Univerzitet u Tuzli

Farmaceutski fakultet
Dr.sc.Adaleta Softić

Imunohemijske metode u
istraživanjima uloge
lizosomskih cisteinskih
proteaza i njihovih inhibitora
u ćelijama imunog sistema
 Uvod

• Stepen maturacije dendritičnih

ćelija (DC) je krucijalan za efektivnu
antigenu prezentaciju i inicijaciju
primarnog imunog odgovora.

• Maturacijski stimulusi izazivaju

adheziju nezrelih DC za
ekstracelularni matriks, što je
praćeno angažovanjem integrinskog
receptora CD11b/CD18 [macrophage
antigen-1 (Mac-1)], reorganizacijom
citoskeleta i formiranjem podosoma.
 Hvatanje i
prezentacija
proteinskih
antigena putem
dendritičnih
ćelija
 Uvod
• Katepsin X je eksprimiran u DC i
drugim APC i uključen u aktivaciju
Mac-1.
• Tokom maturacije, katepsin X se
translocira prema plazma membrani
maturirajućih DC, aktivira Mac-1 a
time i ćelijsku adheziju.
• U zrelim DC, katepsin X redistribuira
iz područja ćelijske membrane u
perinuklearno područje, što
koincidira sa de-adhezijom DC,
formiranjem nakupina ćelija i
formiranja zrelog fenotipa.
 Uvod

• Prema rezultatima Jevnikarove i

saradnika (2009) prokatepsin X bi
se mogao aktivirati djelovanjem
katepsina L; autori su utvrdili da
obe proteaze snažno kolokaliziraju
sa β2 lancem integrina uz plazma
membranu aktiviranih monocita
/makrofaga i uz uropode T
limfocita.
• Cistatin C je kandidat za
regulaciju aktivnosti katepsina L a
time i aktivacije prokatepsin X.
 Cilj istraživanja

Analizirati kolokalizaciju cistatina C sa ciljnim

enzimima, katepsinom L i katepsinom X, tokom
diferencijacije DC u kulturi
 Hipoteza

Tokom diferencijacije DC u kulturi dolazi do

kolokalizacije cistatina C sa ciljnim enzimima,
katepsinom L i katepsinom X, kao i katepsina L
i katepsina X.
 Postupak pripreme kulture DC

1. Izolacija
PBMC iz krvi 2. Izolacija
CD14+ ćelija 3. Uzgoj u
kulturi uz
faktore rasta i
LPS; 4. Imunofluo-
skrining rescentna
kolokalizacija
 1.Izolacija PBMC iz krvi

PBMC se izdvajaju iz pune krvi centrifugiranjem u gradijentu

gustoće uspostavljenom uz pomoć Ficoll histopaque.

Centrifugiranje
na 300xg 30 min
na 4°C u swing-
out bucket
rotoru, bez
kočnice
 1.Izolacija PBMC iz krvi

Materijal i reagensi
• Svježa heparinizirana krv
• Ficoll Histopaque (Sigma- Aldrich) – neutralni, jako
razgranati hidofilni polisaharid velike molekulske mase
• Dulbecco's modified eagle medium uz dodatak 1%
penicilin-streptomicin otopine
2.Imunomagnetna izolacija CD14+ ćelija
2.Imunomagnetna izolacija CD14+ ćelija

imunomagnetna
izolacija
CD14+ ćelija
 2.Imunomagnetna izolacija CD14+ ćelija

• Sterilnom Pasterovom pipetom se otpipretira sloj

mononuklearnih ćelija, a zatim se vrši ispiranje sa
DPBS (bez Ca i Mg) 1500xg/8min nekoliko puta, da bi
se isprali trombociti koji mogu začepiti magnetnu
kolonu.
• Talog se resuspendira u 0,5%FBS/DPBS (bez Ca i Mg),
otprilike 80 uL. Potom se ostavi na 4 C a onda se
100uL suspenzije miješa sa 100 uL magnetic beads
CD14+, te se inkubira 15 min u frižideru.
• Na držač magneta postavi se magnet a na njega
kolona. Kolona se spere sa 0,5% FBS/DPBS (bez Ca i
Mg). Zatim se otpipetira suspenzija. Suspenzija kroz
kolonu teče polako, oko 30 min.
 2.Imunomagnetna izolacija CD14+ ćelija

• Zatim se kolona ispira da bi se odstranile ostale ćelije.

Prvo ispiranje je sa 1 mL 0,5%FBS/DPBS (bez Ca i
Mg), a drugo i treće sa 3 mL.
• Eluiranje sa kolone: kolona se ukloni sa magnetnog
nosača a zatim ispere sa oko 3 mL medija RPMI 1640.
Pod pritiskom, sa kolone se ispiru monociti, hvataju se
u falkonku, u koju se na kraju dospe do 50mL medija.
• Centrifugiranje 1400xg 7 min. otprilike, a potom
inkubacija 2h u frižideru (da se ćelije smire) i
dodatak faktora rasta. (GM-CSF i IL-4).
• Ćelije se dohrane slijedećeg dana a dan kasnije se
promijeni kompletan medij.
• 5. dana su to imDC.
3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta
 3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta

5. dana,
Kultura CD14+ nezrelim DC
ćelija 2. dana, mjeren nivo
RPMI-1640 ½ medija ekspresije CD1a,
7. dana,
medij+ zamijenjena uz CD14, CD80,
zrelim DC,
dodatak CD83, CD86, i
10% FBS mjeren nivo
početne HLA-DR.
ekspresije
gentamicin količine Ćelije CD1a, CD14,
(50 μg/mL) rhGM-CSF resuspendirane CD80, CD83,
rhGM-CSF (500 U/mL)
u mediju sa CD86 i HLA-
(500 U/mL) rhGM-CSF (500 DR.
rhIL-4 U/mL) i LPS (20
rhIL-4 (400 U/mL) ng/mL) i uzgajane
(400 U/mL) u kulturi još dva
dana.
 Protočna citometrija

(engl. flow cytometry) ili FACS (engl. fluorescence-activated

cell sorting)

Za analizu sa protočnim citometrom potrebna je suspenzija

ćelija.

Prilikom prolaska kroz izvor svjetlosti, svaka pojedinačna

ćelija odaje svjetlosne signale, koji ovise od njenih osobina.

Izvor svjetlosti je laserska zraka (najpogodnija je argonska)

koja je usmjerena na tok ćelija, koje kroz mjesto interakcije
sa laserskom zrakom prolaze pojedinačno (hidrodinamsko
fokusiranje).
Protočna citometrija
Princip

U protočnoj ćeliji dolazi do injektiranja uzorka, koji ima

spor tok, u bržu noseću tekućinu (engl. sheath fluid).

Zbog površinske napetosti i laminarnog toka dolazi do

odvajanja kapljice uzorka iz injektora u uski brzi tok
tekućine nosioca.

Tačan nadzor brzine oba protoka omogućuje kontrolu širine

srednjeg toka i posljedično smještaja ćelija u njemu.
Protočna citometrija
Princip
 Elektronika

Fluidi Detektori svjetla

FL3 P Cy5

FL2 PE

FL1 FITC

SSC

FSC
Računar
Protočna citometrija
Raspršena svjetlost

Pri interakciji laserskog zraka sa uzorkom, većina fotona

neometano prolazi kroz tok.

Međutim, neki fotoni, zbog ometanog puta kroz uzorak,

mijenjaju svoje karakteristike, što opažamo kao odbijanje ili
raspršivanje svjetlosti.

Dva detektora mjere količinu raspršene svjetlosti koju odaje

obasjana ćelija (emitovana svjetlost je jednake talasne
dužine kao obasjavajuća svjetlost).

Prvi detektor je FALS (engl. forward angle light scatter)

koji se nalazi u ravnini puta laserskog zraka (tj. na suprotnoj
strani toka) i omogućuje detekciju odbijene svjetlosti.
 Protočna citometrija
Raspršena svjetlost

Parametar „prednje rasipanje“ (engl. forward scatter“, FSC), nastaje

zbog kontakta sa ćelijskom membranom i srazmjeran je veličini ćelije;
što je veća ćelija, veće je rasipanje svjetlosti te tako i signal koji se
detektira na detektoru, koji prima raspršenu svjetlost iz smjera
laserkog zraka (kut odbijanja zrake je malen).

Kad su ćelije prozirne, dolazi do prolaska velike količine fotona kroz

citoplazmu. Ukoliko dođe do interakcije sa organelama
(endoplazmatski retikulum, jedro...) dolazi do odbijanja fotona pod
različitim uglovima od smjera laserske zrake.

Fotodetektor RALS (engl. right angle scatter) nalazi se pod pravim

uglom u odnosu na lasersku zraku i omogućuje zapis drugog parametra
– „bočno rasipanje“ (engl. side scatter) koji je razmjeran
kompleksnosti (zrnatosti ili granuliranosti) pojedinačne ćelije; što je
više organela odnosno membranskih struktura, veće je bočno
rasipanje i viši je signal.
 Stepen raspršenja svjetlosti pod pravim uglom
od smjera laserske zrake razmjeran je zrnatosti
tj. unutrašnjoj strukturi ćelije.

Detektor za unutrašnju
strukturu ćelije

Detektor za veličinu ćelije

Upadna laserska
svjetlost

Stepen raspršenja svjetlosti u

smjeru laserske zrake razmjeran
je veličini ćelije
 Protočna citometrija
Analiza rezultata – SSC/FSC grafik

Analiza lizirane pune krvi korištenjem dvoparametrijskog FSC/SSC dijagrama

 Protočna citometrija
Imunofluorescentno označavanje proteina

Pored morfoloških karakteristika protočnom citometrijom možemo

analizirati funkcionalne karakteristike ćelija.

Razvrstavanje ćelija prema veličini i zrnatosti omogućuje

razdvajanje bijelih krvnih ćelija na pojedinačne populacije, pa
ukoliko želimo razlikovati podvrste limfocita, potrebno ih je
razvrstati u pogledu prisustva pojedinačnih označavajućih molekula
(obično na površini ćelije), čije se prisustvo određuje sa specifičnim
anititijelima.

Protočni citometar ima dva do četiri fluorescentna detektora

(PMT) koji mjere svjetlost većih talasnih dužina od pobuđujuće
(laserske) svjetlosti.
 Protočna citometrija
Imunofluorescentno označavanje proteina

Svaki detektor prima emitiranu fluorescentnu svjetlost određene

talasne dužine i na taj način mjeri signal, koji daje određena
fluorescentna boja.

Fotodetektori pretvaraju svjetlosne signale u električne.

Izmjerene vrijednosti električnih signala po kompjuterskoj obradi

prikazuju se matematički i grafički.

Na taj način o svakoj ćeliji, pored podataka o njenoj relativnoj

veličini i zrnatosti (FSC i SSC) se dobija i informacija o vrsti i
jačini emitiranih fluorescentnih signala.
Protočna citometrija
Imunofluorescentno označavanje proteina

Spektar vidljive
svjetlosti
390-750 nm
 Protočna citometrija
Analiza rezultata – jednoparametarski histogrami

Ovo su grafici koji pokazuju rezultate mjerenja jednog

parametra (relativnu fluorescencu ili intenzitet raspršenja
svjetlosti) na X-osi i broj događaja (broj ćelija) na Y-osi.

Histogram izgleda
jednostavno i koristan je za
procjenu ukupnog broja ćelija
u uzorku koji posjeduje
odabrane fizičke
karakteristike ili eksprimira
određeni marker. Ćelije sa
željenim karakteristikama su
označene kao pozitivan odziv.
 3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta
membranski markeri
PBMC mogu diferencirati u dva seta DC (mDC1 i mDC2) koje
se odlikuju produkcijom različitog seta citokina, što je
povezano sa različitim kapacitetom za usmjeravanje
diferencijacije T ćelija.

Kao i mDC1 (CD1a+), mDC2 eksprimiraju visoke nivoe CD11c,

CD40, CD80, CD86, i MHC molekule klase II.

mDC2 (CD1a-) ne sintetiziraju IL-12, sintetiziraju visok nivo

IL-10, i usmjeravaju diferencijaciju T ćelija periferne krvi u
Th0/Th2.

mDC2 mogu diferencirati u CD83+ DC ćelije u prisustvu anti-

CD40 mAb, i LPS-a uz IFN-γ, ali ostaju CD1a- i ne stvaraju
IL-12 nakon maturacije.
 3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta
membranski markeri

• CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2) na DC predstavljaju najvažnije

kostimulatorne molekule za aktivaciju T ćelija Obično se
CD80 i CD86 koriste za dokazivanje zrelih DC (mDC).

• CD83 pripada imunoglobulinskoj (Ig) superfamiliji i

predstavlja marker mDC. Među imunim ćelijama, stabilna
ekspresija ovog markera utvrđena je jedino na DC, ali
može biti prolazno eksprimiran na aktiviranim limfocitima.
CD83 je uključen u regulaciju imunosti in vitro i in vivo.
 3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta
skrining fenotipa protočnom citometrijom

Fenotip nezrelih i zrelih dendritičnih ćelija. Isprekidana linija-fluorescentni odziv izotipske

kontrole; puna linija-fluorescentni odziv membranskog markera.
Fenotip nezrelih dendritičnih ćelija: CD1ahi, CD14-, CD80low, CD83-, CD86low, i HLA-DRlow .

Fenotip zrelih dendritičnih ćelija: CD1alow, CD14-, CD80hi, CD83low, CD86hi, HLA-DRhi
Fluorescentna mikroskopija
razvija se početkom 20-tog vijeka, kada je primjećeno da
neki biološki molekuli fluoresciraju pri osvjetljavanju
intenzivnim svjetlosnim zrakom određene talasne dužine
- od 60-tih godina se intenzivno koristi u biologiji i medicini
(npr. antitijela), posebno u ćelijskoj biologiji zbog visoke
osjetljivosti i rezolucije uz neinvazivni način detekcije
-Mnoge komponente biljnih tkiva fluoresciraju kada se
osvijetle svjetlošću malih talasnih dužina, apsorbiraju
svjetlosnu energiju jedne talasne dužine i emituju je na
talasnim dužinama pomjerenim ka crvenom dijelu spektra.
Fluorescencija se sastoji iz dvije forme:
-Primarna – prirodna fluorescencija (autofluorescencija)
tkivnih jedinjenja i u nekim slučajevima je izuzetno slaba
-Sekundarna – postiže se bojenjem fluorescentnom bojom ili
fluorohromom i obično je jača.
Konfokalna mikroskopija

Principe konfokalne mikroskopije postavio je fizičar i

konstruktor Marvin Minski 1957. godine.

Pojam konfokalan (eng. Confocal) je složenica iz engleskog

termina CONjugated FOCAL plane.

Sredinom osamdesetih godina prošlog vijeka, kombinovanjem

usavršenih računara, lasera i optike, dolazi do konstruisanja
konfokalnih mikroskopskih sistema koji uprkos vrlo velikoj
cijeni postaju šire primjenjivani zahvaljujući svojim izuzetnim
karakteristikama.
 Konfokalna laserska pretražna mikroskopija
(confocal laser scanning microscopy, CLSM)

Konfokalna laserska pretražna

mikroskopija je metoda svjetlosne
mikroskopije pomoću koje je moguće
detektirati svjetlost emitiranu iz vrlo
tankog sloja u uzorku.

U biologiji i medicini od
posebnog je značaja
fluorescentna konfokalna
mikroskopija u kojoj se
detektira fluorescenca u
fiksiranom i obojenom uzorku,
te u živim tkivima i ćelijama.
Konfokalna laserska pretražna mikroskopija
(confocal laser scanning microscopy, CLSM)

Što se tiče optičkih principa, razlike između klasične

fluorescentne mikroskopije i konfokalne mikroskopije su
minimalne. Međutim, tehnička izvedba modernih
konfokalnih mikroskopa uvodi čitav niz značajnih novina u
odnosu na metodu ekscitacije, detekcije i interpretacije
mikroskopske slike.

Dok se u klasičnoj fluorescentnoj mikroskopiji, poznatoj i

pod nazivom mikroskopija širokog polja, izvor svjetlosti
koristi za istovremeno osvjetljavanje čitavog vidnog
polja, u pretražnoj mikroskopiji ono se osvjetljava tačku
po tačku.
Konfokalna laserska pretražna mikroskopija
(confocal laser scanning microscopy, CLSM)

U tu se svrhu pretežno koriste laserski izvori svjetlosti,

uglavnom plinski laseri, a u novije vrijeme i laserske diode.

Fokusirana laserska zraka prelazi preko uzorka tačku po

tačku i ondje pobuđuje fluorescentne molekule, fluorofore,
odakle i potiče termin ″pretražni″ u nazivu metode.

Kako je u svakom trenutku osvijetljena samo jedna tačka

uzorka, nikada nije moguće vidjeti realnu sliku čitavog
vidnog polja pomoću npr. okulara, kao u klasičnoj
mikroskopiji.
Slika se, bilježeći intenzitet emitirane svjetlosti tačku po
tačku pomoću odgovarajućeg detektora, može formirati tek
u memoriji kompjutera i biti prikazana na zaslonu.
Konfokalna laserska pretražna mikroskopija
3 1. laserski zrak, kao tačkasti
izvor kontrolisanog
svjetlosnog intenziteta, se
2

pomoću motorizovanih
1 optičkih elemenata fokusira u
bilo koju tačku vidnog polja
2. reflektovana svetlost ili
emitovana fluorescencija sa
uzorka usmjeravaju se ka
detektoru kroz minijaturni
otvor («pinhole») te se tako
propušta samo svjetlost koja
dolazi iz tačke fokusa
(«princip konfokalnosti»)
3. svjetlosni detektor
(fotomultiplikator) mjeri
intenzitet pristigle svjetlosti
 Konfokalna laserska pretražna mikroskopija
(confocal laser scanning microscopy, CLSM)

Dobijanje konfokalnih slika visoke rezolucije omogućeno je

zahvaljujuci primjeni lasera i analogno-digitalne konverzije koju
podržavaju savremeni računarski sistemi.

Laserski blok uređaja čine Argonski laser (sa nekoliko

spektralnih linija: 457nm, 478nm, 488nm i 514nm) i Helijum-
Neonski laser (543nm). Tako je omogućena ekscitacija
fluorohorma (fluorescentnih indikatora) koji apsorbuju svjetlost
u plavom i zelenom dijelu vidljivog spektra.

Dvokanalno registrovanje emitovanog svjetla je u opsegu od 475

nm preko zelenog i crvenog dijela vidljivog spektra do IC svetla.
Takođe upotrebom živine HBO-lampe moguće je dobiti signal sa
fluorohorma koji zahtijevaju UV ekscitaciju, kakav je DNK
marker, DAPI.
Konfokalna laserska pretražna mikroskopija
(confocal laser scanning microscopy, CLSM)
Nezrele DC
Cys C GM 130 rezultat 4.
Imunofluorescentna
kolokalizacija

Adherentne DC

Cys C GM 130 rezultat

Zrele DC

Cys C GM 130 rezultat

Kolokalizacija cistatina C sa GM 130

u nezrelim, adherentnim i zrelim DC.
Uzorci su označeni različitim
primarnim Ab:
anti-cistatin C 1A2 mAb (svi uzorci),
anti- GM 130 pAb (svi uzorci).
Sekundarna antitijela su označena
fluorescentnom bojom Alexa Fluor.
Nezrele DC

4.
Imunofluorescentna
Cys C LysoTracker rezultat

kolokalizacija

Adherentne DC

Cys C LysoTracker rezultat

Zrele DC

Cys C LysoTracker rezultat Kolokalizacija cistatina C sa

LysoTracker-om (crvena boja) u
nezrelim, adherentnim i zrelim
DC. Cistatin C je označen sa anti-
cistatin C 1A2 mAb (svi uzorci).
Sekundarno antitijelo, usmjereno
prema anti-cistatin C primarnom
antitijelu je označeno sa Alexa
Fluor 488.
Nezrele DC
4.
Imunofluorescentna
Cat X Cys C rezultat

kolokalizacija

Adherentne DC nakon 2h

Cat X Cys C rezultat

Adherentne DC nakon 5h Kolokalizacija cistatina C sa

katepsinom X u nezrelim i
Cat X Cys C adherentnim ćelijama nakon 2
rezultat
sata i nakon 5 sati.
Uzorci su označeni različitim
primarnim antitijelima:
anti-cistatin C 1A2 mAb (svi
uzorci)
anti-katepsin X 2F12 (svi uzorci).
Sekundarna antitijela su
označena fluorescentnom bojom
Alexa Fluor.
 Cat Xnakon 12h Cys C rezultat
Adherentne DC
4.
Imunofluorescentna
kolokalizacija
Adherentne DC
Cat Xnakon 18h Cys C rezultat

Adherentne DC
Cat X
nakon 24h Cys C rezultat

Kolokalizacija cistatina C sa
katepsinom X u adherentnim
ćelijama nakon 12 , 18 i 24 sata
od stimulacije diferencijacije
LPS-om i zrelim DC. Uzorci su
Zrele DC Cat X Cys C rezultat označeni različitim primarnim
antitijelima:
anti-cistatin C 1A2 mAb (svi
uzorci)
anti-katepsin X 2F12 (svi uzorci)
Sekundarna antitijela su
označena fluorescentnom bojom
Alexa Fluor.
Nezrele DC

4.
Cys C Cat L rezultat

Imunofluorescentna
kolokalizacija
Cys C Cat L

Adherentne DC
Cat L
Cys C rezultat

Kolokalizacija cistatina C sa
Zrele DC katepsinom L u nezrelim,
adherentnim i zrelim DC.
Cys C Cat L rezultat Uzorci su označeni različitim
primarnim antitijelima:
anti-cistatin C 1A2 mAb
(svi uzorci)
anti-katepsin L pAb
(svi uzorci).
Sekundarna antitijela su
označena fluorescentnom
bojom Alexa Fluor.
 4.
Nezrele DC

Imunofluorescentna
Cat X Cat L rezultat

kolokalizacija

Adherentne DC
Cat X Cat L

rezultat

Zrele DC
rezultat Kolokalizacija katepsina X sa
katepsinom L u nezrelim,
adherentnim i zrelim DC. Uzorci
Cat X Cat L su označeni različitim primarnim
antitijelima:
anti-katepsin X 2F12 (svi uzorci)
anti-katepsin L pAb (svi uzorci)
Sekundarna antitijela su
označena fluorescentnom bojom
Alexa Fluor.