34

VII VEŽBA
IZDVAJANJE I ODRŽAVANJE ČISTIH KULTURA
MIKROORGANIZAMA

U prirodnim sredinama skoro uvek se nalazi pomešano više vrsta mikroorganizama. Medjutim,
nijedna vrsta mikroorganizama ne može se bliže upoznati, u pogledu svojih morfoloških,
odgajivaĉkih i biohemijskih karakteristika, sve dok se ne izdvoji kao ĉista kultura. Znaĉi ovo je
osnova mikrobiološkog rada.

Pod čistom kulturom se podrazumeva potomstvo mikroorganizama nastalo

razmnožavanjem jedne ćelije.

METODE ZA IZDVAJANJE ČISTIH KULTURA MIKROORGANIZAMA

Tokom vremena otkriven je i usavršen veći broj metoda za izdvajanje ĉistih kultura
mikroorganizama. Najpoznatije metode koje se koriste u mikrobiološkoj tehnici rada su: metoda
razredjivanja, iscrpljivanja, po Lindneru, pomoću mikromanipulatora, monospornim
izolatorom, korišćenjem selektivnih podloga, nakupljanjem i dr. Postupak izdvajanja ĉiste
kulture kod nekih metoda može se direktno kontrolisati pod mikroskopom (Lindnerova metoda,
pomoću mikromanipulatora, monospornog izolatora), a kod drugih prati se razvoj kolonija na
podlozi, a da li je kultura ĉista, proverava se mikroskopski.

Izdvajanje čiste kulture metodom razredjivanja.

Za sve namirnice za ĉije je mikrobiološko ispitivanje potrebno više razreĊenja, uzima se 1 ml

osnovnog (decimalnog) razreĊenja sterilnom pipetom i prenosi u epruvetu sa 9 ml fiziološkog
rastvora. Zameni se pipeta ĉistom i izvrši homogenizacija. Postupak se ponavlja pri izradi
daljih razreĊenja. Na ovaj naĉin postiže se decimalno razblaženje uzorka jer prenošenjem 1ml
u 9ml (ukupno 10ml) pri svakom prenošenju razredjujemo uzorak 10x.

-OdreĊivanje broj mikroorganizama u g ili ml

Od pripremljenih osnovnih razreĊenja uzoraka (10g/ml uzorka u 90 ml fiziološkog rastvora)

otpipetira se po 1 ml u Petrijeve ploĉe i zalije, uz mešanje, sa oko 15 ml rastvorenog i na
45°C ohlaĊenog hranljivog agara. Kad se podloga stegne, ploĉe se inkubiraju na 30°C u
trajanju od 72 ĉasa. Nakon 1-3 dana na površini podloge pojaviće se vidljive zajednice -
kolonije mikroorganizama. Pretpostavlja se da je svaka kolonija nastala umnožavanjem jedne
jedine ćelije. Posle inkubiranja, izbroje se kolonije na ploĉama na kojima je izraslo 30 do 300
kolonija. Dobijeni broj kolonija množi se veliĉinom razreĊenja i iskazuje kao broj
mikroorganizama u g ili ml. Bakteriološkom petljom zahvata se kultura sa kolonije i zaseje
kosa površina agara koji se takodje stavlja u termostat. Kada se kultura razvije, mikroskopski se
proveri da li je ĉista. Ćelije u preparatu, ako je kultura ĉista, ujednaĉenog su oblika i veliĉine.
 35

Sl. 1 Prikaz postupka

decimalnog razblaženja

Metoda iscrpljivanja

Ovo je jedna od najjednostavnijih metoda za izdvajanje ĉistih kultura. U odnosu na druge

metode ova metoda zahteva najmanje pribora i materijala za izdvajanje ĉiste kulture. Zasniva se
na uzimanju bakteriološkom petljom materijala, iz koga se želi da izdvoji ĉista kultura, i
povlaĉenju petlje po površini ĉvrste podloge. Pri tome mikroorganizmi sa petlje prelaze na
podlogu. Pri svakom narednom potezu sve je manje organizama na petlji. Materijal sa petlje se
iscrpljuje a na mestima gde je povlaĉena petlja pojaviće se kolonije, (vidljive zajednice mikro-
organizama), medju kojima mogu biti i takve koje su usamljene, odnosno koje su nastale
umnožavanjem jedne ćelije.
POSTUPAK: Ĉvrsta hranljiva podloga se rastopi i iz epruvete izlije u Petri kutije. Kada se agar
stegne uzima se bakteriološka petlja, opali na plamenu špiritusne lampe, ohladi a zatim zahvati
materijal iz koga se želi da izdvoji ĉista kultura. Petlja sa materijalom se unosi u Petri kutiju i
 36

povlaĉi više puta po površini agara kako bi se sa nje skinuo materijal. Nakon toga Petlja se
ponovo opali na plamenu špiritusne lampe, a Petri kutija se sa dnom okrenutim prema gore
stavlja u termostat. Posle odredjenog vremena (24-48h ili duže) izvrši se pregled materijala. Ako
postoje usamljene kolonije sterilnom petljom se presejavaju na kosu površinu hranljivog agara.
Zasejane podloge u epruvetama takodje se stavljaju u termostat da bi se razvila ĉista kultura. Na
kraju se proverava mikroskopiranjem da li je dobijena ĉista kultura. Pripremi se fiksirani
obojeni preparat (preparat po Gramu) i ako su ćelije u preparatu jednake veliĉine, jednakog
oblika i isto obojene ovo su dokazi da je izdvojena ĉista kultura. Provera se vrši i pravljenjem
razredjenja ĉiste kulture i ponovo izvrši zasejavanje. Ako u ponovljenjom postupku izrastu
kolonije istog oblika, veliĉine i boje, i to nam ukazuje da je izdvojena ĉista kultura.

Sl. 2 Prikaz postupka

iscrpljivanja

MIKROSKOPSKI KONTROLISANE METODE IZDVAJANJA

MIKROORGANIZAMA

Ove metode se zasnivaju na razredjivanju mikroorganizama u hranljivoj podlozi, koja se nanosi

na pokrovno staklo postavljanjem istog iznad komora, a zatim se pomoću mikroskopa izdvaja
jedna ćelija koja se inkubira do pojave odgovarajuće kolonije. Najĉešće se primenjuju
Lindnerova metoda, izdvajanje pomoću mikromanipulatora i izdvajanje pomoću
monospornog izolatora.

Lindnerova metoda najĉešće se koristi za izolaciju kvasaca. Kvasci se razredjuju u sladovini, a

zatim se nanose na pokrovno staklo. Pomoću mikroskopa se izaberu viseće kapi, na preparatu
viseća kap, koje sadrže samo jednu ćeliju.
 37

POTREBAN MATERIJAL I PRIBOR: Mikroskop, nekoliko epruveta sa sterilnom

sladovinom, staklena ploĉica sa udubljenjem, ljuspica, vazelin, Pasterova pipeta, Petri kutija sa
vatom navlaženom vodom i savijenim staklenim štapićem, sterilni filter papirići, pinceta, sveža
preĉišćena kultura kvasca na sladnom agaru, duboki i iskošeni sladni agar i 96% alkohol.

POSTUPAK: Bakteriološkom petljom prenese se manja koliĉina biomase kulture kvasca (1) u
prvu epruvetu sa sladovinom (2) i dobro izmeša da bi se dobila suspenzija. Dve do tri kapi
dobijene suspenzije prenesu se u narednu epruvetu, a zatim iz druge u treću epruvetu i takodje
se dobro promeša. Zatim se pripremi ploĉica sa udubljenjem i pokrovno staklo obrisanoi sa 96%
alkoholom i opaljeni na plamenu. Potom se sterilnom Pasterovom pipetom nanose kapi
suspenzije kvasca (3), veliĉine glavice špenadle, ivice udubljenja na ploĉici namažu vazelinom,
postavlja pokrovno staklo preko udubljenja i dobijeni preparat viseća kap mikroskopira (4).
Najpre se mikroskopira sa uveliĉanjem 120x, a potom 600x. Vidno polje mora obuhvatiti celu
kap. Mikroskopiranjem pregledaju se sve kapi i markiraju one koje sadrže samo jednu ćeliju.
Posle mikroskopiranja ploĉica sa komorom se prenosi u Petri kutiju (5) i inkubira na 30 C.
Nakon 24h ponovo mikroskopira da bi se proverilo da li je došlo do umnožavanja kvasca (6), a
što se može zapaziti ako je došlo do zamagljivanja kapi. Sterilnom pincetom zahvati se sterilan
filter papirić iz epruvete (7), levom rukom podigne se pokrovno staklo iznad komore, vrhom
filter papira upije se kap s kolonijom kvasaca i aseptiĉki prenese u epruvetu sa sladovinom (8).
Na isti naĉin postupa se i sa ostalim kapima u kojima je bila po jedna ćelija mikroorganizma.
Zasejana sladovina se može inkubirati 48h na 26-30 C i nakon toga mikroskopom proveri da li
je dobijena ĉista kultura. S druge strane može se iz epruvete sa sladovinom izvršiti zasejavanje
sladnog agara u Petri kutiji (9). Ona se inkubira 48h na 30 C, dolazi do razvića pojedinaĉnih
usamljenih kolonija (10) koje predstavljaju potomstvo nastalo umnožavanjem jedne ćelije.
Sterilnom bakteriološkom petljom dodirne se kolonija i izvrtši zasejavanje na kosoj površini
sladnog agara (11). Zasejani agar se inkubira na 30 C i nakon 48h doći će do umnožavanja
kulture i formiranje kolonija (12). Na ovaj naĉin dobijena je ĉista kultura kvasaca, koja se
mikroskopski proverava pripremanjem fiksiranih obojenih preparata. U fiksiranom obojenom
preparatu, ukoliko je kultura ĉista, mogu se videti ćelije kvasaca istog oblika i veliĉine.
 38

Izdvajanje čiste kulture pomoću mikromanipulatora

Mikromanipulator je specijalni uredjaj pomoću kojeg se vrši izdvajanje jedne ćelije

mikroorganizama. Sastoji se iz dva operaciona stativa izmedju kojih se postavlja mikroskop. Za
stative se priĉvršćuju mikropipete ili igle. Pomoću zavrtnja mikropipete se pokreću veoma
lagano, što se može videti pod mikroskopom. Ovakvo kretanje omogućuje ispitivaĉu da se
kontrolišući pod mikroskopom mikropipetom približi ćeliji u visećoj kapi. Kada se vrh pipete
približi do ćelije, stvaranjem vakuma ćelija se uvlaĉi u pipetu. Ovako izdvojena ćelija sada se
prenosi na ĉvrsu hranljivu podlogu gde će formirati koloniju ili vidljivu zajednicu koja
predstavlja ĉistu kulturu ili populaciju koja je nastala razmnožavanjem od jedne ćelije.

Izolacija čiste kulture monospornim izolatorom

Ova metoda se zasniva na raspršivanju retke suspenzije spora plesni ili ćelija kvasca po površini
spora u Petri kutiji. Zatim se mikrospora sa objektivom ĉija je moć uveliĉavanja 10x na kome je
montiran izolator, nadje usamljena ćelija, odnosno spora. Mikroskopskim zavrtnjem cev
izolatora se spusti do dna Petrijeve kutije i na taj naĉin izvrši seĉenje agara valjkastog oblika sa
sporom. Pod pritiskom sterilnog vazduha, odnosno vazduha koji je prošao kroz filter od
pamuĉne vate, valjkasti iseĉak agara, sa sporom prenosi se u sterilnu hranljivu podlogu, a zatim
inkubira u termostatu na odgovarajućoj temperaturi za formiranje kolonije.
 39

Metode za izdvajanje ĉistih kultura koje se zasnivaju na biološkim osobinama

mikroorganizama. Postoji veći broj ovih metoda. Svaka od njih prilagodjena je biološkim
osobinama mikroorganizama koji se žele da izdvoje kao ĉiste kulture. Selektivnim hranljivim
podlogama dodaju se materije koje stimulišu rast samo one vrste koja se želi da izoluje. Osim
toga, selektivnim podlogama dodaju se materije koje spreĉavaju razviće nepoželjnih
mikroorganizama (anilinske boje, antibiotici, antiseptici, soli žuĉne kiseline, fenol i dr.).
Sporogene bakterije od asporogenih mogu se odvojiti zagrevanjem na 80 C oko 10 min. Pri
ovoj temperaturi asporogene bakterije bivaju uništene a otporne spore preživljavaju. One se
dalje mogu izdvojiti kao ĉiste kulture primenom navedenih metoda. Termofilni mikro-
organizmi se razvijaju na višim optimalnim temperaturama pa to omogućuje da se odvoje od
drugih mikroorganizama, jer se drugi mikroorganizmi ne mogu razvijati na tim temperaturama.
Podloge sa indikatorom olakšavaju izdvajanje pojedinih vrsta mikro-organizama. Neke vrste
svojim razvićem menjaju boju indikatora u podlozi i to olakšava izdvajanje jednih vrsta od
drugih. Izdvajanje ĉistih kultura iz patološkog materijala koji je zagadjen sprovodi se preko
osetljivih životinja koje se inficiraju a potom se iz tih životinja vrši izdvajanje ĉistih kultura
korišćenjem odgovarajućih podloga. Kada se želi da izdvoje mikroorganizmi male veliĉine
onda se materijal filtrira kroz filtre ĉije pore propuštaju samo mikroorganizme male veliĉine.

ODRŽAVANJE ČISTIH KULTURA MIKROORGANIZAMA

Ĉiste kulture mikroorganizama za svakodnevnu upotrebu održavaju 3se na teĉnim (u

epruvetama i kolbama) i ĉvrstim hranljivim podlogama (na kosom agaru), na tamnom i
hladnom mestu na temperaturi od 4-6 C u hladnjaku. Pri ovakvom ĉuvanju hranljiva podloga se
menja, hranljive materije iz podloge uzimaju mikroorganizmi, nastaju proizvodi metabolizma,
podloga se suši, mikroorganizmi mogu gubiti neke svoje osobine i posle duže ili kraće vremena
kultura može uginuti. Iz tog razloga mikroorganizmi ĉuvani na ovaj naĉin moraju se ĉešće
presejavati. Najveći broj vrsta presejava se svake druge do svake ĉetvrte nedelje. Manje
osetljive vrste (sporogene bakterije) presejavaju se svakih 4 do 6 meseci, a osetljive vrste
(bakterije mleĉne kiseline) svakih 7-15 dana. Pri ovakvom održavanju kultura potrebno je dosta
vremena, sredstava, pribora i dr. Iz tih razloga primenjuju se drugi postupci za održavanje
mikroorganizama u obliku trajnih kultura.

Ĉuvanje mikroorganizama u obliku trajnih kultura vrši se bez ĉešćeg presejavanja duže ili kraće
vreme (od jedne do više godina), što zavisi od vrste organizama i naĉina ĉuvanja. Najĉešći
naĉini ĉuvanja su : u epruvetama pod slojem parafinskog ulja, u hermetiĉki zatvorenim
sudovima (otvor epruvete sa zapušaĉem zaliva se parafinom), u sterilnom zemljištu, pesku,
kaolinu, u smrznutom stanju, u liofilizovanom stanju i dr. Ĉuvanje kultura u smrznutom stanju i
u liofilizovanom stanju su metode koje su dosta raširene u praksi.

Postupak liofilizacije izvodi se u posebnim aparatima za liofilizaciju, na taj naĉin što se kultura
u teĉnom stanju naglo smrzava na -78 C i pod negativnim pritiskom (u vakumu) suši. Voda se
udaljava prelaskom leda direktno u paru, pri ĉemu teĉna faza izostaje. Liofilizovane kulture se
ĉuvaju bez presejavanja u zalivenim staklenim ampulama više godina.