MÔÛ ÑAÀU

Vieâm loeùt daï daøy taù traøng laø moät trong nhöõng vaán ñeà tieâu hoùa thöôøng
gaëp nhaát. Thoâng thöôøng, lôùp nieâm maïc beân trong cuûa daï daøy vaø ruoät non
ñöôïc bao phuû bôûi moät lôùp chaát nhaøy, do ñoù baûo veä nieâm maïc traùnh ñöôïc
söï taùc ñoäng cuûa acid dòch vò. Khi lôùp nhaøy bò suy yeáu, acid baét ñaàu taán
coâng nieâm maïc daï daøy vaø daãn ñeán caùc vieâm loeùt gaây ñau ñôùn, noùng
raùt ôû vuøng thöôïng vò. Ngaøy nay khoa hoïc ñaõ chöùng minh thuû phaïm chính
gaây ra tình traïng naøy laø do vi khuaån Helicobacter pylori. Vi khuaån naøy tieát ra
nhöõng ñoäc toá laøm phaù huûy lôùp nhaøy baûo veä nieâm maïc vaø gaây vieâm
loeùt [1, 2].

Phöông phaùp tieâu dieät vi khuaån H. pylori chuû yeáu laø söû duïng khaùng sinh, tuy
nhieân hieän nay ñaõ gaëp nhieàu thaát baïi bôûi vì H.pylori trôû neân khaùng vôùi
nhieàu loaïi khaùng sinh. Vì vaäy, vieäc nghieân cöùu söû duïng cheá phaåm sinh hoïc
probiotic vaø bacteriocin ñeå öùc cheá vi khuaån H.pylori ñang ñöôïc caùc nhaø khoa
hoïc quan taâm [20].

Probiotic laø nhöõng vi sinh vaät soáng maø khi ñöôïc tieâu thuï vôùi löôïng thích hôïp
seõ mang laïi nhöõng taùc ñoäng coù ích cho vaät chuû. Bacteriocin khaùc vôùi haàu
heát caùc khaùng sinh duøng trong y hoïc do chuùng laø caùc phaân töû protein neân
deã bò phaân huûy bôûi enzyme protease trong heä tieâu hoùa. Bacteriocin ñöôïc taïo
ra bôûi caùc loaøi Lactobacillus coù khaû naêng öùc cheá ñöôïc nhieàu loaïi vi khuaån
gaây beänh [13]. Tuy nhieân, cho ñeán nay chöa coù nhieàuù nghieân cöùu söû duïng
Lactobacillus sp hay bacteriocin töø Lactobacillus sp ñeå öùc cheá laïi H. pylori. Ñeà
taøi “Phaân laäp, tuyeån choïn vi khuaån Lactobacillus sp coù khaû naêng öùc
cheá vi khuaån Helicobacter pylori” nhaèm muïc tieâu phaân laäp, tuyeån choïn
doøng Lactobacillus sp. coù khaû naêng öùc cheá laïi vi khuaån H.pylori ñeå thöû
nghieäm taïo cheá phaåm sinh hoïc öùc cheá H.pylori gaây ra beänh daï daøy.

Noäi dung nghieân cöùu goàm:

- Phaân laäp vi khuaån Lactobacillus töø caùc nguoàn leân men ôû Vieät nam.
- Kieåm tra khaû naêng öùc cheá cuûa caùc chuûng Lactobacillus phaân laäp
ñöôïc vôùi H.pylori, choïn ra chuûng coù khaû naêng khaùng H.pylori cao nhaát
1
- Khaûo saùt moät soá hoaït tính probiotic cô baûn cuûa chuûng tuyeån choïn.
- Ñònh danh chuûng tuyeån choïn baèng phöông phaùp 16S rDNA.
- Thöû nghieäm taïo cheá phaåm probiotic cuûa chuûng tuyeån choïn vaø böôùc
ñaàu ñaùnh giaù ñoä oån ñònh cuûa cheá phaåm.

2
 CHÖÔNG 1

TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

1.1 Vi khuaån Helicobacter pylori

1.1.1 Ñaëc ñieåm vi khuaån H.pylori

H.pylori laø moät tröïc khuaån Gram aâm, hình cong hoaëc hình chöõ S, ñöôøng kính
töø 0.3- 1 µm, daøi 1.5-5 µm vôùi 4-6 loâng maûnh ôû moãi ñaàu, chính nhôø caùc
loâng naøy cuøng vôùi hình theå cuûa mình maø H.pylori coù theå chuyeån ñoäng
trong moâi tröôøng nhôùt. Ñieàu kieän lí töôûng cho vi khuaån phaùt trieån laø moâi
tröôøng coù 5 % O2, 10% CO2, 85% N2, nhieät ñoä töø 35-370C [3, 4].

Hình 1.1 – Vi khuaån H.pylori [13]

H. pylori thöôøng cö truù ôû trong lôùp nhaøy, taäp trung chuû yeáu ôû hang vò sau ñoù
laø thaân vò, khoâng thaáy H.pylori treân beà maët nieâm maïc ruoät vaø vuøng dò
saûn ruoät ôû daï daøy. H.pylori gaén choïn loïc vaøo moät vò trí ñaëc hieäu cuûa chaát
nhaøy vaø moät vò trí glycerolipidic cuûa maøng H.pylori saûn sinh ra moät löôïng lôùn
urease, lôùn hôn nhieàu so vôùi baát kyø moät loaïi vi khuaån naøo khaùc, vì theá ôû
daï daøy söï hieän dieän cuûa urease gaàn nhö ñoàng nghóa vôùi söï coù maët cuûa
H.pylori.

Nhieãm H.pylori thöôøng gaëp nhaát ôû ngöôøi, taàn suaát nhieãm H.pylori thay ñoåi
tuøy theo tuoåi, tình traïng kinh teá vaø chuûng toäc. Coù khoaûng hôn nöûa daân soá
treân theá giôùi bò nhieãm H.pylori, chuû yeáu ôû caùc nöôùc ñang phaùt trieån vôùi
taàn suaát raát cao töø 50-90% ôû löùa tuoåi lôùn hôn 20 vaø haàu heát treû em bò
nhieãm töø 2-8 tuoåi [5, 21]. Vieät nam cuõng thuoäc vuøng coù tyû leä nhieãm H.pylori
3
cao vaøo khoaûng hôn 70% ôû ngöôøi lôùn, ôû caùc nöôùc phaùt trieån tuoåi bò
nhieãm thöôøng lôùn hôn 50 tuoåi, chieám 50% daân soá [21].

H.pylori ñöôïc laây truyeàn qua nhieàu ñöôøng nhö mieäng-mieäng, phaân-mieäng. Ô
nhöõng nôi coù ñieàu kieän veä sinh keùm, nöôùc vaø thöùc aên bò nhieãm laø nguoàn
laây lan quan troïng ban ñaàu [5, 6, 21].

1.1.2 Cô cheá gaây beänh cuûa H. pylori

Vi khuaån H.pylori deã daøng di chuyeån qua lôùp nieâm dòch vaøo lôùp döôùi nieâm
maïc daï daøy ñeå toàn taïi trong moâi tröôøng acid cuûa dòch vò nhôø hoaït ñoäng
cuûa caùc tieâm mao vaø caáu truùc hình xoaén. Sau khi vaøo trong lôùp nhaøy daï
daøy. H.pylori baùm dính vaøo bieåu moâ tieát ra nhieàu men urease, phaân huûy
urea thaønh ammoniac trong daï daøy, gaây kieàm moâi tröôøng xung quanh, giuùp
H.pylori traùnh ñöôïc söï taán coâng cuûa acid –pepsin trong dòch vò. Maët khaùc, sau
khi baùm vaøo maøng teá baøo thoâng qua caùc thuï theå, H.pylori seõ tieát ra caùc
noäi ñoäc toá, gaây toån thöông tröïc tieáp caùc teá baøo bieåu moâ daï daøy, gaây
thoaùi hoùa, hoaïi töû, long troùc teá baøo taïo ñieàu kieän ñeå acid-pepsin thaám
vaøo tieâu huûy roài gaây loeùt [5, 7].
H.pylori gaây toån thöông nieâm maïc daï daøy seõ laøm giaûm tieát somatostatin,
löôïng somatostatin giaûm seõ gaây taêng gastrin maùu töø teá baøo G saûn xuaát ra,
maø chuû yeáu taêng gastrin-17, coøn gastrin-34 taêng khoâng ñaùng keå. Haäu quaû
treân laøm taêng teá baøo thaønh ôû thaân vò, taêng tieát HCL vaø keøm theo laø
taêng hoaït hoùa pepsinogen thaønh pepsin. Ñaây laø hai yeáu toá taán coâng chính
trong cô cheá beänh sinh cuûa loeùt daï daøy taù traøng.
H.pylori saûn xuaát ra nhieàu yeáu toá coù taùc duïng hoaït hoùa baïch caàu ña nhaân
trung tính, baïch caàu ñôn nhaân, ñaïi thöïc baøo, giaûi phoùng caùc yeáu toá trung
gian hoùa hoïc trong vieâm, giaûi phoùng ra yeáu toá hoaït hoùa tieåu caàu moät chaát
trung gian quan troïng trong vieâm, laøm cho bieåu moâ phuø neà hoaïi töû , bò acid –
pepsin aên moøn daãn ñeán loeùt. Cô theå bò nhieãm H.pylori, saûn xuaát ra khaùng
theå choáng laïi H.pylori. Caùc khaùng theå naøy laïi gaây phaûn öùng cheùo vôùi
caùc thaønh phaàn töông töï treân caùc teá baøo bieåu moâ daï daøy cuûa cô theå,
gaây toån thöông nieâm maïc daï daøy [5, 7].

4
H.pylori gaây vieâm loeùt daï daøy qua ba cô cheá: söï thay ñoåi sinh lí daï daøy,
nhieãm ñoäc tröïc tieáp töø caùc saûn phaåm cuûa vi khuaån, caùc phaûn öùng vieâm
vôùi söï giaûi phoùng nhieàu saûn phaåm phaûn öùng ñoäc toá khaùc nhau. Neáu
nhieãm truøng khoâng ñöôïc ñieàu trò thì sau 10 naêm seõ tieâu nieâm maïc daï daøy,
laøm taêng pH leân 6-8. Caùc tuyeán bò maát, vieâm teo nieâm maïc daï daøy vaø di
saûn ruoät, ñieàu naøy coù theå khôûi ñaàu cho giai ñoaïn aùc tính [2].

Hình 1.2- Sô ñoà cô cheá vieâm, loeùt daï daøy do H.pylori [2]
1.1.3. H. pylori khaùng khaùng sinh
- Khaùng khaùng sinh tieân phaùt cuûa H.pylori
Khaùng khaùng sinh tieân phaùt laø tình traïng treû em chöa dieät ñöôïc H.pylori tröôùc
ñoù, tình traïng khaùng khaùng sinh laø haäu quaû cuûa vieäc chæ ñònh ñieàu trò
khaùng sinh chöõa caùc beänh lyù khaùc cho beänh nhaân ví duï nhö duøng
clarithromycin trong ñieàu trò nhieãm khuaån hoâ haáp, levofloxacin trong ñieàu trò
nhieãm truøng ñöôøng tieåu vaø metronidazole trong ñieàu trò nhieãm truøng tieát
nieäu vaø sinh duïc. Trong nhöõng tröôøng hôïp naøy, khaùng sinh ñieàu trò ñôn lieäu

5
khoâng theå dieät ñöôïc H.pylori vaø gaây tình traïng ñeà khaùng cuûa H.pylori vôùi
khaùng sinh. Moät soá ít tröôøng hôïp ñöôïc truyeàn chuûng H.pylori khaùng thuoác
töø ngöôøi khaùc sang, ví duï H.pylori ñöôïc truyeàn töø boá meï sang [8].
- Khaùng khaùng sinh thöù phaùt cuûa H.pylori
Khaùng khaùng sinh thöù phaùt cuûa H.pylori laø tình traïng khaùng khaùng sinh cuûa
nhöõng chuûng H.pylori ôû nhöõng beänh nhaân ñaõ ñöôïc ñieàu trò dieät H.pylori
tröôùc ñoù [8]. Vieäc khaùng khaùng sinh ngaøy caøng gia taêng cuûa H.pylori daãn
ñeán söï thaát baïi trong ñieàu trò vaø ñieàu naøy daãn ñeán gaùnh naëng veà kinh
teá cho gia ñình beänh nhaân vaø xaõ hoäi.
1.1.4. Toång quan veà tình hình ñeà khaùng khaùng sinh cuûa H. pylori
Söï ñeà khaùng khaùng sinh cuûa H.pylori laø yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû
cuûa caùc phaùc ñoà ñieàu trò hieän duøng. Tæ leä löu haønh cuûa vi khuaån khaùng
thuoác thay ñoåi tuøy theo töøng vuøng ñòa lyù khaùc nhau vaø töông quan vôùi söï
söû duïng khaùng sinh trong daân soá chung. Ví du,ï söï tieâu thuï clarithromycin vaø
tæ leä ñeà khaùng khaùng sinh naøy taêng töông töï nhau (gaáp 4 laàn) ôû Nhaät
Baûn trong khoaûng thôøi gian töø 1993 ñeán 2000 [22]. Traùi laïi, söï söû duïng
macrolide thaän troïng ôû caùc nöôùc Baéc Aâu trong nhöõng thaäp nieân qua keát
hôïp vôùi moät tæ leä H.pylori khaùng clarithromycin thaáp hôn so vôùi caùc nöôùc
Nam Aâu, nôi maø clarithromycin ñöôïc söû duïng roäng raõi [22]. Taøi lieäu höôùng
daãn Chaâu Aâu hieän nay veà ñieàu trò H.pylori gôïi yù raèng trò lieäu ñaàu tay phaûi
ñöôïc ñieàu chænh cho thích hôïp vôùi söï ñeà khaùng clarithromycin vaø
metronidazole. Thaät vaäy, moät lieäu phaùp ba thuoác keùo daøi 14 ngaøy ñöôïc
khuyeân duøng ôû nhöõng nôi maø tæ leä khaùng clarithromycin lôùn hôn 15-20%, öu
tieân keát hôïp vôùi amocillin neáu tæ leä khaùng metronidazole tieân phaùt lôùn hôn
40% [22]. Treân cô sôû naøy, vieäc theo doõi tæ leä ñeà khaùng khaùng sinh toû ra
coù yù nghóa ñoái vôùi vieäc ñieàu trò nhieãm H.pylori trong thöïc haønh laâm saøng.
Döôùi ñaây laø moät soá toång hôïp döõ lieäu veà tình hình ñeà khaùng cuûa H.pylori
vôùi nhieàu khaùng sinh khaùc nhau ôû nhöõng nöôùc khaùc nhau treân theá giôùi.

6
 Baûng 1.1.Tæ leä ñeà khaùng khaùng sinh cuûa H.pylori ôû nhöõng khu
vöïc khaùc nhau treân theá giôùi

Khu vöïc Amoxycillin Clarithromycin Metronidazole Tetracyclin Levofloxacin Ña

khaùng
Chaâu Myõ 8/352 118/402 177/401 11/393 KSL 53/352
2,2% 29,3% 44,1% 2,7% 15%
Chaâu Phi 113/172 KSL 159/172 58/132 0/40 KSL
65,6% 92,4% 43,9% 0.0%
Chaâu AÙ 60/517 154/8139 192/517 11/456 106/908 21/252
11,6% 18,9% 37,1% 2,4% 11,6% 8,3%
Chaâu AÂu 3/599 352/3156 420/2459 14/599 148/614 204/2272
0,5% 11,1% 17% 2,1% 24,1% 8,9%
Tính chung 184/1640 2014/11697 948/3549 94/1580 254/1562 278/2876
11,2% 17,2% 26,7% 5,9% 16,2% 9,6%
[22]

1.2 Vi khuaån lactic vaø probiotic

1.2.1. Ñaëc ñieåm chung cuûa vi khuaån lactic

Vi khuaån lactic laø vi khuaån Gram döông, khoâng taïo baøo töû, kò khí tuøy yù vaø
haàu heát khoâng di ñoäng. Chuùng thuoäc loaïi ña khuyeát döôõng, ñöôïc tìm thaáy
trong nhieàu loaïi thöïc phaåm leân men nhö söõa chua, kim chi, döa muoái chua, nem
chua. LAB toàn taïi khaù haïn cheá trong moät soá moâi tröôøng do nhu caàu dinh
döôõng cao cuûa noù [9, 10, 24].

Veà maët hình thaùi, caùc nhoùm LAB toàn taïi chuû yeáu ôû hai daïng: hình que hoaëc
hình caàu, veà maët sinh lí, chuùng töông ñoái ñoàng nhaát: thu nhaän naêng löôïng
nhôø phaân giaûi carbohydrate vaø tieát ra acid lactic [10]. Khaùc vôùi caùc vi khuaån
ñöôøng ruoät sinh acid lactic, LAB laø nhoùm kò khí khoâng baét buoäc, chuùng
khoâng coù cytochrome vaø enzyme catalase. Tuy nhieân, chuùng vaãn coù theå sinh
tröôûng ñöôïc khi coù maët oxy do coù enzyme peroxidase [9, 10, 24].

Caùc loaïi vi khuaån lactic bao goàm 4 gioáng sau: Streptococcus, Leuconostoc,
Pediococcus, Lactobacilus.

7
 a b

Hình 1.3.Lactobacillus casei (a) vaø Lactobacillus bulgaricus (b) [10]

1.2.2. Quaù trình leân men lactic

Quaù trình leân men lactic laø quaù trình chuyeån hoùa kò khí ñöôøng vôùi söï tích luõy
acid lactic trong moâi tröôøng. coù theå toùm taét theo phöông trình sau:

Caùc loaøi LAB khaùc nhau veà cô cheá leân men glucose, caên cöù vaøo saûn phaåm
leân men LAB ñöôïc chia thaønh hai nhoùm

 Nhoùm vi khuaån leân men ñoàng hình: saûn phaåm taïo ra chuû yeáu
laø acid lactic
 Nhoùm vi khuaån leân men dò hình: saûn phaåm taïo ra ngoaøi acid lactic
coøn coù ethanol, CO2.....

Leân men lactic ñoàng hình

Caùc LAB leân men ñoàng hình phaân giaûi ñöôøng theo con ñöôøng EMP vaø cho
saûn phaåm chuû yeáu laø acid lactic (90-98%). Chæ moät phaàn nhoû pyruvate ñöôïc
decacboxyl hoùa vaø chuyeån thaønh acid acetic, ethanol, aceton vaø CO2. Möùc ñoä
taïo thaønh caùc saûn phaåm phuï thuoäc vaøo söï coù maët cuûa oxy.

8
Moät soá LAB leân men ñoàng hình thöôøng gaëp laø L. acidophilus, L. casei

Leân men lactic dò hình

Vi khuaån lactic leân men dò hình do thieáu 2 enzyme chuû yeáu cuûa con ñöôøng
EMP laø aldolase vaø triozophosphat- merisoase neân giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình
phaân giaûi glucose xaûy ra theo con ñöôøng pentose-phosphat. Quaù trình chuyeån
hoùa trizophosphat thaønh acid lactic gioáng nhö leân men ñoàng hình.

Saûn phaåm cuûa quaù trình leân men lactic dò hình ngoaøi acid lactic coøn coù caùc
saûn phaåm khaùc nhö acid succinic, ethanol, acid acetic vaø caùc chaát khí coøn laïi
[10, 24].

Moät soá LAB leân men dò hình thöôøng gaëp laø L. brevis, L.fementum… [9, 10].

1.2.3. Tieâu chuaån choïn chuûng vi khuaån lactic söû duïng laøm probiotic

Vi sinh vaät ñöôïc söû duïng trong haàu heát caùc cheá phaåm probiotic hieän nay chuû
yeáu laø LAB, do chuùng mang nhöõng ñaëc ñieåm öu vieät voán coù thích hôïp cho
vieäc taïo cheá phaåm probiotic. Tuy nhieân, khoâng phaûi baát kì LAB naøo cuõng
ñöôïc öùng duïng laøm probiotic. Nhöõng chuûng LAB ñöôïc choïn phaûi ñaûm baûo
caùc tieâu chuaån sau: tieâu chuaån veà an toaøn, tieâu chuaån veà ñaëc ñieåm vaø
chöùc naêng [11, 12].

Khía caïnh an toaøn cuûa probiotic bao goàm nhöõng ñieåm cuï theå sau:

 Coù ñònh danh chính xaùc.

 Nhöõng chuûng söû duïng cho ngöôøi toát nhaát laø coù nguoàn goác töø
ngöôøi.
 Ñöôïc phaân laäp töø ñöôøng tieâu hoùa cuûa ngöôøi khoûe maïnh.
 Ñöôïc chöùng minh laø khoâng coù khaû naêng gaây beänh.
9
  Khoâng lieân quan tôùi beänh taät.
 Khoâng gaây khöû lieân hôïp muoái maät.
 Ñaëc ñieåm di truyeàn oån ñònh.
 Ñeà khaùng ñöôïc khaùng sinh.

Leõ taát nhieân, tính an toaøn cuûa caùc chuûng probiotic laø ñieàu ñöôïc quan taâm
haøng ñaàu. Coù moät soá phöông thöùc giuùp tieán haønh ñaùnh giaù tính an toaøn
cuûa probiotic nhö nghieân cöùu treân caùc ñaëc tính cuûa chuùng probiotic, nghieân
cöùu veà döôïc ñoäng hoïc cuûa chuûng probiotic, nghieân cöùu caùc taùc ñoäng qua
laïi giöõa probiotic vaø vaät chuû. Caùc probiotic thöôøng thuoäc nhoùm vi sinh vaät
GRAS (Generally Regarded As Safe).

Baûng 1.2.Vi khuaån probiotic vaø tính an toaøn veà khaû naêng
laây nhieãm

Gioáng vi sinh Khaû naêng laây nhieãm

vaät
Lactobacillus Khoâng gaây beänh, ñoâi khi gaây nhieãm truøng cô
hoäi ôø caùc beänh nhaân suy giaûm mieãn dòch
(AIDS).
Lactococcus Khoâng gaây beänh.

Streptococus Gaây beänh cô hoäi, coù S.thermophilus ñöôïc söû

duïng trong caùc saûn phaåm söõa.

Bacillus Chæ coù Bacillus subtilis ñöôïc söû duïng laøm

probiotic.
Bifidobacterium Phaàn lôùn khoâng gaây beänh, moät soá gaây nhieãm
truøng ôû ngöôøi

[12]

Ñoái vôùi nhöõng vi sinh vaät ñöôïc söû duïng laøm probiotic (baûng 1.2) cho ngöôøi
ñeàu baét buoäc phaûi ñaït nhöõng yeâu caàu treân, song ñoái vôùi vaät nuoâi chuùng

10
ta coù theå giaûm bôùt ñi moät soá yeâu caàu, chuû yeáu laø tuøy thuoäc vaøo töøng
loaøi vaät nuoâi vaø tính an toaøn khi söû duïng noù [11, 12]ù.

Ñeå moät probiotic coù theå mang laïi nhöõng lôïi ích treân söùc khoûe con ngöôøi
chuùng phaûi coù nhöõng ñaëc ñieåm sau:

 Chuûng vi sinh vaät phaûi coù nhöõng ñaëc ñieåm phuø hôïp vôùi
coâng ngheä ñeå coù theå ñöa vaøo saûn xuaát, deã nuoâi caáy.
 Coù khaû naêng soáng vaø khoâng bò bieán ñoåi chöùc naêng khi ñöa
vaøo saûn phaåm, khoâng gaây caùc muøi vò khoù chòu cho saûn
phaåm.
 Caùc vi khuaån soáng phaûi ñi ñeán ñöôïc nôi taùc ñoäng cuûa
chuùng, ñeå toàn taïi ñöôïc chuùng phaûi coù hai ñaëc tính laø coù
khaû naêng dung naïp vôùi acid (chòu pH thaáp ôû daï daøy) vaø dòch
vò cuûa ngöôøi, ñoàng thôøi chuùng phaûi coù khaû naêng dung naïp
vôùi muoái maät (laø ñaëc tính raát quan troïng ñeå probiotic coù theå
soáng soùt ñöôïc khi ñi qua ruoät non). Beân caïnh ñoù, vi khuaån
phaûi coù khaû naêng baùm dính vaøo nieâm maïc ñöôøng tieâu hoùa
vaät chuû, khaû naêng baùm vaøo beà maët vaø sau ñoù laø phaùt
trieån trong ñöôøng tieâu hoùa ngöôøi ñöôïc xem laø ñieàu kieän tieân
quyeát quyeát ñònh chöùc naêng cuûa probiotic. Nhöõng vi khuaån
coù khaû naêng baùm dính vaøo beà maët ruoät seõ toàn taïi laâu hôn
vaø do ñoù coù ñieàu kieän ñeå bieåu hieän nhöõng taùc ñoäng ñieàu
hoøa mieãn dòch hôn laø nhöõng chuûng khoâng coù khaû naêng
baùm dính.
 Coù khaû naêng sinh caùc enzyme hoaëc caùc saûn phaåm cuoái
cuøng maø vaät chuû coù theå söû duïng, coù khaû naêng kích thích
mieãn dòch nhöng khoâng coù taùc ñoäng gaây vieâm.
 Coù khaû naêng caïnh tranh vôùi heä vi sinh vaät töï nhieân, coù hoaït
tính ñoái khaùng vôùi caùc vi sinh vaät gaây beänh, ñaëc bieät laø vi
sinh vaät gaây beänh ñöôøng ruoät.
 Saûn xuaát caùc chaát khaùng vi sinh vaät nhö bacteriocins, acid höõu
cô..
11
  Coù khaû naêng choáng ñoät bieán vaø caùc yeáu toá gaây ung thö.

1.2.4. Cô cheá khaùng khuaån cuûa vi khuaån lactic

Vi khuaån lactic laøm giaûm soá löôïng vi khuaån gaây beänh ñeå ngaên chaën caùc
maàm beänh baèng caùch tieát ra caùc chaát khaùng khuaån öùc cheá caû vi khuaån
Gram döông vaø Gram aâm. Ñoù laø caùc acid höõu cô nhö acid lactic, acid acetic vaø
ñaëc bieät laø bacteriocin nhoùm peptide hay protein ñöôïc toång hôïp nhôø ribosome
coù hoaït tính khaùng vi sinh vaät

Nhöõng hôïp chaát naøy coù theå laøm giaûm khoâng chæ nhöõng sinh vaät mang
maàm beänh maø coøn aûnh höôûng ñeán söï trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån vaø söï
taïo ra caùc ñoäc toá. Ñieàu naøy ñöôïc thöïc hieän baèng caùch giaûm pH khoang
ruoät thoâng qua söï taïo ra caùc acid beùo chuoãi ngaén deã bay hôi, chuû yeáu laø
acetate, propionate vaø butyrate, nhaát laø acid lactic.

Hình 1.4 Cô cheá khaùng khuaån cuûa bacteriocin [26]

Ñoái vôùi bacteriocin, cô cheá khaùng khuaån do vi khuaån lactic toång hôïp ñaõ ñöôïc
nghieân cöùu ñaàu tieân ôû nisin, bacteriocin Gram döông [26]. Döïa treân baûn chaát
12
cation vaø tính kò nöôùc, haàu heát caùc peptide hoaït ñoâng nhö maøng teá baøo
thaám. Bacteriocin coù khaû naêng tieâu dieät caùc vi khuaån khaùc do söï taïo thaønh
caùc keânh laøm thay ñoåi tính thaám cuûa maøng teá baøo, nhieàu loaïi bacteriocin
coøn coù khaû naêng phaân giaûi DNA, RNA vaø taán coâng vaøo lôùp peptidoglycan
ñeå laøm suy yeáu thaønh teá baøo [26]. Trong giaû thieát roäng cuûa kieåu hoaït
ñoäng cuûa bacteriocin, coù giaû thieát raèng söï töông taùc cuûa bacteriocin vôùi teá
baøo nhaïy caûm bao goàm 2 giai ñoaïn. Giai ñoaïn thöù nhaát töông öùng vôùi söï
huùt baùm vaät lyù cuûa phaân töû bacteriocin ñeå tieáp caän thuï quan beân ngoaøi
teá baøo vaø noù coù theå laø moät pha thuaän nghòch. Söï toån thöông sinh lyù hoïc
khoâng thöôøng xuyeân ñöôïc taïo ra vaø loaïi boû cuûa bacteriocin trong giai ñoaïn
naøy. Trong moät thôøi gian vöøa phaûi sau ñoù, giai ñoaïn 2 phaùt trieån maø thay
ñoåi beänh lyù khoâng thuaän nghòch bò aûnh höôûng qua toån thöông sinh hoùa ñaëc
tröng. Nhöõng nghieân cöùu veà colicins thaáy raèng colicinsù huùt thuï quan ñaëc
tröng treân voû beân ngoaøi cuûa sinh vaät.

Giai ñoaïn 1: söï huùt baùm vaät lyù ñeå tieáp caän vôùi thuï quan cuûa teá baøo. Quaù
trình thuaän nghòch khoâng thöôøng xuyeân gaây nguy hieåm sinh lyù teá baøo.

Giai ñoaïn 2: xuaát hieän nhöõng thay ñoåi khoâng thuaän nghòch daãn ñeán cheát teá
baøo.

Lactobacillus laø moät ví duï ñieån hình, ñöôïc öùng duïng laøm cheá phaåm probiotic
ñeå öùc cheá sinh tröôûng cuûa vi khuaån H.pylori vaø laøm giaûm hoaït tính cuûa
urease caàn thieát cho H.pylori ñeå soáng trong moâi tröôøng acid cuûa daï daøy [26].

1.2.5. Toång quan veà probiotic vaø ñaëc ñieåm vi sinh Lactobacillus trong cheá
phaåm probiotic

1.2.5.1. Toång quan veà probiotic

Naêm 1870, khi nghieân cöùu taïi sao nhöõng noâng daân Bungary coù söùc khoûe
toát, nhaø sinh hoïc ngöôøi Nga Eli Metchnikoff ñaõ ñöa ra thuaät ngöõ “probiotic” coù
nguoàn goác töø Hy Laïp, theo nghóa ñen laø “ vì cuoäc soáng” ñeå chæ nhöõng vi
sinh vaät ñaõ ñöôïc chöùng minh coù aûnh höôûng toát ñeán söùc khoûe cuûa ngöôøi
vaø ñoäng vaät [28].

13
Naêm 1925, Beach laø ngöôøi ñaàu tieân coù nhöõng nghieân cöùu thöïc nghieäm veà
thöùc aên coù chöùa “Lactobacillus acidophilus” [27, 28].

Khaùi nieäm naøy sau ñoù ñöôïc laøm roõ hôn bôûi Fuller (1989), Probiotic laø “moät
chaát boå trôï thöùc aên chöùa vi sinh vaät soáng coù aûnh höôûng coù lôïi ñeán vaät
chuû baèng vieäc caûi thieän söï caân baèng heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät cuûa noù”.

Moät ñònh nghóa khaùc veà probiotic laø “caùc vi sinh vaät soáng coù ích cho söùc
khoûe cuûa vaät chuû khi ñöôïc boå sung moät löôïng vöøa ñuû” [13]. Ñaây laø nhöõng
nhoùm vi khuaån soáng trong ñöôøng tieâu hoùa cuûa ngöôøi, chuùng taïo thaønh
moät khu heä vi sinh vaät, caûn trôï söï phaùt trieån cuûa moät soá vi sinh vaät gaây
beänh, cung caáp cho con ngöôøi moät soá chaát coù lôïi cho cô theå, aûnh höôûng
toát ñeán heä mieãn dòch. Con ngöôøi söû duïng caùc cheá phaåm probiotic nhö moät
loaøi thöïc phaåm, thuoác phoøng vaø chöõa beänh [13].

- Caùc vi sinh vaät probiotic thöôøng gaëp

Vi sinh vaät ñöôïc söû duïng laøm probiotic goàm nhieàu nhoùm khaùc nhau nhö vi
khuaån, xaï khuaån, naám men, naám moác. Tuy nhieân, vì nhöõng ñaëc tính öu vieät
cuûa vi khuaån lactic (LAB) phuø hôïp vôùi vieäc taïo cheá phaåm probiotic cho ngöôøi
cuõng nhö vaät nuoâi neân thaønh phaàn cuûa haàu heát caùc cheá phaåm probiotic
hieän nay chuû yeáu laø caùc chuûng LAB.

Vi sinh vaät probiotic khi ñöôïc boå sung vaøo cô theå qua ñöôøng tieâu hoùa, chuùng
taùc ñoäng thoâng qua moät soá cô cheá khaùc nhau. Tuy nhieân, ñeå coù theå taùc
ñoäng leân heä tieâu hoùa vaät chuû thì tröôùc heát chuùng phaûi coù khaû naêng
soáng soùt ôû ñieàu kieän khaéc nghieät trong ñöôøng tieâu hoùa, ñieån hình laø caùc
ñieàu kieän nhö:

 Chòu pH thaáp
 Chòu acid maät
 Chòu khaùng sinh
 Khaû naêng baùm dính vaøo teá baøo bieåu moâ ruoät
- Cô cheá hoaït ñoäng cuûa probiotic

14
Vi sinh vaät probiotic khi ñöôïc boå sung vaøo cô theå vaät chuû, chuùng taùc ñoäng
leân ñöôøng tieâu hoùa cuûa vaät chuû theo nhöõng cô cheá nhö caïnh tranh vaø ñoái
khaùng vôùi caùc vi khuaån gaây beänh, saûn sinh caùc chaát coù hoaït tính khaùng
khuaån, kích thích ñaùp öùng mieãn dòch cuûa cô theå vaät chuû [13].

Ngaên caûn söï phaùt trieån cuûa caùc vi khuaån gaây beänh baèng caùch sinh ra acid
lactic, acid beùo, peroxide vaø caùc khaùng sinh.

Taêng cöôøng tieâu hoùa thöùc aên: vi khuaån lactic saûn xuaát vitamin nhoùm B vaø
caùc enzyme phaân giaûi protein, lipid vaø chuyeån hoùa ñöôøng lactose trong söõa
thaønh acid lactic, ngaên ngöøa chöùng tieâu chaûy do khoâng dung naïp ñöôøng
lactose trong söõa.

Giaûm cholesterol: nhieàu keát quaû cho thaáy vi khuaån lactic coù taùc duïng laøm
giaûm cholesterol trong maùu. Gilliland vaø coäng söï (2007) thaáy raèng vi khuaån
lactic phaân laäp töø lôïn coù khaû naêng phaân huûy cholesterol trong moâi tröôøng
nuoâi caáy. Caùc baùo caùo cho thaáy noàng ñoä cholesterol trong maùu thaáp ôû
nhöõng con lôïn ñöôïc nuoâi baèng cholesterol coù boå sung caùc chuûng vi khuaån
lactic ñöôïc phaân laäp treân.

- ÖÙng duïng probiotic cho vieâm loeùt daï daøy

Phöông phaùp tieâu dieät vi khuaån H.pylori chuû yeáu laø söû duïng thuoác khaùng
sinh, tuy nhieân hieän nay ñaõ gaëp nhieàu thaát baïi. Sau nhieàu nghieân cöùu vaø
thöû nghieäm, caùc nhaø nghieân cöùu thaáy raèng uoáng probiotic coù theå giuùp
ngaên chaën caùc vi khuaån coù haïi gaây loeùt. Moät nghieân cöùu thöû nghieäm veà
hoaït ñoäng cuûa lôïi khuaån Bifidobacterium bifidum choáng laïi H.pylori thöïc hieän
treân chuoät ñaõ ñöôïc coâng boá trong öùng duïng vaø vi sinh moâi tröôøng. Keát
quaû thöû nghieäm cho thaáy, sau vaøi ngaøy, nhöõng con chuoät ñöôïc söû duïng lôïi
khuaån coù loeùt ít hôn so vôùi nhoùm ñoái chöùng. Ngöôøi ta giaûi thích keát quaû
naøy laø do khi ñöa probiotic vaøo trong heä thoáng tieâu hoùa, seõ caïnh tranh vôùi
H.pylori veà oxy vaø thöùc aên ñeå tieâu dieät chuùng. Caùc xeùt nghieäm boå sung
cuõng cho thaáy phöông phaùp ñieàu trò naøy ñaõ giaûm thieåu moät phaàn thöông
toån moâ daï daøy do nhieãm H.pylori vaø vi khuaån Bifidobacterium bifidum khoâng

15
gaây beänh hoaëc töû vong cho caû nhöõng con chuoät khoûe maïnh cuõng nhö
nhöõng con bò suy giaûm mieãn dòch.
Söû duïng khaùng sinh ñeå tieâu dieät H.pylori seõ khoâng theå loaïi boû ñöôïc hoaøn
toaøn vi khuaån naøy, tæ leä tieâu dieät cao nhaát chæ ñaït 75 ñeán 90%. Hieäu quaû
ñieàu trò cao hôn neáu phoái hôïp khaùng sinh vôùi probiotic. Probiotic seõ laøm giaûm
caùc taùc duïng phuï khi söû duïng khaùng sinh, taêng hieäu quaû cuûa phaùc ñoà söû
duïng khaùng sinh, haïn cheá khaû naêng baùm dính cuûa H.pylori vaøo teá baøo
bieåu moâ [15, 23].

1.2.5.2.Ñaëc ñieåm vi sinh Lactobacillus trong cheá phaåm probiotic

- Tính khaùng maät cuûa Lactobacillus

Dòch maät laø moät thaùch thöùc lôùn vôùi raát nhieàu vi sinh vaät ñöôïc ñöa vaøo
ñöôøng tieâu hoùa. Maät phaù huûy maøng teá baøo vi sinh vaät vaø tieâu dieät vi
khuaån. Caùc chuûng vi sinh Lactobacillus coù lôïi trong nghieân cöùu coù khaû naêng
thích öùng ñöôïc trong moâi tröôøng maät noàng ñoä leân tôùi 2%. Cheá phaåm
probiotic duøng moät soá chuûng Lactobacillus coù khaû naêng thích nghi vôùi dòch
maät toát nhaát.

- Khaû naêng khaùng khuaån cuûa Lactobacillus

Khaû naêng choáng laïi caùc vi khuaån coù haïi vôùi heä tieâu hoùa laø ñieåm quan
troïng nhaát trong caùc nghieân cöùu. Cheá phaåm sinh hoïc Lactobacillus coù lôïi cho
ñöôøng ruoät bôûi vì hoaït tính khaùng khuaån cuûa Lactobacillus toát, choáng laïi
nhöõng vi khuaån gaây haïi nghieâm troïng. Lactobacillus coù hoaït tính khaùng khuaån
cao, tuy nhieân laïi khoâng bieåu hieän tính khaùng laïi nhöõng vi khuaån coù lôïi hay vi
khuaån cuøng chuûng.

- Taïo ra bacteriocin vaø nhieàu chaát khaùng khuaån khaùc

Lactobacillus taïo ra caùc acid höõu cô nhö acid lactic, acid acetic laøm giaûm moâi
tröôøng pH trong ñöôøng ruoät, kích thích hoaït hoùa khaùng khuaån. Beân caïnh ñoù,
Lactobacillus cuõng taïo ra bacteriocin vaø nhieàu chaát khaùng khuaån khaùc nhö
H2O2, CO2..

16
 - Khaû naêng khaùng khaùng sinh

Lactobacillus qua nghieân cöùu coù khaû naêng khaùng khaùng sinh toát, khaùng sinh
khoâng laøm aûnh höôûng tôùi heä vi sinh Lactobacillus. Vi khuaån Lactobacillus giuùp
chöùc naêng tieâu hoùa ñöôïc duy trì, loaïi boû nguy cô roái loaïn tieâu hoùa, tieâu
chaûy do khaùng sinh ôû ngöôøi. Khaû naêng khaùng caùc loaïi khaùng sinh voâ hình
chung taïo neân moät heä mieãn dòch töï nhieân cho ñöôøng tieâu hoùa, baûo veä
ñöôøng ruoät khoûi caùc vi khuaån gaây beänh tieâu chaûy sinh tröôûng, nhaân roäng
do maát caân baèng vi sinh.

Giaûm cholesterol: nhieàu keát quaû cho thaáy vi khuaån lactic coù taùc duïng laøm
giaûm cholesterol trong maùu. Gilliland vaø coäng söï (2007) thaáy raèng vi khuaån
lactic phaân laäp töø lôïn coù khaû naêng phaân huûy cholesterol trong moâi tröôøng
nuoâi caáy. Caùc baùo caùo cho thaáy noàng ñoä cholesterol trong maùu thaáp ôû
nhöõng con lôïn ñöôïc nuoâi baèng cholesterol coù boå sung caùc chuûng vi khuaån
lactic ñöôïc phaân laäp treân [16].

1.3. Tình hình nghieân cöùu trong nöôùc vaø ngoaøi nöôùc

1.3.1. Tình hình nghieân cöùu ôû Vieätnam

Ôû Vieät nam ñaõ aùp duïng vieäc chaån ñoaùn vaø ñieàu trò nhieãm H.pylori töø hôn
20 naêm nay. Trong nhöõng ñaàu naêm 1990, moät soá nghieân cöùu ñieàu trò loeùt
daï daøy taù traøng vôùi phaùc ñoà OAM (Omeprazol, Amoxicillin, Metronidazol), OAC
(Omeprazol, Amoxicillin, Clarithromycin) 7-14 ngaøy, tæ leä tieät tröø coù theå ñaït lôùn
hôn 90%. Song gaàn ñaây, tæ leä dieät H.pylori giaûm ñaùng keå, moät soá nghieân
cöùu laøm khaùng sinh ñoà cho thaáy tình traïng khaùng khaùng sinh chuû yeáu ôû
Vieät Nam gia taêng, ñaëc bieät laø Levofloxacin 18.4%, khaùng Clarithromycin coù nôi
leân ñeán 30-38.5%, khaùng vôùi Metronidazol 59.8-91.8%. Amoxicillin, Tetracyclin
tröôùc kia khoâng khaùng thuoác ngaøy nay coù nôi ñaõ thaáy tæ leä khaùng 5.8-
55.9% [14]. Vì vaäy, tæ leä thaát baïi trong ñieàu trò baèng phaùc ñoà 3 chuaån
(Esomeprazole + Metronidazole+ Amocillin) cuõïng gia taêng. ÔÛû mieàn Baéc (Vieät
nam), phaùc ñoà boä ba tæ leä dieät tröø H.pylori laø 75.8%. Trong khi ôû mieàn Nam

17
(Vieät nam), phaùc ñoà boä ba tæ leä tieät tröø H.pylori giaûm thaáp dao ñoäng töø
66.1-68.5% [14].

Caùc phaùc ñoà ñieàu trò dieät H.pylori khaùc nhau taïo hieäu quaû ñieàu trò khaùc
nhau. Söï thaát baïi trong ñieàu trò coù theå laø do nhieãm H.pylori khaùng thuoác vaø
söï tuaân thuû ñieàu trò khoâng ñuùng ôû beänh nhaân. H.pylori khaùng thuoác ñoái
vôùi Metronidazole ôû Chaâu AÂu vaø Chaâu Myõ 20-40%, chaâu AÙ 30-60%, ñoái
vôùi Clarithromycin ôû chaâu AÂu vaø chaâu Myõ 4-22%, chaâu AÙ 5-13%. Do vaäy
vôùi tyû leä ñeà khaùng cao vôùi Clarithromycin vaø Metronidazole cho thaáy phaùc
ñoà boä ba chuaån khoâng ñöôïc choïn löïa nhö phaùc ñoà ñieàu trò ban ñaàu taïi Vieät
Nam. Vì vaäy, vieäc tìm ra phaùc ñoà ñieàu trò môùi ñeå thay theá phaùc ñoà boä ba
laø vaán ñeà caáp baùch hieän nay ôû Vieät Nam.

1.3.2. Tình hình nghieân cöùu treân theá giôùi

Ngaøy nay tæ leä dieät H.pylori cuûa caùc phaùc ñoà boä ba ôû möùc toaøn caàu ñaõ
giaûm xuoáng thaáp. Keát quaû nghieân cöùu nhöõng naêm gaàn ñaây treân theá giôùi
ñaõ khaúng ñònh vieäc khaùng thuoác vôùi Metronidazole vaø Clarithromycin aûnh
höôûng ñeán hieäu quaû tieät tröø H.pylori. caùc phaùc ñoà boä ba chuaån hieäu quaû
tieät tröø H.pylori giaûm thaáp nhoû hôn 80% [22]. Vì vaäy, phöông phaùp tieáp caän
ñieàu trò caàn môùi hôn nöõa nhaèm naâng cao hieäu quaû ñieàu trò. Trong nhöõng
naêm gaàn ñaây, moät soá taùc giaû treân theá giôùi ñaõ baùo caùo nhieàu löïa choïn
ñieàu trò khaùc, ñoù laø caùc phaùc ñoà tuaàn töï vaø phaùc ñoà tuaàn töï coäng
theâm probiotic nhaèm naâng cao hieäu quaû tieät tröø H.pylori.

Trong nhieàu nghieân cöùu treân theá giôùi gaàn ñaây ñaõ ñöa ra phaùc ñoà tuaàn töï,
töùc laø thay ñoåi khaùng sinh trong lieäu trình ñieàu trò vôùi muïc ñích taêng hieäu
quaû tieät tröø H.pylori vaø khaéc phuïc tình traïng ñeà khaùng Clarythromycin. Nhieàu
nghieân cöùu treân theá giôùi ñaõ cho thaáy raèng hieäu quaû phaùc ñoà tuaàn töï
dieät tröø H.pylori töø 80-93% [22].

Theo baùo caùo cuûa nghieân cöùu Maastricht III (2007), cheá phaåm sinh hoïc
probiotic cuõng coù theå ñoùng vai troø lieân quan trong vieäc ñieàu trò H.pylori baèng
caùch caûi thieän khaû naêng dung naïp ñieàu trò vaø taêng tæ leä tieät tröø H.pylori
[20, 22]. Thaät vaäy, moät soá nghieân cöùu Lactobacillus ñaõ ñöôïc chöùng minh,
18
Lactobacillus coù hoaït tính ñoái khaùng choáng laïi H.pylori [22]. Lactobacillus ñaõ
ñöôïc chöùng minh laøm giaûm taùc duïng phuï trong quaù trình ñieàu trò khaùng sinh
vaø taêng cöôøng dieät tröø H.pylori. Hôn nöõa moät soá nghieân cöùu boå sung
theâm raèng, Lactobacillus taùc duïng treân nieâm maïc daï daøy, öùc cheá söï keát
dính cuûa H.pylori leân doøng teá baøo bieåu moâ daï daøy vaø ngaên chaën H.pylori
hoaït ñoäng tieát urea [20]. Lactobacillus laø loaïi vi khuaån coù lôïi cö truù ôû ñöôøng
tieâu hoùa con ngöôøi vaø ñöôïc theâm vaøo thöïc phaåm vaø söõa. Lactobacillus ñaõ
cho thaáy taùc duïng ñaày höùa heïn trong ñieàu trò H.pylori [20],

Toùm laïi nhöõng nghieân cöùu treân cho thaáy, vieäc keát hôïp probiotic cuøng vôùi
khaùng sinh khoâng chæ ngaên chaën caùc taùc duïng phuï maø coøn gia taêng hieäu
quaû ñieàu trò ñoái vôùi H.pylori. Nhöõng nghieân cöùu veà probiotic öùc cheá H.pylori
ñaõ coù nhieàu nhöng cheá phaåm probiotic chuyeân bieät trong hoã trôï ñieàu trò
H.pylori vaãn chöa coù. Beân caïnh ñoù, nhöõng lôïi ích cuûa probiotic khoâng chæ
döøng laïi ôû ñoù, ngoaøi vieäc duy trì söùc khoûe tieâu hoùa, probiotic coù theå giuùp
ngaên ngöøa beänh tieåu ñöôøng, kieåm soaùt troïng löôïng, taêng cöôøng khaû naêng
mieãn dòch vaø ngaên ngöøa beänh ung thö [20, 22]. Vì vaäy nghieân cöùu naøy ñöôïc
thöïc hieän nhaèm choïn ra ñöôïc chuûng Lactobacillus coù khaû naêng khaùng ñöôïc
H.pylori maïnh nhaát, khaûo saùt moät soá hoaït tính cô baûn probiotic cuûa chuûng
tuyeån choïn, tieán haønh ñònh danh chuûng tuyeån choïn, böôùc ñaàu khaûo saùt vaø
ñaùnh giaù ñoä oån ñònh cuûa cheá phaåm baèng phöông phaùp saáy phun.

CHÖÔNG 2

VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU

2.1. Thôøi gian vaø ñòa ñieåm

Ñeà taøi ñöôïc thöïc hieän töø thaùng 12/2016 ñeán thaùng 12/2017.

19
 Caùc thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän ôû phoøng thí nghieäm Coâng ngheä sinh hoïc,
thuoäc boä moân Coâng ngheä sinh hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa Thaønh Phoá
Hoà Chí Minh.

2.2. Vaät lieäu vaø thieát bò söû duïng

2.2.1. Nguyeân lieäu

- Caùc maãu rau quaû leân men goàm caûi chua, kim chi, kim baép ñöôïc thu
thaäp töø caùc chôï vaø sieâu thò trong thaønh phoá HCM, maãu ñöôïc phaân
tích trong voøng 24 giôø, löu maãu ôû nhieät ñoä 5-80C sau khi mang veà
phoøng thí nghieäm.
- 10 chuûng vi khuaån lactic ñöôïc löu tröõ taïi boä moân Coâng Ngheä Sinh Hoïc
Ñaïi Hoïc Baùch Khoa Hoà Chí Minh, ñöôïc kyù hieäu töø L11-L20. Ñaây laø
nhöõng chuûng ñaõ ñöôïc saøng loïc ôû hoaït tính khaùng khuaån tröôùc ñaây.
- Chuûng vi khuaån Helicobacter pylori (PH9) ñöôïc phaân laäp töø döï aùn hôïp
taùc giöõa Vieät nam vaø Jica Nhaät Baûn töø naêm 2012-2016, ñöôïc löu tröõ
taïi vieän Pasteur. Chuûng PH9 khaùng clarithromycin.

2.1.2. Hoùa chaát vaø thieát bò söû duïng

- Cao naám men, cao thòt, tween 80 (Ñöùc).

- Glucose, pepton, MnSO4.4H2O, NaCl, NaOH, HCl (Trung Quoác).
- MgSO4.7H2O, KH2PO4, CH3COONa.3H2O.
- Agar (Trung Quoác).

Thieát bò: Noài haáp voâ truøng, tuû giöõ maãu, maùy li taâm thöôøng, kính hieån vi
OLYMPUS, maùy laéc vaø thieát bò duøng ñeå saáy phun miniB290, maùy ño kích
thöôùc haït HORIBA. Duïng cuï: oáng nghieäm, ñóa Petri, bình tam giaùc, que caáy,
pipet, ñaàu típ caùc loaïi…

2.3 Thieát keá thí nghieäm

Choïn nguoàn phaân laäp

Khaûo saùt caùc

Phaân laäp doøng vi khuaån Lactobacillus sp. ñaëc ñieåm sinh
20
hoïc
 Phöông phaùp nuoâi
Kieåm tra khaû naêng öùc cheá cuûa caáy ñoàng thôøi-
Lactobacillus sp. vôùi chuûng chæ thò traûi ñóa

Helicobacter pylori Khaûo saùt voøng

khaùng khuaån

Khaûo saùt caùc tyû leä cuûa chuûng vi khuaån Phöông phaùp nuoâi
tuyeån choïn vôùi Helicobacter.pylori caáy ñoàng thôøi -
traûi ñóa

Kieåm tra khaû naêng

Kieåm tra caùc hoaït tính probiotic cô baûn vaø chòu pH vaø muoái
maät
ñònh danh vi khuaån tuyeån choïn khaùng
Helicobacter pylori Ñònh danh baèng
phöông phaùp 16S
rDNA
Thöû nghieäm taïo cheá phaåm
Khaûo saùt aûnh
probiotic baèng phöông phaùp
höôûng cuûa löu löôïng
saáy phun saáy phun (4,5; 5; 5,5;
6; 6,5 ml/pht)
Khaûo saùt aûnh
höôûng cuûa nhieät ñoä
Cheá
saáy phun (90; 100;
phaåm 110; 120; 1300C)
Sô ñoà 2: Noäi dung thí nghieäm

Töø caùc nguoàn ñaõ choïn, tieán haønh pha loaõng caùc canh tröôøng, taùch loaïi
caùc chuûng vi sinh vaät rieâng reõ ra khoûi nhau baèng phöông phaùp daøn ñeàu
vaø caáy ria. Töø caùc nhoùm vi sinh vaät thuaàn khieát, laøm caùc böôùc phaân
loaïi baèng caùch khaûo saùt ñaëc tính hình thaùi nhôø vaøo hình thaùi khuaån laïc,
hình thaùi cuûa vi sinh vaät khi quan saùt döôùi kính hieån vi vaø nhuoäm Gram.
Tuyeån choïn chuûng vi khuaån Lactobacillus coù khaû naêng öùc cheá H.pylori
baèng phöông phaùp nuoâi caáy ñoàng thôøi, traûi ñóa ñeám khuaån laïc vaø
khaûo saùt voøng khaùng khuaån. Sau ñoù, khaûo saùt caùc tyû leä (1,2,3,4,5%)
cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn vôùi H.pylori baèng phöông phaùp nuoâi caáy
ñoàng thôøi-traûi ñóa. Tieán haønh thöû hoïat tính probiotic nhö khaû naêng chòu
pH vaø muoái maät cuûa chuûng tuyeån choïn coù khaû naêng khaùng H.pylori
maïnh nhaát. Tieán haønh ñònh danh chuûng tuyeån choïn baèng phöông phaùp
giaûi trình töï gen 16S rDNA.

21
Sau ñònh danh, böôùc ñaàu tieán haønh thöû nghieäm taïo cheá phaåm baèng
phöông phaùp saáy phun. Trong saáy phun, nhieät ñoä doøng khí ra laø moät
thoâng soá quan troïng, aûnh höôûng ñeán söï soáng soùt cuûa vi khuaån. Soá
löôïng vi khuaån ngaøy caøng giaûm daàn khi nhieät ñoä doøng khí vaøo, doøng khí
ra taêng leân vaø phun döôùi aùp suaát cao [15]. Do ñoù vieäc caûi thieän khaû
naêng toàn taïi cuûa vi khuaån raát quan troïng. Vì vaäy, vieäc khaûo saùt aûnh
höôûng cuûa löu löôïng doøng vaøo, aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä saáy phun vaø
ñoä aåm cuûa maãu saáy phun ñeán tyû leä soáng cuûa vi khuaån ñöôïc thöïc
hieän.

2.4 .Phöông phaùp

2.4.1. Thu thaäp maãu vaø phaân laäp vi khuaån Lactobacillus

Moät soá maãu thöïc phaåm leân men nhö kim chi, caûi chua, caø phaùo… ñöôïc
thu thaäp töø moät soá chôï vaø sieâu thò trong thaønh phoá Hoà Chí Minh (xem
phuï luïc). Maãu ñöôïc tieàn taêng sinh trong 10 ml moâi tröôøng MRS loûng qua
ñeâm ôû 370C tröôùc khi phaân laäp. Quaù trình phaân laäp ñöôïc thöïc hieän baèng
caùch pha loaõng thaäp phaân ñeán 10 -7, traûi leân moâi tröôøng MRS thaïch vaø
uû ôû 370C trong thôøi gian töø 24 ñeán 48 giôø. Sau ñoù laøm thuaàn nhieàu laàn
vaø thöïc hieän moät soá thöû nghieäm sinh hoùa ñaëc tröng cuûa Lactobacillus.
Choïn nhöõng chuûng coù hình que, Gram döông, catalase aâm tính, vi hieáu khí,
khoâng di ñoäng, gioáng ñöôïc giöõ laïnh 40C treân oáng nghieäm thaïch nghieâng.

2.4.2. Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm sinh hoïc

2.4.2.1. Quan saùt ñaïi theå

Caáy traûi chuûng vi khuaån lactic leân moâi tröôøng thaïch ñóa, nuoâi uû ôû nhieät
ñoä 370C trong 24h. quan saùt hình thaùi, maøu saéc, kích thöôùc khuaån laïc.

2.4.2.2. Quan saùt vi theå

Quan saùt vi theå baèng caùch tieán haønh nhuoäm Gram ñeå quan saùt hình
daïng teá baøo, xaùc ñònh vi khuaån laø Gram döông hay Gram aâm.

22
 Phöông phaùp nhuoäm Gram do nhaø vi khuaån hoïc Ñan Maïch Hans Christan
Gram (1853-1938) phaùt minh ra töø naêm 1884. Nhôø phöông phaùp naøy ngöôøi
ta phaân bieät ra 2 nhoùm vi khuaån ñoù laø: vi khuaån Gram döông vaø Gram
aâm. Nhuoäm Gram khoâng nhöõng giuùp phaân bieät ñöôïc vi khuaån nhôø caùc
ñaëc ñieåm hình thaùi vaø söï saép xeáp cuûa teá baøo maø coøn cung caáp
thoâng tin veà lôùp voû teá baøo. Khi nhuoäm theo phöông phaùp naøy, teá baøo vi
khuaån Gram (+) coù lôùp voû teá baøo daøy taïo bôûi peptidoglycan seõ coù maøu
tím, coøn vi khuaån Gram (-) coù lôùp voû teá baøo moûng hôn do coù ít
peptidoglycan hôn vaø ñöôïc bao boïc bôûi moät maøng moûng seõ coù maøu
hoàng.

Tieán haønh:

 Chuaån bò veát boâi: duøng que caáy voâ truøng laáy moät ít vi khuaån töø
thaïch (sau khi caáy 24h) hoøa vaøo moät gioït nöôùc caát ôû giöõa phieán kính,
laøm khoâ trong khoâng khí.
 Coá ñònh teá baøo baèng caùch hô nhanh veát boâi treân ngoïn löûa ñeøn coàn
2-3 laàn.
 Nhuoäm baèng dung dòch tím keát tinh trong 1 phuùt, röûa nöôùc, thaám khoâ.
 Nhoû boå sung lugol leân veát boâi trong 1 phuùt, röûa nöôùc, thaám khoâ.
 Röûa baèng coàn 30 giaây, tieáp theo röûa laïi baèng nöôùc.
 Nhuoäm boå sung fuchsin kieàm 10-30 giaây, röûa laïi baèng nöôùc. Ñeå khoâ
vaøsoi vôùi vaät kính daàu x100.
 Ghi nhaän khaû naêng baét maøu Gram cuûa vi khuaån [6].

2.4.3. Phöông phaùp nhaân gioáng H.pylori, Lactobacillus vaø döïng ñöôøng cong
sinh tröôûng cuûa H.pylori

2.4.3.1. Phöông phaùp nhaân gioáng H.pylori vaø Lactobacillus

Phöông phaùp nhaân gioáng Lactobacillus

Phaân phoái moâi tröôøng MRS loûng vaøo caùc bình noùn, moãi bình 50 ml moâi
tröôøng, nuùt boâng kín vaø tieät truøng trong noài haáp ôû 115 0C trong 20 phuùt, ñeå
nguoäi.Trong tuû caáy voâ truøng, tieán haønh caáy 1 oáng gioáng loûng cuûa 1ml

23
cuûa Lactobacillus vaøo moãi bình noùn. Sau ñoù nuoâi trong tuû caáy ôû 370C trong
24 giôø.

Phöông phaùp nhaân gioáng H.pylory

Phaân phoái moâi tröôøng pylori agar loûng vaøo caùc bình noùn, moãi bình 50 ml
moâi tröôøng, nuùt boâng kín vaø tieät truøng trong noài haáp ôû 1150C trong 20 phuùt,
ñeå nguoäi. Trong tuû caáy voâ truøng, tieán haønh caáy 1 oáng gioáng loûng 1ml cuûa
H.pylori vaøo moãi bình noùn. Nuoâi trong tuû caáy ôû ñieàu kieän kî khí ôû 37 0C trong
72 giôø.

2.4.3.2. Xaây döïng ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa H.pylori

Laáy 1000 ml moâi tröôøng pylori agar loûng, sau ñoù chænh pH ñeán 7.2, ñem ñi khöû
truøng ôû 1210C trong 15 phuùt. Sau ñoù caáy gioáng 3% vaø ñem ñi uû ôû tuû caáy
trong ñieàu kieän kî khí ôû 370C. Tieán haønh nhaân gioáng caáp 1, sau ñoù caáy traûi
gioáng treân moâi tröôøng thaïch ñóa, phuû phía treân moät lôùp pylori agar vì H.pylori
phaùt trieån ôû ñieàu kieän kî khí vaø ñem uû ôû ñieàu kieän kî khí ñeå xaùc ñònh maät
ñoä teá baøo trong dung dòch ban ñaàu. Tieán haønh nhaân gioáng trong 120h vaø
cöù sau 24h laáy maãu ñeå xaùc ñònh maät ñoä teá baøo.

2.4.4. Phöông phaùp khaûo saùt khaû naêng khaùng H.pylori

2.4.4.1. Phöông phaùp nuoâi caáy ñoàng thôøi treân moâi tröôøng loûng

Coù raát nhieàu nghieân cöùu veà caùc phöông phaùp trong vieäc kieåm tra khaû
naêng khaùng vi sinh vaät cuûa vi khuaån probiotic. Tuy nhieân, taát caû ñeàu döïa
treân khaû naêng sinh khaùng sinh hay caùc chaát caïnh tranh ñeå ngaên chaën söï
phaùt trieån cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh.

Ôû thí nghieäm naøy, phöông phaùp ñöôïc söû duïng laø phöông phaùp nuoâi caáy
ñoàng thôøi, traûi ñóa ñeám khuaån laïc ñöôïc duøng ñeå tính tyû leä phaàn traêm öùc
cheá cuûa caùc chuûng vi khuaån lactic vôùi H.pylori.

Ñeå tính toaùn ñöôïc phaàn traêm öùc cheá cuûa caùc chuûng vi khuaån lactic vôùi
H.pylori ôû tæ leä 3%ä; tröôùc tieân, caàn phaûi xaùc ñònh ñöôïc maät ñoä sinh khoái
teá baøo vi khuaån H.pylori trong 1ml dòch moâi tröôøng nuoâi caáy ban ñaàu. Tieán
24
haønh pha loaõng noàng ñoä sinh khoái ñeán 10 6 vaø tieán haønh traûi ñóa ñeám
khuaån laïc, tính toaùn ñöôïc maät ñoä teá baøo dòch nuoâi vi khuaån H.pylori ban
ñaàu (oáng ñoái chöùng). Sau ñoù tieán haønh töông töï ñeå tìm ra ñöôïc chính xaùc
soá teá baøo vi khuaån H.pylori ôû tæ leä 3% maät ñoä cuûa caùc chuûng vi khuaån
lactic ñoái vôùi H.pylori.

Tính tæ leä soáng soùt baèng caùch laáy maät ñoä teá baøo H.pylori (CFU/mL) ôû tæ
leä 3% maät ñoä cuûa caùc chuûng vi khuaån lactic ñoái vôùi H.pylori chia cho maät
ñoä teá baøo cuûa H.pylori ôû oáng ñoái chöùng.

Tæ leä phaàn traêm öùc cheá tính theo coâng thöùc (100-x)% trong ñoù x laø tæ leä %
soáng soùt cuûa H.pylori.

2.4.4.2. Phöông phaùp khueách taùn gieáng thaïch

Chuaån bò dòch huyeàn phuø cuûa vi khuaån H.pylori ñaõ ñöôïc nuoâi caáy trong 72h,
roài tieán haønh ñoã ñóa (lôùp treân cuøng laø lôùp pylori- agar). Nhöõng gieáng nhoû
coù ñöôøng kính 6mm ñöôïc taïo ra treân maët moâi tröôøng baèng thanh ñuïc loã kim
loaïi voâ truøng.

Chuaån bò dòch huyeàn phuø cuûa chuûng vi khuaån lactic tuyeån choïn ñaõ ñöôïc
nuoâi caáy trong 24h, laáy 80µl dòch huyeàn phuø cuûa vi khuaån tuyeån choïn nhoû
vaøo moãi gieáng cuûa ñóa thaïch ñaõ chöùa H.pylori. Tieán haønh uû maãu ôû 40C
trong 15 phuùt cho dung dòch trong gieáng khueách taùn. Sau ñoù, ñem ñóa ñi uû ôû
370C trong voøng 72h ôû ñieàu kieän kî khí ñeå vi khuaån H.pylori phaùt trieån.

Hoaït tính khaùng khuaån cuûa chuûng vi khuaån lactic tuyeån choïn ñöôïc tính baèng
ñöôøng kính voøng voâ khuaån quanh khuaån laïc hay quanh mieäng gieáng treân ñóa.
Tính khaùng khuaån ñöôïc bieåu hieän khi xuaát hieän ñöôøng kính voøng voâ khuaån.
Maãu ñoái chöùng laø moâi tröôøng pylori loûng ñöôïc thöïc hieän song song.

2.4.5. Khaûo saùt caùc tyû leä % cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn vôùi
H.pylori

Sau khi choïn ra ñöôïc chuûng vi khuaån lactic tuyeån choïn coù khaû naêng khaùng
H.pylori cao nhaát, tieán haønh khaûo saùt khaû naêng öùc cheá cuûa chuûng vi

25
khuaån lactic tuyeån choïn vôùi caùc tyû leä 1%, 2%, 3%, 4%, 5% cuûa vi khuaån lactic
tuyeån choïn ñoái vôùi H.pylori. Baèng phöông phaùp nuoâi caáy-traûi ñóa ñoàng thôøi
vaø phöông phaùp xaùc ñònh phaàn traêm öùc cheá ñöôïc ñeà caäp ôû 2.4.4.1 ta tính
ñöôïc tyû leä % öùc cheá cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñoái vôùi H.pylori. Keát
quaû, chuùng toâi xaùc ñònh ñöôïc tyû leä % toái öu cuûa chuûng vi khuaån tuyeån
choïn ñoái vôùi H.pylori.

2.4.6. Phöông phaùp khaûo saùt hoaït tính probiotic cô baûn vaø ñònh danh
chuûng vi khuaån tuyeån choïn

2.4.6.1. Kieåm tra khaû naêng chòu acid vaø muoái maät

a. Kieåm tra khaû naêng chòu acid cuûa vi khuaån tuyeån choïn

Phöông phaùp naøy khaûo saùt maät ñoä teá baøo vi khuaån tuyeån choïn ôû caùc
noàng ñoä pH khaùc nhau laø 2,3,4,5, 6 ñeå so saùnh khaû naêng soáng soùt cuûa
chuùng.

Tieán haønh:

- Moâi tröôøng MRS ñaõ chænh pH (9ml/oáng nghieäm)

- Boå sung 1 ml dòch MRS nuoâi caáy vi khuaån tuyeån choïn
- Ñem ñi uû ôû 370C trong voøng 24 giôø
- Sau ñoù tieán haønh pha loaõng ñeán 10 6 vaø traûi ñóa ñeå kieåm tra maät ñoä
teá baøo
- Xaùc ñònh phaàn traêm khaû naêng soáng soùt cuûa teá baøo vi khuaån tuyeån
choïn theo coâng thöùc (A1/A0)*100 trong ñoù A1 laø maät ñoä teá baøo chuûng
vi khuaån tuyeån choïn ôû caùc giaù trò pH khaùc nhau, A0 laø maät ñoä teá
baøo ôû ñieàu kieän pH 6 [16].

b. Kieåm tra khaû naêng chòu muoái maät cuûa vi khuaån tuyeån choïn vôùi 4 chuûng
vi khuaån coøn laïi

. Tieán haønh:

- Moâi tröôøng MRS ñaõ boå sung 0.3% muoái maät (9ml/oáng nghieäm) ñöa veà
pH 3 cuûa keát quaû a maø tyû leä vi khuaån soáng töông ñoái cao.
26
 - Boå sung 1 ml dòch MRS nuoâi caáy cuûa chuûng vi khuaån vi khuaån tuyeån
choïn
- Ñem ñi uû ôû 370C trong voøng 24 giôø
- OÂáng ñoái chöùng khoâng boå sung muoái maät vaø cuõng ñöôïc thöïc hieän
nhö theá
- Sau ñoù tieán haønh pha loaõng ñeán 10 6 vaø traûi ñóa ñeå kieåm tra maät ñoä
teá baøo
- Xaùc ñònh phaàn traêm khaû naêng soáng soùt cuûa teá baøo vi khuaån tuyeån
choïn theo coâng thöùc (A1/A0)*100 trong ñoù A1 laø maät ñoä teá baøo vi
khuaån ôû moâi tröôøng coù boå sung muoái maät. A 0 laø maät ñoä teá baøo vi
khuaån ôû moâi tröôøng khoâng coù boå sung muoái maät.

2.4.6.2. Phöông phaùp ñònh danh vi khuaån

Ñònh danh baèng phöông phaùp sinh hoïc phaân töû 16S rDNA ôû coâng ty Nam
Khoa

Vi khuaån moïc treân hoäp thaïch phaân laäp ñöôïc gaët vaøo nöôùc muoái sinh lyù
voâ khuaån ñeå ñaït ñoä ñuïc 0.5-1 McF. Sau ñoù ñun caùch thuûy soâi trong 10
phuùt. Ñeå nguoäi roài ly taâm 13000 RPM trong 5 phuùt. Laáy 5µL dòch noåi cho
vaøo PCR mix 45 µL chöùa saün caùc thaønh phaàn keå caû caëp moài NK16s-F

vaø NK16s-R khueách ñaïi ñoaïn DNA daøi 527 bps chöùa trình töï ñaëc hieäu loaøi
treân gen 16S cuûa vi khuaån. Chaïy chöông trình nhieät PCR goàm 1 chu kyø
950C/5 phuùt ñeå kích hoaït enzyme hot start Taq polymerase, roài 40 chu kyø
940C/15 phuùt-600C/30 phuùt-720C/1 phuùt. Saûn phaåm PCR sau ñoù ñöôïc tinh
saïch baèng boä “Wizard SV Gel and PCR clean-up System” cuûa Promega. Saûn
phaåm tinh saïch ñöôïc ñieän di treân thaïch vaø sau ñoù ñònh löôïng baèng quang
phoå GenQuant cuûa Pharmacia, sau ñoù ñöôïc ñöa vaøo phaûn öùng giaûi trình töï
2 chieàu söû duïng moài xuoâi vaø moài ngöôïc cuûa PCR thöïc hieän treân boä
thuoác thöû “DTCS cycle sequencing kit” cuûa Beckman Coulter. Chöông trình luaân
nhieät cuûa phaûn öùng giaûi trình töï vôùi boä thuoác thöû treân laø 30 chu kyø
960C/20 phuùt-500C/20 phuùt-600C/4 phuùt. Saûn phaåm cuûa phaûn öùng giaûi
trình töï ñöôïc keát tuûa baèng ethanol, roài sau ñoù ñöôïc chaïy ñieän di giaûi trình
töï treân maùy giaûi trình töï CEQ8000. Keát quaû giaûi trình töï ñöôïc so chuoãi
27
baèng chöông chöông trình blast search treân ngaân haøng döõ lieäu gen cuûa
NCBI. Töø keát quaû so chuoãi, chuùng ta seõ coù ñöôïc keát quaû ñònh danh vi
khuaån.

2.4.7. Xaùc ñònh soá löôïng teá baøo baèng caùch ñeám soá löôïng caùc
khuaån laïc moïc treân moâi tröôøng thaïch

Nguyeân taéc:

 Caáy moät theå tích xaùc ñònh dòch huyeàn phuø cuûa chuûng caàn
nghieân cöùu leân moâi tröôøng ñaëc tröng trong ñóa petri.
 Xaùc ñònh soá löôïng teá baøo baèng caùch ñeám soá khuaån laïc moïc leân
sau thôøi gian nuoâi caáy, vì moãi khuaån laïc laø keát quaû cuûa söï phaùt
trieån cuûa moät teá baøo.

Caùch tieán haønh:

 Pha loaõng dòch nuoâi caáy H.pylori vôùi caùc noàng ñoä khaùc nhau
baèng nöôùc caát voâ truøng.
 Duøng pipet voâ truøng huùt 0,1 ml maãu, nhoû vaøo ñóa petri coù chöùa
moâi tröôøng pylori agar chuyeân bieät.
 Duøng que gaït voâ truøng daøn ñeàu khaép maët thaïch ñeå taùch
rieâng reõ töøng teá baøo.
 Sau ñoù phuû moät lôùp pylori agar chuyeân bieät leân vì H.pylori phaùt
trieån ôû ñieàu kieän kî khí.
 Moãi maãu caáy 3 noàng ñoä lieân tieáp. Moãi ñoä pha loaõng caáy 3 ñóa
petri vaø laáy keát quaû trung bình coäng cuûa 3 laàn ñeám.
 Ñaët caùc ñóa thaïch vaøo tuû caáy ôû ñieàu kieän kî khí coù nhieät ñoä
thích hôïp 370C.
 Sau 3 ngaøy, ñeám soá löôïng khuaån laïc treân moãi ñóa. Töø ñoù tính
soá löông teá baøo H.pylori.
Coâng thöùc tính soá löôïng teá baøo:
Mi (CFU/ml)=Ai*Di/V
Ai laø soá khuaån laïc trung bình/ñóa

28
 Di laø ñoä pha loaõng
V laø dung tích huyeàn phuø teá baøo cho vaøo moãi ñóa (ml)

2.4.8. Thöû nghieäm taïo cheá phaåm Lactobacillus plantarum baèng phöông
phaùp saáy phun Nguyeân taéc:

Saáy phun laø phöông phaùp chuyeån saûn phaåm töø daïng loûng thaønh daïng
boät. Vaät lieäu loûng ñöôïc bôm ñeán moät bình phun vaø ñöôïc phun vôùi toác
ñoä cao vaøo trong buoàng chaân khoâng. Nhieät ñoä khoâng khí xung quanh ñöôïc
loïc, laøm noùng vaø ñöôïc phaân taùn trong buoàng chaân khoâng. Khoâng khí
noùng laøm nöôùc bay hôi vaø boät ñöôïc taïo thaønh. Khoâng khí beân trong
buoàng coù theå ñaït 2000C.

2.4.8.1. Xaùc ñònh ñoä aåm cuûa maãu saáy phun:

Nguyeân taéc: duøng nhieät laøm bay hôi heát nöôùc trong maãu. Caân troïng
löôïng maãu tröôùc vaø sau khi saáy khoâ, töø ñoù tính ñöôïc phaàn traêm nöôùc
coù trong maãu.

Caùch tieán haønh:

- Caân 10 g maãu.
- Saáy ôû nhieät ñoä 1050C ñeán troïng löôïng khoâng ñoåi.
- Caân troïng löôïng maãu sau saáy, suy ra ñoä aåm cuûa maãu.
(𝐺1−𝐺2)×100
%ñoä aåm = 𝐺1−𝐺

G: troïng löôïng coác söù.

G1: troïng löôïng coác söù+ maãu tröôùc khi saáy.

G2: troïng löôïng coác söù+ maãu sau khi saáy.

2.4.8.2. AÛnh höôûng cuûa löu löôïng doøng vaøo cuûa dòch huyeàn phuø ñeán tæ
leä soáng cuûa vi khuaån L.plantarum

Muïc ñích: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa löu löôïng doøng vaøo cuûa dòch huyeàn
phuø ñeán tæ leä soáng cuûa vi khuaån.

29
Tieán haønh thí nghieäm

Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa löu löôïng doøng vaøo, tieán haønh ñieàu chænh löu
löôïng khi saáy phun: 4,5 ml/phuùt; 5 ml/phuùt, 5,5 ml/phuùt, 6 ml/phuùt, vaät lieäu vi
goùi laø whey protein isolate (WPI) vôùi tæ leä 5%, nhieät ñoä saáy phun ñaàu vaøo
laø 1000C, nhieät ñoä ñaàu ra coá ñònh laø 450C. thí nghieäm ñöôïc boá trí vôùi 5
nghieäm thöùc vaø 3 laàn laëp laïi. Tieán haønh khaûo saùt vaø ñaùnh giaù soá teá
baøo soáng cuûa L.plantarum trong cheá phaåm sau saáy phun.

- Cho 1g cheá phaåm saáy phun ngaâm trong 9 ml dung dòch ñeäm phosphate
pH 7.
- Pha loaõng dung dòch maãu, traûi ñóa treân moâi tröôøng MRS agar vaø uû
ôû nhieät ñoä 370C trong 72 giôø.
- Chæ tieâu theo doõi: maät ñoä L.plantarum (log CFU/g).

2.4.8.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä saáy phun ñaàu vaøo vaø nhieät ñoä ñaàu ra
laø 450C ñeán tæ leä soáng cuûa vi khuaån L.plantarum

Vi khuaån lactic raát nhaïy caûm vôùi nhieät ñoä, ñaëc bieät laø khi nhieät ñoä lôùn
hôn 450C. Vì vaäy nhieät ñoä saáy caøng thaáp thì cho khaû naêng soáng caøng
cao. Nhieät ñoä saáy cao gaây bieán tính protein, oxy hoùa caùc chaát beùo, taùc
ñoäng xaáu ñeán khoâng baøo, ribosome, gaây keát tuï phaân töû DNA hoaëc gaây
ra caùc toån thöông khoù hoài phuïc cho teá baøo. Vì vaäy, tieán haønh khaûo saùt
aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä saáy phun ñeán tæ leä soáng cuûa L.plantarum.

Tieán haønh thí nghieäm:

Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä saáy phun: tieán haønh khaûo saùt caùc
nhieät ñoä saáy phun, ñieàu chænh ôû caùc nhieät ñoä ñaàu vaøo nhö sau: 90 0C,
1000C, 1100C, 1200C, 1300C. Nhieät ñoä ñaàu ra seõ ñöôïc thieát bò saáy phun
ñieàu chænh töông öùng vôùi nhieät ñoä ñaàu ra ñaõ choïn (450C), vaät lieäu vi goùi
laø whey protein isolate vôùi tæ leä laø 5%, löu löôïng doøng 5 ml/phuùt. Nhieät ñoä
ñaàu ra coá ñònh laø 450C, choïn ra nhieät ñoä toái öu nhaát. Thí nghieäm ñöôïc
boá trí vôùi 5 nghieäm thöùc vaø 3 laàn laëp laïi.

30
 Tieán haønh khaûo saùt vaø ñaùnh giaù soá teá baøo soáng cuûa L.plantarum trong
cheá phaåm sau saáy phun.

- Cho 1g cheá phaåm saáy phun ngaâm trong 9ml dung dòch ñeäm phosphate
pH 7.
- Pha loaõng dung dòch maãu, traûi ñóa treân moâi tröôøng MRS agar vaø uû
370C trong 72 giôø.
- Chæ tieâu theo doõi: maät ñoä L.plantarum (log CFU/g).

2.4.8.4. Phöông phaùp xaùc ñònh kích thöôùc haït baèng HORIBA LA 950V2

LA950V2 laø moät saûn phaåm cuûa HORIBA, LA950V2 söû duïng phöông phaùp taùn
xaï laser ñeå phaân tích, phaân boá kích thöôùc haït.

Thoâng soá kyõ thuaät:

 Daõy ño 0.01-300
 Ñoä nhôùt < 10 mPa
 Thôøi gian ño: 1 phuùt
 Ñaàu doø: Silicon Photo Diode
 Heä thoáng tuaàn hoaøn maãu
 Ñaàu doø sieâu aâm: taàn soá 20 kHz vôùi 7 möùc tuøy choïn
 Bôm tuaàn hoaøn: coù 15 möùc tuøy choïn
 Maùy khuaáy: coù 15 möùc tuøy choïn
 Flow/Fraction Cell laøm baèng thuûy tinh Tempax
 Nguoàn ñieän cung caáp: AC 120±10% hoaëc 230 VAC±10%, 50/60 Hz±1%
 Coâng suaát tieâu thuï: 300VA
 Kích thöôùc vaø troïng löôïng: 705x565x500 mm, 56 kg.

Nguyeân lyù hoaït ñoâng (maãu öôùt)

Nguyeân lyù hoaït ñoäng maùy döïa treân phöông phaùp ño taùn xaï aùnh saùng ñeå
xaùc ñònh cöôøng ñoä taùn xaï vaø goùc taùn xaï. Theo nguyeân taéc caùc haït nhoû
seõ coù cöôøng ñoä taùn xaï nhoû vaø goùc taùn xaï lôùn, caùc haït lôùn hôn coù
cöôøng ñoä taùn xaï lôùn hôn nhöng goùc taùn xaï nhoû hôn. Heä thoáng söû duïng hai

31
nguoàn saùng ñeå kieåm soaùt söï töông taùc cuûa maãu vôùi aùnh saùng, trong ñoù
diode phaùt quang maøu xanh coù doø ñöôïc caùc haït nhoû ñeán kích thöôùc 0.01 µm,
tia laser maøu ñoû coù theå doø ñöôïc caùc haït coù kích thöôùc lôùn ñeán 3mm.

Tín hieäu qua caùc ñaàu doø sau khi ñöôïc thu nhaän seõ ñöôïc veà heä thoáng maùy
tính. Heä thoáng söû duïng caùc phaàn meám chuyeân duïng vôùi caùc thuaät toaùn
döïa treân neàn taûng thuyeát taùn xaï Mie ñeå tính toaùn phaân boá kích thöôùc haït
cuõng nhö toái öu caùc ñieàu kieän phaân tích.

Quy trình thí nghieäm

 Baät coâng taéc khôûi ñoäng heä thoáng

 Sau ñoù naïp lieäu (moâi tröôøng phaân taùn)
 Loaïi boït khí
 Hieäu chænh quang hoïc vaø chaïy maãu traéng ñeå loaïi tröø noise
(alignment+blank)
 Cho maãu vaøo
 Xöû lyù maãu (soùng sieâu aâm, toác ñoä khuaáy, toác ñoä tuaàn hoaøn)
 Ño, löu tröõ döõ lieäu/xuaát döõ lieäu
 Röûa loaïi boû maãu

2.4.8.5. Phöông phaùp theo doõi cheá phaåm

- Sau khi saáy phun, cheá phaåm taïo thaønh ñöôïc theo doõi trong 12 tuaàn baûo
quaûn ôû nhieät ñoä phoøng vaø tieán haønh khaûo saùt hoaït tính khaùng
H.pylori cuûa cheá phaåm baèng phöông phaùp khueách taùn ñóa thaïch.
- Caùc chæ tieâu theo doõi: maät ñoä, aåm ñoä, taùi khaûo saùt hoaït tính khaùng
H.pylori.

2.4.9. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu

Soá lieäu thöïc nghieâm ñöôïc xöû lyù baèng phaàn meàm excel vaø SPSS

32
 CHÖÔNG 3

KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU

3.1.Keát quaû phaân laäp vi khuaån Lactobacillus

Moät soá thöïc phaåm leân men truyeàn thoáng ôû Vieät nam bao goàm döa chua, kim
chi, kim baép, döa chua hoãn hôïp ñöôïc söû duïng trong thí nghieäm phaân laäp vi
khuaån lactic. Keát quaû thu nhaän ñöôïc 10 chuûng vi khuaån ñònh danh ban ñaàu laø
vi khuaån lactic, keát hôïp vôùi 10 chuûng vi khuaån töø boä söu taäp cuûa boä moân.
Choïn nhöõng chuûng khaùc nhau döïa vaøo söï khaùc nhau veà hình thaùi khuaån
laïc, hình thaùi teá baøo, baét maøu tím trong quaù trình nhuoäm Gram. Moät soá moâ
taû vaø hình aûnh ñöôïc ghi nhaän trong baûng 3.1 vaø phaàn phuï luïc.

Vi khuaån lactic coù daïng hình que, Gram döông, khoâng taïo baøo töû, khoâng chöùa
saéc toá, catalase aâm tính vaø laø nhöõng vi khuaån vi hieáu khí [13]. Vi khuaån lactic
ñöôïc öùng duïng trong leân men, chuû yeáu trong nhieàu saûn phaåm leân men nhö
söõa chua, phoâ mai. Beân caïnh ñoù, vi khuaån lactic coøn ñöôïc söû duïng trong
ñieàu trò vaø phoøng ngöøa tieâu chaûy, söû duïng cho caùc vaán ñeà veà tieâu hoùa.
Vôùi nhöõng vai troø ñoái vôùi söùc khoûe vaø khaû naêng öùng duïng trong coâng
nghieäp nhö vaäy, ñaõ coù nhieàu nghieân cöùu thöïc hieän böôùc phaân laäp vaø
tuyeån choïn vi khuaån lactic [13]. Vôùi muïc tieâu choïn chuûng gioáng vi khuaån lactic
coù khaû naêng khaùng H.pylori vaø coù hoaït tính probiotic nhö coù khaû naêng chòu
pH thaáp vaø muoái maät. Chuùng toâi tieán haønh saøng loïc ñeå laáy chuûng vi
khuaån lactic coù khaû naêng khaùng H.pylori cao vaø coù hoaït tính probiotic.

33
 Baûng3.1: Ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa moät soá doøng vi khuaån
lactic phaân laäp

Nguoàn Hình thaùi teá baøo Nguoàn Hình thaùi teá baøo
phaân phaân
laäp laäp

L1 L6 (Döa
(Döa chua)
chua)

Hình que ngaén

Hình que ngaén
L2 L7 (Döa
(Kim chua
baép) hoãn
hôïp)

Hình que daøi Hình que xoaén

L3 L8 (Kim
(Döa chi)
chua
hoãn
hôïp)
Hình que ngaén cong
Hình que hôi daøi
L4 L9 (Döa
(Döa chua
chua hoãn
hoãn hôïp)
hôïp)

Hình que ngaén keát Hình que ngaén hôi

chuøm cong
L5 L10
(Döa
chua)

Hình que hôi daøi Hình que ngaén

34
Töø moät soá thöïc phaåm leân men, cuøng vôùi döïa vaøo hình thaùi khuaån laïc, hình
thaùi teá baøo vaø ñoä baét maøu tím trong nhuoäm Gram, ñaõ phaân laäp ra ñöôïc 10
chuûng vi khuaån lactic vaø keát hôïp vôùi 10 chuûng vi khuaån lactic töø boä moân,
chuùng toâi coù 20 chuûng vi khuaån lactic ñeå thöïc hieän caùc böôùc thí nghieäm
tieáp theo trong ñeà taøi naøy.

3.2. Xaùc ñònh ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa Helicobacter pylori vaø khaûo
saùt khaû naêng öùc cheá cuûa vi khuaån lactic vôùi Helicobacter pylori.

3.2.1. Xaùc ñònh ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa H. pylori

Maät ñoä teá baøo H.pylori

6
*104 CFU/ml

0
0 24 48 72 96 120
Thôøi gian (h)

Hình 3.1.Ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa H.pylori

Caên cöù vaøo hình 3.1, ta thaáy vi khuaån H.pylori coù söï taêng tröôûng töø 24h ñeán
72h vaø maät ñoä H.pylori ñaït cöïc ñaïi ôû 72h. Sau ñoù, H.pylori giaûm daàn töø 72h
ñeán 120h. Vì vaäy, 72h laø thôøi gian nuoâi caáy toái öu cho vi khuaån Helicobacter
pylori vaø ñöôïc söû duïng cho caùc thí nghieäm tieáp theo

Trong voøng 24h, H.pylori baét ñaàu quaù trình thích nghi vôùi moâi tröôøng dinh
döôõng vaø söû duïng nhöõng chaát dinh döôõng coù trong moâi tröôøng ñeå phaùt
trieån. Sau ñoù H.pylori böôùc vaøo giai ñoaïn taêng tröôûng veà caû kích thöôùc laãn
soá löôïng. Ñeán 72h, maät ñoä H.pylori ñaït giaù trò cöïc ñaïi vaø sau ñoù maät ñoä

35
H.pylori giaûm daàn. Nguyeân nhaân laø caùc chaát dinh döôõng trong moâi tröôøng
ñaõ bò H.pylori söû duïng heát, beân caïnh ñoù laø caùc saûn phaåm sinh toång hôïp
ñöôïc thaûi ra trong quaù trình nuoâi caáy vaø nhöõng saûn phaåm khoâng mong
muoán naøy öùc cheá söï phaùt trieån cuûa H.pylori, vì vaäy maät ñoä cuûa H.pylori
seõ giaûm khi nuoâi caáy trong thôøi gian daøi.

3.2.2. Khaûo saùt khaû naêng öùc cheá cuûa vi khuaån lactic vôùi H. pylori baèng
phöông phaùp nuoâi caáy ñoàng thôøi treân moâi tröôøng loûng

Sau khi phaân laäp ñöôïc 10 chuûng vi khuaån lactic töø caùc nguoàn leân men nhö
kim chi, kim baép, döa chua cuøng vôùi 10 chuûng vi khuaån lactic ñöôïc cung caáp töø
boä moân, tieán haønh khaûo saùt khaû naêng öùc cheá cuûa 20 chuûng vi khuaån
lactic vôùi H.pylori, roài tieán haønh so saùnh choïn ra chuûng vi khuaån lactic coù tyû
leä phaàn traêm öùc cheá H.pylori cao nhaát, vôùi tyû leä maät ñoä vi khuaån lactic laø
3% so vôùi H.pylori, keát quaû ñöôïc theå hieän ôû hình 3.2.

80
70.48%
Tyû leä % öùc cheá cuûa caùc

%0
chuûng vi khuaån lactic vôùi

70

60
H.pylori

50

40

30

20

10

0
L7
L8
L1
L2
L3
L4
L5
L6

L9
L10
L11
L12
L13
L14
L15
L16
L17
L18
L19
L20

Gioáng

Hình 3.2. Tyû leä% öùc cheá cuûa caùc chuûng vi khuaån lactic ñoái vôùi
H.pylori

36
Caên cöù vaøo hình 3.2, 20 chuûng vi khuaån lactic ñöôïc phaân laäp trong ñoù coù 16
chuûng vi khuaån lactic ñöôïc kí hieäu töø (L1-L16) coù khaû naêng öùc cheá H.pylori
vôùi caùc tyû leä % öùc cheá khaùc nhau, 4 chuûng vi khuaån lactic coøn laïi ñöôïc kí
hieäu töø (L17-L20) khoâng coù khaû naêng öùc cheá ñöôïc H.pylori. Trong ñoù, L3 coù
tyû leä % öùc cheá H.pylori laø cao nhaát so vôùi 11 chuûng vi khuaån lactic coøn laïi.
Tyû leä % öùc cheá cuûa chuûng L3 laø 70,48%. Theo nghieân cöùu cuûa moät soá
taùc giaû tröôùc ñaây cho thaáy vi khuaån lactic coù khaû naêng öùc cheá H.pylori.
Trong nhöõng nghieân cöùu naøy, phaàn traêm öùc cheá cuûa vi khuaån lactic ñoái
vôùi H.pylori laø 72,46% [29] cuõng gaàn vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa ñeà taøi
naøy.

Vi khuaån lactic coù khaû naêng tieát ra caùc acid höõu cô nhö acid lactic, acid acetic…
laøm giaûm pH moâi tröôøng beân trong khoang ruoät, öùc cheá nhieàu loaïi vi khuaån
gaây beänh ñöôøng ruoät. Beân caïnh ñoù, vi khuaån lactic coøn tieát ra bacteriocin laø
chaát khaùng khuaån, coù baûn chaát laø protein. Bacteriocin cuûa vi khuaån lactic
laøm bieán ñoåi khaû naêng tieát urease cuûa H.pylori ôû trong daï daøy, laøm cho
H.pylori khoâng theå trung hoøa ñöôïc dòch acid ôû trong daï daøy. Vì vaäy, H.pylori bò
tieâu dieät ôû trong daï daøy.

3.2.3. Khaûo saùt khaû naêng khaùng H.pylori cuûa chuûng vi khuaån tuyeån
choïn baèng phöông phaùp khueách taùn gieáng thaïch
Sau khi thöû khaû naêng khaùng H.pylori cuûa 10 chuûng vi khuaån lactic phaân laäp
ñöôïc vaø 10 chuûng vi khuaån lactic ñöôïc cung caáp bôûi boä moân baèng phöông
phaùp nuoâi caáy ñoàng thôøi vaø traûi ñóa, xaùc ñònh ñöôïc chuûng vi khuaån lactic
(L3) coù tyû leä phaàn traêm khaùng H.pylori laø cao nhaát (70.48%). Sau ñoù tieán
haønh kieåm tra khaû naêng khaùng H.pylori cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn L3
baèng phöông phaùp ñuïc loã thaïch vaø ño voøng khaùng khuaån sinh ra. Keát quaû
ñöôïc theå hieän ôû hình 3.3; chuûng vi khuaån lactic tuyeån choïn (L3) coù khaû naêng
khaùng H.pylori cao vì taïo ra voøng khaùng khuaån vôùi ñöôøng kính laø 12mm.

37
 Hình 3.3.Khaû naêng khaùng cuûa vi khuaån lactic (L3) ñoái vôùi
H.pylori
Vì vaäy, caû hai phöông phaùp nuoâi caáy ñoàng thôøi-traûi ñóa vaø phöông phaùp
khueách taùn gieáng thaïch ñeàu chöùng toû chuûng vi khuaån lactic (L3) coù khaû
naêng khaùng ñöôïc H.pylori. Trong khi ñoù, maãu ñoái chöùng khoâng coù khaû naêng
khaùng H.pylori.
3.2.4.Khaûo saùt tyû leä phaàn traêm öùc cheá cuûa chuûng vi khuaån tuyeån
choïn ñoái vôùi H.pylori

Sau khi choïn ra ñöôïc chuûng vi khuaån (L3) coù khaû naêng khaùng H.pylori cao
nhaát, tieán haønh khaûo saùt tyû leä cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3) ñoái
vôùi H.pylori ôû caùc tyû leä maät soá cuûa L3 laø 1%, 2%, 3%, 4%, 5% so vôùi
H.pylori. Keát quaû ñöôïc theå hieän ôû hình 3.4

38
 80

chuûng tuyeån choïn vôùi

Tyû leä % öùc cheá cuûa
70

60

H.pylori
50

40

30

20

10

0
1 2 3 4 5
Tyû leä % öùc cheá cuûa chuûng öùc cheá vôùi
H.pylori

Hình 3.4.Khaûo saùt tyû leä phaàn traêm cuûa chuûng vi khuaån tuyeån
choïn vôùi H.pylori

Hình 3.4 cho thaáy, chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3) coù khaû naêng öùc cheá
ñöôïc vi khuaån H.pylori. Vôùi caùc nghieäm thöùc khaùc nhau cuûa chuûng tuyeån
choïn (L3) so vôùi H.pylori, ta coù tyû leä phaàn traêm öùc cheá khaùc nhau. Trong
ñoù, vôùi tyû leä 3% theå tích cuûa chuûng tuyeån choïn( L3)/H.pylori ta coù tyû leä
phaàn traêm öùc cheá laø 70,48%. Hình 3.4 cho thaáy, tyû leä cuûa chuûng tuyeån
choïn (L3)/H.pylori taêng thì tyû leä phaàn traêm öùc cheá cuûa chuûng tuyeån choïn
(L3) ñoái vôùi H.pylori cuõng taêng. Tuy nhieân, tyû leä phaàn traêm öùc cheá cuûa
chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3) ñoái vôùi H.pylori haàu nhö taêng khoâng coù söï
khaùc bieät ñaùng keå ôû caùcû tyû leä 3%, 4%, 5%. Vì vaäy, chuùng toâi choïn tyû leä
3% laø tyû leä toái öu vì tieát kieäm ñöôïc löôïng gioáng theâm vaøo.
Ôû tyû leä 3, 4, 5% cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñoái vôùi H.pylori, phaàn
traêm öùc cheá cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñoái vôùi H.pylori haàu nhö
khoâng thay ñoåi. Bôûi vì khaû naêng sinh toång hôïp ra caùc chaát öùc cheá cuûa
chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñoái vôùi H.pylori ñaõ ñaït möùc baõo hoøa, do ñoù
phaàn traêm öùc cheá cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn vôùi H.pylori seõ khoâng
coù söï thay ñoåi nhieàu töø giaù trò baõo hoøa naøy. Vì vaäy, khi tyû leä % taêng leân
thì tyû leä phaàn traêm öùc cheá cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn vôùi H.pylori
cuõng seõ khoâng taêng khaùc bieät.
39
3.3. Khaûo saùt moät soá hoaït tính probiotic cô baûn cuûa chuûng vi khuaån
tuyeån choïn (L3) vaø ñònh danh
3.3.1. Kieåm tra khaû naêng chòu acid cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3)

Sau khi choïn ra ñöôïc chuûng vi khuaån lactic coù tyû leä phaàn traêm öùc cheá H.pylori laø
cao nhaát. Chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñöôïc khaûo saùt moät soá hoaït tính probiotic cô
baûn nhö khaû naêng chòu acid, chòu muoái maät. Ôû thí nghieäm naøy, khaû naêng chòu
acid cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñöôïc thöïc hieän vaø keát quaû ñöôïc theå hieän
ôû hình 3.5.

120
Tyû leä soáng soùt cuûa chuûng

100
tuyeån choïn (%)

80

60

40

20

0
2 3 4 5 DC
pH

Hình 3.5. Aûnh höôûng cuûa pH ñeán khaû naêng sinh tröôûng cuûa
chuûng tuyeån choïn

Caên cöù vaøo hình 3.5 ta thaáy: sau khi uû 24h ôû caùc moâi tröôøng coù ñoä pH
khaùc nhau, chuûng vi khuaån lactic tuyeån choïn coù khaû naêng soáng soùt nhöng
khaû naêng phaùt trieån giaûm daàn theo söï giaûm daàn cuûa pH. Ñieàu naøy chöùng
toû noàng ñoä acid trong moâi tröôøng ban ñaàu coù aûnh höôûng ñeán söï phaùt
trieån cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn. Tuy nhieân, chuûng vi khuaån tuyeån choïn
vaãn coù khaû naêng chòu ñöôïc acid pH2 phuø hôïp vôùi pH ôû daï daøy. Ñieàu naøy
coù nghóa laø khi chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3) vaøo ñeán daï daøy, vaãn coù

40
theå toàn taïi vaø sinh ra caùc chaát khaùng khuaån acid lactic, acid acetic coù khaû
naêng tieâu dieät H.pylori hay ngaên caûn söï baùm dính cuûa H.pylori vaøo daï daøy.

Chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3) vaøo cô theå qua ñöôøng aên uoáng, noù vaãn
coù khaû naêng soáng soùt vaø phaùt trieån nhöng thaáp hôn so vôùi bình thöôøng.
Khi chuûng tuyeån choïn ñi ñeán ruoät non (pH6,5) cuøng vôùi caùc chaát dinh döôõng
coù taïi ñaây noù coù khaû naêng phaùt trieån laïi bình thöôøng vaø seõ coù nhöõng
lôïi ích nhaát ñònh, chaúng haïn khaû naêng öùc cheá vi khuaån gaây haïi ñöôøng
ruoät. Ñieàu naøy raát coù yù nghóa ñeå chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñöôïc öùng
duïng duøng ñeå laøm probiotic.

Caên cöù vaøo hình 3.5 ta thaáy, chuûng tuyeån choïn (L3) coù phaàn traêm tæ leä
soáng soùt cao nhaát ôû pH5 (81,82%), trong khi ñoù ôû pH2 tæ leä phaàn traêm
soáng soùt laø 54,54%. Keát quaû naøy cho thaáy, chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3)
vaãn coù khaû naêng khaùng ñöôïc pH thaáp.

3.3.2. Keát quaû kieåm tra khaû naêng chòu muoái maät cuûa chuûng tuyeån
choïn (L3)

Sau khi khaûo saùt hoaït tính khaùng acid cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3),
khaû naêng khaùng muoái maät cuûa chuûng tuyeån choïn (L3) cuõng ñöôïc thöïc
hieän taïi pH3

Theo nghieân cöùu cuûa Jacobsen (2001) thì thí nghieäm ñöôïc tieán haønh baèng
caùch söû duïng moâi tröôøng MRS Broth ñöôïc boå sung 0,3% muoái maät vaø ñöôïc
ñöa veà pH3, ñaây laø möùc chòu ñöïng naèm trong giôùi haïn cho pheùp cuûa ña soá
caùc chuûng vi khuaån lactic. Vì vaäy, moâi tröôøng naøy ñöôïc duøng ñeå khaûo saùt
khaû naêng chòu muoái maät cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn (L3).

Keát quaû cho thaáy vi khuaån tuyeån choïn (L3) cuõng coù khaû naêng chòu ñöôïc
muoái maät vôùi tæ leä soáng soùtä laø 59,6%. Nghóa laø khi moät löôïng vi khuaån
tuyeån choïn (L3) ñöôïc ñöa vaøo moâi tröôøng coù muoái maät thì sau 24h, khaû
naêng soáng soùt cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn coøn khoaûng 59,6% so vôùi
bình thöôøng. Vì vaäy, chuûng vi khuaån tuyeån choïn vaãn coù khaû naêng soáng
soùt khi ôû trong ñöôøng tieâu hoùa vaø phaàn soáng soùt naøy seõ ñöôïc tôùi ruoät,

41
taïi ñaây ñieàu kieän soáng toát hôn, chöùa nhieàu chaát dinh döôõng thì phaùt trieån
trôû laïi vaø seõ mang laïi nhöõng lôïi ích nhaát ñònh, chaúng haïn nhö öùc cheá vi
khuaån coù haïi vaø ñieàu naøy raát coù yù nghóa cho vi khuaån tuyeån choïn (L3)
ñöôïc öùng duïng ñeå laøm cheá phaåm probiotic.

Toùm laïi chuûng vi khuaån tuyeån choïn khaùng H.pylori (L3) coù caùc hoaït tính
probiotic cô baûn nhö khaû naêng chòu ñöôïc muoái maät vaø khaùng ñöôïc pH thaáp.

3.3.3. Keát quaû ñònh danh cuûa vi khuaån lactic tuyeån choïn khaùng H.pylori

Chuûng vi khuaån lactic ñöôïc tuyeån choïn sau khi thöû caùc hoaït tính probiotic cô
baûn nhö khaû naêng chòu acid, khaû naêng chòu muoái maät, gôûi ñi ñònh danh ôû
coâng ty Nam Khoa vaø keát quaû ñònh danh ñöôïc theå hieän ôû hình 3.6

Hình 3.6. Keát quaû ñònh danh chuûng L3

Chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñöôïc ñem ñi ñònh danh baèng phöông phaùp giaûi
trình töï gen 16S rDNA vaø tra cöùu treân blast search cho keát quaû laø Lactobacillus

42
plantarum vôùi ñoä töông ñoàng laø 100%. Trình töï 16S rDNA cuûa chuûng tuyeån
choïn (L3) ñöôïc theå hieän trong hình 3.6 vaø keát quaû phaân tích ñöôïc theå hieän
trong phaàn phuï luïc (D). Chuûng vi khuaån tuyeån choïn ñöôïc ñònh danh laø
Lactobacillus plantarum ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu saûn phaåm leân men cuûa Vieät
nam. Lactobacillus plantarum phaân laäp ñöôïc coù khaû naêng öùc cheá ñöôïc vi
khuaån H.pylori vaø coù caùc hoaït tính cô baûn cuûa moät probiotic.

Thoâng tin chuûng gioáng

Toùm taét thoâng tin cuûa chuûng Lactobacillus plantarum ñöôïc theå hieän trong
baûng 3.2. Chuûng naøy ñöôïc baûo quaûn, löu tröõ taïi boä moân Coâng ngheä sinh
hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa.

Baûng 3.2. Toùm taét thoâng tin chuûng gioáng

Teân chuûng Hình aûnh ñaïi theå, vi Ñaëc Moâi tröôøng Moâi tröôøng
theå ñieåm sinh nhaân gioáng giöõ gioáng
hoùa
L.plantarum Catalase MRS: Glycerol:
ñöôïc phaân aâm Peptone:10g 10g/L
laäp töø döa Gram Glucose: 20g Lactose: 5g/L
chua döông Cao thòt: 5g Cao naám
Khoâng di Caonaám men:5g men: 0.5g/L
ñoäng Natri acetate: 2g
Vi hieáu khí Tween 80: 1ml
MgSO4.7H2O:0.2g
MnSO4.4H2O:0.2g
KH2PO4: 2g
Khuaån laïc coù hình
pH6.5
troøn, traéng nhoû, teá
baøo hình que ngaén,
keát chuoãi.

43
3.4. Thöû nghieäm taïo cheá phaåm L.plantarum vaø böôùc ñaàu ñaùnh giaù ñoä
oån ñònh cuûa cheá phaåm

Sau khi ñònh danh chuûng vi khuaån tuyeån choïn laø Lactobacillus plantarum, vôùi
ñònh höôùng tieáp theo tieán haønh taïo cheá phaåm vaø böôùc ñaàu ñaùnh giaù ñoä
oån ñònh cuûa cheá phaåm L.plantarum. Trong quaù trình taïo cheá phaåm baèng
phöông phaùp saáy phun, caùc yeáu toá nhö ñoä aåm, thôøi gian saáy, nhieät ñoä saáy
ñeàu aûnh höôûng tröïc tieáp chaát löôïng cuûa saûn phaåm. Trong saáy phun, löu
löôïng dòch phun aûnh höôûng raát lôùn ñeán maät ñoä vaø ñoä aåm cuûa cheá
phaåm L.plantarum. Vì vaäy, aûnh höôûng cuûa löu löôïng dòch phun ñöôïc khaûo saùt
ôû thí nghieäm sau.

3.4.1. AÛnh höôûng cuûa löu löôïng dòch phun

Löu löôïng dòch phun coù aûnh höôûng lôùn ñeán löu löôïng doøng nhaäp lieäu, naêng
suaát thieát bò vaø caû nhieät ñoä khoâng khí ñaàu ra. Löu löôïng dòch phun taêng
ñoàng nghóa vôùi thôøi gian löu cuûa vaät lieäu saáy trong buoàng saáy giaûm, löôïng
hôi nöôùc thoaùt ra töø dòch huyeàn phuø vi khuaån ít hôn laøm ñoä aåm taêng.

Baûng 3.3. AÛnh höôûng cuûa löu löôïng dòch phun

Lưulượng
dịchphun 4,5 5 5,5 6 6,5
(ml/phuùt)

Mậtñộ
L.plantarum 10,21±0,01a 10,85±0,01b 10,96±0,05b 11,32±0,05c 11,43±0,02c
(log CFU/g)

Độ ẩm (%) 6,01±0,04a 6,71±0,03a 9,15±0,03b 10,86±0,02c 12,01±0,01d

44
Keát quaû ôû baûng 3.3 cho thaáy, löu löôïng dòch phun aûnh höôûng lôùn ñeán maät
ñoä L.plantarum vaø ñoä aåm cuûa cheá phaåm L.plantarum. Khi löu löôïng dòch phun
thaáp, saûn phaåm sau saáy coù ñoä aåm thaáp, maät ñoä L.plantarum khoâng cao so
vôùi löu löôïng dòch phun cao. Nguyeân nhaân laø do thôøi gian löu cuûa dòch huyeàn
phuø vi khuaån L.plantarum trong buoàng saáy laâu, maät ñoä L.plantarum bò giaûm
do taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä ôû buoàng saáy. Löu löôïng dòch phun taêng leân, maät
ñoä L.plantarum taêng leân do thôøi gian löu cuûa dòch huyeàn phuø vi khuaån
L.planatarum trong buoàng saáy giaûm laøm giaûm taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä leân
L.plantarum. Löu löôïng dòch phun tieáp tuïc taêng, thôøi gian löu cuûa nguyeân lieäu
trong buoàng saáy giaûm, saûn phaåm sau saáy coù ñoä aåm taêng leân vaø maät ñoä
L.plantarum taêng leân. Vì vaäy löu löôïng dòch phun 5 ml/phuùt laø thích hôïp nhaát
cho quaù trình saáy phun dòch huyeàn phuø L.plantarum. Maät ñoä L.plantarum ôû löu
löôïng dòch phun 5ml/phuùt sau khi saáy thì cao tuy nhieân khoâng cao baèng maät
ñoä L.plantarum ôû löu löôïng dòch phun laø 5,5; 6 ml/phuùt. Maëc duø vaäy, ôû löu
löôïng dòch phun 5ml/phuùt cheá phaåm coù ñoä aåm thaáp neân L.plantarum coù
khaû naêng baûo quaûn ñöôïc toát vaø coù hoaït hoùa cao trong cheá phaåm (xeùt
theo tieâu chuaån boät cheá phaåm sinh hoïc vôùi ñoä aåm phaûi nhoû hôn 7%). Vì
vaäy, löu löôïng dòch phun 5 ml/phuùt ñöôïc choïn.

3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñầu vaøo

Trong quaù trình saáy phun, nhieät ñoä cuõng aûnh höôûng ñeán cheá phaåm, nhieät
ñoä cao laøm giaûm maät ñoä soáng cuûa vi khuaån vaø ñoä aåm cuûa cheá phaåm.
Vì vaäy, aûnh höôûng cuûa yeáu toá nhieät ñoä trong quaù trình saáy phun ñöôïc
khaûo saùt vaø keát quaû ñöôïc theå hieän ôû baûng 3.4.

Baûng 3.4. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä saáy phun ñaàu
vaøo

Nhiệt ñộ (oC) 90 100 110 120 130

Mậtñộ 11,52±0,11a 11,45±0,06a 10,84±0,02b 9,30±0,01c 8,12±0,01d

L.plantarum

45
(log CFU/g)

Độ ẩm (%) 11,2 ± 0,04a 6,72± 0,02b 6,01±0,04b 5,95±0,05c 5,78±0,02d

Nhieät ñoä khoâng khí saáy thaáp quaù hay cao quaù ñeàu baát lôïi cho quaù trình
saáy phun dòch huyeàn phuø cuûa L.plantarum. Keát quaû ôû baûng 3.4 cho thaáy,
nhieät ñoä khoâng khí saáy coù aûnh höôûng roõ reät ñeán maät ñoä L.plantarum vaø
ñoä aåm saûn phaåm. Nhieät ñoä khoâng khí saáy thaáp, ñoä aåm saûn phaåm vaãn
coøn cao vaø maät ñoä L.plantarum vaãn coøn cao vì ít bò aûnh höôûng bôûi nhieät
ñoä. Nhieät ñoä khoâng khí saáy taêng laøm ñoä aåm cuûa saûn phaåm giaûm vaø
maät ñoä cuûa L.plantarum cuõng giaûm do chòu taùc ñoäng bôûi nhieät ñoä. Khi
nhieät ñoä khoâng khí saáy taêng leân 1300C, maät ñoä L.plantarum giaûm xuoáng
nhanh choùng do bò tieâu dieät bôûi nhieät ñoä cao vaø ñoä aåm cuûa saûn phaåm
cuõng giaûm xuoáng. Vì vaäy, nhieät ñoäâ khoâng khí saáy phun ôû 1000C laø thích
hôïp cho quaù trình saáy phun dòch huyeàn phuø cuûa L.plantarum vì maät ñoä
L.plantarum cao vaø ñoä aåm cuûa cheá phaåm cuõng thích hôïp bôûi vì theo nhieàu
nghieân cöùu [31] thì ñoä aåm trong maãu saáy phun phaûi nhoû hôn 7% ñeå ñaûm
baûo tyû leä soáng soùt cuûa vi khuaån trong cheá phaåm. Vì vaäy, maãu saáy phun
coù ñoä aåm lôùn hôn 6,72 % laø ñaït yeâu caàu.

3.4.3. Cheá phaåm saáy phun

Sau khi saáy phun, cheá phaåm L.plantarum ôû daïng haït, teá baøo L.plantarum sau
khi saáy ñöôïc ñoùng goùi döôùi ñieàu kieän voâ truøng trong tuùi huùt chaân khoâng
bôûi vì söï coù maët cuûa oxi seõ nhanh choùng laøm hoûng saûn phaåm.

46
 Hình 3.7.Kích thöôùc haït cheá phaåm L.plantarum sau khi saáy phun

Caên cöù vaøo hình 3.7, ta thaáy haït cheá phaåm L.plantarum coù caùc kích thöôùc
sau: kích thöôùc haït chieám 80% trong hoãn hôïp laø 10,30 µm, kích thöôùc haït
chieám 20% trong hoãn hôïp laø 2,85 µm vaø kích thöôùc haït trung bình laø 6,2 µm.
Kích thöôùc haït ñaït yeâu caàu vì theo chæ tieâu chaát löôïng nhaø saûn xuaát kích
thöôùc haït chæ töø 1-2mm.

Hình3.8. Hình aûnh cheá phaåm L.plantarum sau khi saáy phun

3.4.4. Theo doõi chế phẩm vaø ñaùnh giaù hoaït tính khaùng H.pylori

Caùc cheá phaåm taïo thaønh ñöôïc theo doõi thôøi gian baûo quaûn töø 4 ñeán 12
tuaàn ôûđñiều kiện bảo quản ôû nhieät ñoä phoøng, trong tuùi huùt chaân khoâng.

47
 Baûng 3.5.Theo doõi cheá phaåm

Thời gian (tuần) Mật ñộ L.plantarum Độ ẩm (%)

(log CFU/g)
Ban ñầu 11,45a 6,70a
4 11,40a 6,72ab
5 11,42a 6,68ab
6 11,19a 6,70a
7 10,88ab 6,60ab
8 10,80ab 6.70a
9 10,80ab 6,65ab
10 10,55ab 6,70a
11 10,18ab 6,75ab
12 9,95ab 6,70a

Saûn phaåm sau khi saáy phun coù ñoä aåm khoaûng 6,7%, ñöôïc baûo quaûn ôû
nhieät ñoä 2-50C trong bình baûo quaûn tuùi huùt chaân khoâng. Maät ñoä L.plantarum
khoâng thay ñoåi khaùc bieät coù yù nghóa so vôùi maät ñoä L.plantarum ban ñaàu
trong khoaûng 6 tuaàn ñaàu. Töø tuaàn 7 ñeán tuaàn 11, maät ñoä L.plantarum coù
giaûm so vôùi ban ñaàu nhöng khoâng ñaùng keå, tuaàn 12 thì maät ñoâ L.plantarum
giaûm chaäm so vôùi maät ñoä L.plantarum ban ñaàu, maät ñoä vaãn cao. Trong 12
tuaàn khaûo saùt, maät ñoä L.plantarum ñaït 9,95 (logCFU/g) ôû tuaàn thöù 12.

48
Taùi khaûo saùt khaû naêng khaùng H.pylori cuûa L.plantarum sau khi taïo cheá
phaåm baèng phöông phaùp saáy phun vaø 12 tuaàn baûo quaûn

L.plantarum sau khi saáy phun taïo cheá phaåm, tieán haønh thöû hoaït tính khaùng
khuaån cuûa L.plantarum ñoái vôùi H.pylori ñeå kieåm tra hoaït tính ñoái khaùng cuûa
L.plantarum ñoái vôùi H.pylori sau khi taïo thaønh cheá phaåm.

Hoaït tính khaùng khuaån ñöôïc thöïc hieän ñoái vôùi vi khuaån H.pylori thoâng qua
phöông phaùp ñuïc loã thaïch vaø ño voøng khaùng khuaån sinh ra. Keát quaû
L.plantarum coù khaû naêng khaùng ñöôïc H.pylori ngay sau khi taïo thaønh cheá
phaåm vaø sau khi taïo cheá phaåm 12 tuaàn, caû hai ñeàu taïo ra ñöôïc voøng khaùng
khuaån vôùi ñöôøng kính laø 12mm. Ñieàu naøy chöùng toû, L.plantarum khoâng bò
maát hoaït tính khaùng H.pylori sau khi taïo cheá phaåm baèng phöông phaùp saáy
phun vaø trong quaù trình baûo quaûn cheá phaåm.

Vì vaäy, sau quaù trình saáy phun vaø taùi kieåm tra khaû naêng khaùng H.pylori thì
hoaït tính naøy vaãn ñöôïc baûo toaøn.

Keát quaû nghieân cöùu treân cuõng phuø hôïp vôùi moät soá nghieân cöùu treân theá
giôùi, L.plantarum coù khaû naêng öùc cheá ñöôïc H.pylori [29]. Khaû naêng khaùng
khuaån cuûa vi khuaån Lactobacillus plantarum cuõng ñöôïc khaûo saùt qua nhieàu
nghieân cöùu, beân caïnh khaùng H.pylori, Lactobacillus plantarum coøn coù khaû
naêng khaùng ñöôïc nhieàu loaïi vi khuaån khaùc. Lactobacillus plantarum töø saûn
phaåm caù leân men truyeàn thoáng cuûa Malaysia coù khaû naêng khaùng laïi vi
khuaån gaây beänh Salmonella. Saûn phaåm döa chuoät leân men baèng chuûng
L.plantarum trong ñieàu kieän noàng ñoä muoái cao (4-7%), öùc cheá söï phaùt trieån
cuûa chuûng chuûng vi khuaån gaây beänh öù maën.

49
 CHÖÔNG 4

KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ

Keát luaän

1. Töø nhöõng thöïc phaåm leân men vaø boä söu taäp vi khuaån lactic löu tröõ ôû boä
moân Coâng Ngheä Sinh Hoïc ñeà taøi ñaõ tuyeån choïn vaø ñònh danh ñöôïc moät
chuûng vi khuaån Lactobacillus plantarum coù caùc hoaït tính probiotic cô baûn vaø
coù khaû naêng öùc cheá ñöôïc H.pylori vôùi tyû leä phaàn traêm öùc cheá laø
70,48%.
2. Thöû nghieäm taïo cheá phaåm L.plantarum vaø xaùc ñònh ñöôïc caùc thoâng soá
saáy phun:
- Löu löôïng dòch phun cuûa L.plantarum laø 5 ml/phuùt.
- Nhieät ñoä ñaàu vaøo cho quaù trình saáy phun L.plantarum laø 100oC.

Cheá phaåm coù maät ñoä 9,95 logCFU/g, aåm ñoä 6,7% vaø baûo toaøn hoaït tính
khaùng H.pylori sau 12 tuaàn baûo quaûn ôû nhieät ñoä phoøng.

Kieán nghò

- Thöïc hieän phaân laäp theâm nhieàu chuûng vi khuaån lactic töø nhieàu nguoàn
khaùc nhau trong töï nhieân, ñeå choïn ra vi khuaån lactic coù khaû naêng
khaùng H.pylori cao nhaát.
- Khaûo saùt theâm moät soá hoaït tính probiotic khaùc cuûa L.plantarum nhö
khaû naêng khaùng oxi hoùa, khaû naêng khaùng khuaån ñoái vôùi moät soá
chuûng vi khuaån gaây beänh khaùc, ñaëc bieät laø coù khaû naêng khaùng
khaùng sinh, vì coù theå keát hôïp cheá phaåm L.plantarum vôùi khaùng sinh
ñeå coù theå ngaên ngöøa H.pylori hieäu quaû.
- Thaêm doø khaû naêng öùng duïng cuûa cheá phaåm qua caùc giai ñoaïn tieáp
theo (in vivo).

50
51
52