HPLC

High-Performance Liquid Chromatography

Tekočinska Kromatografija Visoke Ločljivosti

DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA HPLC LOČBO

in PARAMETRI S KATERIMI JO OPIŠEMO

Vsebina vaje:
• Osnove HPLC,
• “branje” kromatogramov z odčitavanjem osnovnih
vrednosti,
• izračun osnovnih parametrov s katerimi opišemo
kromatografsko ločbo,
• spoznavanje dejavnikov, ki vplivajo na ločbo z
reverzno-fazno HPLC.

1
 Ločevanje - separacija
Za vse
kromatografske
metode velja, da
je ločevanje spojin
posledica
različnega
zadrževanja le teh
na/v stacinarni
fazi.

Vrste HPLC glede na način zadrževanja

Normalno-fazna Reverzno-fazna Ionsko Kiralna Afinitetna Gelska /

porazdelitvena porazdelitvena izmenjevalna izključitvena

Stacionarna faza Tipični primeri Sestavine tipične Tipični analiti

(kemizem) stac. faz: mobilne faze

Lipofilna C18, C8, C6-fenil, Voda ali pufri, Večina organskih

CN... acetonitril ali spojin!
na delcih iz metanol, Večina zdravilnih
reagenti za tvorbo učinkovin!
SiO2 ionskih parov

2
Reverznofazna porazdelitvena kromatografija

Nepolarna stacionarna faza : Polarna mobilna faza

•“Močno topilo”: organsko = acetonitril, metanol, THF,

izopropanol, etanol…
Več močnega topila → krajše zadrževanje analitov v
stacionarni fazi

•“Šibko topilo”: vodno = voda ali pufri

Več šibkega topila → daljše zadrževanje analitov v
stacionarni fazi

Reverznofazna porazdelitvena kromatografija

Nepolarna stacionarna faza : Polarna mobilna faza

•Nepolarna spojina se bo dlje zadržala v stacionarni fazi:
•Imela bo daljši retencijski čas
•Za elucijo bo potrebno več močnega topila v mobilni fazi.
•Polarna spojina se bo slabo zadržala v stacionarni fazi:
•Imela bo krajši retencijski čas.
•Za elucijo bo potrebno manj močnega topila v mobilni fazi.
•Retencijski čas je torej odvisen od fiz-kem lastnosti spojine, ki
jo določamo. Je značilnost analizirane spojine in ga
uporabljamo za identifikacijo!

3
Reverznofazna porazdelitvena kromatografija

Nepolarna stacionarna faza : Polarna mobilna faza

•Kaj pa spojine, ki ionizirajo?!

•pH vrednost mobilne faze mora biti za takšne spojine dobro

definirana. Zato je ponavadi v sestavi mobilne faze pufer.
•pH mobilne faze mora biti različen od pKa preiskovane spojine!

•Ali se pri enakih ostalih HPLC pogojih bolje zadrži ionizirana ali
neionizirana oblika iste spojine?

Namen tekočinske kromatografije je fizično

ločiti posamezne komponente vzorca,
da jih lahko identificiramo in določimo njihovo
koncentracijo.
m AU

70
Vzorec:
Ekstrakt česna, ki ga je potrebno
60

50
standardizirati glede na
40 koncentracijo SAC (S-Alil Cistein).
30
97
9
.9
86
A5.027
a:

20
re

10

2 4 6 8 10 12 14 m in
8

6
.3
3

m AU
0

7
3
5

25
.

1
a
:
re
A

20

15
Standard SAC brez primesi
10

2 4 6 8 10 12 14 m in

4
RESOLUCIJSKI FAKTOR “Rs” je parameter s
katerim opisujemo kakovost ločbe

2(tA  tB)
RS 
WA  WB
t [min]

Resolucijski faktor naj bo vsaj

1,5 (včasih vsaj 2).

! Resolucijski faktor mora biti

DOVOLJ VELIK, ne ČIM
VEČJI

RESOLUCIJSKI FAKTOR “Rs” je parameter s

katerim opisujemo kakovost ločbe

2(tA  tB)
RS 
WA  WB
t [min]

Resolucijski faktor naj bo vsaj

1,5 (včasih vsaj 2).

! Resolucijski faktor mora biti

DOVOLJ VELIK, ne ČIM
VEČJI

5
RESOLUCIJSKI FAKTOR “Rs” je parameter s
katerim opisujemo kakovost ločbe

2(tA  tB)
RS 
WA  WB
WA
t [min]

Resolucijski faktor naj bo vsaj

1,5 (včasih vsaj 2).

! Resolucijski faktor mora biti

WA
DOVOLJ VELIK, ne ČIM
VEČJI

Dejavniki, ki vplivajo na ločbo - na Rs faktor

N  k '    1 
Rs    
4  1  k '   
Učinkovitost kolone - število Retencijski faktor Selektivnost:

 
teoretskih podov (kapacitivnost):

N  16 tR
2
tR  t 0
w k'   k 'A
t0
 
ali pa ,
2 Spreminjamo ga preprosto z
k 'B
tR
N  5,54 razmerjem med “močnim” k'A> k'B
w½ in “šibkim” topilom V osnovi je odvisna od
stacionarne faze, vendar lahko
Primerne vrednosti so 2-10
(w je širina vrha bazni liniji ; kljub temu nanjo vplivamo z
w½ je širina vrha na polovici izborom primernega topila v
višine) MF.

6
Znati moramo izračunati:
• Resolucijski faktor “ Rs ” • Nesimetričnost vrhov “T”
2(tA  tB) ab
RS  T
WA  WB 2a
• Število teoretskih podov “ N ”

N  16 tR
w
  2

Torej moramo izmeriti:

• Retencijski faktor “ k’ ” • Retencijski čas
tR  t 0
k' “tr , tA , tB , t0”
t0
• Selektivnost “ α “ • Širino vrhov na bazni liniji
  k 'A “ W, WA , WB ”
k 'B
(α ≥ 1 oz. k'A ≥ k'B) • Dolžini daljic a in b

Retencijski čas “tr , tA , tB , t0”

tA
tB

t0

7
Širina vrhov na bazni liniji: “W” lahko tudi “tW”

Širina vrha je ČAS! [min] ali [s]

Nesimetričnost vrhov “T”

ab h
T
2a
a b 5% h

0,5 < T < 2

“a” in “b” sta ČAS! [min] ali [s]

8
 Retencijski faktor “ k’ ”
tA
tB
tB  t 0
k 
'
B t0
t0
tB – t0
Čas potovanja Čas zadrževanja
spojine B z spojine B v
mobilno fazo stacionarni fazi

Selektivnost “ α “
'
tA
k
 A
'
tB
k B
t0
t A  t0

t B  t0 tB – t0
Čas zadrževanja
spojine B v
stacionarni fazi
(α ≥ 1 oz. k'A ≥ k'B) tA – t0
Čas zadrževanja spojine
A v stacionarni fazi

9
Znati moramo izračunati:
• Resolucijski faktor “ Rs ” • Nesimetričnost vrhov “ T ”
2(tA  tB) ab
RS  T
WA  WB 2a
• Število teoretskih podov “ N ”

N  16 tR
w
  2

Torej moramo izmeriti:

• Retencijski faktor “ k’ ” • Retencijski čas
tR  t 0
k' “tr , tA , tB , t0”
t0
• Selektivnost “ α “ • Širino vrhov na bazni liniji
  k 'A “ W, WA , WB ”
k 'B
(α ≥ 1 oz. k'A ≥ k'B) • Dolžini daljic a in b

“Najosnovnejši” HPLC sistem

Mobilna faza

UV/Vis Detektor
“Zapisovalnik”
Črpalka Injektor

Kolona

10
Mobilna faza:
-Razmerje med MOČNIM in ŠIBKIM topilom
- pH vrednost

Kolona s stacionarno fazo:

- dolžina
Črpalka: - velikost delcev
- selektivnost stacionarne faze
-pretok MF
[mL/min] Injektor

(-pritisk
[bar])
- Vol. Injiciranja Detektor
(zanka) (npr UV-Vis):
- Valovna dolžina

Kromatogram tB tA
-Retencijski časi
-Širine vrhov
-Višine in površine vrhov
t0 -Resolucijski faktor
-Čas analize

IZVEDBA VAJE

•Vklopimo vse komponente HPLC sistema.

•Nastavimo oz. preverimo osnovne parametre analize:
•Začetna sestava MF je 90%MeOH in10% H2O. MF je že degazirana.
•Pretok MF je 1,3 mL/min.
•Valovna dolžina detekcije za diazepam in nordiazepam je 228 nm.
•Hitrost papirja na rekorderju: 30mm/min
•Pripravimo prvo raztopino za injeciranje:
Po 100μL osnovnih raztopin Nordiazepama, Diazepama, KI z avtomatsko
pipeto prepipetiramo v epruvetko. Dodamo 700μL topila (50% MeOH).
Predpostavimo aditivnost volumnov, ker so osnovne raztopine tudi
pripravljene v 50% MeOH.
•Posnamemo kromatogram, zamenjamo mobilno fazo s 60% MeOH in
•ponovno posnamemo kromatogram.

11
IZVEDBA VAJE

•Ocenimo kakovost ločbe v prvih dveh kromatogramih tudi z izračunom Rs,

in k’.
•Izberemo naslednjo mobilno fazo posnamemo kromatogram in ga
ovrednotimo. Če ločitev ni ustrezna, ta korak ponovimo.
•Ko je ločitev ustrezna izračunamo še povprečni vrednosti N in T.
•Z ustrezno MF posnamemo še kromatogram samega nordiazepama.
•Eksperimentalno preverimo vpliv različnih parametrov na retencijo, ločbo in
odzive v kromatogramu:
•Pretok MF,
•zamenjava MeOH s CH3CN
•vpliv valovne dolžine detekcije,
•pH MF...
•Pogovorimo se o ostalih parametrih in dejavnikih, ki vplivajo na ločbo.

HPLC

VALIDACIJA HPLC ANALIZNE METODE

in KVANTITATIVNO DOLOČANJE

12
 Vsebina vaje:
• Osnove upravljanja sodobnega HPLC,
• spoznavanje nekaterih parametrov za validacijo
kromatografske analizne metode,
• kvantitativna določitev brez in z uporabo
internega standarda.

Površina in višina kromatografskega vrha

sta sorazmerni koncentraciji spojine v
injicirani raztopini.

•Eksterni standard: c h cvz

St
h ESt

•Interni standard: ch h c

vz ISst
St
h h St ISvz

•Standardni dodatek: c  h V  c
h  h V
vz SD
St
vz2 vz vz

13
 Validacija metode - Kaj je validacija?

Validacija je dokumentiran postopek preizkušanja in

potrjevanja,

da katerikoli material, proces, postopek, aktivnost, sistem, oprema

ali mehanizem
uporabljen pri razvoju, proizvodnji, kontroli in distribuciji

lahko dosega, dosega in bo dosegal predpisane rezultate.

Nekateri parametri, ki jih testiramo v postopku

validacije HPLC analizne metode

•Specifičnost ali selektivnost,

•“Natančnost” ali “ponovljivost” (ang.: precision),
•“Točnost” ali “pravilnost” (ang.: accuracy)
•Območje linearnosti
•Meja zaznavnosti LOD (ang.: Limit Of Detection)
•Meja določljivosti (ang.: Limit Of Quantitation)
•Robustnost (“odpornost” metode, na manjše spremembe osnovnih
dejavnikov)

14
Specifičnost ali selektivnost

•Sposobnost metode, da loči preiskovano spojino od ostalih

sestavin vzorca in jo pravilno izmeri.
•V nekaterih vzorcih so “ostale sestavine” lahko reagenti ali
sintezni intermediati, razgradni produkti, pomožne snovi... V
bioloških vzorcih so to lahko spojine biogenega izvora,
metaboliti učinkovine...
•Za potrditev selektivnosti je potrebna kombinacija separacijske in
spektroskopske metode npr.: HPLC-DAD ali LC-MS ali LC-MS-MS.

Natančnost in točnost:

15
•“Natančnost” ali “ponovljivost” (ang.: precision)

•Ponovljivost določi en analitik (na vajah ena skupina) na enem

sistemu v relativno kratkem času.
•Potrebnih je 5 ali 6 meritev v treh vzorcih z različnim “ozadjem”
(matrix; pomembno predvsem pri bioloških vzorcih, ki se lahko razlikujejo) pri
dveh ali treh različnih koncentracijah.
•Podamo relativni standardni odklon meritev (RSD).

•Ponovljivosti med dnevi in med laboratoriji na vajah ne bomo

določali. Tudi vpliva “ozadja” (ostalih sestavin vzorca) ne bomo
preverjali .

•“Točnost” ali “pravilnost” (ang.: accuracy)

•Točnost analizne metode nam pove, kako dobro se rezultati

približajo pravi vrednosti.
•Izmerimo jo s kvantitativnim določanjem dobro poznanega
vzorca - standarda oz. s primerjavo rezultata z referenčno
metodo.
•Izmerjeno vrednost primerjamo z znano pravo vrednostjo in
podamo rezultat v obliki odstopanja.

16
•Območje linearnosti

•Analizna metoda je “linearna”, če je odziv linearno odvisen od

koncentracije vzorca.
(Lahko uporabimo tudi drugo dobro definirano matematično zvezo med odzivom in koncentracijo.)

•Linearnost preverimo z večkratnim (3-6×, na vajah le 1×)

injiciranjem serije standardov, ki obsegajo koncentracijsko
območje vsaj 80-120% predvidenih koncentracij vzorcev.
•Poleg dovolj visoke vrednosti Pearsonovega koeficienta
korelacije (r) je nujno tudi, da odsek regresijske premice na
ordinati ni bistveno različen od vrednosti 0 (nič).
•Regresijsko premico tudi narišemo!

17
Meja zaznavnosti LOD
(ang.: Limit Of Detection), tudi LLOD (Lower Limit Of Detection)

•LOD je najnižja koncentracija analita v vzorcu, ki ga analizna

metoda še lahko zazna.
•V kromatografiji se pogosto določi kot tista injicirana
koncentracija, pri kateri je višina vrha 3× večja od šuma bazne
linije.

Meja določljivosti (ang.: Limit Of Quantitation)

•LOQ je najnižja koncentracija analita v vzorcu, ki ga analizna

metoda še lahko ponovljivo izmeri.

•V kromatografiji je to običajno tista injicirana koncentracija, pri

kateri je višina vrha 10× do 20× večja od šuma bazne linije.

•Pri tej koncentraciji naj bi imeli rezultati metode RSD < 10-15%.

18
 HPLC sistem
Komponenti
DAD Detektor mobilne faze

Kolona v termostatu

PC z
ustrezno Avtomatski
programsko degaser = razplinjevalec MF
vzorčevalnik
opremo

Binarna
črpalka

Kvantitativno določanje s HPLC

•Površina in višina kromatografskega vrha sta sorazmerni

koncentraciji spojine v injicirani raztopini.

•Odziv vzorca lahko primerjamo z odzivom enega standarda

ali pa uporabimo umeritveno premico.

•Metodo z internim standardom uporabimo, kadar se lahko

odziv instrumenta med posameznimi meritvami malo
spreminja.

•Tehniko standardnega dodatka uporabimo, kadar želimo

zmanjšati vpliv ostalih sestavin vzorca na meritev
preiskovane spojine.

19
IZVEDBA VAJE

•Vklopimo vse komponente HPLC sistema, preverimo nastavitve.

•“Zaženemo sekvenco” injeciranj že pripravljenih standardov za UK.
•Ti standardi vsebujejo naraščajoče koncentracije nordiazepama (NOR) in
enako koncentracijo internega standarda (IS) diazepama (DIA), kot kasneje
pripravljeni vzorci.
•Pripravimo vzorce z IS in standard z IS. Vse redčimo 1/10 z avtomatskimi
pipetami. Predpostavimo aditivnost volumnov. To dodamo v sekvenco.
•Pripravimo raztopine za večkratno injeciranje oz. jih izberemo iz že
pripravljene UK. Izvedemo večkratno injeciranje in izračunamo
ponovljivosti.
•Pripravimo raztopine za primerjavo s šumom bazne linije (določitev LOD
in LOQ). Vsako od teh raztopin injeciramo vsaj 2×.

IZVEDBA VAJE

Obdelava podatkov z MS Excel (pripravimo in delamo že sproti med

analizo):

•Narišemo UK in izračunamo naklon, odsek na ordinati in Pearsonov

koeficient korelacije brez in z uporabo IS.

•Izračunamo validacijske parametre.

•Izračunamo konc. v vzorcih brez in z uporabo metode IS.

20
 PRIPRAVA BIOLOŠKEGA
VZORCA in ANALIZA S PLINSKO
KROMATOGRAFIJO
(GC)

Vsebina vaje:
• Priprava vzorca z ekstrakcijo tekoče-tekoče,
• osnove plinske kromatografije,
• določitev izkoristka in ponovljivosti ekstrakcije,
• določitev koncentracije preiskovanih spojin v
vzorcu.

21
Za kvantitativno določanje posamezne
spojine v zmesi (v kompleksnih vzorcih)

Pristopi (uporabljamo različne kombinacije):

• “Čiščenje” oz. priprava vzorca,

• separacija (kromatografija),

• specifična kvantitativna detekcija

(Ne)primernost večine bioloških vzorcev za

neposredno analizo s kromatografskimi
metodami...

Vzorcev kot so kri, krvna plazma ali serum itd. ne

moremo neposredno analizirati brez predhodne
priprave. Najpogosteje uporabljene možnosti so:
•Obarjanje proteinov
•Ekstrakcija na trdni fazi (SPE)
•Ekstrakcija tekoče/tekoče

22
Obarjanje proteinov

•Obarjanje proteinov z ledeno mrzlim org. topilom (metanol

ali acetonitril v razmerju 1:3 = vzorec : org. topilo),
• shranjevanje 1-3 dni pri -20°C,
•centrifugiranje pri 15 000g, analiza supernatanta s HPLC,
UPLC, GC... ali
•še predhodno redčenje z vodo, sušenje in rekonstitucija...

Ekstrakcija na trdni fazi (SPE)

•Priprava kolon za ekstrakcijo,

•vezava preiskovanih spojin iz vzorca,
•spiranje nečistot iz vezalca,
•spiranje preiskovanih spojin iz vezalca,
•sušenje očiščenih vzorcev
•rekonstitucija v MF
•analiza s HPLC...

23
Ekstrakcija tekoče/tekoče

•Ekstrakcija tekoče/tekoče z ustreznim organskim topilom,

•ločitev vodne in organske faze,
Analiza
•sušenje org. faze, z GC
•rekonstitucija (ponovno raztapljanje) posušenega vzorca ,
•analiza z reverzno-fazno HPLC...

Izkoristek priprave vzorcev

(Recovery)
cv Vv  nv nr

•homogeniziranje
•obarjanje
nv
•centrifugiranje
•filtriranje
•ekstrakcija tekoče/tekoče
•ekstrakcija na trdni fazi (SPE)
•sušenje in “rekonstituiranje”

cr Vr  nr
•koncentriranje

24
Osnovne plinske kromatografije (GC):
• uparjen vzorec potuje po koloni s pomočjo
inertnega plina (mobilna faza - MF)
• glede na stacionarno fazo (SF) ločimo
– plinsko (MF) - trdno (SF) kromatografijo (GSC)
– plinsko (MF) - tekočo (SF) kromatografijo (GLC)
• GSC - retencija vzorca posledica fizikalne
adsorpcije
• GLC - retencija vzorca posledica njegovega
porazdeljevanja med MF in SF

Shematski prikaz plinskega kromatografa:

25
 Nosilni plin
• to so inertni plini: He, N2, H2
– ustrezna čistost
– odstranjevanje vode in drugih nečistot

Injektor:
• injekcijska brizga
• septum
• uparjevalna komora ali liner

Zgradba injektorja:

Načini injiciranja :
•split (cepiti)
•splitless

26
Kolone:
dolžina (m) premer (mm) št. podov/ meter resolucija
– polnjene 1-5 2-4 1000 majhna
– kapilarne 5 - 60 0.1 - 0.53 5000 velika
- Packed Capillary
Length (m) 1-5 5-60
Inner diameter (mm) 2-4 0.10-0.53
Plates per meter 1000 5000
Total plates 5000 1,000,000
Resolution Low High
Flowrate (mL/min) 10-60 0.5-15
Permeability (10 7 cm2 ) 1-10 10-1000
Capacity 10 µg / peak <100 ng / peak
Liquid film thickness (µm) 10 0.1 - 10

Stacionarne faze:
• polisiloksani R R R

Nepolarne: nepolarne substance R Si O Si O Si R

(CH, steroide...) R R n R
Polarne: polarne substance
(Cl, NO2 – Ar, R-Bz....) R CH3 - nepolarna
C6H5 , C3H6CN , C3H6CF3 - polarne

• polietilenglikoli
Polarna: kisline, alkohole,etre, H OCH2CH2 n
OH
glikole,...

• vezane ali premrežene

• debelina filma (0.1 – 5 m)

27
Detektorji
Lastnosti idealnega detektorja:
• ustrezna občutljivost
• stabilnost in reproducibilnost
• linearnost
• delovanje v širokem T intervalu
• kratek odzivni čas
• ...
Vrste detektorjev:
• FID (“flame ionization detector” - plamensko ionizacijski
detektor)
• ECD (“electron capture detector” – detektor na zajetje
elektronov)
• TCD
• ....

FID
• piroliza vzorca in MF s pomočjo H2 in zraka

• odziv je odvisen od št. C atomov (masna odvisnost)

• občutljivost 10-13 g

28
IZVEDBA VAJE

•Vajo začnemo s pripravljenim GC sistemom:

•T det. = T inj. = 280ºC
•Kolona ULTRA2 (SF: (5%-fenil)-metilpolisiloksan) 25m x 0,25 mm x 0,32 μm
•T program: začetek 1 min na 200º, nato 6º/min do 250ºC, na koncu še 2 min na 250ºC
•Pretok (kolona): 2,5 mL/min
•Make up: 30 mL/min
•Vodik: 33 mL/min
•Zrak: 185 mL/min
•Purge time ON: 0,1 min
•Split: 10 mL/min
•Tekom vaje se pogovorimo o teh parametrih in njihovem pomenu.

•Takoj injeciramo standarda kofeina (0,666 mM) in karbamazepina (0,25

mM). Oba pripravljena neposredno v etil-acetatu.
•V 5 mL plastični epruveti zmešamo 25 μL osnovne raztopine kofeina + 25
μL osnovne raztopine karbamazepina, dodamo 1,45 mL medija + 1,5 mL
EtAc ter ekstrahiramo na “vortexu” 1min.

IZVEDBA VAJE

!Vodno in organsko fazo pred ekstrakcijo shranjujemo na ledu!

•Po ločitvi organske in vodne faze 3× injeciramo organsko fazo in
•izračunamo izkoristek vsake ekstrakcije za obe spojini, povprečni
izkoristek treh ekstrakcij ter
•ponovljivost izkoristka (RSD).
•Ekstrahiramo neznan vzorec in posnamemo kromatogram
•izračunamo koncentraciji preiskovanih spojin v vzorcu
•Ekstrahiramo prazen vzorec (“blank”) in posnamemo kromatogram
•preverimo morebitno prisotnost endogenih snovi iz org. faze, ki bi
lahko motile našo analizo.
(ta korak bi v ugodnejših časovnih okoliščinah seveda morali izvesti pred analizo)

29
IZVEDBA VAJE

•Diskusija o metodah, rezultatih, težavah pri delu...

•Diskusija o dejavnikih, ki vplivajo na pripravo vzorca (izkoristek in
njegovo ponovljivost
•...

30