BÀI THỰC HÀNH 1: XÁC ĐỊNH MICROPLASTIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM

HUỲNH QUANG NILE RED

1. Tổng quan
Microplastics còn gọi là vi nhựa là những miếng nhựa nhỏ có kích thước <5mm, trong đó vi nhựa
lớn có kích thước 5mm – 1mm (nhìn thấy được), vi nhựa nhỏ 1mm – 20µm [1]. Hình dạng và nguồn
gốc của vi nhựa rất đa dạng, bao gồm dạng hạt, dạng tấm mỏng, dạng sợi…, bắt nguồn từ các vật
liệu nhựa lớn bị bào mòn theo thời gian trong điều kiện tự nhiên, cũng có một số loại hạt nhựa được
cố tình đưa vào sản phẩm với các mục đích khác nhau, ví dụ như trong sản phẩm tẩy tế bào chết và
kem đánh răng [2].
Theo một nghiên cứu trước đây, có hơn 5 nghìn tỷ mảnh nhựa đang trôi nổi trên biển, trong đó
vi nhựa chiếm hơn 94% [3]. Vi nhựa trôi nổi này dễ bị các sinh vật biển ăn phải và tồn tại trong cơ
thể chúng. Cuối cùng, những sinh vật này trở thành thức ăn cho con người và vi nhựa trở lại tồn tại
trong cơ thể chúng ta. Bên cạnh đó, vi nhựa có thể hấp phụ những chất độc hại từ chất trừ sâu đến
BPA khi trôi nổi như vậy [2]. Vì vậy, việc xác định vi nhựa, ngăn ngừa sự phát tán và loại bỏ chúng
khỏi môi trường là thách thức hiện nay.
Trong những năm gần đây, phương pháp nhuộm huỳnh quang bằng Nile Red là một phương
pháp phổ biến, chi phí thấp và được áp dụng rộng rãi để xác định vi nhựa. Nile Red. Kỹ thuật nhuộm
huỳnh quang bằng Nile Red trên vi nhựa được xuất phát kỹ thuật nhuộm lipid, chất có tính kỵ nước
giống nhựa [4]. Nile Red bám trên vi nhựa sẽ phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Chính vì thế, bài thực hành này sẽ bước đầu cung cấp phương pháp xác định vi nhựa tồn tại trong
môi trường với phương pháp nhuộm chất huỳnh quang bằng Nile Red.
2. Phương pháp phân tích
2.1.Dụng cụ thí nghiệm, thiết bị và hoá chất
2.1.1. Dụng cụ thí nghiệm, thiết bị
- Erlen 250mL
- Erlen 50mL
- Beaker 100mL
- Micro pipette 0 – 100µL
- Pipette thuỷ tinh 10mL
- Ống thuỷ tinh có nắp 5mL
- Đĩa petri
- Giấy lọc Whatman Cellulose Nitrate, đường kính 47mm, kích thước lỗ 0.45µm.
- Cân phân tích
- Máy lắc ly tâm
- Máy lọc chân không
- Tủ sấy
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Kẹp nhíp
- Bình tia
- Rây ràng 5mm
2.1.2. Hoá chất
- Bột Nile Red
- Acetone

1
- Nước cất
2.2.Chuẩn bị hoá chất nhuộm Nile Red
Dung dịch Nile Red chuẩn có nồng độ 1mg/mL [5] được chuẩn bị như sau:
- Dùng cân phân tích cân lượng chính xác 1mg bột Nile Red.
- Đổ 1mg bột Nile Red vào ống thuỷ tinh có nắp đậy chứa sẵn 1mL dung dịch Acetone.
- Lắc li tâm 100vòng/phút trong 30 phút.
*Dung dịch Nile Red trữ được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4oC.

Hoá chất nhuộm Nile Red sử dụng trong thí nghiệm được pha loãng 200 lần từ dung dịch Nile
Red lưu trữ, đồng nghĩa với nồng độ 5µg/mL, được chuẩn bị theo các bước sau (1):
- Rút 0.025mL (25µL) bằng micro pipette (rửa đầu kim bằng nước cất nhiều lần) cho vào erlen
50mL có chứa 5mL dung dịch Acetone.
- Lắc ly tâm trong 10p với tốc độ 100 vòng/phút.
Công thức pha dung dịch Nile Red làm việc (1):
𝑁𝑅𝑠 ×𝑉1
𝑁𝑅𝑤 = (1)
𝑉2
Trong đó:
- NRW: Nồng độ dung dịch Nile Red làm việc (mg/mL)
- NRs: Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/mL)
- V1: Thể tích của dung dịch Nile Red chuẩn (mL)
- V2: Thể tích dung môi Acetone (mL); V2 = 200xV1
2.3.Quy trình thực hiện
Dựa trên các tài liệu tham khảo từ những nghiên cứu trước đây và các thí nghiệm tiền đề được
thực hiện tại cơ sở, sau đây là sơ đồ phương pháp xác định microplastic bằng phương pháp nhuộm
huỳnh quang Nile Red:

Mô tả quy trình ở biểu đồ 1:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu
- Đối với mẫu nhựa: các mẫu nhựa PP, PE, PET, LDPE…, lấy từ các vật dụng thông thường
có in ký hiệu nhựa, được mài nhỏ bằng giấy nhám sau đó cho vào erlen 250mL. Pha nước cất
đến vạch 150mL.
- Đối với mẫu mỹ phẩm, kem đánh răng: sử dụng cân phân tích, cân 1g mẫu thô sau đó cho vào
erlen 250mL. Pha nước cất đun sôi đến 150mL rồi lắc ly tâm ở tốc độ 150 vòng/phút trong 30
phút. Mỗi loại mỹ phẩm, kem đánh răng thực hiện 3-5 lần.
- Đối với nước sông: lọc toàn bộ mẫu trong chai chứa mẫu qua rây sàng 5mm để loại bỏ các
vật lớn (nếu có). Mỗi thí nghiệm 150mL mẫu nước sông được cho vào vào erlen 250mL.
- Đối với nước đóng chai 500mL: mỗi thí nghiệm đổ 150mL mẫu nước đóng chai vào erlen
250mL. Làm thí nghiệm đến khi hết mẫu trong 500mL nước đóng chai.
Bước 2: Nhuộm dung dịch mẫu

2
 150mL dung dịch
mẫu

1mL Dung dịch Lắc ly tâm

Nile Red 100rpm, 20p
5µg/mL

Dung dịch ổn định

trong 5p

Lọc chân không

Mẫu giấy lọc có vi

nhựa

Để khô tự nhiên.
Để vào đĩa Petri bọc kín

Đem giấy lọc sau khi

sấy đi soi kính hiển vi
huỳnh quang

Biểu đồ 1: Quy trình xác định vi nhựa sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang bằng Nile
Red
- Dung dịch Nile Red sử dụng để nhuộm là dung dịch Nile Red 5µg/mL, được chuẩn bị như
trên mục 2.2.
- Hút 1mL dung dịch Nile Red 5µg/mL cho vào erlen 250mL đang chứa 150mL dung dịch mẫu.
- Lắc ly tâm bình erlen ở tốc độ 100 vòng/phút trong 30 phút. Sau đó để dung dịch ổn định
trong 5 phút.
- Lọc chân không dung dịch mẫu bằng giấy lọc Whatman Cellulose Nitrate filter, lỗ lọc 0.45µm.
Bước 3: Soi mẫu nhựa bằng kính hiển vi huỳnh quang
- Giấy lọc được soi dưới kính hiển vi huỳnh quang Olympus BX53 ở bước sóng từ 400 – 650nm,
độ phóng đại 40X. Hạt nhựa được nhuộm huỳnh quang sẽ phát sáng hơn so với nền.
- Chụp ảnh hạt vi nhựa có trên giấy lọc.
2.4.Báo cáo kết quả
2.4.1. Đếm vi nhựa trên thị trường, tính mật độ hạt vi nhựa
- Trên mỗi giấy lọc, 5 thị trường từ kính hiển vi được chụp lại. Số hạt nhựa xuất hiện trên các
thị trường được ghi lại. Số hạt vi nhựa trên giấy lọc được tính theo công thức sau:
∑51 𝑁𝑛 ×𝑆𝑓𝑖𝑙𝑡𝑒𝑟
𝑁𝑀𝑃 = (2)
5×𝑆1

3
 Trong đó:
o NMP: Tổng hạt vi nhựa trong hạt nhựa
o Nn: Hạt vi nhựa đếm được trong mỗi thị trường (từ 1 đến 5)
o S1: Diện tích thị trường (mm2)
o Sfilter: Diện tích giấy lọc (mm2)
2.4.2. Phân loại kích thước các hạt vi nhựa
- Sử dụng phần mềm ImageJ để tạo thước đo trên ảnh chụp. Từ đó phân loại kích thước, đếm
hạt vi nhựa có trong dung dịch mẫu.
- Sử dụng công thức (2) để tính mật độ của các kích thước hạt có trên giấy lọc.

Tài liệu tham khảo:

[1] G. Erni-cassola, M. I. Gibson, and R. C. Thompson, “Lost , but found with Nile red ; a novel
method to detect and quantify small microplastics ( 20 µm – 1 mm ) in environmental
samples,” 2017.
[2] M. Sartain, E. Sparks, and C. Wessel, Microplastics Sampling and Processing Guidebook.
Mississippi State University, 2018.
[3] M. Eriksen et al., “Plastic Pollution in the World ’ s Oceans : More than 5 Trillion Plastic
Pieces Weighing over 250 , 000 Tons Afloat at Sea,” pp. 1–15, 2014.
[4] W. J. Shim, Y. K. Song, S. H. Hong, and M. Jang, “Identification and quantification of
microplastics using Nile Red staining,” vol. 113, pp. 469–476, 2016.
[5] T. Maes, R. Jessop, N. Wellner, K. Haupt, and A. G. Mayes, “A rapid-screening approach to
detect and quantify microplastics based on fluorescent tagging with Nile Red,” Nat. Publ.
Gr., no. November 2016, pp. 1–10, 2017.