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    Paul Berg Herbert Boyer CAPITULO Tecnologia del DNA recombinante En nuestro capitulo final, describiremos una tecnologia que se ha converti- do, en menos de dos décadas, en una herramienta fundamental para el avance de la bioguimica. Ayuda a definir las fronteras bioguimicas presen- tes y futuras, a la vez que ilustra muchos principios importantes. Mientras ‘que las leyes que gobieman la catélisis enzimatica, las estructuras macro- moleculares, el metabolismo celular, y las rutas de informacion, continiian sin estar totalmente aclaradas, la nueva investigacion se dirige hacia proce- sos bioquimicos todavia mas complejos. La divisiOn celular, la respuesta inmune, los procesos de desarrollo en eucariotas, la visi6n, el gusto, la oncogénesis, los procesos cognitivas del cerebro del lector al leer estas palabras, todos ellos estan dirigidos por una elaborada sinfonta de interac- ciones moleculates y macromoleculares. Mientras aumentan los esfuerzos dedicados a la comprensién de la bioguimica que se encuentra detrés de ‘estos procesos, empiezan a verse claras las verdaderas expectativas € implicactones de la exploracion bioquimica emprendida en el siglo dieci- rhueve. El ser humano no sélo puede comprender la vida; también puede modificarla, La aproximacién bioquimica para comprender un proceso bioldgico complejo es el aislamiento y estudio in vitro de los componentes individua- les, con la finalidad de comprender el proceso global de un organismo entero. Quiz, la fuente més importante y fértil de ideas sobre estos procesos sea precisamente el almacén de informacion celular, es decir, el DNA. Sin embargo, el imponente tamaho de los cromosomas celulares constituye una enorme dificultad. ;Cémo se puede encontrar y estudiar un gen particular que codifique para una proteina 0 molécula de RNA con una funcion molecular que solo podemos estimar aproximadamente, cuando ‘ese gen es s6lo uno de los 100.000 genes distribuidos entre los miles de nnillones de pares de bases que constituyen el genoma de un mamifero? Las respuestas empezaron a aparecer a mediados de la década de los afios se- tenta Décadas de avances en genética, bioquimica, biologia celular y fisica quimica se dieron encuentro en los laboratorios de Paul Berg, Herbert Boyer y Stanley Cohen, para producir técnicas de localizacién, aislamiento, reparacion y estudio de pequefios segmentos de DNA, derivados de cromosomas mucho mayotes. En conjunto, estas técnicas se conocen ‘como elonactén de DNA. La clonacién de DNA ha abierto oportunidades inimaginables hace s6lo unas décadas, incluyendo la identificacién y el estudio de genes implicados en casi todos los procesos biolégicos conoci- dos. Estos nuevos métodos estén transformando la investigacion basica, la agricultura, la ciencia forense, la medicina, la, ecologfa, y muchos otros ‘campos, mientras que por otra parte han introducido en nuestra sociedad la necesidad de optar entre desconcertantes alternativas, generando serios, problemas éticos. Capitulo 28 Tecnologia del DNA recombinante Revolucionaria como es, esta tecnologta esta basada en los principios biol6gicos y bioquimicos mas fundamentales. Las dos primeras partes de este capitulo remarcan estos fundamentos, resumiendo nuestro conox miento actual sobre la quimica y los enzimas del metabolismo de los acidos ucleicos descritos en los cinco capitulos anteriores. Posteriormente, nos referiremos a los temas que ayudan a ilustrar el amplio margen de aplica- ‘clones y la potencialidad de esta tecnologia, Clonacién de DNA: fundamentos Clonar significa hacer copias idénticas; es un término que en principio sélo se referia al procedimiento de aislar una célula de una gran poblacién y Permitir su reproduccién para generar muchas células idénticas. De este modo, se disponia de suficientes cantidades de un Gnico tipo celular para su estudio. Analogamente, la clonacién de DNA comporta la separacién de lun gen especifico o fragmento de DNA de su cromosoma, mucho mayor, ¥ la unién a una pequefta molécula de DNA portador, para replicar este DNA ‘modificado mil e incluso millones de veces. El resultado es una amplifica- cidn selectiva de un gen o fragmento de DNA particular. La clonacion de un fragmento de DNA, bien sea procariético © eucariético, comporta cinco procedimientos generales: 1, Un método para cortar el DNA en una localizacién precisa, El descubrimiento de las endonucleasas especificas de secuencia (en- donucleasas de restriccién) permitié disponer de las tijeras molecu- lares necesarias, 2. Un método para unir covalentemente dos fragmentos de DNA. La DNA ligasa puede hacerlo. 3. Selecci6n de una molécula de DNA pequefia capaz de autorreplicar- se. Los segmentos de DNA que se quieren clonar pueden unirse a plésmidos 0 a DNA viricos (vectores de clonaci6n). Aquellas molé- culas de DNA compuestas que contienen unidos covalentemente segmentos derivados de una o més fuentes se denominan DNA re- combinantes, 4, Un método para trasladar el DNA desde el tubo de ensayo hacia el interior de una célula huésped que ofrece la maquinaria enzimética necesaria para la replicaci6n de este DNA. 5. Métodos para seleccionar o identificar aquellas células huésped que contienen el DNA recombinante. Los métodos utilizados para llevar a cabo estos procesos, y otros relaciona- dos, se denominan en conjunto tecnologia de DNA recombinante, o mis, informalmente ingenteria genética. Ahora nos centraremos en estos mé- todos haciendo énfasis en sus origenes bioquimicos. En esta discusién inicial, nos centraremos en la clonacién de DNA en la bacteria Escherichia coli, que fue el primer organismo utilizado en trabajos de DNA tecombinante y que todavia continia siendo el huésped mas ‘comin. E, coli tiene muchas ventajas: se conoce bastante bien e! metabolis- mo de su DNA (y muchos otros procesos bioquimicos), muchos vectores de clonacién que se encuentran de manera natural asociados con E. coli, como bacteriétagos y plésmidos, estan bien caracterizados y se dispone de técnicas efectivas para el traspaso de DNA de una bacteria a otra, Posterior- mente en este capitulo hablaremos de la clonacién de DNA en otros orge- 985 Cromosoma evcaritics Vector de © clonacion lasmido) ‘otra con endorateas tote con fe vesinecion,separaeon endonclessa fe fos agentes wy | ote oO | ‘rantomacion| (Ge necelon is) eines Drcteians htaped Figura 28-1 Representacién esquematica de la clonacién de DNA. Es posible obtener un fragmento dde DNA de interés rompiendo cromosomas. eucariéticos con endonucleasas de resticcién, Después de aislar los fragmentos y ligarios a un vector de clonacién que ha sido igualmente cortado ‘con una endonucleasa de resiriccin, el DNA. recombinante que resulta es introdueide en una ‘lula huésped donde puede ser propagado (lonado). Es de temarcar que el tamato del ‘cromosoma de E.coli con respecto al de un vector de clonacién tipico, como un plésmido, es mucho mayor de lo que aqui se ilusta, Parte IV Las rutas de la informacion Las endonucleasas de restriccién y la DNA ligasa dan como resultado el DNA recombinante Un conjunto de enzimas, disponibles gracias a décadas de investigacién en ‘l metabolismo de los écidos nucleicos, es de particular importancia para la tecnologia del DNA recombinante (Tabla 28-1). Dos tipos de enzimas en particular juegan un papel central en relaci6n con los métodos de genera: cién y propagacién de una molécula de DNA recombinante, como se fesquematiza en la Figura 28-1. El primero, las endonucleasas de restric- clén, cortan el DNA por secuencias especificas generando una serie de fragmentos mas pequetios. El segundo, la DNA ligasa, se utliza para unir el fragmento de DNA a clonar, una vez aislado, a un vector de clonacién adecuado. El vector recombinante se puede introducir entonces en una Célula huésped, que lo “clona’ a la vez que da lugar a muchas generaciones de divisiones celulares. eee lad guise ean Las endonucleasas de restricciOn se encuentran en una amplia gama de especies bacterianas. Werner Arber descubri6 que su funcién biologica es teconocer y cortar DNA fordneo (p. ¢., el DNA de un virus infeccioso); se dice que este DNA sera restringido. El propio DNA de la célula no se conta, debido a que la secuencia que reconocerfan las endonucleasas de restric: ci6n ha sido metilada (¥, por lo tanto, protegida) por una metilasa de DNA specifica, El conjunto formado por la endonucieasa de restriceion y la metilasa correspondiente, en una bacteria, se conoce como sistema de modificaci6n-restricclén. Exisien tres tipos de endonucleasas de restric-

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