z

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


BÁO CÁO
THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME
GVGD: Ths. Đỗ Thị Hiền

Nhóm 7
1. Đỗ Thị Thu Thủy 2008160138
2. Phạm Thị Thu Đan 2008160014
3. Tô Thị Hoàng Mỹ 2008160081

TpHCM, tháng 05 năm 2019

BÀI 5 CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOSE OXIDASE
BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

ĐÁNH GIÁ
STT HỌ VÀ TÊN NỘI DUNG THÍ NGHIỆM
NHÓM TRƯỞNG
Cố định enzyme glucose oxidase,
1 Đỗ Thị Thanh Thủy xác định hoạt tính của enzyme tự 9
do và enzyme cố định.
Xây dựng đường chuẩn của D-
glucose, xác định hàm lượng
2 Tô Thị Hoàng Mỹ 9
protein, xác định thông số động
học của enzyme tự do.
Xây dựng đường chuẩn của D-
glucose, xác định hoạt tính của
3 Phạm Thị Thu Đan enzyme tự do và enzyme cố định, 9
xác định thông số động học của
enzyme tự do.
1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1.1. Enzyme glucose oxidase
Glucose oxidase (GOD, 𝛽-D-glucose oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là enzyme
xúc tác quá trình oxi hóa 𝛽-D-glucose thành acid gluconic với oxi là chất nhận điện tử và
tạo ra hydro peroxide (H2O2).
C6H12O6 + O2 + H2O  C6H12O7 + H2O2
Enzyme glucose oxidase thường được thu nhận từ nấm mốc Penicillium notatum,
Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger.
Enzyme glucose oxidase hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 30-50oC, và ở khoảng
pH từ 4,5-6,5.
Ứng dụng: Thường được dung làm thuốc thử xác định glucose trong nước tiểu để phát
hiện bệnh tiểu đường…
1.2. Enzyme cố định và enzyme tự do
Enzyme cố định(enzyme không hòa tan), enzyme loại này được tạo ra nhờ cố định trên
chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau như bằng cách phương pháp hấp phụ vật lý,
phương pháp gằn enzyme bằng lien kết đồng hóa trị; tuy nhiên, phổ biến nhất là phương
pháp cố định trên gel. Có nhiều nguyên liệu tạo gel như gelatin, carrageenan,
polyacrylamide, chitosan, alginate,…. Trong đó, alginate được sử dụng phổ biến do có
nguồn gốc tự nhiên, tạo thành gel trong CaCL2 ở bất kì nhiệt độ nào dưới 100oC và không
bị chảy khi đun nóng.
Ưu điểm của enzyme cố định đó là có thể tái sử dụng được nhiều lần, không bị lẫn vào
sản phẩm cuối.
Enzyme tự do là enzyme hòa tan. So với enzyme cố định, hoạt tính của enzyme tự do
thông thường sẽ cao hơn hoạt tính của enzyme cố định.
2. CÁCH PHA HÓA CHẤT DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM
- Pha dung dịch đệm acetic pH = 5.6:
+ Pha dung dịch A: Acetic acid 0.2M: Hút 11.55ml CH3COOH hòa tan vào nước cất
định mức tới 1000ml.
+ Pha dung dịch B: Sodium acetate 0.2M: Cân 16.4g CH3COONa (27.2g
CH3COONa.3H2O) hòa tna định mức tới 1000ml.
+ Trộn 4.8ml dung dịch A và 45.2ml dung dịch B được 50ml đệm acetate pH=5.6.
- Pha dung dịch glucose 0.09%: Cân 0.09g glucose hòa tan trong 100ml đệm acetate
pH =5.6.
- Pha dung dịch GOD 2%: Cân 2g GOD hòa tan trong 100ml đệm acetate pH = 5.6.
3. VAI TRÒ CỦA CÁC CHẤT TRONG TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM

TÊN HÓA CHẤT VAI TRÒ

Cố định enzyme glucose oxidase
Dung dịch C
Cố định enzyme
(Sodium alginate 3% : GOD 1%, 1:1)
CaCl2 Tạo gel
Thí nghiệm xây dựng đường chuẩn D-glucose
Glucose Chất chuẩn
Đệm acetate pH = 5.6 Ổn định môi trường
Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme tự do và cố định
Glucose Cơ chất
Đệm acetate pH = 5.6 Tạo điều kiện cho GOD hoạt động tốt
Enzyme GOD Thủy phân glucose
Thuốc thử DNS Tạo màu với glucose
Thí nghiệm xác định thông số động học của enzyme tự do
Glucose Cơ chất
Đệm acetate pH = 5.6 Tạo điều kiện cho GOD hoạt động tốt
Thủy phân glucose, xác định thông số
GOD tự do 1%
động học enzyme tự do
Thuốc thử DNS Tạo màu với glucose
Thí nghiệm xác định thông số động học của enzyme cố định
Glucose Cơ chất
Đệm acetate pH = 5.6 Tạo điều kiện cho GOD hoạt động tốt
Thủy phân glucose, xác định thông số
GOD cố định
động học enzyme cố định
Thuốc thử DNS Tạo màu với glucose

4. TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM

4.1. Cố định enzyme glucose oxidase vào gel sodium alginate
- Pha 100ml dung dịch sodium alginate 3% (w/v) (3g/100ml) (dung dịch A).
- Pha 100ml dung dịch enzyme GOD 1% (w/v) (1g/100ml) (dung dịch B).
- Trộn dung dịch A và B trên với tỷ lệ 1:1 (v/v) được 200ml dung dịch C.
Sử dụng bơm kim tiêm 1 mL hút dung dịch E, nhỏ từng giọt vào cốc có chứa 30 mL
CaCl2 2%. Khi nhỏ kín bề mặt, dung đũa thủy thinh khuấy nhẹ đến khi các hạt chìm
xuống đáy cốc. Lưu ý: Không để đẩu kim quá xa mặt dung dịch để tránh tạo đuôi cho hạt.
Ngâm các hạt enzyme cố định trong dung dịch CaCl2 2% trong 30 phút để tăng độ bền
hạt. Sau đó, lọc thu hạt enzyme cố định và rửa lại với 5 mL nước cất. Đo tổng thể tích
dung dịch sau khi rửa hạt. Đem các hạt đi cân.
 Hình 1. Hình ảnh thí nghiệm Hình 2. Hình ảnh thí nghiệm
lọc sau khi cố định enzyme. các hạt enzyme đã được cố định.

4.2. Xác định hoạt tính enzyme glucose oxidase

4.2.1. Nguyên tắc
Lượng glucose được chuyển hóa bởi enzyme glucose oxidase được xác định dựa
trên phản ứng tạo màu giữa glucose và thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS), cường độ
màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ glucose trong phạm vi nhất định.
Dựa vào đồ thị đường chuẩn với glucose tinh khiết, ta tính được hàm lượng glucose có
trong mẫu phân tích. Cường độ màu đo trên máy quang phổ tạ bước sóng 540nm.
4.2.2. Xây dựng đường chuẩn D-glucose
Chuẩn bị 12 ống nghiệm đã được rửa sạch, tráng cồn và để ráo. Ghi nhãn tên cho
các ống nghiệm.
Thêm các hóa chất vào 6 ống nghiệm như trong bảng dưới đây:

Các ống thí nghiệm

Hóa chất Đơn vị Ống Ống Ống Ống Ống Ống
1 2 3 4 5 6
Glucose 0.09% ml 0 1 2 3 4 5
Đệm acetate pH = 5.6 ml 5 4 3 2 1 0
Nồng độ glucose 𝜇mol/ml 0 1 2 3 4 5
Lấy 1ml ở mỗi ống cho vào 6 ống nghiệm tương ứng khác.
Thuốc thử DNS 1% ml 3
Dùng giấy nhôm bịt kín đầu ống nghiệm. Đặt vào nồi nước đang sôi trong 5 phút.
Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đo độ hấp phụ bước sóng 540nm.
(Lưu ý: mẫu trắng là ống 1).
 Hình 3. Thí nghiệm dựng đường chuẩn D-glucose.
4.2.3. Xác định hoạt tính của enzyme tự do và enzyme cố định
Hoạt tính: Một đơn vị hoạt độ của enzyme glucose oxidase là lượng enzyme dùng
để chuyển hóa 1 µmol glucose trong thời gian 1 phút ở 30oC và pH 5,6.
1 UI = 1 µmol cơ chất/1 phút
Chuẩn bị 3 ống nghiệm đã được rửa sạch, tráng cồn và để ráo. Ghi nhãn tên cho
các ống nghiệm.
Thêm các hóa chất vào 3 ống nghiệm như trong bảng đưới đây:

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị
Đối chứng Enzyme tự do Enzyme cố định
Glucose 0.09% ml 0 1.6 1.6
Acetate pH = 5.6 ml 1 0.4 0.4
Enzyme GOD 0 1ml GOD 1% m hạt = 1.6282g
Để yên trong 30 phút ở 30oC.
Dừng phản ứng bằng cách đun sôi trong 3 phút. Sau đó lọc ống enzyme cố định loại
bỏ hạt.
Thuốc thử DNS
ml 2
1%
Đun sôi trong 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem các ống nghiệm đo
OD ở bước sóng 540nm.
 Hình 4. Hình ảnh thí nghiệm xác Hình 5. Hình ảnh thí nghiệm xác
định hoạt tính enzyme trước khi đun. định hoạt tính enzyme sau khi đun

4.3. Xác định hàm lượng protein

Định lượng protein có trong V1(ml) enzyme GOD tự do và V2(ml) nước rửa hạt
enzyme cố định bằng phương pháp Bradford.
Chuẩn bị 3 ống nghiệm đã được rửa sạch, tráng cồn và để ráo. Ghi nhãn tên cho các
ống nghiệm.
Thêm các hóa chất vào 3 ống nghiệm như trong bảng đưới đây:

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị
Ống 0 Enzyme tự do Nước rửa
Nước cất ml 1 0 0
Mẫu cần xác định 1ml enzyme tự do 1ml nước rửa
Thuốc thử Bradford ml 2
Lắc đều, để yên 20 phút, đo OD 𝜆 = 595nm.
 Hình 6. Thí nghiệm xác định hàm lượng protein.
4.4. Xác định thông số động học của enzyme tự do
Chuẩn bị 6 ống nghiệm đã được rửa sạch, tráng cồn và để ráo. Ghi nhãn tên cho các
ống nghiệm.

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị Ống Ống Ống Ống Ống Ống
0 1 2 3 4 5
Glucose 0.09% ml 0 1 2 3 4 5
Đệm acetate pH =5.6 ml 5 4 3 2 1 0
Nồng độ glucose 𝜇mol/ml 0 1 2 3 4 5
GOD 1% ml 1
Để yên trong 5 phút ở 37oC
Dừng phản ứng bằng cách đun sôi trong 3 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Dịch lọc ml 1
Thuốc thử DNS 1% ml 3
Đun sôi trong 5 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đo OD ở bước sóng
540nm
 Hình 7. Thí nghiệm xác định thông số động học của enzyme tự do.
5. KẾT QUẢTÍNH TOÁN VÀ THẢO LUẬN
5.1. Xây dựng đường chuẩn D-glucose
Kết quả thí nghiệm

Các ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

Nồng độ glucose (𝜇mol/ml) 0 1 2 3 4 5
Giá trị OD đo ở 540nm 0 0.218 0.504 0.939 1.609 1.864
 Đường chuẩn D-glucose
2
y = 0.3979x - 0.1392
1.5 R² = 0.9711

1
OD

0.5

0
0 1 2 3 4 5 6
-0.5
Nồng độ glucose (𝜇mol/ml)

Phương trình đường chuẩn:

y = 0.3979x – 0.1392
Trong đó: y: Giá trị OD đo được.
x: Nồng độ glucose (𝜇mol/ml).
5.2. Xác định hoạt tính của enzyme tự do và enzyme cố định
Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme

Các ống nghiệm Đối chứng Enzyme tự do Enzyme cố định

Nồng độ glucose (𝜇mol/ml) 0 6.93 6.93
Giá trị OD ở 540nm 0 1.176 1.951
Lượng glucose (𝜇mol/ml) 0 x1= 3.305 x2 = 5.253

𝑛 𝑑×𝑉𝑔𝑙𝑢 1.56×1.6
Nồng độ glucose ban đầu = = = = 6.93 (𝜇mol/ml)
𝑉𝑑𝑑 𝑀𝑔𝑙𝑢 ×𝑉𝑑𝑑 180×2

Hoạt tính của enzyme tự do là:

UI Nồngđộglucosebanđầu−x1 6.93−3.305
A( )= = ≈ 0.121 (UI/mL)
mL Thờigianphảnứng 30

Hoạt tính của enzyme cố định là:

 𝑈𝐼 𝑁ồ𝑛𝑔độ𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒𝑏𝑎𝑛đầ𝑢−𝑥2 6.93−5.253
B( )= = ≈ 0.056 (UI/mL)
𝑚𝐿 𝑇ℎờ𝑖𝑔𝑖𝑎𝑛𝑝ℎả𝑛ứ𝑛𝑔 30

Hiệu suất cố định hoạt tính enzyme:

8.907
B ×m 0.056×
30
H= = ≈ 0.137
A ×V1 0.121.1
Trong đó:
H: Hiệu suất cố định hoạt tính enzyme
m: Khối lượng hạt enzyme cố định thu được (g)
V1: Thể tích dung dịch enzyme GOD tự do (mL)
Nhận xét: Hoạt tính của enzyme tự do lớn hơn hoạt tính của enzyme cố định.
5.3. Xác định hàm lượng protein
Đồ thị đường chuẩn albumin đã xây dựng ở bài 2

0.6
y = 0.0094x + 0.0428
0.5 R² = 0.9402
0.4

0.3
OD

0.2

0.1

0
0 10 20 30 40 50 60
Nồng độ albumin(𝜇g/ml)

Ta có phương trình đường chuẩn:

y = 0.0094x + 0.0428
Trong đó:
y: giá trị OD đo được ở bước sóng 595nm.
x: nồng độ albumin 𝜇g/ml

Các ống nghiệm Ống 0 Enzyme tự do Nước rửa

Giá trị OD ở 559nm 0 3.088 0.333
Lượng protein(x) (𝜇g/ml) 0 x3 = 323.957 x4 = 30,872

Hàm lượng protein có trong dung dịch enzyme tự do là:

 Y1(mg protein) = x3 × V1× 10−3 = 323.957× 5× 10-3≈ 1.620 (mg protein)
Trong đó:
V1: Là thể tích dung dịch enzyme GOD đem đi cố định (5ml)

Hàm lượng protein có trong dung dịch nước rửa là:

Y2(mg protein) = x4× V2× 10-3 = 30.872× 32× 10-3≈0.988 (mg protein)
Trong đó:
V2: Là thể tích dung dịch nước rửa (32ml)
Hàm lượng protein có trong hạt enzyme cố định là:
Y(mg protein) = Y1 – Y2 = 1.620 – 0.988 = 0,632 (mg protein)

5.4. Xác định hoạt tính riêng

Hoạt tính riêng là hoạt tính enzyme trên hàm lượng protein
Hoạt tính riêng của enzyme tự do:
𝐴 ×𝑉1 1.306 ×5
Y3(UI/mg) = = =4.031
𝑌1 1.620
Trong đó:
A: Hoạt tính của enzyme tự do (UI/ml).
V1: Thể tích dung dịch enzyme GOD đem đi cố định (ml).
Y1: Hàm lượng protein có trong dung dịch enzyme tự do (mg).
Hoạt tính riêng của enzyme cố định:
𝐵×𝑚 1.371 ×8.907
Y4(UI/mg) = = =19. 322
𝑌 0.632
Trong đó:
B: Hoạt tính của enzyme cố định (UI/g).
m: Khối lượng hạt enzyme cố định thu được (g).
Y: Hàm lượng protein có trong hạt enzyme cố định (mg).
5.5. Xác định thông số động học của enzyme tự do
Kết quả thí nghiệm

Các ống nghiệm Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5

OD đo ở 540nm 0 0.358 0.518 0.742 0.979 1.179
Lượng glucose ban
0 1 2 3 4 5
đầu(𝜇𝑚𝑜𝑙/ml)
Lượng glucose
-0.139 0.0032 0.0669 0.156 0.2503 0.3299
(y) (𝜇𝑚𝑜𝑙/ml)
Lượng glucose mất đi 0.1392 0.9968 1.9331 2.844 3.7497 4.6701
V (𝜇𝑚𝑜𝑙/ml.phút) 0.0278 0.1994 0.3866 0.5688 0.7499 0.934
S(𝜇𝑚𝑜𝑙/ml) 0 1 2 3 4 5
1/S 1 0.5 0.33 0.25 0.2
1/V 5.0163 2.5865 1.7581 1.3335 1.0706
 6
y = 4.9141x + 0.1122
5
R² = 0.9998
4
1/V
3

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
1/S

Đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V

Dựa vào đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V

Ta có:
1
b= = 0.1122 =>𝑣𝑚 =8.913 (𝜇𝑚𝑜𝑙/ml.phút)
𝑣𝑚

𝐾𝑚
a= = 4.9141 =>𝐾𝑚 = 43.799
𝑣𝑚
5.6. Xác định thông số động học của enzyme cố định

Kết quả lấy ở nhóm 9

- Xây dựng đường chuẩn D-glucose

Các ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

Nồng độ glucose (𝜇mol/ml) 0 1 2 3 4 5
Giá trị OD đo ở 540nm 0 0.298 0.763 1.197 1.529 2.019
 Đường chuẩn D-glucose
 Gía trị OD
2.5
2
1.5
1 y = 0.4063x - 0.0482
0.5 R² = 0.9965

0
0 1 2 3 4 5 6
-0.5
Nồng độ glucose((𝜇mol/ml)

Phương trình đường chuẩn:

y =0.406x – 0.048
Trong đó: y: Giá trị OD đo được.
x: Nồng độ glucose (𝜇mol/ml).
- Xác định thông số động học của enzyme cố định

Các ống nghiệm Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5

OD đo ở 540nm 0 0,356 0,83 1,34 1,46 1,834
Lượng glucose ban
0 1 2 3 4 5
đầu(𝜇𝑚𝑜𝑙/ml)
Lượng glucose
0,100 0,292 0,499 0,548 0,700
(y) (𝜇𝑚𝑜𝑙/ml)
Lượng glucose mất đi 0,900 1,708 2,501 3,452 4,300
V (𝜇𝑚𝑜𝑙/ml.phút) 0,180 0,342 0,500 0,690 0,860
S(𝜇𝑚𝑜𝑙/ml) 1 2 3 4 5
1/S 1 0,500 0,333 0,250 0,200
1/V 5,554 2,928 1,999 1,448 1,163

1/v
6.000
5.000
4.000
3.000 y = 5.4649x + 0.1228
R² = 0.9989
2.000
1.000
0.000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
1/S
Ta có:
1
b= = 0.122 =>𝑣𝑚 =8.197 (𝜇𝑚𝑜𝑙/ml.phút)
𝑣𝑚

𝐾𝑚
a= = 5.464 =>𝐾𝑚 = 44.788
𝑣𝑚
Nhận xét: Vận tốc phản ứng của enzyme tự do nhanh hơn vận tốc phản ứng của
enzyme cố định. Km của enzyme tữ do nhỏ hơn Km của enzyme cố định cho thấy
ái lực của enzyme tự do với cơ chất lớn hơn ái lực của enzyme cố định với cơ chất.
Ái lực càng lớn thì khả năng gắn kết giữa enzyme và cơ chất càng lớn, tức là tăng
khả năng thủy phân cơ chất, vận tốc phản ứng nhanh hơn.
6. TRẢ LỜI CÂU HỎI
- Khi nhỏ dung dịch C vào trong dung dịch CaCl2 2% thì có sự tạo thành gel vì trong
dung dịch C có chứa alginate là loại polymer có nguổn gốc tự nhiên có khả năng tạo
gel trong CaCl2 dù ở bất kỳ nhiệt độ nào dưới 100oC và không bị chảy khi đun nóng
- Hạt enzyme cố định có hình cầu nhỏ.
- Hoạt tính của enzyme tự do nhỏ hơn hoạt tính của enzyme cố định.