Tham Dinh Qui Trinh Phan Tich - 13-03-2019 PDF

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
(Validation of Analytical Procedure)
PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn

Bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm
Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Tài liệu tham khảo
1. Asean guideline for validation of analytical procedures (2008), pp. 1-17.
2. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học.
3. Bộ Y tế (2018), Thông tư 04/2018/TT-BYT ban hành ngày 09 tháng 02 năm 2018 Quy định về
Thực hành tốt phòng thí nghiệm, phụ lục 1.
4. BP (2017), Validation of analytical procedure and chromatographic separation techniques.
5. European Medicines Agency (2015), Guideline on bioanalytical method validation, pp. 1 – 23.
6. FDA (2018), Bioanalytical method validation – Guidance for industry, Rockville, MD, USA, pp. 1
– 44.
7. Nguyễn Thị Ngọc Giàu, Nguyễn Ngọc Thể Trân, Nguyễn Đức Tuấn (2010), “Xây dựng quy trình
định lượng desloratadin bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học, 10-
2010, 28-32.
8. Lê Trung Hậu, Nguyễn Đức Tuấn (2014), “Xây dựng quy trình định lượng tạp chất phân hủy
của esomeprazol bằng phương pháp HPLC”, Tạp chí Y học TPHCM, 18(2), 134-138.
9. Trần Thị Như Hoài, Nguyễn Đức Tuấn (2016), “Xây dựng phương pháp HPLC để kiểm nghiệm
tạp chất liên quan cho thành phẩm perindopril và indapamid”, Tạp chí Dược học, 5-2016, 45-
51.
10. ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and
methodology, pp. 1 – 13.

Tài liệu tham khảo
11. Ludwig Huber (2007), Validation and qualification in analytical laboratories, second edition, pp.
140, 142-144, 146, 148.
12. OMCL (Ofﬁcial Medicines Control Laboratories) Network of the Council of Europe (2014),
Validation of analytical procedures, pp. 1-9.
13. Trương Uyên Phương, Nguyễn Thuý Duyên, Nguyễn Đức Tuấn (2014), “Định lượng đồng thời
clorpheniramin maleat, paracetamol và salicylamid trong chế phẩm đa thành phần bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí Dược học, 11-2014, 34-39.
14. Quyết định của Bộ Y tế số 44/2014/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm 2014 về việc ban hành
Thông tư Qui định việc đăng ký thuốc, phụ lục 1 “Bộ hồ sơ kỹ thuật chung Asean (ACTD) và
các hướng dẫn kỹ thuật”.
15. Quyết định của Cục trưởng Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm
2013 về việc ban hành Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8.
16. USP 42 (2018), General chapters of the US Pharmacopeia on Validation of compendial
procedures and on Veriﬁcation of compendial procedures.
17. Trần Thị Cẩm Vân, Trần Quốc Lộc, Nguyễn Đức Tuấn (2018), “Xây dựng quy trình định lượng
đồng thời fexofenadin và tạp A bằng phương pháp HPLC”, Tạp chí Y học TPHCM, 22(1), 416-
425.
18. Đoàn Thị Ngọc Yến, Nguyễn Đức Tuấn (2013), “ Định lượng đồng thời paracetamol, loratadin
và dextromethorphan HBr trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Dược học, 01-2013, 25-29.

Mục tiêu
 Trình bày được định nghĩa và phân loại quy trình phân tích; sự
cần thiết phải thẩm định quy trình phân tích; phạm vi thẩm định
và tái thẩm định một quy trình phân tích.
 Mô tả được các chỉ tiêu cần được thẩm định đối với một quy
trình phân tích.
 Đánh giá được một quy trình phân tích sau khi được thẩm định.
 Trình bày được các chỉ tiêu cần được thẩm định đối với một
quy trình định lượng dược chất và/hoặc chất chuyển hóa có tác
dụng trong mẫu sinh học.

Nội dung
1. Quy trình phân tích
2. Thẩm định quy trình phân tích
3. Phạm vi thẩm định, tái thẩm định
4. Các chỉ tiêu điển hình trong thẩm định cần được xem xét
5. Hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của Bộ Y tế: phương pháp HPLC, UV-
Vis, định lượng kháng sinh bằng vi sinh vật, ……
6. Ví dụ minh họa: thẩm định quy trình định lượng tạp B của perindopril tert-butylamin
và tạp A của indapamid bằng phương pháp HPLC trong chế phẩm viên nén chứa
perindopril tert-butylamin (4 mg) và indapamid (1,25 mg)
7. Một số tình huống/câu hỏi liên quan đến thẩm định quy trình phân tích
8. Thẩm định quy trình định lượng dược chất và/hoặc chất chuyển hóa có tác dụng trong
mẫu sinh học – So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA - Ví dụ minh họa

Quy trình phân tích
 Quy trình thử nghiệm (test procedure)

 Chỉ ra cách tiến hành phân tích
 Mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện từng phép thử
phân tích
 Chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn (đối chiếu), các thuốc thử,
cách sử dụng trang thiết bị, cách thiết lập đường chuẩn
 Xử lý, tính toán và biện giải kết quả, v.v...
(Nhưng không chỉ giới hạn ở các phần này)

 Phân loại
 Quy trình định tính: nhằm khẳng định sự có mặt của các chất phân tích
trong mẫu thử. Thường được thực hiện bằng cách so sánh kết quả phân
tích (phổ đồ, đáp ứng sắc ký, phản ứng hóa học, …) của mẫu thử với chất
chuẩn
 Quy trình thử tạp chất: nhằm mục đích phản ánh chính xác mức độ tinh
khiết của mẫu thử
 Định lượng các tạp chất (quantitative test for impurities’ content)
 Thử giới hạn tạp chất (limit tests for the control of impurities)
 So với phép thử giới hạn tạp chất thì phép thử định lượng tạp chất còn
yêu cầu thêm một số chỉ tiêu thẩm định khác

 Phân loại
 Quy trình định lượng hoạt chất trong mẫu nguyên liệu hoặc thành phẩm thuốc
hoặc một hay nhiều thành phần được chọn khác trong thành phẩm thuốc: nhằm mục
đích đo lường chất phân tích có mặt trong mẫu thử (nguyên liệu, chế phẩm, môi
trường thử độ hòa tan, dược liệu, dịch sinh học, …)
 Định lượng là phép đo hàm lượng một hoặc nhiều thành phần chính của dược
chất
 Đối với thành phẩm thuốc: những chỉ tiêu thẩm định tương tự cũng được áp dụng
khi định lượng các hoạt chất hoặc một hay nhiều thành phần được lựa chọn khác
 Các chỉ tiêu thẩm định này cũng có thể áp dụng cho các phép định lượng liên quan
đến các quy trình phân tích khác (ví dụ: môi trường thử độ hòa tan)
 Định lượng dược chất trong dịch sinh học có hướng dẫn thẩm định riêng

Thẩm định quy trình phân tích
 Quá trình thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp
 Chứng minh quy trình phân tích (QTPT) đó có đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến
 Khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được
 Tất cả các QTPT được sử dụng để thử nghiệm phải phù hợp với mục đích phân
tích và phải chứng minh bằng việc thẩm định
 Việc thẩm định cũng áp dụng để thiết lập các tiêu chí chấp nhận khi kiểm tra tính
phù hợp của hệ thống, QTPT dự kiến sử dụng trước khi thực hiện
 Công việc bắt buộc, có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương pháp phân tích
phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích
 Để đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở
 Trong công tác tiêu chuẩn hóa, phải xây dựng các QTPT (phải được thẩm định)
để giúp cho việc thực hiện các chỉ tiêu và kiểm tra chất lượng của tiêu chuẩn

 Tất cả các số liệu liên quan thu được trong quá trình thẩm định và các công
thức được sử dụng để tính toán các đại lượng đặc trưng của việc thẩm định
cần được đưa ra và thảo luận
 Các chất chuẩn (đối chiếu) được sử dụng trong quá trình thẩm định cần phải
được đánh giá rõ ràng và kèm theo tài liệu về độ tinh khiết. Mức độ tinh khiết
phụ thuộc vào mục đích sử dụng
 Thực tế: có thể phác thảo công việc thực nghiệm nhằm xem xét tiến hành
đánh giá một cách thích hợp đồng thời nhiều thuộc tính để đưa ra những hiểu
biết về khả năng của một quy trình phân tích (ví dụ: tính đặc hiệu, tuyến tính,
khoảng xác định, độ đúng và độ chính xác)
 Theo yêu cầu của Asean: tất cả các dữ liệu liên quan đến các chỉ tiêu thẩm
định cùng với các chỉ tiêu chấp nhận tương ứng phải nộp cho cơ quan quản
lý dược phẩm

Phạm vi thẩm định – Tái thẩm định
 Tất cả các QTPT mới (chưa có trong dược điển hay AOAC) phải được thẩm định,
kể cả những QTPT có trong dược điển nhưng có sự thay đổi
 Các phương pháp trong dược điển được coi là đã được thẩm định với các mục
đích sử dụng theo mô tả tại các chuyên luận. Tuy nhiên, phòng thí nghiệm cũng
cần xác nhận rằng nếu phương pháp trong dược điển được sử dụng cho mục
đích khác thì nó phải được thẩm định cho mục đích sử dụng đó để chứng minh
rằng nó là phù hợp
 Ví dụ: đối với một dược phẩm được kiểm tra lần đầu tiên, không thấy có sự khác
biệt đáng kể nào phát sinh do sự có mặt của tá dược, hoặc với dược chất là do
tạp chất từ phương pháp tổng hợp mới
 Việc kiểm tra tính phù hợp của hệ thống là một phần không thể thiếu của nhiều
QTPT. Các thử nghiệm dựa trên các thiết bị điện tử, hoạt động phân tích và các
mẫu được phân tích cùng tham gia vào trong một hệ thống (hệ thống HPLC, GC,
CE và IR)

 Loại kiểm tra tính phù hợp của hệ thống nào sẽ được áp dụng là tùy thuộc vào
loại quy trình được sử dụng
 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống được áp dụng để đánh giá lại
(verification) các phương pháp trong dược điển/AOAC hoặc QTPT đã được
thẩm định và phải được thực hiện trước khi thử nghiệm
 Chỉ khi các tiêu chí về tính phù hợp của hệ thống được đáp ứng thì phương
pháp hoặc quy trình mới được coi là phù hợp với mục đích sử dụng
 Lưu ý: nếu một số lượng lớn các mẫu đang được phân tích liên tục, thì việc
kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sẽ được thực hiện trong suốt chuỗi thử
nghiệm để chứng minh rằng hiệu năng của quy trình đạt yêu cầu

 Việc thẩm định lại QTPT có thể cần thiết trong các trường hợp dưới đây:
 Thay đổi trong khâu tổng hợp dược chất
 Thay đổi thành phần của thành phẩm
 Thay đổi QTPT
 Mức độ thẩm định lại được yêu cầu tùy thuộc vào bản chất của sự thay đổi.
Một số thay đổi khác cũng có thể yêu cầu phải thẩm định lại
 Ngoài ra, phải tái thẩm định khi đưa xét duyệt tại các Cơ quan kiểm nghiệm
quốc gia xin đăng ký lại để lưu hành thuốc (còn gọi là thẩm định định kỳ) để
kiểm soát QTPT vẫn còn có thể áp dụng mà không ảnh hưởng đến kết quả

Các chỉ tiêu điển hình trong thẩm định cần được xem xét
Mục đích của QTPT phải được hiểu rõ ràng vì sẽ quyết định những chỉ tiêu cần được
đánh giá
 Độ đúng (accuracy)
 Độ chính xác, độ chụm (precision)
 Độ lặp lại (repeatability)
 Độ chính xác trung gian, độ chụm trung gian (intermediate precision)
 Độ tái lặp (reproducibility) hay độ ổn định (ruggedness)
 Tính đặc hiệu (specificity) hay tính chọn lọc (selectivity)
 Giới hạn phát hiện (limit of detection, LOD)
 Giới hạn định lượng (limit of quantitation, LOQ)
 Tính tuyến tính, độ tuyến tính (linearity)
 Miền giá trị, khoảng xác định (range)
 Độ bền, độ thô (robustness)
 Tính thích hợp (phù hợp, tương thích) của hệ thống (system suitability): HPLC, GC,
CE, IR

Các yếu tố cần được thẩm định đối với một QTPT theo hướng dẫn của Asean,
GLP, BP, ICH, Bộ Y tế, USP và OMCL
Loại quy trình phân tích Xác định tạp chất Định lượng Phân
Định
Định Thử giới - Độ hòa tan (chỉ đo lường) tích
tính
Các chỉ tiêu lượng hạn - Hàm lượng/Hoạt lực vết
Độ đúng - + - + +
Độ chính xác
Độ lặp lại - + - + +
Độ chính xác trung gian - +1 - +1 +1
Độ tái lặp - + - + +
Tính đặc hiệu2 + + + + +
Giới hạn phát hiện - -3 +  +
Giới hạn định lượng - + -  +
Tính tuyến tính - + - + +
Miền giá trị - + - + +
+: chỉ tiêu cần phải thẩm định
: chỉ tiêu thông thường không cần phải thẩm định
1: trong trường hợp đã thẩm định độ tái lặp lại thì không cần phải thẩm định độ chính xác trung gian
2: một QTPT kém đặc hiệu có thể được bổ trợ bằng một hay nhiều QTPT hỗ trợ khác.
3: có thể cần được thẩm định trong một số trường hợp

Lưu ý
 Các chỉ tiêu được liệt kê trong các hướng dẫn trên là điển hình
đối với các loại QTPT đã nêu. Tuy nhiên, các trường hợp ngoại
lệ phải được giải quyết theo từng trường hợp cụ thể
 Chỉ tiêu độ thô không được liệt kê nhưng cần được xem xét đến
ở các giai đoạn thích hợp trong quá trình phát triển QTPT

Thẩm định QTPT – Bộ Y tế
Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)
Phụ lục 8: Danh mục các quy trình thẩm định
 Phương pháp hóa học
Thẩm định quy trình định lượng bằng chuẩn độ thể tích (CĐ)
 Phương pháp dụng cụ, hóa lý
 Phương pháp đo quang phổ
 Thẩm định quy trình phân tích bằng đo quang phổ IR
 Thẩm định quy trình phân tích bằng đo quang phổ UV/Vis
 Thẩm định quy trình phân tích bằng đo quang phổ AAS
 Phương pháp sắc ký
 Thẩm định quy trình phân tích bằng SKLM
 Thẩm định quy trình phân tích bằng HPLC
 Thẩm định quy trình phân tích bằng SKK
 Phương pháp vi sinh
Thẩm định quy trình định lượng kháng sinh bằng vi sinh vật
 Phương pháp khác
Thẩm định quy trình định lượng một số chế phẩm thuốc enzym
Thẩm định quy trình định lượng (QTĐL) bằng chuẩn độ thể tích (CĐ)
QTĐL có trong dược điển/AOAC QTĐL của nhà sản xuất
- Tính đặc hiệu - Tính đặc hiệu

- Độ đúng - Độ tuyến tính
- Độ lặp lại - Khoảng xác định
- Độ đúng
- Độ chính xác
+ Độ lặp lại
+ Độ chính xác trung gian

Thẩm định QTPT bằng đo quang phổ IR
QTPT theo dược điển/AOAC QTPT của nhà sản xuất

- Tính thích hợp của hệ thống - Tính thích hợp của hệ thống
- Độ đúng - Độ đúng
- Độ lặp lại - Độ tuyến tính
- Độ chính xác
+ Độ lặp lại

Thẩm định QTPT bằng đo quang phổ UV-Vis
Định tính Định lượng, thử tạp Định lượng, thử tạp
theo dược điển/AOAC của nhà sản xuất
Tính đặc hiệu - Tính đặc hiệu - Tính đặc hiệu
- Độ đúng
- Độ chính xác
+ Độ lặp lại
- Giới hạn phát hiện
- Giới hạn định lượng

Thẩm định QTPT bằng đo quang phổ AAS
QTĐL theo dược điển/AOAC QTĐL của nhà sản xuất

- Độ đúng
- Độ chính xác
+ Độ lặp lại
- Giới hạn phát hiện (LOD)
- Giới hạn định lượng (LOQ)

Thẩm định QTPT bằng SKLM
QTPT có trong dược điển/AOAC QTPT mới

Định tính Tạp chất Định tính Tạp chất
- Đặc hiệu - Đặc hiệu - Đặc hiệu - Đặc hiệu
- Giới hạn phát hiện

Thẩm định QTPT bằng SKK

 Độ ổn định của hệ thống (Tính thích hợp của hệ thống)
 Tính đặc hiệu
 Tính tuyến tính
 Khoảng xác định
 Độ đúng
 Độ chính xác
 Độ lặp lại
 Độ chính xác trung gian
 Giới hạn phát hiện
 Giới hạn định lượng

Thẩm định QTPT bằng HPLC

 Tính tuyến tính – khoảng xác định
 Độ đúng
 Độ chính xác
 Độ lặp lại
 Tính thích hợp của hệ thống
 Độ lặp lại
 Độ chính xác trung gian

Thẩm định quy trình định lượng kháng sinh bằng vi sinh vật
 Tính tuyến tính – khoảng xác định
 Độ đúng
 Độ chính xác (độ lặp lại trung gian)

Thẩm định QTPT định tính và định lượng một số chế phẩm bằng enzym
Định Định lượng

tính
Độ Độ Độ tuyến Khoảng Độ Độ chính xác
Loại phương
đặc đặc tính xác định đúng Độ lặp Độ chính xác
pháp
hiệu hiệu lại trung gian
Phương pháp
trong dược + + - - + + -
điển/AOAC
Phương pháp
ngoài dược điển + + + + + + +

Thẩm định QTPT theo yêu cầu trong Hồ sơ đăng ký thuốc
Dược chất mới

 Tiến hành thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu và báo cáo số liệu thẩm định
QTPT đối với tất cả các QTPT được áp dụng trong tiêu chuẩn
Dược chất generic
 Khi đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất hoặc tiêu chuẩn
dược điển không thuộc nhóm dược điển tham chiếu (ngoại trừ DĐVN,
BP, USP, JP, IP (DĐQT), EP), tiến hành thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu
và báo cáo số liệu thẩm định QTPT đối với các QTPT nào chưa được
áp dụng để đánh giá chất lượng dược chất qui định trong các dược
điển thuộc nhóm dược điển tham chiếu

Trường hợp đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn dược điển
 Khi đăng ký chất lượng theo một trong các dược điển thuộc nhóm dược điển tham
chiếu (DĐVN, BP, USP, JP, IP (DĐQT), EP):
Cần có báo cáo đánh giá sự phù hợp của việc áp dụng QTPT trong dược điển đăng ký
để kiểm tra chất lượng thuốc xin đăng ký. Tùy từng trường hợp cụ thể, có thể áp dụng
một trong 02 hình thức sau:
 Bằng biện luận: Đưa ra các biện luận đối với mỗi QTPT được áp dụng nhằm chứng
minh kết quả phân tích thu được là không bị ảnh hưởng bởi các thành phần tá
dược có mặt trong công thức thuốc xin đăng ký
 Bằng thực nghiệm: Cung cấp các số liệu thẩm định lại QTPT trong dược điển áp
dụng cho thuốc xin đăng ký đối với QTPT nào khi biện luận cho thấy cần thiết phải
đánh giá sự phù hợp bằng thực nghiệm. Việc thẩm định lại QTPT của dược điển
được tiến hành theo hướng dẫn thẩm định QTPT như sau:
 Định tính: Tính đặc hiệu
 Định lượng (Định lượng hoạt chất hoặc thành phần đã chọn khác, tạp chất và
lượng hoạt chất giải phóng ở chỉ tiêu độ hòa tan): Độ đúng và tính đặc hiệu
 Thử giới hạn tạp chất: Tính đặc hiệu

Trường hợp đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn dược điển:
 Khi đăng ký chất lượng theo một dược điển không thuộc nhóm dược điển
tham chiếu
Cung cấp đầy đủ số liệu thẩm định QTPT như quy định đối với trường hợp
đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất.

Trường hợp đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất
 Phải tiến hành thẩm định (toàn bộ hoặc một số thông số thẩm định theo yêu cầu) đối
với các QTPT được áp dụng trong các phép thử định tính, thử giới hạn tạp chất, định
lượng (bao gồm định lượng tạp chất, dược chất và các thành phần được lựa chọn
khác) nhằm chứng minh sự phù hợp của việc áp dụng các QTPT đó để đánh giá chất
lượng của thuốc xin đăng ký
 Đối với mỗi QTPT, trong trường hợp không thẩm định thông số nào, nhà sản xuất phải
thuyết minh sự phù hợp của việc bỏ thẩm định thông số đó trong báo cáo thẩm định
QTPT
 Tiến hành thẩm định và nộp báo cáo số liệu thẩm định QTPT theo Hướng dẫn thẩm
định QTPT như sau:
 Đối với quy trình chưa có trong các Dược điển hoặc có trong dược điển không
thuộc nhóm tham chiếu: Thẩm định QTPT đầy đủ theo hướng dẫn của ASEAN
 Đối với quy trình đã có trong các Dược điển tham chiếu (ví dụ như QTPT một
thành phần hoạt chất, thử tạp chất... trong chế phẩm đa thành phần): áp dụng như
đối với quy trình đăng ký theo Dược điển tham chiếu

Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc
 Khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần
khác có thể có trong mẫu thử
 Thông thường các thành phần này gồm các tạp chất, sản phẩm phân hủy,
chất nền, …
 Việc xác định tính đặc hiệu cần được tiến hành trong khi thẩm định các phép
thử định tính, xác định tạp chất và định lượng
 Quy trình dùng để xác định tính đặc hiệu phụ thuộc vào mục tiêu đã định của
QTPT
 Không phải lúc nào cũng xác định được một QTPT đặc hiệu cho một chất
phân tích nhất định (phân biệt hoàn toàn). Trường hợp này cần phải kết hợp hai
hay nhiều QTPT để đạt được mức độ đặc hiệu cần thiết

Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy trình định tính
 Những phép thử định tính phù hợp là phép thử có thể phân biệt được các
hợp chất có cấu trúc tương tự cùng có mặt trong mẫu thử
 Khả năng phân biệt của một quy trình định tính có thể được khẳng định bằng
kết quả dương tính của mẫu có chứa chất phân tích (có thể bằng cách so
sánh với chất đối chiếu đã biết) kết hợp với kết quả âm tính của mẫu thử
không chứa chất phân tích
 Thêm vào đó, phép thử định tính này có thể được áp dụng cho các chất có
cấu trúc tương tự hoặc gần với với cấu trúc của chất phân tích để chứng tỏ
phép thử định tính không cho kết quả dương tính với các chất này
 Việc lựa chọn xem chất nào có khả năng lẫn vào mẫu phân tích cần dựa trên
những đánh giá khoa học kết hợp cân nhắc xem chúng có khả năng có mặt
không

Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy trình định tính
 Đối với thành phẩm cần chứng minh

các thành phần khác trong công thức
bào chế không ảnh hưởng tới phép thử
 Giả dược (chứa đầy đủ các thành phần

trừ chất phân tích) âm tính với phép
thử: Không cho phản ứng hóa học như
có màu đặc trưng hay tủa, trong SKLM
không cho vết có Rf giống như vết
chuẩn, trong HPLC và sắc ký khí không
cho pic có thời gian lưu trùng với thời
gian lưu của chuẩn; không có phổ IR và Sắc ký đồ HPLC xác định
phổ UV-VIS giống với phổ chuẩn hoặc tính đặc hiệu của indinavir
phổ của chất chuẩn tương ứng

Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – QT định lượng và thử tạp chất
 Đối với quy trình sắc ký, các sắc ký đồ đại diện nên được sử dụng để chứng minh tính
đặc hiệu và từng thành phần riêng biệt phải được ghi lại rõ ràng. Độ tinh khiết của pic
cần được xác định bằng đầu dò PDA hay đầu dò khối phổ
 Tính đặc hiệu có thể được chứng minh bằng độ phân giải của hai thành phần được
rửa giải gần nhau nhất. Phải đệ trình các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu
thử
 Các thông số đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký như: số đĩa lý thuyết, độ
phân giải, hệ số đối xứng của pic v.v
 Với những KT phân tích khác cũng cần phải có những ghi chép tương tự
 Trong trường hợp sử dụng phép định lượng không đặc hiệu, thì cần dùng các QTPT
hỗ trợ khác để chứng minh tính đặc hiệu của chúng
 Ví dụ nếu dùng phương pháp chuẩn độ thể tích để định lượng các nguyên liệu khi
xuất xưởng, thì có thể kết hợp phép định lượng này với phép thử tạp chất thích hợp.
Cách đánh giá đều giống nhau đối với cả phép định lượng và thử tạp chất bao gồm:

Trường hợp có chuẩn tạp chất
 Đối với phép định lượng, cần phải chứng minh phương pháp đã dùng phân
biệt được chất cần phân tích khi có mặt của tạp chất và/hoặc các tá dược
 Trong thực tế, có thể thực hiện bằng cách thêm một lượng thích hợp tạp chất
và/hoặc tá dược vào mẫu ban đầu cần định lượng (nguyên liệu hoặc thành
phẩm) và chứng minh rằng kết quả định lượng không bị ảnh hưởng bởi sự có
mặt của tạp chất và/hoặc tá dược (bằng cách so sánh với kết quả định lượng
trên mẫu không thêm tạp chất và/hoặc tá dược)
 Đối với phép thử tạp chất, sự phân biệt này có thể được thiết lập bằng cách
thêm vào nguyên liệu hoặc thành phẩm một lượng thích hợp các tạp chất và
chứng minh rằng từng tạp chất riêng biệt này được tách riêng rẽ ra khỏi nhau
và/hoặc ra khỏi các thành phần khác có trong mẫu


Ví dụ: quy trình thử giới hạn tạp chất liên quan của paracetamol bằng HPLC với đầu dò
UV-Vis trong dược điển Việt Nam V. Có khoảng 11 tạp chất liên quan, trong đó có 2 tạp
chất chính là 4-aminophenol và cloroacetanilid. Tính đặc hiệu được xác định bằng cách
xác định độ phân giải giữa paracetamol và tạp chất 4-aminophenol (tạp chất K)
 Dung dịch đối chiếu được chuẩn bị ngay khi tiến hành thử nghiệm: hòa tan 5,0 mg 4-
aminophenol, 5 mg paracetamol chuẩn và 5,0 mg cloroacetanilid trong methanol và pha
loãng thành 20,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch này thành 250,0 ml
với pha động
 Điều kiện sắc ký: cột pha đảo C8 (250 x 4,6 mm; 5 m); 35oC; 1,5 ml/phút; 245 nm; 20
l. Pha động: 375 thể tích dung dịch Na2HPO4 1,79%, 375 thể tích dung dịch NaH2PO4
0,78% và 250 thể tích methanol có chứa 0,46% dd tetra-butylamoni hydroxid 40%
 Tiến hành: Tiêm dung dịch đối chiếu. Phép thử chỉ có giá trị khi Rs giữa pic của tạp
chất 4-aminophenol và pic của paracetamol ít nhất là 4; tỷ lệ S/N cho tạp chất
cloroacetanilid ít nhất là 50


Ví dụ: quy trình thử giới hạn tạp chất liên quan của paracetamol bằng HPLC với đầu dò
UV-Vis trong dược điển Việt Nam V. Có khoảng 11 tạp chất liên quan, trong đó có 2 tạp
chất chính là 4-aminophenol và cloroacetanilid. Tính đặc hiệu được xác định bằng
cách xác định độ phân giải giữa paracetamol và tạp chất 4-aminophenol (tạp K)
Các tạp chất: A: N-(2-hydroxyphenyl) acetamid;
B: N-(4-hydroxyphenyl) propanamid; C: N-(3-
cloro-4-hydroxyphenyl) acetamid; D: N-
phenylacetamid; E: 1-(4-hydroxyphenyl) ethanon;
F: 4-nitrophenol; G: 1-(4-hydroxyphenyl) ethanon
oxim; H: 4-(acetylamino) phenyl acetat; I: 1-(2-
hydroxyphenyl) ethanon; J: N-(4-clorophenyl)
acetamid (cloroacetanilid); K: 4-aminophenol
1. Tạp chất K; 2. Paracetamol; 3. Tạp
chất B; 4. Tạp chất A; 5. Tạp chất C; 6.
Các tạp chất E và D; 7. Tạp chất G; 8.
Tạp chất H; 9. Tạp chất F; 10. Tạp chất
I; 11. Tạp chất J

Trường hợp không có chuẩn tạp chất
 Nếu không có tạp chất hoặc sản phẩm phân hủy chuẩn, tính đặc hiệu có thể
được chứng minh bằng cách so sánh kết quả phân tích trên mẫu thử có chứa
tạp chất hoặc các sản phẩm phân hủy bằng QTPT đã xây dựng với kết quả
phân tích trên mẫu thử có chứa tạp chất hoặc chất phân hủy bằng quy trình
chính thống khác ví dụ như phương pháp dược điển/AOAC hoặc QTPT khác
đã được thẩm định (quy trình độc lập)
 Nếu cần, thì bao gồm cả so sánh trên mẫu được lưu trữ ở các điều kiện
khắc nghiệt có liên quan như: ánh sáng, nhiệt độ, thủy phân bằng
acid/kiềm và oxy hóa với mục đích làm phân hủy mẫu rồi chứng tỏ
không có sự ảnh hưởng của các chất phân hủy


Ví dụ: điều kiện phân hủy mẫu được đề nghị như sau:
 Dùng ánh sáng phân hủy: phơi mẫu dưới ánh sáng UV cường độ cao trong
24 giờ, tăng dần 50, 100, 200 watt/giờ/m2.
 Dùng nhiệt phân hủy: đặt mẫu ở 100oC trong 24 giờ.
 Thủy phân bằng acid: pha dung dịch thử trong acid hoặc acid hóa dung môi
(nồng độ acid 0,5 N) trong 24 giờ hoặc đun/hồi lưu hoặc chiếu UV trong HCl
0,5 N/24 giờ.
 Thủy phân bằng kiềm: pha dung dịch thử trong kiềm hoặc kiềm hóa dung môi
(nồng độ kiềm 0,5 N) trong 24 giờ hoặc đun/hồi lưu hoặc chiếu UV trong
NaOH 0,5 N/24 giờ.
 Oxy hóa: xử lý với dung dịch H2O2 3% trong 24 giờ hoặc chiếu xạ UV trong
H2O2 3% trong 24 giờ.


 Điều kiện phân hủy được đề xuất cho dược chất và thành phẩm
Điều kiện phân hủy Dược chất Dược chất Thành phẩm Thành phẩm
rắn lỏng rắn lỏng
Nhiệt/ẩm X X
Oxy hóa X X X
Ánh sáng UV X X
Tác nhân acid/kiềm X X
 Để định lượng: so sánh hai kết quả định lượng từ quy trình đang được thẩm
định và quy trình độc lập.
 Để thử giới hạn tạp chất: so sánh hàm lượng tạp chất hoặc sản phẩm phân
hủy theo thời gian giữa hai quy trình.

 Các phép thử độ tinh khiết của pic cũng rất hữu ích để chỉ ra
rằng pic sắc ký của chất phân tích không chứa nhiều hơn một
thành phần (ví dụ phép thử độ tinh khiết bằng đầu dò PDA hay đầu
dò khối phổ).
 Với đầu dò PDA, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết
của pic có thể có lợi trong việc chứng minh rằng pic sắc ký không
phải là pic của hai thành phần trở lên

Đầu dò PDA: sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic để chứng minh
pic sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên
Xác định các pic tinh khiết và không tinh khiết trên sắc ký đồ HPLC

 Trong định lượng, tính đặc hiệu còn được biểu thị bằng độ chênh lệch hay là
hiệu giữa các kết quả thu được từ một mẫu giả định với các kết quả thu được
từ mẫu thử
 Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp. Độ nhiễu càng thấp, tính
đặc hiệu càng cao.
 Một trong các phương pháp để xác định tính đặc hiệu trong QTĐL:
 Chuẩn bị mẫu: trong khi xác định theo phương pháp đề xuất với mẫu
thử, tiến hành chuẩn bị một mẫu giả định có công thức và thành phần
các chất hoàn toàn giống như mẫu thử và mẫu trắng
 Xác định các mẫu trên bằng phương pháp đề xuất. Kết quả thu được
so với mẫu trắng
 Xác định hiệu hay độ sai lệch của các kết quả thu được

 Tính đặc hiệu cũng được dùng để làm sáng tỏ trong trường hợp chế phẩm đã
bắt đầu có sản phẩm phân hủy. Trong nghiên cứu về độ ổn định của thuốc để
tính tuổi thọ, thường phải xây dựng quy trình định lượng hoạt chất trong điều
kiện có sản phẩm phân hủy
 Ví dụ: khi định lượng thiamin hydrocloric bằng phương pháp đo phổ UV hay
bằng phương pháp đo bạc đều cho kết quả về hàm lượng như nhau thậm chí
còn lớn hơn 100% so với lúc mới sản xuất. Lý do là thiamin hydrocloric khi bị
phân hủy thành các hợp chất mới vẫn cho hấp thụ UV, còn trong phép đo bạc
thì hàm lượng Cl- kết hợp vẫn không thay đổi. Do vậy phải sử dụng phương
pháp định lượng chọn lọc riêng cho thiamin hydrocloric là phép đo huỳnh
quang (theo USP) hay HPLC

 Khi chưa xác định được chế phẩm có hay không có sản phẩm
phân hủy thì nên tự tạo ra mẫu biết chắc chắn là có sản phẩm
phân hủy rồi đem so với một mẫu hoàn toàn biết chắc chắn là
không có sản phẩm phân hủy
 Kết quả thu được sẽ cho phép thẩm định tính đặc hiệu của
phương pháp
 Trong trường hợp chế phẩm có nhiều thành phần thì việc xác
định tính đặc hiệu lại càng cần thiết

Ví dụ: Xác định tính đặc hiệu của quy trình định lượng desloratadin trong viên
bao phim bằng HPLC với đầu dò PDA
 Chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng (pha động), mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử
thêm chuẩn, mẫu phân giải (mẫu được để trong các điều kiện khắc nghiệt)
 Tiến hành sắc ký các mẫu trên
 Điều kiện sắc ký: cột pha đảo C8 (250 x 4,6 mm; 5 m). Bước sóng phát hiện
278 nm. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút. Thể tích tiêm 20 l. Pha động: hỗn hợp gồm 25
thể tích acetonitril và 75 thể tích dung dịch đệm phosphat 10 mM (pH 2,5) có
chứa 10 mM triethylamin

Yêu cầu
 Thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử và mẫu phân giải tương đương thời gian lưu
của pic desloratadin trong mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng không có pic trùng với pic
desloratadin
 Khi thêm một lượng chất chuẩn desloratadin vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic
của desloratadin tăng lên so với trước khi thêm chất chuẩn
 Pic desloratadin tách hoàn toàn các pic khác trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu
phân giải (nếu có)
 Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử và mẫu phân giải giống phổ
UV-Vis tại thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu chuẩn
 Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic desloratadin không có các thành
phần khác trong tất cả các mẫu

Mẫu trắng Chuẩn desloratadin

nồng độ 100 µg/ml
Viên desloratadin Viên desloratadin

nồng độ 100 µg/ml thêm chuẩn

Chuẩn desloratadin Viên desloratadin
Chuẩn desloratadin Viên desloratadin

Chuẩn desloratadin Chuẩn chiếu ánh

nồng độ 100 µg/ml sáng trực tiếp/ 48 giờ
Chuẩn đặt ở nhiệt độ Chuẩn bị thủy phân

trên 60 0C/ 48 giờ trong HCl 0,5 N/ 48 giờ
Chuẩn bị thủy phân trong Chuẩn bị oxy hóa bởi

NaOH 0,5 N/ 48 giờ H2O2 3%/ 24 giờ
Viên desloratadin
Ánh sáng trực Trên 60 0C/ 48 giờ

tiếp/48 giờ

Chuẩn dưới ánh sáng Chuẩn bị thủy phân trong Chuẩn bị oxy hóa bởi H2O2
trực tiếp/ 48 giờ NaOH 0,5 N/ 48 giờ 3%/ 24 giờ
Viên desloratadin
trên 60 0C/ 48 giờ

Chuẩn dưới ánh sáng Chuẩn bị thủy phân trong Chuẩn bị oxy hóa bởi H2O2
trực tiếp/ 48 giờ NaOH 0,5 N/ 48 giờ 3%/ 24 giờ
Viên desloratadin
trên 60 0C/ 48 giờ

Tính tuyến tính – Miền giá trị (Khoảng xác định) - LOD – LOQ
Đáp ứng
Miền giá trị
Độ dốc = Độ nhạy
S/N = 10/1
S/N = 3/1
Tung độ
góc
Hàm lượng
Minh họa tính tuyến tính, miền giá trị, LOD và LOQ
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM
Tính tuyến tính

Tính tuyến tính
 Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi qui
 Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi qui
Trắc nghiệm t (phân phối Student)

Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj không có ý nghĩa thống kê”
HA: Bj  0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê”
Giá trị thống kê:
Bi   i B S2
t  S 
2
 X 
b 2
S 2
S 2
X
Biện luận:
b b i
Nếu t0 < t0,05 (N-2)  chấp nhận giả thuyết H0

Nếu t0 > t0,05 (N-2)  chấp nhận giả thuyết HA

Tính tuyến tính
Trắc nghiệm F (phân phối Fischer)

Giả thuyết:
H 0: Bj = 0 “Phương trình hồi qui không tương thích”
HA: Bj  0 “Phương trình hồi qui tương thích”
Giá trị thống kê:
S 2f Phương sai của yếu tố khảo sát
F
S r2 Phương sai của yếu tố ngẫu nhiên
F0,05 = FINV(0,05, 1 , 2 )
1 = a-1 ; 2 = N-a
Biện luận:
Nếu F < F0,05  chấp nhận giả thuyết H0
Nếu F > F0,05  chấp nhận giả thuyết HA

Tính tuyến tính
Ví dụ: Định lượng một hợp chất bằng phương pháp đo độ hấp thụ
x (mcg/ml) Độ hấp thụ (y) 2.5
0 0,05 y = 0.6914x + 0.0074
2 R2 = 0.9984
0,2 0,14
1.5
0,4 0,29
0,6 0,43 1
0,8 0,52 0.5

1,0 0,67
0
3,0 2,1 0 1 2 3 4
 r = 0,9988; a = 0,6914; b = 0,0074

 Phương trình hồi qui: Y = 0,6914X+ 0,0074
Miền giá trị (Khoảng xác định)
 Khoảng cách giữa nồng độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu thử (bao gồm
cả các nồng độ này). Trong khoảng nồng độ này, QTPT đã được chứng minh đáp ứng
độ chính xác, độ đúng và tính tuyến tính
 Khoảng xác định thường được lấy từ những nghiên cứu tính tuyến tính và phụ thuộc
vào việc ứng dụng dự định của quy trình để định lượng mẫu thử chứa chất phân tích với
hàm lượng nằm trong khoảng ở 2 cực (cực đại và cực tiểu) của khoảng xác định của
QTPT
 Ví dụ: Trong phần kết luận của phương pháp đo quang “Khoảng nồng độ tuyến tính
hay khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert-Beer là 4 mcg/ml – 12 mcg/ml” được
xác định bằng cách
 Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính
 Khẳng định khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại hay không
 Còn phụ thuộc vào mục đích của quy trình

Các khoảng xác định tối thiểu cần được cân nhắc theo mục đích của QTPT
Quy trình Khoảng xác định tối thiểu

phân tích
Định lượng nguyên
liệu hoặc thành 80% - 120% của nồng độ thử
phẩm thuốc
Xác định độ đồng 70% - 130% nồng độ thử. Có thể mở rộng miền giá trị tùy thuộc
đều hàm lượng vào bản chất của dạng bào chế (ví dụ: thuốc hít có phân liều) thì
cần khoảng xác định rộng hơn
Thử độ hòa tan ± 20 % khoảng qui định trong tiêu chuẩn
Ví dụ: nếu tiêu chuẩn phóng thích hoạt chất của một loại thuốc
phóng thích có kiểm soát là 20% sau 1 giờ và 90% sau 24 giờ
thì miền giá trị là 1% – 110% so với hàm lượng ghi trên nhãn
của thuốc

Các khoảng xác định tối thiểu cần được cân nhắc theo mục đích của QTPT
Quy trình Khoảng xác định tối thiểu

phân tích
Xác định  Từ giới hạn tạp chất cho phép (100%) đến 120% của tiêu chuẩn
tạp chất  Đối với các tạp chất đã biết có độc tính bất thường hoặc sinh ra độc tính
hoặc có tác dụng dược lý không mong muốn thì LOD/LOQ của tạp chất phải
tương ứng với giới hạn mà tạp chất đó cần được kiểm soát
Chú ý: để thẩm định quy trình thử tạp chất được tiến hành trong phát triển
sản phẩm có thể cần thiết phải cân nhắc khoảng xác định xung quanh một
giới hạn đã được gợi ý
 Nếu quy trình định lượng hoạt chất và thử tạp chất được thực hiện trên
cùng một phép thử và chỉ sử dụng chuẩn hoạt chất, miền giá trị nên từ giới
hạn tạp chất cho phép cho đến 120% mức chất lượng của chỉ tiêu định
lượng hoạt chất

Ví dụ: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong quy trình định lượng
đồng thời paracetamol và salicylamid bằng kỹ thuật HPLC
Paracetamol Salicylamid
C (µg/ml) S (µV x giây) C (µg/ml) S (µV x giây)
46,88 2086980 62,50 7546948
70,31 3220332 93,75 11399858
93,76 4285773 125,00 14943704
117,20 5355724 156,25 18264351
140,64 6355724 187,50 21363139

Ví dụ: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong quy trình định lượng
đồng thời paracetamol và salicylamid bằng kỹ thuật HPLC
Kết quả xử lý thống kê Paracetamol Salicylamid
Hệ số tương quan 0,9998 0,9991
Hệ số B 45536,6 110390
Giá trị t của hệ số B 80,6 40,7
Hệ số Bo -8238,7 904850
Giá trị t của hệ số Bo -0,15 2,52
Giá trị F 6503,0 1600,5
Giá trị F0,05 10,13 10,13
Giá trị t0,05 3,18 3,18
Phương trình hồi quy y = 45536,6x y = 110390x
Miền giá trị (µg/ml) 46,88 – 140,64 62,50 – 187,50

Độ chính xác – Độ đúng
• Độ đúng cao
• Độ chính xác cao

• Độ đúng thấp
• Độ chính xác cao

• Độ chính xác thấp

• Độ chính xác thấp

• Độ đúng thấp

Độ đúng
 Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần (closeness) cuả các
giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu
thử đã được làm đồng nhất trong cùng điều kiện xác định
 Còn được gọi là độ xác thực (trueness)
 Ảnh hưởng bởi sai số hệ thống
 Độ đúng cần được thiết lập trong miền giá trị (khoảng xác định) của phương
pháp phân tích
 Đại lượng đặc trưng
 Tỷ lệ thu hồi (%)
X : Hàm lượng chất chuẩn cho vào
100%
 X : Hàm lượng đo được (tìm lại được)
 RSD của tỷ lệ thu hồi

Độ đúng
 Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận phụ thuộc vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và
nồng độ chất phân tích
 Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích
Nồng độ chất phân tích (%) Tỷ số nồng độ Đơn vị tương ứng Tỷ lệ phục hồi (%)
100 1 100% 98 – 102
 10 10-1 10% 98 – 102
1 10-2 1% 97 – 103
 0,1 10-3 0,1% 95 – 105
0,01 10-4 100 ppm 90 – 107
0,001 10-5 10 ppm 80 – 110
0,0001 10-6 1 ppm 80 – 110
0,00001 10-7 100 ppb 80 – 110
0,000001 10-8 10 ppb 60 – 115
0,0000001 10-9 1 ppb 40 – 120
 Bảng này chỉ có tính tham khảo. Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100%, QTPT càng có
độ đúng cao

Độ đúng – Phương pháp tiến hành
Quy trình định lượng
Nguyên liệu
 Áp dụng QTPT đối với chất phân tích đã biết rõ độ tinh khiết (ví dụ chất đối chiếu).
 So sánh các kết quả của QTPT được đề xuất với kết quả của QTPT chính thống có độ
đúng đã được công bố và/hoặc đã được xác định (quy trình độc lập).
 Độ đúng có thể được suy ra sau khi độ chính xác, tính đặc hiệu và tính tuyến tính đã
được xác định.
Thành phẩm thuốc
 Áp dụng QTPT đối với hỗn hợp mẫu tự tạo chứa thành phần của thành phẩm thuốc
mà trong đó có một lượng đã biết trước các dược chất cần phân tích được thêm vào.
 Phương pháp thêm chuẩn: Trong trường hợp không có đầy đủ các thành phần để làm
mẫu tự tạo thì thêm lượng hoạt chất đã biết hàm lượng (đảm bảo nồng độ định lượng
vẫn nằm trong khoảng tuyến tính) vào mẫu thử đã biết trước hàm lượng.
 So sánh kết quả thu được với một quy trình chính thống có độ đúng đã được công bố
và/ hoặc đã được xác định (quy trình độc lập).
 Độ đúng có thể được suy ra sau khi độ chính xác, tính đặc hiệu và tính tuyến tính đã
được xác định.
Độ đúng – Phương pháp tiến hành
Quy trình định lượng tạp chất
 Tiến hành trên các mẫu thử (nguyên liệu hoặc thành phẩm thuốc) đã được
thêm một lượng tạp chuẩn đã biết. Trong trường hợp không có tạp và/hoặc
sản phẩm phân hủy chuẩn thì có thể chấp nhận so sánh kết quả thu được với
một quy trình chính thống. Hệ số đáp ứng của hoạt chất cũng có thể được sử
dụng.
 Trong mọi trường hợp, cần phải xác định rõ từng tạp chất hoặc tổng các tạp
chất được tính như thế nào so với chất phân tích chính (ví dụ khối lượng/ khối
lượng hoặc phần trăm diện tích)

Độ đúng – Các dữ liệu cần có
 Độ đúng phải được tính dựa trên tối thiểu 9 lần định lượng trên ít nhất 3 mức
nồng độ khác nhau trong khoảng nồng độ đã được xác định của quy trình
phân tích (ví dụ 3 nồng độ, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần)
 Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm tìm thấy của chất phân tích
trước đã biết được thêm vào mẫu thử hoặc độ lệch giữa giá trị trung bình đo
được và giá trị thực cùng với khoảng tin cậy
 Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 98,0-102,0% với RSD ≤ 2% nếu
không có quy định khác
Chú ý:
 Tỷ lệ phục hồi nên được xác định ở khoảng nồng độ cần định lượng sau này
và phải bao gồm nồng độ gần với giới hạn định lượng
 Tỷ lệ phục hồi ở mỗi nồng độ riêng biệt phải đáp ứng với mức giới hạn cho
phép, không được lấy tỷ lệ phục hồi trung bình

Ví dụ: Thẩm định độ đúng của quy trình định lượng tạp sulphon trong thành phẩm
esomeprazol bằng HPLC. Thêm chuẩn tạp D vào mẫu thử không có tạp sulphon ở ba
mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với giới hạn qui định (0,2%). Mỗi mức nồng độ,
chuẩn bị 3 mẫu và tiến hành sắc ký mỗi mẫu 1 lần
Mức nồng độ (%) Lượng thêm vào (%) Lượng tìm được (%) Tỷ lệ phục hồi (%)
0,164
0,163 99,39
0,164
80% 0,166 102,22
0,164
0,165 100,61
0,205
0,207 100,98
0,205
100% 0,203 99,02
0,205
0,202 98,54
0,245
0,249 101,63
0,245
120% 0,245 100,00
0,245
0,244 99,59
Trung bình 100,11

%RSD 1,06

Ví dụ: Thẩm định độ đúng của quy trình định lượng paracetamol trong thành
phẩm bằng HPLC
Nồng độ
HLtb para HL CĐC Diện tích Tổng lượng Hàm
tìm được
Tỷ lệ thêm có trong thêm vào ½ pic sau khi tìm được lượng Tỷ lệ phục
sau khi
CĐC (%) ½ mtb mtb viên thêm CĐC sau khi thêm phục hồi hồi (%)
thêm CĐC
viên (mg) (mg) (µV x giây) CĐC (mg) (mg)
(µg/ml)
200,7 9521603 450,72 450,7 199,0 99,15
80 200,4 9523496 450,81 450,8 199,1 99,35
199,9 9533206 451,27 451,3 199,6 99,85
249,7 10477087 495,95 496,0 244,3 97,84
100 251,7 249,5 10485295 496,34 496,3 244,6 98,04
250,3 10522573 498,10 498,1 246,4 98,44
300,1 11623678 550,22 550,2 298,5 99,47
120 300,3 11664560 552,16 552,2 300,5 100,07
302,8 11593089 548,78 548,8 297,1 98,12
TB 98,93
SD 0,83
RSD 0,84%

Độ chính xác
 Mức độ sát gần (closeness) giữa các kết quả thử riêng rẽ xi với giá trị trung bình
khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện
xác định
 Mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so với giá trị trung bình
 Ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên
 Biểu thị bằng RSD hoặc CV
 Tiêu chuẩn chấp thuận cho độ chính xác phụ thuộc rất nhiều vào loại phân tích
 QTĐL thường quy: RSD có thể đạt dễ dàng trên dưới 1%
 Phân tích các mẫu sinh học: độ chính xác khoảng 20% ở giới hạn định lượng dưới
và 15% ở các nồng độ khác cao hơn
 Mẫu thực phẩm và mẫu môi trường: độ chính xác tùy thuộc rất nhiều vào mẫu
phân tích, nồng độ chất phân tích và kỹ thuật phân tích. Trong các trường hợp này,
RSD có thể thay đổi từ 2% đến khoảng 20%

Độ chính xác
Sự thay đổi độ chính xác theo nồng độ chất phân tích

Nồng độ chất phân tích (%) Tỷ số nồng độ Đơn vị tương ứng RSD %
100 1 100% 1,3

10 10-1 10% 2,8
1 10-2 1% 2,7
0,1 10-3 0,1% 3,7
0,01 10-4 100 ppm 5,3
0,001 10-5 10 ppm 7,3
0,0001 10-6 1 ppm 11
0,00001 10-7 100 ppb 15
0,000001 10-8 10 ppb 21
0,0000001 10-9 1 ppb 30
 Bảng trên chỉ mang tính chất tham khảo. Giá trị RSD càng nhỏ, QTPT càng có độ
chính xác cao

Độ chính xác – Phân loại
 Độ lặp lại (repeatability)

 Độ chính xác trung gian (intermediate precision)
 Độ tái lặp (reproducibility)

Độ lặp lại (repeatability)
 Biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và trong khoảng thời gian
ngắn, cụ thể là việc tiến hành thử nghiệm được thực hiện bởi một người trong
cùng một phòng thí nghiệm, trên cùng một trang thiết bị và trong cùng một thời
gian
 Tiến hành: định lượng tối thiểu 9 mẫu thử trong khoảng nồng độ đã được xác
định của quy trình (ví dụ: 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ 3 mẫu thử) hoặc
thực hiện định lượng tối thiểu 6 mẫu thử ở nồng độ 100% (nồng độ định lượng)
 Yêu cầu: RSD  2% nếu không có qui định riêng

Độ lặp lại (repeatability)
 Ví dụ: Xác định hàm lượng của viên nén Alphachymotrypsin trong mẫu thử
bằng QTPT đề xuất qua 7 lần xác định
Số lần xác định Kết quả (%) Số liệu thống kê

1 98,5
n =7
2 98,1
x= 98,47%
3 98,7
SD = 0,62%
4 99,7
RSD% = CV% =  0,63 %
5 98,1
e =  0,57% (với t = 2,47 ở P = 0,95 và n = 7)
6 98,4
Khoảng tin cậy:  = 98,47%  0,57%
7 97,8

Độ chính xác trung gian

 Biểu thị độ chính xác của quy trình theo các biến số của phòng thí nghiệm tại nhiều
ngày khác nhau (độ chính xác liên ngày), với nhiều kiểm nghiệm viên khác nhau và với
các trang thiết bị khác nhau, … .
 Việc xác định độ chính xác trung gian phụ thuộc vào tình hình cụ thể đối với từng
QTPT được áp dụng. Cơ sở xây dựng quy trình cần chỉ ra ảnh hưởng của các biến cố
ngẫu nhiên đến độ chính xác của QTPT
 Những thay đổi điển hình cần xem xét bao gồm: ngày phân tích, kiểm nghiệm viên,
thiết bị, v.v... Thực tế không cần phải nghiên cứu những ảnh hưởng này một cách riêng rẽ.
Khuyến khích sử dụng thiết kế thực nghiệm (ma trận)
 Tiến hành: Tùy vào tình huống, phương pháp chủ yếu là thực hiện định lượng lặp lại
nhiều mẫu. So sánh kết quả được thực hiện trong cùng một phòng thí nghiệm nhưng bởi
các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác, thiết bị khác. Các kết quả thu được không
được khác nhau có ý nghĩa thống kê (có thể dùng test F với khoảng tin cậy 95% để đánh
giá)

Độ chính xác trung gian

 Ví dụ: Xác định độ chính xác trung gian của phương pháp HPLC để định
lượng đồng thời paracetamol và salicylamid
Hàm Hàm lượng thực (mg) Giá trị

Giá trị
Hoạt chất lượng thống kê 3
thống kê Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
trên nhãn ngày
TB 154,62 156,02 156,63 155,76
Paracetamol 150,00 mg SD 0,64 0,29 0,36 0,97
RSD 0,42% 0,19% 0,23% 0,62%
TB 217,52 219,15 219,33 218,67
Salicylamid 200,00 mg SD 0,95 0,17 0,41 1,02
RSD 0,44% 0,08% 0,19% 0,47%

Độ tái lặp
 Biểu thị độ chính xác của nhiều phòng thí nghiệm (hợp tác nghiên cứu) tiến
hành nghiên cứu trên cùng một mẫu đồng nhất đã được phân thành nhiều mẫu
nhỏ
 Độ tái lặp được xác định bằng cách so sánh kết quả giữa các phòng thí
nghiệm.
 Độ tái lặp được tiến hành đánh giá trong trường hợp tiêu chuẩn hóa QTPT (ví
dụ như đối với các quy trình trong dược điển)
 Những số liệu này không nằm trong hồ sơ đăng ký thuốc

Độ chính xác – Các dữ liệu cần có
 Độ chính xác của một quy trình cần phải đưa ra các dữ liệu sau:
Độ lệch chuẩn (standard deviation), độ lệch chuẩn tương đối
(Relative standard deviation) hay hệ số biến thiên (Coefficient
of variation) và khoảng tin cậy
 Một QTPT nếu chỉ đạt riêng độ chính xác hay độ đúng thì chưa
đủ. Do vậy một quy trình phải đáp ứng cả độ chính xác lẫn độ
đúng. Quy trình như vậy mới chắc chắn rằng ít bị ảnh hưởng bởi
sai số ngẫu nhiên hay sai số hệ thống và nếu có là với mức độ xác
suất có thể chấp nhận được. Đây là hai yếu tố căn bản cần thẩm
định

Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng
Đáp ứng
Miền giá trị
Độ dốc = Độ nhạy
S/N = 10/1
S/N = 3/1
Tung độ
góc
Hàm lượng
Minh họa tính tuyến tính, miền giá trị, LOD và LOQ

 LOD là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện
được nhưng không nhất thiết để có thể định lượng được
 LOQ là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng
được với độ đúng và độ chính xác thích hợp. LOQ là một thông số của phép
định lượng các chất có nồng độ thấp trong mẫu thử, đặc biệt thường được
dùng để xác định tạp chất và/hoặc sản phẩm phân hủy
 LOD và LOQ thường được biểu thị bằng phần trăm, phần ngàn, phần triệu
(ppm), phần tỷ (ppb)
 Không có các mức giới hạn bắt buộc phải đạt được đối với các giá trị LOD và
LOQ của mỗi phương pháp

Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng – Phương pháp tiến hành
 Phương pháp xác định LOD và LOQ tùy thuộc vào QTPT là
phương pháp phân tích dụng cụ hay không dụng cụ
 Ngoài các phương pháp nêu ra dưới đây, các phương pháp
khác cũng có thể được chấp nhận
 Dựa vào quan sát
 Dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu
 Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc
 Dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng
 Dựa vào đường chuẩn

Dựa vào quan sát
 Thường dùng cho phương pháp phân tích không dụng cụ, nhưng
cũng có thể dùng cho các phương pháp phân tích dụng cụ
 LOD: phân tích mẫu thử có chất phân tích đã biết nồng độ và xác
định nồng độ tối thiểu mà tại đó có thể đọc được đáp ứng của chất
phân tích
 LOQ: phân tích mẫu thử có chất phân tích đã biết nồng độ và xác
định nồng độ tối thiểu mà tại đó có thể định lượng được chất cần
phân tích với độ đúng và độ chính xác có thể chấp nhận được

Dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu

 Chỉ có thể áp dụng cho những phương pháp phân tích có nhiễu
đường nền (HPLC, GC, CE)
 So sánh đáp ứng đo được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích
thấp đã biết với đáp ứng của mẫu trắng, từ đó tính được nồng độ
tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện (LOD) và có thể định
lượng được (LOQ)
 Tỷ lệ đáp ứng trên nhiễu (S/N) nằm giữa 3:1 hoặc 2:1 thường
được chấp nhận để thiết lập LOD và thông thướng 10:1 với LOQ

 Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) ảnh hưởng đến độ chính xác
của kết quả định lượng và có thể tính theo công thức
2H
S/N 
h
 H là chiều cao của pic ứng với chất cần thử trên sắc ký đồ
thu được với dung dịch chất chuẩn có nồng độ đã định,
chiều cao này được đo từ đỉnh pic đến đường nền ngoại
suy trên một khoảng bằng 20 lần chiều rộng của pic ở nửa
chiều cao của pic
 h là khoảng dao động của nhiễu đường nền trên sắc ký đồ
thu được với mẫu trắng, khoảng dao động này được xác
định trên một quảng đường bằng 20 lần chiều rộng của pic
ở nửa chiều cao của pic trên sắc ký đồ thu được với dung
dịch chất chuẩn đã định và nếu có thể thì khoảng đường
này phân bố đều hai bên vị trí của pic của chất cần thử

Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc

Giá trị LOD và LOQ của phương pháp được xác định theo công thức sau:
SD SD
LOD  3,3  LOQ  10 
a a
Trong đó:
+ a: Độ dốc của đường chuẩn
+ SD: Độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. Có thể xác định SD theo nhiều cách
Dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng
Tiến hành một số lượng thích hợp các phân tích trên mẫu trắng, đo đáp ứng
nền và tính độ lệch chuẩn của các đáp ứng này
Dựa vào đường chuẩn
Dựa vào đường chuẩn đặc trưng của mẫu thử có chứa chất phân tích có
nồng độ nằm gần trong khoảng LOD hay LOQ. Số dư độ lệch chuẩn của
đường hồi quy hoặc độ lệch chuẩn của giá trị giao điểm với trục tung của
đường hồi quy có thể được sử dụng như là độ lệch chuẩn

Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng – Các dữ liệu cần có
 Giá trị LOD và LOQ

 LOD: Nếu dựa vào quan sát hoặc dựa vào tỷ lệ đáp ứng trên nhiễu
thì cần đưa ra các sắc ký đồ có liên quan. Trong trường hợp ước
tính giá trị LOD bằng tính toán hoặc bằng ngoại suy thì sau đó
những ước tính này cần được đánh giá bằng cách phân tích độc lập
một số lượng mẫu thử thích hợp có nồng độ đã biết gần với giới
hạn phát hiện hoặc bằng giới hạn phát hiện
 LOQ: Giới hạn này sau đó cần được đánh giá bằng cách phân tích
một số lượng mẫu thử thích hợp có nồng độ đã biết gần với giới
hạn định lượng hoặc bằng giới hạn định lượng

Ví dụ: Xác định LOD và LOQ của quy trình định lượng tạp sulfon
của esomepreazol bằng HPLC
 Dựa vào quan sát thực nghiệm
 LOD là 0,01 mcg/ml và LOQ = 0,04 mcg/ml
 Tiêm lặp lại 6 lần ở nồng độ LOQ để xác định độ chính xác cho
kết quả RSD của diện tich pic nhỏ hơn 3% và giá trị S/N trung
bình là 10,4
 Tiến hành thẩm định độ đúng tại LOQ cho tỷ lệ thu hồi 97% -
103%

Ví dụ: Xác định LOD và LOQ của quy trình định lượng tạp sulfon của
esomepreazol bằng HPLC
Mẫu trắng Mẫu giả dược
Mẫu chuẩn Mẫu thử Esomeprazol
Esomeprazol
Tạp D
Tạp D

Ví dụ: Xác định LOD và LOQ của quy trình định lượng tạp sulfon của
esomepreazol bằng HPLC
LOD (S/N = 3/1) LOQ (S/N = 10/1)

Độ bền, độ thô (Robustness)
 Việc đánh giá độ thô cần được xem xét trong giai đoạn phát triển phương
pháp và tùy thuộc vào loại QTPT đang được nghiên cứu
 Độ thô chỉ ra được mức độ tin cậy của phương pháp khi có những thay đổi
nhỏ có chủ định của các thông số của phương pháp
 Nếu những phép đo nhạy cảm với những thay đổi điều kiện phân tích thì điều
kiện phân tích cần được kiểm soát thích hợp, hoặc chỉ dẫn những điểm cần
lưu ý trong quá trình phân tích
 Kết quả đánh giá độ thô là kết quả đánh giá dãy các thông số phản ảnh tính
thích hợp của hệ thống (ví dụ: độ phân giải) phải được thiết lập để đảm bảo
duy trì được tính hiệu lực của QTPT bất kỳ khi nào sử dụng

 Một số các biến đổi thường gặp trong phân tích là

 Tính ổn định của dung dịch phân tích
 Thời gian chiết
 Sắc ký lỏng
 Ảnh hưởng của sự thay đổi pH và thành phần trong pha động
 Ảnh hưởng của cột sắc ký khác nhau (lô sản xuất, nhà cung cấp)
 Ảnh hưởng của nhiệt độ cột và tốc độ dòng
 Sắc ký khí
 Ảnh hưởng của cột sắc ký khác nhau (lô sản xuất, nhà cung cấp)
 Ảnh hưởng của nhiệt độ cột và tốc độ dòng

Ví dụ: Thẩm định chỉ tiêu độ thô của quy trình định lượng fexofenadin và tạp A bằng phương
pháp HPLC
 Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; 5 µm); Pha động: ACN –
H2O – H3PO4 - NH4OH (42:58:0,1:0,2); Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 20
µL; Bước sóng phát hiện: 220 nm
 Tiến hành phân tích mẫu chuẩn ở các điều kiện thay đổi như sau:
 Thay đổi tốc độ dòng ± 0,1 ml/phút
 Thay đổi thành phần pha động với tỷ lệ 5%
 Yêu cầu:
 Độ phân giải giữa fexofenadin và tạp A phải lớn hơn 1,5
 RSD của thời gian lưu và diện tích pic fexofenadin và tạp A có trong các mẫu ≤ 2,0%
 Hệ số bất đối của pic fexofenadin và tạp A phải trong khoảng 0,8-1,5

pháp HPLC
Kết quả khảo sát độ thô khi thay đổi tốc độ dòng
Tốc độ tR
Hoạt chất RSD% S (mAU x giây) RSD% RS AS
dòng (phút)
Fexofenadin 8,386 0,07 3022,016 0,09 1,4
0,8 ml/phút
Tạp A 12,610 0,25 185,682 0,73 5,7 1,1
Fexofenadin 9,566 0,43 3100,127 0,67 1,5
0,7 ml/phút
Tạp A 14,221 0,62 186,011 0,89 5,9 1,1
Fexofenadin 7,388 0,27 3078,466 0,45 1,4
0,9 ml/phút
Tạp A 11,034 0,46 185,440 0,78 6,0 1,1

pháp HPLC
Kết quả khảo sát độ thô khi thay đổi tỷ lệ thành phần pha động
Hệ Pha động (ACN

S (mAU x
pha - H2O - H3PO4 - Hoạt chất tR (phút) RSD% RSD% RS AS
giây)
động NH4OH)
40 : 60 : 0,1 : Fexofenadin 6,551 0,08 3025,581 0,45 1,5
1
0,2 Tạp A 9,205 0,34 187,228 0,92 5,2 1,1
42 : 58 : 0,1 : Fexofenadin 8,386 0,07 3022,016 0,09 1,4
2
0,2 Tạp A 12,610 0,25 189,682 0,73 5,7 1,1
45 : 55 : 0,1 : Fexofenadin 10,096 0,09 3028,368 0,57 1,5
3
0,2 Tạp A 15,425 0,68 188,222 1,07 5,6 1,2

Phép thử tính thích hợp của hệ thống (Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống)
 Là phần không thể tách rời trong nhiều QTPT (HPLC, GC, CE,
IR)
 Đánh giá tính thích hợp của hệ thống là những phép thử nhằm
đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu
thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách
tiến hành phân tích và mẫu thử
 Các thông số của phép thử tính tương thích của hệ thống được
thiết lập cho từng quy trình riêng biệt phụ thuộc vào loại quy trình
được thẩm định. Các thông số này đặc biệt quan trọng trong
các phương pháp sắc ký

 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống được áp dụng để đánh giá lại
(verification) các phương pháp trong dược điển/AOAC hoặc QTPT đã được
thẩm định và phải được thực hiện trước khi thử nghiệm. Chỉ khi các tiêu chí về
tính phù hợp của hệ thống được đáp ứng thì phương pháp hoặc quy trình mới
được coi là phù hợp với mục đích sử dụng
 Nếu một số lượng lớn các mẫu đang được phân tích liên tục, thì việc kiểm tra
tính phù hợp của hệ thống sẽ được thực hiện trong suốt chuỗi thử nghiệm để
chứng minh rằng hiệu năng của quy trình là đạt yêu cầu
 Việc đánh giá lại là không cần thiết đối với các phương pháp cơ bản trong
dược điển như: pH, mất khối lượng khi làm khô và các phương pháp hóa ướt
...

 Trong phương pháp sắc ký, các bộ phận khác nhau của thiết bị sắc ký cần phải
được kiểm tra hiệu chỉnh để có thể đạt được hiệu năng theo yêu cầu khi tiến hành
phép thử hay định lượng
 Các phép thử tính phù hợp của hệ thống là phần không thể thiếu của một phương
pháp và được dùng để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp
 Hiệu lực biểu kiến, thừa số lưu giữ (hệ số phân bố khối lượng), độ phân giải, độ
lưu giữ tỷ đối và hệ số đối xứng là những thông số thường được dùng để đánh giá
hiệu năng của cột
 Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến đặc tính sắc ký bao gồm: thành phần, nồng
độ ion, nhiệt độ và pH biểu kiến của pha động; Tốc độ dòng, kích thước cột, nhiệt
độ cột và áp suất; Các đặc tính của pha tĩnh bao gồm loại chất mang, độ xốp (cỡ
lỗ), cỡ hạt, kiểu các hạt, diện tích bề mặt riêng; Pha đảo và các pha tĩnh có biến
đổi bề mặt khác như biến đổi hoá học (được biểu thị bởi end-capping, carbon
loading v.v...]
Các yêu cầu sau đây và các yêu cầu bổ sung trong chuyên luận cụ thể phải được đáp ứng,
trừ khi có chỉ dẫn khác:
 Trong phép thử các tạp chất liên quan hay định lượng, hệ số đối xứng của pic chính
trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu phải trong khoảng từ 0,8 đến 1,5, trừ khi
có chỉ dẫn khác;
 Trong phép định lượng hoạt chất mà giá trị xác định là 100% chất tinh khiết, độ lệch
chuẩn tối đa được phép [RSD(%)max] cho các lần tiêm lặp lại của dung dịch đối chiếu
được tính theo công thức sau:
0,6 t90%,5
KB n K là một hằng số (= 0,349) thu được từ biểu thức K  
RSD(%)max = 2 6
0,6
t 90%,n 1 mà biểu thị RSD yêu cầu cho 6 lần tiêm với B = 1,0
2
B là giới hạn trên được cho trong chuyên luận riêng trừ đi 100%
n là số lần tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu (3  n  6)
t90%,n-1 là giá trị t-Student ở mức xác xuất 90% (hai phía) với bậc tự do và n-1

 Nếu không có chỉ dẫn gì khác, độ lệch chuẩn tương đối được phép tối đa
không được vượt quá giá trị tương ứng ghi trong bảng dưới đây. Yêu cầu này
không áp dụng cho phép thử các tạp chất liên quan
Số lần tiêm lặp lại
3 4 5 6
B (%) Độ lệch chuẩn tương đối được phép tối đa
2,0 0,41 0,59 0,73 0,85
2,5 0,52 0,74 0,92 1,06
3,0 0,63 0,89 1,10 1,27
 Trong phép thử các tạp chất liên quan, LOQ phải bằng hoặc nhỏ hơn giới hạn
cho phép
 Yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống là đòi hỏi cho quá trình tiến hành sắc ký.
Tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như tần suất sử dụng và kinh nghiệm với
hệ thống sắc ký, người phân tích sẽ lựa chọn một quy trình kiểm chứng thích
hợp về tính phù hợp này
 Ví dụ: Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng
thời paracetamol và salicylamid bằng phương pháp HPLC trên mẫu chuẩn
(n=6)
Dược chất Giá trị
tR (phút) S (µV x giây) AS RS Nbk
thống kê
TB 3,667 4586474 1,4 2,0 5791
Paracetamol
RSD 0,09% 0,56% 0,56% 0,37% 1,28%
TB 5,946 16471990 1,4 4,8 7299
Salicylamid
RSD 0,23% 0,51% 1,04% 0,54% 0,96%

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký

 Mức độ điều chỉnh các thông số khác nhau để thỏa mãn tính phù hợp của hệ
thống sắc ký mà không làm thay đổi căn bản phương pháp được liệt kê tùy
theo phương pháp sắc ký (tham khảo Dược điển Việt Nam V)
 Việc điều chỉnh các điều kiện rửa giải gradient thì khắt khe hơn so với rửa giải
đẳng dòng vì nó có thể dẫn tới sự chuyển dịch các pic đến một bước khác của
quá trình gradient. Điều này dẫn đến việc xác định không đúng vị trí các pic,
làm che lấp pic hoặc làm chuyển dịch pic tới mức chất phân tích được rửa giải
ra sau thời gian đã định
 Những thay đổi khác với những điểm đã được qui định đòi hỏi phải thẩm định
lại phương pháp
 Những điều kiện sắc ký được mô tả đều đã được thẩm định khi biên soạn xây
dựng chuyên luận

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký – Sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy
 Thành phần của pha động: Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh ± 30%
nồng độ tương đối hay ± 2% nồng độ tuyệt đối tùy theo khoảng giá trị nào lớn hơn. Ví
dụ với dung môi thành phần nhỏ là 10% của pha động thì thay đổi 30% tương đối nghĩa
là nồng độ trong khoảng 7% đến 13% trong khi thay đổi 2% nồng độ tuyệt đối nghĩa là
nồng độ trong khoảng 8% đến 12%; như vậy, khoảng theo nồng độ tương đối lớn hơn.
Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối.
 pH của thành phần nước trong pha động được thay đổi ± 0,2 đơn vị pH, hoặc thay đổi ±
1,0 đơn vị pH khi nghiên cứu các chất không ion hóa.
 Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động được thay đổi ± 10%.
 Thể tích mẫu chấm sắc ký điều chỉnh trong khoảng 10% đến 20% của thể tích quy định
nếu sử dụng bản mỏng cỡ hạt nhỏ (2 μm đến 10 μm).
 Khoảng dịch chuyển của tuyến dung môi không được dưới 50 mm và với bản mỏng
hiệu năng cao thì không được dưới 30 mm

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký – Sắc ký lỏng rửa giải đẳng dòng
 Thành phần pha động: Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh ± 30% nồng
độ tương đối hay ± 2% nồng độ tuyệt đối tùy theo khoảng giá trị nào lớn hơn. Không
thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối.
 pH của thành phần nước trong pha động: Chỉ điều chỉnh thay đổi ± 0,2 đơn vị pH hoặc
thay đổi ± 1,0 đơn vị pH khi nghiên cứu các chất không ion hóa.
 Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động được thay đổi ± 10%
 Tốc độ dòng: ± 50%; có thể chấp nhận một sự điều chỉnh lớn hơn khi thay đổi kích
thước cột
 Nhiệt độ: Được điều chỉnh ± 10°C khi có quy định nhiệt độ tiến hành sắc ký
 Bước sóng của đầu dò phát hiện: Không được điều chỉnh.
 Thể tích tiêm: Có thể giảm đi miễn là khả năng phát hiện và độ lặp lại của pic cần xác
định thỏa mãn yêu cầu; không cho phép tăng thể tích tiêm

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký – Sắc ký lỏng rửa giải đẳng dòng
 Các thông số cột:
 Pha tĩnh: Không thay đổi bản chất của nhóm thế trong pha tĩnh (ví dụ không thay
C18 bằng C8); Kích thước hạt: Cho phép giảm tối đa 50%; không được phép tăng.
 Kích thước cột: Chiều dài: ± 70%; Đường kính trong: ± 25%
 Khi kích thước cột thay đổi, tốc độ dòng có thể phải điều chỉnh theo công thức sau:
F1 là tốc độ dòng được chỉ ra trong chuyên luận (ml/phút)

F2 là tốc độ dòng hiệu chỉnh (ml/phút)
l1 là chiều dài cột ghi trong chuyên luận (mm)
l2 là chiều dài cột được sử dụng (mm)
d1 là đường kính trong của cột ghi trong chuyên luận (mm)
d2 là đường kính trong của cột được sử dụng (mm).

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký – Sắc ký lỏng rửa giải gradient
Việc điều chỉnh các điều kiện cho hệ thống sắc ký rửa giải gradient đòi hỏi cần cẩn thận
hơn so với hệ thống sắc ký đẳng dòng.
 Thành phần của pha động dùng rửa giải gradient: Những điều chỉnh nhỏ về thành phần
của pha động và chương trình dung môi có thể được chấp nhận, miễn là:
 Các yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống được thỏa mãn;
 Các pic chính được rửa giải trong vòng ± 15% của thời gian lưu quy định;
 Thành phần cuối cùng của pha động không yếu hơn về lực rửa giải so với thành
phần quy định.
 Khi không thể đạt được thỏa mãn các yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống thì
nên xem xét về thể tích lưu trú (còn gọi là thể tích trễ gradient: là thể tích giữa
điểm mà các chất rửa giải của pha động gặp nhau và đỉnh của cột) hoặc thay đổi
cột tách

Thể tích lưu trú (Dwell volume)
 Cấu hình của thiết bị dùng có thể làm thay đổi đáng kể độ phân giải, thời gian
lưu và thời gian lưu tỷ đối được quy định; đó là do thể tích lưu trú quá lớn
 Các chuyên luận thường đưa vào một giai đoạn đẳng dòng trước khi bắt đầu
chương trình gradient để làm thích ứng với các thời điểm gradient; điều này
giúp xem xét sự khác nhau giữa thể tích lưu trú của hệ thống thiết bị được sử
dụng để phát triển phương pháp và hệ thống đang được sử dụng
 Người sử dụng có trách nhiệm điều chỉnh khoảng thời gian của giai đoạn đẳng
dòng cho phù hợp với thiết bị được sử dụng

Thể tích lưu trú (Dwell volume)
 Nếu thể tích lưu trú được dùng khi xây dựng chuyên luận được chỉ ra trong
chuyên luận, các thời điểm (t min) ghi trong bảng chương trình dung môi có thể
được thay thế bằng các thời điểm điều chỉnh (tc min) và được tính bằng công
thức sau:
D là thể tích lưu trú (ml)
D0 là thể tích lưu trú khi phát triển phương pháp (ml)
F là tốc độ dòng (ml/phút)
Giai đoạn đẳng dòng bổ sung cho mục đích trên đây
có thể bỏ qua nếu các số liệu thẩm định để áp dụng
phương pháp không có giai đoạn này

 pH của thành phần nước trong pha động không được phép điều chỉnh.
 Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động cũng không được phép điều chỉnh.
 Tốc độ dòng: Có thể điều chỉnh tốc độ dòng khi kích thước cột tách thay đổi (tương tự
sắc ký lỏng rửa giải đẳng dòng)
 Các thông số về cột:
 Pha tĩnh: Không thay đổi bản chất của nhóm thế trong pha tĩnh (ví dụ không thay
C18 bằng C8); Kích thước tiểu phân không được thay đổi.
 Kích thước cột: Chiều dài: ± 70%; Đường kính trong: ± 25%.
 Khi kích thước cột tách thay đổi, tốc độ dòng có thể phải điều chỉnh dựa theo công
thức tương tự trong sắc ký lỏng rửa giải đẳng dòng
 Nhiệt độ: ± 5°C khi nhiệt độ vận hành sắc ký được quy định trong chuyên luận
 Bước sóng phát hiện của đầu dò: Không được điều chỉnh.
 Thể tích tiêm: Có thể giảm đi miễn là khả năng phát hiện và độ lặp lại của pic cần xác
định thỏa mãn yêu cầu; không cho phép tăng thể tích tiêm

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký – Sắc ký khí

 Pha tĩnh: Kích thước tiểu phân: Có thể giảm tối đa 50%; không được phép
tăng lên (cột nhồi); Bề dày lớp phim: Cho phép thay đổi từ -50% đến
+100% (cột mao quản).
 Kích thước cột: Chiều dài: ± 70%; Đường kính trong: ± 50%.
 Tốc độ dòng: ± 50%.
 Nhiệt độ: ± 10%.
 Thể tích tiêm và thể tích chia dòng: Có thể được điều chỉnh, miễn là khả năng
phát hiện và độ lặp lại là thỏa mãn yêu cầu

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký – Sắc ký lỏng siêu tới hạn
 Thành phần pha động: Đối với cột nhồi, lượng hợp phần dung môi nhỏ có thể được
điều chỉnh ± 30% tương đối hay ± 2% tuyệt đối, tùy theo khoảng giá trị nào lớn hơn;
không cho phép thay đổi đối với hệ thống cột mao quản.
 Bước sóng phát hiện của đầu dò không được thay đổi.
 Pha tĩnh: Kích thước tiểu phân: Có thể giảm tối đa 50%; không được phép tăng lên
(cột nhồi).
 Kích thước cột: Chiều dài: ± 70%; Đường kính trong: ± 25% cho cột nhồi và ± 50%
cho cột mao quản.
 Tốc độ dòng: ± 50%.
 Nhiệt độ: ± 5°C khi nhiệt độ vận hành sắc ký được quy định trong chuyên luận.
 Thể tích tiêm: Có thể được điều chỉnh, miễn là khả năng phát hiện và độ lặp lại là thỏa
mãn yêu cầu, không được phép tăng lên.

Hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích theo Bộ Y tế

bằng HPLC

Tính đặc hiệu (tính chọn lọc)
Thực nghiệm:
 Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:
 Mẫu trắng: Dung môi pha động, dung môi hòa tan mẫu, pha loãng mẫu
(nếu có),…
 Mẫu giả dược (placebo – mẫu nền) bao gồm các thành phần tương tự
như chế phẩm thuốc nhưng không chứa dược chất.
 Mẫu chuẩn: chứa chất chuẩn cần phân tích pha trong dung môi pha động.
Mẫu chuẩn thường có nồng độ chất cần phân tích ở khoảng nồng độ giữa
của đường chuẩn.
 Mẫu thử: chứa dược chất cần phân tích. Mẫu thử có nồng độ chất cần
phân tích tương đương với nồng độ trong mẫu chuẩn.
 Ghi lại các sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích; độ
tinh khiết của pic hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử; phổ UV
của pic hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn.


Yêu cầu:
 Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu placebo không xuất hiện pic ở trong khoảng
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
 Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic của chất
chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử nếu xuất hiện
thêm các pic khác (pic tạp) không phải pic của hoạt chất cần phân tích, thì pic
của hoạt chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp và đáp ứng
các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng được qui định trong dược
điển.
 Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử phải tinh khiết (purity
level xấp xỉ 100%). Hệ số chồng phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích thu
được trong sắc ký đồ và phổ UV của pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu
chuẩn xấp xỉ 1,0.


Báo cáo:
 Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu giả dược… bao gồm
cả lượng cân các thành phần, quy trình xử lý mẫu, hệ số pha loãng (nếu có).
 Sắc ký đồ đại diện cho các loại mẫu. Trong sắc ký đồ phải có các thông tin
như tên mẫu, loại mẫu; và các thông tin của pic (thời gian lưu, diện tích/chiều
cao, mức độ tinh khiết pic, hệ số đuôi, độ phân giải,….)
 Kết quả so sánh thời gian lưu, đáp ứng pic (nếu có) của mẫu giả dược, mẫu
thử và mẫu chuẩn.
 Kết quả so sánh phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích trong mẫu thử và
mẫu chuẩn.

Tính tuyến tính (khoảng xác định)

Thực nghiệm:
 Chuẩn bị dãy các mẫu chuẩn, có nồng độ phải bao phủ khoảng xác định của
phương pháp (tối thiểu phải tương ứng với từ 80% đến 120% giá trị hàm
lượng so nhãn). Mẫu có nồng độ chất cần phân tích của dãy chuẩn phải lớn
hơn giá trị LOQ của phương pháp. Số lượng các mẫu của dẫy chuẩn tối thiểu
là 05 mẫu (không bao gồm mẫu giả dược). Có thể chuẩn bị các mẫu của dãy
chuẩn bằng cách pha loãng từ một mẫu chuẩn ban đầu với các hệ số pha
loãng khác nhau hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác
nhau.
 Tiến hành sắc ký các mẫu, ghi lại các sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic
trong các mẫu.
 Xác định phương trình hồi qui tuyến, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng
độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng
phương pháp bình phương tối thiểu.

Tính tuyến tính (khoảng xác định)
Yêu cầu:
 Hệ số tương quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,999. Trường hợp r < 0,999 phải có
sự giải thích phù hợp.
Báo cáo:
 Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu chuẩn bao gồm lượng cân, quy trình xử lý
mẫu, hệ số pha loãng (nếu có).
 Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu.
 Kết quả xác định phương trình hồi qui và hệ số tuyến tính:
Lượng cân chuẩn (mg) Nồng độ chất cần phân tích Diện tích pic
Stt
hoặc hệ số pha loãng trong mẫu (mcg/mL) - X (mV*s) - Y
1
….
n
Phương trình hồi qui: Y = ax + b
Hệ số tương quan: r = ………….

Độ đúng
Thực nghiệm:
 Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn
cần phân tích vào các mẫu giả dược.
 Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất
cần phân tích vào các mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3
mức nồng độ 80, 100 và 120% so với mức nồng độ định lượng ghi trong quy trình và
nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít
nhất 03 mẫu độc lập.
 Phân tích mẫu theo quy trình phân tích. Xác định độ đúng của phương pháp theo
công thức:
Tỉ lệ thu hồi (%) = (Lượng hoạt chất thu hồi/Lượng HC thêm vào ) x 100%
Yêu cầu:
 Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và giá trị RSD ≤
2,0%. Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp.
 Có thể báo cáo độ đúng và giá trị RSD tại mỗi mức nồng độ hoặc tính chung cho tất cả
các mức nồng độ.

Độ đúng
Báo cáo:
 Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu bao gồm cả lượng cân, hệ số pha loãng, nồng độ
mẫu…
 Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu xác định độ đúng của phương pháp.
 Kết quả xác định độ đúng của phương pháp:
Lượng chất Lượng hoạt Tỷ lệ
Khối lượng giả
Mẫu STT chuẩn thêm vào Diện tích pic chất tìm lại
dược (mg) thu hồi (%)
(mg) (mg)
1
80%
…..
TB
RSD
1
100%
…..
TB
RSD
1
120%
…..
TB
RSD

Độ chính xác – Độ lặp lại
Tính thích hợp của hệ thống
Thực nghiệm:
 Chuẩn bị mẫu thử hoặc chuẩn theo quy trình. Nồng độ hoạt chất trong mẫu
tương ứng với nồng độ giữa của đường chuẩn. Lượng mẫu thử đủ cho ít nhất
5 lần tiêm mẫu.
 Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện
tích pic trung bình và các thông số khác của pic (độ phân giải, hệ số đuôi,..).
Yêu cầu:
 Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%, nếu không có qui
định khác. Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp.
 Các thông số khác của pic phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp sắc
ký qui định trong Dược điển và qui định cụ thể trong đề cương thẩm định đối
với phương pháp.

Tính thích hợp của hệ thống
Báo cáo:
 Cách chuẩn bị và xử lý mẫu bao gồm lượng cân, quy trình xử lý mẫu, hệ số
pha loãng…
 Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu xác định tính thích hợp của hệ thống.
 Kết quả xác định tính thích hợp của hệ thống:
Thời gian lưu Diện tích pic Chiều cao pic Thông số khác
Stt
(phút) (mV*s) (mV) (nếu có)
1
….
n≥5
Trung bình
SD
RSD (%)

Độ lặp lại
Thực nghiệm:
 Tiến hành phân tích tối thiểu ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ 3 lần trong khoảng
nồng độ đã xác định của quy trình.
 Hoặc tiến hành phân tích tối thiểu 06 mẫu thử ở nồng độ 100%.
 Xác định hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu.
 Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định
lượng hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu.
Yêu cầu:
 Giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ≤
2,0%. Các trường hợp giá trị RSD > 2%, cần phải có sự giải thích phù hợp.

Độ lặp lại
Báo cáo:
 Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu bao gồm lượng cân, quy trình xử lý mẫu, hệ
số pha loãng
 Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu thẩm định độ lặp lại.
 Kết quả xác định độ lặp lại:
Lượng cân mẫu thử Diện tích pic % Hàm lượng hoạt chất
Stt
(mg) (mV*s) trong mẫu
1
….
6
Trung bình
SD
RSD (%)

Độ chính xác – Độ chính xác trung gian
Thực nghiệm:
 02 kiểm nghiệm viên, phân tích các mẫu tự tạo (thêm chất chuẩn chất phân
tích vào mẫu giả dược) có nồng độ chất cần phân tích tương ứng với 100%
hàm lượng ghi nhãn một cách độc lập trên 02 hệ thống HPLC khác nhau. Mỗi
kiểm nghiệm viên phân tích 06 mẫu.
 Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong
các mẫu do mỗi kiểm nghiệm viên phân tích và giữa hai kiểm nghiệm viên.
 Xác định mức độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên.
Yêu cầu:
 Giá trị định lượng trung bình của mỗi kiểm nghiệm viên và của cả hai kiểm
nghiệm viên phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0%.
 Giá trị RSD (%) kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm và của cả hai kiểm
nghiệm viên phải ≤ 2,0%.
 Độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%.
Chú ý:
 Trường hợp giá trị trung bình và/hoặc giá trị RSD nằm ngoài các khoảng
chấp nhận nói trên, cần phải có có sự giải thích phù hợp.
 Trong một số trường hợp có thể sử dụng Test-F hoặc phân tích ANOVA để
đánh giá kết quả phân tích giữa 2 kiểm nghiệm viên để xác định độ chính xác
trung gian.
Báo cáo:
 Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu chuẩn và thử bao gồm lượng cân, quy trình
xử lý mẫu, hệ số pha loãng (nếu có).
 Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu do mỗi kiểm nghiệm viên phân tích.
 Kết quả xác định độ chính xác trung gian:

Báo cáo:
Kiểm nghiệm viên: …………………… Kiểm nghiệm viên: ……………………
Ngày phân tích: …………………………. Ngày phân tích: ………………………….
Stt Hệ thống HPLC: ……………………..(mã) Hệ thống HPLC: ……………………..(mã)
Khối lượng mẫu Diện tích píc Khối lượng mẫu Diện tích píc
% Hàm lượng % Hàm lượng
(mg) (mV*s) (mg) (mV*s)
1
….
6
Trung bình: …………………………………… Trung bình: …………………………….

RSD:…………………………………………… RSD:…………………………………….
Kết quả phân tích của cả 02 kiểm nghiệm viên

Trung bình.:.............................................................................................................
RSD:………………………………………………………………………………
Độ sai khác kết quả định lượng trung bình:
Giữa hai kiểm nghiệm viên:......................................................................................
Giữa các kiểm nghiệm viên với kết quả trung bình của cả hai kiểm nghiệm viên:
+ Kiểm nghiệm viên 1:.....................................................................................
+ Kiểm nghiệm viên 2:.......................................................................................


bằng phương pháp quang phổ UV-Vis
(trang 14)

Thẩm định quy trình định lượng kháng

sinh bằng phương pháp vi sinh vật
(trang 44)

Thẩm định quy trình định lượng đồng thời tạp B

của perindopril tert-butylamin và tạp A của
indapamid bằng phương pháp HPLC

Một số tình huống/câu hỏi liên quan đến thẩm định QTPT
Câu 1: Có cần phải thẩm định các QTPT xác định giới hạn chất bảo quản ? Nếu
có thì có cần phải thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu như đối với quy trình định lượng
dược chất ?
Gợi ý trả lời

- Tất cả các QTPT đều phải được thẩm định trước khi sử dụng
- Thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu

Câu 2: Khi sử dụng mẫu tự tạo gồm dược chất + tá dược để thẩm định độ đúng
của các quy trình định lượng, có thể sử dụng dược chất dưới dạng nguyên liệu
thay cho chất chuẩn dược chất để chuẩn bị mẫu tự tạo ? Nếu được, có cần cung
cấp COA của lô nguyên liệu dược chất đã dùng ?

- Được. Cần cung cấp thông tin về nguyên liệu đã dùng trong thẩm định. Tùy
từng trường hợp có thể yêu cầu bổ sung thêm COA của lô nguyên liệu dùng
trong thẩm định đó

Câu 3: Thẩm định QTPT bằng SKLM có yêu cầu nộp ảnh chụp sắc ký đồ thu
được. Nếu cơ sở không có thiết bị chụp ảnh sắc ký đồ thì có thể chụp bằng máy
ảnh thường được không ?

- Nên có ảnh chụp sắc ký đồ, chụp bằng bất kỳ phương tiện gì miễn là có thể
quan sát được rõ hình ảnh sắc ký đồ

Câu 4: Thuốc thành phẩm có chứa 3 dược chất. quy trình định lượng được xây
dựng để định lượng đồng thời 3 dược chất. Để thẩm định độ đặc hiệu của QTPT
này, mẫu giả dược chỉ bao gồm các thành phần tá dược có đủ không ? Có cần
phải đánh giá ảnh hưởng giữa các dược chất với nhau trong quy trình định
lượng đồng thời các dược chất này không ?

- Nên đánh giá ảnh hưởng giữa các dược chất với nhau trong quy trình định
lượng đồng thời các dược chất

Câu 5: Khoảng xác định của phương pháp có thể được suy ra từ tính tuyến tính
và độ đúng được không hay là phải thực hiện phân tích lặp lại một dung dịch 6
lần ở các nồng độ qui định (ví dụ: định lượng là tiêm lặp lại 6 lần mẫu thử ở các
nồng độ 80% và 120%) ?

- Khoảng xác định của phương pháp được chấp nhận suy ra từ tính tuyến tính
và độ đúng

Câu 6: Có cần phải thẩm định thêm chỉ tiêu nào cho quy trình phát hiện vết nội
tiết tố không nếu phương pháp này tương tự phương pháp định lượng dược
chất trong thành phẩm ?

- Có. Thẩm định thêm LOD và LOQ. Nồng độ tối đa cho phép của dung dịch
thử phải > LOQ

Câu 7: Hai thuốc thành phẩm có công thức tương tự nhau, chỉ khác nhau tá
dược màu bao phim. Tiêu chuẩn thành phẩm của 2 thuốc áp dụng cùng một
QTPT thì có thể sử dụng chung một số liệu thẩm định QTPT cho 2 thành phẩm
này không ? Biết rằng sắc ký đồ thu được từ các dung dịch thử của 2 thuốc này
giống hệt nhau

- Có thể sử dụng chung (trừ tính đặc hiệu), nhưng cần có biện luận rõ ràng

Câu 8: Có thể sử dụng kết quả thẩm định độ đúng được tiến hành ở 3 mức nồng
độ của mẫu tự tạo, mỗi mức nồng độ lặp lại 3 lần để đánh giá độ lặp lại của
QTPT được không ? Nếu được, cần đánh giá kết quả như thế nào ?

- Chỉ nên chấp nhận khi việc thẩm định độ lặp lại gặp khó khăn do không có
mẫu thử đồng nhất (ví dụ: khi thẩm định độ lặp lại của quy trình thử độ hòa
tan) hoặc khi mẫu tự tạo về cơ bản giống thuốc thành phẩm (vi dụ: các thuốc
ở dạng dung dịch). Các trường hợp còn lại nên thử trực tiếp trên mẫu thử là
thuốc thành phẩm

Thẩm định quy trình định lượng

dược chất và/hoặc chất chuyển hóa
có tác dụng trong mẫu sinh học

Thẩm định quy trình định lượng dược chất và/hoặc chất chuyển hóa có tác
dụng trong mẫu sinh học theo hướng dẫn của US-FDA, EMA và Việt Nam
 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống
 Tính đặc hiệu
 Tỷ lệ thu hồi (Hiệu suất chiết)
 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
 Độ đúng và độ chính xác
 Giới hạn định lượng dưới (lower limit of quantitation, LLOQ)
 Độ ổn định của mẫu thử
 Ảnh hưởng của nền mẫu và lượng mẫu tồn dư (nhiễm chéo)
 Ảnh hưởng của sự pha loãng
 Phân tích mẫu thử

Giới thiệu
 Các phương pháp sắc ký, như GC, HPLC sử dụng các đầu dò khác nhau như quang phổ
tử ngoại - khả kiến, huỳnh quang, phổ khối thường được sử dụng trong nghiên cứu đánh
giá tương đương sinh học để xác định nồng độ thuốc (dược chất và/hoặc chất chuyển
hóa – chất cần phân tích) trong các mẫu sinh học (thường là các mẫu máu, huyết tương,
huyết thanh hay nước tiểu) của người tình nguyện tham gia nghiên cứu
 Những phương pháp này có tính đặc hiệu cao; có khả năng tách và định lượng trên cùng
một hệ thống và cùng thời điểm. Trong một số trường hợp, có thể sử dụng phương pháp
phân tích sinh hóa và sinh học nếu phương pháp có đủ độ đúng, độ chính xác, độ đặc
hiệu để xác định được nồng độ thuốc trong các mẫu sinh học
 Do quá trình phân tích mẫu sinh học bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như lượng mẫu ít,
nồng độ thấp, lẫn nhiều tạp chất là các chất nội sinh (lipid, protein, chất nội sinh, chất
chuyển hóa…) và sự khác nhau giữa các cá thể, nên phương pháp phân tích phải được
thiết lập và thẩm định để đảm bảo độ tin cậy

Giới thiệu
 Việc thẩm định và chấp nhận một phương pháp phân tích sinh học nên bao
gồm 2 giai đoạn riêng biệt
 Giai đoạn trước nghiên cứu
 Giai đoạn nghiên cứu áp dụng phương pháp phân tích trong dịch sinh
học đã được thẩm định để phân tích thực sự các mẫu từ nghiên cứu sinh
học để khẳng định độ ổn định, chính xác và đúng
 Cần phải thiết lập đường chuẩn cho mỗi lần phân tích trong mỗi lô (mỗi
ngày) và xác định nồng độ chất cần phân tích trong các mẫu thử dựa trên
đường chuẩn đó
 Nên phân tích một số mẫu chuẩn kiểm tra (quality control – QC) được chuẩn
bị riêng đồng thời với các mẫu thử theo quy trình, xen kẽ vào các thời điểm
dựa trên tổng số mẫu thử cần phân tích cho một lô
 Cũng cần phải thẩm định phương pháp xử lý và giữ các mẫu sinh học

Giới thiệu
 Tất cả quy trình cần được thực hiện theo các SOP đã được xây dựng. Các
quy trình có liên quan và công thức được dùng để thẩm định phương pháp
phân tích sinh học nên được đệ trình và thảo luận
 Bất cứ một sự thay đổi nào về phương pháp phân tích trong dịch sinh học
trước và trong quá trình phân tích mẫu nghiên cứu cũng cần phải được thẩm
định lại đầy đủ; nên báo cáo lại tất cả những thay đổi và giải thích rõ mục
tiêu của việc thẩm định lại
 Theo các yêu cầu của hướng dẫn về “Nghiên cứu các hoạt chất bất đối”
(Investigation of Chiral Active Substances), nghiên cứu tương đương sinh
học phục vụ cho cấp phép các thuốc tương đồng có chứa hoạt chất bất đối
nên dựa trên các phương pháp phân tích sinh học các chất đối quang
(enantiomer) trừ khi cả 2 chế phẩm đều chứa cùng dạng đồng phân hình học
bền vững và cả 2 chế phẩm đều chứa dạng racemic và các đồng phân hình
học cùng có dược động học tuyến tính

Kiểm tra tính phù hợp hệ thống
 Để đảm bảo các thiết bị có khả năng cho kết quả chính xác và đáng tin cậy
tại thời điểm sử dụng
 Tiêu chí chấp nhận: hệ số đối xứng, độ phân giải, thời gian lưu, tỷ số diện tích
pic chất phân tích/nội chuẩn
 Sự phù hợp của hệ thống được đánh giá trước khi phân tích mẫu
 Mẫu dùng kiểm tra tính phù hợp với hệ thống phải khác với mẫu nghiên cứu,
mẫu chuẩn đối chiếu và mẫu chuẩn kiểm tra
 Dùng chất chuẩn để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống trước khi tiến hành
phân tích
 Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần một mẫu chất chuẩn của chất cần phân tích và
chuẩn nội pha trong dịch sinh học ở mức nồng độ cao (HQC)

Tính đặc hiệu
 Phải chứng minh được rằng chất xác định được là dược chất hay chất chuyển hóa
có tác dụng. Sự phân tích mẫu không bị ảnh hưởng bởi các chất nội sinh và chất chuyển
hóa có liên quan
 Tính đặc hiệu nên được đánh giá trong suốt quá trình xây dựng phương pháp, thẩm
định phương pháp và có thể tiếp tục trong suốt giai đoạn áp dụng phương pháp để phân
tích mẫu thật
 Trong nghiên cứu tính đặc hiệu, phải thực hiện phương pháp thêm chất chuẩn để
loại bỏ sai số do nền mẫu
 Khi xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu sinh học bằng phương pháp sắc ký
lỏng – khối phổ cần phải có các nghiên cứu ảnh hưởng của nền mẫu
 Để xác định tính đặc hiệu, tiến hành phân tích các mẫu trắng (huyết tương, nước tiểu
hoặc các nền mẫu sinh học khác) từ ít nhất 6 nguồn cung cấp khác nhau. Mỗi mẫu trắng
phải được kiểm tra về sự nhiễu và tính chọn lọc ở giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Tính đặc hiệu
 Các chất gây nhiễu trong dịch sinh học gồm các chất nội sinh, các chất
chuyển hóa, các sản phẩm phân hủy hay các thuốc dùng đồng thời với thuốc
đang nghiên cứu.
 Nếu phương pháp định lượng đồng thời nhiều chất phân tích, mỗi chất
phân tích phải được kiểm tra để đảm bảo không có sự gây nhiễu qua lại
 Báo cáo kết quả phải bao gồm cả sắc ký đồ của mẫu trắng (dịch sinh học),
mẫu chất chuẩn pha trong dịch sinh học và mẫu thử thu được sau khi dùng
thuốc

Tính đặc hiệu
Ví dụ cách xác định và yêu cầu về tính đặc hiệu khi áp dụng phương pháp HPLC để
phân tích thuốc trong dịch sinh học
 Tiến hành sắc ký mẫu huyết tương trắng, mẫu chất chuẩn pha trong huyết tương
trắng (mẫu tự tạo) và mẫu chất chuẩn pha trong dung môi tại 3 nồng độ trong phạm vi
định lượng, trong đó có 1 nồng độ gần hoặc bằng LLOQ (mẫu đối chiếu).
 Yêu cầu:
 Thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu tự tạo phải tương đương với thời
gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu đối chiếu, đồng thời mẫu huyết tương
trắng không có pic trùng với pic chất cần phân tích.
 Với đầu dò PDA, phổ UV-Vis của chất cần phân tích trong mẫu tự tạo giống phổ
UV-Vis của chất cần phân tích trong mẫu đối chiếu. Pic của chất cần phân tích
tinh khiết và tách hoàn toàn các pic khác trong sắc ký đồ của mẫu tự tạo
 Đáp ứng của mẫu huyết tương trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất
cần phân tích phải không vượt quá 20% đáp ứng của chất cần phân tích ở nồng
độ LLOQ. Đáp ứng của mẫu huyết tương trắng tại thời điểm trùng với thời gian
lưu của nội chuẩn không được vượt quá 5% đáp ứng của nội chuẩn ở mẫu LLOQ

Tỷ lệ thu hồi (Hiệu suất chiết)
 Hiệu suất chiết của chất cần phân tích trong quy trình định lượng là đáp ứng
của đầu dò ghi nhận được từ một lượng chất phân tích thêm vào và chiết ra
trong nền mẫu sinh học, được so với đáp ứng của đầu dò ghi nhận nồng độ
thực của chất phân tích trong dung môi pha mẫu
 Lượng thu hồi là hiệu suất chiết của phương pháp phân tích. Tỷ lệ thu hồi
của chất phân tích không đòi hỏi 100% nhưng khoảng thu hồi của chất
phân tích và nội chuẩn phải ổn định, chính xác và có tính tái lặp
 Tiến hành xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh kết quả phân tích của
mẫu chiết được từ mẫu tự tạo ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình và cao của
đường chuẩn) với kết quả của mẫu chuẩn không chiết được pha trong dung môi
pha mẫu (đại diện cho tỷ lệ thu hồi 100%)

Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
 Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ định lượng giữa đáp ứng của đầu dò (thiết bị) và
các nồng độ biết trước của chất phân tích
 Để xây dựng đường chuẩn cho trường hợp có nhiều chất phân tích, mỗi chất phân phải
xây dựng một đường chuẩn, các mẫu thuộc đường chuẩn phải được chuẩn bị trên cùng
một loại nền mẫu sinh học như mẫu thử trong nghiên cứu bằng cách thêm chất phân
tích biết trước nồng độ vào nền mẫu
 Nồng độ của chất đối chiếu dùng trong đường chuẩn phải dựa trên khoảng nồng độ định
lượng thực tế trong nghiên cứu cụ thể
 Các điểm của đường chuẩn bao gồm ít nhất từ 6 đến 8 mẫu với nền mẫu được xử lý
gồm có chất phân tích và chuẩn nội (không bao gồm mẫu điểm 0 – mẫu có nồng độ hoạt
chất cần phân tích bằng 0), mẫu trắng là mẫu dịch sinh học được xử lý không có chất
phân tích và không có chuẩn nội, mẫu “không” là mẫu dịch sinh học trắng được xử lý có
chuẩn nội

 Các mẫu chuẩn phải phủ được khoảng nồng độ cần định lượng
 Đường chuẩn gồm mẫu có nồng độ tại giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
 Không được xác định nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu thử bằng
phương pháp ngoại suy
 Các đường chuẩn xây dựng (ít nhất là 3) phải được báo cáo trong quá trình
thẩm định
 Tiến hành thẩm định phương pháp phải gồm tối thiểu sáu điểm của đường
chuẩn được thực hiện trong một số ngày, với ít nhất bốn nồng độ (bao gồm
LLOQ, thấp, trung bình và cao) được phân tích hai lần trong mỗi lần thử
nghiệm

 Mẫu chuẩn kiểm tra (Quality control, QC): được dùng để so sánh khi định lượng là
những mẫu tự tạo biết trước nồng độ, chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần
phân tích trong mẫu sinh học trắng
 Phải kết hợp ít nhất ở ba mức nồng độ kiểm tra (QC), tiêm hai lần mỗi lần thử nghiệm,
bao gồm giới hạn định lượng dưới LLOQ (QC thấp), nồng độ trung bình (QC giữa),
nồng độ cao (QC cao) trong khoảng nồng độ nghiên cứu xây dựng
 Tiêu chí chấp nhận
 Không ít hơn 67% mẫu kiểm tra (QC) có nồng độ tìm lại phải nằm trong khoảng ±
15% nồng độ lý thuyết
 Không ít hơn 50% mẫu kiểm tra (QC) ở mỗi mức nồng độ phải nằm trong khoảng ±
15% so với nồng độ lý thuyết
 Các mẫu của đường chuẩn và mẫu kiểm tra (QC) được chuẩn bị từ các dung dịch
chuẩn gốc riêng biệt, phải báo cáo về độ chính xác và độ đúng
 Điểm của đường chuẩn ở nồng độ LLOQ có yêu cầu độ lệch không quá 20% so với
nồng độ lý thuyết và không quá 15% ở các nồng độ khác

Độ đúng và độ chính xác
 Độ đúng và độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 4 nồng
độ của mẫu chuẩn kiểm tra (LLOQ, LQC, MQC và HQC) trong khoảng nồng
độ được xây dựng. Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu
 Độ chính xác của một phương pháp phân tích phản ánh sự sát gần của
từng giá trị đo đơn lẻ của chất phân tích được đo lặp lại nhiều mẫu bằng
phương pháp được chọn từ một mẫu chung đồng nhất
 Độ chính xác có thể được biểu thị bằng RSD hoặc CV trong ngày và giữa
các ngày. Nói chung, CV không được vượt quá 15%, riêng nồng độ gần với
LLOQ thì không được vượt quá 20%

Độ đúng và độ chính xác
 Độ đúng được biểu thị là khả năng tiến tới gần nồng độ thực nhất của chất
phân tích trong mẫu sinh học
 Được biểu thị bằng khả năng tìm lại tương đối, và phải nằm trong khoảng
85% - 115%, nhưng có thể chấp nhận 80% - 120% đối với điểm gần LLOQ
 Tiến hành xác định độ chính xác trong ngày và độ chính xác khác ngày để
xem xét độ lặp lại của phương pháp theo thời gian và ảnh hưởng do các
yếu tố về kiểm nghiệm viên, thiết bị, hóa chất, thuốc thử và phòng thí
nghiệm
 Khi nồng độ mẫu thử cao hơn giới hạn định lượng trên của đường chuẩn thì
phải được pha loãng
 Độ đúng và độ chính xác của các mẫu pha loãng cũng cần được tiến hành
thẩm định

Giới hạn định lượng dưới
 Điểm thấp nhất của đường chuẩn phải được xem là giới
hạn định lượng dưới (LLOQ) nếu đáp ứng ngay LLOQ ít nhất
gấp 5 lần so với đáp ứng của mẫu trắng
 Nồng độ tìm lại tại LLOQ có độ chính xác không vượt quá
20% và đạt độ đúng ± 20% so với nồng độ lý thuyết. LLOQ phải
được thực hiện ít nhất năm mẫu
 Giới hạn định lượng dưới ít nhất phải thỏa mãn khả năng
phân tích nồng độ của mẫu thử lấy ở thời điểm bằng 3 – 5 lần
thời gian bán thải hoặc bằng 1/20 đến 1/10 giá trị Cmax của chất
phân tích

Độ ổn định của mẫu thử
 Độ ổn định hóa học của thuốc trong nền mẫu được chọn dưới điều kiện cụ
thể trong khoảng thời gian qui định được đánh giá bằng một số phương pháp
 Đánh giá sự ổn định tiền nghiên cứu bao gồm quản lý mẫu thử và điều kiện
bảo quản trong suốt quá trình nghiên cứu, gồm điều kiện bảo quản tại vị trí
lâm sàng, trong quá trình gửi mẫu và ở các vị trí liên quan khác
 Độ ổn định của thuốc trong mẫu sinh học phụ thuộc vào điều kiện bảo quản,
tính chất hóa lý của chất phân tích, nền mẫu chứa thuốc và đồ đựng
 Độ ổn định của chất phân tích trong nền mẫu và đồ chứa cụ thể không thể
ngoại suy áp dụng cho nền mẫu và đồ chứa khác
 Phép thử độ ổn định của chất phân tích phải đánh giá độ ổn định trong suốt
quá trình từ thu thập mẫu, bảo quản, rã đông, đánh giá sự ổn định ngắn hạn
(để ở điều kiện phòng thí nghiệm, ở nhiệt độ phòng), độ ổn định dài hạn (trữ
đông ở nhiệt độ mong muốn), độ ổn định sau các chu trình đông- rã đông và
trong quá trình phân tích mẫu
 Điều kiện thử nghiệm độ ổn định phải phản ánh được tình trạng tương tự diễn ra trong
suốt quá trình xử lý mẫu và phân tích mẫu thật
 Nếu điều kiện bảo quản mẫu trong suốt quá trình phân tích mẫu nghiên cứu có thay
đổi trong lúc thẩm định phương pháp, thì phải thiết lập đánh giá độ ổn định ở điều kiện
mới
 Quy trình thẩm định phải bao gồm đánh giá sự ổn định của hoạt chất trong dung dịch
chuẩn gốc do các mẫu định lượng trong khảo sát độ ổn định được pha loãng từ một
dung dịch gốc (và pha ngay trước khi phân tích) trong dịch sinh học không được có
chất gây nhiễu và không có mặt của chất cần phân tích
 Dung dịch chuẩn gốc khảo sát độ ổn định cần được pha trong dung môi thích hợp và
có nồng độ biết trước
 Mẫu khảo sát độ ổn định phải được so sánh với đường chuẩn hay mẫu chuẩn kiểm
tra (QC) được pha ngay trước khi phân tích
 Tiêm ít nhất ba lần lặp lại ở mỗi nồng độ thấp và cao. Kết quả mẫu thử độ ổn định
phải nằm trong khoảng ± 15% nồng độ lý thuyết
Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc

 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội phải được đánh giá
 Dữ liệu độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc phải được xây dựng để xác định
khoảng thời gian ổn định dung dịch chuẩn gốc khi bảo quản
 Độ ổn định trong dung dịch gốc của chất phân tích và chuẩn nội cần được
đánh giá ở nhiệt độ phòng ít nhất 6 giờ
 Nếu dung dịch gốc được bảo quản ở điều kiện lạnh hoặc đông trong một thời
gian nhất định thì cũng phải chứng minh được độ ổn định
 Sau thời gian bảo quản nhất định, độ ổn định được kiểm tra bằng cách so
sánh độ đáp ứng của dung dịch sau thời gian bảo quản với dung dịch gốc ngay
khi được chuẩn bị

Độ ổn định trong huyết tương

Độ ổn định ngắn hạn
 Thực hiện trên 3 mẫu khác nhau ở mỗi nồng độ cao và thấp, sau khi rã đông ở nhiệt độ
phòng, giữ ở nhiệt độ phòng từ 4 – 24 giờ và được phân tích
 Nên thiết kế và tiến hành giống điều kiện xử lý tại phòng thí nghiệm cho các mẫu
nghiên cứu
Độ ổn định dài hạn
 Thời gian ổn định dài hạn phải được đánh giá là tương đương hoặc dài hơn thời gian
tính từ ngày đầu tiên lấy mẫu đến ngày phân tích mẫu cuối cùng
 Độ ổn định dài hạn được xác định bằng cách bảo quản ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ thấp
và cao ở nhiệt độ bảo quản dự kiến (-20 oC hoặc -70 oC)
 Thể tích mẫu phải đủ cho phân tích trong 3 lần khác nhau, nồng độ của mẫu sau mỗi lần
xác định được so sánh với giá trị trung bình của nồng độ ở ngày bắt đầu thử nghiệm độ
ổn định dài hạn

Độ ổn định đông và rã đông
 Độ ổn định của chất phân tích được xác định sau 3 chu kỳ làm lạnh và rã đông
 Thực hiện ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ cao và thấp được làm lạnh ở nhiệt độ bảo
quản dự kiến trong 24 giờ và rã đông ở nhiệt độ phòng, khi rã đông hoàn toàn các mẫu
được làm lạnh trở lại trong vòng 12 – 24 giờ giống lần đầu, sau 3 chu kỳ như thế mẫu
được đem đi phân tích
 Nếu mẫu phân tích không ổn định ở nhiệt độ dự kiến thì phải bảo quản ở nhiệt độ -
70oC
 Trong quá trình đánh giá độ ổn định đông - rã đông, nên tiến hành ở điều kiện bảo
quản mẫu dự kiến giống với điều kiện cho phân tích mẫu


Độ ổn định sau khi xử lý mẫu
 Độ ổn định của mẫu đã xử lý là độ ổn định sau khoảng thời gian từ khi đã xử
lý xong đến lúc phân tích, ví dụ chờ ở khay tiêm mẫu tự động trong hệ thống
sắc ký lỏng
 Độ ổn định của chất phân tích và chuẩn nội phải được đánh giá qua thời gian
này bằng cách so sánh với nồng độ ban đầu sau khi xử lý với nồng độ sau một
thời gian để ở nhiệt độ của bộ phận tiêm mẫu

Ảnh hưởng của nền mẫu và lượng mẫu tồn dư
 Ảnh hưởng của nền mẫu và lượng mẫu tồn dư nên được khảo sát khi phân
tích trong nền mẫu sinh học bởi vì nó có thể ảnh hưởng đến độ tuyến tính và
độ chính xác của phương pháp dẫn đến kết quả thay đổi mặc dù không quá
nhiều
 Trong trường hợp sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS, hướng dẫn của US-FDA có
đề cập xem xét sự thay đổi của nền mẫu, để đảm bảo không bị ảnh hưởng
trong quá trình thẩm định phương pháp. Theo hướng dẫn này, đường chuẩn
trong dịch sinh học nên được so sánh với đường chuẩn trong dung môi để
phát hiện ra ảnh hưởng của nền mẫu. Song song với việc pha loãng mẫu thử
nên pha loãng mẫu chuẩn để phát hiện ảnh hưởng của nền mẫu
 Trong hướng dẫn của EMA có qui định rõ việc thẩm định ảnh hưởng của nền
mẫu và lượng mẫu tồn dư

Ảnh hưởng của nền mẫu
 Khi sử dụng kỹ thuật khối phổ phải khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu, sử
dụng ít nhất 6 lô mẫu nền khác nhau, ở 2 mức nồng độ thấp (3 lần LLOQ) và
nồng độ cao (gần ULOQ)
 Với mỗi chất phân tích và IS, yếu tố nền mẫu (matrix factor, MF) được tính
toán cho từng lô mẫu nền bằng cách lập tỷ số diện tích pic của chất phân tích
có trong nền mẫu (định lượng chất phân tích được thêm vào nền mẫu sau khi
chiết hoạt chất) với diện tích pic của chất phân tích khi không có nền mẫu
(chất phân tích pha trong dung môi pha mẫu)
 Tỷ số MF của chất phân tích và nội chuẩn được tính với CV tính từ 6 lô mẫu
nền trắng không được quá 15%
 Báo cáo thẩm định phải gồm diện tích pic của chất phân tích và nội chuẩn,
nồng độ được tính toán cho mỗi mẫu độc lập và giá trị CV tính cho mỗi nồng
độ
Lượng mẫu tồn dư

 Lượng mẫu tồn dư phải được xem xét và hạn chế đến mức tối thiểu trong quá
trình xây dựng phương pháp
 Trong quá trình thẩm định, lượng mẫu tồn dư được đánh giá bằng cách tiêm
mẫu trắng ngay sau khi tiêm mẫu có nồng độ cao hoặc giới hạn định lượng
trên của đường chuẩn (ULOQ)
 Lượng mẫu tồn dư không được quá 20% của giới hạn định lượng dưới
(LLOQ) và 5% đối với nội chuẩn

Ảnh hưởng của sự pha loãng
 Việc pha loãng mẫu phải không được ảnh hưởng đến độ đúng và độ chính
xác ( 15%)
 Ảnh hưởng cửa sự pha loãng nên được đánh giá bằng cách thêm vào nền
mẫu sinh học trắng chất phân tích có nồng độ cao hơn ULOQ và pha loãng
mẫu với mẫu dịch sinh học trắng (thực hiện không ít hơn năm mẫu đối với mỗi
hệ số pha loãng)
 Việc đánh giá ảnh hưởng của sự pha loãng nên bao gồm giai đoạn pha loãng
mẫu trong QTPT
 Chỉ tiêu này có thể được thực hiện khi thẩm định một phần
 Có thể sử dụng nền mẫu khác nếu không ảnh hưởng đến độ đúng và độ
chính xác

Phân tích mẫu thử
 Khi định lượng các mẫu thử bằng phương pháp phân tích đã được thẩm định,
mỗi mẫu thử có thể phân tích một lần hoặc lặp lại nếu cần
 Toàn bộ các mẫu thử của mỗi người tình nguyện phải được phân tích trong
cùng một điều kiện
 Một lô mẫu phân tích (các mẫu phân tích trong cùng một điều kiện – trong thời
gian một buổi hoặc một ngày) bao gồm toàn bộ các mẫu thử của một hoặc
một số người tình nguyện; các mẫu của đường chuẩn/khoảng tuyến tính và
các mẫu QC – với tối thiểu 3 mức nồng độ tương ứng với khoảng nồng độ
thấp, trung bình và cao của đường chuẩn/khoảng tuyến tính và tương ứng với
mỗi mức nồng độ phải có tối thiểu 2 mẫu
 Số lượng các mẫu QC của một lô phân tích không được ít hơn 5% tổng số
mẫu thử và cũng không được ít hơn 6 mẫu

Phân tích mẫu thử
 Nồng độ chất cần phân tích trong mỗi mẫu thử và các mẫu QC được xác định
dựa trên kết quả phân tích các mẫu của đường chuẩn trong lô phân tích
 Chỉ chấp nhận kết quả của một lô mẫu phân tích khi: các mẫu đường
chuẩn/khoảng tuyến tính đạt yêu cầu về độ đúng, độ chính xác và độ lệch
giữa kết quả xác định nồng độ chất cần phân tích trong các mẫu QC phải sai
khác không quá  15% so với giá trị nồng độ lý thuyết tương ứng
 Tiêu chuẩn chấp nhận kết quả lô phân tích được qui định bởi các hướng dẫn
cụ thể của Cơ quan quản lý

So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA
Chỉ tiêu US-FDA EMA

- Không ít hơn 6 lô mẫu sinh học trắng - Không ít hơn 6 lô mẫu sinh học trắng
Tính đặc - LLOQ thấp nhất của chất phân tích - Độ nhiễu tại đáp ứng của chất phân tích ở
hiệu đạt độ đúng và chính xác LLOQ ≤ 20%
- Độ nhiễu tại đáp ứng của nội chuẩn ≤ 5%
- Điểm thấp nhất của đường chuẩn - Điểm thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ)
Giới hạn (LLOQ) - LLOQ ≤ Cmax/20
định - Đáp ứng LLOQ ≥ 5 lần so với đáp - Tín hiệu ở LLOQ ≥ 5 lần so với tín hiệu của
lượng ứng của mẫu trắng mẫu trắng
dưới - Độ chính xác ≤ 20% và độ đúng 80%- - Độ chính xác ≤ 20% và độ đúng 80%-120%
120% so với nồng độ thực so với nồng độ thực
Đường - Đường chuẩn ít nhất 6-8 mẫu với nền - Đường chuẩn ít nhất 6 mẫu với nền mẫu
chuẩn và mẫu được xử lý gồm có chất phân tích được xử lý gồm có chất phân tích và IS
khoảng và IS - Ở LLOQ: CV ≤ 20% so với nồng độ thực và
tuyến tính - Ở LLOQ: CV ≤ 20% so với nồng độ ≤ 15% ở các nồng độ khác
thực và ≤ 15% ở các nồng độ khác - Xây dựng ít nhất 3 đường chuẩn
- Ở 3 mức nồng độ: thấp, trung bình, - Ở 3 mức nồng độ: LQC, MQC, HQC
Mẫu kiểm cao (LQC, MQC, HQC)
tra (QC) - Mẫu QC là mẫu độc lập với các mẫu - Mẫu QC là mẫu độc lập với các mẫu của
của đường chuẩn đường chuẩn


- Thực hiện ít nhất 3 nồng độ - Thực hiện ít nhất 4 nồng độ, phải có nồng
Độ đúng
độ LLOQ, 3 lần LLOQ, MQC, HQC
và độ
- Độ đúng: CV ở nồng độ LLOQ không - Độ đúng: CV ở nồng độ LLOQ không lớn
chính xác
lớn hơn ± 20%; Ở nồng độ LOQ, MQC, hơn ± 20%; Ở nồng độ khác CV không lớn
trong ngày
HQC có CV không lớn hơn ± 15 % hơn ± 15%
và khác
- Độ chính xác: CV ở nồng độ LLOQ ≤ - Độ chính xác: CV ở nồng độ LLOQ ≤ 20 %;
ngày
20%. Ở nồng độ khác CV ≤ 15% Ở nồng độ khác CV ≤ 15%
- Tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và nội
chuẩn phải ổn định, chính xác và có
Hiệu suất
tính tái lặp - Không đề cập
chiết
- Thực hiện ở 3 nồng độ: LQC, MQC
và HQC
- Dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn
- Độ ổn định trong huyết tương: - Độ ổn định trong huyết tương ở nồng độ
+ Ngắn hạn thấp và cao:
Độ ổn định
+ Dài hạn + Ngắn hạn ở nhiệt độ phòng
+ Đông-rã đông + Dài hạn (-20 oC và -70 oC)
+ Sau khi xử lý mẫu + Đông-rã đông
+ Sau khi xử lý mẫu


Xem xét có sự thay đổi của nền mẫu CV của nền mẫu đối với chất phân tích và IS
Ảnh
hay không, để bảo đảm phương pháp không quá 15% ở 3 lần LLOQ và HQC, tính
hưởng của
phân tích không ảnh hưởng của nền trên 6 lô nền mẫu
nền mẫu
mẫu
- Tiêm mẫu trắng ngay sau khi tiêm mẫu có
Lượng
- Không đề cập nồng độ cao
mẫu tồn
- Lượng mẫu tồn dư ≤ 20% ở LLOQ và ≤ 5%
dư
với nội chuẩn
- Pha loãng mẫu có nồng độ cao hơn - Pha loãng mẫu có nồng độ cao hơn ULOQ
Ảnh
ULOQ (thực hiện ít nhất 5 mẫu đối với mỗi hệ số pha
hưởng của
- Độ đúng và độ chính xác của các mẫu loãng)
sự pha
pha loãng phải được thẩm định - Độ đúng và độ chính xác nằm trong khoảng
loãng
± 15%.

Ví dụ minh họa
Thẩm định quy trình định lượng amlodipin (AM), atorvastatin (AT)
và hai chất chuyển hóa o-AT và p-AT
trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS

 Trên đây là một số yếu tố cơ bản của một QTPT cần phải được
thẩm định
 Điều cần lưu ý là hồ sơ về việc thẩm định một quy trình phải
được ghi chép rõ ràng đầy đủ và chi tiết để một kiểm nghiệm
viên nào cũng có thể tiến hành lặp lại được kể cả việc tiến hành
thực nghiệm cũng như thẩm định và xử lý tính toán các kết quả
thực nghiệm


Tham Dinh Qui Trinh Phan Tich - 13-03-2019 PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Tham Dinh Qui Trinh Phan Tich - 13-03-2019 PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

(Validation of Analytical Procedure)

PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Quy trình thử nghiệm (test procedure)

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Để đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Thay đổi trong khâu tổng hợp dược chất

 Thay đổi thành phần của thành phẩm

 Thay đổi QTPT

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

QTĐL có trong dược điển/AOAC QTĐL của nhà sản xuất

- Tính đặc hiệu - Tính đặc hiệu

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Thẩm định QTPT bằng đo quang phổ IR

QTPT theo dược điển/AOAC QTPT của nhà sản xuất

- Tính đặc hiệu - Tính đặc hiệu

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Thẩm định QTPT bằng đo quang phổ UV-Vis

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Thẩm định QTPT bằng đo quang phổ AAS

QTĐL theo dược điển/AOAC QTĐL của nhà sản xuất

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Thẩm định QTPT bằng SKLM

QTPT có trong dược điển/AOAC QTPT mới

- Giới hạn phát hiện

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Thẩm định QTPT bằng SKK

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Thẩm định QTPT bằng HPLC

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Định Định lượng

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Dược chất mới

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Đối với thành phẩm cần chứng minh

 Giả dược (chứa đầy đủ các thành phần

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Trường hợp có chuẩn tạp chất

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Trường hợp có chuẩn tạp chất

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Trường hợp có chuẩn tạp chất