MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN ĐIỂM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP REAL-TIME PCR

I. Giới thiệu kỹ thuật real-time PCR
Là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq DNA
polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991. Là phương pháp nhân bản DNA đích
trong ống nghiệm thành nhiều bản sao dựa vào chu kì nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống
phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể
thấy được qua thiết bị đọc tín hiệu huỳnh quang chuyên biệt. Trong phản ứng real-time PCR,
người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch
đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc
hiệu (FAM, HEX ...)
Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA.
Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân
bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm
vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong
dung dịch). Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi
phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước
phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích đường cong nóng chảy
(Melting curve analysis).

Hình 1. Phương pháp real-time PCR với tác nhân phát huỳnh quang liên kết với mạch đôi DNA
(EvaGreen)

Tác tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò: đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA, Texas Red,
Cy3, Cy5, …, được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau:
(1) Mẫu dò lai (hybridization probe): gồm hai mẫu dò có vị trí bắt cặp gần nhau trên mạch
khuôn và một hoặc hai mồi (primer). Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích trong phản ứng
PCR. Mẫu dò phía đầu có mang nhóm hùynh quang ở đầu 3’ còn mẫu dò phía đuôi mang nhóm
huỳnh quang đầu 5’. Khi 2 mẫu dò bắt cặp trên cùng một trình tự DNA, nhóm hùynh quang
“cho” (donor dye) và nhóm “nhận” (acceptor dye) trên 2 mẫu dò sẽ gây ra hiệu ứng FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer). Hiệu ứng này được ghi nhận mỗi khi có sự bắt cặp
của mẫu dò 5’ và mẫu dò 3’ lên những trình tự mới được tạo thành trong quá trình PCR.

Hình 2. Phương pháp real-time PCR với mẫu dò lai

(2) Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe) với ví dụ thông dụng nhất là TaqMan probe (còn gọi là
kỹ thuật 5’ nuclease). Mẫu dò được đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát huỳnh quang (reporter
dye), và đầu 3’ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye). Nhóm “dập” sẽ ngăn sự phát
huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn. Trong quá trình tổng hợp
mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò,
khiến nó không còn chịu tác động của nhóm “dập”. Lúc đó nhóm “phát” sẽ phát tín hiệu huỳnh
quang và thiết bị tự động được ghi nhận.
 Hình 3. Phương pháp real-time PCR với mẫu dò TaqMan
(3) Mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe) điển hình như “Molecular beacon”: bao gồm một
trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm giữa hai trình tự lặp lại đảo ngược. Các nhóm
“phát” (reporter) và “dập” (quencher) được gắn vào hai đầu mút của mẫu dò. Do đó, sự phát
huỳnh quang không xảy ra khi mẫu dò ở dạng tự do (cấu hình “kẹp tóc”) trong dung dịch. Khi
mẫu dò bắt cặp với trình tự đích, nó sẽ duỗi dài khiến hai nhóm “phát” và “dập” tách xa. Lúc đó,
tín hiệu huỳnh quang được phát ra và ghi nhận.

Hình 4. Phương pháp real-time với mẫu dò “kẹp tóc” (molecular beacon probe)
 Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm lượng
sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng. Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được
các đầu dò của máy luân nhiệt real-time PCR thu nhận và xử lý. Khi cường độ tín hiệu huỳnh
quang của mẫu vựơt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu được
xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng –
Ct, Cycle Threshhold) để so sánh với một đường cong chuẩn (standard curve) đã biết để suy ra
nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu. Đường cong chuẩn được xây dựng từ
chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trước nồng độ.
2. Thành phần của phản ứng real time PCR:

 Master mix (Buffer, MgCl2, dNTPs, Taq polymerase).

 Mồi xuôi: 12.5pmol
 Mồi ngược: 12.5pmol
 Mẫu dò: 10pmol
 Nước cất vô trùng
 DNA bản mẫu
 ∑V = 25µl
3. Những chỉ tiêu chung đối với thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng real time PCR.
- Chiều dài mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, chiều dài thông thường dao
động 18-25bp. Tuy nhiên trong các trường hợp cụ thể thì chiều dài có thể dài hơn hoặc ngắn hơn
chiều dài chuẩn, giới hạn trong khoảng 15-30bp.
- Thiết kế các mồi với hàm lượng GC khoảng 50-60%. Các vùng với hàm lượng GC cao
hơn có thể không biến tính tốt trong tiến trình PCR, dẫn đến phản ứng kém hiệu quả. Tránh lặp
lại các nucleotide G hay C liên tiếp dài hơn 3 nucleotide. Tại đầu 3’ của mồi, cần có nucleotide G
hay C để tăng độ đặc hiệu cho bắt cặp.
- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi (Tm) cũng là thông số rất quan trọng. Dựa trên đó mà
chúng ta có thể quyết định nhiệt độ ủ (bắt cặp) trong chu trình PCR cho thích hợp. Theo nhiều
nghiên cứu, nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không nên quá 5 oC (lý tưởng là
2-3oC). Duy trì nhiệt độ nóng chảy Tm trong khoảng 50-650C.
- Mồi được thiết kế có nhiệt độ bắt cặp (lai) trong khoảng 55-60 oC để tránh sản phẩm
khuếch đại không đặc hiệu.
- Cấu trúc thứ cấp: cấu trúc này bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop - tự bắt cặp giữa
các nucleotide trong cùng một oligonucleotide), homo dimer (hai oligonucleotide giống
nhau tự bắt cặp) và hetero dimer (các oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau). Nếu
cấu trúc này càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ càng thấp vì nó sẽ góp
phần cản trở khả năng bắt cặp của các mồi vào trình tự đích. Để xác định độ bền vững
của các liên kết trên, người ta dùng một khái niệm là sự biến đổi năng lương tự do (Gibbs
free energy) ΔG (kcal/mole). Theo hãng IDT, giá trị tuyệt đối của ΔG liên kết thứ cấp
 càng lớn hơn -9 kcal/mole thì càng không ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR. Vì thế
cần điều chỉnh vị trí mồi tránh cấu trúc thứ cấp, nhất là tại đầu 3’.
 Self –dimer: cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của
các primer giống nhau.
 Hairpin loop: cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung gữa các base
trong cùng một primer.
 Hetero dimer: cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base
của các primer khác nhau.
- Chiều dài sản phẩm khuếch đại trong khoảng 75-150bp, không nên quá 150bp để hiệu
quả PCR có thể đạt được tối hảo.
Các yêu cầu đối với mẫu dò:
- Chiều dài mẫu dò không quá 30nu. Đối với trường hợp mẫu dò có kích thước ngắn để
đảm bảo cho nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò trong phản ứng hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi 5-
10oC có thể gắn vào mẫu dò một số chất là tăng nhiệt độ nóng chảy như MGB (minor groove
binder), LNA (locked nucleic acid),…
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của probe phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của primer khoảng
5 – 10oC nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với DNA mạch khuôn trong bước bắt cặp và
kéo dài của chu kỳ PCR.
- Không nên có G ở đầu 5’ vì G có thể hấp thu ánh sang huỳnh quang ngay cả khi mẫu
DNA bị phân giải bởi Taq polymerase.
- Tỷ lệ GC trong mẫu dò khoảng 30-80% với C nhiều hơn G.
- Vị trí bắt cặp của đầu 5’ của mẫu dò Taqman chỉ cách vị trí 3’ 2-5 nt của mồi bắt cặp trên
sợi đích, và rất quan trọng là đầu 5’ gắn reporter không phải là G vì G có thể là quencher cho rất
nhiều reporter.
- Lựa chọn reporter và quencher phù hợp.
Một số phương pháp dùng để phát hiện đột biến điểm dựa trên kỹ thuật real-time PCR
1. Allele Specific real-time PCR
Allele specific real-time PCR thực chất là phương pháp real-time PCR được tối ưu hóa
primer cũng như các điều kiện phản ứng cho mục đích phát hiện các đột biến điểm đặc trưng cho
allele (các trạng thái khác nhau của cùng một gene). Sự khác biệt chỉ với nucleotide này cũng đủ
để làm thay đổi tính trạng allele tương ứng trên gene. Để phát hiện được đột biến điểm (sai khác
một nucleotide) cần phải tìm ra điều kiện nhiệt độ lai khắc nghiệt sao cho sự khác biệt của một
nucleotide tại đầu 3’ tận cùng của primer so với khuôn DNA cũng đủ cho quá trình bắt cặp (và
khuếch đại) của primer không thể xảy ra. Dựa trên tín hiệu của chất phát huỳnh quang sẽ phân
biệt được chủng đột biến và chủng hoang dại.
 Khi thiết kế primer để phát hiện đột biến điểm, ta cần đặc biệt quan tâm tới nucleotide
cuối cùng ở đầu 3’OH. Sự sai khác của những nucleotide này so với DNA khuôn thường dẫn đến
primer không thể thực hiện được quá trình khuếch đại. Nguyên nhân nằm ở hoạt động của
enzyme Taq polymerase. Enzyme này hoạt động bổ sung nucleotide theo hướng từ đầu 5’ đến
đầu 3’ nên nó sẽ lắp nucleotide vào đầu 3’ tận cùng cho đến khi hoàn thành quá trình khuếch đại.
Sự sai khác một trong ba nucleotide cuối cùng ở đầu 3’ của primer so với DNA khuôn sẽ ức chế
quá trình này. Tận dụng đặc điểm này mà ta sẽ thiết kế primer cũng như tối ưu hóa phản ứng
real-time PCR sao cho phân biệt được các đột biến điểm.

Hình 1: Mồi bắt cặp với đột biến

Trong chiến lược thiết kế một mồi bắt cặp hoàn toàn với trình tự đột biến và có 1
mismatch ở nucleotide thứ nhất tính từ đầu 3 ‘OH khi bắt cặp với trình tự hoang dại đôi khi vẫn
có khả năng kéo dài ở chủng không đột biến với tỉ lệ thấp hơn. Để khắc phục tình trạng trên, có
thể tăng nhiệt độ gia tăng nhiệt độ bắt cặp của mồi để sản phẩm đặc hiệu hơn. Một hướng giải
quyết khác là thiết kế mẫu dò bắt cặp với đột biến điểm.

Hình 2: Thiết kế mẫu dò bắt cặp với đột biến

2. Phương pháp MGB Taqman real-time PCR (real –time PCR với mẫu dò Taqman được
gắn MGB)
Nguyên tắc
Trong kỹ thuật này, mix real-time PCR ngoài các thành phần cơ bản của mix PCR, còn chứa hai
thành phần quan trọng để mẫu dò có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của sản
phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: (1) mẫu dò Taqman, là những oligonucleotide có
trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích, và trình tự này dài khoảng 24-30nt với
đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang reporter còn đầu 3’ có gắn chất hấp thụ quencher để hấp
phụ được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter. (2) Enzyme Taq polymerase có hoạt
tính 5’-3’ exonuclease để có khả năng thủy giải cắt bỏ mẫu dò khi mẫu dò này bắt cặp trên sợi
khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung. Cơ chế phát huỳnh
quang của mẫu dò Taqman có thể tóm tắt như sau: (1) khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm
khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì mẫu dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh
quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của mẫu dò hấp phụ, ống thử
nghiệm sẽ không được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. (2) Khi có sự xuất
hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì mẫu dò Taqman sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm
này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp
nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của mẫu dò Taqman sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được
huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện
thì số lượng reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu.
Các đặc tính của 2 reporter FAM và VIC.

Kênh kính lọc

Bước sóng kích Bước sóng Kênh kích lọc
Tên reporter nguồn sáng
thích HQ phát ra huỳnh quanh
kích thích

Channel 1: Channel 1: 515-

FAM 495 520
475 – 495 nm 545 nm

Channel 2: 515- Channel 2: 565-

VIC 538 554
545 nm 585 nm