mối lần chiết bằng dung môi
n-hexan với thể tích dung môi mỗi lần chiết là 20ml. ...............................25
Bảng 2.4. Kết quả xác định tổng % chiết qua mỗi lần chiết bằng dung môi aceton 28
Bảng 2.5. Kết quả xác định 1 số đại lượng trong quá trình chiết dầu hạt gấc ..........30
Bảng 2.6. Kết quả khảo sát quá trình hấp thụ dầu hạt gấc trên cột DIAPAK C. ......32
Bảng 2.7. Phần trăm giải hấp chất phân tích bằng các hệ dung môi khác nhau .......34
Bảng 2.8. Kết quả rửa giải dầu bằng phương pháp chiết pha rắn .............................34
Bảng 2.9. Các thông số trong sắc kí đồ khi phân tích dầu hạt gấc bằng RP-HPLC .41
Bảng 2.10. Kết quả xác định thành phần của các triglixerit chính trong dầu hạt gấc ......46
Bảng 2.11. Kết quả xác định hàm lượng dầu và thành phần của các axit béo có trong
dầu hạt gấc. ................................................................................................47

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1.a.b: Gấc nếp ..................................................................................................3
Hình 1.2. Hoa và quả gấc ............................................................................................4
Hình 1.3. Màng gấc .....................................................................................................4
Hình 1.4. Hạt gấc ........................................................................................................4
Hình 1.5. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải ....................................13
Hình 1.6. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B ...............................13
Hình 1.7. Sắc kí đồ của chất A và chất B..................................................................14
Hình 1.8. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B 15
Hình 1.9. Cách tính hệ số khôngđối xứng của peak .................................................16
Hình 2.1. Sơ đồ bước chuyển năng lượng của dao động electron (A) và phổ hấp thụ
phân tử của hợp chất chứa ba nối đôi liên hợp (B). .................................22
Hình 2.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc (trong dm n-
hexan) ......................................................................................................23
Hình 2.3. Phổ hấp thụ phân tử eclectron của dầu hạt gấc trong các dung môi khác
nhau. 1-trong dung môi n-hexan, 2- trong dung môi CH2Cl2. ................24
Hình 2.4. Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi hexan (thể tích dung môi của
mỗilần chiết 10 ml) ..................................................................................26
mỗi lần chiết 20 ml) .................................................................................26
Hình 2.6. Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi diclometan ............................27
Hình 2.7. Dung dịch dầu gấc trong dung môi diclometan trong 6 lần chiết (thể tích
mỗi lần 10ml) ...........................................................................................28
Hình 2.9. Mô hình phân tử triglixerit và phospholipid có tròng dầu hạt thực vật ....31
Hình 2.10. Quá trình hấp thu dầu trên cột chiết pha rắn DIAPAK C. ......................32
Hình 2.11. Quá trình rửa giải cột chiết bằng các hệ dung môi khác nhau ................33
Hình 2.12. Quá trính chiết là làm sạch dầu hạt gấc ..................................................35

Hình 2.13. Sắc kí đồ của các phân đoạn dầu gấc thu được trong quá trình rửa giải
bằng hệ n-hexan và diclometan (1:1, v/v). A- dầu hạt gấc trước khi được
làm sạch, 1-8: các phân đoạn dầu thu được sau 1-8 ml rửa giải. ............36
bằng diclometan. A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân
đoạn dầu thu được sau 1-4 ml rửa giải. ...................................................36
Hình 2.15.Sắc kí đồ của các phân đoạn dầu gấc thu được trong quá trình rửa giải
bằng aceton A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân đoạn
dầu thu được sau 1-4 ml rửa giải .............................................................37
Hình 2.16. Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel ..............38
Hình 2.17. Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel theo thời
gian. .........................................................................................................39
Hình 2.18. Sắc ký đồ của dầu hạt gấc (A) trên nền dầu chuẩn momordica charantia
(B) ............................................................................................................41
Hình 2.19. Ba dạng cấu hình của các acid liên hợp octadecatrienoic có trong thiên
nhiên và dạng phổ hấp thụ phân tử của chúng ........................................43
Hình 2.20. Phổ hấp thụ electron trong dung môi 40% isopropanol và 60%
acetonitrin được đo trong cuvet của đầu dò diot quang (DAD). .............44
Hình 2.21. Các mẫu gấc được thu hái từ các tỉnh khác nhau. ...................................45
Hình 2.22. Kết quả tách triglixerit có trong dầu hạt gấc. ..........................................46

MỞ ĐẦU
Ngày nay cùng với sự phát triển khoa học, nhiều loại bệnh đã được phát hiện
và bước đầu nghiên cứu về phương pháp điều trị.Để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức
khoẻ người bệnh, các nhà khoa học đã nghiên cứu và chế tạo nhiều loại thuốc đặc
trị. Tuy nhiên, sau một thời gian sử dụng thì một số loại thuốc gây ra các tác dụng
phụ làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người bệnh chính vì vậy các nhà khoa học
quay trở lại với thiên nhiên, nghiên cứu thành phần hóa học, dược tính của các chất
có trong các loài thực vật với mong muốn sẽ tìm ra được phương thuốc mới an toàn
hơn cho sức khỏe con người. Việt Nam là đất nước nhiệt đới gió mùa với khí hậu
nóng ẩm, cây cối phát triển thuận lợi, rất phong phú và đa dạng.Vì vậy, việc nghiên
cứu, phân tích, giải mã các thành phần hóa học của thảo dược ngày càng phát triển.
Gấc là một cây thực phẩm đặc biệt ở Việt Nam, có danh pháp khoa học là
momordica cochinchinensis, thuộc chi mướp đắng.Ở Việt Nam có khoảng 3 loài
thường gọi là gấc nếp, gấc tẻ và gấc lai.Trái gấc được sử dụng trong ẩm thực, chăm
sóc sắc đẹp và y học.Gấc là loại thực phẩm đã được sử dụng lâu đời ở nước ta,
nhưng việc nghiên cứu cây này thì mới chỉ được nghiên cứu trong những năm gần
đây. Năm 1988-1989, TS. Phan Quốc Kinh và các cộng sự đã nghiên cứu các chế
phẩm từ quả gấc để làm các chất bổ sung chất dinh dưỡng. Từ năm 1941, bộ môn
dược liệu Đại học Dược Hà Nội đã bước đầu xác định màng đỏ bao quanh hạt gấc
có tác dụng giống như vitamin A và có tác dụng tăng trọng cho động vật và con
người. Ngoài -caroten thì phần màng đỏ của gấc còn chứa lycopene một chất
chống lão hóa mạnh nhất hiện nay.Ngành dược Việt Nam đã sản xuất một số chế
phẩm có chứa dầu màng gấc làm thuốc bổ, điều trị suy dinh dưỡng cho trẻ em và
một số bệnh về mắt.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong dầu hạt gấc có chứa một lượng
lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học. Trong đó phải kể đến đầu tiên là hàm lượng
triglixerit với gốc axit béo không no chứa 3 nối đôi liên hợp α - eleostearic, một loại
axit béo với khả năng chống oxi hóa cao đã và đang được sử dụng để chế xuất thuốc
Kiều Thị Lan 1 K40C – Sư phạm Hóa học

chống ung thư, chống giảm béo (CLA). Ngoài ra trong hạt gấc còn có một số các
hợp chất giá trị khác như saponin, ankaloit,…Tuy nhiên hiện nay ứng dụng của gấc
ở nước ta mới chỉ dùng lại ở việc sử dụng cơm gấc và màng đỏ bao quanh hạt gấc là
chủ yếu.Việc nghiên cứu để chiết xuất các hợp chất có giá trị trong hạt gấc hầu như
chưa được đề cập và chưa đưa vào sản xuất.Chính vì vậy, việc nghiên cứu để chiết
và làm sạch tinh dầu từ hạt gấc là nhu cầu cấp bách để tiến tới có thể tạo ra những
sản phẩm thương mại có giá trị từ hạt gấc.
Chính vì vậy, em chọn đề tài: “Đánh giá quy trình chiết và làm sạch tinh dầu
từ hạt gấc bằng phương pháp phổ UV và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC ” với mục
tiêu nghiên cứu như sau:
- Tìm ra quy trình chiết thành phần glixerit từ hạt gấc.
- Tìm ra quy trình tinh chế và làm sạch dầu gấc chiết được.
- Sử dụng phương pháp trắc quang UV-VIS và phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao để đánh giá hiệu quả chiết và làm sạch tinh dầu gấc đồng thời phân tích
thành phần glixerit của nó.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC
1.1.1. Đặc điểm thực vật học
1.1.1.1. Khái quát
Tên khoa học: Momordica Cochinchinensis
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliosida
Bộ: Cucubitales
Họ: Bầu bí Cucurbitaceae
Chi: Momordica
Loài: M. cochinchinensis
Tên nước ngoài: Muricic (Pháp), Cochinchina Momordica (Anh).
Tên Việt Nam: gấc (Kinh), mộc miết tử, má kưâru (Thái), mác khẩu (Tày).
Ở Việt Nam có khoảng 3 loài thường gọi là gấc nếp, gấc tẻ và gấc lai.
Hình 1.1.a.b: Gấc nếp
1.1.1.2. Mô tả thực vật

Cây gấc thuộc họ bầu bí, là cây dây leo, đa niên, đơn tính khác gốc, có
cây mang hoa đực, cây mang hoa cái. Đây là cây sống nhiều năm, mỗi năm lụi một
lần nhưng lại đâm chồi từ gốc cũ lên vào mùa xuân năm sau.
Lá mọc so le, có 3-5 thuỳ màu lục sẫm, gốc hình tim, lúc đầu có lông ở mặt
trên, sau nhẵn; gân hình chân vịt; cuống lá dài 2-3 cm.

Hoa nở vào tháng 4 đến tháng 5, hoa đực và hoa cái riêng trên cùng một
cây; hoa đực mọc ở kẽ lá; tràng 5 cánh, màu trắng hoặc ngà vàng, hình trứng
thuôn, có lông dày ở mặt trong; hoa cái có lá bắc nhỏ, bầu xù xì.
Quả to hình bầu dục dài từ 15 - 20cm, đuôi nhọn có nhiều gai mềm đỏ
đẹp. Quả non màu xanh, quả chín màu đỏ tươi. Bổ đôi theo chiều ngang thấy
có 6 hàng hạt xếp đều nhau, mỗi hàng có từ 6 đến 10 hạt. Quanh hạt có nhiều
màng màu đỏ tươi. Người ta còn dựa vào độ sai của quả (nhiều hay ít), kích
thước của quả (to hay nhỏ), gai quả (dày hay thưa), màu sắc của ruột quả (đỏ
hay vàng gạch), dầu (ít hay nhiều), số lượng hạt (nhiều hay ít) để phân loại:
gấc tẻ, gấc nếp hay gấc lai.
Hạt gấc có màng đỏ bao quanh lớp vỏ cứng đen, quanh mép có răng
cưa tù và rộng, hạt dày 25 - 35mm, rộng 19 - 31mm trông gần giống con ba
ba nhỏ bằng gỗ trong hạt có nhân chứa dầu.
Hình 1.2: Hoa và quả gấc Hình 1.3: Màng gấc
Hình 1.4: Hạt gấc

1.1.1.3. Phân bố, sinh thái
Chi Momordica L. có khoảng 45 loài trên thế giới, đa số là cây trồng, tập
trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi và châu Mỹ. Châu Á có 5-7 loài, trong đó
Việt Nam có 4 loài (M. Karaudren Aymonin, 1975 và Nguyễn Hữu Hiếu, 1994).
Gấc được trồng nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc, Philippin, Lào và Việt Nam.

Ở Việt Nam, gấc được trồng từ lâu đời trong nhân dân.Cây trồng có giống
quả chín màu đỏ và giống quả màu vàng. Giống quả vàng hiện thấy trồng ở một số
vùng núi thuộc tỉnh Lai Châu và Sơn La. Giống quả đỏ có 2 loại: quả to và quả
nhỏ, đều được trồng nhiều ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ.
1.1.2. Thành phần hóa học của quả gấc.

Bảng 1.1. Các thành phần trong màng tươi của quả Gấc chín.
Số thứ tự Thành phần Giá trị (%)
1 Nước 77
2 Protein 2,1
3 Lipide 7,9
4 Glucide 10,5
5 Xơ 1,8
6 Muối khoáng 0,7
7 β-caroten 0,046
8 Lycopene 0,038
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DẦU THỰC VẬT

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tùy thuộc vào thành phần hóa
học có trong mẫu (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung
bình,…) mà ta có thể chọn các dung môi hay hệ dung môi chiết khác nhau.
1.2.1. Chọn dung môi chiết.
Thông thường các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực
khác nhau nên đôi khi để tạo ra độ phân cực thích hợp người có thể sử dụng
một loại dung môi hoặc có thể phối hợp nhiều dung môi theo một tỉ lệ nhất
định để tạo ra hệ thống dung môi mới. Dung môi dùng cho quá trình chiết cần
phải được lựa chọn kỹ càng, cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải dễ thấm vào dược liệu, hòa tan được
những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, phải dễ dàng bay hơi khi cần

cô đặc dung dịch chiết và trơ về mặt hóa học (không phản ứng với những chất
nghiên cứu, không độc, không dễ bốc cháy). Những dung môi này cần phải
được làm sạch trước khi sử dụng, nếu chúng có lẫn những chất khác thì ảnh
hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết.
Methanol (CH 3 OH) và Chlorofom (CCl 3 ) thường chứa chất diotyl phtalat
[di-(2-etylhexyl)-phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat].Chất này sẽ làm sai lệch
kết quả phân tích trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, ngoài ra nó có thể
làm bẩn dung dịch chiết của mẫu vật.
Methanol (CH 3 OH) và Ethanol 80% (C 2 H5OH) là những dung môi phân
cực hơn các hidrocacbon thế đó, các dung môi thuốc nhóm rượu sẽ thấm tốt
hơn vào màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được
lượng lớn các thành phần trong tế bào. Dung môi cồn trong nước có những đặc
tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Người ta cũng thường ít sử dụng nước để thu
được dung dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của
methanol.
Ví dụ về lựa chọn dung môi trong chiết xuất được thể hiện ở bảng sau:

Độ phân cực Dung môi Phân nhóm hóa học chiết
Terpenoid, Flavonoid, Alcanoid,
Thấp Chlorofom
Aglycogen
Cyclohexan Sáp, chất béo
Hexan Sáp, chất béo
Terpenoid, Flavonoid, Alcanoid,
Dicloromethan
Aglycogen
Diethylether Alcanoid, Aglycogen
Ethylacetat Alcanoid, Aglycogen, Glycosid
Aceton Flavonoid, Alcanoid, Aglycogen
Tannin, Polyphenol, Terpenoid,
Ethanol Flavonoid, Serol, Alcanoid,
Polyacethylen
Trung bình
Saponin, Tanin, Phenol, Flavon,
Đường, Aminoacid,
Methanol Anthrocyanidin, Terpenoid,
Xanthoxyllin, Totarol, Lactone,
Polyphenol
Đường, Aminoacid, Saponin,

Nước Tanin, Lectin, Terpenoid,
Cao Anthrocyanin, Tinh bột, Polypeptid
Bảng 1.2: Dung môi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ
dược liệu (Houghton và Raman, 1998)
Người nghiên cứu cần có sự hiểu biết về thành phần hóa học cũng như đặc
tính của các chất có trong mẫu vật được từ đó có thể lựa chọn các dung môi thích
hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân hủy bởi dung môi và quá trình tạo thành
chất không mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất quay ở nhiệt độ không quá 30C - 40C với
một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.

1.2.2. Quá trình chiết

Quá trình chiết xuất diễn ra lần lượt như sau:
− Dung môi thâm nhập vào bên trong dược liệu.
− Dung môi hòa tan các chất bên trong dược liệu.
− Khuếch tán các chất tan trong dung môi (khuếch tán phân tử và khuếch tán
đối lưu) bao gồm:
+ Khuếch tán các chất tan từ trong dược liệu qua màng tế bào ra mặt
ngoài dược liệu (khuếch tán qua lỗ xốp và khuếch tán phân tử).
+ Khuếch tán các chất từ mặt ngoài dược liệu ra lớp dung môi xa hơn
(khuếch tán phân tử).
+ Khuếch tán các chất theo dòng chuyển động của dung môi (khuếch
tán đối lưu).
1.2.3. Phương pháp chiết
Phương pháp chiết xuất là yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của
quá trình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm các phương pháp
truyền thống và phương pháp hiện đại.
Phương pháp truyền thống sử dụng dung môi kết hợp với gia nhiệt và khuấy
trộn. Các phương pháp chiết xuất hay sử dụng như:
a) Phương pháp chiết lạnh.
− Phương pháp ngâm.
− Phương pháp ngấm kiệt.
b) Phương pháp chiết nóng
− Phương pháp sắc.
− Phương pháp hãm.
− Phương pháp hầm.
− Phương pháp lôi cuốn hơi nước.
− Phương pháp chiết Soxhlet.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi lẽ phương pháp này không đòi hỏi nhiều thời gian,

công sức và rất dễ thực hiện. Thiết bị sử dụng là một chiếc bình thủy tinh với một
khóa ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung
môi, có thể sử dụng dung môi nóng hoặc lạnh nhưng sẽ thu được hiểu quả cao hơn
nếu dùng dung môi nóng.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng nhiều như phương
pháp chiết liên tục bởi lẽ mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24h
rồi chất chiết được lấy ra. Quá trình chiết một mẫu được thực hiện qua 3 lần dung
môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá
trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ: Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và
sự xuất hiện của các cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
Các flavonoid là những hợp chất màu.Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà
không có màu đồng nghĩa với việc trong cặn chiết không còn flavonoid và quá trình
chiết sẽ kết thúc.
Các lacton của Sesquitecpen và các glicotid trợ tim, phản ứng kedde có thể
dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho
biết sự xuất hiện của các hydrocacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình
chiết sẽ kết thúc.Hay khi chiết các ankaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của các
hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:
Dragedroff và các tác nhân Maye.
Như vậy, tùy thuộc vào mục đích của người nghiên cứu là cần lấy chất gì từ đó
lựa chọn dung môi và các phương pháp chiết thích hợp nhằm đạt hiệu quả cao nhất.
Mặt khác, ta có thể dựa vào các mối quan hệ của dung môi và chất tan của
các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
Ngoài ra, hiện nay có nhiều kĩ thuật chiết hiện đại mới được áp dụng với
nhiều ưu việt trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên như:
− Chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (Chiết siêu âm – UAE).
− Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Chiết vi sóng – MAE).
− Chiết xuất lỏng siêu tới hạn (Chiết siêu tới hạn – SPE).
− Chiết xuất bằng dung môi dưới áp lực cao (Chiết dung môi nhanh – ASE).

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN

1.3.1. Định nghĩa về chiết pha rắn.
Chiết pha rắn (SPE) (Solid – Phase Extraction) là quá trình phân bố chất tan
giữa hai pha lỏng – rắn có thể là các hạt silicagel xốp, các polime hữu cơ hoặc các
loại nhựa trao đổi ion hay than hoạt tính. Quá trình chiết có thể thực hiện ở điều
kiện tĩnh hay động. Các chất bị giữ lại trên pha rắn có thể được tách ra bằng cách
rửa giải với dung môi thích hợp. Thông thường thể tích cần thiết để rửa giải hoàn
toàn chất phân tích luôn nhỏ hơn rất nhiều so với thể tích của dung dịch mẫu ban
đầu, vì thế có hệ số làm giàu cao.
1.3.2. Các cơ chế chiết pha rắn.
Về cơ bản, cơ chế chiết SPE giống với cơ chế tách trong phương pháp sắc kí
lỏng hiệu nâng cao (HPLC) gồm 3 cơ chế chính: cơ chế hấp phụ pha thường, cơ chế
hấp phụ pha đảo và cơ chế trao đổi ion. Tuy nhiên, SPE khác với HPLC là trong
HPLC có sự tách chất phân tích ra khỏi nhau trong hệ dòng chảy liên tục của pha
động, còn SPE giữ chất phân tích lại trên pha rắn sau đó rửa giải chất phân tích ra
khỏi pha rắn với dung môi thích hợp. Các chất phân tích sẽ được tách khỏi dung
dịch ban đầu với nồng độ đậm đặc hơn và tinh khiết hơn.
− Cơ chế hấp phụ pha thường (normal phase)
Là sự hấp thu các chất phân tích từ dung môi không phân cực lên bề mặt
phân cực của pha rắn. Cơ chế của quá trình tách dựa trên lực tương tác phân cực
như: các liên kết hydro, các tương tác phân cực π – π, tương tác lưỡng cực hay
tương tác lưỡng cực cảm ứng. Cơ chế này liên quan đến sự hấp thu các nhóm chức
của chất tan lên các vị trí phân cực của pha tĩnh để chống lại độ tan của các chất tan
trong pha động.
Trong SPE pha thường, thường sử dụng các loại pha tĩnh không liên kết như:
silica, alumina và magie silica, nhưng phổ biến nhất vẫn là silica.
Để rửa giải chất phân tích ra khỏi chất hấp thu, thường sử dụng dung môi phân
cực có khả năng phá vỡ các liên kết giữa chất phân tích với bề mặt chất hấp thu.

− Cơ chế hấp thụ pha đảo (reversed – phase)

Ngược với cơ chế hấp thụ pha thường, pha tĩnh ở đây là các chất không phân
cực còn pha động là pha không phân cực. Cơ chế là tương tác không phân cực còn
gọi là tương tác Van Der Vaals, hiệu ứng phân tán hay sự phân tách.
− Cơ chế trao đổi ion
Dựa vào sự trao đổi ion của chất tan (mang điện tích) trong các dung môi
phân cực hay không phân cực với chất hấp thu trao đổi ion. Cơ chế tương tác ion
này có nang lượng cao (80Kcal/mol). Vì vậy, các chất tan phân cực có thể hấp thu
hiệu quả từ dung môi phân cực cũng như tù dung môi không phân cực. Trong quá
trình hấp thu sẽ xuất hiện sự cạnh tranh để trao đổi ion. Quá trình này phụ thuộc vào
độ chọn lọc của ion hay số lượng ion cạnh tranh ở các vị trí này. Do vậy, chất chất
tích được làm giàu sẽ phải cạnh tranh với các ion khác trong dung dịch mẫu. Sự trao
đổi ion là quá trình thuận nghịch.
Các chất hấp thụ trao đổi thường có chứa các nhóm chức anion hoặc các
cation liên kết với silica.Các chất trao đổi cation mạnh có chứa nhóm chức axit
sulfonic và các chất trao đổi ion yếu thường là các nhóm axit cacboxylic. Đối với
các chất trao đổi anion mạnh là các nhóm chức chứa amin bậc 4, còn các chất trao
đổi anion yếu thường là bậc 1,2 và 3.
Pha tĩnh thường là silica liên kết với nhóm chức anion hay cation. Nếu là các
chất trao đổi cation mạnh thì dùng silica liên tiếp với nhóm sulfonic axit, còn là chất
trao đổi yếu thường là liên kết với nhóm – COOH.
Việc rửa giải các chất phân tích hấp thu trên pha tĩnh có thể tiến hành theo
nhiều cách: nếu là trao đổi cation có thể dùng H+ của axit mạnh hoặc dùng các
cation mạnh hơn, nếu là trao đổi anion thì dùng OH − hoặc các anion khác.
1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương pháp sắc
kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là
phương pháp sắc kí lỏng cao áp ( High Pressure Liquid Chromatography). Phương
pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp

sắc kí cột cổ điển.Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại
hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.Phương pháp
này được áp dụng rộng rãi trong các ngành kiểm nghiệm thuốc và nó hiện là công cụ
đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng.
1.4.1. Khái niệm.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoạc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được
biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc kí lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lí
do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay
hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp
chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực
thực phẩm, dược phẩm, môi trường,…
1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc kí
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc kí và
loại sắc kí. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ. Nếu pha tĩnh là
chất trao đổi ion thì ta có sắc kí trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc
kí phân bố hay sắc kí chiết. Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc kí gel hay sắc kí rây
phân tử. Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có
một pha động. Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân
tích A,B,C,… vào cột phân tích, kết quả là các chất A,B,C,… sẽ được tách ra khỏi
nhau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng hợp các
tương tác.

Chất phân tích A+B+C
F1 F3
F2
Pha tĩnh Pha động
Hình 1.5.Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột
nước trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại. Đối với mỗi
chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1,F2,F3. Trong đó, F1 và F2 giữ vai trò
quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây, F1 là lực giữ chất phân
tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy,
với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau.Kết quả là các chất khác nhau sẽ di
chuyển trong cột với tốc độ khác nhau khi ra khỏi cột như hình 1.16.
Hình 1.6. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B
1.4.3. Phân loại sắc kí hấp phụ
Quá trình sắc kí dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối
với các chất tan và sự rửa giải của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Sự tách một
hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong loại này có hai
kiểu hấp phụ:
+ Sắc kí hấp phụ pha thường (Normal Phase: NP-HPLC): pha tĩnh phân
cực, pha động không phân cực.
+ Sắc kí hấp phụ pha đảo (Reverse Phase: RP-HPLC): pha tĩnh không
phân cực, pha động phân cực.

Trong đó, sắc kí hấp phụ pha đảo được ứng dụng nhiều nhất vì có thể tách
các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,
phân cực yếu hay trung bình như các vitamin, các thuốc hạ nhiệt, giảm đau,…
Hiện nay, chủ yếu chúng ta sử dụng loại sắc kí pha đảo (RP-HPLC).
1.4.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc kí đồ.
t0: thời gian lưu chết.

trA: thời gian lưu chất A. trB: thời gian lưu chất B.
t’rB: thời gian lưu thực chất A. t’rB: thời gian lưu thực chất B.
Hình 1.7. Sắc kí đồ của chất A và chất B
a) Thời gian lưu thực.
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và
các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc kí đã
chọn.Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
− Bản chất sắc kí của pha tĩnh.
− Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
− Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
− Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.
b) Hệ số dung lượng K’.
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong
hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và
lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.

𝑡𝑅 − 𝑡0
𝐾′ =
𝑡𝑜
Nếu K’ nhỏ thì 𝑡𝑅 cũng nhỏ và sự tách kém.Nếu K’ lớn thì peak bị
doãng.Trên thực tế, K’ từ 1 – 5 là tối ưu.
c) Độ chọn lọc α.
Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí, khi hai chất A và B
có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn
lọc α.
𝐾′𝐵
α= với ( K’B > K’A)
𝐾′𝐴
với α càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng.
Hình 1.8. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B
d) Số đĩa lí thuyết.
Số đĩa lí thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện
sắc kí nhất định. Mỗi đĩa lí thuyết trong cột sắc kí giống như một lớp pha tĩnh có
chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân
tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung
bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
− Đường kính và độ hấp phụ của pha tĩnh.
− Tốc độ và độ phân cực của pha động.
− Hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
Vì vậy với mỗi điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối
với một chất phân tích và số đĩa lí thuyết của cột cũng được xác định.

Số đĩa lí thuyết được tính theo công thức sau:

2
𝑡𝑅
𝑁 = 5,54 ( )
𝑊0,5
Trong đó, 𝑡𝑅 là thời gian lưu giữ của chất phân tích.
𝑊0,5 là độ rộng tại 1⁄2của peak.
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.
e) Độ phân giải.
Độ phân giải là đại lựng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một
điều kiện sắc kí đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau phải được tính theo
công thức sau:
𝑡′𝑟𝐵 − 𝑡′𝑟𝐴
𝑅=2
𝑊𝐵 + 𝑊𝐴
Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách
nhau là R=1,0. Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp.
f) Hệ số không đối xứng.
Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của mức trên sắc
kí đồ thu được. T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa peak tại điểm 1/10 chiều
cao peak.
𝑎
𝑇=
𝑏
Hình 1.9. Cách tính hệ số khôngđối xứng của peak

Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải
quan tâm đến hệ số không đối xứng T.
Khi T ≤ 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận.

Khi T > 2,5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định, vì vậy phép định lượng
cần phải thay đổi các điều kiện sắc kí để làm cho peak cân đối hơn theo các cách
sau:
− Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến detector.
− Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.
− Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể
tích tiêm mẫu.
1.4.5. Hệ thống HPLC
Trong đó:
1- Bình chứa dung môi pha động.
2- Bộ phận khử khí.
3- Bơm cao áp.
4- Bộ phận tiêm mẫu.
5- Cột sắc kí (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt.
6- Đầu dò detector (nhận tín hiệu).
7- Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu xử lí số
liệu và điều kiển toàn bộ hệ thống.
8- Thiết bị in dữ liệu.

1.4.5.1. Bình đựng dung môi

Hiện nay máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho
phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỉ lệ mong
muốn và tổng tỉ lệ dung môi của 4 đường là 100%.
Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết
và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết nguyên chất.
1.4.5.2. Bộ phận khử khí
Mục đích của bộ phận khử khí là nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong
dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn
sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:
− Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian
lưu của peak thay đổi.
− Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì
có thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và
máy sắc kí sẽ ngừng hoạt động.
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng đều cho kết quả phân tích sai.
1.4.5.3. Bơm cao áp.
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc kí. Bơm
phải tạo áp suất khoảng 3000 – 6000 PSI hoặc 250 – 500 atm (1 atm = 0,98 bar) và
bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 – 9,999 ml/phút. Hiện nay đã có
nhiều loại pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar.Máy sắc kí lỏng của chúng ta
hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar.
1.4.5.4. Bộ phận tiêm mẫu.
Đưa mẫu vào cột theo phương pháp không ngừng dòng chảy với dung tích là
5 – 10 µl. Có hai cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng
syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler).
1.4.5.5. Cột sắc kí khí.
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống HPLC.

Cột pha tĩnh thông thuồng được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột
khoảng 10 – 30 cm, đương kính trong 1 – 10 mm, hạt chất nhồi cỡ ∅ = 5 − 10 𝜇𝑚 .
Ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt.
Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã
được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta
còn dùng các loại hạt sau: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion.
1.4.5.6. Đầu dò.
Đầu dò (hay còn gọi là detector) là một bộ phận phát hiện các chất khi chúng
ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc kí đồ để có thể định tính và định lượng.
Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng các loại detector
thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất
phân tích.
𝐴 = 𝑘. 𝐶
Trong đó: A là tín hiệu đo được.
C là nồng độ chất phân tích.
k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn.
Tín hiệu này có thể là: độ hấp phụ quang; cường độ phát xạ; cường độ điện
thế; độ dẫn điện; độ dẫn nhiệt; chiết xuất;…
Trên cơ sở đó người ta chế tạo các loại detector sau:
− Detector quang phổ tử ngoại từ 200 – 380 nm.
− Detector quang phổ khả kiến (UV-VIS): từ 190 – 900nm.
− Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự
nhiên. Đây là loại detector có độ chọn lọc cao nhất.
− Loại hiện đại hơn có detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay
hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất
theo độ hấp thu cực đại của các chất.

1.4.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu.

Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Các máy thế hệ mới đều
dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các
thông số của peak,…
1.4.5.8. Thiết bị in dữ liệu.
Sau khi phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra
giấy để hoàn thiện hồ sơ.
1.4.6. Các bước tiến hành sắc kí.
1.4.6.1. Chuẩn bị dụng cụ, máy móc.
Máy HPLC phải được kiểm chứng định kì để bảo đảm máy hoạt động tốt,
cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỉ lệ dung môi, tốc độ dòng,
năng lượng đèn UV,…đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt cột sắc kí phải được kiểm tra về số đĩa lí thuyết theo định kì hay khi
có nghi ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc kí.
Ví dụ, sắc kí pha thường NP-HPLC: rửa bằng methanol, không rửa bằng
nước. còn sắc kí pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải
rửa nước trước cho sạch.
Tỉ lệ methanol : nước = 50 : 50 v/v cho sạch hết các chất còn đọng lại trong
cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối tránh tình trạng chỉ
rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị
mốc, hỏng dẫn đến không thể dùng được.
1.4.6.2. Chuẩn bị dung môi pha động.
Các dung môi dùng cho sắc kí là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa
chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích.Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng
tỉ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu. lọc
dung môi qua màng lọc 0,2 – 0,45 µm.

1.4.6.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC.

Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc:
− Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường
hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
− Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được
bằng cách lọc hay chiết…
− Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng 0,2 – 0,45 µm.
− Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể
gây ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng
dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra
có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
1.4.6.4. Cách vận hành thiết bị.
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hang sản xuất, phần mềm
điều khiển hệ thống sắc kí HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc
sau:
− Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống
dẫn trước khi cho vào cột.
− Đặt đầy đủ các điều kiện sắc kí như:
+ Cấu hình máy.
+ Tỉ lệ các dung môi pha động.
+ Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu
cầu.

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1. Đánh giá qui trình chiết từ hạt gấc
2.1.1. Phổ hấp thụ các chất chứa gốc với 3 nối liên hợp
Để xác định sự có mặt của gốc α-eleostearic (9Z, 11E, 13E – octadeca-
9,11,13-trienoic) trong dầu từ hạt gấc chúng tôi tiến hành đo phổ hấp thụ electron
của dung dịch chiết trong n-hexan. Kết quả thu được chỉ ra trong hình 1(B). Trong
vùng hấp thụ này cực đại hấp thụ dài nhất ở 281 nm tương ứng với sự có mặt của
các hợp chất với 3 nối đôi C=C liên hợp. So sánh phổ hấp thụ của dầu hạt gấc với
phổ hấp thụ electron của dầu hạt mướp đắng (momordica charantia), dầu được xem
như là 1 nguồn dầu chuẩn trong thiên nhiên với thành phần chính là α-eleostearic
acid, hoàn toàn trùng khớp.
Hình 2.1. Sơ đồ bước chuyển năng lượng của dao động electron (A) và phổ hấp thụ
phân tử của hợp chất chứa ba nối đôi liên hợp (B).
2.1.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang A của dầu hạt gấc với nồng độ của dầu
gấc (mg/ml).
Mật độ quang A được đo trong vùng bước sóng 220-400nm,
Bảng 2.1.Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc (tại = 270nm)
A 0.06 0.123 0.227 0.339 0.446 0.56 0.673
C(mg/ml) 0.003 0.005 0.01 0.015 0.02 0.0251 0.03
A 0.795 0.889 1.004 1.12 1.243 1.347 1.386

C(mg/ml) 0.0351 0.04 0.045 0.05 0.055 0.06 0.0652

Hình 2.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc
(trong dung môi n-hexan)
Kết quả chỉ ra rằng có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ của dầu gấc
trong khoảng 0.003-0.06mg/ml và mật độ quang của dung dịch đo được (tại cực đại
hấp thụ λmax=270nm). Sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ dầu với mật độ quang
đo được theo định luật Bouger - Lambert -Beercó thể dễ dàng giải thích được vì
trong thành phần của dầu hạt gấc chứa một lượng ổn định gốc α-eleostearic nằm
trong thành phần của các triglixerit. Chỉ có thành phần này mới hấp thụ trong vùng
bước sóng 220-400 nm, chính vì vậy nên sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dầu
với mật độ quang A chính là sự phụ thuộc của nồng độ acid α-eleostearic với mật
độ quang. Cũng từ những dữ liệu thực nghiệm trên chúng tôi đi xác định được
phương trình đường chuẩn phụ thuộc của nồng độ dầu hạt gấc và mật độ quang A.
Phương trình có dạngy = 0.0449x - 0.0002 (R² = 0.9998). Phương trình này được
chúng tôi sử dụng để điều khiển quá trình chiết và làm sạch dầu gấc sau đây.
2.1.3. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào các dung môi
Tiến hành cân trên cân phân tích 2 lượng dầu như nhau (m=3.5mg) sau đó
định mức trong 2 bình định mức 100 ml bằng dung môi n-hexan và diclometan. Sau
đó tiến hành đo mật độ quang của 2 dung dịch thu được.

Hình 2.3. Phổ hấp thụ phân tử eclectron của dầu hạt gấc trong các dung môi khác
nhau. 1-trong dung môi n-hexan, 2- trong dung môi CH2Cl2.
Dễ dàng nhận thấy rằng cường độ hấp thụ của dầu hạt gấc trong n-hexan
cao hơn nhiều so với tron dung dịch CH2Cl2. Đồng thời khi chuyển từ dung môi n-
hexan sang dung môi diclometan phổ hấp thụ electron của dung dịch có sự chuyển
dịch, cực đại hấp thụ thay đổi từ 270nm sang 274 nm.
2.1.4. Chiết tinh dầu hạt gấc bằng các dung môi hữu cơ
Để tránh sự phân hủy của các hợp chất liên hợp kém bến dầu hạt gấc được
chiết bằng cối sứ ở nhiệt độ phòng khi khuấy trộn của hạt gấc đã được nghiền với
dung môi hữu cơ.
- Chiết dầu hạt gấc bằng các dung môi n-hexan
Đầu tiên chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của thể tích dung môi của
các lần chiết và mức độ chiết dầu hạt. Tiến hành chiết dầu hạt gấc bằng hexan với 9
lần, thể tích dung môi mỗi lần thêm vào là 10 ml và 20 ml. Xác định lượng dầu thu
được qua mỗi lần chiết bầng 2 phương pháp độc lập: Phương pháp phân tích khối
lượng và phương pháp đo quang. Kết quả thu được chỉ ra trong bảng 1.2 và 1.3.

Bảng 2.2. Kết quả xác định khối lượng dầu hạt gấc qua mỗi lần chiết bằng
dung môi n-hexan với thể tích dung môi mỗi lần chiết là 10ml.
Khối lượng dầu (g) Tổng phần trăm chiết (%)
Thể tích
Phương pháp Phương pháp Phương pháp Phương pháp
dung môi
khối lượng đo quang khối lượng đo quang
10 0.6486 0.6490 51.31 51.35
20 0.3525 0.3521 79.20 79.21
30 0.1254 0.1256 89.12 89.15
40 0.0614 0.0612 93.98 93.99
50 0.0240 0.0248 95.89 95.96
60 0.0179 0.0182 97.30 97.40
70 0.0152 0.0150 98.50 98.58
80 0.0149 0.0139 99.68 99.68
90 0.0040 0.0040 100 100.00
Bảng 2.3. Kết quả xác định khối lượng dầu hạt gấc qua mối lần chiết bằng dung
môi n-hexan với thể tích dung môi mỗi lần chiết là 20ml.
Khối lượng dầu (g) Tổng phần trăm chiết (%)
Thể tích
Phương pháp Phương pháp Phương pháp Phương pháp
dung môi
khối lượng đo quang khối lượng đo quang
20 0.6486 0.7384 64.92 65.04
40 0.3525 0.2715 88.79 88.99
60 0.1254 0.0686 94.82 95.07
80 0.0614 0.0250 97.02 97.26
100 0.0240 0.0183 98.63 98.48
120 0.0179 0.0106 99.56 99.38
140 0.0152 0.0050 100.00 100.00

Từ kết quả thu được ở bảng 2.2 và 2.3 nhận thấy rằng kết quả xác định khối
lượng dầu qua mỗi lần chiết bằng 2 phương pháp độc lập tương đối trùng khớp với
nhau. Điều đó có thể khẳng định rằng việc lựa chọn 2 phương pháp trên để kiểm
soát quá trình chiết và làm sạch dầu hạt gấc là hoàn toàn phù hợp. Từ kết quả thu
được bằng phương pháp đo quang chúng tôi xây dựng đồ thị phụ thuộc của lượng
dầu thu được vào số lần chiết (hình 2.4 và hình 2.5).
mỗi
lần chiết 10 ml)
mỗi lần chiết 20 ml)

Kết quả thu được trong hình 2.4 và 2.5 chỉ ra rằng trong trường hợp thể tích
của dung môi ở mỗi lần chiết là 10ml thì chỉ với 6 lần chiết lượng dầu thu được
khoảng 98% (tức là cần dùng hết 60 ml để chiết được 98% dầu có trong hạt gấc).
Trong trường hợp chiết bằng 20 ml dung môi mỗi lần chiết cần dùng 4 lần chiết (80
ml dung môi) để đạt được lượng dầu như trên.
- Chiết dầu hạt gấc bằng các dung môi diclometan
Tiến hành tương tự trường hợp trên đối với dung môi diclomentan. Cân
2,0±0.1g khối lượng hạt gấc đã nghiền nhỏ trên cân phân tích. Tiến hành chiết bằng
dung môi diclometan 10 lần trong 2 trường hợp: thể tích mỗi lần chiết 10 ml và 20
ml. Khối lượng dầu thu được xác định bằng phương pháp đo quang với đường
chuẩn được xây dựng lại trong dung môi diclometan (ở mỗi lần chiết dung dịch
được gom lại trong bình định mức và định mức đến vạch sau đó tiến hang pha loãng
và đo mật độ quang (hình 2.7)). Kết quả thu được chỉ ra trong hình 2.6 dưới đây
Hình 2.6. Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi diclometan
: Thể tích dung môi mỗi lần chiết 20ml
: Thể tích dung môi mỗi lần chiết 10ml

Hình 2.7. Dung dịch dầu gấc trong dung môi diclometan trong 6 lần chiết (thể tích
mỗi lần 10ml)
Từ hình 2.7, nhận thấy rằng kết quả thu được khá tương đồng với kết quả thu
được trong trường hợp chiết bằng dung môi n-hexan. Với thể tích chiết mỗi lần là 10ml
thì cũng cần dùng đến 60 ml để chiết được khoảng 98% dầu trong hạt gấc, đối với
lượng thể tích chiết 20 ml trong mỗi lần cần đến 100ml để đạt được hiệu quả trên.
- Chiết dầu hạt gấc bằng các dung môi aceton
Chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát chiết dầu hạt gấc bằng dung môi phân
cực hơn (dung môi aceton). Với dung môi này tiến hành kiểm soát quá trình chiết
bằng phương pháp khối lượng (loại trừ phương pháp đo quang vì dung môi aceton
cũng hấp thụ mạnh ở vùng bước sóng 270nm).
Bảng 2.4. Kết quả xác định tổng % chiết qua mỗi lần chiết bằng dung môi aceton
Thể tích dung Tổng phần Thể tích dung Tổng phần
môi (ml) trăm chiết(%) môi (ml) trăm chiết (%)
10 68.12 20 70.12
20 86.33 40 88.33
30 93.64 60 95.64
40 95.85 80 97.85
50 97.06 100 99.06
60 98.46 120 99.62
70 99.66 140 99.84
80 100 160 100

Chúng ta thấy rằng khi tăng thể tích dung môi trong mỗi lần chiết thì trong
những lần chiết đầu tiên lượng dầu thu được cũng tăng lên. Nhưng khi xét cả quá
trình chiết thì với việc sử dụng lượng dung môi mỗi lần chiết là 10 ml thì với 6 lần
chiết chiết tối ưu hơn so với việc cũng sử dụng 60 ml với 3 lần chiết.
So sánh giữa các dung môi chiết:
Hình 2.8 Biểu diễn quá trình chiết dầu gấc bằng 3 dung môi có độ phân cực
tăng dần với thể tích mỗi lần chiết là 10ml. Chúng ta thấy rằng sự khác nhau về
tổng phần trăm chiết chỉ ra xay với 3 lần chiết đầu tiên. Trong ba lần chiết đầu tiên
độ phân cực của dung môi càng tăng thì lượng dầu chiết cũng tăng theo. Điều này
cũng không có gì mâu thuẫn với nguyên tắc chiết đã trình bày ở trên. Trong những
lần đầu tiên khuấy trộn của hạt (đã được nghiền nhỏ) với dung môi thì các dung môi
phân cực dễ dàng thẩm thấu và phá vỡ các tế bào dầu (oil body) trong hạt. Tuy
nhiên sau một vài lần chiết khi lớp vỏ của các tế bào dầu đã bị phá vỡ thì việc sử
dụng các dung môi phân cực chỉ làm tăng hàm lượng các tạp chất không cần thiết
(các axit tự do, phốtpholipid …). Tổng thành phần chính (các triglixerit) đều gần
như được chiết hoàn toàn sau 6 lần chiết (98%).
Hình 2.8.Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng các dung môi hữu cơ khác nhau

Dung dịch dầu thu được sau khi chiết được đuổi hết dung môi bằng phương
pháp cất quay chân không và được giữ ở -5oC đến khi tiến hành các phân tích tiếp theo.
Để so sánh mức độ chiết của các dung môi chúng tôi tiến hành lấy những lượng
bằng nhau của hạt gấc đã được nghiền sẵn. Tiến hành chiết 6 lần bằng dung các
dung môi ở trên và xác định một số đặc điểm dầu thu được.kết quả chỉ ra trong
bảng 2.5.
Bảng 2.5. Kết quả xác định 1 số đại lượng trong quá trình chiết dầu hạt gấc
Dung môi chiết n-hexan Diclometan aceton
Hàm lượng dầu trong hạt 52.33 52.68 52.70
Chỉ số khúc xạ của dầu thu được* 1.5035 1.5041 1.5045
* Chỉ số khúc xạ đo ở nhệt độ t=27oC

Nhận thấy rằng cả 3 dung môi đều cho kết quả xác định hàm lượng dầu như
nhau, chỉ số khúc xạ của dầu thu được không có sự khác nhau nhiều. Chứng tỏ rằng
cả ba dung môi trên đều hoàn toàn phù hợp với việc chiết dầu từ hạt.Tuy nhiên xét
về phương diên thuận tiện và bảo vệ môi trường thì n-hexan có ưu điểm hơn. Chính
vì vậy chúng tôi chọn n-hexan làm dung môi chính để chiết trong các nghiên cứu
sau này.
2.2. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH LÀM SẠCH TINH DẦU GẤC
Dầu thu được từ hạt bằng phương pháp chiết hoặc ép chứa rất nhiều thành
phần: trong đó thành phần chính là các triglixerit (90-95%), ngoài ra diglixrit (1-
2%), aicd tự do (̴̰ 0.5%), monoglixerit, photpholipit, các chất sắc tố và các thành
phần khác. Trong đó có những hợp chất có thể làm bẩn thành phần của dầu, có thể
làm tăng quá trình tự oxi hóa của dầu, gây cản trở trong quá trình phân tích các
thành phần cơ bản trong dầu.

Hình 2.9. Mô hình phân tử triglixerit và phospholipid có tròng dầu hạt thực vật
2.2.1. Nghiên cứu quá trình làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn
2.2.1.1. Nghiên cứu quá trình hấp phụ của dầu trên cột chiết silicagel
Từ dầu thu được sau khi chiết chuẩn bị dung dịch dầu trong n-hexan với
nồng độ 10 mg/ml để tiến hành nghiên cứu quá trình hấp phụ dầu trên cột chiết pha
rắn. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột chiết pha rắn DIAPAK C
(BioChemMac CT, Moskva), được nhồi bằng silicagel (0,52g silicagel/cột).
Silicagel KCМГ: dạng hạt với hốc nhỏ, silicagel КСКГ: dạng hạt với hốc lớn (tinh
khiết hóa học).Trước mỗi quá trình chiết cho chảy qua cột 6 ml n-hexan để điều hòa
cột (sử dụng xilanh), sau đó dẫn 20 ml dung dịch dầu (hòa tan trong n-hexan) nồng
độ 10mg/ml qua cột chiết pha rắn theo từng lượng thể tích 1ml. Xác định hàm
lượng của dầu hấp phụ trên cột chiết pha rắn theo từng lượng thể tích bằng phương
pháp quang phổ UV ở bước sóng 270nm. Tổng khối lượng dầu hấp phụ trên cột
được tính bằng tổng khối lượng dầu hấp phụ theo từng lượng thể tích chảy qua và
được xác định lại bằng phương pháp cân khối lượng để đối chiếu. Kết quả thu được
chỉ ra trong hình 2. 2 và bảng 2.1

Hình 2.10.. Quá trình hấp thu dầu trên cột chiết pha rắn DIAPAK C.
1- Hàm lượng dầu hấp thu trên cột theo từng ml thể tích mẫu qua cột trong quá trình
tăng thể tích, 2- Tổng khối lượng dầu được hấp thu trên cột trong
quá trình chiết pha rắn (mg).
Bảng 2.6.Kết quả khảo sát quá trình hấp thụ dầu hạt gấc trên cột DIAPAK C.
Lần bơm mẫu thứ 1 2 3 4 5 6
Khối lượng dầu giữ lại
9.99 9.99 9.99 9.99 9.99 9.97
trên cột (mg)
Tổng lượng dầu giữ lại
9.99 19.99 29.98 39.97 49.97 59.96
trên cột (mg)
Lần bơm mẫu thứ 7 8 9 10 11 12
9.97 9.92 9.90 9.90 9.35 5.89
trên cột (mg)
69.93 79.90 89.83 99.72 109.07 114.96
trên cột (mg)
Lần bơm mẫu thứ 13 14 15 16 17 18
2.77 1.50 1.04 0.72 0.39 0.30
trên cột (mg)
117.74 119.24 120.28 121.01 121.39 121.70
trên cột (mg)

Từ những dữ liệu trên nhận thấy rằng, cột chiết pha rắn hấp phụ hoàn toàn 10
ml dung dịch dầu trong n-hexan ban đầu (nồng độ 10mg/ml) mà hoàn toàn không bị
mất chất phân tích. Giới hạn hấp thu của cột chiết đối với dầu hạt gấc tính toán
được là 120 ±2 (P=0.95; n=3) mg/cột chiết (0.5g silicagel).
2.2.1.2. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ của dầu
Để nghiên cứu quá trình rửa giải trên cột chiết pha rắn chúng tôi sử dụng 3
hệ dụng môi với độ phân cực tăng dần: hỗn hợp n-hexan và diclometan (P=1.7),
diclometan (P=3.4) và aceton (P=5.4). Sau đó dùng phương pháp hấp thụ quang
phân tử để kiểm soát quá trình rửa giải và phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
pha đảo (RP-HPLC) để đánh giá, phân tích thành phần của các phân đoạn thu được.
Tiến hành rửa giải cột chiết bằng cách bơm từng phần (1 ml) qua cột chiết.
Dung dịch thu được sau khi rửa giải được pha loãng và đo mật độ quang để tính
lượng dầu thu được.
Hình 2.11. Quá trình rửa giải cột chiết bằng các hệ dung môi khác nhau

Bảng 2.7. Phần trăm giải hấp chất phân tích bằng các hệ dung môi khác nhau
Thể tích dung môi
1 2 3 4 5 6 7 8
(ml)
hỗn hợpn-hexan
và diclometan 45.23 66.34 85.42 94.31 98.54 99.12 99.89 100
(1:1,v/v)
diclometan 92.47 97.86 99.09 99.67 99.96 100 100 100
aceton 94.21 98.21 99.12 99.88 99.97 100 100 100
Kết quả trong bảng 2.7 và hình 2.8 chỉ ra rằng, nếu sử dụng dung môi phân
cực như diclometan hay aceton thì chỉ cần đến 4 ml đủ để rửa giải gần như hoàn
toàn lượng dầu hấp phụ trên cột chiết. Trong trường hợp dùng hệ n-hexan và
diclometan (1:1;v/v) cần dùng đến 6 ml để rửa giải 99% chất hấp phụ trên cột. Từ
lượng dầu sạch thu được sau khi chiết pha rắn sẽ tính toán được phần mức độ chiết.
Kết quả chỉ ra trong bảng.
Bảng 2.8. Kết quả rửa giải dầu bằng phương pháp chiết pha rắn
n-hexan và
Hệ dung môi Diclometan Aceton
diclometan (1:1,v/v)
Giá trịPʹ 1.7 3.4 5.4
Thể tích cần dùng 8 4 4
Lượng dầu thu
82.3% 88.23% 88.52%
được
Dung dịch thu được sau khi rửa giải được làm bay hơi dung môi thu được
dầu trong suốt không chứa thành phần rắn vẩn đục như dầu khi chưa được làm sạch.
Sau quá trình chiết pha rắn từ 122 mg dầu chưa làm sạch thu được 108 mg dầu
sạch, như vậy trong dầu chưa làm sạch chứa khoảng 12% hợp chất phân cực hơn và
hiệu suất thu hồi sau khi làm sạch khoảng 88%. Ý nghĩa thực nghiệm của việc làm

sạch dầu hạt gấc là cùng một mẫu dầu chưa làm sạch sau một thời gian cất giữ trong
tủ lạnh (t=10oC) trong thời gian một vài tháng lượng triglixerit thì mẫu dầu ban đầu
bị phá hủy khá lớn (trên 70%) còn mẫu đã làm sạch thì không xảy ra hiện tượng đó
(hình 2.12).
Để đánh giá thành phần các lớp chất trong từng phân đoạn dầu thu được sau
khi rửa giải cột chúng tôi tiến hành phân tích bằng hệ thống HPLC (Agilent 1260).
Lượng dầu thu được trong mỗi thể tích dung dịch sau khi rửa giải được đuổi sạch
dung môi bằng phương pháp cất quay chân không, sau đó hòa tan trong pha động
(40% isopropanol và 60% acetonitrin). Sắc kí đồ thu được trong 3 trường hợp với 3
dung môi rửa giải khác nhau chỉ ra trong hình 2.13, 2.14 và 2.15
Hình 2.12. Quá trính chiết là làm sạch dầu hạt gấc
1 - Dầu gấc chưa làm sạch và 2- dầu gấc đã làm sạch sau 5 tháng bảo quản

1-
bằng hệ n-hexan và diclometan (1:1, v/v). A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch,
1-8: các phân đoạn dầu thu được sau 1-8 ml rửa giải.
bằng diclometan. A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân đoạn dầu
thu được sau 1-4 ml rửa giải.

bằngaceton A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân đoạn dầu thu
được sau1-4 ml rửa giải
Trên hình 2.13 chỉ ra rằng hệ dung môi n-hexan và diclometan (1:1,v/v) rửa giải
rất chọn lọc các lớp chất trong dầu hạt gấc. Trong 3 lần rửa giải đầu tiên (thể tích
mỗi lần 1ml) thì chỉ có triglixerit được rửa giải.Sau đó lần thứ 4 khi lượng triglixerit
để giảm xuống đáng kể thì triglixerit và 1 lượng diglixerit, monoglixerit cùng được
rửa giải. Lần rửa giải tiếp theo hầu như chọn lọc với di và monoglixerit. Kết quả thu
được khá tương tự với trường hợp giải hấp bằng diclometan (hình 2.14). Trong
trường hợp dùng aceton làm dung môi rửa giải thì mức độ rửa giải chọn lọc của các
lớp chất rất kém.Dễ nhận thấy rằng 4 sắc kí đồ của 4 lần giải hấp thì gần như không
có sự khác biệt (bỏ qua sự khác biệt về kích thước của các pic trong các trường
hợp). Điều này cũng dễ dàng có thể giải thích bằng độ phân cực của các dung môi
dùng rửa giải cột chiết. Trong trường hợp sử dụng silicagel như một pha tĩnh trong
chiết pha rắn thì có sự tương tác giữa các nhóm Si-OH với các nhóm phân cực trong
các hợp chất của các lớp chất trong dầu gấc (Ví dụ các nhóm este –COO– trong các
glixerit). Khi rửa giải bằng các dung môi hữu cơ thì các chất càng kém phân cực thì
sẽ được rửa giải đầu tiên chính vì vậy triglixerit sẽ được rửa giải trước, sau đó đến
diglixerit, monoglixerit, axit béo tự do, photpholipit … Nếu sử dụng một dung môi
phân cưc như aceton thì nó đồng thời có thể rửa giải toàn các lớp chất lipit cùng lúc
và không có sự chọn lọc.

Tuy nhiên một số hợp chất không no với nối đôi liên hợp (như carotenoid) khi
tiếp xúc với các nhóm silanol trong một vài hãng silicagel thương mại làm pha tĩnh
thì chúng bị phân hủy rất nhanh. Vì vậy khi sử dụng silicagel với vai trò chất hấp
phụ cần phải điều khiển hoạt tính của chúng với các chất mà nó hấp phụ. Để đánh
giá quá trình lưu giữ dầu trong trạng thái bị hấp phụ trên silicagel, đầu tiên từ dầu
sau khi đã làm sạch tiến hành tách riêng thành phần cơ bản (di α-eleostearat-stearat
(αE2S)) bằng hệ thống sắc kí điều chế Shimadzu LC20 sử dụng pha động 50%
isopropanol và 50% acetonitrin với đầu dò điot quang ở bước sóng 270 nm. Hệ
thống sắc kí điều chế Shimadzu LC20, cột điều chế 250×10 mm,
SUPELCOSILTMLC-18. Từ thành phần thu được chuẩn bị dung dịch α-E2S trong
n-hexan (3mg/ml). Lấy 1ml dung dịch chuẩn bị cho vào trong chai đựng mẫu vials
thêm vào 0.2 g pha rắn (silicagel) với ba nhãn hiệu khác nhau (silicagel KCМГ:
dạng hạt với hốc nhỏ, silicagel КСКГ: dạng hạt với hốc lớn, silicagel trong cột chiết
pha rắn DIAPAK C), đậy nắp, giữ ở nhiệt độ phòng và để tiếp xúc trực tiếp với ánh
sáng. Sau những khoảng thời gian nghiên cứu, gạn bỏ phần dung môi ra khỏi pha
tĩnh, giải hấp bằng aceton, sau đó loại bỏ aceton và hòa tan mẫu bằng pha động để
tiến hành chạy sắc kí HPLC. Kết quả sau khi chạy sắc ký đưa ra trong hình 2.10.
Hình 2.16.Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel. 1-Dung
dịch dầu gốc, sản phẩm sau khi giải hấp sau 48h với: 2-silicagel mác КСМГ; 3-
silicagel nhãn КСKГ; 4- silicagel trong cột chiết pha rắn DIAPAK C.

Theo kết quả được chỉ ra trong hình 2.16 có thể thấy rằng trong mẫu dung
dịch chuẩn ban đầu tách ra từ dầu hạt gấc chứa triglixerit αE2S, với một một lượng
nhỏ đồng phân của nó (sắc kí đồ 1), nhưng sau một thời gian tiếp xúc trong thời
gian 48 tiếng với silicagel nhãn hiệu KCМГ (sắc kí đồ 2), KCKГ (sắc kí đồ 3) và
silicagel chứa trong cột chiết pha rắn DIAPAK C (sắc kí đồ 3) đều phá phủy gần
như hoàn toàn chất phân tích.
Sau đó chúng tôi nghiên cứu sự phụ thuộc của mức độ chuyển hóa của chất
phân tích vào thời gian tiếp xúc của chất phân tích với silicagel chứa trong cột chiết
pha rắn để đánh giá khả năng sử dụng cột chiết pha rắn DIAPAK C trong làm sạch dầu
hạt gấc. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm như trên nhưng với thời gian giữ của chất phân
tích trên silicagel khác nhau. Kết quả thu được chỉ ra trong sắc kí đồ hình 2.17.
Hình 2.17. Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel theo thời
gian. 1- dung dịch dầu gốc; 2- sau 1h tiếp xúc; 3- sau 24h tiếp xúc,
4- sau 48h tiếp xúc.
Từ kết quả thu được có thể thấy rằng với thời gian tiếp xúc của silicagel với
α-E2S càng ngắn thì mức độ chuyển hóa của chất phân tích càng nhỏ. Đồng thời với
thời gian tiếp xúc không quá dài (0,5-1,0 giờ) chất phân tích bị phân hủy không

đáng kể (nhỏ hơn 1%). Như vậy có thể sử dụng cột chiết pha rắn DIAPAK C để làm
sạch dầu chứa gốc axit với nối đôi liên hợp tuy nhiên thời gian tiếp xúc giữa mẫu
với pha rắn phải được giới hạn.
2.3. ĐÁNH GIÁTHÀNH PHẦN TRIGLIXERIT TRONG DẦU HẠT GẤC
2.3.1. Định tính các triglixerit trong dầu hạt gấc
Để phân tích thành phần của các triglixerit trong dầu hạt gấc chúng tôi sử
dụng phương sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo. Mẫu được phân tích bằng hệ thống
HPLC Agilent 1260 Infinity với đầu dò PDA và đầu dò khối phổ, cột tách 250×4
mm, Kromasil 100-5C18, dung môi 40% isopropanol và 60% acetonitrin, nhiệt độ
cột 30oC, thể tích tiêm mẫu 20μl, nồng độ dầu 1mg/ml, bước sóng 270nm. Các mẫu
dầu hạt gấc được chiết và làm sạch theo phương pháp đã nghiên cứu ở trên.
Đồng ý với kết quả xác định thành phần của các axit béo có trong dầu hạt
gấc trong công bố của Mathaus.B. và các cộng sự, dầu hạt gấc chứa các triglixerit
với một gốc nối đôi liên hợp của octadecatrien (α-eleostearic).Tuy nhiên các thành
phần triglixerit của dầu hạt gấc chưa có tài liệu nào công bố.Chính vì vậy trong
nghiên cứu này sẽ xác định thành phần của các triglixerit có trong dầu gấc đồng
thời chứng minh sự có mặt của gốc α-eleostearic, thành phần mà nhiều nghiên cứu
trước đây không phát hiện ra.
Đầu tiên sự có mặt có gốc octadecatrien liên hợp trong dầu hạt gấc được dễ
dàng phát hiện ra khi đo phổ hấp thụ phân tử của dung dịch chiết trong n-hexan (đã
chỉ ra trong các phần trên). Để xác định thành phần của các triglixerit cho chạy sắc
ký dầu hạt gấc trong các điều kiên đã trình bày ở trên trên nền dầu của hạt mướp
đắng (momordica charantia). Dầu hạt mướp đắng được dùng như một dầu chuẩn
với thành phần của các triglixerit đã biết sẵn .Sắc kí đồ chỉ ra trong hình 2.18.

Hình 2.18. Sắc ký đồ của dầu hạt gấc (A) trên nền dầu chuẩn
momordica charantia (B)
Nhìn trên sắc ký đồ của dầu hạt gấc xuất hiện 10 thành phần triglixerit chính,
Thành phần của triglixerit trong dầu được xác định thông qua việc tính toán theo
phương pháp bước chuyển số gia, sử dụng dầu hạt mướp đắng làm dầu chuẩn.
Bảng 2.9. Các thông số trong sắc kí đồ khi phân tích dầu hạt gấc bằng RP-HPLC
Tên Logk Bước chuyển số gia (  X →Y )
Triglixerit Thời gian
pica b
(m/z [M+H ]) lưu (tR,phút)
+
E_L L_O O_P P_S
1 X3 (873.7) 10.204 0.489

2 X2L (875.8) 11.964 0.578 0.089
3 XL2 (877.7) 14.143 0.668 0.090
4 X2O (877.7) 15.173 0.705 0.127
5 X2P (851.7) 16.164 0.738 0.033
6 XLO (879.7) 18.123 0.796 0.091 0.128
7 XLP (853.8) 19.38 0.829 0.034
8 X2S (879.7) 20.464 0.856 0.119
9 X2O (881.6) 23.502 0.924 0.128
10 XLS (889.8) 24.587 0.946 0.090 0.117
Giá trị trung bình (  X →Y ) 0.090 0.128 0.034 0.118
Dầu momordica charantia
Giá trị trung bình (  X →Y ) 0.090 0.128 0.034 0.118

a
Đánh số pic như trong sắc kí đồ hình 2.18, b Thời gian chết của cột to=2,5
phút, được xác định dựa vào thời gian giữu của dãy triglixerit E3-E2L-EL2-E3. Các
triglixerit được kí hiệu bằng các chữ cái, biểu thị cho các gốc axit béo có trong
phân tử. L – gốc linoleic acid, O- gốc oleic, P – gốc panmitic , S- gốc stearic, αE-
gốc α-eleostearic acid
Các pic được xác nhận lại bằng kết quả xác định bằng phổ khối.Kết quả
được đưa ra trong bảng 2.9.Từ sắc kí đồ, nhận thấy rằng dầu của 2 dạng khác nhau
của họ momordica (hạt mướp đắng và hạt gấc) có thành phần tương tự nhau chỉ có
tỉ lệ của các pic hơi khác nhau.Từ bảng 2.9 nhận thấy rằng giá trị của bước chuyển
số gia lặp lại tốt (sự khác của các giá trị không quá sai số của phép xác định logk,
0.002).Từ kết quả đó xác định thành phần của triglixerit trong dầu hạt gấc, đồng
thời kết quả được xác nhận bằng phổ khối với các giá trị ion cơ bản m/z [M+H+].
Tiếp theo là tiến hành xác định chính xác lại cấu trúc của acid octadecatrien
liên hợp (kí hiệu bằng X) có trong dầu hạt gấc (hay nói cách khác đi chứng minh
cấu trúc của X chính là α-eleostearic (C18:39Z, 11E, 13E)).Chú ý rằng, theo lý thuyết
tồn tại rất nhiều đồng phân của axit liên hợp octadecatrienoic với sự khác nhau của
vị trí các nối đôi liên hợp và khác nhau về cấu hình cis- trans của các nối đôi đó.
Tuy nhiên trong tự nhiên tồn tại 1 số lượng có giới hạn các axit đó trong dầu từ
hạt thực vật. Bởi vì trong dầu thực vật chỉ tổng hợp 2 đồng phân vị trí octadeca-
9,11,13-trienoic và octadeca-8,10,12-trienoic. Ngoài ra nối đôi C=C ở giữa chỉ
có cấu hình trans. Chính vì vậy chỉ tồn tại 3 dạng cấu trúc (khi xem xét trên giới
hạn của 3 nối đôi liên hợp). Ứng với 3 cấu trúc đó có 3 dạng phổ hấp thụ
electron phân tử.

Hình 2.19. Ba dạng cấu hình của các acid liên hợp octadecatrienoic có trong thiên
nhiên và dạng phổ hấp thụ phân tử của chúng
Loại I: punicic C18:39Z, 11E, 13Zvà jacaric acids C18:38Z, 10E, 12Z; Loại II: catalpic
C18:39E, 11E, 13Z, α-eleostearic C18:39Z, 11E, 13E và calendic acids C18:38E, 10E, 13Z; và
loại III: β-eleostearic C18:39E, 11E, 13E and all-trans-calendic acids C18:38E, 10E, 12E.
Tất cả các octadecatrienoic acid liên hợp chỉ có 3 dạng phổ hấp thụ phân tử
như trên hình 2.19. Đồng thời ứng với sự thay đổi cấu hình của phân tử từ dạng cis
sang dạng transsẽ quan sát thấy hiện tượng chuyển dịch xanh trong phổ hấp thụ
phân tử. Chính vì vậy sự so sánh phổ hấp thụ phân tử electron cho chúng ta một
công cụ để xác định cấu trúc của các gốc axit octadecatrienoic đó.Trong quá trình
làm thực nghiệm đã chứng minh được rằng, không có hiệu ứng solvatochromic
trong dung môi sử dụng để tách các triglixerit (30 - 60% isopropanol trong
acetonitrin) chính vì vậy sử dụng đầu dò diot quang, bộ phận có khả năng đo phổ
phân tích của các thành phần tách được trong quá trình sắc kí, trong trường hợp này
hoàn toàn phù hợp.
Để xác nhận cấu hình của axit α-eleostearic trong dầu gấc phổ hấp thụ
electron của toàn bộ 10 triglixerit tách được trong sắc ký đồ của dầu gấc và so
sánh với phổ hấp thụ electron của α-eleostearic trong dầu mướp đắng. Kết quả
chỉ ra trong hình 2.20.

Hình 2.20. Phổ hấp thụ electron trong dung môi 40% isopropanol và 60%
acetonitrin được đo trong cuvet của đầu dò diot quang (DAD).
Kí hiệu 1, a, b trong sắc ký đồ A của dầu hạt gấc
Kết quả chỉ ra rằng cả 10 triglixerit cơ bản trong dầu gấc đều có dạng phổ
hấp thụ phân tự loại và hoàn toàn trùng khớp với phổ hấp thụ phân tử của α-
eleostearic trong dầu hạt mướp đắng. Ngoài ra trên sắc kí đồ A hình 2.18 bên cạnh
các pic chính được đánh số xuất hiện một vài pic phụ trong đó thời gian giữ lớn hơn
các pic chính (đánh dầu bằng chữ cái a). Phổ hấp thụ phân tử của các pic này có sự
chuyển dịch xanh ứng với sự chuyển cấu hình từ cis sang trans (hình 2.20). Các pic
đứng ngay trước các pic chính (pic b), có phổ hấp thụ phân tử có sự chuyển dịch đỏ
so với phổ hấp thụ phân tử của píc chính. Bằng sự so sánh thời gian giữ và phổ hấp
thu phân tử xác định dược rằng: các pic a- là các triglixeit trong phân tử có 1 gốc α-
eleostearic thay thể bằng 1 gốc β-eleostearic. Pic b- là các triglixeit trong phân tử có
1 gốc α-eleostearic thay thể bằng 1 gốc punic acid.
2.3.2. Định lượng các triglixerit trong dầu hạt gấc
Để định lượng các triglixerit có trong dầu hạt gấc phải dựa vào diện tích của
các pic với hệ số điều chỉnh là số lượng của gốc eleostearic trong hợp chất
triglixerit.Để đảm bảo tính chính xác mẫu gấc đã được thu hái ở 14 tỉnh thành khác
nhau từ Bắc vào Nam và tiến hành phân tích.

Hình 2.21. Các mẫu gấc được thu hái từ các tỉnh khác nhau.
1- Gấc tẻ, 2- Gấc lai, 3- Gấc nếp
Thu hái trong năm 2016
Kí hiệu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8
Thái Vĩnh An Đắc Yên Quảng
Vị trí Hà Nội Daclak
Bình Phúc Giang Nông Bái ngãi
Thu hái trong năm 2016
Kí hiệu G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7
Quảng Thái Hải Nam
Vị trí Ba Vì Hà Giang Lào Cai
Bình Nguyên Phòng Định
Trong hình 2.22 là sắc kí đồ của 3 mẫu gấc trồng ở ba địa điểm khác
nhau.Dễ nhận thấy rằng dù tỉ lệ giữa các triglixerit có thể khác nhau nhưng trong
thành phần của dầu gấc đều chứa 10 loại triglixerit.Tất cả các phép xác định đều
được chạy 5 lần lấy kết quả trung bình.
Từ kết quả thu được chúng tôi tính toán thành phần của các axit béo trong 14
mẫu dầu trên. Kết quả chỉ ra rằng thành phần của axit béo trong dầu hạt gấc: α-
eleostearic-63,68 %; linoleic -11.37 %; oleic-6.69 %; pamitic-2.38 %; stearic-15.72
%. Kết quả này khá phù hợp với kết quả xác định thành phần acid béo có trong dầu
gấc của các tài liệu tham khảo khác.Từ kết quả này có thể đưa ra kết luận rằng dầu
hạt gấc là một nguồn phong phú α-eleostearic.

Hình 2.22.Kết quả tách triglixerit có trong dầu hạt gấc.

А- mẫuG3; B- mẫu G1; С- mẫu М8
Bảng 2.10. Kết quả xác định thành phần của các triglixerit chính trong dầu hạt gấc
Tên Hàm lượng của các triglixerit (%) (n=5; ±0.9%)
mẫu αE3 αE2L αEL2 αE2О αELО αE2S αELS
М1 9.33 9.53 5.27 11.5 5.41 41.23 12.24
М2 9.04 13.17 9.27 17.45 9.13 22.73 10.26
М3 13.66 10.66 3.33 13.46 3.87 35.74 11.05
М4 12.87 12.87 4.21 14.15 3.98 36.18 8.98
М5 9.06 9.16 4.37 13.72 5.05 37.42 14.74
М6 22.18 13.50 3.87 14.11 4.13 24.34 8.62
М7 29.23 12.03 2.46 18.74 3.35 21.79 5.08
М8 39.36 10.58 0.95 7.15 1.28 22.97 4.12
G1 16.98 8.70 1.74 12.27 2.51 45.47 5.29
G2 5.77 8.55 4.86 10.31 4.98 44.42 9.75
G3 3.29 7.25 5.28 13.26 6.54 42.17 13.46
G4 5.31 7.01 4.44 12.23 4.68 49.07 10.81
G5 11.72 8.98 2.52 12.39 3.32 47.46 7.83
G6 7.34 7.93 4.61 13.13 5.01 43.84 10.48
G7 3.40 6.88 6.06 10.95 5.02 48.38 12.47

Bảng 2.11.Kết quả xác định hàm lượng dầu và thành phần của các triglixerit
có trong dầu hạt gấc.
Hàm lượng Hàm lượng của các triglixerit %

Tên
dầu (%) (n=5; ±0.4%)
mẫu
(n=3; ±1.14%) αE L O P S
M1 50.8 61.44 13.23 5.72 1.79 17.82
M2 52.2 58.89 17.75 9.9 2.46 11
M3 48.8 64.52 11.3 5.92 2.67 15.6
M4 51.2 64.57 12.01 6.17 2.19 15.05
M5 52.1 60.64 13.22 6.94 1.82 17.39
M6 48.4 67.94 11.68 6.18 3.03 10.99
M7 49.5 72.39 8.81 7.44 2.4 8.96
M8 51.7 72.01 6.10 3.10 1.70 9.03
G1 52.7 68.48 7.02 5.55 2.04 16.92
G2 50.9 61.44 13.23 5.72 1.79 17.82
G3 49.6 58.14 13.37 7.47 2.48 18.54
G4 48.8 61.23 10.96 5.77 2.08 19.96
G5 53.0 65.52 8.85 5.3 1.89 18.43
G6 52.8 61.57 11.36 6.76 2.2 18.11
G7 51.1 59.05 12.64 6.16 1.86 20.28
Trung
50.9 63.68 11.37 6.69 2.28 15.72
bình
Các triglixerit được kí hiệu theo các gốc axit trong phân tử triglixerit (không xét
đến sự phân bố khác nhau của các gốc trong phân tử). Ví dụ: L2O (di linoeat-
oleat) biểu thị cho triglixerit trong phân tử chứa 2 gốc axit linoleic và 1 gốc
oleic, L – gốc linoleic acid, O – gốc oleic, P – gốc panmitic, S – gốc stearic,
αE – gốc α-eleostearic acid.

KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này tôi đã đưa ra được phương pháp chiết tinh dầu hạt gấc
(momordica cochinchinesis) bằng dung môi hữu cơ trong đó sử dụng dung môi n-
hexan là thuận tiện, hiệu quả nhất và đánh giá được quá làm sạch tinh dầu bằng
phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết DIAPAK C để làm sạch dầu chứa gốc
axit với nối đôi liên hợp. Kết quả chỉ ra rằng với thời gian tiếp xúc với pha tĩnh đủ
lâu của chất phân tích thì thành phần triglixerit trong dầu bị phân hủy.
Đồng thời sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu đó và sử dụng phương pháp sắc kí
lỏng hiệu năng cao RP-HPLC tôi đã xác định được thành phần triglixerit có trong
dầu hạt gấc, kết quả chỉ ra rằng dầu hạt gấc chứa hàm lượng cao axit α-eleostearic
là một hợp chất có hoạt tính sinh học cao.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng
Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm
Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, “Cây thuốc và động vật
làm thuốc ở Việt Nam”, tập I, Nxb. Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, trang 734-
735, (2004).
2. Bộ Y Tế,“Kỹ thuật sản xuất dược phẩm”, tập 2, Nhà xuất bản Y học, (2007).
3. Võ Văn Chi, “Từ Điển Cây Thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học, trang 79,
(1999).
4. Bùi Minh Đức và cộng sự, “Bột Gấc và dầu Gấc. Hàm lượng cao β -
caroten, lycopen và α - tocopherol đảm bảo dinh dưỡng bền vững, phòng và
điều trị HIV/AIDS” trong tạp chí“Cây Thuốc Qúy”, số 17/2004, trang 20,
(2004).
5. Phạm Hoàng Lộ (1999), “Cây cỏ Việt Nam”, quyển I, Nhà xuất bản trẻ,
trang 568.
6. Nguyễn Quang Lộc và cộng sự, “Kỹ thuật ép dầu và chế biến dầu, mỡ thực
phẩm”, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, (1993).
7. Đỗ Tất Lợi, “Những cây thuốc và vị thuốc ViệtNam”, Nhà xuất bản Khoa
Học và Kĩ Thuật, Hà Nội, trang 335 – 337, (2004).
8. Thi Xuân Mi, “Thảo dược chữa bệnh” (Nguyễn Thanh Tùng dịch, BS. Ngọc
Tám hiệu đính), Nhà xuất bản Thanh Hóa, trang 62, (2002).
9. Thái Phan Quỳnh Như, “Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)”, Viện kiểm nghiệm Bộ Y Tế, (2001).
10. Thái Duy Thìn và cộng sự, “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) và đo quang phổ UV – vis để định tính và định lượng
các hoạt chất trong thuốc có từ 2 đến 5 thành phần”, Viện kiểm nghiệm
thuốc Bộ Y tế, Trường Đại học Dược Hà Nội, (2003).

11. Ngô Thị Thủy, “Dầu Gấc, thuốc qúy của người Việt”, trong tạp chí
“CâyThuốc Quý” số 19/2004, trang 21, (2004).
TIẾNG ANH
1. Żwir-Ferenc A., Biziuk M. “Solid Phase Extraction Technique –
Trends,Opportunities and Applications”,Polish J. Environ. Stud. 15, 677-690,
(2006).
2. V. Ruiz-Gutiérrez, M.C Pérez-Camino, “Update on solid-phase extraction for the
analysis of lipid classes and related compounds”, Journal of Chromatography A,
885, 321–341, (2000).
3. Ishida B.K., Turner C., Chapman M.H. et al, “Fatty Acid and Carotenoid
Composition of Gac (Momordica cochinchinensisSpreng) Fruit”, J.
Agric. Food Chem,52, 274–279, (2004).
4. Ruger, R., Niehaus, T., van Lenthe, E. et al. “Vibrationally resolved UV/Vis
spectroscopy with time-dependent density functional based tight binding”, J. Chem.
Phys., (2016).
5. Deineka, V.I., Staroverov, V.M., Fofanov, G.M., Balyatinskaya, L.N.,
“AnIncrementApproach to the HPLC Analysis of Triglycerides” Pharmaceutical
Chemistry Journal, 37, 392-395, (2002).

Đánh Giá Quy Trình Chiết Và Làm Sạch Tinh Dầu Từ Hạt Gấc Bằng Phương Pháp Phổ UV Và Sắc Kí Lỏng Hiệu Năng Cao HPLC

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Đánh Giá Quy Trình Chiết Và Làm Sạch Tinh Dầu Từ Hạt Gấc Bằng Phương Pháp Phổ UV Và Sắc Kí Lỏng Hiệu Năng Cao HPLC

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KIỀU THỊ LAN

ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH TINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Sinh viên thực hiện: Kiều Thị Lan

Kiều Thị Lan

Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

LỜI CAM ĐOAN

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Kiều Thị Lan

Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

1.4.5.6. Đầu dò. ................................................................................................................. 19

Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tên Tiếng Anh Tiếng Việt

SPE Solid – Phase Extraction Chiết pha rắn

 Wavelength Bước sóng

UV-VIS Ultraviolet-Visible Phổ tử ngoại khả kiến

High Performance Liquid Phương pháp sắc kí lỏng hiệu

Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

Kiều Thị Lan K40C – Sư phạm Hóa học

Kiều Thị Lan 1 K40C – Sư phạm Hóa học

Kiều Thị Lan 2 K40C – Sư phạm Hóa học

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

Hình 1.1.a.b: Gấc nếp

1.1.1.2. Mô tả thực vật

Kiều Thị Lan 3 K40C – Sư phạm Hóa học

Hình 1.2: Hoa và quả gấc Hình 1.3: Màng gấc

Hình 1.4: Hạt gấc

Kiều Thị Lan 4 K40C – Sư phạm Hóa học

1.1.2. Thành phần hóa học của quả gấc.

Số thứ tự Thành phần Giá trị (%)

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DẦU THỰC VẬT

Kiều Thị Lan 5 K40C – Sư phạm Hóa học

Kiều Thị Lan 6 K40C – Sư phạm Hóa học

Đường, Aminoacid, Saponin,

Kiều Thị Lan 7 K40C – Sư phạm Hóa học

1.2.2. Quá trình chiết

Kiều Thị Lan 8 K40C – Sư phạm Hóa học

Kiều Thị Lan 9 K40C – Sư phạm Hóa học

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN

Kiều Thị Lan 10 K40C – Sư phạm Hóa học

− Cơ chế hấp thụ pha đảo (reversed – phase)

Kiều Thị Lan 11 K40C – Sư phạm Hóa học

Kiều Thị Lan 12 K40C – Sư phạm Hóa học

Chất phân tích A+B+C

Kiều Thị Lan 13 K40C – Sư phạm Hóa học

t0: thời gian lưu chết.

Kiều Thị Lan 14 K40C – Sư phạm Hóa học

với α càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng.

Kiều Thị Lan 15 K40C – Sư phạm Hóa học

Số đĩa lí thuyết được tính theo công thức sau:

Hình 1.9. Cách tính hệ số khôngđối xứng của peak

Kiều Thị Lan 16 K40C – Sư phạm Hóa học

Kiều Thị Lan 17 K40C – Sư phạm Hóa học

1.4.5.1. Bình đựng dung môi