TÁCH CHIẾT ADN: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG

Nguyên lý tách chiết ADN

Tách chiết ADN là kỹ thuật cơ bản trong hầu hết các phòng thí nghiệm phân tử, di
truyền và sinh học nói chung. Phân tử ADN sau tách chiết cần đảm bảo được số lượng
và chất lượng để đáp ứng được các phân tích sau đó. Hiện nay trên thị trường có sẵn
rất nhiều bộ kít tách chiết ADN khá tiện dụng. Tuy nhiên, việc nắm rõ nguyên lý tách
ADN là quan trọng để giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cách thức hoạt động của bộ kít,
giải quyết vấn đề khi có lỗi sảy ra.
Cho đến nay đã có rất nhiều quy trình tách chiết ADN được đưa ra và báo cáo thành
công bởi nhiều nhà nghiên cứu. Đối với mỗi loại mô, tế bào quy trình tách chiết có thể
sẽ khác nhau. Dù vậy thì nguyên lý tách chiết ADN từ tế bào vẫn gồm các bước cơ
bản sau:
Bước 1: Phá màng
Bước 2: Loại bỏ protein
Bước 3: Kết tủa và thu DNA
Phương pháp tách chiết ADN truyền thống
Bước 1: Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong dung dịch chất tẩy
(SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi
trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với ADN.
 Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử
phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng.
 Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác
dụng phá màng nhẹ hơn.
Bước 2: Loại protein
Sau khi phá vỡ tế bào, ADN sẽ được trộn lẫn với các thành phần khác của tế bào chủ
yếu là protein trong dung dịch. Việc quan trọng lúc này là tách ADN ra khỏi thành
phần protein của tế bào. Để thực hiện bước này người ta chủ yếu sử dụng hỗ hợp
Phenol/Chloroform. Phenol-Chloroform không tan trong nước nhưng có khả năng làm
biến tính protein. Do đó, protein sẽ bị tủa lại khi gặp phenol. Trong khi đó ADN thì
không bị tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước. Khi ly tâm phenol/Chloroform nặng
sẽ lắng xuống dưới, protein tủa sẽ nằm tại danh giới của nước và phenol, còn ADN thì
nằm lại trong pha nước ở phía trên. Thu pha nước chứa ADN này để thực hiện các
bước tiếp theo.
Bước 3: Kết tủa nucleic acid
Sau bước tủa protein, ADN thu được nằm trong dung dịch với dung môi là nước. Sử
dụng Ethanol hoặc Isopropanol để tủa ADN trong dung dịch. Sau đó ly tâm để thu cặn
ADN. Cặn ADN này có thể được rửa trong Ethanol 70% một hoặc hai lần để làm sạch
mẫu. Tiếp theo để cho bay hơi cồn và huyền dịch hóa cặn ADN thu được trong đệm.
Một số kit tách chiết ADN thương mại
Nhìn chung thì hầu hết các kít tách chiết ADN thương mại hiện nay đều phát triển
theo nguyên lý chung gồm ba bước như đã đề cập bên trên. Sau đây chúng tôi xin giới
thiệu đến các bạn một số kít tách chiết phân tử ADN phổ biến trên thị trường.
DNAzol ™ Reagent
Dùng để tách DNA từ các mẫu rắn (mô) và lỏng (máu)
Kit này sử dụng dung dịch chất tẩy rửa là Guanidine, nó cho phép chọn lọc kết tủa
DNA từ dung dịch tế bào sau khi ly giải.
Khả năng phân lập và thu hồi DNA nhanh: sau mẫu sinh học được bổ sung với
DNAzol ™ Reagent, DNA sẽ được tủa với ethanolà DNA có thể được hòa tan trong
nước hoặc 8mM NaOH. Toàn bộ quy trình có thể được hoàn thành trong 10-30 phút
với hiệu quả thu hồi DNA 70-100%.
PureLink™ Genomic DNA Mini Kit
Dùng bộ kit này để tinh lọc DNA gen từ máu, mô, tế bào, vi khuẩn, swabs và đốm
máu, sử dụng cột spin-column dựa trên silica, vi ly tâm.
PureLink® Genomic DNA Mini Kit bao gồm các bộ phận và các giao thức cải tiến
theo các phương pháp cột spin quen thuộc dễ sử dụng và quen thuộc đang được sử
dụng .Cột mới được cấu hình để liên kết và giải phóng DNA hiệu quả hơn. Mỗi nguồn
mẫu sử dụng một quy trình tách chuyên biệt và một bộ đệm lysis được tối ưu để tăng
cường hoạt tính proteinase K và loại bỏ ô nhiễm protein. Một muối hỗn hợp đệm thúc
đẩy sự liên kết bền vững của DNA đến nhựa cột, và bộ đệm rửa mạnh mẽ loại bỏ tất
cả dấu vết của protein và muối. DNA được tách trong dung dịch muối thấp để cho
phép ổn định pH của DNA trong quá trình bảo quản.
MagMAX™-96 DNA Multi-Sample Kit
MagMAX™ DNA Multi-Sample 96-Well Kits được thiết kế để làm sạch nhanh
chóng, chất lượng DNA từ nhiều loại mẫu khác nhau bao gồm máu và mô, đuôi chuột,
miếng gạc má, lông trâu và tế bào nuôi cấy.
Bộ kit này sử dụng công nghệ phân tách axit nucleic Magnetic dựa trên hạt nhân để
tạo ra sản phẩm DNA tinh lọc cao, không chứa chất ức chế có thể ảnh hưởng đến các
phản ứng như xét nghiệm gen, CE và thế hệ tiếp theo, và phân tích nóng chảy ở độ
phân giải cao. Bộ dụng cụ 96-prep và 5x 96-prep được thiết kế cho việc xử lý định
dạng tự động và thông lượng cao hơn.
Bộ MagMAX™ DNA Multi-Sample 96-Well cũng mang lại sản lượng DNA cao từ
các mẫu giàu chất béo hoặc glycogen, như các mô não và gan.
TÁCH PLASMID
1. Nguyên lý tách plasmid

Việc tách plasmid ra khỏi ADN hệ gen (genome) là rất khó khăn. Tuy nhiên người ta
có thể dựa vào sự khác nhau về mặt lý hóa của 2 loại ADN, bao gồm: kích thước, hình
dạng, cấu trúc chung. Plasmid là những phân tử ADN nhỏ, mạch vòng, thường ở dạng
siêu xoắn, có khả năng tái bản độc lập và có kích thước 0.05 – 10% kích thước của
nhiễm sắc thể vi khuẩn. Trên cơ sở đó, người ta tiến hành dùng các hóa chất có tác
dụng phá vỡ các liên kết hidro giữa các nucleotide của cả ADN plasmid và ADN
genome dẫn đến ADN bị biến tính. Sau đó, tiến hành hồi tính: ADN hệ gen không thể
hồi tính do kích thước lớn và dễ dàng loại bỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, ADN plasmid
ở dạng siêu xoắn (supercoiled configuration) có đặc điểm là dễ dàng phục hồi lại hình
dạng ban đầu dưới điều kiện hồi tính.

2. Một số phương pháp tách plasmid ở vi khuẩn.

o Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm

tách plasmid
 Tế bào vi khuẩn được xử lý với dung dịch chứa SDS và NaOH. Trong đó’
 SDS: biến tính protein – phá vỡ màng tế bào.

 NaOH: làm biến tính ADN genome và ADN plasmid.

 Sau đó, hỗn hợp được trung hoà bằng potassium acetate (CH 3COOK) à
ADN plasmid sẽ được hồi tính nhanh chóng và hoà tan trong dung dịch, còn
ADN genome và các protein khác bị kết tủa và giữ lại trong phức hợp SDS-
kali à ly tâm lại tủ và thu ADN plasmid tinh sạch.
 o Phương pháp đun sôi

 Vi khuẩn có chứa ADN plasmid được phá vỡ bằng lysozyme, Triton-X100

và nhiệt độ à DNA genome vẫn bám vào màng tế bào vi khuẩn, còn DNA
plasmid được giải phóng và hoà tan trong dung dịch.

 Thu nhận ADN plasmid bằng cách tủa với alcohol.

o Phương pháp dựa bào Lithium

 Xử lý mẫu với hỗn hợp Triton X-100/LiCl à màng trong của tế bào vi khuẩn
bị phân huỷ.

 Bổ sung phenol/chloroform à biến tính và kết tủa các protein nội bào. Đồng
thời, tế bào sẽ co lại nhanh chóng và đẩy dung dịch nội bào (có chứa ADN
plasmid) ra ngoài; ADN genome và protein sẽ bị giữ lại trong sinh khối tế
bào.

 Ly tâm à thu ADN plasmid

3. Phương pháp truyền thống trong tách chiết plasmid


Cấy chuyển 1 khuẩn lạc vào 5 ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh và
nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 37o

Chuyển dịch nuôi cấy vào các ống effendorf 1.5 ml và ly tâm 5000
vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi.

Hoà tan tế bào trong 200 ml dung dịch I (GTE solution) dẫn đến phá vỡ
màng tế bào, voltex mạnh để tế bào trộn đều trong dung dịch. Để ở nhiệt độ
phòng trong 5 phút.

Bổ sung 200 ml dung dịch II (0.2N NaOH, 1% SDS) dẫn đến biến tính ADN
NST, lắc nhanh vài lần, ủ hỗ hợp trong đá 5 phút.

Bổ sung 300 ml dung dịch III để lạnh, vortex nhẹ, ủ hỗ hợp trong đá 10
phút.

Ly tâm 14000 vòng/phút, 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Hút phần dịch sang một ống effendorf mới, bổ sung 0.5 ml isopropanol hoặc
ethanol 100% lạnh, vortex.

Ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi.

Rửa tủa bằng cách thêm từ từ 0.5 ml ethanol 70%, chắt bỏ cẩn thận, không
làm mất tủa.

Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 10 – 15 phút.

Nhẹ nhàng hoà tan tủa trong 100 đệm TE 1X. Bảo quản ở -20o

4. Một số kit tách chiết DNA plasmid

 Plasmid Extraction Kit – Invitrogen: dùng để tách chiết DNA từ vi khuẩn.

 Plasmid Extraction Kit – Invitrogen: có thể tách chiết được 10µg DNA
plasmid, độ tinh sạch cao, sử dụng LyseBlue cho sự phân tách tối ưu và thu
tối đa sản lượng DNA

 Kit QIAprep Spin Miniprep: có thể tách chiết lên đến 20µg DNA plasmid
với độ tinh sạch cao, thời gian nhanh. Khả năng tách cao hơn khi sử dụng
High-Yield Supplementary Protocol (lượng tách được là 30µg)

 ChargeSwitch™ NoSpin Plasmid Micro Kit: Kích cỡ mẫu 0,5-1 ml nuôi cấy
qua đêm; Năng suất tiêu biểu lên tới 5 μg, tránh được các chất gây ô nhiễm
enzym cho kết quả tốt hơn và tối ưu hóa cho qua trình tự động hóa. Chất
phản ứng NoSpin mới tạo ra sự kết tụ tế bào vi khuẩn và cho phép các tế
bào được viên kết tụ mà không cần ly tâm.

 ChargeSwitch™ Plasmid ER Mini Kit: sử dụng công nghệ hạt từ tính cho
phép tinh sạch DNA plasmid nhanh chóng và hiệu quả từ 1-5 ml nuôi cấy vi
khuẩn qua đêm mà không sử dụng muối hỗn hợp, dung môi hữu cơ hoặc
ethanol và tách được 20 μg DNA plasmid với tổng thời gian khoảng 10 phút
sau khi chuẩn bị mẫu.
Tối ưu hóa cho việc chiết xuất DNA có độ tinh khiết cao hơn
• Cải thiện hiệu suất với giá đỡ từ đi kèm
ĐIỆN DI ADN-Protein
Nguyên tắc chung của phương pháp điện di
Điện di là quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dưới tác
dụng của dòng điện. Trong quá trình điện di, phân tử tích điện sẽ di chuyển về điện
cực có điện tích trái dấu với nó, việc phân tách nhau của các chất là theo khối lượng.
Một hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau
và được phân tách.
Mục đích: dùng để tách, phân tích các phân tử như ADN, ARN hay protein dựa trên
đặc điểm vật lý của chúng như: kích thước, hình dạng.
2. Một số phương pháp điện di
Các phân tử protein, acid nucleic có thể chạy điện di trên một khuôn đỡ như: giấy,
cellulose acetatem gen tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật
điện di trên giá rắn (agarose hoặc polyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất.
 Gel polyacrylamide: phân tách phân tử protein và các phân tử DNA có chiều
dài <1kb.
 Gel agarose: phân tách hiệu quả các phân tử DNA hoặc RNA có kích thước
từ 20 bp – 20 kb.
o Điện di trên gel agarose
1. Nguyên tắc
Các phân tử acid nucleic có khối lượng và điện tích khác nhau, được tách khi di
chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và
cường độ thích hợp.
Tốc độ di chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào: kích thước, cấu trúc
phân tử, nồng độ gel, lực điện trường…
2. Các yếu tố ảnh hưởng
 Kích thước phân tử: phân tử có kích thước càng lớn thì tốc độ di chuyển
càng chậm.
 Nồng độ gel:các đoạn DNA mang kích thước khác nhau, dịch chuyển ở các
tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.
 Cấu trúc DNA: DNA dạng vòng đóng, vòng đứt hay mạch thẳng sẽ dịch
chuyển với tốc độ khác nhau khi cùng một khối lượng.
  Thành phần base và nhiệt độ: điện di DNA trong gel agarose không bị ảnh
hưởng nhiều bởi base hoặc nhiệt độ.
3. Quy trình

điện di
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose
 Bước 2: Tra mẫu vào giếng
 Bước 3: Nhuộm DNA bằng
EtBr: Là thuốc nhuộm ADN/ARN được sử dụng phổ biến nhất cho tới nay.
Nó có thể được sử dụng để nhuộm gel sau khi hoàn thành quá trình điện di,
hoặc trộn với đệm diện di, hoặc trộn vào gel. Độ nhạy của EtBr cũng rất
cao, nó có thể phát hiện lượng ADN chỉ với 1 ng. EtBr có khả năng tự mình
chèn vào giữa base nito của sợi xoắn kép ADN. Ethidium bromide có độ hấp
thụ cực tím UV ở mức 300 và 360 nm. Ngoài ra, nó có thể hấp thụ năng
lượng từ các nucleotide bị kích thích bởi hấp thụ bức xạ 260 nm. EtBr phát
ra ánh sáng vàng/cam xung quanh bước sóng 590 nm. Nó có khả năng phát
hiện ADN rất nhạy, nhưng lại là chất gây đột biến tiềm tàng và có độc tính.
Do đó nếu sử dụng Ethidium Bromide cần hết sức cẩn thận trong quy trình
nhuộm và xử lý rác thải.
Họ thuốc nhuộm SYBR: Đây là dòng sản phẩm hóa chất nhuộm gel an toàn
được sản xuất bởi Invitrogen. Những sản phẩm thuộc dòng SYBR rất nhạy,
và là một chất thay thế hiệu quả cho Etbr. Có 3 sản phẩm đã được Invitrogen
thương mại hóa là: SYBR®Gold, SYBR®Green, and SYBR®Safe. Mỗi
sản phẩm này có ưu và nhược điểm riêng. SYBR®Gold thì có thể phát hiện
tới 25 pg ADN. Nó có thể được kích thích sử dụng UV hoặc ánh sáng xanh
(để tránh đứt điểm Nicking of DNA). SYBR®Gold cũng có thể sử dụng trực
 tiếp trong điện di. SYBR®Green chỉ sử dụng nhuộm gel sau PCR nhưng
không sử dụng trong quá trình điện di. SYBR®Green có thể sử dụng để
thực hiện Realtime PCR. Tuy nhiên, SYBR®Gold, SYBR®Green được coi
là chất có nguy cơ gây ung thư, và cũng là chất độc với môi trường. Ngược
lại SYBR®Safe lại không độc và thân thiện với môi trường. Nó cũng có thể
được sử dụng trong quá trình điện di (trộn vào gel) và sử dụng ánh sáng
xanh làm nguồn sáng kích thích.
Chú ý: Kính lọc sắc sử dụng cho chụp ảnh gel nhuộm bằng Ethidium
Bromide không thể sử dụng cho lọc sắc với ánh sáng phát ra từ SYBR. Do
đó khi sử dụng bạn cần lựa chọn đúng kính lọc sắc thích hợp
 Bước 4: Quan sát và chụp ảnh
4. Ứng dụng
Ước lượng kích thước của các phân tử DNA.
 Phân tích các sản phẩm PCR.
 Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế.
5. Ưu, nhược điểm
Ưu điểm: gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu và mẫu dễ thu hồi.
 Nhược điểm: gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị
tiêu hao và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.
o Điện di polyacrylamide
1. Nguyên tắc
 Dùng để phân tách các phân tử protein, các đoạn DNA, RNA. Gel được rót
vào giữa hai tấm kính được ngăn cách bởi các miếng đệm để ngăn không
cho polyacrylamide tiếp xúc với không khí.
 Chiều dài của gel: 10 – 100 cm.
 Nồng độ gel: 3.5% – 20% ( tuỳ thuộc vào kích thước của phân tử protein
hoặc DNA).
2. Điện di không biến tính
 Ít ảnh hưởng đến hoạt tính, cấu trúc của các chất cần phân tách.
 Điện di trong môi trường đệm ở pH kiềm (8-9) nhằm để các protein tích
điện âm.
  Đối tượng: protein, DNA
3. Điện di biến tính
 Trong điện di biến tính: đệm mẫu và đệm chạy protein được bổ sung thêm
các chất sau:
 SDS (Sodium dodesyl sulphate): phá vỡ cấu trúc bậc 2, 3 của protein và làm
cho cấu trúc hcuooix protein duỗi thẳng ra và toàn bộ phận tử tích điện âm.
 Các chất khử: β – mecaptoethanol (β-ME) hay DTT có tác dụng cắt cầu
ddisulfide (-S-S-) ở nhiệt độ 95oC – 100oC à giúp protein tồn tại ở dạng
chuỗi polypeptide tách dời nhau.
 Đới tượng: protein.
4. Các bước tiến hành
 Bước 1: Chuẩn bị mẫu
 Bước 2: Tra mẫu và chạy điện di
 Thể tích mỗi giếng 10 – 25 µl.
 Lượng mẫu tuỳ độ nhạy của phương pháp nhuộm.
 Tốc độ điện di 5-8 Vol/cm.
 Bước 3: Nhuộm gel
 Bước 4: Xử lý kết quả
KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT
Kỹ thuật Southern blot là phương pháp lai giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA.
Southern Blot cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen
hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào.

1. Nguyên lý kỹ thuật southern blot

 Dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA.

 Dựa vào nguyên tắc bổ sung giữa các cặp nucleotide: A-T, G-C (các đoạn
polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung).

 Màng lai nitrocellulose hay nylon có khả năng tiếp nhận DNA.

2. Nguyên tắc lai southern blot

 Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hoá chất gây biến tính DNA ( NaOH,
Formandehyt).

 Đòi hỏi một đoạn DNA (RNA) đã biết trình tự để làm mồi “Probe”. Probe
được đánh dấu.

 Các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting,
buồng lai, máy PCR.

3. Quy trình

 Giai đoạn 1: Tách chiết và làm biến tính các DNA thành sợi đơn

o Tách chiết DNA cần nghiên cứu

o DNA được cắt bởi các enzyme giới hạn (RE) thành các đoạn kích
thước khác nhau.

o Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose

o DNA mạch kép được xử lý với kiềm, biến tính thành DNA mạch
đơn ngay trên gel.
  Giai đoạn 2: Chuyển DNA từ gel agarose lên màng lai (nylon hoặc
nitrocellulose)

 Chuyển DNA vừa biến tính lên màng lai

 Màng lai sau quá trình trên được xử lý nhiệt hoặc chiếu tia UV để cố định
DNA trên màng.

 Giai đoạn 3: Lai với mẫu dò và kiểm tra bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi.

 Lai các DNA cố định trên màng lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ, biotin
hoặc mẫu dò phát quang sinh học. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ
sung của các mẫu dò với DNA cố định.

 Sau quá trình lai, màng lai được rửa để loại các mẫu dò không bắt cặp cặp
chuyên biệt với DNA trên màng.

 Cuối cùng, nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi (đối với đầu dò đánh dấu phóng
xạ), phương pháp so màu (với đầu dò đánh dấu bằng biotin) hay dựa vào sự
phát quang (với các đầu dò phát quang sinh học) để định vị DNA –probe.

kỹ thuật southern blot

4. Ứng dụng của kỹ thuật southern blot

 Southern blot được sử dụng dể đánh giá bản copy của gen trong genome,
xác định các intron, exon, các đoạn bị đột biến thêm hoặc mất đoạn…

 Khi sử dụng các DNA marker khác nhau làm mẫu dò, có thể phân biệt được
các loài, các loài đồng hình.

 Southern blot – RFLP: giúp phát hiện sự đa dạng chiều dài các đoạn cắt bởi
RE, qua đó, nhận biết sự sai biệt di truyền ở vị trí nhận biết của các RE dẫn
đến sai biệt trong chiều dài của các đoạn DNA tạo ra từ RE đó. Đồng thời,
RFLP còn sử dụng để xác định huyết thống, lập bản đồ giới hạn gen.

 Chẩn đoán bệnh thai nhi.

II. Northern blot
Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, người
ta đã dùng một phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là
Northern blot. Phương pháp này còn được gọi là Northern blotting, phương pháp lai
Northern hay phương pháp lai RNA.
- Nguyên lý: tương tự kĩ thuất southern blot
Nguyên tắc: Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách bằng điện di trên gel agarose.
- RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên
vị trí như ở trên gel).
- RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu
phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish
peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép.
- Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu
phóng xạ.
Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu.
Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc
phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.
Ứng dụng:
Phương pháp Northern blot cho phép phát hiện sự có mặt, xác định kích thước,
trọng lượng phân tử, khối lượng mRNA ở trong các mẫu khác nhau. Ðây là một
phương pháp rất tốt để phân tích sự biểu hiện của gen khi chúng ta cần định lượng để
phân biệt sự khác nhau giữa hai mẫu và nó rất nhạy bởi vậy chúng ta có thể điện di
một lượng lớn RNA tổng số hoặc mRNA trên gel.
 WESTERN BLOT NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG

Western blot là phương pháp phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel
SDS-PAGE, thường chỉ sử dụng kháng thể có gắn phóng xạ hoặc gắn huỳnh quang để
phát hiện một loại protein nào đó, được dùng rộng rãi trong chẩn đoán HIV, viêm gan.

1. Nguyên lý kỹ thuật western blot

Là kỹ thuật lai giữa protein với protein (giữa kháng nguyên với kháng thể) protein
kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.

Trong Western Blot, một hỗn hợp protein được phân tách bằng điện di SDS-PAGE,
miếng gel được ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS) – là một tác nhân biến tính
protein. Các vạch protein được chuyển lên màng nitrocellulose và từng vạch protein
được phát hiện bằng cách ngâm màng cellulose với kháng thể đơn dòng và đa dòng có
gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm. Nếu protein quan
tâm được kết hợp bởi kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí của nó trên các điểm có thể
được phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm film X quang.

2. Nguyên tắc

 Bước 1: Xử lý mẫu

Lấy mẫu từ mô thực vật hoặc động vật hay môi trường nuôi cấy. Đầu tiên xử lý rắn
bằng phương pháp cơ học sử dụng máy nghiền. Thêm vào các chất tẩy rửa, muối và
dụng dịch đệm để ly giải tế bào và hoà tan protein.

 Bước 2: Điện di trên gel

Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa
trên điểm đẳng nhiệt, khối lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp các yếu tố trên.

Phương pháp điện di phổ biến nhất là điện di trên gel polyacrylamide và có bổ sung
sodium dodecyl sulfate (SDS).

 Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai

Người ta sử dụng phương pháp thẩm tách điện để chuyển protein từ gel lên màng lai,
sử dụng một dòng điện để kéo dài các protein từ gel lên màng PVDF hoặc
nitrocellulose.

 Bước 4: Xử lý màng lai

Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên thường thực hiện các bước để ngăn
chặn liễn kết giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác định protein mục tiêu.

 Bước 5: Quá trình lai và phát hiện vị trí lai

Để phát hiện các protein chuyên biệt, màng được dò protein quan tâm bằng kháng thể
đã biến đổi có khả năng liên kết với enzyme thông báo, enzyme này kết hợp với một
cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang và tạo màu. Quá trình này diễn
ra gồm 2 bước:

 Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp.
 Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục
gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) có gắn enzyme. Tiếp tục ủ màng
lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Đặt một tấm phim
nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do
enzyme.

3. Ứng dụng

 Xác định sự hoạt động của gell thông qua sự có mặt của protein trong mô.

 Nhận dạng protein mục tiêu.

 Đánh giá tính chuyên biệt của kháng thể.

 Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra: thử nghiệm khẳng định HIV,
viêm gan B.

 Năm 2002, đã ứng dụng thành công phương pháp Western Blot trong việc xác định
kháng nguyên giun đũa chó trên thỏ, mở ra một hướng đi mới trong việc xét nghiệm
chẩn đoán chính xác các bệnh ký sinh trùng trên người.
Trích li từ AND Trích li từ RND Trích li từ protein
của tế bào của tế bào của tế bào
Cắt bằng enzim
cắt giới hạn
Làm biến tính Làm biến tính
bằng focmaldehyt bằng SDS
Chạy trên gen Chạy trên gen Chạy trên gen
agarose thường agarose thường poluacrylamid
dùng dùng thường dùng
Làm biến tính
DNA với alkil
Chuyển lên màng Chuyển lên màng Chuyển lên màng
nitrocellulose nitrocellulose nitrocellulose
bằng hoạt động bằng hoạt động bằng điện di
mao dẫn mao dẫn
Tắc nghẽn với Tắc nghẽn với Tắc nghẽn với
DNA dư RNA dư protein dư
Lai với mẫu dò Lai với mẫu dò Lai với mẫu dò
DNA được đánh DNA được đánh kháng thể được
dấu dấu đánh dấu hoặc
enzim được đánh
dấu phóng xạ
Phóng xạ tự ghi Phóng xạ tự ghi Phóng xạ tự ghi
hay thể hiện rõ
với chất nền có
màu
KỸ THUẬT PCR
Kỹ thuật PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc
một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp luỹ thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu
bản sao của một trình tự DNA nào đó. Do đó kỹ thuật PCR hiện được ứng dụng rất
nhiều tại các phòng thí nghiệm. Ví dụ để xác định sự có mặt của đoạn ADN nào đó, có
thể tách chiết ADN sau đó tiến hành điện di để xác định kết quả.

1. Nguyên lý kỹ thuật PCR

 Phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA invitro
của DNA poly,merase, thông qua các chu kỳ lặp lại của phản ứng tổng hợp
để nhân bane các đonạ DNA quan tâm lên hàm mũ.

 Kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn DNA (gen) khác nhau lên hàng
triệu làn so với ban đầu.

 Để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta cần phải biết được trình tự
nucleotide ở hai đầu của đoạn DNA đó đẻ thiết kế cặp mồi đặc hiệu.

2. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản:

 Bước 1: Biến tính hay tách sợi DNA lép thành sợi đơn

Nhiệt độ: 94-95oC

Thời gian: vài chục giây đến vài phút.

 Bước 2: Gắn mồi vào sợi DNA

Nhiệt độ tuỳ thuộc vào Tm của mồi.

Thời gian: 30-60 giây

 Bước 3: Kéo dài chuỗi mới

Nhiệt độ: 72oC

Thời gian: 30s đến vài phút.

3. Một số nguyên tắc thiết kế mồi

 Dựa trên trình tự nucleotide đã biết của đối tượng nghiên cứu hoặc đối
tượng liên quan.

 Dựa trên độ lớn của genome, chiều dài nên đủ lớn sao cho 4 n sẽ lớn gấp đôi
genom (18-24 nt).

 Trình tự nên có 50 – 60% G+C, Tm của hai primer phải gần như nhau.

 Tránh những trình tự giàu GC hay lặp lại.

 Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa hai primer, đặc hiệu là ở đầu 3’.

 Nên có trình tự ở đầu 5’ có luên kết bền với khuôn.

 Phần đặc hiệu ở đàu 3’ và nên kết thúc bằng GG, GA, AG.

4. Ưu, nhược điểm

o Ưu điểm

 Thời gian thực hiện nhanh.

 Đơn giản, ít tốn kém.

 Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.

 Phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn hay đột biến điểm.

 Dùng để định lượng so sánh bằng cách cho tiến hành khuếch đại đồng thời
trình tự đích và một trình tự đối chứng có nồng độ đã biết.

o Nhược điểm

 Kích thước trình tự cần khuếch đại.

 Sự ngoại nhiễm.
 Các sai sót gây ra do Taq polymerase.

5. Ứng dụng kỹ thuật PCR

 Nhận dạng sinh vật

 Phát hiện các đột biến gen

 Nhân dòng gen

 Định lượng các thể gây bệnh/ nhiễm độc

 Nghiên cứu sự biểu hiện gen

 Tạo đột biến định vị.

6. Một số cải biến của kỹ thuật PCR

o PCR lồng – Nested – PCR

 PCR lồng làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu
do sự khuếch đại ADN không đặc hiệu. Sử dụng hai cặp mồi trong hai phản
ứng PCR liên tiếp. Trong phản ứng đầu tiên, một cặp mồi được sử dụng để
tạo ra các sản phẩm ADN, bên cạnh đoạn ADN đích mà phản ứng hướng
đến vẫn có thể bao gồm các đoạn ADN khuếch đại không đặc hiệu. Các sản
phẩm sau đó được sử dụng tiếp phản ứng PCR thứ hai với cặp mồi mà vị trí
gắn khác hoàn toàn hoặc khác một phần từ vị trí 3′ của mỗi mồi ở phản ứng
đầu tiên

o PCR đa mồi (Mutiplex PCR)

 Khuếch đại nhiều trình tự DNA trong một phản ứng PCR bằng cahsch sử
dụng nhiều cặp mồi.

 Xác định các đột biến mất đoạn và lặp đoạn trong các bệnh di truyền.

 Ưu điểm:

 Khác phục được âm tính giả.

 Hiệu quả cao

 Xác định được chất lượng, hàm lượng khuôn.

 RT-PCR

 PCR phiên mã ngược dùng để khuếch đại ADN từ ARN. Enzyme phiên mã
ngược sao mã ngược ARN tạo thành ADNc, sau đó ADNc này được khuếch
đại bằng PCR. RT – PCR được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gene, để
xác định sự biểu hiện của một gen hoặc để xác định trình tự của một bản sao
mã ARN, bao gồm cả vùng khởi đầu và kết thúc phiên mã.