Pruebas Bioquimicas para La Identificacion de Bacterias de Importancia Clinica Mac Faddin PDF

14. Pruebos bioquimicas para Ia identificacién de bacterias La propiedad termorresistente es la base para la diferenciacion de algunas especies del género Pseudomonas. A) B) c) IV. REACTIVOS EMPLEADOS pnitrofenil fostato.? Preparar en concentracion del 0,1. % en agua destiladautilizando. un frasco volumé ico. 2. Guardar en un frasco de vidrio color caramelo. Evitar la exposicién ala luz 3. Rotular correctamente. Buffer Tris, 0,02 M, pH:8 1, Disolver 3.02 g (0,025 moles, peso mol, 121) detrissdlido (hidroximetil) aminometano (0 2-amino-2-hidroximetil-1.3-propandiol) en 100 ml aproximadamente de agua destilada en un frasco volumétrico de un litvo. Hervir el agua destilada para que se desprenda el CO." 2. Agregar 25 ml de CH LN (0,025 moles de CIH) y cs.p. 1.000 ml con agua destilada hervida. 3. Controlar el pH; a 37° C debe ser 8. 4. Rotular correctamente. Método de utilizacién (de ambos reactivos).” 1. Con una torunda estévil retirar las células que se desarrollan en un medio de agar adecuado y preparar una suspension celular del organismo bajo sospecha, en buffer T (pH:8) con una densidad igual al N°3 del nefeloémetro de MeFar land. a) Estandarizar las densidades de células por ml b) Preparar diez tubos patron nu- merados desde el 1 hasta el 10. 1. Cada tubo contiene un multi- plo de 300.000.000 de orga- hismos por ml Numero del tubo patron por 300,000,000 es igual al mtimero de organismos por ml (Tubo 3 = 9 x 10* cél/mb), oH Fosfatasa b—on OH paitrofenil fostato, Gncoloro) Colocar 0,5 ml de la suspensién de microorganismo en buffer en dos tubos, y rotularlos tubos 1 y 2. Colocar el Tubo 1 en un baito de agua a 70°C durante 20° min EI Tubo 2 es el control no calentado. Despueés de la incubacién del Tubo 1, agregar 0,5 ml de una solucién de-prnitrofenil fosfato al 01% (incolora) a ambos tubos. Segunda incubacién, ambos _tubos, nun bafo de agua MG, b) Desde 1h hasta el dia siguiente. es negativa (no aparece color amarillo en ninguno de los tubos), incubar 24 h. 7. Registrar las reacciones de color D) Control de calidad. Antes de adoptarlos para su empleo general, deben contro- Larse los reactivos con cultivos positives y negativos conocidos. El Staphylococcus epidermidis y ka P. aeruginosa constituyen Duenos controles porque se obtiencn hacilmente y no crean problemas cuando se los conserva como cultivos madre, epidermidis: prueba de la fostatasa negativa, no se produce fosfatasa® P. aeruginosa: prucba de la fostatasa positiva, resistente al calor. BE) Conservacion: Guardar ambos reactivos en un reftigerador (a 4° C) cuando no se los emplea. Su estabilidad es variable: por lo tanto, periddicamente habra que hacer un control de calidad. desechandolos si muestran una reaccion negativa o débil con un organismo positive conocido. F) Quimica de la accion del reactivo: El Prnitrofenil fosfato es un reactivo ineo- loro que se desclobla para dar p-nitrofenol (un compuesto de color amarillo) y fosfato inorginico cuando sobre él acttia ‘la enzima fosfatasa.’ Las sales coloreadas de los p-nitrofenoles se forman con bases (buffer Tris); probablemente son sales de una estructura quinoide.” as sales de nitrofenol son de color amarillo intenso.” Fosfato inorginico pritvoenot i (amarillo)PRUEBAS BIOQUIMICAS INDIVIDUALES Prueba de la fosfatasa alcalina termorresistente I. PRINCIPIO Determinar la actividad enzimatica termo- labil de la fosfatasa alcalina de un organismo. Il. OBJETIVO (Véase también Ia Seccin III, cap. 33) EL organismo que se va a estudiar con respecto a la actividad de la fosfatasa alcalina debe ser identificado previamente como miembro del género Pseudomonas. Muchos miembros de las Enterobacteriaceae son resistentes al calor " y esta prueba no diferencia entre el género Psewlomonay y otros géneros entéricos. Diferenciacién de especies de Pseudomonas A) Termorresistentes *: 1) Pseudomonas aeruginosa; 2) Pseudomonas pseudomallei: 3) Pseudomonas boreopalis B) Termolabiles: todas las demas especies de Pseudomonas.? III. BASES BIOQUIMICAS La enzima fosfatasa es una fosfomonoeste- rasa ® que acttia sobre los sustratos monoéste- res fosfatos.2* La hidrélisis del esterfosfato produce fosfato inorganico (Pi) y alcohol (R-OH)* El enlace entre el oxigeno y el fosforo se rompe por hidrdlisis (C-O!P), liberando el fosfato inorginico del monoéster fosfato.* La enzima_ fosfatasa alcalina tiene su actividad catalitica éptima cuando existe un pH alcalino, de alli su nombre de fosfatasa alealina* Algunas enzimas fosfatasas alealinas son resistentes al calor, mientras que otras son destruidas cuando son sometidas a una temperatura cle 70° C durante cierto tiempo. ° Po ° Fostito inorginien H oH Fosfatasa alealina 5 Wonka + HO i (Hidrilisis) oO Ester de fosfate onginico Fosfato, inorgainico AlcoholV. RESULTADOS La fotografia en colores de | Ios resultados puede verse en la Figura 1-1 (Apéndice 1), “VI. INTERPRETACION A) Termorresistentes: P. aeruginosa, P. seu- domallei, P. boreopotis 1. Tubo calentado: marillo). 2. Tubo de control no calentado: positiva (color amarillo). B) Termolibiles: Especies de Pseudomonas que no sean las mencionadas en A). 1. Tubo calentado: negativa (incolora). 2. Tubo de control no calentado: positiva (color amarillo), ©) No se trata de una especie de Psewdo- monas. 1. Tubo calentado: negativa (incolora). 2. Tubo de control no calentado: negativa (incolora). Una reaccién fuertemente positiva puede producirse a la hora de la incubacién; sin embargo, una rea cin débil puede requerir la incuba- cién durante 24 h (de un dia para el otro)." positiva (color VII. PRECAUCIONES A) EL organismo debe ser identificado como miembro del género Pseudomonas antes de probar su actividad de la fosfatasa alealina. Muchos miembros de las Enterobac- teriaceae producen Ia enzima fosfatasa Proteus, Providence, Salmonella, Shigella, Klebsiella y Escherichia coli; y muchas de estas fosfatasas son resistentes al calor." Esta prueba silo diferencia las especies dentro del género Pseudomonas.? Todas las especies de Pseudomonas tienen flagelos polares y la prueba de OF es oxidativa para la glucosa, lo que descarta posibles 1, Bailey, R. W., and Seott, E.G. Diagnos- tie Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 'Y. Mosby Company, 1966, p. $29. it 2. Cantarow, A., and Schepartz, B. Bio. chemistry, $rd ed., Philadelphia: W. B. ‘Saunders Company, 1962, p. 239. 3. Cowan, S. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- 6. Fosfatasa alcalina termorresistente 15 miembros de las Enterobacteriaceae. Asi- mismo las especies de Pseudomonas tienen requerimientos de temperatura variables para su crecimiento Gptimo, Muchas especies de Pseudomonas no se desarrollan a 37° C y, sin embargo, todas las especies de P. aeruginosa y P. pseudomallei crecen bien a 37°C7 B) Todas las especies dle Pyeudomonas produ cen la enzima fosfatasa, pero la mayoria son inactivadas cuando son calentadas a 70° C durante 20 min. Solamente la P. aeruginosa, P. pseudomallei y P. boreopolis son termorresistentes; otras especies de Pseudomonas son termolabiles (sensibles al calor).7 Hasta el momento no existe medio bioquimico para diferenciar la P. aeruginosa de la P. pseudomallei.? La dife- renclacién se hace seroldgicamente, util zando antigenos solubles especificos para la especie.’ ©) La enzima fosfatasa es producida por las especies de Pseudomonas y algunos miembros de las Enterobacteriaceae " sinica- ‘mente cuando son cultivadas en un medio que contenga una concentracién suma mente reducida de fosfato.” Por lo tanto, emplear un medio que no contenga fostato adicional, como el agar-extracto de glucosa-triptona 0 cualquier medio que no contenga mas de un 0.2 % de peptona y 0,05 % de extracto de levadura? D) La suspensién de células en buffer debe serincolora antes del agregado del reactivo p-nitrofenil fosfato.” Un caldo de cultivo no es conveniente como medio para la suspensin celular, ya que la peptona imparte a la suspensidn un color amarillo. Asimismo, muchas especies de Pseudoma- nas producen un pigmento amarillo yer- doso, fluoresceina, que puede ocultar una reaccién negativa.” Sin embargo, silo se forma fluoresceina cuando el cultivo se efectia en un medio que contiene fosfato."* E) No se deben preparar suspensiones celulares utilizando un buffer fosfato ya que éste inhibe la actividad de la fosfatasa.? BIBLIOGRAFIA ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 35 and 162 Davidson, I., and Henry, J. B. Todd- Sanford Clinical Diagnosis by Labora- tory Methods, 14th ed., Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1969, p. 1259 Fioser, L. F., and Fieser, M. Organic16 Pruebas bioquimicas para Ia identificacién de bacterias Chemistry, 3rd ed., New York: Reinhold Publishing Corporation, 1956, p. 461, Harrow, B., and Mazur, A., Textbook of Biochemistry, 9th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1966, pp. 111 and 144. Liu, P. V. (1966) Differentiation of patn. ogenic pseudomonads by heat resist- ance of alkaline phosphatase. Am. J. Clin, Pathol., 5, 689. Lynch, 8. S., Mellor, L. D., Spare, P. D., and Inwood, M. J. H. Medical Labo- ratory Technology and Clinical Pathot- ogy, 2nd ed., Philadelphia: W. B. Saun- ders Company, 1969, p. 307 .Noller, C. R: Chemistry of Organic Com- pounds, ard ed., Philadelphia: W. B. ‘Saunders Company, 1965, p. 555. 10, Rice, E. W. Principles and Methods of Clinicas Chemistry for Medical Technol- — ogists, Springfield, Ill: Charles C ‘homes, Publisher, 1960, pp. 38-89. 11, Torriani, A. (1960) Influence ot inor- ganic phosphate in the formation of phosphatases by Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, $8, 460. 12, Whitmore, F. C. Organic Chemistry, New York: D. Van Nostrand Company, Inc., 1997, p. 782 18, Wilson, Sir G. S., and Miles, A. A. To- ley and Wilson's Principles of Bacteriol- ogy and Immunity, Vol. I, 5th ed., Balti- ‘more: The Williams & ‘Wilkins Com- pany, 1964, p. 639. 4Prueba de la esculina en medio con bilis I. PRINCIPIO Determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucésido esculina en esculetina y glucosa, en presencia de bilis (10 a 40 %). Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, cap. 32) A) Ayudar a la diferenciacién de los estreptococos del grupo D de otros estreptococos que no pertenecen a dicho grupo. B) Ayudar a la diferenciacién de la Listeria monocytogenes (+). H Deglucost. No hidracarbonauto (B-D-glucopiranosi) Ho, oJ HOH icles) a a 2 gd gt o 4 \ Acido Hidralisis HOH he Vn HOW Eseulina (CisHyeOs) 6 ,g-glucésido-7-hidroxicumarina HI. BASES BIOQUIMICAS La esculina es un glucdsido; un acetal derivado de monosacaridos simples. Cuando un elemento que no es un hidrato de carbono se une a un aziicar por medio de un enlace acetal, el acetal resultante se denomina glucésido y la mitad no hidrocarbonada aglucona.' La aglucona esti unida al azicar madre por medio de un atomo de oxigeno (enlace glucosidico LO- )2 Los acetales son répidamente hidrolizados por los icidos; ? la base de la prueba de la esculina es la hidrélisis de la esculina en esculetina, liberando la molécula de glucosa. La produccién de esculina puede ser HOA 09 any Hon LI Ko Axghtcona Non af) ON HE Enlace ghueosidien hon Fsculinsa Glucéside (derivado acetal) Ganon a) on ee vu A F a \\oH H/, Ho SS wo? yh HOH Esculetina (aglucona) B-D-glucosa 6.7-dihidroxieumarina18 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias demostrada por cualquiera de los dos medios.* Método de rutina La esculetina reacciona con una sal de hierro para formar un complejo castano oscuro o negro. Elcitrato dehierro (FeCgH;O;) se incorpora al medio de esculina con bilis en una concentracién del 0,05 % como indicador de la hidrélisis de la esculina y de la formacién de esculetina resultant HO. : Eseuletina Complejo de hier Kendilico (colar negro: feastao oscuro) ones férricos Se desconoce el mecanismo exacto, pero se supone asi on eee ie oe u 9 Método alternativo La produccién de acido con formacién de gases (CO2 y Ha) 0 sin ella en la mitad ghucosa, puede indicar también la descomposicion de la esculina. IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE ESCULINA ‘CON BILIS (pH: 7) A) Ingredientes (medio general) 1, Peptona Bg 2. Extracto de ca 3g 3. Bilis de buey 40g 4 culina 1g 5. Citrato de hierro (FeCgH3O7) 05 ¢ Agar bg 6, 5g 7. Agua destilada 1.000 ml B) Productos que se encuentran en el comercio (véase Apéndice V). 1. Pfizer: medio selectivo para enterococos (MSE). 2. Difco: dos variedades. c) G H) a) Medio de esculina y bilis (MEB) b) Medio de esculina y bilis modificado (MEBM) (modificacién, sin agregado de sucro equino) 3. BioQuest (BBL): medio de esculina y bilis (MEB, agar selectivo para entero ‘cocos), Diferencias generales entre los medios comerciales 1. Goncentracién de bilis. a) 40 % (Difco). b) 10 % (Pfizer y BBL). 2. Azida sédica (NaNa), 0,25 gflitro. a) Presente en Jos medios de Pfizer y BBL. b) Ausente en los medios de Difco. Método de preparacién. 1. Medir exactamente la cantidad que indica el prospecto; los diferentes productos pueden variar ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o de: mineralizada 3, Calentar suavemente la solucion. 4. Colocar aproximadamente 5 ml en un tubo con tapa de rosea (16 x 125 mm), Método de esterilizacion. 1, Autoclave. 2 121°C, 15 libras, 15 min, Dejar enfiiar manteniendo el tubo énetli- nado (para obtener una gran superficie en pico de flauta. Refrigerar para su conservacién (4-10° ©). Método de inoculacién. 1. Inéculo de un caldo de Todd-Hewitt de 24 h, cultivo puro. Agregar 2 goras a la superficie del pico de flauta con na pipeta de Pasteur 0 un asa de inoculacién. Incubacién. 35° C. 48h. 1. Pueden controlarse periédicamente los tubos y si la reacts anotar el resultado. 9. Esperar hasta las 72 h antes de hacer un informe negativo.V. INTERPRETACIONES A) Prueba EB positiva (hidrélisis de la esculina): presencia de un color negro a castanio oscuro en el pico de flauta La mitad 0 mis de la superficie del medio aparece negra. i En cualquier intervalo de tiempo? B) Prueba EB negativa (hidrélisis de la esculina). 1._Nose ha producido el ennegrecimien- to del medio, 2. Ennegrecimiento de menos de la mitad del tubo después de 72 h de incubacion (reaccion +/-)* 3. Puede producirse crecimiento, pero esto no indica la descomposicién de la esculina; solamente indica que la con- centracién de bilis. no inhibio cl crecimiento normal de los organismos que no corresponden a los estreptococos del grupo D. VI. PRUEBA RAPIDA: PRUEBA CON LA TIRA REACTIVA IMPREGNADA. CON ESCULINA Y BILIS. (PATHOTEC) A) Fabricante: General Diagnosties Division, Warner-Lambert Company B) Resultados: dentro de 1 a 4h de la cubacién. C) Método: seguir las indicaciones del fabricante. D) Correlacién con la prueba patron 1, 98 %* 75%! A veces, falsos positivos: * a) Excheri- chia; b) Citrobacter; ©) Proteus morganit \ veces, falsos negatives: * a) Klebsie- Ila; b) Enterobacter: 0) Serratia Esculina en medio con bilis 19 4. Dific de interpretar el color.! VII. PRECAUCIONES A) La prueba con esculina y bilis se utiliz6 originariamente para identificar a los enterococos; sin embargo, otros estreptococos del grupo D y a veces que no son del grupo D y otros géneros, Arrororeus® y Listeria, pueden tolerar la concentracién de bilis y desdoblar la esculina. Las propiedades de crecimiento en medios con 40 % de bilis y acido de la esculina (hidrélisis) no son tinicas de los estreptococos del grupo D, sino que son caracte risticas que comparten con la mayoria de las cepas del grupo D.! La prueba con esculina y bilis no puede ser usada para identificar a los enterococos, pero puede utilizarse una reaccién positiva eu enubinacivn eon otras pruchas para identificar presuutivameate a las especies de Streptocorrus del grupo D. Véase la Seccién IIT, Capitulo 32, donde se halls un esquema de identificacién detallado para la diferenciacién del grupo D. Las reacciones serolégicas son el rinica medio para coufirmar ki identificacién de los estreptococos del grupo D.' No debe confiarse en una prueba aislada para identifica presunticamente a los estreptococos del grupo D, sean enterococos no. Facklam ' y Facklam y col recomiendan una combina n de las pruebas con esculina ybilis y de tolerancia a la sal (crecimiento en cloruro de sodio al 65“). como puede verse en el cuadro 2-1 Las dilerencias de los medios de esculina y bilis que se encuentran en el comercio justifican las diversas reacciones de los organismos.* La azida sodica inhibe a los organismos gramnegativos, haciendo que el medio, resulte selective para los estrep- B) oi} Cuadro 2-1" MSE, MER o MEBM CING 65% + Creciniiento . No se observ No se obsersis ‘erp 1D No del gry D Crecimiento : Mentificacrin Enteracoce grape D No enteroroco, Neenteronorn Pasties Siey «#0 y. exp, Shiprocarens viridans Si son p-hemoliticas, verifiear vise trata det let grapes Si si pehemicicos, conti pare cl grupo B, Sison a oy controlar: la purer del call, con sil: volver a sislar en phe de ag sangre de earner nar la procter20 Pruebas bioquimicas pora la identificacién de bacterias tococos; sin embargo, los medios de Difco no contienen azida y no son selectivos. Los medios de cultivo de Difco contienen cuatro veces mas de bilis (40 %) que los de Pfizer y BioQuest (10%), y la menor concentrac de bilis es menos inhibidora para los estreptococos que no pertenecen al grupo D.' Otros estrepto= cocos, como algunas especies viridans, son capaces de descomponer la esculina: S. sanguis, S, mutans y S. anginosus (Strepto- coccus MG de la_antigua clasificaciin), pero estas especies por lo general no pueden tolerar una mayor concentracién de bilis del 40 % ¢ hidrolizar la esculina en combinacidn. No obstante, con la baja concentracin de bilis de los medios de Pfizer y BioQuest. se puede producir el crecimiento y la hidrolisis* Los estudios BIBLIOGRAFIA de Sabbaj y col” demostraron que todas las cepas de S. mutans (grupo viridans) hidrolizaban la esculina. Algunas cepas poctian crecer en bilis al 40%. pero no ke hacian en el medio con 6.5 % de sal. Ota especie de estreptococos del grupo. viridans que a veces podia hidrolizar la esculina y crecer en un medio de mayor concentracién era el S, sanguin. Por lo tanto, ef medio que contiene azida es mejor como medio selectivo primavio, pero aquel con mavor concentracion de bilis (40%) y sin azida (Difco) €s mejor para la diferenciaciin, Los est dios de Facklam * demostraron que el medio MSE. (Pfizer) no es conveniente para diferenciar con precision los estreptococos del grupo D- de les que no pertenecen a dicho grupo. 1. Blazevie, D. J., Schrenckenberger, P. C. and Matsen. J, M. (1973) Evaluation of the PathoTec "Rapid I-D system.” Appl Microbiol, 26, 886. 2. Cantarow, A., and Schepartz, B. Bio chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W. B Saunders Company, 1962, pp. 10-11 3. Cowan, 8. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, p. 24 4, Facklam, R. (1972) Recognition of group D streptococcal species of human origin by biochemical and physiological test, Appl. Microhiol.,. 23, 1181, 5, Facklam, R. R. (1973) Comparison of sev- eral laboratory media for presumptive identification of enterococci and group D streptococei. Appl. Microbiol.,.26, 138. 6. Facklam, R. R., Padula, J. F., Thacker, L.G., Wortham, E. C., and Sconyers, B. J. (1974) Presumptive identification of group A, B, and D streptococci. Appl. Microbiol., 27, 107. 7. Norris, J. R., and Ribbons, D. W. Meth- ‘ods in Microbiology, Vol. 6A, New York: ‘Academie Press, 1971, p. 11 8. Rosner, R (1978) Evaluation of the Path ‘otec "Rapid I-D system” and two addi tional experimental reagent-impregnated paper strips. Appl. Microbiol., 26, 890. 8. Sabbaj. J., Sutter, V. L., and Finegold, S. M. (1971) Comparison of selective media for isolation of presumptive group D streptococe! from human feces. Appl. Mie crobiol., 22, 1008Prueba de solubilidad en la bilis I. PRINCIPIO Para controlar la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en presencia de sales biliares, en un tiempo y con una temperatura especificos. Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, cap. 32) A) Se utiliza especificamente para difere! ciar entre el Streptococcus pneumoniae soluble en bilis y otras especies de Streptococcus alfa-hemoliticas no solubles en bil Puede ayudar a la diferenciacion del Haemophilus influenzae y el H. aegyptins solubles en bilis, de otras especies de Haemophilus insolubles en bilis, B) IIL. BASES BIOQUIMICAS Las sales biliares son sales sddicas de los cidos biliares sintetizadas de un compuesto comuin, el colesterol."" Downie y col."® sepa- raron los dciclos biliares en dos categorias: 1) Acidos no combinados cuyos diversos tipos solo difieren en su estructura quimica; 2) Jcidos coleicos, que son compuestos por adicion del acido desoxicélico y que varian de acuerdo con el tipo de agregados que se producen. Las sales biliares son dcidos biliares conju- gados con aminoacidos por medio de liga duras amidas (C=O) entre el grupo carboxi (COOH) del cido y el grupo amino (NH) de la_glicina_ (NH,CH,COOH) o Ia taurina (NH,CHsCH,SO3H).4 I aminoacido taurina deriva de otro aminoacido, la cist y su forma conju- gada con el Acido célico se denomina acido taurocélico. El acido célico conjugado con la glicina recibe el nombre de seido glicocélico, HOw coon eng oH Acide eslico chuig oo, Gomenason HO: . WW ‘ OH Acido taurncsitien22 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias El dcido desoxicslico es un dihidroxiteido; el acido célico y el taurocélico son trihidroxi- Acids. Todos los acidos biliares tienen un nticleo biisico comin, el anillo ciclopentano: perhidrofenantreno.® Ania cclopentane: pethidrolenanteeno Las sales biliares que carecen de grupos oxhidrilos (OH) son inaetions, mientras que las sales del acido desoxicélico, un compuesto dihidyoxi con grupos oxhidrilos en los carbonos 3 y 12, son mis activos que los trihidroxi- Jos, colico_o wurocélico, que poscen grupos oxhidrilos en los carbonos 3,7 y 12 del nicleo basico." Downie y col." afirman que la lisis rapida del S. prenmoniae por los cidos biliares esta relacionada con el ntimero y posicién de los grupos oxhidrilo y su capacidad para formar compuestos de adi- Anicas. Las sales biliares utilizadas en las pruebas de solubilidad en bilis son, por lo general, desoxicolato de sodio 0 taurocolato de socio. ya que estos dos son los compuestos liticos mis activos entre los diversos dicidos.biliares. Estos se encuentian como aniones cuando estin en un pH alealino, y por ello se los denomina sales biliates." El desoxicolato es un dcido monobasico que tiene un pH. ligeramente alcalino cuando esta en soluciin acuosa tal como una sal sddica.' Las sales biliares hacen descender ka tensién superficial en ke interfase medio-membrana!!! y también provocan una descompo- sicién de ka membrana celular." Sin embargo. este descenso de la tension superficial no es la linica causa de lisis del S. pneumoniae; intervienen otros mecanismos no aclarados.'"!1 ELS, pnewnoniae produce una enzima in lular autolitica (autolisina) que hace que el organismo sulra una autdlisis rapide (lisis) cuando es cultivado en un medio atifi- cial 1-821 Mair,"® Downie y col!” y Bus rrows y Moulder * afirman que el papel de las sales biliares es acelerar el proceso autolitico natural; los acidos biliares se combinan con as células neumocécieas y las alteran de manera que la enzima autolitica es activada." Downie y col.!® asevéran que las sales biliares aparentemente no lisan las células neumocicicas si esti ausente la autolisina natural; ambos procesos son similares." Goe- bel_y Avery ™ sefialan, no obstante, que la accién de las sales biliares es independiente de la enzima autolitica Burrows y Moulder,* Gowan y Steel? y Dubos v Hirsch " aseguran que si-un cultivo de S. pnewnoniae es destruido por el calor (65° C. 30 min) inactivando la enzima autoli- fica, no se produce la lisis ni naturalmente ni por aclicién de sales biliares. Dubos y Hirsch afirman que la activacién por las sales biliares, de la enzima autolitiea, que se_ produce naturalmente, se debe a la alteracion o a la extraccién de un inhibidor autolitico normal de las células neumocécicas. Goebel y Avery hallaron también que ka autdlisis normal por el S. pneumoniae puede ser inhibida si se emplea una alta concentracién de sales biliares para la prueba de solubilidad en bilis. También pueden emplearse aur de sodio, dodecilsulfato de sodio y otros detergentes que hacen descender la tensién superficial para lisar el 8. pneumoniae: 1 sin embargo, el laurilsulfato es menos especifico que el desoxicolato de sodio."* Leifson ® dice que en algunos experimentos preliminares hay indices de que otros organismos, adenuis del S. pnermoniae, son solubles en el desoxicolato de sodio. sulfate IV. REACTIVOS EMPLEADOS A) Desoxicolato de sodio 0 taurocolato de sodiv (10 %). 1. Productos que existen en el comercio. aw BBL: reactivo desoxicolato.* b) Difco, 1) Desoxicolato de sodio* 2) ‘Taurocolato de sodio* El extracto comercial de bilis de buey (BBL, Difco) es bilis deshidratada que puede ser reconstituida, pero se prefiere el desoxicolato! 2. Método de preparaci6n. a) Pesar una cantidad de sal biliar, 10 g/100 ml (concentracién 10 %). y csp. 100 ml.con agua destilada. ‘Ambas sales biliares son Cicilmente solubles en agua destilada." 1) Desoxicolato de sodio: solucion incolora.® 2) Taurocolato de sodio: solucién color dimbar clavo* b) Las sales de bilis comerciales son. neutras (pH: 7) y no requieren ajuste del pH# Las sales biliares deshidratadas que se encuentran en el comer:son equivalentes a la bilis fresca y se las prefiere porque pueden ser esterilizadas y controlarse el porcentaje.® B) Rojo de fenol indicador del pH. 1. Alealino: color rojo rosado. 2. Acido: color amarillo. C) Hidréxido de sodio (NaOH), 10 N (40%). 1. Ingredientes. a) Hidréxido de sodio, libre de carbonato. RG. 40 g b) Agua destilada 100 ml 2. Método de preparacion. a) Pesar ripidamente el hidréxido de sodio y disolver en menos ce 100 ml de agua destilada en un vaso. Este reactivo es muy higroscépico. b) Colocar el vaso en un bao de agua circulante para controlar la temperanura ©) Enfriar y traspasar la solucién de hidréxido de sodio a un trasco volumétrico de 100 ml y agregar agua destilaca c.s.p. 100 ml d) Guardar en un frasco para reactivos de vidrio cubierte con parafina 0 polietileno. e) Rotular correctamente. EL hidroxido de sodio es sumamente ciustico y por eso debe evitarse el contacto con la piel para prevenir quemaduras D) Hidréxide de sodio, 0.1 N. 1. Ingredients a) Hidréxido de sodio, 10. N 1 ml b) Agua destilada, agregar hasta un total de 100 ml 2. Método de preparacién. a) Por medio de una pipeta. trasteriy 1 ml de una solucion de NaOH 10 N a un frasco volumétrico de 100 ml, y es.p. L00 ml con agua destilada b) Rotular correctamente. E) Solucién fisioligica estevil (CINa al 0,85 %), Solubilidad en la bilis 23 Control de calidad: Todos los reactivos deben ser controlados con ciltivos positives y negativos antes de ponerlos en uso. S. pneumoniae soluble en bilis. Otras especies dle Streptococcus: insolubles en bilis. Conservacion: Guardar todos los reactivos en un refrigerador (4° C) mientras no se emplean. Su estabilidad es variable; por lo tanto, periddicamente se hara un control de calidad, desechando los que muestran una reaccién negativa 0 débil con un organismo positive conocido. Vv. METODO Inéculo bacteriano-medios de crecimien- to: dos selecciones, 1. Pla ¢ de agar sangre (5 @ sangre de nero). a) Incubar a 35° C. b) Frasco bujia para aumentar el CO. Qa3s@, ©) Ra Wh. 2. Caldo de Todd-Hewitt®” a) Incubar a 35° ©, 18 a 24 bh. b) Centrifugar y desechar el sobrenadante." Método de utilizacion. 1. Preparar una suspension eypesa de un cultivo pmo, en 1 ml de solucié fisiol6gica normal (CIN2). 2 Agregar 1 gota cle! indicador del pH rojo de fenol y aduptar el pH a7 (rosaclo) agregando algunas gotas de NaOH 0.1. Si es necesario. Dividir ka suspension de bacterias salina neutra en dos tubos (0.3 mr tubo). Rotukar uno como prucha, cl otro Como cautrol. 4. Agregar 0.5 ml de desoxicolato de sodio (0 taurecokato de sodio) al 10.% al tubo mareado prucha 5. Agregar 0.5 ml de solucién fisioligica normal estéril al tubo mareado contvel 6. Agitar suevemente los dos tubos para lograr Ia suspensién de las bact 7. Incubacic a) A 37° Cen incubador 0 bate de agua. b) 3h, controlande cada hora.24 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias 8. Observar cuando empieza a ackararse, lo que debe ocurrir dentro de las 3b En lugar de ka suspension en solucidn fisioligien puede usarse wn cultivo de organismos en crecimiento activo, pero dehr ser amortiguaclo 7 FI aldo de Todd-Hewitt contienc glucosa, vel aicido producide por los Organismos metabolizantes hace que el medio sea demasiado acide para detectar la solubilidad en ki bilis si se emplea sin amortiguar. Fl pil del medio no debe ser mais sicido de 6. VI. RESULTADOS \y La fotografia en colores de los resultados puede verse en la Figura 3-1 (Apéndice 1) VI. INTERPRETACION A) Soluble en bilis. 1. Soluci6n clara 0 ackaraindose (bilis — B) disuelta) 2. S. pneumoniae. B) Insoluble en bilis, 1. La solucién se mantiene turbia (nebu- losa). igual que el control 2. Especies e-Streptococcus tt otro orgas nismo, VIII, PRUEBA RAPIDA: TEGNICA EN PLACA A) Método de Hawn y Beebe." B) Resultados (a los 30 min). ©) Método. 1. 18a 24 h de crecimiento en placa de () agar con 5% de sangre de carnero. a) Sospecha de S. purwmoniae b) Colonias bien aisladas D) 2 Agregar, con un asa de inoculuci6n, una gota de desoxicolato al 2% (pH: 7) directamente sobre una colonia aislada, 3. Incubacién. No invertir la placa; de- jarla. descubierta. 35° C. 30 min, a) Soluble en bilis. i La colonia se desintegra, Deja un iirea parcialmente he- molisada en el medio de cultivo donde. se encontraba la colonia. Insoluble en bilis: ft colonia se mantiene intacta Antes del agregado de la sal biliar, marcar un circulo alrededor de la cole con tinta china sobre el fondo de la cipsula de Petri para ayudar a localizarla despues dela prucha b) IX. PRECAUCIONES Siempre deben usarse los tGrmines soluble © insoluble para la interpretacion de las pruebas de solubilidad en bilis, No usar positive (4) 0 negativo (—) para indicar los resultados. Una reaccion positiva no es stficientemente explicativa; puede significar que el organismo cs soluble en hilis o simplemente que muestra ereci- miento pero no tiene accién con las sales biliares. La prueba de solubilidad en bilis se utiliza tinicamente para diferenciar entre las especies de a-Streptococcusy 8. pneumoniae. Sin embargo, cuando hay duda en cuanto al modelo hemolitico que presenta wn posible especie de Streptococcus, efectuar la prueba de solubilidad en bilis, A menudo ¢s dificil diferenciar lay especies de a-Stieptororcus vy S. pretinoniae por su morfologia con kr coloracin de Gram 0, por la miorfologia de su colonia y. por lo tanto, reguieren pruebas adicionales para su dilerenciacién (pruebas de solubilidad en bilis y/o de sensibilidacl a la optoquina). Sin embargo, el S. pneumaniae y todas las especies de Streptococcus son catalasa negativos. y esta determinacion se hava antes de realizar la prueba de solubilidad en bilis. La Tiss por el taurocolato de sodio comercial resulta, a menudo, variable: la sal biliar de mayor actividad litica es el desoxicolato de sodie." reaccidn insoluble en bilis puede ser mada con el agregado de una gota de dileali diluido (NaOH 0,1 N)21 Wilson \ Miles °t afirman que existen dudas en cuanto a que la solubilidad en un pH alealine dependa completamente de las sales biliares puesto que el aleali solo, agregado a una suspension de S. pnewno- nie, ocasiona la lisis de los cultivos mas recientesE) Si se emplea para la prucha de solubilidad en bilis un caldo de cultivo amortiguado, evitar un cultivo demasiado denso: los fragmentos celulares podrian impartirle una cierta turbiedid que ocul- laria una reaccién soluble. F) Downie y col." sostienen que las variaciones en la reacci6n de solubilidad en bilis del S. pneumoniae puede atribuirse, a veces, a pérdida del factor de virulencia la cipsula, que puede provocar una alteracién en ki susceptibilidad del organismo a la lisis por las sales biliares. Downie y col." afirman que la tempera- Tura tiene efecto sobre la propiedad. autolitica natural del S. pnenmaniae ¥ la lisis efectuada por las’ sales iliares Goebel y Avery aseguran que la lisis se produce lentamente a 0% C, pero que ki velocidad aumenta a mavor temperatura La velocidad de Ia lisis aumenta has que ka temperatura Hega a 37° Cv luego disminuye a medida que la temperatura se eleva hasta 45°.” Wilson v Miles *! sostienen que la concen- tracién de sales de las suspensiones bacterianas afecta la solubilidad en bilis del S. pnewnoniae: el agregado de sulfato de magnesio favorece la lisis: por las sales biliares. Segin Falk y Yang." la concentracion de los cloruros: monova= lentes es importante: ka lisis es inhibida cuando se encuentran en alta concentra- o H) Solubilidad en la bilis 25 cién (2. a4 %). Sin embargo, Anderson y Hart" hallaron que existia una relacién reciproca entre la concentracion de las sales biliares requerida para la isis.» la concentracion del cloruro de sodio pre sente en. la suspension bacteriana, EL cloruro de sodio no daba muestras de inhibir la lisis, yal mismo tiempo. en ausencia de sal Se procucia la lisis.. No obstante, a medida que aumentaba la concentracion de sal) (hasta el van disminuia la concentracién de ka sal biliar necesaria para producir la lisis.! 1) Cuando se realiza la prueba de solubilidad en bilis utilizando un caldo de cultivo metabolizante activo o solucién fisioldgica. es esencial adaptar el pH aun punto neutro (7) antes det agregado cle kas sales biliares.* © EL desoxicolate de sodio, si se encuentra en una suspensidn dicicla, puede formar un precipitade o gel que dé por resultado una false reaccidn insoluble: *?" con un pH ce aproxina- damente 6.3. se forma un precipitado Acido. J) Si la solucién no se ackara al término de 3h de incubacién, el organismo es insoluble en bilis. Las especies de Haemophilus-e-hemoliticas tambien son solubles en bilis v Branson! recomienda que se ineuben los ttbos por lo menos 2h si en ellos se encuentran Harmophilis. K) BIBLIOGRAFIA Anderson, A. B., and Hart, PD. A (1934b) The lysis of pneumocacei by sodium deoxycholate. Lancet, ti, 359, 8 9 Difeo Manual, Sth ea., Detroit; Difco Laboratories, 1963, p. 287 Difeo Supplementary Literature, De- 2 Bailey, R. W., andScott, E.G, Diagnos- __troit; Difeo Laboratories, 1968, pp. 81 tie Mterobiology, 2nd ed., St. Louis: C. and 411, V. Mosby Company, 1966, p. 118. 10. Downie, A.W., Stent, L., and White, & 3. BBL Manual of Products and Labora. M. (1913) The bile solubility of pnewmo- tary Prasthiregs BE oA Geter, eoeeta, with metal release a Md.: Division of BioQuest, Division of ghemical structure of various bile salts. Becton, Dickinson and Company. 1968, ‘BY. J, Exp. Pathol, 12, 1 pp. 147, 161, and 170 11, Dubos, R.J., and Hirsch, J. G, Bacterial 4. Branson, D. Methods in Clinical Bacteri- and Mycotic Infections of Man, 4th ed., ology. Springfield, Ill: Charles © Philadelphia: J.B. Lippincott Com: ‘Thomas, Publisher, 1972, pp. 9-10 pany, 1965, p. 92 5, Burrows, W.,.and Moulder, J. W. Text 12, Falk, I.8., and Yang, S. 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Tox pley and Wilson's Principles of Bacteriol- ‘ogy and Immunity, Vol. I, th ed., Bal more: The Williams & Wilkins Com- pany, 1964, pp. 727-728,Pruebas de fermentacién de los hidratos de carbono I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de fermentar (degradar) un hidrato de carbono especifico incorporado a un medio basico, produciendo icido, 0 acido con gas visible. Il. OBJETIVO (Véase también Ia Seccién III, caps. 32 a 34) A) Las formas de fermentacién son general mente caracteristicas para grupos 0 especies bacterianas especificas. 1. Que fermentan la glucosa: todos los miembros de las Enterobacteriaceae. 2. Que fermentan la glucosa y la lactosa Escherichia coli, Klebsiella’ y grupos Enterobacter. B) lar a la diferenciacién entre los géneros: Listeria monocytogenes (salicina A) de especies de Corynebacterium (saliei- na ~). ©) La forma de utilizacion de los hidratos de carbono puede ayudar a la diferenciacion de las especies 1. Aeromonas punctata (vafinosa A) de otras especies de Aeromonas (rafinosa —). 2. Neisseria lactamica (lactosa A) de-ouras especies dle Neisseria (lactosa ~) Proteus rettgeri (inositol A) del Proteus morganii (inositol —). 4. Providencia alcaligenes (adonitol A. inositol —) de ka Providencia stuartié {adonitol —, inositol A) Staphylococcus aureus (manitol A) del Stapntocacus chierids (anit =) 6. Streptococcus. salivarius w Streptococcus sanguis (inulina A) de las especies de Streptococcus del grupo D (inulina = 7. Yersinia enterocolitica (sacarosa A) de ouras especies de Yersinia (saearosa —) Ill, BASES BIOQUIMICAS Los hidratos de carbono se clasifican como: 1) monosaciiridos, aldehidos polihidroxilicos © cetonas: 2) polisacitridos w oligosaciiidos, productos de condensacion de-dos 0 mis monosacaridos (polimeros de los monosici- ridos), 0 3) alcoholes polihidricos v eiclitoles {inositoles), productos de la reduecisn cle los monosacaridos.® Un monosacarido © anicar simple esti compuesto generalmente por I a 6 carbonos: eritrosa, un azticar con 4 carbonos (tetrosst: C,HxO,): ribos bulosa, xilosa va INOS, aaiicares con 5 carbonos (pentosa: CH Os). glucosa (dextrosa), fructosa (levulosa), galac~ tosa. vo manosa, azticares con 6 carbonos (hexosa: Cab yOn).™ Entre las pentosas, ta xilosa, fa ribosa y ka arabinosa son aldosay mientras que kt ribulosa es una cetosa.!® Los compuestos hexosas, glucosa, galaetosay manosa, son aldosas vo la fructosa es una cetosa." Los disaciridos (CHO) son polisacsi- ridos. (oligosacaridos) compuestos por dos.28 Pruebas bioquimicas para la idemtificacién de bacterias unidades de monosaciridos, glucosa, mas otro monosacarido. Sai sar glucosa + fructos Maltosa + 2 unicadles de glucosa Lactosa + glucosa + galactosa Glucésido es un término general que designa a un disacarido, sin tener en cuenta el anticar que contenga.”” EI trisactrido rafinosa (CHO) esta compuesto por tres monosaciridos: glucosa, fructosa y galactosa, Un ejemplo de polisacirido es la inulina que esti formada por muchos polimeros del monosacarido fructosa. Los alcoholes que colectivamente reciben el nombre de “azticares”* ® son el adonitol, dulcitol, manitol y sorbitol; todos son alcoholes polihidricos que son’ productos de la reduccién de un monosacirido.® Chucosa reduecion sorbitol (alcohol hexahidrox’) El compuesto inositol es un sustrato organico que no es un hidrato de carbono.* Los polisacaridos, trisacaridos y disaciridos son demasiado complejos para entrar en una célula bacteriana para su degradacion. Si uueden ser metabolizados por una especie acteriana determinada, primero son catabo- lizados en monosacaridos menos complejos por enzimas exocelulares (permeasas) de manera que puedan penetrar en la célula La fermentacion es un proceso metabdlico de oxidacin-reduccién anaerébico en el cual un sustrato orginico sirve como el aceptor de hidrégeno final (aceptor de electrones) en lugar del oxigeno2” La fermentacion de sustratos orginicos como los carbohidratos dan tanto productos finales reducidos como oxidados? El tipo de productos finales producides por la fermentaci6n de los hidratos de carbono depende de varios factores: 1) el tipo de organismo que lleva a cabo el proceso de fermentacién; 2) la naturaleza del sustrato que debe ser fermentado, y 3) a veces, los factores ambientales como la temperatura y la acidez.2" Los productos finales de la fermentacion de los hidratos de carbono y los alcoholes, denominados colectivamente “azticares”,** #1 son pocos: dos gases, hidrégeno y anhidrido carbénico; algunos pocos sicidos algunos alcoholes, y una cetona."* ‘Algunas bacterias pueden fermentar anae- robicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden metabolizarla por ambos métodos, mientras que otras, atin, son inca paces de utilizar la glucosa. No todos los monosacaridos son degradados por todas las especies bacterianas; sus formas de fermentacion difieren, ayudando a la identificacion del grupo, género 0 especie. Asimismo, las bacterias muestran diferencias en los ciclos utilizados para la fermentacion del_mismo: sustrato,"” dando como resultado diferentes productos finales. La forma y el grado en que €s desasimilado un sustrato depende de la especie bacteriana y de las condiciones de cultivo, El ciclo de fermentacién que produce como roducto final el acido lactico es el proceso de jermentacién mas difundido. Sin embargo, se producen otros ciclos de fermentacion, que difieren con respecto al sustrato metabolizado o la naturaleza del producto final producicdo.” Gon la utilizaci6n de las pruebas con los hidratos de carbono podemos obtener mode- Jos de fermentacion de uma determinada especie bacteriana observando: 1) la ausencia’ de glucésidos, y/o 2) la ausencia de mone- sacaridos en disacaridos, trisacirides y polisa- Jridos mas complejos,” que muestran que tx glucosa ha sido metabolizada Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono son por lo general anaerobios facultativos.® Por medio del proceso de fermentacién, un hidrato de carbono es degradado (0 fermentado) y descompuesto en dos moléculas de carbono triosas ™ que son nuevamente degradadas en un ntimero de compuestos de 1, 2, 3 y 4 carbonos* Los productos finales varian con cada especie acteriana, y depende del sistema enzimatica existente en la especie y las condiciones det medio ambiente. Sin embargo, el criterio importante es que antes de la descomposicion del aziicar glucosa, ésta es fosforilada en un compuesto glucosa 6-fosfato® La fermentacion requiere un compuesto organico como aceptor de electrones terminal. EI mas importante ciclo fermentativo de la degradacién de la glucosa es el ciclo de Embden-Meyerhof, aun cuando también ella puede producirse por la derivacién pentosae el ciclo de Enmer-Doudoroff 0 en combina- cin con ellos. No obstante, los tres cicles requieren la fosforilacién de la glucosa como’ paso inicial antes de que pueda producirse bx degradacién, El acido pirtivico (CHs;CO.GOOH) es ef intermediario clave en la degradacion de bi glucosa, y la desasimilacion del acido pirtvico pee por se diferentes que forman una variedad de productos termiJivido 6-fosfogucdnice Derivacion pentosa nah ribulos . CO: icido pinion nol 0; Fermentacién de los hidratos de carbono 29 ha glucers. ————__+ glucosa G:tosfia lo de Embden-Meyerhof 1 Fructos Gefostato fructoss LGedilostiae i 2 moles glieeraldlehide S-lostite, 2 moles divide pinivieo Ciclo de Entner-Doudoroff fiido 8 cota t-desoxi-6-fosfingluconico, gliceraldehide 3-fostiato a través del Ciclo de /Embden-Meyerhof 2 moles de sicido pirtivico Tres cielos de Jermentacién fasforitada nales caracteristicos de las fermentaciones bacterianas.* Como consecuencia de ki oxidacidn los monosaciridos son catabolizacos en fcido pintivico a waves de una de procesos graduales, en cid uno de los cules Interviencn ensimas especificas, Una bueter puede utilizar diferentes cielos para format ‘icido pintivico. y ch el mismo organismo puede ocurrir simuliincamente mais de un cielo” serie Los productos finales caracteristicos de la fermentacion baeteriana son: 7 Ly steicto lictivo: 2) aicidos acético v formico: 3) deido lictico v alcohol etilico (etal; 4) alcohol ctilico (etanol): 5) acetilmetilearbinel (acetoina)_y COs: 6) acide suceinico a acide propidnico v COz: 7) COs ¥ acetona a alcohol tsopropilice (isopropanol): 8) acido butirieo a alcohol butilico (butanol). (Véase grafico en vigina siguiente.) Existen distintas clases de fermentacion producida por las bacterias, y cada una depende de los productos finales caracteristicos formados. Segtin la mavoria de los autores. Jos grupos mis importantes. de bacterias muestran uno de los cinco tipos principales de formas de fermentacién Fermentacién alcohélica Chicos + 2 eranal + CO, En la lamada fermentacién alcohdli las bacterias alcohdli s degradan a la glu: cosa en Acido pinivico siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhol? Fermentacién del acido lact 0 Las bacterias que producen dicido lictico pueden ser divididas a su vez en dos subgrupos: fermentacoras homolicticas. y heterokicticas Tas hacterias homolicticas © simplemente licticas "degrada la glucosa por medio del ciclo de Embden-Meverhol, casi exciusiva- mente en el producto final, dicido le tic 1% con vestigios tinicamente de otros productos finales," Las fermentacoras heterokicticas, a las que a veces se denomina fermentadoras del dcido lictico mixtas© "pueden. catabolizar la glucosa por medio de uno a tres cielos de degradaciom (Embden-Meyerhof, derivacién pentosa, © proceso de. Entner-Doudoroff) * para dar productos finales caracteristicos: acido lictico mis dcido acético y acidos formicos, alcohol etilico, COs, "7 y a veces. glicerol." Una sola especie bacteriana puede mostrar fermentacién acida tanto homolactica como heterolactica. El factor de control es influido por el pH y el sustrato presente para la actividad bacteriana.? Fermentacién del acido prop nico El principal producto final del dcido pirtivico es el sicido propisnico (propionato) y30 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias Hidrato (isacirido, trisa de carbono \cirido, polisacarido) 4 CoH 20s Glucosa 4 CH,COCOOH éinterm clave} ‘Acido piriivico HOOCCH,CH,COOH ‘Acido succinico 1 CH,CH,COOH + CO, ‘Acido propisnico CH;COCHOHCH, + CO, -— ‘Acetilmetilcarbinol m CH,CHOHCHOHCH, 2,3-butilenglicol CH,CHOHCOOH Acido lactico CH,COOH + HCOOH Acido acético Acido formico ii H; + CO, CH;CHO + CO; —— “‘Atetaldehido cx,ch.on Alcohol etilico Acetileoenzima A a CH, C— CH,COOR Acido acético CH:COCH,COOH ‘Acido acetoacetion CH.COCH, | | | CH,CH.CH,COOH CO, + ier Acido butirico | CH,CHOHCH; CH,CHOHCH,COOH — CH,CH.CH.CH.OH Alcohol isopropilico Acido g-hidroxibutirico Alcohol butilico CO, a través del dcido succinico, aun cuando puede producirse acido acético.' 17 $ (> aceraldehido — acide acético Acido pirtivico L__. scio succinico — acido propis- ico + CO, La fermentacién propiénica es llevada a cabo por los organismos anaerdbicos.” Fermentaciones del grupo coliforme A_ menudo se hace referen coliforme como fermentadores tos," *” fermentadores del 4cido férmico,"* 0 bacterias_ colon-disenteria-tifoidea (grupo CDT). "La fermentacién acida mixta es, caracteristica de los miembros de las Entero- bacteriaceae y estos organismos degradan la glucosa con la formacion de una variedad de productos finales. El grupo coliforme puede ser subdividido en dos categorias: 1) las que producen diversos productos acidos mixtos, y 2) las que producen butilenglicol como prindpal producto final. El tipo o las combinaciones y cantidades* del producto final producido dependen del género o Ia especie en estudio."” Los microorganismos acidos mixtos producen los siguientes productos: dcidos {6r- mico, acético, lictico y succinico; etanol, y COs y Hei pero no butilenglicol, (butanediol). % #°EL alcohol es formado por la fermentacién alcohdlica; el acido lictico, el 4cido acético y el CO; son formados por la fermentacién lactica a uavés de la dism: tacién del acido pirtvico.* En la dismutacién es reducida una molécula de acido pirtivico, dando Acido lactico, y la otra molécula es oxidada formando dcido acético y CO,Entre las Enterobacteriaceae, la E. coli muestra este tipo de fermentacién® 2 moléculas de acide pinivico = acide avético + “+ acido lictico + CO, EI segundo grupo est4 formado por los ismos cuyo principal producto final es el butilenglicol."""™ Entre las Enterobacte- riaceae, los gruposKlebsiella-Enterobacter muestran este tipo de fermentacién. Fermentacién del alcohol butilico La fermentacién del alcohol butilico es efectuada por bacterias anaerébicas como el Clostridium.’ Los diferentes productos finales formados son acido acético, acido formico, etanol, acido butirico, alcohol buti- hico, acetona, alcohol isopropilico, y una gran cantidad de COge Hz." La combinacién y cantidades de los productos finales formados dependen del género y la especie Bacterianos.”” Algunos organismos producen rimariamente acide butirico y acético, CO, y 2, mientras que otros producen butilenglicol, acetona, y alcoholes butilico ¢ isopropilico."* Sin embargo, no hay formacién de Acido lactico. IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Caldo bisico rojo de fenol, pH: 7,45 # 1. Ingredientes. a) Peptona (proteosa 0 digesto pancreitico de caseina) Wg b) Extracto de carne (opcional) log ©) Cloruro de sodio (CINa) 5 og d) Rojo de fenol 0,018 g ©) Agua destilada 1.000 ml 2. Indicador del pH, rojo de_fenol. a) Acido: color amarillo, pH:6.8. b) Alcalino: color rojo rosado, pH:8.4. ©) Medio no inoculado: 1) pH1:7,4; 2) color anaranjado rojizo. Productos comercial a) Difco. b) BBL. 4. Método de preparacién, caldo basico rojo de fenol, a) Pesar exactamente las cantidades como se indica en el prospecto. Los productos de diferentes labo- Fermentacién de fos hidratos de carbono 31 ratorios pueden variarligera- mente. b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. ©) Calentar suavemente hasta diso- lucion. 5. Método de esteril rojo de fenol. a) Autoclave. b) 121°C, 15 libras, 15 min. 6. Enfriar a 45-50° C en baiio de agua, 7. Método de preparacidn, hidratos de carbono. a) Pueden utilizarse diversos hidratos de carbono. La baterfa usada depende de las dificultades que se presenten para identificar un or: ganismo determinado. b) Por lo general, utilizar de 8 a 10 auticares. Los que se emplean con mis frecuencia son: 1) glucose actosa; 3) sacarosa; 4) manitol; 5) dulcitol; 6) salicina; 7) adonitol: 8) inositol; 9) sorbitol; 10) arabinosa; 11) rafinosa; 12) ramnosa; 13) xilosa; 14) trehalosa; 15) celobiosa; 16) galactosa; 17) inulina; 18) fructosa (azticar invertido); 19) melibiosa. c) Concentracién de azticares en el caldo basico. 1. Agregar a alicuotas de la base preparada, los hidratos de carbono que se desee. a) Salicina, 0,5 % b) Todos los demas, 1 % 2. Preparacién de las concentraciones de azticar, dos métodos, a) Agregar directamente el aziicar ala base en la concen- tracién deseada, por ejemplo 10 g de aziicarflitro de base para una concentracién final del 1 %. b) Preparacién de soluciones de azticar. Preparar una concentracién del 5 0 10 % del aziicar deseado en agua destilada. Solucién al 5 %: 5 g/100 ml. Solucién al 10 %: 10 g/100 nil. Agregar la solucion de azi car a la base para obtener una concentraci6n final deseada de 0501 %2 0,5 %/litro: Colocar_100-ml—__ de una solucion al5 %enun § frasco volumétrico de un ion, caldo basico32 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias litro y agregar caldo basico ar su posible descomposicion. rojo de fenol c.s.p. 1.000 ml 9. Enfriar antes de su empleo y refrig Mezclar bien. ur para. su conservacion (4-108 C) 1 %/litro: Colocar 100 ml 10. Inoculacién. de una solucién al 10% en a) Crecimiento de un cultive pura de Métodos de est co de hidratos de carbone. a) Filtracion (recomendada como el un frasco volumétrico de un litro y agregar caldo_basico rojo de fenol cs.p. 1.000 ml Mezclar bien. rilizacion, medio baisi- método de cleccién). 1. Método del filtro de membrana (Millipore). 2. Membranas, poros de 45 ps de dliimetro. Asépricamente, tubo de aproximadamente 4 a 5 ml/tubo es- tivil. 4. Unicamente al uabo de glucosa, introducir un tubo de Durham estén. a) Posicién invertida. b) Detects la produccién de gas Autockive, dos métodos alterna- tivos 1, Método de preparacién. a) Agregar a alicuotas de la base de rojo de fenol preparada no esterilizada, los hidratos de carbono individuales cle- gidos. b) Tubo de hidrato de carbono (medio basico) no esterilizado, 45 mlftubo. ©) Unicamente a los tubos de Blucosa, agregar tubos de Dur- ram invertidos. 2, Método 1: 116-118° libras, 15 min.* a) Algunos hidratos de carbono soportan la autoclave sin descomponerse 0 con pocas alteraciones. b) No se aconseja someter a autoclave durante 15 min. a los siguientes hidratos de carbono? ? 1) lactosa; 2) sacarosa; 8) salicina; 4) xilosa; 5) arabinosa; 6) trehalosa; 7) maltosa. 3. Método 2: 121°C, 15 libras, 3 min. a) Utilizado cuando el ele~ mento tiempoes fundamental b) Debenefectuarscloscontro- les antes de su utilizaci6n con. fines diagndsticos para contro- » 1a 12 18 a 24h (AHK 0 cualquier otro cultivo conveniente). b) Inéculo expeso 1. Puede inocularse una bateria de hidratos de carbono con un solo inéculo. 2. Métodos de inoculacién. a) Con hisopo, Pasar el hisopo sobre el crecimiento de un cultivoen AHK u otro conveniente. El hisopo se habra humedecido previamente con solucién fisiologica 0 caldo estéril si el cultivo se ha efectuadoen un medio solido. Asépticamente, pasar el hisopo contra un costado de cada uno de los tubos con hidratos de carbono, por encima del nivel del liquide. Inclinar el tubo para que se incorpore el inéculo. Sacudir suauiemente cada tubo. No dear que el liquido salpique la tapadel tubo (cierre de metal. b) Con aguja o asa de inocu- lacién, Pasar la aguja 0 el asa sobre el crecimiento de un cultivo AHK u otro conveniente. Si se trata de un caldo de cultivo, utilizar un asa de inoculaci6n. Asépticamente, introducir la aguja o el asa en cada uno de los tubos de hidrato de carbono. Agitar suavemente cada tubo. Nodejarqueel liquidosalpique la tapa del tubo (cierre de metal). ©) General, cualquier método de inoculacién. Por lo comin es suficiente un solo inéculo para inocular una bateria de 8 a 10 hidratos de carbono. ‘Cuando se inocula una bateria, no hay necesidad de pasar la llama entre cada inocu- acion. ‘Cuando se utiliza una aguja asa para inocular una bateria con un solo inéculo, el traspasode aziicares de un tubo a otro es tan infimo que no hay problema de que un tubo contenga una mezcla de carbohidratos. Cuando se inocula una bateria no es necesario observar en forma apreciable el inéculo en cada uno de los tubos. Un solo indculo espeso tomado de un cultivo contiene millones de bacterias que son suficientes parainocular cadatubocon un nuimero apreciable de bacterias necesarias para que se produzca el metabolismo. Sin embargo, cuando se prueba una gran bateria de hidratos de carbono, por ejemplo, 15 a 20 aziicares, puede ser necesario emplear 2 a 3 indculos separados. En este caso, se pasara siempre por Ia lama la aguja o el asa antes de volver a introducirla en el cultivo. Si se utiliza un hisopo, se emplearé uno nuevo para cada recoleccién del cultivo. Estas precaucio- hes evitan toda posibilidad de contaminacién del cultivo, que podria necesitarse para otras pruebas 0 para subcultivos. a) Incubadora a 35° C. b) 18a 24h. Puede ser necesaria una incu- bacién prolongada. Puede ser necesaria una incu- bacién de hasta 30 dias para considerar negativo un resultado. B) Indicador del pH alternativo: indicador de Andrade modificado, pH:7,1 a 7,2." Utilizar en lugar del rojo de fenol en el medio de caldo con rojo de fenol. Se recomienda cuando se somete a los hidratos de carbono a una incubacién rolongada. ucion al 1 % a) Ingredientes 1. Fucsina acida .... 05g 2 Aguadestilada ... 100° ml 3. Hidréxido de sodio (NaOH) EN ..... 15-18 ml a) Hidréxido de sodio (10 N 040%), Hidroxido de sodio, libre de carbonato, R.G., 40 g. Fermentacién de los hidratos de carbono 33 b) Método de prepara eo. Agua destilada, 100 ml. Método de preparacion. Pe- sar ripidamente el hidroxido de so disolver en menos de 100 ml de agua destilada en una probeta. Este reactivo es muy higroscépico. Colocar la probeta en un bario de agua frfa circulante para controlar la temperatura. Enfriar_y trasferir la solu- cién de NaOH a un frasco volumétrico de 100 ml y agre- er destilada csp. 100 mi, Guardar en un frasco para reactivos de vidrio recubierto de polietileno o parafin: Rotular correctamente. EI hidréxido de sodio es sumamente catistico y por eso hay que evitar el contact con la piel para impedir quema duras dolorosas. b) Hidréxido de sodio (1 N 04% Hidréxido de sodio, 10 N, 10 ml. Agua destilada hasta un total de 100 ml. Método de preparacion, Ut- lizando una pipeta (tipo Pro o de bulbo), trasferir 10 ml de NaOH 10'N a un frasco volu- métrico de 100 ml y agregar agua destilada c.s.p. 100 ml, ‘i6n* ida en agua Disolver fucsina destilada. Agregar 15 ml de NaQH 1N 4%. Mezclar y dejar descansar a ta temperatura del ambiente (25°C) durante 24 h, agitando frecuentemente. El color rojo deberé wasformarse en un color castano. a) Si no se produce una deco- loracién suticiente, agregar 1 ml de NaOH (4 %). b) Mezclar y dejar otras 24 h. ©) Puede ser necesario el agregado de més alcali hasta obtener el color amarillo pajizo requerido. Evitar la adicion excesiva de NaOH. Agregar gota a gota hasta alcanzar el Color deseado. 4. Método de empleo34 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias a) Preparar 1 litro de medio basico de caldo de hidrato de carbone, pero omitir cl indicador de pH rojo de fenol. b) Agregar al anterior 10 ml de indi eador de pH de Andrade (en concentracién del 1%)" ©) Ajustar el pHa 7.1 a 7.2 con NaOH 1 NA d) Agregar el hidrato de carbone elegido (véase la Seccién 1V.A.7,¢ hasta A.9) ©) Continuar de la misma manera que si se utiliza un medio con rojo durante 20 min.* 1) El medio de carbohidrato de An- drade es rosado cuando esti caliente, pero con el enfriamiento desaparece el color.® Reacciones de color de Andrade. a) Las mismas del indicador del pH. rojo neutro, b) Acida: rojo rosado, pH:5.* ©) Alcalina: amarillo a incolore* ©) Medio bisico semisélide con rojo de fenol, pH:7.5. 1, Ingredientes. a) Medio de caldo de hidrato de carbono con rojo de fenol. b) Agregar 0.4 % de agar.? El contenido de agar puede aumentar hasta el 0,6 % 1. Colocar el frasco de la mezcla agar-base-hidrato de carbono en un agitador magnético que contenga un elemento caldrico, 2. Mantener la temperatura en punto bajo. Agregar un magneto al frasco y mantener el medio en constante movimiento mientras se distribuye en tubos (4 a 5 ml/ tubo). 2. El medio basico semisélido con hidratos de carbono elimina el empleo de los tubos de Durham para la deteccién de gases. 3. Manipular de la misma manera que si se utilizara un caldo, con las siguientes excepciones a) Enfriar en posicién vertical antes de su uso. b) Inoculacié 1. Cuicamente con aguja de inocu- lacién, 2. Hacer la picadura hasta 0.6.cm del fondo de cada tubo. Evitar las picaduras cerea de las paredes del tubo. 4. Para los estudios de fermentacion de especies de Neisseria, agregar asépti- camente liquide ascitic estéril para favorecer el crecimiento Utilizando un indicador del pH con un determinado hidrato de carbone puede determinarse si_una bacteria ha degradado el mismo en varios productos terminales, observando un cambio de color visible en el medio Indieador de ph + CHO bit lucilis + H.CO,, aldehidos + cambio de color Pueden emplearse las pruebas de fermentacion de los hidratos. de carbone” para determinar qué productos terminales se han formado, pero no los cidos utilizados."! También el medio incorporado contiene otros componentes de crecimiento que pueden ser degradados, para dar diversos productos terminales similares a los producidos por la descomposicién del hidrato de carbono, y al mismo tiempo el organismo estd utilizando parte del carbono formado por la degradacion del carbohidrato para producir nuevas células."* El indicador del pH que se utiliza mas comtinmente para demostrar que un hidrato de carbono ha sido fermentado es el rojo de fenol, ya que la mayoria de los productos nales del metabolismo de los carbohidratos son acidos organicos. Con el rojo de fenol el cambio de color se aproxima al pH original del medio (cido pH:6,8, medio pH.:7,4). La peptona que se encuentra en el medio también es degradada por la bacteria presente y da sustancias que son de pH alcalino. El ido producido por la fermentacién de un hidrato de carbono se observa por un cambio del pH solamente cuando el acido producido por la degradacién del carbohidrato es mayor jue las sustancias alcalinas producidas por ilcgradaciGebies Secor Larbiearean de un cambio de color que indica acidez esta influida por dos factores: 1) el indicador del pH utilizado, y 2) las propiedades amorti- guadoras del medio.*V. RESULTADOS Los fotografias en colores de los resultados pueden verse en las Figuras 4-1 y 4-2 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES A) Medio de caldo con hidratos de carbono y rojo de fenol. 1.” Positivo. a) Acido (A), pH:6,8. b) Color amarillo, ©) Produccién de gas, variable. 1. Positivo para gas (G). a) Aerogénico: se encuentra CO; + Hi. b) Se observan burbujas de gas en el tubo de Durham, 0 el medio se halla completamente desplazado por el gas que deja una parte sin colorear en el tubo incluido. ©) Una sola burbuja en el tubo de Durham basta para registrar produccién de gas 4d) Registrar produccién de sci- do y gas (AG). 2. Negativa para gas. a) Anaerogénica. b) No se observan burbujas de gas y el medio del tubo de Durham se mantiene amarillo. ©) Registrar produccién de acido solamente (A), 2. Retardada. a) Color anaranjado. Si no se tiene seguridad, comparar con el tubo no inoculado. b) Volver a incubar. 3 Negativa. a) Alcalina. b) Color rosa-rojizo. B) Medios semisdlidos de hidratos de carbono con rojo de fenol Positiva. 2) Acida (A), pH:6,8. b) Color amarillo. ©) Produccién de gas, variable. 1. Positiva para gas (G). a) Aerogénica: se encuentra CO; + Hy. b) Deteccién de gas (por una variedad de medios segin la cantidad de gas producido). Burbujas de gas en todo el medio. Fermentacién de los hidratos de carbono 35 Una ligera muesca en el medio separada de la pared del tubo. El gas puede elevar el medio desde el fondo del tube dejando un espacio en blanco, Sise produce una gran cantidad de gas, cl medio puede llegar hasta la tapa del tubo. Desdoblamiento del medio. Una sola burbuja en el medio basta para registrar produc- cién de gas. Registrar como_produccién de Acido y gas (AG). 2. Negativa para gas. a) Anaerogénica. b) No hay burbujas de gas ni descomposicién del medio. ©) Se registra produccién de acido tinicamente (A). 2. Retardada. a) Color anaranjado. Si no hay segu- tidad, comparar con un tubo no inoculado. b) Volver a incubar. 3. Negativa. a) Alcalina. b) Color rosa rojizo, pH:8,4. G. Medio de caleo con hidratos de carbono con indicador del pH de Andrade. 1. Positiva.* a) Acido (A), pH:50. b) Rojo rosado. ©) Produccién de gas, variable. Véan- se las reacciones con el medio de caldo con hidratos de carbono y rojo de fenol. 2. Negativa® a) Alcalina. b) Amarillo a incoloro, VII. PRECAUCIONES A) Colectivamente los hidratos de carbono se denominan “azicares”. Sin embargo, muchos son en realidad alcoholes polih- dricos.* Cuando es un azticar propiamente dicho la terminacién es “osa” mientras que los'alcoholes terminan con “ol”. Por lo tanto, son ejemplos de azticares: lactosa, sacarosa, maltosa; mientras que dulcitol y manitel son alcoholes. Existen algunas excepciones, como en el caso del azticar salicina (glucésido) B) La concentracién de los hidratos de carbono incorporados en el caldo basico con rojo de fenol es comiinmente 1%;86 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias oO b) E) F) G con excepeién de la salicina (0.5). Se pueden usar concentraciones: de 0.5." con fudos los hidratos de carbone, pero se recomienda cl L@ porque esta concentvacion reduce la posibilidad de reversion Orr y Vaylor ® han Hlegado a la coneh- sién de que algunos tipos de peptona son inconvenientes para ki preparacién del medio con hidratos de carbon. En sus estudios, hallaron que la Shigella flexneri tipo 6, Newcastle y los bietipos Manche; ter. no producian icicle ni gas en ciertos lotes de peptona.”* El componente basico es la peptona de br caseina que debe estar exemta de hidratos de carbon que podrian ser fermentados.* Si no se dispone de un medio comercial deshidratade se harin controles con los lotes de peptona para determinar si son convenientes cuando se prepara inicialmente un medio con hidratos de carbon, Cook y Knox 7 recomiendan que el medio con hidratos de carbono esté exento de nitratos. porque su presencia interfere cn la produccion de gases. Hermann" recomienda evitar el agr gado de extracto de levadura, suero 0 Tiquido ascitico al medio con carbohidre- tos. Sin embargo, se ha recomendado la adicién de liquido ascitico. para demos- tar la capacidad de fermentacion de especies de Neiseria? EL agregado de extracto de levadura es optative: Difeo lo incorpora mientras que BBL no lo hace. y, sin embargo, ambos medios dan resultados idénticos. Cuando se utiliza el medio semisslide con hidratos de carbono, picar el medio con una aguja de inoculacion en el centro del tubo, hasta unos 0.6 cm del fondo, Hacer la picadura con suavidad ¥ no utilizar ef asa de inoculacion, Las maniobras brus- caso el empleo de este tiltimo elemento puede dar una false apariencia de pro: duccién de gases que se debe desintegracio’ mecinica del medio. Cuando se utiliza un medio de caldo con hidratos de carbono, se coloca por lo general un tubo de Durham en posicién invertida, en el tubo de glucosa tinieamente Si-un organismo es Capaz de producir gas en la glucosa, entonces también se producira gas en los otros hidratos de carbono utilizados. No obstante, si es sabido que el organismo en estudio no fermentala glucosa, esaconsejable agregar tubos de Durham a algunos otros de los hidratos de carbono puestos a prueba en la H) bateria. ‘Todos los miembros de las Entero- bacteriaceae son fermentadores dela glucosa por definicion y, por lo tanto, solo ser necesariocomprobar la produceion de gases en la glucosa por medio de un tubo, de Durham, Con frecuencia el microbidlogo, sobre todo cuando estudia un miembro de las Enterobacteriaceae. no observa produc cin de gases en un medio AHK 0 AHA, Pero esto no siempre significa que cl organisme no produzca gas. Cuando se emplean hidratos de carbono. siempre hay que hacer la prueba de pro- duccién de gas, Cualquier signo, au una pequeiia burbuja de gas aislada, ex prueba de produccién gaseosa. A menudo es tan grande cl volumen de gas que llega a reemplazar completamente el medio del tubo de Durham, dando de estar vacio, Antes de poner en autoclave los hidratos de cathono, colocar un ube de Durham en el tubo de glucosa yo en otros, en posicién invertida, pero no imten- tar que el medio se intwoduzca: por lo, general el tubo flotara en la superticie del medio, Con todo, durante el proceso, de autoclave, el mectio se introducira por fuerza en el tubo de Durham invertido. Si éste no estuviera invertido, nie seria posible determinar la produceién de gas. Si se utiliza un medio semisélide con hidratos de carbon no es necesaria la introduceién del tubo de Durham, va que la produccién de gas estara indicada por el resquebrajamiento del medio, la pr sencia de burbujas, 0 la separacién del medio de los costados © el fondo del tubo. Si se produce un gran volumen de gas, como en el caso de los grupos Klebsiella Enterobacter, el medio podra ser despl: zado basta la tapa (cierre) del tubo. Si esto ocurre. manipular el cultivo con cuidado cuando se hace un subeultivo para evitar la autocontaminacidn o la contaminacion del cultivo. E] medio con hidratos de carbono, cuando esta caliente o al ser retirado de la auto- claye, tiene un color anaranjado claro, que cambia a rojo anaranjado cuando se entria, Después de sometido a la autoclave, el medio semis6lido con hidratos de carbono debe ser enfriado en posicion vertical. Hay que ser muy cauto en la interpreta cién de las pruebas con hidratos de bono, ya que el color que indica lafermentacién varia segtin el indicador del PH utilizado en el medio (cuadro 4.1). Cuadro 4.1 Aida Alealing Indicaddor del pH (Rermentaciiny (Negativa) Rojo de fenol Andrede Amarillo Rojo rosado Rojo rosaclo Amarillo {incoloro) K) La incorpora L) M nde algunos hidratos de carbono en el medio basico puede dar una condicién dcida, Si asi ocurre, agregar NaOH 0,1.N gota a gota hasta obtener el color rojo anaranjado deseado.’ Evitar el agregado excesivo de NaOH con lo que se obtendria un color rojo intenso.” $i se produce esta intensi cacién del color, el medio puede ser demasiado alcalino para que se produzca la fermentacién propiamente dicha en el periodo comtin de incubacién Cuando se efecttia la prueba de una gran bateria de hidratos de carbono, es decir, 15 a 20 anicares, sera necesario emplear 2a 3 indculos separados. En este caso, pasar siempre por la llama la aguja o el a de inoculacién antes de volver a introducirla en el cultivo. Si se utiliza un hisopo, se empleara uno nuevo cada vez que se recoge cultivo. Estas precauciones evitan toda posibilidad de contaminacion del cultivo, que podria ser necesario para otras pruebas 0 para subcultivos. Todos los hidratos de carbono deben ser rotulados correcta ¢ inmediatumente des- pués de su preparacién. Todos tienen un aspecto semejante y habra que colo- carlos en una gradilla siguiendo un cierto. orden segtin el programa de trabajo del laboratorio. Por lo general, el microbidlogo no rotula cada hidrato de carbono, sino que sigue sistemdticumen- te un orden determinaclo. Sin embargo, si se tienen dudas en cuanto al orden 1, Andrade, E. (1906) Influence of glycerin in differentiating certain bacteria. J. Med. Res., 14, 551, 2. Bailey, R.'W., and Scott, E.G, Diagnos- fic Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 5 V. Mosby Company, 1966, pp. 238 and 312, 8. BBL Manual of Products and Labortory Procedures, Sth ed., Cockeysville, Md: Division of BioQuest, Division of Bec 6: ton, Dickinson and Company, 1968, p. 131. N) )) Fermentacién de los hidratos de carbone 37 empleado, rotular cada tubo tal como se halla colocado en la gradilla y si al interpre tar los resultados hay dudas con respecto a la identidad de un azticar, repetir la prueba A menudo se registra la fermentacién de los hidratos de carbono como posit va (+) 0 negativa (—). Como registro de fermentacién se prefiere decir la acidez, indicindola con el simbolo A. A +/— significa generalmente reaccién. dada (color anaranjado) y debe incubarse de nuevo, Si también se observa gas visible, se registra la fermentacién con el simbolo AG para indicar acidez y produccion de gas. El medio con hidratos de carbono es ligeramente alcalino (pH:7,4). Algunos carbohidratos, cuando son sometidos al calor en un pH alcalino ? son degradados en aaticares mas simples. La glucosa, en presencia de fosfatos. es destruida gradualmente con la autoclave." EI proceso de autoclave con una presion de 15 libras hidroliza la maltosa y la glucosa con la produccién de acider con la destruccion gradual de esta til tima."” McDade y Weaver ® recomiendan un medio de fosfato reducido (KH;PO, al 0.08 %) con indicador del pH rojo de fenol en una concentracién de 0,0072 % Jo que da un pH de 7,5 a 7.6. Aconsejan el empleo de estas concentraciones euando se realizan pruebas de los miembros de las Enterobacteriaceae, un medio mis rico cuando se estudian los Streptococcus y uno sin buffer y con un pH bajo (7. para las especies de Neisseria EI suero contiene una enzima capaz de hidrolizar la maltosa en glucosa.? Cuando para el enriquecimiento de un medio de maltosa se agrega suero, éste debera ser calentado antes de su adicién durante una hora a 60°C para inactivar la enzima? ) BIBLIOGRAFIA 4: Blair, J. E., Lennette, E. H., and Truant, J, P. 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Bacillus (+) cel Clostridium (—), 3. Listeria monocytogenes (+) ylo Coryne bacterium (+) del Exysipelothrix (-) Excepciones: a) Connebacterium pyogenes (—); b) Corynebacterium haemolyt- cum (= B) Ayudar a la diferenciacién de especies: Moraxella bovis (¥) y Moraxella kingié (—) de otras especies de Moraxella (+). III. BASES BIOQUIMICAS La enzima catalasa se encuentra en la mayoria de las bacterias aerobias y anacrobias facultativas que contienen citocromo;*"" la excepcién principal es el Sireptecoccus. Por lo general, los organismos que no poseen el sistema citocromo carecen también de la enzima catalasa y por lo tanto no pueden descomponer el perdxido de hidrégeno.* La mayoria de las bacterias anaerobias (por ejemplo, especies de Clostridium) poseen ta enzima peroxidasa en lugar de la catalasa. Sin embargo, Doelle ? afirma que la prueba de la catalasa no es especifica y puede interferir en la accion de las enzimas peroxidasas. ‘Tanto las catalasas como las peroxidasas entran en la clasificaci6n enzimatica general de “hidroperoxidasas”.' La catalasa ¢s una hemoproteina; el grupo prostético esta for mado por cuatro atomos de hierto trivalente (Fe***-férrico) por molécula* que retiene su. estado oxidado durante la actividad enzimatica.? Burrows y Moulder* sostienen que hay pruebas de que algunas bacterias pueden poseer una catalasa que no contiene hierro. Los estudios efecttrados por Dacre y Sharpe * demuestran una actividad de la_catalasa fuerte y débil entre los lactobacilos. Whitten- bury ™ observé la presencia de dos tipos de catalasa entre las bacterias que producen dcido lictico: 1) la clisica catalasa que descompone el perdxiclo de hidrogeno y que no es sensible a las condiciones acidas, y 2) una seudocatalasa que carece del grupo prostético hem y es sensible a un pH acido, Whittembury ® sugiere que las bacterias que producen Acido lictico poseerian un sistema respiratorio rudimentario por el cual, si se les suministra, una fuente de ferroporfirinas, algunos organismos producirfan una hemoproteina. Johnston y Delwich demostraron también la presencia de ambos tipos de catalasa entre los organismos Licticos. El perdxido de hidrogeno se forma como un producto terminal oxidativo de la descompo- sicién aerdbica de los azicares. La flavoproteina reducida reacciona directamente con el oxigeno gaseoso por medio de la reduccién40. Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias de electrones, para formar perdxido de hidrdgeno,'"" y no por accibn directa entre el hidrégeno y el oxigeno molecular." FPH, + Op = FP + HO, Flavoproteina reducidat nt a Flavoproteina oxidada Fl perdxido de hidrogeno, si se_deja acumular, es t6xico para. las baeterias provoca su muerte. La catalasa descompone el peroxide de hidrégeno uw oxida los sustratos secundarios; + sin embargo, no tiene accidn contra otros perdxidos.” La descomposicidn del peroxido de hidré- geno se produce a través de la accién de dos envimas: 1) catalasa (oxidorreductasa del perdxido de hidrégeno), y 2) una peroxidasa, nicotinamida adenindinuclestico (NAD) reducido, nicotinamida adenindinuclestico fos fato (NADP) reducido, citocromo ¢, 0 gluta tidn,? En la descomposicién del peréxido de hidrégeno. una moléula actiia como. el sustrato y la otra como un dador; el sustrato reducido por los dtomos de hidrogeno cedidos por el dador, da como resultado un sustrato reducido y un dador oxidado.t H A #0, + H lg cals Sustrato Dador 2 moléculas de peroxide de hidigeno [ecieos > 2H:,0 + O, de agua Otros compuestos, aparte del perxido de hidrégeno, que pueden ser sustratos utilizados por la catalasa, son: varios alcoholes (por ejemplo, etanol), formaldehido hidratado (H.C(OH),), acido nitroso (NOH), y acido formico (HCOOH) ambién pueden usarse sustratos inespecificos como las aminas aromaticas, fenoles y acidos aromaticos." La enzima catalasa puede emplear ¢} peroxido de hidrégeno para oxidar los alcoholes metilico (CH,OH) y etilice (C3H;OH), cedien- do sus correspondientes aldehidos."* El pH Sptimo para la actividad de la catalasa es 7." IV. REACTIVOS A) Perdxido de hidrdgeno, 30 % (Superoxal). 1. Conservar en frasco_ color caramelo. Evitar la innecesaria exposicion a Ta luz. 2. Mantener continuamente refrigerado, cuando no se usa. B) Buffer fosfato (M/15), pH:7. 1. Ingredientes. a) Fosfato. monopotisico (KH.PO) anhidro 2... 1361 g by Fosfato disédico (NasHPO,) anhidro . ©) Agua destilada 2. Método de preparacién. a) Agregar las sales a un pequetio volumen de agua destilada (hery da y enfriada antes de su uso) en un frasco volumétrico de un litro. b) Disolver por agitacion y agregar agua destilada hervida es.p. 1.000 nil Tween 80, 10% 1. Se obtiene el producto en el comercio: BBL-Tween 80 (polisorbato 80)? 2. Método de preparacié a) Agregar Iml de Tween 80 concentrado a un pequeno yolumen de agua destilada en un frasco volu- métrico de 10 ml b) Disolver por agitacién y agregar agua destilada cs.p. 10 ml El ‘Tween 80 es un_polioxietileno derivado del monooleato de sorbitan, compuesto de actividad en superficie? Control de calidad: E} peroxido de hidré geno debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su uso general. El Staphylococcus aureus y cualquier especie de Streptococcus son buenos controles, ya que se obtienen ficilmente y su conser- vaciénven cultivos madre no crea problemas. S. aureus: prueba fuertemente positiva; especies de Streptococcus, prueba negativa, Si sobre una placa de agar sangre se coloca una gota de peréxido de hidré- geno se observa una enérgica produccién, de burbujas y espuma, debida a la presencia de catalasa en los eritrocitos. Puede utilizarse una placa de agar chocolatado como control negativo, ya que en ella se han destruido los globulos san- guineos.” El peréxido de hidrégeno (Superoxal) es muy inestable y debe pasar por un 1,420 g 1.000 ml Cc)Prueba del citrato 1. PRINCIPIO Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como tinica fuente de carbono para el metabolismo, provocando alealinidad. WI. OBJETIVO (Véase también la Seccién IIT, Capitulos 32 a 34) A) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros. 1. Edwardsiella (=) de Salmonella (por to feneral +), 2. Serratia liquefaciens (+) de Yersinia pseudotuberculosis {por lo general ~) y Y. enterocolitica (~). 3. Klebsiella (+) de Actinobacillus equui ©. 4. Grupos Klebsiella general +) de nterobacter (por lo Excherichia coli (—). B) Ayudar a la diferenciacién de las especies. 1. Aeromonas hydrophilia (por lo general +) de la Aeromonas salmonicida (=), 2 Bordetella pertussis (—) de otvas especies de Bordetella (+). Moraxella osloensis (+) y Moraxella phenylpyronvica (©) de otras especies de Moraxella (—). 4. Proteus rettgeri (+) del Protens morganii (-). 5. Psendomonas cepacia (+) de la Psendo- monas maltophitia (—) III. BASES BIOQUIMICAS Algunas bacterias pueden suministrar energia en ausencia de fermentacion 0 produc- ci6n de acido Lietico "™ empleando el citrato como tinica fuente de carbono. Normalmen- te, el metabolismo del citrato comprende una condensacién de acetilo con la coenzima Ay oxalacetato " para entrar en el ciclo de Krebs. EI metabolismo del citrato por la mayoria de las bacterias es ripido a través del ciclo del icido tricarboxilico o el ciclo de fermentacién del citrato.” En las bacterias, el desdoblamiento del citrato comprende un. sistema enzimitico sin la intervenci6n de la coenzima A, Esta enzima se denomina citritasa (citrato oxalacetato-liasa) ™ 0 citrato desmolasa." La enzima requiere un catién bivalente para su actividad, que es suministrado por el magnesio 0 el manganeso.” Originariamente se pensé que la descom- pos ial del citrato daba oxalacetato (la sal del acid oxalacético) y acetato (la sal del dcido acético)." Sin embargo, se considera actualmente que el oxalacetato y el acetato son intermediarios en cl metabolismo del ato." piruvato + COs Los productos obtenidos del metabolisme del citrato dependen del pH del medio." " $i el pH aumenta (alcalino), se producen mis acetato y formato, con una disminucién de ka produccién de lactato y COz."* Por encima de pH 7 no hay produccién de lactato y los productos son: 546 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias Gitrato + CO. + acide finmiien + 2 tcido accion Con un pH acido, el acetilmetilcarbinol (acetoina) y el lactato son los. principales productos ‘de utilizacién del. citrato,! Independientemente de los productos terminales producides, el primer paso dela fermentacion del citrato da por resultado ke produccin de piruvato. La degradacion del piruvato depende, entonces, del pH del medio." Cinaio > oxilacerate + acetate, Osalacetato — pinwate + CO, pit alvatine Piruyato — acetate + formate, PH sicido 2 Pinuvate — acetate + CO, + lactate 2 Piraata > acotwinta + 2.CO, El medio utilizado para a fermentacion del citrato contiene también sales de amonio inorganicas, Un organismo que es capaz de utilizar citrato como su tinica fuente de carbono utiliza también las sales de amonio como sur inica fuemte de nitrégeno, Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NHs) con la consiguiente alcalinidad. Deffner v Franke * * han postulado que la utilizacion “de citrato_ por. el Enterobacter acrogenes (Aerobacter) originaba los siguientes productos: 1 Citrate + 7 acetate + 5 CO, + formate + succinate La_utilizacion de acidos orginicos y sus sales como fuente de carbono produce carbonatosy bicarbonatos alcalinos en la nueva degradacion.” IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Medio de citrato de Simmons, pH 6on%m 1, Ingrediemtes. a) Sulfato de magnesio (MgSO,) 02 g b) Monofosfato de amonio o fosfato de amonio dihi- drogenado (NH)H.PO, 1g ©) Fosfato dipotasico (KyHPO,) ees 4) Citrato de sodio (2.77 g de citrato de sodio, 5 1/2 de HO) 28 ©) Clorure de sodio 5 og Agar aw ¢ g) Azul de bromotimol (solucion alcoholica al 15%) 0.08 g hy Agua destilada 1000 mt Indicador del pH: azul de bromotimol a) Acido: color amarillo (no se observa). pH: 6. b) Alealino: color azul de intenso. pH: 7.6. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 6.9: 2) color verde Prusia Existen productos comerciales a) Difco. b) BBL, Método de preparacion a) Pesar exactamente la cantidad de acuerdo con las indicaciones del prospect. b) Rehidratar con. desmineralizada. ©) Calentar swavemente hasta su diso- lucion. ) Colocar aproximadamente 4a 5 ml en cada tubo (pico de flanta largo, con poca profundidad). gua cestilada 0 Método de esterilizacion. a) Autoclave, b) 121° C, 15 libras, 15 min, Dejar que el medio solidifique en posicién inclinada. Enfriar antes de su empleo y refr gerar para su conservacion (4-10° C Tnoculacion, a) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h (cultivo en AHK u otro medio adecuado) b) Inéculo fiviano.» ©) Unicamente en cola de pescado sobre un medio en pico de flauta, Incubacién. a) 35°C, b) 24.48 h, A veces es necesari unaincubacién mas prolongada (hasta 4 dias)." El medio de citrato de Simmons es una modificacién del medio original de Koser con el agregado de 1.5 % de agar, y un indicador del pH, azul de bromotimoi."* Puede incorporarse en el medio como fuente de carbono citrato de sodio 0 citrato de potasio."* B) Medio de citrato sulfuro de Christensen, pH: 67.552 1. Ingredientes. a) Citrato de sodio g b) Glucosa g ©) Extracto de levadura g ) Monoclorhidrato de cisteina ol og ©) Citrato férrico de monio o4 g f) Fosfato monopotisico 1 g ) Cloruro de socio 5g h) Tiosulfato de sodio 0,08 g i) Rojo de fenol O01 g g p Agar 15 ) Agua destilada 1000 ml 2. El medio de citrato sulfuro de Chris- tensen permite poner a prueba la utilizacion del citrato en presencia de nitrégeno orginico, monodorhi- drato de cisteina."" Sino se quiere determinar la produccién de sulfuro de hidrdgeno se_podra climinar del medio el citrato férrico de amonio y el tiosulfato de sodio, ya que ellos no imerfieren en la utilizacion del citrato.® " Indicador del pH: rojo de fenol. a) Acido: color amarillo, pH: 6.8. b) Alcalino: color rojo rosado, pH 8.4. ©) Medio no inoculado: 1) pH 2) color crema a cobrizo (ante) 4. Existen productos comerciales. a) Difco. b) BBL. Proceder de la misma manera que cuando se emplea medio de citrato de nmons en cuanto a la preparacién, esterilizaci6n, almacenamiento, inocu- laci6n e incubacién Citrato 47 V. RESULTADOS Los resultados pueden verse en las fotogrofias en colores de la figura 6-1 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES A) Medio de citrato de Simmons. 1. Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de fauta 2. Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio de color (verde) B) Medio de citrato de Christensen. 1, Prueba positiva el pico de Mauta 2 Prueba negativa: no se observa cambio de color (ante) color rojo rosado en VII. PRUEBAS RAPIDAS A) Prueba de la sangre citratada.” 1, Método de Cordaro y Sellers.* 2. Principio: demostrar la fxcultad de un organismo de utilizar el citrato que se encuentra en la sangre citratada para formar un coagulo, 3. Medios. a) Diluyente del indculo. 1. Ingredientes a) Caldo de infusién de cerebro deshidratado (CIC), 12.5 gilitro. b) Cloruro de calcio (ClCa), > 100 mg. 6) Clorure de sodio (CINa), ae 2. Preparacién. » a) Distribuir en frascos con tapa a rosca (volumen 120 ml) 85 ml caldo/frasco. b) Poner en autoclave a 121° C, 15 libras, 15 min. 3. Refrigerar pai cién (4-108 ©). su conserva b) Medio de prueba.48 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias 1. A un frasco de CIC agregar ) Seguir las indicaciones del fabri- asépticamente 15 ml desangre de ante. baneo citratada vencida. b) Es esencial un inéculo. espeso.%® 2. Merclar y empleando técnicas asépticas distribuir con una pie 4. Correlacion con los métodos de pru peta I mlen pequenos tubos de ba standard. nsayo estériles. Preparar sola mente el mimero de tubos nece- a) 96,8 %? sarios para un lote de pruebas. b) Escasa correlacién con la prueba 3. EL resto de la mezcla caldo- del citrato de sangre se mantendri refrige- reproductibi vada 1 a 2 meses. ©) Falsos_ positives y_ falsos_nega- tivos."* 4, Inéculo. d) Falsos positives con el Proteus morganii.® a) Crecimiento de un cultivo puro de e) Es dificil interpretar una tira débil- 18 h, en AHTA. b) Indculo espeso, la cantidad que alcanza a recoger el asa de inocu- lacién, 5. Incubacién. 35° C. 1 a 3,5 h. a) Puede ser necesaria una incuba- cién més prolongada, hasta 6,5 h. b) Examinar los tubos cada hora. 6. Interpretacién. a) Prueba positiva: presencia de un coagulo firme. b) Prueba negativa: no hay formacion de coagulo; el. medio se mantiene homogéneo. La presencia de codgulo en la prueba de la sangre citratada es indice de utilizacién del citrato.* Segiin Cordaro y Sellers,’ es esencial un medio de inéculo nutritivo, pero no usar solucién fisioldgica ni uno que contenga glucosa (que retarda el tiempo de coagu- facion). Se incorpora al medio una pequeia cantidad de cloruro de sodio (2,5 g) para impedir la lisis de los eritrocitos." Se prefiere la sangre entera y no el plasma porque tiene un tiempo de coagulacién mas ripido y ofrece la ventaja de que no necesita centri- fugacién. B) Tiras para la prueba del citrato impregnadas con reactivo (Pathotec). 1. Fabricante: General Diagnostics Divi- sion, Warner-Lambert Company. 2. La identificacién rapida de las Entero- bacteriaceae se obtiene en el término de 4h. 3. Método, A) D) mente positiva por el color producido por una reaccién negativa.™ VIII. PRECAUCIONES Puede haber variaciones en la inten: del color producido en una prueba de citrato positiva, debido a las diferencias en los lotes de indicadores del pH que se encuentran en el comercio. Si se usa un inéculo grande para estriar el cultivo en pico de flauta, puede obtenerse en éste un color amarillo claro a cobrizo, sin afectar el medio de mas abajo." Sin embargo, este color no indica una reaccién positiva. También un inécu- lo demasiado espeso puede dar un faiso resultado positivo.* Cuando se inocula una baterfa de sustancias bioquimicas con el mismo cultivo, pasar por la llama la aguja o el asa de joculacién antes. de estriar el_medio citratado, 0 inocularlo primero. El traspaso de glucosa u otro nutriente al medio de citrato puede producir una falsa reacci6n positiva. Vaughn y col! demostraron que si se introduce en el pico de flauta de citrato una sustancia facilmente metabolizada como la peptona, glucosa 0 acetato, el citrato resultara metabolizado. Matsen y Sherris ® y Branson * recomiendan diluir el indculo en solucién fisiolé- gica antes de inocular el citrato para evitar el traspaso de otras fuentes de carbono. Después de 24 h de incubacién, un organismo citrato positive puede mostrar una ligera alcalinidad, apenas visible en cl pico de flauta. Si se tienen dudas en cuanto a la interpretacion, compararlo con un tubo de citrato no inoculado. Algunos organismos citrato positivos necesitan la incubacion durante 48 h o mas para que se produzca un cambio en el pH.FE) Weaver y col recomiendan que cuando se utiliza la tra de citrato impregnada con reactivo, para dar validez a los resultados habra que tener en cuenta lo siguiente: 1) usar un inéculo espeso; 2) tomarlo de un cultivo en pico de flauta de Citrato 49 agar hierro triple azucarado (AHTA) en vez de agar con tripticasa de soja (ATS), que muestra tendencia a dar resultados débilmente positivos o falsos negativos, y 3) aumentar el tiempo de incubacion de 4a 6 bh si las reacciones son dudosas. BIBLIOGRAFIA BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, 5th ed., Cockeysville, Md.: Division of BioQuest, Division of Becton, Dickinson and Company, 1968, p. 99) Borchardt, K. A. (1968) Scheme for screening and identifying enteric and other gram negative bacteria using reagent-impregnated strips. Am. J. Clin. Pathol., 50, 129. Branson, D. 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PRINCIPIO Comprobar la facultad de un organismo de coagular el plasma por accién de la enzima coagulasa. I. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulo 32.) A) La prueba de la coagulasa se utiliza de manera especifica en la diferenciacién de especies perteneciemtes al género Sta- phylococcus: S. aureus (que por lo comin tiene reaccién +) del S. epidermidis (-) B) Por lo general una prueba de la coagulasa positiva ¢s cl criterio diagnéstico’ final para la identificacién del Staphylococcus. Frecuentemente esta prueba es utilizada ‘como indice de virulencia o patogenicidad. Ill. BASES BIOQUIMICAS La coagulasa, enzima producida por el S. aureus, es relativamente-termoestable, ya que resiste a temperaturas de hasta 60° C durante 30 min.*" Probablemente es de naturaleza proteica,"* y es facilmente inactivada por las enzimas proteoliticas.” Se desconoce el mecanismo exacto estructura quimica de la coagulasa.®"" Si embargo, se sabe que esta enzima desemperia Gierto papel en la coagulacién. Actiia sobre algtin componente que se encuentra en el suero para producir un coagulo 0 tombo. In vitro, la coagulasa aumenta la velocidad de coagulacién del plasma; el resultado final es la formacién de un coigulo de fibrina.® la Plasma 2°". eosigulo de fibrina coagulasa Puede demostrarse el mecanismo normal de la coagulacién con el siguiente esquema abreviadc protrombina , $$ enzima romboaui ombina Fibrinégeno > fibrina (coigulo o trombo)Oginsky y Umbreit® afirman que hay pruebas de que la coagulasa induciria un mecanismo activador alternado, ya sea como una enzima o como un activador de un componente plasmético, para convertir cl fibrindgeno en fibrina. Smith y col. sugieren que la coagulasa es una sustancia semejante a la protrombina que reacciona con los factores plasmaticos normales para formar una sustancia semejante a la trombina que, a st vez, activa al fibrinégeno para formar fibri Burrows y Moulder? sostienen que la coagulacién del plasma se produce en dos etapas: 1) hay una reaccidn entre la enzima producida por las bacterias, una procoagulasa, con un factor 0 activador presente en el plasma para formar coagulasa, y 23 la propia coagulacién del plasma activada por la coagulasa. Segtin Burrows y Moulder,” factor bacteriano verdadero es la procoagulasa, y el factor plasmatico es una fraccién globulinica similar, pero no idéntica, a la protrombina. Duthrie" ofrece pruebas de que la enzima coagulasa, que Burrows y Moulder? dicen que es en realidad procoa- ulasa, esta presente en cos formas: coagulasa ligada (ligada a la célula) y coagulasa libre. La coagulasa ligada se detecta con el método del portaohjetos, la reaccién de aglutinacién del plasma,’ y'no ésta presente en filtrados de cultivo."* La coagulasa ligada 0 factor de aglutinacién convierte al fibriné- eno en fibrina directamente sin intervencién eee plasmaticos, y no es inhibida por los anticuerpos de la coagulasa libre.* El método de la prueba de la coagulasa en tubo detecta tanto la coagulasa libre como la ligada, con la tinica distincion de su antige- nicidad."* Dubos y Hirsch “ y Drummond y Tager ® denominan al factor plasmatico tactor reactivo de la coagulasa 0 FRC, y la coagulasa libre, extracelular, reacciona con el FRC para formar una sustancia similar pero no idéntica ala trombina, actuando de tal modo indirec- tamente para convertir el fibrinégeno en fibrina. Durante la coagulacion, péptidos similares son liberados del fibrindgeno y del principio coagulasa-FRC." La diferencia principal es que el factor reactive de la coagulasa no necesita iones de calcio. para formar un coagulo y es insensible a la heparina.”” La concentracién de estafilocoagul fluye sobre la velocidad de coagulacién del plasma: cuanto mis alta la concentracién, mas rapidamente se formar el coagulo. Una concentracién elevada provoca la instantanea coagulacién del plasma2* Coagulasa 51 La tuncién real de la coagulasa in vivo no ha sido atin aclarada, Durante muchos atios se crey6 que la enzima coagulasa provocaba la formaci6n de una capa de fibrina alrededor de una lesién bacteriana, formando asi una barrera contra la accién fagocitica de los leucocitos "*" y las drogas antimicrobianas. Rogers y Tompsett® efectuaron estudios sobre la accién de la estafilocoagulasa, que no llegan a apoyar la teorfa de que los fagocitos son incapaces de englobar a los organismos S. aureus cuando hay una barrera de fibrina. Seguin Dubos y Hirsch la barrera de fibrina localiza las lesiones estafilocécicas. Ekstedt,"* Ekstedt y Nungester,” y Yotis y Ekstedt * demostraron que la produccin de coagulasa neutraliza 0 inhibe la actividad antibacteriana del suero normal contra el S. aureus; normalmente, la actividad del sucro bactericida contra el Staphylococeus."* Esto queda demostrado por el hecho de que los organismos S. aureus que producen coagulasa pueden desarrollarse en el suero normal; no asi los Staphylococcus coagulasa negativos."® Ehrenkranz y col.” hallaron que el suero humano puede ejercer una actividad bacteriostitica. contra. algunas. cepas coagulasa negativas 0 coagulasa positivas. El mecanismo ¢s incierto, pero segin Yotis y Ekstedt,* no tiene relacion con el mecanismo respiratorio bacteriano. La actividad de la coagulasa es independiente de otras toxinas estafilocécicas que pueden ser producidas por el S. aureus.7 No obstante, Cowan “asegura que todaslas cepas de S. aureus coagulasa positivas producen a 0 B hemolisinas, oambas. Burrows y Moulder 7 afirman que las @ 0 4 hemolisinas, también indice de cepas virulemtas, estan relacionadas con la actividad de la coagulasa. Young y Leitner” no hallaron correlacion entre la produccién de hemolisina y coagulasa en sus estudios. Weckman y Catlin “correlacionaron la produccién de coagulasa con la formacién de desoxirribonucleasa. La enzima estafilocoagulasa es antigéni- ca; Rammelkamp y col..** Duthrie,'® y Zen-Yoii y col.,>” reconocen siete estafilocoa- gulasas antigénicas diferentes. Sin embargo, Miale y cole sdlo reconocen cuatro tipos amtigénicos:' A, B, G y D, denominadas colectivamente isocoagulasas. Smith y col. admiten que hay dos tipos diferentes, I y IL. y que algunos S. aureus producen uno u otro Upo, y algunos ambos, La reaccion coagulasa positiva en portaobjetos se asemeja a la aglutinacién especifica y por eso se la ha denominado, a menudo, aglutinacién no especifica.*52 Pruebos bioquimicas para la identificacién de bacterios El mecanismo in vitw de la coagulacion del plasma por el S. aureus se debe ala producci6n de una enzima vineulada con el mecanismo normal de ka coagulacion, Otros géneros pueden coagular el plasma. no enzinxiticamente, sino por la destvuceion del anticoagulante plasmatica.2825 IV. REACTIVOS EMPLEADOS A) Plasma o fibrindgeno, dos selecciones. 1. Plasma. a) Recomendado: nejo }) Alternativas: de caballo, earner o bovino. Estéril. ‘esco 0 liofilizado (deshidratado). humano © de co- ° dy 2. Fibrindgeno. a) Estevil, by Fresca. B) Productos que se encuentran en el co- metcio. 1. Difeo.® a) Bacto-coagulasa plasma. b) Bacto-coagulasa plasmacon EDTA. 2. BBL! a) Coagulasa, plasma de conejo b) Coagulasa, plasma de conejo con EDTA, ©) Coagulasa, plasma de caballo con EDTA C) Métodos de preparacién. 1. Plasma comercial. a) Reconstituir solamente la cantidad necesaria para el uso diario. No se recomienda guardar frascos de plasma rehidratado.* b) Utilizando una pipeta exerilizada, rehidratar con agua destilada de acuerdo con las indicaciones del prospecto. 1. Los productos de diferentes laboratorios pueden variar i geramente. 2. Existen ampollas preparads con diferentes alicuotas: 1, 3,15 y 25 ml. 2 Plasma fresco de sangre entera." a) Dejar que los globulos rojos sedi- menten o centrifugar | emtera b) Asépticamente, quitar el sobrenadante (plasma) que contiene el anticoagulante en un recipiente asterilizado, Exitar recoger hemati sangre Fibrindgeno fresco." a) Asépticamente, retirar el plasma que contiene anticoagulante de la san gre entera b) Precipitacion de fibrinégeno de plasma fresco citratado, 1, Mezclar voltimenes iguales de plasma y una solucion saturada de clorure de sodio. 2. Dejar que se precipite el fibri- nogeno. 3. Centrifugar. c) Reconstituir el fibrinégeno precipitado hasta 5 veces su volumen con agua destilada, estéril d) Guardar en un recipiente esterilizado. ©) El fibrindgeno resulta efectivo tan- to para el método del portaobjetos como el del tubo, aun diluido hasta 1:160. D) Antes de emplear plasma citratado 0 fi brinégeno citratado, se recomienda agregar heparina para eliminar una reaccién de la coagulasa retardada falsamente positiva por organismos capaces de utilizar el citrato, haciendo de tal modo que el plasma coagule.4##**247.46 Wood " sugiere el agregado de 5 unidades de heparina por ml de plasma citratado para inhibir fa coagulacion por los organismos que utilizan citrato, lo que hace que la prueba resulte mas especifica para los Staphy- lococcus. E) Control de calidad: Tanto el plasma como el fibrinégeno, cuando se utiliza éste, deben ser controlados con cultivos positivos y negatives conocidos antes de su empleo general. S. aureus: reaccion dela ce heee positiva; S. epidermidis: reac de fa coagulasa negativa..F) Asimismo, puede controlarse la coagu- labilidacl clel plasma por su recaleifiea- Gon. Agregar uma gota de solucin de cloruro de calcio (CLCa) al 5% a una alicuota de 0 ml de plasma (dilucion 2) con lo que se formari un codgulo.2® Conservacién: Guardar las ampollas de plasma deshidratado que sc obticnen en el comercio, cerradas, en un refrigerador °C) micnuas ne se empleen para preservar sur estabilidad."! No se_reco- mienda conservar el plasma reconstituide pasado el dia de su uso; sin embargo, Cuando sea necesario, se podri refrigerat durante algunos dias utilizindolo sino hay muestras de contaminacién, "$i debe guardarse plasma reconstituide, se preferira la temperatura de congelacion 20° C) a la de refrigeracion.! EL plasma o el fibrindgeno frescos deben serconservadosen un refrigerador (4°C)o en estado congelado (—20° C). Muchos recomiendan no congelar el plasma que se va a usar para la prueba de la coag asa; sin embargo, se ha observado que la coagulabilidad’ del plasma no se ve afectada por la congelacién y que puede usurse, siempre que se realice un control de calidad antes de su empleo. La estabilidad de todos los reactivos, plasma (fresco, deshidratado o congelado) y fibri- négeno, varia y se hard con cada lote un control de calidad, desechandolo cuando dé una reaccin negativa 0 debil con un organismo positive conocido, Si el plasma comercial no reaceiona convenientemente en el control de calidad, todo el lote debera ser devuelto al fabricante. EL factor_plasmitico varia entre las especies animales, provocando diferencias en la conducta de coagulacién. La mayoria de las enzimas coagulasa coag- lan el plasma humano, de cerdo, conejo y caballo, pero no el de la rata, polio, cobayo, bovine 0 de carnero.* Los estudios Hevados a cabo por Orth y col. muestran que la concentracién del FRC nuixima en el plasma humano, dismina- vendo en el cerdo, conejo y caballo, con las cifras mas bajas en el plasma bovino, de pollo y de carnero. En cuanto al plasma que se utiliza en la prueba de la coagulasa debe adaptarse a los siguientes criterios: 1) debe contener concentraciones suficientes de FRC y fibrindgeno. 2) debe estar exento de actividad fibrinolitica, y 3) debe estar Coagulasa 53 libre de inhibidores.*" La fibrindlisis se produce cuando ef sistema plesmindgeno-plasmina es activa- do por la estafiloquinas. ($1) y el factor estafilocdcico de Mueller (MF), que pro- voea la formacién de plasma que ocasiona isis del coigulo de fibrina."* Orth y coL™ observaron fibrindlisis cuando se utilizaba plasma de conejo, humano, de camnero ¥ de ctballo para el método de 1 asst en agar. Lat actividad de ta ha erst mis imtensa con el plasma de conejo y disminuia con el humano, de carnero y el de caballo. Los de bovine de pollo y de cerdo tenfan ka actividad mas débil! La presencia de un coagulo, de fibrina indica la ausencia o debilidad de ta actividad de la plasmina, Cowan y Steel " informaron que el plasma de carnero 0 bovine es coagulade per ka coagulisa, pero que da menos restiltados positivos. Chapman ® afirma que se prefiere el plasma de conejo al humano porque su coaigulo es mis firme y mayor la velocidad de coagulacién, Morton y Cohn recomiendan no usar plasma humano sise inocula un tubo de ensayo de un medio solide, pero se acepta plasma de conejo o humano cuando se prueba un cultivs efectuado en caldo. Need- ham y col. recomiendan solamente el empleo de plasma de conejo, sin tener en cuenta el tipo de medio en el que ha desarvollado el inéculo. Needham y col explican su preferencia por el plasm de conejo por la posbilidad ce que el S. aueus pierda su capacidad de producir coagulasa cuando es inoculado a parur de un medio sélido, debido a que los anticuerpos del plasma humano causan inhi- bicién. Streifield y col. demostraron el crecimiento del , aureus, pero con inhibicién de la coagulasa debida a la gammaglobulina, y Ehrenkranz y col"? comprobaron una accién_ bacteriostitica. en sueros” humanos contra cepas de Staphylococcus que pueden ser climinadas con el empleo de plasma humano diluido inoculado de un calde de cultiv posiblemente estafilocécico. Yearsly y Carter” demostraron un ligero aumento de,la actividad de la coagulasa én el plasma diabético sobre el plasma humano hormal, mientras el diabético no estuviera bajo conwol insulinico. Puede utilizarse plasma de muestras de sangre utilizacas en amilisis biequimicos, siempre que 10 se haya empleado fluoruro de sodio como anticoagulante."" “También Go- wan y Steel recomiendan no usar muestras de plasma que contengan el anticoagu razonablemente54 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias etilendiaminotetracetato (EDTA 0 secuestra ne). Sin embargo, los laboratories Difco " y BBL * recomiendan el EDTA, dado que el mismo no es utilizado por las bacterias. y elimina resultados falsamente positivos de coagulacién del plasma por bacterias que utilizan el citrato, La enzima estafilocoagulasa coagulard el plasma cualquiera que sea el anticoagulante que se encuentre en el mismo, oxalato, citrato 0 hepar También se produce la coaguluci6n hasta con una dil Gidn plasmmitica de 15100, limitada principal. mente por ka cantidad de librindgeno presen: te2* EF plasma oxalatado 0 citratado. puede ser empleado para la deteccién de la estafilocoagulasa, va que el calcio no constituye un factor? Vv. METODOS A) Prueba en portaobjetoss coagulasa ligada. 1. Colocar una gota estéril de agua destilada o solucion fisiolégica (CINa al 0,85 %) en un portaobjetos de vidrio limpio. 2 Emulsificar suavemente una suspen bn espesa de Staphylococcus (de an cultivo en caldo puro de 18 a 24 h, 0 la cantidad recogida con un asa de’ una colonia aiskidat pura de un cultivo en placa) en la gota de solucién fisioligica (0 agua). 3. Mezclar suavemente la cantidad recogida con un asa de plasma prev mente controlado, en la suspension de estafilococos: 4. Colocar en el mismo portaobjeto organismos de control positivos y ni tives, para hacer la prueba simultinea. Observar la inmediata formacion de un precipitado macroscépico en forma de agiutinados blancos. a) Una especie coagulasa positiva da por lo general una reaccién a los 5 a 20 seg. b) Se considera negativa la prueba en portaobjeto sino se produce la coagulacién a los 3 a 4 min La prueba de la coagulasa en portaobjeto es un método tinica mente presuntive™ y todos los resultados negativos 0 retardados (mas de 20 seg) deben ser confirma- dos con la prueba en tubo de ensayo * ya que los resultados de la prueba en portaobjetos no B) Prueba en tubo de ensayo," pueden compararse con precisién con los del tubo.74> A veces se menciona la prueba del portaobjeto con la denomina- cion de prueba de aglutinacion plasmatica, y detecta la coagulasa Figacla, sins Este método se utiliza para el estudio de un gran ntimero de cultivos de posibles S. anrens, pero sélo es confiable cuando lo realiza un microbidlogo experimentado que reconozca el hecho de que debe usar un indculo espeso del organismo junto con un pequerio indculo de plasma. La velocidad de coagulacién (aglutinacién) depende de la relacion en las concentraciones del organisme y_ el plasma; si el plasma es diluido ntes de su empleo disminuye lt velocidad de una reaccién positiva.* Una concentracién igual de plasma (no diluido) y del organi mo resulta por lo general en la inmediata aglutinacién (a los 5 a 6 seg) de los estalilococos.* Es necesario mezelar ka colonia sospechosa en agua destilada 0 so lucidn fisiolégica antes del agregado de plasma. Si-en la mezcla agua-organismo se produce una precipitacién 0 aglutinacién, ello se debe a autoaglutinacién del organismo y no por la coagulasa.* coagulasa ligada y libre 1. Tubo de en: esterilizado, yo de vidrio (13 x 100) a) Agregar 0,5 ml de plasma humano oede conejo, no diluido y previamente controlado, b) Agregar 0,5 ml de un cultivo en caldo puro de 18 a 24 h, 0 recoger con el asa una buena cantidad de una colonia pura de una placa de agar. 2. Hacer girar ef tubo suavemente para lograr la suspensién del organismo. No agitar 3. Incubacién, a) En bano de agua a 37°C. b) 4 h, observar cada 30 min si se produce la coagulacién.Coagulasa 55 1. Mientras se efeettia el control, © granulacién después de los 20 no agitar ni sacudir el tubo. Incli- seg y hasta 1 min, narlo con cnidado para observar b) So aureus, cep virulenta. si hay coagulo. 2. Sialcabo de 4 hno hay coigue 3. Prueba dudosa.# lo visible, dejar en el baiio de agua o colocar en incubadora a) Granulacién después de 1 win a 35°C hasta el dia siguiente b) Repetir, y si el resultado es idéntico, 4h). confirmar por medio de ta reacciin 3. Gillespie y Cowan ™ reco- rr tubo antes de hacer el informe miendan efectuar la incuba- del resultado. cién de un dia para el otro (24h) a la temperatura del 4, Prueba negativa ambie) (22°C). Bailey y Scott! aconsejan a) No se observa cambio: la suspen- emplear una dilucion de plas- sién se mantiene homogénea ma de l:4 cuando se ust_un b) Confirmar por medio de la prucha en cultive en caldo, o de 1:5 si se tubo de ensayo ames de intormar el agrega al plasma una colonia resultado, aislada. Cowan ™ sugiere util ©) S. epidermidis w otro organismo. zav plasma sin diluir con el cultivo en ealdo, pero diluirlo BY Método del tubo de ensayo. en la proporcion de 1:2 cuan- dose hace una suspensio: 1. Prueba positiva. con una sola colonia. Harper ¥ Conway ** recomiendan una a) Se forma coigulo o filamentos de dilucién 1:2 y Gillespie 4 una fibrina definidos. dilucion de 1:10 del_ plasma, 1, Completa; el coagulo abarca Fisk y Williams y Harper * todo el tubo. informan que la formacion de 2. Parcial; el corigulo no se ex- coagulo se produce mejor cuan- tiende por toda la columna de do se merclan el cultivo ¥ el liquido. Cualquier grado de plasma en proporciones igua- coagulacién se considera posi- les, con el plasma sin diluin tivo. No obstante, en un plasma diluido hasta 1:100 la estafilo- b) 8. aureus, cepa virulenta. coagulasa produce coagulo2* 2. Prueba negativa. VI. RESULTADOS a) No hay formacién de coagulo, ka suspensin se mantiene homoge- nea (igual que en el tubo no Los fotografias en colores de inoculado). los resultados pueden verse b) S. epidermidis u ovr r en la Figura 7-1 (Apéndice 1). ne ‘ ea VII. INTERPRETACION VIII. PRUEBAS ALTERNATIVAS A) Método del portaobjeto. A) Prueba de la coagulasa en placa fraccionada. 1. Prueba positiva.® 1, Método de Parisi, Baldwin y Sottile.* a) Acentuada aghutinacién dentro de los 5 a 20 seg. a) Detecta la produccién de coagu- b) 8. aurens, cepa virulenta Tasa b) Ingredientes primarios 2. Prueba positiva retardada.* 1, Agar con infusién de corazén a) Cualquier grado de aghutinacién y cerebro (ACC), 0 agar YETS56 Pruevas bioquimicas para la identiticacion de bacterias (caldo de tripticasa de soja 2. Manitol al 1%. [BBL] y 0,3 % de extracto de levadura). 2. 2. Plasma. De preferencia, de cerdo.#** Alternativa, de conejo. Correlacin con las pruebas estindar: demasiados resultados falsamente po. sitivos.2528 2. Gorrelacién con ta prueba en tubo estindar, excelente.® Parisi y col.!® recomiendan no usa plasma humano para la técnica de la placa fraccionada, IX. PRECAUCIONES A) Cultivo: Una actividad débil de la coagulasa puede pasar inadvertida si el cultivo en caldo del organismo sospechoso es demasiado viejo (debe ser un cultivo de 18 a 24 h) 0 si cl crecimiento es escaso.! B) Plasma. B) Prueba en tubo de la coagulasa-termonucleasa. 1, Método de Barry, Lachica y Atchisor a) Detecta. 1. Coagulasa libre. 2) Termonucleasa (nucleasa ter moestable) b) Ingredientes primarios. 1, Caldo de infusién de cerebro EI plasma fresco es inestable y puede coagularse y formar particulas que producen una turbiedad 0 depésito que hace dificil interpretar una reac- cién de coagulasa débilmente positiva."! El plasma utilizado para la prueba de la coagulasa no debe ser file ello extrae los agentes de coagulacién de la sangre. lo. "stl wearin (CG), 3. Si se usa plasma de sangre de banc ) humana vencida y recién extraida de 3) Diluyenie dé indcuilo, pacientes hospitalizados, tener en th Mate cn pretnentacitis, Cuenta que puede tener inhibidores pein Por lo tanto se hari la prueba con organismos normales para el control i Phent paw eels emt de calidad (uno intensamente positive do ctilendiant ovaracedco ¥ uno negative) ademas de un organis- (EDTA) Wifeo)." mo débilmente positivo.'#” Si sola- 3. Técnica del agar con acido mente se dispone de este tipo de deosintibonucttice’ (ADN) sangre, el problema se atenuars dilu azul toluidina (ADT). yendo el plasma y tomando el inéculo de un caldo de cultivo.® Correlacién con la prueba en tubo 4 Todos los dias que se utilice plasma se standard: Barry y col? recomiendan realizar ambas pruebas simultineamente como control de calidad, C) Prueba de la placa de agar con coagulasa- manitol. Método de Esber y Faulconer.2" a) Detecta. Tanto la coagulasa ligacia como la libr Fermentacion del manitol b) Ingredientes primarios. 1. Plasma hun 7% sanguineo nO. hari un control positivo y negativo. C) Prueba en portaobjeto. 1 En ‘el método del portaobjeto, la granulacién 0 aglutinacion que se observe en la suspensién del organismo en agua destilada (o solucién lisio- logica) antes del agregado de plasma, se debera muy probablemente a auto- aglutinacion del organismo v no a la actividad de la coagulasa.* Cadness- Graves y col" hallaron wes cepas autoaglutinables en sus estucios, Dede observarse si hay autoaglutinacién, en la suspension, porque de lo contrario puede obtenerse un resultado falsamente positive en la prucha del portaobjeto.Cadness-Graves y col." recomiendan que se confirme por medio de una coloracion de Gram el resultado positivo de una prueba de la coagulasa en portobjeto; se controlari la tipica morlologia gram del Staphylococcus (cocos grampositivos en racimos). Branson’ recomienda el control de la morfologia por medio de la colora- cidn del portaobjetos positive con vio: leta evistal D) Prueba en tubo de ensayo. 1 2. Cuando se realiza la prucba en tube de ensayo, no sacudir ni agitar ef tubo al controlar la formacién del coagulo, Puede producirse un resultado dudo- soo Lalsamente negativo por la rotura del co”gulo en a primera etapa de la coagulacién ® que no se recompone continuando Ia incubacién. Sie plas on Sect coal ae grega una soluci6n de 1:10.000 de Me Ihoclaic, habe’ inusefoscects oie prueba en tubo pero nv en el método del portaobjeto.? Algunas cepas de 8. aureus producen una gran concentracién de fibrinoli- sina que provoca la ausencia de coigulo por lisis precoz, 0 solamente la presencia de un pequeno co’gulo en los primeros momentos de la incubacion que pronto es lisado " y da por resultado falsas reacciones negativas. Esto es posible, sobre todo cuando, se utiliza plasma de conejo." Pe ‘or lo tanto, es fundamental observar el tubo cada 30 min para ver si se forma coiigulo, sobre todo durante la primera hora de incubaciér. Algunas cepas cle S. aavens producen tan’ poca estafilocoagulasa que solamente se observa ka actividad coagu- ante después de 24h de incubacion.'" Se acepta en general que la actividad, de la coagulasa es especifica del S. au- rus. Sin embargo, otros organismos son capaces de coagular el plasma citratado, La coagulacion del plasma citratado tiene una amplia distribucion entre las bacterias. Bayliss y Hall * y Frede- ric ® observaron dicha actividad en la Serratia marcescens. Krech ™ ha informado acerca de un filtrado de Escherichia cali libre de células capaz de coagular el plasma, y_ Billaudelle * ha observado la facultad de coagula- Gion en algunas cepas de Bordetella Coagulasa 57 pertussis. Otros organismos gramnega tivos, que resultaron capaces de coagular el plasma, son Actinomyces,®* Klebsiella Enterobacter y Pseudomonas aeruginosa? ® Se acepta en general s7ehe6enaretie que estos organismos no producen la enzima coagulasa, pero que descomponen el anticoagulante citrato, liberando iones de calcio que a su vez activan los mecanismos normales de la coagulacién de la sangre; la protrombina en trombina.* Los estudios de cromatografia sobre papel efectuados por Bayliss y Hall* muestran que las pruebas de coagulasapositiva_con otros organismos que no son el S. reus coinciden en la ausencia de citrato en la prueba con plasma citratado, No se produce Ia coagulacin si el plasma ha sido filtrado 0 inactivado por la heparina.?* Tampoco ocurre la formacion de coiigulo si_hay una clevada concentracion de citrato 0 si los iones calcio estin unidos por el anticoagulante_oxalato (una sal no metabolizable)." El anticoagulante EDTA tampoco es desdoblado por las bacterias que utilizan el citrato."® Si se diluye el plasma citratado en una proporcién de mis de 1:8, no se lormara coigulo porque los elementos de la coagulacion se encuentran demasiado diluidos como para hacer- lo2* La mayoria de los organismos gramnegativos que destruyen el citra- to requieren generalmente 18 ho mis para formar un codgulo; el catabolismo depende de la concentracion de citrato y de la velocidad de crecimien- to del organismo2* La estafilocoagulasa coagula el plasma, cualquiera que sea el anticoagulante empleado: oxalato, citrato, EDTA o heparina Evans y col informaron que las especies de Streptococcus del grupo D. (enterococos) son eapaces de coagular el plasma citratado, casi siempre como reaccion retardada (24 h), pero no el plastha que contenga otros anticoagu- lintes, Baples ¥ Hal MUGiienM Hone mann. y Young y Leitner * informaron también sobre la actividad de coagulacion del Streptococcus faecalis. Esta formacién de coagulo, segtin Evans y col.?! se debe a la utilizacion del citato y' no a la produceién de la enzima coagulasa; solo los estreptoco-cos del grupo D citratopositivos den formar un coigulo en el pl de conejo. Sin embargo, Wood * afirma que la coagulacién del plasma de conejo por losestreptococos del grupo D se debe no a la utilizaci6n del Gitrato, sino a un agemte liberado por el organismo que es probablemente una enzima, Segtin Wood,* esta actividad enzimatica es la misma que la de la enzima estafilocoagulasa; sin embargo, su accién sobre el plasma humano © equino no tiene paralelo con su actividad sobre el plasma de conejo. Esta accién podria deberse a variaciones en la activacio inhibidora de los plasmas de difere tes especies.” Wood afirma también que la capacidad de coagulaci6n de las especies de Streptococcus del grupo D ¢s caracteristica de las cepas y no de la especie, y que si se agrega al plasma citratado 5 unidades de heparina por ml, se inhibe la coagulacién provocada por los estreptococos. A menudo se confunden las espe- Ges de Streptococcus del grupo. D (enterococos) con Staphylococcus, porque pueden tolerar una elevada concentradén de sales. Algunas pueden fermentar el manitol, y muestran posiblemente crecimiento y fermenta- Gin en medio de agar manitol salado, que en general se considera selectivo. para la identificacién de especies de Staphylococcus. Sin embargo, las colonias de las especies de Staphylococcus en el medio de agar manitol salado, 58 Pruebas bioquimicas para la identitcacion de bacterias son grandes en comparacién con los enterococos (colonias pequefias 0 en cabeza de alfiler con ligera fermenta- cién de manitol). Cuando hay dudas, antes de hacer la prueba de la actividad de la coagulasa realizar la prueba de la catalasa; las especies de Staphylococcus son catalasa positivas, y todas las especies de Streptococcus, catalasa negat vas. Evans y col! recomiendan que si el resultado de la coagulasa en plasma Gitratado es retardado (mas de 3 y hasta 24h para la formacion de coagulo), habra que sospechar que el Organismo no. es un Staphylococcus aureus. También aconsejan usar un anticoagulante que no. sea citrato. Burrows y Moulder,’ Smith y col.,"* y Bayliss y Hall? han_ presentado informes respecto a que el Bacillus subtilis, un bacilo grampositivo, es capaz de coagular el plasma citratado u oxalatado, humano 0 de conejo, gracias a_un producto metabdlico. Rammell informs que el citrato inhibe el crecimiento del S. aureus El uso de plasma heparinizado impide las reacciones_ falsamente por los organismos que ut Gitrato. E) General: Las cepas mas virulentas de S. aureus poseen enzimas coagulasa. Ehren- kranz y col.!” y Morton y Cohn ® recomiendan que no se use la presencia 0 ausencia de coagulasa como criterio de virulencia; los sintomas clinicos son de importancia mucho mayor para determinar la patogenicidad. BIBLIOGRAFIA 1. Bailey, R. W., and Scott, B. G. Diagnos- sis. Acta Pathol. Microbiol. Seand., 37, tic Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 5. 'V. Mosby Company, 1968, p. 106. 2. Barry, A. L., Lachiea, R. V. F., and Atchigon, F. W. (1978) Identification of 6, Branson, D. 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PRINCIPIO Medir la capacidad enzimatica. de un organismo para decarboxilar un aminoacide para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad I. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32 a 34,) A) Las pruebas de las decarboxilasas se emplean fundamentalmente para determinar grupos bacterianos entre las Ente- robacteriaceae. B) Los aminoiicides decarboxilados son la lisina, la ornitina y la arginina. 1. Lisina-decarboxilasa a) Ayudar a la diferenciacion entre los géneros: Edwardsiella (+), Sal- monella (por lo general +), y Arizo- na (+) del Citrobacter (—). b) Ayudar a la diferenciacién de las especies: Enterobacter aerogenes (+) y Enterobacter hafniae (+) del Ente- robacter cloacae (~ ‘nterobacter agglomerans (~). 2. Ornitina-decarboxilasa, a) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros: Enterobacter (por lo general +) del Klebsiella (—) b) Ayudar a la diferenciacién de las especies. 1. Enterobacter agglomerans (=) de otras especies: de Enterobar- ter (+). 2. Proteus mirabilis (+) del Proteus vulgaris (—). 3. Proteus morganii (+) del Proteus vettgen (=), 4. Yersinia enterocolitica (+) de la Yersinia pestis (=) y Yersinia preu- dotuberculosis (—) Arginina-deshidrolasa, a) Ayudar a la diferenciacién de las especies: Enterobacter cloacae (+) de otras especies de Enterobacter (generalmente —). b) Ayudar a la identificacién de las Pseudomonas. TH. BASES BIOQUIMICAS La decarboxilacién es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas decarboxilasas especificas son capaces de ra los aminodcidos en su grupo carboxilo(~COOH), dando una amina 0 una diamina y anhidrido carb6nico.* Las enzimas decarboxilasas son numerosas y cada una es especifica para un sustrato R—CH—NH;—COOH—> R—CH.—NH, +CO, Anninoacidte Amins Anbidride carbonic62 Pruebos bioquimicas para la identificacién de bocterias determinado. En un laboratorio de bacteriologia clinica, las tres decarboxilasas impor tantes utilizadas para la identificacién bacteriana son la lisina, la ornitina y la arginina Estas decarboxilasas son enzimas adapiativas 0 inducidas; son formadas por un organismo solamente cultivadas en un medio acido en presencia de un sustrato especifico, y los productos de la decarboxilacién provocan una desviacién del pH hacia la alcalinidad.* La decarboxilaci6n esta limitada a aquellos aminodcidos que poseen por lo menos un grupo quimicamente activo que no sea una amina (-NH,) 0 un grupo carboxilo (=COOH),” y la descomposicién de los aminodcidos se produce anaerdbicamente. EI proceso de decarboxilacién es irreversible. no oxidativo, y requiere una coenzima co- mun, el fosfato de piridoxal.® El aminoacido L-lisina sufre la decarboxila- cién para dar cadaverina (una diamina) y anhidrido carbonico por accion de especifica lisina-decarboxilasa. + CO, By Ta enzima ornitina-decarboxilasa para dar la diamina putrescina y anhidrido carbonico.” OHNE; Ae CH, CO: oo | bail CH,—NH, coon L-Ornit Putrescina (diamina) ‘Tanto la cadaverina como la putrescina son estables cuando son producidas en condiciones anaerdbicas® Se cultiva la_bacteria estudiada en anaerobiosis recubriendo la superficie del medio con parafina o vaselina. Con el sellado de los tubos, todo el oxigeno no combinado es consumido por el or mo presente durante la fase de crecimiento inicial y durante la decarboxilacién el pH del medio aumenta (hacia la alcalinidad) a medida que se produce anhidrido carbonico Como el pH puede ser controlado, es posible incorporar un indicador del pH, ya sea ptirpura de bromocresol y/o rojo. de cresol, en el medio que contiene el aminoicido. E] aminoacid L-arginina es catabolizado a través de dos sistemas que pueden ocurrir simultinea o separadamente®, Estos. dos caminos son el sistema de la arginina-dehidrolasa y el sistema de la arginina-decarboxilasa. En el sistema de la decarboxilasa, la L-arginina sufre la decarboxilacién para dar agmatina, una molécula mas grande que la putrescina, que no puede ser considerada el producto final en el catabolismo de la arginina por las bacterias vivas.? Una nueva descomposicién de la agmatina se produce por una de dos vias. La accién catalitica de la enzima agmatinasa desdobla la agmatina en dos compuestos, putrescina y urea. Si se encuentra ia enzima ureasi, la urea es también catabolizada para dar dos moléculas de amoniaco (NH) y anhidrido carbonico (CO.). Mller ® hallé que la putrescina no sufre una nueva descomposicién de grado demostrable Este mismo autor comprobé también que todas las cepas de las Enterobacteriaceae producen la enzima agmatinasa y por lo tanto muestran un enérgico catabolism de la agmatina, dando putrescina y urea, 0 putrescina y 2 NH y COs si también se encuentra presente la enzima ureasi La agmatina es catabolizada por la enzima agmatina-deshidrolasa en putrescina, CO» y NH, por medio de un compuesto intermedia rio, monocarbamil putrescma, que se encuentra en los organismos Streptococcus faecalis. En el sistema dehidrolasa, la descomposi- cién de la L-arginina, segtin lo han demostrado Knivett," Slade y Samp? v Oginsky’ Gehring 2! se produce en un proceso de dos tapas: primero una descomposicién de la L-arginina en L Prevorsek 7 y col2® recomiendan usar sola- VII. INTERPRETACION mente_la tira de lisina para la identificacion presuntiva de espe- Cualquier aminoacido da los mismos resul- cies de Salmonella, tados en color: ejemplo, la lisina-decarboxilasa. 2. Prueba de la placa en mancha. A) Prueba positiva: purpura turbio a un a) Semimicrométodo de Geilach y purpura amarillento apagado (producido, col.5 por la cadaverina). b) Resultados: a las 6 a 24 h de B) Prueba negativa: color amarillo claro y incubacion. brillante (solamente fermentado por la ©) Solucién de sustrato aminodcido, glucosa). yolumen total 100 ml.68 Pruebos bioquimicas para la identificacién de bacterios d) 1. Lisina, 1% en buffer ftalato dcido de potasio 0,004 M (pH: 5,7). 2. Fosfato de piridoxal, 1 a 2 mg. 3. Indicador rojo de bromofenol, concentracién 0,0016 %. 4. Cloroformo (conservador) varias gotas. Guardar en reftigerador (4- 10° C) (se mantiene bien durante varios meses). Método. 1, Cépsula de control tinicamente a) Buffer. b) Indicador. 2. Capsulas de prueba. a) 4 gotas de solucién de aminoacido. b) Una sola gota (pipeta capi- lar) de suspensién celular. Grecimiento de un agar en pico de flauta de 6 h. Hisopo estéril del crecimien- to en 0,5 ml de buffer fialato acido de potasio 0,004 M (pH ajustado a 5,7). 3. Cubrir la placa con gasa. 4, Incubacién a 35° C durante 24h; leer alas 6h y alas 24h. 5, Imerpretacion, a) Positiva: color rojo rosado. b) Negativa: no hay cambio de color, se mantiene amarillo. 3. Método de Brooker y col.> a) b) Resultados: a las 4 h de la incu- bacién Medio y preparacion. 1. Peptona (Difco) 05 ¢ 2. Extracto de levadura Wifco) 03 g 3. Agua destilada o deionizada 100 mi 4. Calentar suavemente para disol- °) d) e) 5. Ajustar el pH de 5 a 5,2. Distribucién y esterilizacién, dos opciones 1. Distribuir alicuotas de 1 ml en tubos de borosilicato y tapar. Colocar en autoclave, a 121°C, 15 libras, 15 min 2. Filtracién. Filtre Millipore Asépticamente distribuir alicwo- tas de I ml en tubos de borosilicato y tapar. Método. 1. Inoeulacién: un inéculo espeso recogido con el asa. 2. Cubrir con 1 ml de yaselina 0 parafina fundida estéril. 3. Incubacion. Dos elecciones. 4) Se recomienda un baiio de agua a 37° C.> Mejor inter- cambio del calor. Se obtienen resultados positivos en un periodo mais breve. ncubador de aire seco a 35°C. ‘b) Leer a las 1, 2,3 y 4h Interpretacion. 1. Positive: color verde o azul (pH: 6,1). 2. Negativo: color amarillo. Es fundamental un inéculo espeso (10° 0 mas); si se usa un inéculo demasiado liviano de placas de agar sangre de carnero (ASC) o agar de MacConkey (MAC), pueden producirse falsos resultados negativos al cabo de 4h de incubacion.* Los resultados se interpretan dentro de un limite de 4h; la inoculacién puede exten- derse sin peligro hasta un maximo de 8h pero no mis. A las 24h, Jas cepas de Citrobacter pueden resultar falsamente positivas.” c B) Ornitina-decarboxilasa: Método de Fay ver, luego agregar. y Barry. a) Monoclorhidrato de LAisina (1%) i) 1. Result dentro de las 2.a 4h de b) Azul de bromotimol incubaci alcohélico 0,5 g 2. Medio.a) Medio de decarboxilasa _modifi- cado. 1. Sin glucosa. 2 Con’ pH disminuido a 5.5. b) Ingredientes y preparacién 1. Peptona (Difco) 5g 2. Extracto de levadura (Witeo) 3g 3. Purpura de bromocresol al 0.2 % (alv) en alcohol etilico al 50 % (viv) 5 4. Agua destilada 0 deionizada cs.p. 1000 ml 5. Calentar suavemente hasta diso- lucién, después agregar 10 g de dlorhidrato de L-ornitina (Dif- co). 6. Ajustar el pH a 5,5, con acido clorhidrico (HCI concentrado 0 hidréxido de sodio (NaOH). ° 1 erilizacién. Autoclave. 121° ©, libras, 15 min, d) Método, 1 Eldia de la prueba. a) Distribuir asépticamente alicuotas de 1 ml, b) Tubos esterilizadas (12 x 75 mm), 2. Inoculacién, a) Crecimiento de un cultivo de 18 a 24h (ASC 0 MAC), b) Colonia aislada. Recubrir los tubos con 0,5 ml por lo menos de vaselina estéril 4. Incubacién. Calentador a 37° Qadh ©) Interpretacion. 1. Positiva: color purpura oscuro. 2. Negativa: color amarillo. £) Correlacién con la prueba es dar de Méller; 100 %. A veces la Escherichia coli puede reducir el indicador a un color gris claro; si esto ocurre agregar una gota c) B) Co D) Decarboxilasas 69 de indicador bromocresol directamente al tubo y volver a interpretar Asimismo algunas cepas ornitina positivas de E. coli_y Protew pueden mostrar s6lo un ligero color piirpura al término de 4h; confirmar el resultado positivo reincubando owos 30 a 6O min.® Lisina y ornitina-decarboxilasas, 1. Método de cromatografia de gas de Lambert y Moss.2” Anillisis por cromatografia de gas liquido para la deteccién de: a) Putrescina, decarboxilacién de la ornitina, b) Cadaverina, decarboxilacién de la lisina, 3. Resultados: dentro de las 3 a 5 h. 4. Método: véase la referencia 20, IX. PRECAUCIONES Después de reposar durante la incuba- cién una prueba de decarboxilasa debe presentar dos capas de diferentes colores, amarillo y purpura. Agitar suavemente el tubo antes de hacer la. interpretacién. Con frecuencia es dificil leer una prueba de decarboxilasa positiva debido a la resencia de un color piirpura amari- lento indefinido. En este caso, comparar siempre con un tubo no inoculado. Todo vestigio de color purpura indica una prueba positiva si ha sido incubada por lo menos 24h. En algunos casos, el color indefinido 0 la desaparicién del mismo después de una incubacién prolongada durante varios dias, se debe a la destruc- cin del indicador del pH La adicién de purpura de bromocresol al tubo demuestra que ésta era la causa. Esta decoloracién 0 resultado indefinido se produce frecuentemente con el Proteus mirabilis y el Proteus vulgaris Rotular todos los tubos de decarboxilasa antes de la inoculacién. La mezcla de diversos tubos de aminoacidos dara resultados sin validez para la identificacion bacteriana. Se acepta como conveniente: C, control; A, arginina; L, lisina; O, ornitina. El tubo de control que no contiene aminodcido debe mantener su color amarillo después de 18 a 24 h de70 Pruebas bioquimicas para Ia identiticacién de bacterias incubacién, lo que indica que tinicamente ha sido fermentada la glucosa. Un control positive (pirpura) invalida todas. las pruebas de decarboxilasa y no puede hacerse ninguna interpretacién. En el cuadro 8-1 se presenta la lista de los organismos de control que pueden some- terse a prueba para obtener resultados precisos en cuanto a la actividad de decarboxilasa de la lisina, la arginina y Ia ornitina* Cuadro 8.1 H) por lo menos 18 a 24 h, Las interpreta- Giones prematuras pueden dar un resul- ado, fasammente nedatyeaD ROTEL 10 a 12 h de incubacion es fermentada la glucosa, lo que da como resultado un color amarillo (pH acido). Sélo después que la glucosa es fermentada se observara la actividad de la decarboxilasa. La actividad de la lisina decarboxilasa de Falkow produce un definido desvio del pH a un color purpura en 24h. La actividad de la lisina-decarboxilasa en la Salmonella se_usa para diferenciar este grupo del Citrobacter freundii. Sin embargo, la Salmonella paratyphi A da una ion negativa (amarillo) en 24 hh y representa una excepci6n. La Salmonella gallinarum da una reaccién de la ornitina-decarboxilasa positiva retardada, que necesita de 5 a 6 dias de incubacién. Esta reaccion retardada se debe a una ligera permeabilidad de la bacteria viva para la ornitina, y es una rara excepcién. Muchas cepas de Escherichia coli, inclu yendo aquellas que fermentan el adonitel, muestran una reacci6n retardada para la actividad de la ornitina-decarboxilasa medio de decarboxilasa de Moller requiere un pH bajo, condiciones anaeré- bicas y estrictos controles. El medio de decarboxilasa de Falkow depende simplemente de un cambio en el indicador del Organiomas Avginina Omitina ‘te control Proteus vulgaris = q = mea Klebsiella z + = Proteus morganii a eZ . i Sabronella sphi + + < Enterobacter cloacae Bs - + Enterobacter aerogenes - + " Salmonella ‘pkimarinm tf + ‘ 7 = i D E) Las bacterias metabolizantes pueden catabolizar los aminoacidos de otra manera, y las aminas formadas pueden ser degradadas nuevamente. Estas posibilidades se K) El producen sobre todo en la descompo- sicién de la L-arginina. El catabolismo de la L-arginina puede ocurrir simultaneamente por diferentes ciclos: el sistema de la decarboxilasa y/o el sistema de la HIT dehidrolasa.” L) F) El indicador del pH, piirpura de bromocresol, cuando se incorpora al medio, da cambios mas definidos en las reacciones del pH, pero al mismo tiempo la desvia- cién del pH en los controles aparece antes que en el sistema de prueba de la decarboxilasa* Cuando se usan las pruebas de la decarboxilasa de Falkow 0 Mdller, no tratar de interpretar los resultados hasta tanto los tubos no hayan sido incubados G) El medio de Falkow no es conveniente para determinar la actividad de la lisin; decarboxilasa con los dos géneros Kleb- siella_y Enterobacter.» *° En la Klebsiella el pH disminuye a medida que aumenta el perfodo de incubacién debido fundamentalmente a la formacién de acetilmetilcarbinol (VP_positivo).%? Como los resultados pueden ser equivocos, no se recomienda el método de Falkow para la identificacién de los grupos Klebsiella y Enterobacter." BIBLIOGRAFIA 1. Barile, M. F., Schimke, R. T., and Riggs, D. B. (1368) Presence of arginine dihydrolase pathway in Mycoplasma. J. Bacteriol., 91, 189, 2. BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, 5th ed.,, Cockeysville, ‘Maryland: Division of BioQuest, Divi- sion of Beeton, Dickinson and Com: pany, 1968, p. 108. 3, Blazevic, D. J., Schreckenberger, P. C., ‘and Matsen, J. M. (1973) Evaluation of the PathoTee "Rapid I-D” system. Appl. “Microbiol., 26, 886. 4, Borchardt, K. A. (1968) Simplified method for identification of enteric and other gram-negative bacteria using reagent-impregnated strips. Am. J. Clin. Pathol., 49, 748, 8. Brooker, D. C., Lund, M. B., and Bla- zevie, D. J. (1972) Rapid test for lysine decarboxylase activity in Enterobacteri aceae. Appl. Microbiol.,.26, 622. 6. Burrows, W., and Moulder, J. W. 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PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de crecer en un medio inhibidor y fermentar un carbohidrato(s) producendo un cambio de color relacionado con el pH I. OBJETIVO (Véase también Ia Sec Capitulo 32) nm IH, A) El caldo FK para diferenciar todas las especies de Streptococcus pertenecientes al grupo D, de otras especies de Streptococcus que no pertenezcan al grupo mencio- nado. 1. Especies de Streptococcus del grupo D (enterococos y no enterococos) 2. Otras especies de Streptococcus, que no son del grupo D (=) B) El caldo SF para diferenciar los enterococos del grupo D (estreptococos) de los no enterococos del grupo D y otras especies de Streptococcus que no son del grupo D. 1. Especies de Streptococcus enterocdcicos del grupo D (+). 2. Especies de Streptococcus no enterocs- cicos del grupo D (-). 3. Otras especies de Streptococcus, que no son del grupo D (—). Il. BASES BIOQUIMICAS Todas las bacterias aerdbicas obtienen su energia de la respiracién, proceso respon sable de la oxidacion de diversos sustratos. El oxigeno molecular oxida un sustrato con la intervencién del sistema de trasporte de electrones.’ Cuando existen condiciones aerdbicas, el oxigeno es el aceptor de hidrégeno final, produciendo con él agua 0 perdxido de hidrégeno, segiin la especie bacteriana y su sistema enzimatico.”? Por lo general el sistema citocromo sélo se encuentra presente en organismos aerdbicos," lo que los hace capaces de_ utilizar oxigeno como un aceptor de hidrdgeno final para reducir el oxigeno molecular en per- Oxido de hidrégeno, el tiltimo enlace de la cadena de la respiracion aerébica.» Castor y Chance ® demostraron por medié de métodos fotoquimicos que existen cuatro pigmentos bacterunos que se sabe que acttian como enzimas. respiratoriascitocromoox dasas terminales: citocromo a, citocromo a: citocromo ag, y un pigmento que se une al monoxido de carbono (CO-ligadura) denominado citocromo o. Los diversos citocromos son pigmentos respiratorios que contienen compuestos de ferroporfirina.* Los caldos fecales, FK y SF, contienen un inhibidor, la arida sddiea. La azida quimica, en altas concentraciones, inhibe ka enzima citocromooxidasa en la cadena de trasporte de electrones, donde el trasporte se une a la sintesis del ATP (oxidaciones biolégicas). Sin embargo, o hay inhibicién celular cuss do el sistema de trasporte de electrones no se une a la fosforilacion."*La inhibicién azidica se produce cuando el citocromo a3 de la cadena respiratoria se combina en su forma férrica (Fe***) con la azida, enlazando el metal del grupo prosté- tico ¢ impidiendo la reaccién del metal con el oxigeno molecular.‘ Harrow y Mazur " afirman que la combinacién con la azida puede hacerse a través de la porcién prostética hem del citocromo as, 0 el cobre que se encuentra en az, 0 ambos a la vez. Este enlace del oxigeno molecular inhibe la enzima citocromooxidasa dando como resultado la pérdida de la trasmisién de electrones a través de la cadena oxidativa del sistema respiratorio al oxigeno.' La distribucién de los diversos citocromos varia con cada especie bacteriana; algunos organismos poseen sélo una oxidasa mientras que otros pueden producir dos ‘o tres La arida s6dica ejerce un efecto bacterios- tatico sobre los organismos gramnegativos,**!® aunque permite el crecimiento de bacterias grampositivas."* Los enterococos (especies de Streptococcus del grupo D) son bacterias grampositivas, que carecen de un sistema citocromo y del ciclo del acido tricarboxilico; de alli que sean capaces de crecer en presencia de la azida sddica inhibidora.’ La degradacién del hidrato de carbono. se produce a través del ciclo de la hexosa difosfato, dando una reaccién acida en el medio SF o FK con azida sédica e hidratos de carbono. IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Dos opciones. 1. Caldo de Streptococcus faecalis, pH:6,9 (caldo SF) 3414 a) Ingredientes. Triptona...... 200 g Dextrosa (glucosa) ..... 5 og 3. Fosfato dipotasico (KeHPO,) ..... 4 g 4. Fosfato monopotdsico (KH;PO)) ... 1b g 5. Azida sédica NaN;) 05 g 6. Cloruro de sodio (CINa) wn, 5g 7. Ptirpura de bromocresol ... 0,082 g 8. Aguadestilada . 1.000 ml Caldos fecales pare enteracocos 73 b) Indicador del pH: ptirpura de bromocresol. 1. Acido: color amarillo, pH:5,2. 2. Alcalino: color purpura, pH: 68. 3. Medio no inoculado: a) pH, 6,9; 6) color parpura. ©) Existen productos comerciales 1. Difco. 2 BBL. d) Método de preparacion. 1. Pesar con precision las cantidades, como se indica en el pres- pecto. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar suavemente hasta diso- Jucién. 4, Distribuir aproximadamente 4 a 5 ml por tubo. €) Método de esterilizacién. 1. Autoclave. 2. 121°C, 15 libras, 15. min. £) Enfriar antes de su empleo y ref gerar para su conservaci 10°C). 8) Inoculacién: crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h. h) Incubacién. Minimo absoluto: 48h 2. Recomendada: " 45° ¢ 48 h. 35°C. 24a 24a El medio SF se prepara de acuerdo con la formula de Hajna y Perr organismos coliformes y gramnegativos son inhibidos por la azida que se encuentra en el caldo SF, pero las especies de Streptococcus del grupo D son detectadas por la presencia de crecimiento junto con la fermentacién de la glucosa, lo que da un pH Acido y un cambio de color. Segin Hajna y Perry" el caldo SF es selectivo para el crecimiento de Streptococcus del grupo D tinicamente, cuando es incubado a 45,5°C; otras especies de Streptococcus son inhibidas. Facklan y Moody" hallaron que con la incubacién a 35° C algunas cepas del grupo D crecian en el caldo SF, lo que no se74 Pruebas bioquimicas para Ia identificacién de bacterias hubiera producido a 45,5° C como lo sugieren Hajna y Perry." Sin embargo, la incuba- cién a 45° C no és factible en un laboratorio comin, ya que la mayoria de las incubadoras tienen una temperatura entre 35 y 37° C. Por lo tanto, la presencia de una reaccidn acida y un cambio de color en el caldo SF es prueba presuntiva "para la identificacién de las especies de Streptococcus del grupo D. La prueba SF no es por si sola suficiente para determinar presuntivamente la presencia de todos los estreptococos del grupo D y junto con ella se deberan efectuar otras (crecimi cINa al 65 %, crecimiento en bilis 40%, crec miento en caldo FK, crecimiento a 10 y 45° C, ¥ producckin de cide a parti de la esculina). ‘Algunas especies del grupo D se desarrollan en caldo SE, mientras que todas las especies de Streptococcus del grupo D muestran creci miento en caldo KF 2. Caldo estreptocdcico fecal de Kenner, pH:7,2 (caldo FK) 28" a) Ingredicntes, 1. Peptona (proteosa 3.0 polipeptona) 10 2. Extracto de levadura 7 0 ¢ 3. Cloruro de sodio (CINa) .. . 5 8 4. Glicerofosfato desodio .... Wg 5. Carhonato de sodio (opcional) (NaHCO)) « 0,636 ¢ 6. Maltosa 2g 7. Lactosa s+. 1 8 8. Azida s6dica (NaNs) - o4 g 9. Rojodefenol .. 0,018g o Purpura de bromocresol... 0,015 g. 10, Aguadestilada . 1.000 ml b) Indicadores del pH. 1. Rojo de fenol a) Addo: coloramarillo, pH:6. b) Alcalino: color rojo rosado, pH:7.6. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 7.2; 2) color castatio rojizo. 2, Purpura de bromocresol. a) Acido: color amarillo, pH: 32 b) Alcalino: pH:6.8. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 7,2; 2) color purpura. color piirpura, ©. Existen productos en el comercio. Difco. a) Gontiene purpura de bro- mocresol_ como indicador del pH. b) No contiene carbonato de sodio. 2. BBL. a) Contiene rojo de fenol como indicador del pH. b) Contiene carbonato de sodio. d) Método de preparacion. 1. Pesar las cantidades con exactitud como se indica en el prospecto. Los productos de distintos laboratorios pueden var ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada 0 desmineralizada. lentar suavemente hasta diso- lucién 4. Distribuir en tubos, aproximadamente 4 a 5 ml por tubo. e) Método de esterilizacion 2"? 1. Autoclave. 2. 121°C, 15 Wi . 15 min. f) Dejar enfriar antes de su empleo y refrigerar para su conservacion (4-10° C), g) Inoculacién: crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h. h) Incubacién. 5° C, 24 a 48 bh. El caldo estreptocécico FK se prepara de acuerdo éon la férmula de Kenner y col.,!” quienes recomiendian queel pH del medio esté entre 7,2 y 7,3 y que contenga como ingrediente carbonato de sodio. En oposicidn al caldo SF que incorpora un solo hidrato de carbono, glucosa (dextrosa), cl caldo FK emplea dos, maltosa y lactosa, para detectar la capacidad de fermentacion de un organismo.La reaccién_positiva con prueba presuntiva de contaminacién fecal del agua.!7 V. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 9-1 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES Caldo SE. 1. Positiva. a) Color castafio amarillento. 1. Crecimiento (turbiedad). 2. Fermentacién del hidrato de carbono. b) Especies de Streptococcus del grupo D (enterococos). S. faecalis S. faecalis var. zymogens. S. faecalis var. liquefaciens S. faecium. S. faecium var. casselifavus. S.durans (S. faecium var. durans.). Ook eNe 2. Negativa. a) Color ptirpura 1, No se observa crecimiento, 2. El hidrato de carbono no es fermentado. b) Especies de Streptococcus del grupo D, no enterococos. 1. Streptococcus bovis. 2. Streptococcus equinus. 3. Streptococcus avium. ©) Especies de Streptococcus que no pertenecen al grupo D. d) Otras bacterias. B) Caldo FK. 1, Positiva: indicador del pH rojo de fenol o purpura de bromocresol. Caldos fecales para enterococos. 75 a) Color amarillo. 1. Crecimiento (turbiedad). 2. Hidrato de carbono fermentado. b) Especies de Streptococcus del grupo D, enterococos. S. faecalis, S faecalis var. zymogens S! faecalis var. liquefaciens. S. faecium. S. faecium var. casselifavus. S. durans (S. faecium var. durans). oe eee ©) Especies de Streptococcus del grupo D, no enterococes. 1. 8, bois, 2. S. equinus. 3. S. avium, Negativa, a) Indicador del pH rojo de fenol: color castano rojizo. b) Indicador del pH pérpura de bromocresol: color puirpura 1. Crecimiento (turbiedad) 0 no se observa crecimiento. 2. El hidrato de carbono no es fermentado. ©). Especies de Streptococcus que no son del grupo D. d) Owas bacterias, VII. PRECAUCIONES A) Generales. 1 Antes de inocular un caldo SF 0 FK habra que asegurarse que el organismo es un Streptococcus. Todas las especies de Streptococcus son catalasa negativos y son cocos grampositivos di puestos en cadenas, pares o aisladamente. Las especies de Streptococcus del grupo D pueden mostrar hemolisis a, Bo y, en agar sangre de carnero al 5 %. A menudo resulta dificil diferenciar los a-Streptococcus del S$, pneumoniae por su morfologia de colonia o su morfologia gram. Si el organismo escatalasa negativo, tiene cocos grampositivos dispuestos en cadenas, pares 0 aisladamente, y es insoluble en bilis y/o resistente a la optoquina, es casi Seguro que se trata de una especie de Streptococcus que no es el S. pmeumoniae. Kenner y col.!7 consideran que los estreptococos fecales incluyen alos enterococos del grupo D (especies de Streptococcus) asi como al S. bovis, S. mits, S. salivarius, y S. equinus; todos ellos dan una reaccién positiva en el medio FK; una reaccién acida con cambio de color del indicador del PH incorporado al medio. Se han utilizado indistintamente los términos “estreptococos fecales”, “en terococos” y estreptococos del grupo D, pero es evidente ahora que no son sindnimos." Los estreptococos del grupo D incluyen especies que son enterococos como otras que no lo son; ambos grupos poseen el antigeno de Lancefield grupo D. Facklam ® recomienda eliminar el término “fecal”, ya que el S. bovis ha causado infecciones humanas y el tér- mino no tiene significado. De las cuatro especies a las que en general se denomina “estreptococos fecales” se conoce actualmente que dos de ellas poseen el antigeno D; de alli que se las clasifique como estreptococos del grupo D (S. bovis y S. equinus). Segiin muchos autores, los entero cocos del grupo D sélo agrupan a cuatro especies 0 biotipos: S. faecalis, S. faecalis var. zymogens, S. faecalis var liquefaciens, y S. durans. Los estudios realizados por Deibel* demuestran que el S. faeculis agrupa a clos especies diferentes: S. faecalis y una nueva especie, S. faecium y el biotipo S. faecium var. casselifavns EI S. bovis y el S. equinus poseen el antigeno D pero son clasificados como. especies no enteracécicas.*s!%619202 EI crecimiento en caldo SF, 6,5 % CINa, 40 % bilis, cido de ta esculina, y el aislamiento a 10 y 45°C son los 1, Bailey, R. W., and Seott, B.G Diagnos- tie Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. V. Mosby Company, 1966, pp. 115-116 3. and 311-312 2. BBL Manual of Products and Labora- . Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi- tory Procedures, 5th e 76 Pruebas bioquimicas para ia identiticacién de bacterias 0, criterios que se emplean para identificar a los enterococos del grupo D (crecimiento) de los estreptococos no enterocécicos (no hay crecimien- to).00n3 20 Puede determinarse presuntivamente la presencia del antigeno del grupo D con la prueba de la esculina biliar; para su confirmacion debe efectuarse Iatipificacién serolégica (Lancefield).” Una ver determinada la presencia del antigeno D, se haran una serie de pruebas para diferenciar entre las especies de Streptococcus enterocécicas y No enterocécicas. B) Caldo FK. El pH del caldo FK debe estar entre 7,2. y 7,3, y no debe usarse si esti por debajo de 7. El periodo de autoclave es de 10 min; evitar el recalentamien- to, ya que ello hace descender el pH, con lo que disminuye también la productividad del medio. Facklam y Moody # observaron en sus estudios que el caldo FK no era un medio conveniente para diferenciar entre los estreptococos del grupo D, dado que otros estreptococos a-hemo- liticos daban una reaccién dcida (posi- ‘a). Asimismo, hallaron que muchas especies de Streptococcus podian desarrollarse en el medio FK, pero eran incapaces de producir el ‘icido necesario para que se produzca un cambio en el pH. Kenner y col." afirman que otras bacterias son capaces de crecimiento en caldo FK, produciendo turbiedad, aunque se mostraron incapaces de producir acido en proporciones sufi- Gentes como para dar un cambio de color, El medio FK fue elaborado para detectar la contaminacion fecal del agua y no como medio especifico para la’ identificacién presuntiva de. las especies de Streptococcus del grupo D. Junto con la prueba FK deben reali- Zarse otr0s tests. BIBLIOGRAFIA sion of Becton, Dickinson and Com- pany, 1968, pp. 115 and 138, Burrows, W., and Moulder, J. W. Test- book of Microbiology, Vol. I, 19th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Com: pany, 1968, pp, 110-111 4. Cantarow, A.. and Schepartz, B. Bio-10. nL. 12, 13, 4 chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1962, pp. 263 and 387. . Castor, L. N., and Chance, B. (1959) Photochemical determinations of the ox- idases of bacteria. J. Biol. Chem. 234, 1587. Deibel, R. H. (1964) The group D streptococci, Bacteriol. Rev., 28, 330. Difeo Manual, 9th ed., Detroit, Michi- gan: Difeo Laboratories, 1953, pp. 46- 48 Difco Supplementary Literature, De- troit, Michigan: Difeo Laboratories, 1968, pp. 100 and 229, Dubos, R. J., and Hirsch, J. G. Bacterial and Mycotic Infections of Man, 4th ed., Philadelphia: J. B. Lippincott Com: pany, 1965, pp. 98-94 Facklam, R, R. (1972) Recognition of group D ‘streptococeal species of human origin by biochemical and physiological tests. Appl. Microbiol., 23, 1191. Facklam, R. R., and Moody, M. D. (1970) Presumptive identification of group D streptococci: the bile-esculin test. Appl. Microbiol., 20, 245. Frobisher, M. Fundamentals of Microbi- ology, Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1957, p. 181. Hartman, P. A., Reinbold, G. W., and Saraswat, D. 8. (1966) Indicator organisms—a review. I. Taxonomy of the fecal streptococci. Int. J. Syst. Bacte- riol., 16, 197. Hajna, A. A., and Perry, C. A. (1943) Comparative study of presumptive and confirmative media for bacteria of the coliform group and for fecal streptococei. Am. J. Public Health, 33, 550. 16. 1 18. 19 20 a1 22. Coldes fecales para enteracocos 77 . Harrow, B. and Mazur, A. Textbook of Biochemistry, Sth ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1966, p. 190. Jones, D., and Shattock, P. M, F. 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(1962) The serological grouping of Strep- tococcus equinus. J. Gen. Microbiol.,29, 731 Steel, K. J. (1961) The oxidase reaction as a taxonomic tool. J. Gen. Microbiol., 25, 291,Prueba de la 8-galactosidasa (ONPG) I. PRINCIPIO Demostrar la presencia 0 ausencia de la enzima f-galactosidasa_utilizando el compuesto organico o-nitrofenil-B-D-galactopira- nésido (ONPG). I. OBJETIVO (Véase también Ia Seccién III, Capitulos 33 y 34) A) Diferenciar entre os organismos con reaccién retardada a la lactosa de los organismos lactosa negativos, 1. Citrobacter y Arizona (+) de Salmone- Mla (—). cherickia coli anaerogénico (Alkales- cens dispar) (+) de la Shigella (-) B) Ayudar ala diferenciacion de las especies: Pseudomonas cepacia C+) y Pseudomonas maltophilia (+) de otras especies de Pseudo- monas (—). Ill, BASES BIOQUIMICAS Se clasifica a las enzimas bacterianas como constitutivas o adaptativas. Una enzima adaptativa o inducida es aquella producida por una bacteria sélo cuando se encuentra. stt sustrato especifico, mientras que una enzima constitutiva se produce tanto en ausencia 0 en presencia del sustrato” La B-galactosidasa es una enzima inducible; su accién es especifica contras las galactosidasas simples.* La formacion de una enzima inducida es controlada genéticamente; sin embargo, la presencia de una enzima inducida puede disminuir en las células después de varias generaciones si se suprime el inductor (sustrato).’ También la mutacién de un gene puede hacer que una enzima inducida’ se convierta en enzima constitutiva; el mecanismo de formacién es el mismo.? Cohen y Monod han informado que en los mutantes, la B-galactosa inhibe la formacién de B-galactosidasa_constitutiva. Un. glucdsido €s un compuesto. acetal (RCH < QR" ) formado a partir de un hidrato, de carbono que existe en alguna de sus dos formas: a0 B. En la forma 8 el grupo oxhidrilo (OH) en el carbono mimero I esti por arriba del plano del anillo o a la izquierda en la formula estructural en cadena recta de un hidrato de carbono, mientras que en la forma @ esti debajo del plano oa la derecha en la cadena recta. “CH.OH ¢ HOH Forma a Forma gEn el disacarido lactosa, dos monosacari dos, glucosa y galactosa, estén unidos a través de grupos oxhidrilos por un enlace glucosidico. H ; —« H'C—OH ( HoH oO ee ae | wt H Hot ‘cH,on Residuo de glucosa Residuo de galactosa “CHOH ‘CHOH af c on) On On Residuo de galactosa Residuo de glucosa Enlace p-glucosdico lactosa nosil}-D-glucopiranosa) la B-galactosidasa se denomina a 68919 debido a su descomposicién de la _lactosa. Sin embargo, también puede hidrolizar otros galactésidos; # generalmente esta hidrdlisis no es catalizada por una lactasa especifica? El sustrato lactosa es una galactosidasa natural que, cuando es catalizada por una 8-D-galactosidasa, produce -D-galactosa y Deglucosa; Ja ligadura se rompe entre el ono 1 ciate galactosa y el oxigeno. Los organismos que fermentan la lactosa en forma activa poseen dos enzimas inducidas genéticamente diferentes: -galactosidasa-permeasa y B-D-galactosidasa.*# Antes de que el sustrato lactosa pueda ser metabolizado por un organismo debe penetrar en la pared de la célula, La enzima Begolactosidasa 79 B-galactosidasa-permeasa est localizada en la membrana celular y se halla vinculada con el trasporte de la lactosa. El trasporte de todos los elementos nutritivos es controlado por permeasas proteicas especificas;"” la B- galactosidasa-permeasa es especifica para la alactosa ® 0 los galactosidos. La -galactosi- lasa-permeasa puede ser inducida por la presencia de lactosa en el medio 0 por otros galactésidos como la melibiosa, metil-a-D- galactésido 0 propil-a-D-galactosidasa; sin embargo, deben existir las condiciones para la sintesis proteica. El mecanismo de accién de la permeasa no ha sido determinado atin, "™ pero se sabe que la -galactosidasa-permeasa €s responsable del trasporte y acumulacion de -galactésidos dentro de la célula, donde son catalizados por la enzima-B-D-galactosidasa. La B-D-galactosidasa es una enzima intra- celular vinculada con la hidrdlisis (descom: posicién) de la lactosa y otros #-galact: dos; +5" la lactosa es hidrolizada en galactosa y glucosa. Algunos organismos son fermentadores activos de la lactosa, otros lo son en forma retardada y algunos incapaces de fermentar la lactosa, cualquiera que sean las condiciones. Los coliformes fermentadores activos de la lactosa producen tanto la enzima 6-galactosidasa-permeasa como la B-galactosidasa, y por eso catabolizan rapidamente la lactosa (dentro de las 24h) en anhidrido carbénico e hidrégeno (CO, + Hs) a través de las intermediarias galactosa y glucosa. Los no fermentadores de la lactosa carecen de ambas enzimas; por lo tanto, la lactosa no puede penctrar en la célula ni ser degradada. Sin embargo, Lowe " afirma que las células incapaces de fermentar Ia lactosa pueden presentar alguno de los dos fenotipos: 1) G-P+; pérdida de B-galactosidasa, y por lo tanto, pueden acumular galactésidos, pero son incapaces de metabolizarlos; 0 2) G-+P—: poseen B-galactosidasa, pero pierden la enzima permeasa. Los que producen la fermentacién retardada de la lactosa, llamados “fermentadores tardios de la lactosa” carecen de la enzima ‘B-galactosidasa-permeasa.* Los fermentadores retardados tienen el poder de fermentar la lactosa dado que producen la enzima ntracelular necesaria para metabolizarla. Cuando se utiliza una concentracién de lactosa al 1%, estos organismos producen durante cierto periodo de tiempo (48h a varios dias 0 semanas) algunas células mutantes que poseen f-galactosidasa-permeasa," junto con células no fermentadoras de la lactosa "® y se observa la “fermentacin80 Pruebas bioauimicas para la identificacién de bocterias tardia de la lactosa". Lowe y Evans " encon- traron que los fermentadores retardados eran impermeables a una concentracion de lactosa del 1%. Sin embargo, aumentando concentracién de la lactosa (hasta 10%) 6 el tiempo de fermentacién en algunas cepas bacterianas."" Lowe " afirma rebas sugieren que los “fermenta- paces de metabolizar la lactosa en virtud de que poseen B-galactosidasa, Por lo tanto, esti aumentado el tiempo de fermentacién de la lactosa cuando el organismo carece, en un principio, de ka enzima permeasa y es inoculade en un medio de lactosa al 1%, en comparacién con el menor tiempo para el metabolismo cuando se encuentran ambas. enzimas, EL elemento tiempo depende de la velocidad de desarrollo de las células mutantes ¥ de la velocidad de difusién del sustrato en la céhula Puede predecirse la facultad de fermentar la lactosa, demostrando la presencia ola ausencia de actividad B-galactosidasa cuando se emplea el compuesto orginico o-nitrote B-D-galactopirandsido (ONPG)2* Si se en- Baceria + ONPG hidvolizala, paigotenol Lincolores Bagtkietsida "Gumarlloy NU: cHoH DH bidvatizaa, GS) °NOs Byalactosidasa Lea sinvtenilp-D- o-nitvote ‘galactopinsnirst (NP) LONPG) cuentran células positivas para la metaboliz: cidn_ activa de ka galactosidasa, el reactive ONPG incoloro es hidrolizado liberando un compuesto cromogénico amarillo, o-nitrofenol (ONP): la prueba de la B-galactosid: positiva se basa en la deteccién del o-nitrofenol. El o-nitrofenol liberado sufre un cambi tautomérico cuando se_encuentra en una solucién alcalina, produciendo un color amarillo.* Este compuesto es un acido débil y en condiciones aicidas es casi incoloro; por lo tanto es fundamental determinar la actividad de la B-galactosidasa en una solucion bien amortiguada.” El o-nitrofenol puede ser detectado © medido en dilucién débil.* Muchos organismos son capaces de demos- (rar una actividad B-galactosidasa positiva, Segiin los estudios de LeMinor y Ben Hamida,” los sigui mentadores dios de la una rea Begalaccosid. schevichia coli, alu nas cepas de Klebsiella, algunas cepas de Enterobacter, el grupo Arizona, Citrobacter y Shigella sonnei, ‘LeMinor y Ben Hamida estudiaron también otros organismos que dieron una reaccién B-galactosidasa rapid mente positiva: Enterobacter hajnia, Serratia marcescens, Mlealescens-Dispar, Shigella. dysen- teria 1. Vibrio cholera, Pasteurella preudotu- berculosis y Pasteurella haemolytica. IV. REACTIVOS EMPLEADOS A) Bu fostato de sodio, 0,01 M, pH:74"" Agregar 69g de NasHPO,, a 45 ml de agua destilada en_un frasco volu- métrico de 50 ml. 2. Disolver por calemtamiento a 37° C. 3. Lentamente, agregar aproximadamente 7,5ml de hidréxido de sodio (NaOH) 5.N (0 3g) mientras se adapta el pH a7. 4. Agregar agua destilada h: un volumen de 50 ml. Rotular correctamente. hidréxido de sodio es sumamente cdustico; evitar el contacto con la piel porque pueden producirse quemaduras dolorosas. 1 obtener B) o-Nitrofenil-B-D-galactopirandsido (o-ni trofenil-B-D-galactosido). compuesto orto (0) puede ser sus- tituido por el p-nitrofenil-B-D-galacté- iclo.* 2. Existen productos comerciales: (véase ¢l Apéndice V) a) Sigma Chemical Company. b) Calbiochem. iS Método de preparacion. a) Agregar 80 mg de reactivo ONPG a 15 ml de agua destilada. Calentar el frasco a 37°C para disolver los cristales. No calentar demasiado, © Agregar 5 ml de la solucién det ag ruter fostato y austar el pH a 7. ) b) Conservar en’ frasco. de. vidrio color caramelo. Evitar la innecesaria exposicién a la luz,¢) Rotular correctamente. La solucién de ONPG debe ser incolora para determinar la actividad B-galactosidasa ©) Tolueno, graduaci6n analitica, D) Solucidn fisioligica (CINa 0,85 %). E) Control de calidad: Debe controlarse la solucién de ONPG con cultivos positivos y negativos conocidos antes de su empleo general. Las especies E. coli y Proteus son Controles convenientes, dado que se obtienen facilmente y no ctean problemas si se mai de cultivos madre. E.coli: F) Conservac todos los reactivos en el refrigerador (4° C) mientras no se emplean. Su estabilidad es variable; por lo tanto, se hara un control de calidad peridico y se desecharan si_muestran una reaccién negativa o débil con un organismo reconocidamente positivo, An- tes de su empleo, deberd colocarse la solucién de ONPG en un baiio de agua a 37°C para volver 2 disolver el fosfato que cristaliza durante la conservacion.* Vv. METODOS A) Método 1 1. Caldo de cultivo: el adecuado para el organismo. a) Inocular retirando con ¢l asa una cantidad abundante del organismo en estudio." b) Incubacién. 37°C, 18 a 24 h. 2. Método de utilizacién. a) Después de la incubacién, centrifugar y retirar el sobrenadante colocindolo en un desinfectante. Al sedimento celular, agregar 0,25 ml de solucion fisiolégica normal (0,85 %). Agregar una gota de tolueno y agitar el tubo? Colocar el tubo en un bano de agua a 37°C durante § a 10 min. Agregar 0,25 ml de solucion de ONPG a la suspensién celular. 1) Reincubar. Baiiodeaguaa37°C.20 min, a 24 h, 1. Leer el resultado al término de 20 min, b) ©) d) e) B) B-galactosidasa 81 2. Si ex negativo (no se observa cambio de color), continuar laincubacién y leer al cabo de 1, 2,3 y 24 ho hasta que se produzca un cambio de color dentro de un periodo de 24h. Método 2. 1. Medio de ONPG." crecimiento: caldo_ de 2) Solucién de ONPG. 1. Ingredientes. a) ONPG b) Buffer fostato de sodio, pH 001M 1.000 ml 2. Método de preparacién. a) Disolver a la temperatura del ambiente (25° ©). bp Esterilizacion: filtracion, Método del filtro de mem- bran Millipore. Memb: nas, didmetro del poro 0.45 micrones, b) Agua de peptona, al 1%. 1. Ingredientes. a) Peptona........ 10g b) Cloruro de sodio (CINa) ... bg ©) Agua destilada . 1.000 ml 2. Método de preparacion. a) Colocar los ingredientes en 5 un frasco y disolver por * calentamiento. b) Ajustar el pH de 8 a 84. ©) Hervir 10 min d) Filtrar. ©) Reajustarel pH de7,2a 7.4 3. Método de esterilizacion. Au- clave. 115° C, 20 min, étodo de utilizacién.s" a) Asépticamente, agregar 1 parte (250 ml) de solucién de ONPG estéril, a 3 partes (750 ml) de agua de peptona al I % estéril en un frasco82 Fruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias esterilizado, Para evitar el uso de otro frasco esterilizado, agregar 250 ml (1 parte) de la solucion de ONPG preparada directamente a 750ml @ panes) de agua de peptona. b) Distribuir en tubos, aproximada mente 2,5 ml de caldo de ONPG por tubo esterilizado. ©) Inocular un tubo de caldo ONPG- agua de peptona con un inéculo espesn (tomado con el asa)."° d) Incubacién. Bano de agua o incubadora a 37°C, 20 min a 24h 1. Leer el tubo al cabo de 20 min, 2. Si es negativo (no se ha producido cambio de color) continuar la incubacién hasta que se produzca un cambio de color dentro de un periodo de 24h LeMinor y Ben Hamida * recomiendan el empleo de tolueno para favorecer la libera- cién de la enzima B-galactosidasa. Sin embargo, Lowe ® asegura que el tolueno no es esencial para la liberacidn de la enzima si el organismo ha sido sometido a una incubacion de 24 h en una suspensién en caldo ONPG. La reaccién B-galactosidasa positiva se basa en la observacién de un cambio de color, y por lo tanto el volumen total no tiene demasiada importancia. VI. RESULTADOS Los fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 10-1 (Apéndice 1) VII. INTERPRETACION A) Prueba positiva 1. Color amarillo. 2 20 mina 24h. B) Prueba negativa: incoloro después de 24h, Si se usa un inéculo espeso, se producira una reaccién positiva répida dentro de un periodo de incubacién de 20 min a 3h; un color amarillo a los 20 min es una reaccién positiva intensa. El color amarillo producido es estable y no se aclarara si no se observa inmediatamente una reaccién positiva. VIII. PRUEBAS RAPIDAS A) Cinta impregnada con reactive para la prueba de la B-galactosidasa (ONPG) (PathoTee). 1. Fabricante: General Diagnostics Divi- sion, Warner- 2. Resultados: 3. Métodos: seguir las indicaciones del fabricante, 4, Gorrelacién con la prueba standard: 100 %."* B) Tabletas Key para la prueba ONPG. Fabricamte: Key Company. Resultados: dentro de las 6 h o menos. Método: seguir las indicaciones del fabricante. Correlacidn con la prueba standard. Scientific Products + ey a) A veces falsamente negativa por indéculo insuficiente. b) Es necesario un inéculo espeso de un cultivo en AHTA o AHK. C) Discos de papel de filtro ONPG de Difco. 1, Fabricante: Difco Laboratories. 2. Método: seguir las indicaciones del fabricante. IX. PRECAUCIONES A) En cualquiera de los métodos es necesario un inéculo espeso (la cantidad recogida con el asa de inoculacién) para obtener una alta concentracién de enzima, si ésta se encuentra presente, y aumentar la velocidad de una reaccién positiva® Antes de su empleo, debe colocarse la solucién 0 caldo ONPG en un bafio de agua a 37°C para redisolver el fosfato que cristaliza durante su conservacién? Si la solucién de ONPG no esta convenientemente amortiguada pueden producirse resultados falsamente negativos 0 falsamente positivos Puede producirse un resultado falsa mente negativo (incoloro) si la solucién es 4cida. EV ortonitrofenol liberado es un Acido débil y su tautémero bencenoide Acido es casi incoloro.* Por lo tanto, la determinacién del ortonitrofenol liberado debe hacerse en alguna de estas dos condiciones: 1) una solucién bien amorti- B) c)guada, pH:7 a 7.5, con lo cual se disocia na proporcién fija produciendo un color amarillo, 0 2) con un pH fuertemente alcalino, de 10 0 mas, en el cual una porcion insignificante queda sin disociar- se e incolora.* Puede producirse un resultado falsamente positivo (amarillo) sila solucién no esti convenientemente amortiguada debido a la estimulacién de la aparente actividad galactosidasa por los iones sodio.** El rubidio y los iones amonio sustituidos como el etanolamonio y etilendiamoni acttian como inhibidores de la actividad galactosidasa® Lederberg * sugiere que estos iones compiten entre si y posiblemente con el ion hidrégeno, dado que el efecto inhibidor del rubidio (Rb) sufre una reversién por los iones sodio o potasio, y dice que los iones bivalentes como el cloruro, sulfato, nitrato, acetato y fosfato, no demostraron tener efecto sobre la actividad enzimatica, 1, Belliveau, R. R., Grayson, and Butler, T. J. (1968) A ra B-galactosidasa 83 Lederberg observé también que la con- servacién de células bacterianas en un buffer M/10 podia intensificar la activi dad galactosidasa; la conservacién_ en agua destlada bajo refrigeracién no tiene efecto. Es necesario tener cuidado de mantener las suspensiones celulares en su estado original.* 2 D) La solucién de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo para la determinacion de la actividad enzimatica. En el caldo de ONPG, la misma peptona uede impartir un ligero color amarillo a la suspensién célula-caldo, aun cuando solo se encuentra en una concentracién del 1%. Una reaccién positiva es capaz de variar en la intensidad del color amarillo producide, por lo tanto, se aconseja efectuar simultaneamente un control negativo cuando se usa la suspension célula- caldo ONPG. BIBLIOGRAFIA tosidase sur celle de la fermentation du lactose en milieu complexe dans le diag- method of identifying Enterobacteri- aceae. Am. J. Clin. Pathol., 50, 126. 2, Burrows, W., and Moulder, J. W. Text- book of Microbiology, Vol. 1, 19th ed., Philadelphia: W.B.” Saunders Com: pany, 1968, p. 116. 3. Cantarow, A., and Schepartz, B. Bio- chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W.B, Saunders Company, 1962, pp. 241-242, 4. Cohen, G. N., and Monod, J. (1957) Bac- terial permeases. Bacteriol. Rev., 21, 169. 5. Cowan, S, T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 34, 98, and 122. 6, Fieser, L., and Fieser, M. Organic Chemistry, 3rd ed., New York: Reinhold Publishing Corporation, 1956, p. 461, 1. Harrow, B., and Mazur, A. Textbook of Biochemistry, Sth ed., Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1966, p. 981 8, Lederberg, J. (1950) The beta-p-galactosidase of Escherichia coli, strain K-12. J. Bacteriol., 60, 381 9, LeMinor, L., and Ben Hamida, F. (1962) Avantages de la recherche de la P-galac- 10. nL 12, 13, 4 16 : Metabolism, nastic bactériologique, en particulier des Enterobacteriaceae. Ann. Inst. Pas- teur, 102, 267 Lowe, G. H, (1962) The rapid detection of lactose fermentation in paracelon organisms by the demonstration of 6->- galactosidase, J. Med. Lab. Technol., 19, 21. Lowe, G. H., and Evans, J. H. (1957) A sample medium for the rapid detection of salmonella-like paracolon organisms. J. Clin, Pathol., 10, 318. Oginsky, EL. and Umbreit, W. W. An Introduction to Bacterial Physiology, 2d ed San Prancieco! W. H. reemen and Company, 1959, p. 398, Oser, B. L. Hawk's Physiological Chem- istry, 14th ed., New York: MeGraw-Hill Book Company, 1965, pp. 395 and 404, Rosner, R. (1873) Evaluation of the PathoTee “Rapid I-D” system and two Aaditional experimental reagentim pregnated paper strips. Ay iero- Bia 26,290, APP Mi Sokatch, J.R. Bacterial Physiology and New York: Academic Press, 1969, pp. 62 and 67.Prueba de licuefaccién de la gelatina I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteolitico (gelatinasas) que licuan la gelatina. I. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32 a 34.) A) Ayudar a la diferenciacién entre los géne 1, Staphylococcus aureus (+) del Staphyte coccus epidermidis (+, lento) y especies de Micrococcus (variables y lentas) 2. Listeria monocytogenes (=) de ciertas especies de Corynebacterium: C. uleevans (4). C. haemolyticum (+) y ©. pyogenes (variable, en su mayorfa_positiva). B) Ayudar a la diferenciacién de las especies. Staphylococcus aureus (+) del Staphylococcus opidtermidis (+, lent ©) Ayudar a la identificacién de: 1. Serratia tiquefaciens (+). Preis + yo Beet Polipeptides + Hat bey HO Neprichisis 2. Serratia marcescens (+). 3. Pseudomonas aeruginosa (+, 4. Especies de Flavobacterium (+) ripida) Ill. BASES BIOQUIMICAS Se incorpora gelatina a diversos medios para determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteolitico que, a su vez, son detectadas por la digestion 0 licuefaccién de la gelatina presente. Estas enzimas, que son capaces de gelatindlisis, se denominan gelatinasas. Las proteinas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar en una célula bacteriana; por lo tanto, para que una célula utilice las proteinas, primero debe ser catabolizada en componentes més peque- hos. Las enzimas exocelulares de tipo proteolitico, gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteinas, y esta capacidad ayuda a la identificacion bacteriana. EI catabolismo de las proteinas por las gelatinasas es un proceso en dos etapas, y el Tesultado final da una mezcla de aminoiicidos individuales. polipéptides a nodcidos individuates @IV, MEDIOS EMPLEADOS A) Medio de gelitina de Kohn,’ muy reco- mendaco, 1. Discos de gelatina desnaturalizada y carbon a) Ingredientes. 1. Gelatina nuvritiva 15g 2. Agua corriente o destilada fria 100 mi 3. Carbon inactivado, finamente pulverizado . 35g b) ©) Existen productos en el comercio: gelatina nutritiva, Difco.” BBL." Método de preparacién. 1. Espolvorear la gelatina nutritiva sobre la superficie del agua Esperar unos minutos hasta que la misma se humedezca y se forme una suspensién ho- mogénea. 2. Hacer hervir la mezela de gelatina. 3. Agregar carbén en polvo. 4. Agitar bien y dejar enfriar hasta 48°C en un baiio de agua. 5. Volcar en una capsula de Petri de vidrio u otro recipiente adecuado, cuyo fondo se habra recubierto con una fina pelicu- la de Vaspar (cera) o vaselina, hasta una altura de 3mm. a) Volar la mezcla bastame fria como para que coagule ripidamente, de manera de evitar que se forme un sedimento de carbé: b) La cubierta interior del re- Gpiente impide que la mez- dla de gelatina y carbén se adhiera al vidrio, y facilita su remocién. 6. Dejar que la mezcla se endu- rezca. 7. Suavemente, retivar la lamina de gelatina y carbon intacta, y Colocarla en formol al 10% durante 24 h. © ad) e) i) Licuefaccién de la gelatina 85 a) Formaldehido, M0 % oo 10 ml b) Agua destilada . 90 ml ¢) Carbonato de calcio (CO;Ca) 1 ) Cloruro de sodio (CINa) 09g 8. Cortar discos de gelatina con carb6én, de J cm de diimetro. 9. Envolver en gasa los discos de gelatina y dejarlos durante 34h debajo de un chorro de agua corriente 10. Colocar los discos en tubos con tapa a rosca (1 por tubo) y cubrir con una pequena canti: dad de agua, Dejar Hoja la tapa. Método de esterilizacion: * dos mé- todos. 1. Vapor circulante, 30 min. 2. Calentamiento repetido, 3 veces. a) Barto de agua a 90-100" C. b) 20 min cada vez Después de la esterilizacién. 1. Decantar el agua asépticamente. 2. Agregar de 3a 4 ml por tubo de caldo de tripticasa de soja (CTS) estéril u otro medio de crecimiento liquide adecuado, estéril. 3. Incubar durante 24h antes de su empleo, como control de esterilidad. Dejar enfriar antes de su empleo, ajustar as tapas y refrigerar para su conservacion (4-10° C). Inoculaci6n. a) b) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h: en AHTA, AHK u otro cultivo adecuado. Suspensidn densa Preparar un tubo de control (no inoculado) junto con la bacteria en estudio, y rotularloconvenientemente, Incubacién. a) Simultaneamente los tubos con caldo de prueba y el de control aa86 Pruebas bioquimicas pora la ideniificacién de bacterios b) 35-87° C4!" método de rutina. ©) 18a 24h, o mas. La prueba de la gelatina de Kohn depende de la presencia de una enzima preformada o inducida, gelatinasa, cuya actividad licua ta gelatina, liberando de tal modo las particulas de carbén.? Se recomienda la inoculacién del medio con un inéculo denso de la bacteria en estudio, ya que el tiempo de licuefaccion esta determinado por la cantidad de enzima preformada que exista.'” La gelatina con carbén acta solamente como un sustrato para determinar la actividad de la gelatinasa; no sirve como medio nutritivo. Este sustrato contiene una gran cantidad de pequenisimas particulas de carbon unidas por una pequena cantidad de gelatina que, aun con una ligera licuefac- Cién, libera dichas particulas que pueden detectarse ficilmente." De alli que las particulas de carbon liberadas resulten un indice de la licuefaccion de la gelatina.” El método de Kohn, con gelatina desnaturalizada, carbon y formol es ripido por la termoestabilidad de la gelatina desnaturalizada con formol."” Cuando son sometidas al calor todas las proteinas resultan clesnatura- lizadas; sin embargo, la gelatina proteica es una excepcién.* Con la gelatina de Kohn puede producirse la licuefaceidn a los 87° Cy solo hace falta que se licue una pequena cantidad de gelatina para que queden libera das las particulas de carbon, dando u prueba positiva. La licuefaccién de la gelat puede detectarse denuo de las 24 h, en comparacion con 7 dias o mis cuando se utiliza el método mas comin, la picadura en gelatina nutritiva incubada a 22°C Kohn ® recomienda no someter a autoclave su medio, dado que ello puede ablandar la clatina, Tampoco se producen resultados ‘alsamente positivos si el medio le cultivo de Kohn es agitado mecanicamente; en realidad, se recomienda la agitacién cuando se inter~ pretan los resultados." B) Medio de gelatina nuvritiva para puncién, pH:6.8.% 1. Ingredientes a) Extracto de carne b) Peptona ©) Gelatina d) Agua destilada 5 120g 1.000 ml 2. Existen productos comerciales: BBL. Ditco. &. Métodos «le preparac a) b) Método de esteri 121° Ch Enfr tapas, y Ingredientes individuales 1. Primero agregar solamente ge latina al agua destilada o desmineralizada y dejar descansar de 15 a 30 min. 2. Calentar hasta que hierva (50°C) para que se diluya la gelat Agregar el extracto de carne y la peptona, y volver a ¢ hasta ebullicion para d todos los componentes. 4. No calentar en exceso. 5. Ajustar el pH de 68 a Medio deshidratado comercial 1. Pesar exactamente la cantidad siguiendo las indicaciones del prospecto. 2. Rehidratar con agua destilada © desmineralizada, 3. Calemtar suavemente hasta su disolucién, 4. Distribuir en tubos, aproximadamemte de 4 a5 ml por cada tubo con tapa a rosea. Dejar las tapas flojas. libras, 15 min, av en posicion vertical, ajustar las relrigerar para su. conservacion (4-10° ©) Inoculacion. a) b) Mantener en el refrigerador los tubos de gelatina hasta el momento de su inoculacién. El medio debe estar solidificado, Aguja de inoculacién 1. Crecimiento de un cultive puro de 18 a 24h: en AHK u otro medio de cultivo conveniente. Indculo espeso. Hacer una puncién en el medio hasta una profundidad de 1My a 24cm. Preparar un tubo de control para hacer la prueba junto con los de la bacteria en estudio. Rotular control Incubacion, Simultineamente los tubos de prueba y de control. 2: oa 259 C 5° C, 24 ha 4 dias.a) Observar si hay crecimiento (tur biedad) y licuefaccion, Al término de cada periodo de 24 h, colocar ambos tubos (bacteria y control) en un refrigerador © un baiio de hielo durante un periodo suficiente (aproximadamente 2h)" para determinar si se ha producido 0 no la digestion de la gelatina (licuefaccion). Hacer el traspaso de la incubadora al refrigerador sin agitar los tubos. b) Controlar diariamente los tubos hasta 2 semanas a menos que la licuefaccién se produzca antes. A veces puede ser necesario una incubacién prolongada (de 30 dias a 6 semanas)."! En las pruebas de rutina, se determinan los resultados de la licuefaccién al término de 2 semanas de incubacién a 35° C. El medio de gelatina nutritiva para puncién no es conveniente para las pruebas de rutina de la actividad de la gelatinasa, dado que muchas especies requieren una incubacién prolongada antes de que aparezcan muestras de licuefaccion" En los métodos diagnés- ticos de rutina para identificar bacterias, la duracién de la incubacién debera alcanzar un periodo razonable C) Medio de gelatina con tioglicolato, pH:74 1. Ingredientes. a) Casitona 15,5 g b) Extractodelevadura 5g ©) Dextrosa (glucosa) 2 ¢ d) Cloruro de sodio (CINa) 25 g ©) Lecistina 0.25 g 1} Sulfito de sodio (NaSO.) Ol g 8) Acido tioglicdtico 03. mi h) Agar 0.75 g i) Gelatina 50g j) Agua destilada 1.000 ml 2. Producto comercial: Difco. 3. Método de preparacién.* a) Pesar exactamente la cantidad segiin las indicaciones del prospecto. b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada fria. Licuefacci6n de la gelatina ©) Colocar en un bafio de agua a 50° C para que se mojen los ingredientes ) Calentar suavemente hasta su diso- lucién, €) Distribuir en tbos, aproximadamente de 4 a 5ml por cada tubo con tapa a rosca. f) Dejar las tapas flojas. 4. Método de esterilizacién. Autoclave. 121° C, 15 libras, 15 min, Enfriar en posicién vertical, ajustar las tapas y refrigerar para su conservacion (410° C). 6. Inoculacién, a) Mantener los tubos de gelatina con tioglicolato. en un. refrigerador hasta el momento de la inoculacién. b) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h: en AHK o cualquier otro medio apropiado. ©) Suspension densa. 7. Preparar un tubo de control (no inoculado) junto con la bacteria en estudio. Roiular control 8. Incubacion. a) Ambos tubos, el de prueba y el de control, simultineamente. b) 22-25°C 0a 85°C. ©) 24ha 14 dias 1. Observar si hay crecimiento (turbiedad) y controlar la licue- faccién al término de cada periodo de 24h, colocando ambos tubos (de prueba y de control) en un refrigerador 0 en un bano de hielo durante un periodo suficiente (2 h) © para determinar si se ha producido la licuefaccion de la gelatina. 2. Controlar diariamente los t- bos, hasta las 2 semanas, a menos que se produzca antes la licuefaccién. A veces puede ser necesaria una incubacién mas prolongada (30 dias) El medio de gelatina con tioglicolaté puede prepararse también agregando simplemente una concentracién de gelatina al 5% a un medio de tioglicolato ‘deshidratado.’ Este medio permite la determinacién de la licue-88 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias faccién bacteriana de la gelatina sin tener en cuenta los requerimientos de oxigeno: por lo tanto, no se necesitan métodos de incubacién especiales (por ejemplo, anaerobiosis). La actividad de la gelatinasa varia entre las bacterias segin la temperatura de incubacin; la cantidad de enzima producida difiere de un género a otro." Los estalilococos producen mas enzima gelatinasa cuando un Cultivo es incubado para su crecimiento a 20° C, mejor que a 37°C." Gorini * muestra en sus experiencias que la mayor actividad gelatinasica ocurre cuando el cultivo se prueba para su desarrollo a 26°C, avis que a 37°C. V. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 11-1 (Apéndice 1), VI. INTERPRETACIONES A) Medio de gelatina con carbén de Kohn 1. Positivo. 2) Organismo en estudio. 1. Las particulas libres de carbon se depositan en el fondo del tubo. 1 saaciemente el tubo para las particulay. vuelvan a suspenderse, presentindese como “una nube negra visible" b) “Tubo de control ina con carbon, 1. Mezela de gel imtacta 2. Nose observan panticulas libres de carbon en el medio, Negativo, a) Organism en estudio. 1. Mevcla de gelatina con carbon, « inntacta 2. Nose observan particulas libres de carbon en el inedio. Reincubar durante un perfodo adicional b) Tubo de control 1. Mezcla de gelatina con carbin, intacta 2. Nose observan particulas libres de carbon en el medio, B) Medio de gelatina nutritiva para puncién © medio con tioglicolato. Precauciones: entriar el medio sise ha incubado a 37° C antes de interpretar los resultados L. Positive, a) Organismo en estudio: medio cuaudo. b) Tubo de control: el medio. se mantiene sélide, 2 Negativo, a) Organismo en estudio: El medio se mantiene slide, Volver a incubar durante un periodo adicional b) Tubo de control: el medio se mantiene sdlido. VII. PRECAUCIONES A) Generales, 1. Preparar siempre un tubo de control (no inoculado) junto con el organismo en estudio; es suficiente un solo tubo de control si se hace la prueba simultsinea de varios organismos, tinicamente cuando todos los tbos son inoculados al mismo tiempo, 2. La gelatina es sdlida cuando se incuba a 20°C 09 menos y liquida a una temperatura de 35° Co mis. La gelatina cambia de gel (estado sélido) a liquido a los 28° C aproximadamente. Por lo tanto, si se incuban los tubos de gelatina a 35°C 0 mis, deben ser colocados primero en un refrigerador oun bano de hielo y enfriado antes de su interpretacién No agitar los tubos de gelatina mientras estin caliemes ya que, con fs cuencia, el crecimiento ¥ la licuetac- cién de la gelatinase producen solamente en La capa superficial.’ Si se agita kt gelatina dejindola. merclar con el liquido caliente del_medio, exite la posbitdad de pasar por ato un resultado. positive, informando un resultado falsamente negativo.B) Medio de gelatina con carbon de Kohn, i Después de la preparacién de los discos de gelatina con carbén, es fundamental lavarlos bien en agua corriente durante 24 h para quitarles todo vestigio de formol. Este residuo podria inhibir la actividad de la gelatinasa.” Kohn hallé que un caldo de peptona es superior al caldo nutritive como medio liquido para la licuefaccién de la gelatina. Segiin Kohn, el caldo nutritivo tiene “un efecto inhibitorio definido y los resultados son retardados en cierta medida” Edwards y Ewing * recomendaron el agregado de 0,1 ml de tolueno por tubo de medio de Kohn para acelerar las cepas bacterianas, que son lentas en su accién de licuar la gelatina. EI tolueno aumenta el tiempo de licuefaccién y se geman de 1 a3 dias, Licuefaccién de la gelatina 89 mente a 20° C y sensible al calor y al tolueno; la segunda producida tantoa 20° como a 37° C, termoestable y no afectada por el tolueno. La temperatura de crecimiento influye sobre la cantidad y tipo de enzima producida.” La utilidad del tolueno se apliea principalmente a los licuadores lentos de la gelatina. Sin embargo, dado que algunas cepas bacterianas son inhi das por el tolueno, Lautrop recomien- dla que si se usa este solvente, debe incubarse simultaneamente dos tubos por cada organismo en estudio, uno de ellos sin el agregado de tolueno. C) Medio de getatina nutritiva para puncidn L. El tipo de licuefaccién de la gelatina (por ejemplo, en forma de pino, de ino invertido, etc.) no tiene mucha importancia para el diagnéstico de rutina. Basta con registrar licuefac- Gion de la gelatina positiva o negativa. y a veces hasta 6 07, para obtener —-2._‘La gelatina varia en cuanto a su capa- un resultado positivo.” E] tolueno es cidad de gelificacién;* por lo tanto, un solvente Iipido que aumenta la cada lote de medio de gelatina nutri- liberacién de enzimas intracelulares tiva debera ser sometido a control. por medio de un aumento en la per- 3. Las bacterias mesofilicas pueden cre~ meabilidad de la pared celular. No cer muy lentamente, 0 no desarrollar- obstante, Lautrop asegura que el se, cuando son incubadas a 22-25° C. efecto del tolueno es variable; puede Para evitar este problema, incubar aumentar o inhibir la licuefaccion y el los tubos a 35°C y enfriar antes de resultado depende de la temperatura interpretar los resultados.* de incubacion. Lautrop ® habla de la 4. Segiin Cowan y Steel * algunas bacte- posibilidad de que existan dos enzi- rias_no muestran crecimiento en el mas gelatinasas; una producida sola- medio de gelatina nutritiva, BIBLIOGRAFIA BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, Sth ed., Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi. sion of Becton, Dickinson and’ Com- pany, 1968, pp. 129 and 160 Cowan, §.'T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 19, 27-28, 16, and 156. Difeo Manual, 9th ed., Detroit: Difeo Laboratories, 1953, p. 32. and 450, Frobisher, M. Fundamentals of Microbi- ology, Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1957, p. 239, Gorini, L. (1981) ‘Le réle du calcium Gans Vactivité ot Ia stabilité de qu- elques proteinases bactériennes. Bio- chim. Biophys. Acta, 6, 237, |. Kohn, J. (1953) A preliminary report of a new gelatin liquefaction method. J. Clin, Pathol., 6. 249. Difco Supplementary Literature, De- 10. Lautrop, H. (1856) A modified Kohn’s troit: Difeo Laboratories, 1968, p. 401. test for the demonstration of bacterial Edwards, P. R., and Ewing, W. H. Iden- gelatin liquefaction. Acta Pathol. Micro- tification of Enterobacteriaceae, Minne- biol. Scand., 39, 357, apolis: Burgess Publishing Company, 11, Wilson, Sir G. S., and Miles, A. A. To- 1955, pp. 245-246. Fieser, L. F., and Fieser, M. Organic Chemistry, 3rd ed., Now York: Reinhold Publishing Corporation, 1956, pp. 417 ley and Wilson’s Principles of Bacteriol- ogy and Immunity, Vol. I, 5th ed: Balti- more: The Williams & Wilkins Com- any, 1964, pp. 493-494,12 Prueba del gluconato I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de oxidar el acido glucénico, su tinica fuente de carbono, en los compuestos reductores 2-cetogluconato. Il, OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 33 y 34.) A) Ayuda a la diferenciacién entre los gé- neros. 1. Enterobacter (+) y Klebsiella (+) del Escherichia coli (~). 2. Pseudomonas aeruginosa (+) del Aleali- genes faecalis (—) B) Ayudar fundamentalmente a la diferenciacion de las especies: Pwendomonas aeruginosa (+), Pefluorescens (+), P. cepacia (+), P. pseudomallei (+), P. putida (+) y P. mallet (variable) de otras especies de Pseudo- monas (=). ) Ayudar a la identificacin de: especies de Serratia (por lo general +). III. BASES BIOQUIMICAS EL sustrato gluconate de potasio (cide glucénico potasico) es una sal potisica del ficido glucdnico, En un principio la oxidacion del gluconato fue utilizada por Haynes * para diferenciar las Pseudomonas, pero actual mente se sabe que otros organismos. sobre todo entre las Enterobacteriaceae, poscen esta capacidad. Las bacterias utilizan los hidratos de carbono por medio de dos procesos metabélicos: la fermentacién 6 la oxidacién. En el proceso fermentativo, el catabolismo de la glucosa comprende la fosforilacién inicial, después un desdoblamiento en dos moléeulas triosa. Sin embargo, cuando la glucosa es metabolizada por oxidaciin en Acido ghucénico, no se produce la fosforilaciin inicial y solamente ‘aquellos organismos eapaces de metabolisme oxidative pueden utilizar el gluconato de potasio como su tini fuente de carbo Estos organismos oxidativos son sobligados. Sebek yRandles "afirman que la falta de fostorilacién en la etapa inicial de oxidacién se debe a la incapacidad del adenosintsifosfato (ATP) de penetrar en li célula bacte En la oxidacidn, la giucosa no es desdoblada en dos moléculas triesa; el grupo aldehido es. oxidado directamente en un grupo carboxilo que forma acido glucdnico. Los azticares aldosas como la glucosa y la galactosa son aldehidos polihidricos, por lo cual cada molécula contiene un grupo aldehido. Cuan- do solamente se oxidan los grupos aldehidos en grupos carboxilo, la serie de compuestos derivados se denominan “icidos aldénicos”, uno de los cuales es el dcido glucénico,"" qu puede ser nuevamente degradado en icido S-cetogluconico (2-cetogluconato), el inter= mediario clave en la prueba del gliconato, a[GHG — grupo aldehico HO-R-H —_Weidniiin n0-¢_om “Sin fosforiacn H-Gon CH,OH crea que puede acumukuse 0 ser de nuevo metabolizado en forma lenta." Estructural- mente cl acido 2-cetoglucénico difiere del dcido_glucénico por un grupo carbonilo en Cy" Metabolismo oxidativo de la glucosa * Ghucosa Acido glucénico (gluconate) Acielo 2-cetoglucénico @-cetoghaconato) Fosforitacién Acido 2ctonfefostoglucsnico Qcct0-6 fosfogluconato) Entra en los cielos metabolicos 2 moles de dcido pintivieo La glucosa y el acido glucénico (gluconato) no son compuestos reductores, pero si lo son otros intermediarios del ciclo metabélico oxidative, por ejemplo, el acido-2-cetoghucd- nico (2-cetogluconato)." IV, MEDIOS EMPLEADOS A) Caldo de gluconato y peptona 1. Modificacién del medio de Haynes." 2. Ingredientes, pH:7. a) Peptona 1s b) Extracto de levadura 1 ©) Fosfato de potasio (KSHPO,) d) Agua destilada 40 g 1.000 mi EI gluconato de potasio puede ser reemplazado por 37.25 g de gluconato de sodi 3. Método de preparacién, Gluconato 91 H-¢—OH H-¢-on CHOH Acido glucénico (gluconatoy B) a) Galentar suavemente hasta disoh- ar (Millipore) ©) Distribuir en tubos, aproximadamente 2 ml por tubo. 4. Método de esterilizacién. a) Autoclave. b) 115°C, 15 libras, 15 min. 5. Enfriar antes de su empleo y refrigerar para suc 6. Inoculacién. a) Indculo espeso.! b) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h: en AHK 0 AHTA, Incubacién, aj 25°C, b) 48 has 8. Agregar reactivo de Benedict 0 una tableta Clinitest directamente al tubo incubado anvs de intentar la interpretacion. La sal potdsica de gluconato se utiliza porque da una solucién clara y es facil de ‘obtener.3Se usa una solucion al 4 % (p/p) porque al término de las 48 h de Incubaci6n esta cantidad permite que la P. aeruginosa acumule por lo menos 50 % de 2-cetogluconato de potasio.* Tableta, para prueba Key con sustrato y gluconato, 1. Fabricante: Key Scientific Products Company. 2. Método: seguir las indicaciones del fabricante,92 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias V. REACTIVOS EMPLEADOS: DOS OPCIONES A) Solucidn cualicaiva de Benedict 1, Ingredientes.' a) Sulfato de cobre (CuSO,5H:0) L733 g b) Carbonato de sodio, anhidro (NayCO,) Wg ©) Citrato de sodio (CsHJOH(COO);Nas)— 17.3 g d) Agua destilada 100 ml 2. Método de preparacién.! a) Solucién 1: disolver el citrato y el arbonato de sodio en 60 ml de agus destilada, b) Solucién 2: disolver el sulfate de cobre en 20 ml de agua destilada ©) Agregar la solucién 3 a fa solucion 1, removiendo constantemente. d) Ajustar al volumen total (100 ml) con agua destilada 3. Método de utilizacién.* a) Agregar 1 ml de reactivo de Bene- chet duvetamente al tubo de gluco nato incubade. b) Mezclar bien © Colocar en agua hinviente? 1. Bano de agua 2 10 min B) Tabletas € initest. 1. Fabricante: Ames Company, Inc. 2. Agregar media tableta Clinitest divec- tamente 2 un tubo de ghuconato ince bado. ©) Control de calidad. Antes de su empleo general. cualquier reactivo debe ser pro- on of Cu + 2eetogluconaco OH Hidréxido Agente reductor wiiprico 2. CulOH)s (color azul) bado con cultivos positivos y negatives conocidos. Un buen control pueden ser especies de Kledsiella y E. cali* dado que se obtienen faicilmente y su conservacién en cultivos madre no crea_problemas. Fspecies de Kirbsiella: reaccién de ghuconato positiva: £, coli: reaccién de glucona- to negattivs D) Conservacién: Guard: Benedict en un lugar c es muy susceptible de cristalizarse con el {riot Las tabletas Clinitest son estables indefinidamente si se conservan sin abrir a la temperatura del ambiente: sin embargo, son higroscépicas y muy suscepti- bles'a la humedad. También son destruidas a temperaturas superiores a los 49° C Si las tabletas presentan un color azul oscuro deben desecharse. Por lo tanto, como su estabilidad varia, se hari todas las semanas un control de calidad y se desecharan sidan una reaccién negativa © débil con un organismo positivo conocido, el reactivo de ido por cuanto Quimica de la accién del reactivo. 1. Benedict: El hidrato de carbono intermediario 2-cetogluconato, cuando se encuentra, reduce el hidréxido ct- prico (sulfato de cobre) cuando es calentado en un 6xido cuproso insoluble, que es precipitado.* Véase la reaccién al pie de la pagina. 2. Tableta Clinitest:? Contiene sulfato de cobre, carbonato de sodio, una pequeria cantidad de acido citrico e Pidtoxido de sodio (NaOH), El carbo nato de sodio y el acide citrico dan efervescencia para acelerar la disolu- cion de la tableta, mientras que el hidréxido de sodio proporciona la alcalinidad necesaria para la reduecidn. EI sistema autotérmico es gene- rado por el hidréxido de sodio’ mas la reaccién entre éste y el acido citrico. Véase pagina siguiente. Borsa Gyal +210 + 0 Gxido cuproso crept eco Sica rojizo) Seats pda2. Cutt + 2cetoghiconato NaOH ones céipricos ee (color acu) “A reductor INTERPRETACION: CUALQUIERA DE LOS REACTIVOS Vi. Con_ la tableta Clinitest esperar 15 seg después que ha cesado la ebullicion, desou agitar suavemente el tubo antes de interpretar el color producido. A) Prueba positiva, 1. Un precipitado de color amarillo a anaranjado 0 anaranjado rojizo. 2. Prueba positiva de la presencia de una sustancia reductora. B) Prueba negativa. 1. No hay cambio. El color se mantiene azul o verde azulado. 2 Prueba negativa cle la presencia de una sustancit reductora, Calor Reduccin Gluconato 93 Cu,0| + compuesto oxidade Gxido cuproso (precipitate de color amarillo a anaranjado rejizo) El color producido depende de la cantidad de sustancia reductora acumulada: cuanto mayor sea Ja cantidad, mis anaranjado 0 anaranjado rojizo sera el color VI. PRECAUCIONES A) Tableta Clinitest: No utilizar la prueba de ta tira impregnada en Chinatir, va que ésta es especifiea para la glucosa, que es un aaicar no reductora.” B) Tableta Key con sustrato gluconato: Pease y col” recomiendan la tableta sobre el caldo de gluconato, porque es vis pre- cisa. En sus pruebas el 93% de las Pseu- domonas que producian fluovesceina fi ron positivas para el gluconato, Tambié hallaron demasiacos resultados falsamen te positivos y falsamente negativos utilizando el medio de caldo.” BIBLIOGRAFIA 1, Branson, D. Methods in Clinical Bacteri- ology, Springfield, I: Charles C ‘Thomas Publisher, 1972, p. 23 2. Burrows, W., and Moulder, J. W. Text- book of Microbiology, Vol. 1., 19th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Com: pany, 1968, pp. 118-121, 8. Cohen, 8, 8. (1951) Glucokinase and the oxidative path of glucose-G-phosphate utilization. J. Biol. Chem., 189, 617. 4. Cowan, S. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- ria, Cambridge: Cambridge University Prose, 1966, pp. 116 and 146, 5. Haynes, W. C. (1951) Peeudomonas aeruginosa—its characterization and identification. J. Gen. Microbiol.,.5, 93%. 6. Hugh, R., and Leifson, E. (1958) The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria. J. Bacteriol., 68, 24 7. Kark, R. M., Lawarence, J. R., Pollak, V.E., Pirani, C. L., Muehreke, R. C., u. 12, and Silva, H. A Primer of Urinalysis, 2nd ed., New York: Hoeber Medical Di- vision, Harper and Row, 1963, pp. 36— 38. . Oser, B. L, Hawk's Physiological Chem- istry, 14th ed., New York: McGraw-Hill Book Company, 1966, pp. 80-81 and 89, Pease, M., Malcolm, J., Chernaik, R., and Dunlop, 8, (1968) An approach to the problem of differentiating Pseudo- monads in the clinical laboratory. Am, J. Med. Technol., 34, 35. |. Sebek, O. K., and Randies, C. 1. (1952) ‘The oxidative dissimilation of mannitol and sorbitol by Pseudomonas fluores- Gens. J. Bactericl., 62, 698, ‘Shaw, C., and Clark, P. H. (1955). Bio- chemical classification of Proteus and Providence cultures. J. Gen. Mirobiol., 13, 155. Stanier, R. Y., Doudorff, M., and Adel- berg, E. A. The Microbial World, 2nd ed., Englewood Cliffs, N.J.: Prentice- Hall, Inc., 1963, p. 268.Prueba del dcido sulfhidrico 1. PRINCIPIO Determinar si se ha liberado icido sulfhidrico (SHs) por accién enzimatica, de los especies de Pseudomonas (por neral ~). B) Ayudar a la identificacién de: lo ge- aminoacidos que contienen azufre produ: ciendo una reaccién visible de color negro. 1. Enterobacteriaceae: a) Arizona (+); 6) Citrobacter (variable); ¢) Edwardsiella (+); d) Salmonelta (por lo general +), Francisella tularensis (Pastewrella tula- II. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 33 y 34.) Ayudar a la diferenciacién de las especi 1. Bacteroides oralis (+) y Bacteroides serpens (+) de otras especies de Bacteroi- des (por lo general =~). 2. Brucella neotomae (+) de la Brucella abortus (variable), Brucella suis (variable), Brucella melitensis (=), Brucella avis (~) y Brucella canis (—). 3. Proteus mirabilis (+) y Proteus vulgaris (4) de Proteus morganii (=) y Proteus rettgeri (—). 4. Pseudomonas putrefaciens (+) de otras Hay—CHH000H CH S Crh Metionina rensis) (+). III. BASES BIOQUIMICAS La protedlisis de las proteinas da aminoacidos individuales; algunas especies bact heterotrdficas son capaces de liberar enzimaticamente de los diferentes an dos que las contienen, produciendo Acido sulfhidrico (SH.)."* La peptona. teina, la cistina y el tiosulfato, tod erianas anufre cl gas Ii cis- jos son fuentes de azutre, pero las diferentes especies uuilizan distintos compuestos o amin que contienen azulre para producir ‘cidos SH La enzima responsable de esta actividad es la cisteinasa."* Los aminoscidos que son: contienen H.N—CH-COOH HsX. CH Gistina Ln producto dle reduecion de Ta cistinas" I,N—CH-COOH CHySH Cisteina azutreAcido sulfhidrico 95 CHy SH Cth Les Desulfurasa cisteing, | : * CHINE: + 1.0 c=0 + HST + NH Coon coon Cisteina Acido Gas Amoniaco Un organismo que produzca SH: cultivado en un medio orginico como la peptona, reduce el azufre por hidrogenacién, produ. ciendo el gas SHs."= El catabolismo anaerdbico de la cisteina da SHs, acido pirtivico y amoniaco.""* Véase formula arriba Se encuentran en el comercio muchos medios que contienen peptona ¢ hierro y que sirven para detectar la produccién de dcido sulfhidrico entre las Enterobacteriaceae. Los indicadores del acido sulfhidrico varian entre estos medios: hierro, sulfato ferroso, sulfato de amonio ferroso 0 férrico, tiosulfato de sodio © sulfito de bismuto; sin embargo, el principio es el mismo. En uno de estos medios, el agar hierro'de Kligler (AHK), los indicadores del_acido sulfhidrico son una sal, citrato férrico de amonio, y una sustancia quimica, tiosulfaro de sodio. Ambos indicadores deben hallarse presentes, dado que el resultado final es un método en dos etapas, 1* etapa La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reaccién de reduc cidn que da un sulfito y un sulfato."" Para que tenga lugar la reduccién del tiosulfato es necesario que exista en la capa de arriba del medio AHK un medio acido, Para propor- cionar esta acidez se encuentran dos hidratos de carbono. Este es un proceso de respiracién tiosulfato 4H? 4 do + 38,07 reductasa Tiosulfato, Gas fcido. sulll Reaccion total piriivico acido. sulthidrico anaerébica por el cual el tomo de azutre sirve como aceptor de electrones para la oxidacién de los sustratos orginicos.” El tiosulfato (S:0;2-) reemplaza al sulfato como acepior de electrones yes una fuente de azufre para el organismo.” E] Acido sulfhidrico es un gas incoloro, por lo tanto hace falta un segundo indicador para detectar visiblemente su produccién, 2 etapa El gas incoloro SH» reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para producir un precipitado\negro insoluble, sulfuro ferroso, Se recomienda el citrato férrico de amonio mas que el citrato férrico porque es mis soluble.” Puede sustituirse el sulfato ferroso por la sal férrica.® Se determina la produccién de .icido sulfhidrico cuando el gas entra en contacto con ciertos metales, plomo, hierro 0 bismuto, y forma con ellos sulfuros. Véanse formulas al pie de la pagina. Por lo tanto el gas SHy puede ser produ do por la reduccion de una fuente de azutre inorginico como el tiosulfato (—8,0,) 0 la reduccion de azufre orginico proporcionada por el grupo funcional R,-SH del aminoicido cisteina que se encuentra en la peptona,” EL acetato de plomo, Pb(C3H,0.),3H,0 (AcPb), la sal de dicho metal, también es un indicador de la produccién de SHy. El SH, es un gas incoloro que, en contacto con el 280° + 2HST Sulfito Gas sicido sulfhidrico feo + jones Férvicos + sulfuro ferroso | precipitade ney Bacteria (medio acid) + tiosulfato de soto > gts SHe T w SH, + jones férricos — sulfuro fervoso | B precipitado negro insoluble96 Pruebas bioquimicas para la identificaci6n de bacterias acetato de plomo, produce sulfure de plomo, un precipitado negro que se manifiesta por una reaccién visible de color negro. El acetato de plomo es sumamente sensible y detectara las mas pequeiias cantidades de SH, que se produzcan; hace falta una concentracion de 0.2 mM, por lo menos, para la deteccién del Acido suthidrico en un medio de peptona.* Pb(CzH,0,)r3 H,0 + HS — PbS | + H.0 + Acr Acetato de plomo Gas Sulfuro de Acctato sulfhidrico plomo Precipitado negro a capacidad de un organismo de producit SH, es una caracteristica constante y el que lo hace, por lo general, produce gas (CO. + Hs) en medios con hidratos de carbone. Para determinar la produccién de acido sulfhidrico deben tenerse en cuenta cuatro factores: * 1) el tipo y la disponibilidad de la fuente de azufre; 2) la sensibilidad de la prueba para la deteccién del SH.: 3) el Crecimiento de un organisimo en un medio basico; 4) Ia presencia de la erzima produc- tora de SHs en el organismo que se estudia, Existen muchos medios para detectar la produccién de SH», pero los métodos del acetato de plomo son los mas sensibles para las mis pequenias cantidades de SH: en bacterias que no son Enterobacteriaceae: por ejemplo, Brucella IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Deteccién del ceae. SH, de las Enterobact 1. Los medios comerciales utilizados mas comtnmente contienen aminoicidos sulfurades: a) Agar hierro de Kligler (AHK),! Difco.” 1. Ingredientes: véase el capitulo sobre agar hierro de Kligler 2, Indicadores del SH: a) BBL:! Cinato férrico de amonio. Mercla 50/50 de citrato férrico y citrato de amonio. Fiosulfato de sodio. b) Difco: ” Sulfate ferreso y tiosulfato de sodio, b) Agar_hierro wiple azucarado (AHTA). 1. Dos variedades comerciales. 2. Ingredientes. a) BBL, pH:7.3.! Polipeptona 20g 2. Cloruro de sodio 5 g Lactosa wg Sacarosa 100 Dextrosa (glucosa) 1g 6. Sulfato ferroso de amonio* 0,2. g 7. Tiosulfato de sodio* 02 g 8. Rojo de fenol 0,025 g 9. Agar Bg 10. Agua destil. 1.000 ml b) Difco, pH: 7.42" 1. Extracto de came Bee, 2. Extracto de levadura 3g 3. Peptona 200 g 4. Lactosa 10g 5. Sacarosa (serosa) 10g 6. Dextrosa (glucosa) Lg 7. Sulfato fervoso” 0.2 8. Tiosulfato de wdio* 03 g 9. Clorure de o sodio Bg 10. Agar io lg 11. Rojo de fenol 0,024 g 12. Agua destilada 1.000 ml ©) Agar sulfuro-indol-motilidad (SIM): medio semisclido, 1 Dos variedades comerciales. 2° Ingredientes. BBL, pH: 7.3" dor del SHyAcido sulfhidrico 97 1. Peptona 261 g 2. Sulfate ferroso 03g de amonio® 0,2 g 3. Tiosulfato de bismuto * + 8 socio * 02 g g) Verde brillante g 4. Agar 35g g 5. Agua desti- i) Agua desti- - facta 1.000 ml dada 1000 mi 2. Método de preparacion: de cual- b) Diteo, pH: 7.3." quiera de los medios antes mencionados. ee os a) Pesar exactamente las cantidades, 3. Poon ane tal como se indica en el prospecto. 2. Fepwona aig (Lom: prextecrnioehe sala ined gous 8 Boumpeyee panias pueden variar ligeramente. heed 02 ¢ b) Rehidratar con agua destilada o He Tics tarde desmineralizaca ee eee ©) Calentar suaviemente hasta su diso- ee Opa Sos lucion. Os Agua deat ) Distribuir en tubos, aproximada- ada 1.000 ml mente 5 ml por cada uo: excep- cién agar con sulfito de bismuto Agar con hierto ¥ peptona (AHP) (ASB). 1, Dileo.t 1. Medio en placa 2. Ingredientes, pH: 6.72 2. Esterilizar el frasco con el : medio antey de volear en la a) Peptona 0g placa. by) Citrato ferrico de cl Método de esterilizacién; todos los medlios. 1. Ginato a) Autoclave. ferrico * 0.25 g 91° br oe de by 121°C, 15 libras, amonio * 025 g 4. Dejar enfriar ©) Tiosullito de sodio * 0.08 ¢ a) En_ posicién inetinada con capa d) Fostato de superior profunda. potasio log ©) Agar bog lL AHK. 1) Agua destilacla 1000 ml 2. AHTA ©) Agar con sulfite de bismuto (ASB). by) Posicisn vertical 1. BBL. Difco. 7 1 APH. 2. Ingredientes, pH: 7.5.! pH 2. SIM, medio semisélico. ©) Baio de agua a 37° C: medio de a) Peptona log agar con sulfito de bismuto (ASB), by Extracto de came fF 1. Dejar enfriar el frasco con el ©) Dextrosa medio hasta 45-50 C. (glucosa) 5g 2. Aspticamente volear de 15 a i) Fosfato. de sodio 20 ml por cada cipsula de Petri (NasHPO) 4 og esterili-acla Indicador del Sty. Indicaelor del SH98 Pruebas bioquimicas para Ia identificacién de bacterias 3. Dejar enfriar en posicion vert cal (sin tapa). 4. Colocar la tapa (ligeramente entreabierta) sobre la super seca 5. Usar el mismo dia que se preparé la capsula, 5. Método de inoculacién. a) Cultivo puro, colonia aislada. b) Con una aguja de inoculaciéin recoger el centro de la colonia. ©) Medios en tubo. 1. En pico de flauta (i (AHK, AHTA). ado) a) En “cola de pescado”. b) Puncién de la capa profunda. Hasta 0,6 cm del fondo. Retirar la aguja siguiendo el mismo camino de entrada. ©) El orden puede invertirse de acuerdo con las preferencias. 2. Vertical (APH, SIM), puncién en la capa profunda. Hasta 0,6 a lcm del fondo. Retirar la aguja siguiendo la Iinea inicial de inoculacién, d) Medio en placa ASB; estriar para el aislamiento (método de los 4 cuadramtes). Véase el capitulo del disco de optoquina. 6. Incubaci6n. a) 85°C. b) Todos los medios en tubo, 18 a 24h, ©) Placas ASB. 1. Invertir (con la tapa_ hacia abajo) 2. Hasta 48 h antes de dar un informe negative B) Prueba de la tira de acetato de plomo, fundamentalmente para la deteccién del SH, por otras bacterias aparte de las Enterobacteriaceae. 1. Tiras de reactivo. a) Reactivo: solucién acuosa de aceta~ b) ° d) e) h to de plomo (Pb[CH;COO}.3H,0) (AcPb) saturada, caliente, Producto comercial disponible: ras para la prueba de SH» de Difco." Preparacin de las tiras de papel de acetato de plomo 1. Cortar el papel de filtro en tiras de aproximadamente 1,2 cm de ancho y 2,4 cm de largo. 2. Sumergir las tiras en solucion de acetato de plomo caliente y colocar (tomandolas con pi vas) en una cipsula de Petri de vidrio grande o en un frasco de boca ancha con tapa a rosca 3. Dejar secar al aire o colocar en estufa a 50-60° C. 4, Cerrar la cépsula de Petri con cinta de autoclave; colocar la tapa del frasco, sin apreta Método de esterilizacion. 1, Autodave. 2. 121° C, 15 libr ‘as, 15 min. nfriar y secar, después ajustar las tapas. Rotular el recipiente con la fecha del proceso de autoclave. Volver a esterilizar después de 3 semanas Medios empleados. a) Deteccién de rutina del SH.; wes opciones, » Caldo nutritive, pH: 6.9. a) Ingredientes 1. Peptona 0 proteosa peptona 5 g 2. Extracto de carne 3g 3. Agua destilada 1000 ml » b) Productos comerciales. 1. Difco." 2. BBL! 2. Caldo de tiopeptona, pH: 6,8. a) Ingredientes. 1. Peptona tiotona 5 g6, 2 Extracto de carne 38 3. Agua desti- ada 1000 mi b) roducto comercial: BBL. Caldo de tipticasa de soja (CTS), pH: 7.3." a) Ingredientes 1. Peptona tript casa 7g 2. Peptona (po- roto de soja) 3g 3. Cloruro de sodio (CINa) 5 4. Fosfito de potasio (K HPO) 25 g 5. Dextrosa (glucosa) a 6. Agua desti- ada’ 1000 ml b) Existen productos cn el comercio. 1. BBL. 2 Difco.” Método de preparacin: cual quiera de los métodos antes mencionados. a) Pesar la cantidad exactamente como se indica en el prospecto. Los. diferentes productos pueden variar ligeramente. b) Rehidratar con agua dest lada o desmineralizada. ©) Calentar suavemente has su disolucién, a) Distribuir en tubos, aproximadamente de 44.5 ml por tubo. La excepcién es la peptona tiotona (tiopeptona), 0,8 ml por tubo (de 75 x 10 mm)."* a Método de esterilizacion: todos los medios. a) Autoclave. b) 121° C, 15 libras, 15 min, Enfriar a 45° C en un banio de agua. Acido sulfhidrico 99 b) Deteccién del SH, en las especies Brucella. Picos de Mauta de agar con suero y glucosa.!? 1. Ingredientes, have mutritiva, a) Peptona Wg b) Extracto de carne 5 g ©) Clorare de sodio (ClNa) ag dl) Agar 20% stilada 1000 ml 2. Preparacién de la base nutvi- tiva: véase la Seccion TV, B 2, a; parte (4 a6), 3. Asepticamente, agregar al medio hiisico enfriado enriquecimientos estiriles. a) Suero de caballo 50 ml b) Glucosa, solucion acuosa al 20% 50 ml ©) Base nutritive, 1000 ml 4. Merclar bien. 5. Asepticamente, distribuir en tubos, aproximadamente 5 ml por tubo esterilizado, 6. Enfriar en posicion oblicna (pie co de flauta) y refrigerar para su conservacion (4-10° C). El género Brucella requiere el agregaco de cnriquecimientos de enlaces Sulfhidrilos (-SH) para la deteccién del SHs. Métodos. a) Macrométodo. 1, Método de ZoBell y Feltham.” 2° Medios: varias elecciones. a) Caldo de tripticasa de soja (CTs) b) Caldo nutritive. ©) Picos de flauta de agar con suero y glucosa, para las especies de Brucella solamente, 3. Inoculacién. a) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h: AHK u otro cultivo adecuado, b) Indculo espeso.100 Pruebas bioquimicas pare la idemificacién de bocterios 4. Asépticamente, suspender una tira de acetato de plomo estéril por sobre el nivel del caldo, a) Colocar la tira en el tubo, sobre un costado, a unos 10 mm por encima del nivel del caldo. No sumergir la tira en el caldo. b) Asegurar la tira, Doblar un extremo de la tira sobre el borde del tubo, Reponer la tapa para mantener la tira en su lugar 5. Incubacidn. a) Especies de Brucella, 85° C. Fensién COs aumentada (10%), Cambiar diariamente la tira de acetato de plomo hasta los 7 dias de incuba- Gon. Registrar los resultados diariamente b) Todos los demas organismos. 30" © (Gptima) a 35° C2! Leer al cabo de 12 y 24h. Puede producirse un resultado positive dentro de las primeras 12 h de ineu- bacidn. Si es negative despues de 24 hy volver a incubar. Esperar 6 dias antes de hacer un informe negativo. Leer diariamente. No cambiar las tiras; utilizar la misma para el perfodo total de 6 dias. Fiusler®! observé que para ciertas bacterias, Ia deteccién del SH. era iis elevada cuando se incubaban los cultivos a 30° ( La deteccion del acido sulfhidvico, utili zando tiras de papel con avetato de plomo, es mvs ventajosa que con la incorporacion del acetato de plomo al medio, ya que evita los posibles efectos t6xicos de fa sal metilica." Asimismo, es mas fieil detectar el SHs en kas tiras de papel con acetato de plomo que trata de observar una reaccion de color en el medio: con la tira se detectara aun la pequeria cantidad de 0,01 mmol de sulluro de hidrdgeno liberado de ka peptona Es esencial utilizar un indculo denso del organismo que se estudiat, va que ka canticladd de'SH. producido y el tiempo de deteceidn depende de la concentracién de la suspen- sién.7 Cuando se utiliza un inéculo denso, puede obtenerse una reaccidn positiva, ya a los 15 a 30 min después de la incubacion y, por lo comtin, en el término de 1 a2 hen la mayoria de los organismos.? b) Micrométodo. 1. Método de Morse y Weaver.'® 2. Medio: caldo de tiopeptona. Si se prepara justamente antes de su empleo, no hay nece- dad de esterilizar ni los tubos ni el medio." 3. Inoculacién.™ Jos tubos en un banio de agua a 37° C b) Crecimiento de una fase logaritmica de 6 h, de cultivo puro en un medio envi- quecido (por ejemplo, infu- sin de agar en pico de flauta), ©) Trasferir el indculo con un hisopo, sin necesidad de esterilizarlo, Pasar el hisopo por la mitad de la superficie del pico de Mauta; inéculo denso. d) Hacer girar sucvemente el hisopo en el medio; dese- charlo después, poniéndolo en desinfectante. a) Calentar Asépticamente, suspender una tira con acetato de plomo estéril, hasta unos 10 mm por encima del nivel del caldo: asegurarla doblando Lem de ka misma sobre el borde del tubo. No sumergir ka tira en el ealdl. Incubacign. a) 35" ©. b) Leer los resultados con ine tervalos de 15 min, hasta un periodo final de 45- min. Segiin Morse ¥ Weaver," su micrométodo da. resultados comparables. a los obtenidos con, los macrométados: sin embargo, un periodo de incubacién mis prolongade a menta la sensibilidad, haciendo que muchos organismos muestren una produccién de Shy que no se observahaecon las macrotéenicas. Lal Hlopeptona (BBL-peptonit tiotona) es espe- Gialmente rica en azufre. El tiempo para la deteccion del SH, aumenta si el cultive usadepara la_inoculacién_ no esti en Ia fase logaritmica de crecimiento." De acuerdo con Morse y Weaver," las variaciones en la produccién de SH, entre distintos organismos “muestran una diferencia cuantitativa mis que cualitativa”. V. RESULTADOS Las fotogrofias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 13-1 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES A) Medios de aminodcidos que contienen azure, 1. Medios en tubo: AHK, AHTA, SIM y APH a). Positivo: se abserea ennegrecimien- to del medio. 1. Siguiendo la linea de inocu- lacién. 2 En toda la capa superficial b) Negative: no se observa ennegrecimiento. 2. Medio en placa, ASB. a) Positive: colonias negras rodeadas por una zona negro-pardusca en el medio. 1. El ditmetro de la zona puede ser varias veces el tamaiio de la colonia. 2. La superficie de la zona puede mostrar un reflejo. metilico. b) Negative: no ha ni reflejo meti ennegrecimiento B) ‘Tira de acetato de plomo, 1. Deteccién del SHz de rutina, a) Positivo: coloracién negro-pardusca de ka tira de papel: puede tener cierto brillo. b) Negative: no hay alteraciones ni coloracién de la tira Acido sulthidrico 101 2. Especies de Brucella. Deteccion del Sle a) El periodo en que se produce SH. sélo es importante en las especies de Brucella, b) Registrar diariamente los resultados: “SH, producido en los primeros 2 dias.” “SH. producido desde el 1° al 5° dia”, ete, ©) Resultados. 1. Positivo: coloracién negro-pardusca de la tira de’ papel; puede tener brillo. 2. Negativo: no se observa cambio ni coloracién de la tira de papel. El grado de ennegrecimiento de una tira de acetato de plomo puede medirse en centi- metros, con lo que la prueba adquiere el caracter de cuantitativa.® VII. PRUEBA RAPIDA: TIRA IMPREGNADA CON REACTIVO PARA LA PRUEBA DEL ACIDO SULFHIDRICO, PATHOTEC A) Fabric Warn B) Principio. nte: General Diagnostics Division, amibert Company 1. Sustrato: aminodcido que comenga anutve 2. Indicador: acetato de plomo (AePD. C) Resultados: dentro de kas 4h de inew bacion D) Método: seguir las indicaciones del fabri cate, F) Correlacion con tas pruebas. standard 1, 98.6%." 84% 2 2. Falsos positives: Proteus morganii. Proteus rettgeri Providencia2 Enteve. acter cloacée.? Psewtomonas mattaph ia? 3. Falsos negatives: Proteus mirabilis," Especies de Salmonella. VILL. PRECAUCIONES \} Medios de aminosicides que contienen avulre, 1. La produceién de acide sullhidricn puede manifestarse en agar hierrode Kligler (AHK) pero ser negativa en agar hierro triple azucarado por el hidrato de carbono sacarosa que se encuentra solamente en este dhimo medio. Los estudios efectuados por Bulmash y Fulton ! mostraron que la utilizacion de la sacarosa puede supri- mir los mecanismos enzimiticos res ponsables de la produccién de SH, ocultando el indicador sulfuro de hierro en el medio. Padron y Dock- stader? afirman que no todas las especies de Salmonella que producen SH. son positivas en el medio AHTA, ni este medio permite la separacién definida de otros miembros de las Enterobacteriaceae que producen SH. Un organismo que produce SH, puede mostrar ennegrecimiento en el medio SIM (positive) pero no en el AHTA (negativo).? Deben Mevarse a cabo controles de la peptona utilizada en el medio SH, para determinar si el contenido en azufre es suliciente para la deteccién del SH;, Si la peptona es deficiente 102 Pruebas bioauimicas para la identificacién de bacterias es incubada a 34° C y aumenta la inhibicién a medida que la temperatura aumenta hasta 40° Tittsler realiz6 experimentos con la Salmonella pullorum y observé que la temperatura 6ptima de incubacién para una pro- duccién maxima de SH, era de 30a 34° C. B) Tira de acetato de plomo Algunos tratan_ las tiras de acetato de plomo con glicerina para aumentar las condiciones higroscopicas. ZoBell y Feltham ® afirman que esta practica no tiene real utilidad para aumentar la deteccién del SH» Los métodos de la tira de acetato de plomo son diez veces mas sensibles que los que incorporan el metal en el medio. El acetato de plomo es téxico para el Crecimiento bacteriano, y tiene una accion bacteriostitica que inhibe la liberacién del SHz de la peptona: por lo tanto, no permitir que las tivas de acetato de plomo toquen el caldo. para la rapida deteccién del SH,, 4. Cuando se realiza ka prueba de pro- puede agregarse cisteina para enri- duccién de SH, entre las especies de quecer la concentracién de enlaces Brucella, es esencial cambiar diaviamen- fe las tiras con acetato de plomo. 4. Segin se produce cierta También es importante el tiempo inhibicién del SH» cuando la prueba que demora su produccion* BIBLIOGRAFIA 1 BBL Manual of Products and Latora- tory Procedures. 5th ed., Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi- sion of Becton, Dickinson and) Com- any, 1968, pp. 95, 115, 129, 138, 148, 151, and 162, . Blazevie, D. J., Schreckenberger, P. C., and Matsen, J. M, (1973) Evaluation of the PathoTec “Rapid I-D” system. Appl. Microbiol., 26, 886. . Branson, D. 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Haemophilus haemoglobinophilus (+) y Haemophilus influenzae (+) de otras especies de Haemophilus (generaimen- tex). 3. Pasteurella multocida (+) y Pasteurella feumotropica (+) de la Pasteurella haemolytica (—) y Pasteurella ureae (—). 4. Proteus mirabilis (—) de otras especies de Prottus (+). IIL. BASES BIOQUIMICAS El tript6fano es un aminodcido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indélicos principales: indol escatol (metilindol) e indolacético (IAA- indolacetato).*"*"* Diversas enzimas intracelulares que intervienen en este proceso reciben el nombre colectivo de “triptofanasa”, Jo que indica un sistema completo de enzimas vinculadas con la produccién del indol."* NH ct -G—coon Cort w L-Triptéfano 1 ° A I) i -CH:—-C—COOH C — ro——._ { Aye Desaminadon QA i i Indolpiravieo Indot 1 yy cHcH Cryer i Indolacetaldehido t ~y—-cH.cooH CJ e i Acido indolacético Gndolacerato), incubacidn de conto término L Decarboxilacién Cla Escatol (metilindot) incubacién de largo términoSAY? __am Triptofanasa HO Lariptéfano —Desaminacién EI principal intermediario en ta degrada- cidn del wipt6fano es el acido indolpirwvico, del cual puede formarse indol por desamina~ cion, y escatol por decarboxilacién del acido indolacético.* En la pagina anterior se ilustra la degradacién del tript6fano. in vitro. PRINCIPALES METABOLITOS INDOLICOS PRODUCIDOS Reproducido en forma abreviada de Yoko- yama, M. T. y Carlson, J. R., 1974. Appl. Microbiol, 27: 540, con’ autorizacién de la American Society for Microbiology. La enzima viptofanasa caualiza la reaccion de desaminacion," atacando la molécula Uiptfano solamente en su cadena lateral y dejando intacto el anillo aronxitico en la forma de indol.” Véase formula arriba. La desaminacion y la hidrdlisis tienen lugar con el agregaco de una molécula de agua en presencia de la enzima wriptofanasa y el piridoxal {ostato como coenzima. En I dlesaminacion, es extraida la porcion amina (NH) del aminoacido con la liberacion de una molécula de amoniaco. Existen dos tipos de desaminacién: oxidativa y recuctiva, La desaminacion oxidativa extrae el grupo NHz de un aminosiciclo v se agrega un doble enlace al producto desaminado (an compuesto no saturado} junto con la formacion de NH ¥ energia.” Véase formula al pie de la pagina La desaminacion por ef triptofano es del tipo reductor, por lo cual es extraido el NHz y liberado como NHy y energia, que es utilizada por la bacteria, La degradacion del triptofano libera indol dicido pintivico, amontaco y energia, El ticido pirtvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucolitico, 0 entrar en el ciclo de Krebs para liberar COz, HzO y una gran produccién de energia. EI NH, puede ser utilizado para sintetizar nuevos aminoicidos empleando la energia que se encuentra para la reaccién anabilica EL indol, desdoblido de kx molécula tripto: Desaminacién oxidativa R—C—COOH i TRO NH, Aminosicido Indol Indo! 105 ° os 4 -CH:-CH—COOH 7 I Core [CJ + c—t-coon + ws ~ i Acido pirdivieo Amonineo fano, puede ser detectado por un reactive que posea una combinacién quimica que produzca un color definido, La presencia 0 ausencia de formacién de indol se emplea para la identificacion bacteriana. IV, MEDIOS EMPLEADOS A) Caldo de wiptétano 0 de peptona 1. Ingredientes. a) Medio basico, 1, Peptona: una fraccién proteica 2. Cloruro de sodio. b) Tript6t porarse en el caldo de concentracién del 1% ‘ano: variable, puede incor- peptona en 2.” Existen productos comerciales. a) BBL: Caldo con peptona y wipti- casa (caldo de wiptofano). b) Difco: Caldo de triptona, 3. Método de preparacién. a) Pesar exactamente las cantidades segtin las indicaciones del prospec- to. Los diferentes productos pueden variar ligeramente. b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. c) Calentar suavemente hasta su diso- lucion Distribuir en wos, aproximadamente 4 ml por tubo. d) 4. Método de esterilizacién. a) Autoclave, by 121°C, 15 libras, 15 min. Dejar enfriar antes de su empleo y Tefrigerar para su conservacién (4-10°C). *R—G—COOH + NE + Enetgia I ° Acido ceténico106 Pruebas bioquimicas pars la identificacién de bacterias 6. Inoculaci6n. a) Inéculo liviano."* b) Crecimiento de un cultivo puro de 18.a 24h en AHK. 7. Incubacién, a) 35°C. b) 24a 48h 8. Agregar reactivo de Kovacs o de Ehr- lich directamente al tubo incubado, antes de intentar una interpretacién. B) Medio de caseina. 1. Sino se consigue un producto comer- Gal, puede prepararse un digesto pancredtico de solucién de caseina. a) Ingredientes. 1. Digesto pancreatico de caseina 2g 2. Cloruro de sodio 05g 3. Aguadestilada 100ml b) Método de preparacién. 1. Disolver_ por medio de un calentamiento moderado. 2. Distribuir en tubos en cantidades de 4 ml. ¢) Método de esterilizacién. 1. Autoclave. 2. 121° C, 15 libras, 15 min d) Proceder de la misma manera que cuando se emplea el medio comer 2. La easeina contiene 12 g de triptéfa- no por cada 100 g."* V. REACTIVOS EMPLEADOS A) Reaccidn del indol de Ehrlich? 1. Ingredientes. a) p-dimetilamino- benzaldehido, 2g b) Alcohol etilico (absolut) 190 ml ©) HCl (concentrado) 40 mi 2. Método de utilizaci6n. a) Agregar I ml de éter a un tubo de caldo’ incubado de 24 a 48 h. b) Esperar a que el éter suba hasta la superficie del medio, c) Agregar suavemente 0,5 ml de reactivo de Ehrlich al tubo, incli- nandolo para que el reac deslice por la pared del tubo. B) Reaccién del indol de Kovacs Ingredientes. a) Alcohol amilico o isoamilico (puc- de sustituirse por alcohol butilico) 150 ml b) p-dimetilamino- benzaldehido log ) HCI (concentrado) 50 ml 2. Método de preparacién. a) Disolver el aldehido en el alcohol. b) Agregar lentamente cl acido a la mezcla aldehido-alcohol. 3. Método de utilizaci a) Agregar 5 gotas de reactive de Kovacs directamente a un tubo incubado 24 a 48 h. b) Agitar suavemente el tubo. ©) Gualquiera que sea cl reactive empleado, si se hace la prueba de produccién de ndol en un tubo incubado 24h, se recomienda retirar asépticamente para la prueba una porcion de 2 ml 1. La reaccién positiva después de 24h indica una prueba completa. 2. Siel cultivo de 24 h es negativo, debera ineubarse otras 24 hy repetirse la prueba. D) Control de calidad: Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos antes de su empleo general. La E. coli y las especies de Klebsiella resultan controles convenientes para control porque se obtienen facilmente y no ofrece problemas su acién en cultivos madre. E. cali reaccién del indol positiva; especies de Klebsiella: reaccion del indol negativa E) Conservacion: Guardar ambos reactivos en el refrigerador (4° C) mientras no seesen_ Su estabilidad es variable, por lo tan- to se hara todas las semanas un control de calidad, desechandolos si muestran una reaccién debil o negativa con un organismo positive conocido. F) Quimica de la reactividad: Cuando existe indol, éste se combina con el aldehido que se encuentra tanto en el reactivo de Kovacs como en el de Ehrlich, para dar a q NCH, p-Dimetilamino- Indol henzaldehido un color rojo en la capa de alcohol."® Esta reaccién se produce por un proceso de condensacién formado por un desdoblamiento acido de la proteina."* La reaccién de color se basa en la presencia de la estructura pirrélica en el indol. + Estructura pirrélica La estructura pirrélica puede reaccionar en sus formas tautoméricas (cuando se encuen- ta en solucién, algunas de las moléculas alteran su disposicién ce manera que se encuentran dos formas):* Los grupos CH: en cualquiera de las formas pirtdlicas permiten la condensacién con el aldehido en un método en dos etapas. Véase figura en pagina siguiente. Una quinona o una estructura de tipo quinoide es un importante compuesto que produce color. o={)=0 auinon Las etapas I y 2 de la reaccién se producen inmediatamente cuando se emplea el reactivo p-dimetilamino-benzaldehido en HCl concentrado. Indol 107 Los derivados del pirrol_muestran_ las mismas reacciones de condensacién siempre que tengan un grupo CH intacto en posicién a 0 Ben relacidn con el grupo ciclico NH."* La capa alcohélica extrae y concentra el complejo de color rojo. Este complejo es soluble en éter etilico, alcohol etilico, alcohol isoamilico, alcohol amilico 0 alcohol butilico. Hcl —alcohol__, Color rojo violiceo Condensacién oo nfo viol por ealentamiento VI RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en lo Figura 14-1 (Apéndice 1). VII. INTERPRETACION: CUALQUIERA DE LOS REACTIVOS A) Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohdlica. B) Prueba negativa: no se produce color en. la capa alcohdlica; toma el color del reac tivo de Kovacs 0 de Ehrlich (amarillo). ©) Variable (+): un color anaranjado en la superficie del medio debido a desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser un precursor de la formacién de indol.” VIII. PRUEBAS RAPIDAS A) Prueba de la mancha del indol. 1, Método de Vracko y Sherris.” 2. Reactivos; existen varios (véase el Apéndice V). a) Kovacs: p-dimetilamino-benzaldehido (DMABA). 1, Fabricante: Eastman Organic Chemicals. 2. Solucién al 5% en alcohol amilico acidificado (8 ml de alcohol amilico en 1 ml de HCI concentrado)108 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bocterias cHO HC. =H.0 HC- Nica) Estructura pirrélica —_ g-dimetilamino- del indo Conrado b) -p-dimetilamino-benzaldehido. 1. Sohucién al 1% en HCI concentrado al 10 % (viv). 2. Prepararlo fresco cada cuatro meses. 3. Detecta de 6 a 12 yg de indol/ml.” 4. Esel reactivo mas estable y mais econdmico, ©) p- dimetilamino - cinamaldehido (DMACA). 1. Analogo vinilico del DMABA.2” 2. Fabricante: Aldrich Chemical Company, Ine 3. Solucién al 1% en HCl concentrado al 1 % (v/v). 4. Preparar fresco cada 2. meses. 5. Detecta 3 ug de indol/ml 6. Es el reactivo mas sensible 3. Inéculo. a) Cultivo pwo de 18 a 24 b, en agar sangre de carnero (ASC). b) Es preferible, cuando ello es posible: agar sangre con tripticasa de soja, 5 % de sangre de carnero.'"* 4. Método. a) Papel de filtro Whatmann N° 1 (9 cm). 1, Colocar en la tapa de una cipsula de Petri. 2. Humedecer con | a 1.5 ml de reactivo de Kovacs (oalguno de Jos mencionados anteriormen- te). N CH: NCH) 1, = -cu-{ ani LTO tT {* € \-xena @ 2 Compuesto quinoidico rojo viokiceo b) Extender el indculo en el papel de filtro humedecido. Pueden realizarse muchas pruebas en un solo papel de filtro, 5. Interpretacién, a) Indol positiv.”* 1. Kovacs: Castafio > purpura rojizo— color rojo. 1a 3 min, DMABA: Color rosado a rojo. 1a3 min. 3. DMACA: Color azul o verde, a los pocos seg. ra b) Indol_negativo: color blanco a amarillo. B) Microtécnica del indol. 1. Método de Arnold y Weaver. 2. Medios: dos opciones. a) Caldo 1 1. Triptona, 1% 2. Extracto de carne, 0,3 %. b) Caldo 2. 1. Triptfano, 0,03 % 2. Peptona, 0,1 %. 3. Fosfato de potasio (KsHPO,). 0.5%. ©) pH, 6ptimo para la produccién de indol: 7.47.8. ) Distribuir alicuotas de Iml de 108 Lubes de ensayo aldo en pequ (LO x 75 mm),1 No es necesaria una este absoluta." 2. Noes necesario taparlos 3. Reactivo: Kovacs. o ©) Ti a) Debe ser fresco. b) Solvente preferido: alcohol isoam lico, Método. a) Calentar previamente los tubos de caldo; requisito absolute. 1. Bano de agua 37° C. 2. Abrevia el tiempo necesario para la produccién del indol.! b) Indculo denso." i & Preferido: de agar o caldo de uiptona. Alternativa: cualquier_medio de triptéfano 0 medio sintético que contenga triptofano. ©) Agregar 4 gotas de reactive de Kovacs fresco, Incubacién, a) Preferida: bao de agua a 37° C. b) 6m a 2h. Interpretacion a) Indol positive: color rosado a rojo en la capa de alcohol, b) Indol negativo: no hay cambio de color; ef medio se mantic ne amari- Ho claro. a impregnada con reactive para la prueba del indol (Patho Tee) 1 Fabricante: General Diagnostic Divi- sion, Warner Lambert Company Resultados: dentro de las 4 h de ineu- bacién, Método: seguir las indicaciones del fabricante, : Correlaci6n con las pruebas estandar, a) 99,9 % 99% y 99 G2 b) Falsos negativos con especies de Proteus indolpositivas.® 1 Buena correlacién si el inéculo ha sido tomado de un caldo2® Indol 109 2. Algunos falsos negativos cuando proviene de un medio sé do, especialmente AHTA.” ©) Ocasionales Falsos positivos27 Los estudios realizaclos por Weaver y col.” indican que se producen resultados falsamente negativos cuando se toma el indculo de picos de flauta de agar hierro wiazucarado (AHTA); recomiendan agar con tripticasa de soja (ATS) que muestra una excelente corre- lacién. IX. PRECAUCIONES A) Cuando se emplea un caldo de peptona en lugar de triptfano para la prueba del indol, debe controlarse el medio con un organismo_productor de indol_ posi conocido. Esto permite determinar peptona ¢s adecuada para la produccién del indol y, asimismo, el periodo de incubacion éptimo necesario.” Se encuentran en el comercio diferentes lotes y variedades de medios de peptona, algunos de los cuales resultaron inconvenientes para la produccién del indol por la insuficien- fe concentracién de triptéfano que contienen No debe emplearse para la deteccién del indol un medio de peptona que contenga glucosa, La formacién det indol se produce solamente con aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono. Los organismos que utilizan hidratos de carbono por wn proceso oxidativo son incapaces de producir indol." La elevada acidez producida por la mentacion de la glucosa puede impedir el crecimiento del organismo ‘0 inhi- 1 la enzima." El agregado de triptéfano estimula la produccién de indol mientras que la glucosa la inhibe.! #38 ©) Algunos organismos forman indol pero lo descomponen con la misma rapidez con que es producide; por lo tanto, puede producirse una reaccin falsamente negativa” Esto ocurre sobre todo entre algunas especies de Clostridium. D) EF pH optimo para la actividad de la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (pH:7.4 a 7,8); la disminucién del pH (hacia la acidez) provoca una reduccion en la produccién de indol™ y una posible reaccién falsamente negati va o débilmente positiva E) Los cultivos que se van a someter a las pruebas de produccién de indol deben ser B110 Pruebas bioquimicas para ia identificacién de bacterias F) incubados_aerdbicamente. El descenso de la tensién del oxigen disminuye la produccion de indo." E] reactivo de Kovacs debe ser frese embargo, puede conservarse varios dias enel refrigerador (4-10° C). Sise deja a la temperatura del ambiente durante un tiempo, cambiar’ el color (amarillo a castafio) y se hari menos sensible.! Los reactivos deben guardarse en frascos de color caramelo con tapa de vidrio. Si el inéculo es de un cultivo mixto de Organismos indol positives y negativos cuando se realiza la prueba de la mancha, pueden producirse reacciones débilmente 6 falsamente positivas. Es fundamental obtener un cultivo puro. Utilizar para la prueba una sola colonia, bien aislada También debe cultivarse el indculo en un medio que favorezca la produccién de indol: un medio de wiptona o tiptofano. No resultan aceptables el agar de Mac Conkey (MAC) 0 con eosina ¥ azul de metileno (EAM), dado que contienen’ indicadores que podrian trasmitir su color al papel de filtro humedecido con ficido. dando. lugar a_ interpretaciones de color falsamente positivas. BIBLIOGRAFIA 1. 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OBJETIVO zi (Véase también la Seccion IIL, Capitulos 33 y 34.) |A) La produccién de dcido sulfhidrico y/o las formas de fermentacién son general mente caracteristicas de los grupos, géne- ros © especies bacterianos especificos, sobre todo entre las Enterobacteriaceae. 1. Acidosacido, con/sin gas. a) AHK 1. Escherichia 2. Klebsiella 3. Enterobacter by AHTA, 1. Escherichia 2. Klebsiella 3. Enterobacter 4. Serratia Acidojacido, SH» a) AHK: Citrobacter b) AHTA Arizona Citrobacter Proteus mirabilis Proteus vulgaris Behe Alcalino/acido, con/sin gas: AHTA. AHK y a) Escherichia (Alkalescens - Dispar) anaerogénicas, sin motilidad b) Enterobacter hafniae c) Serratia d) Salmonella enteritidis bioserotipo paratyphi A ©) Shigella. £) Proteus morganii g) Proteus rettgeri h) Providencia Alealinofacido, gas, SHx: AHK y ©) Citrobacter A) Sabnonelta typhi €) Otras especies de Salmonella (especies tipo: S. enteritidis y S. chole- rae-suis) £) Proteus mirabilis 8) Proteus vulgaris5. Alcalino/alealino_o alealino/sin.cambio: AHK y AHTA. a) Alcatigenes faecalis b) Acinetobacter (Tribu Mimae; He- rellea y Mima) ©) Pseudomonas aeruginosa B) Ayudar a la especificacién en_género: Yersinia enterocolitica (AHTA, dcido/aci de Y. pestis AHTA, alcalinoficido) y ¥. pseudotuberculasis (AHTA, alcalino/acido). TI. BASES BIOQUIMICAS El agar hierro de Kligler (AHK) y el agar hierro triplemente azucarado (AHTA) son medios diferenciales en tubo que sirven a un doble fin: 1) determinacién de las fermentaciones de los hidratos de carbono, y 2) determinacién de la produccién de’ acide sulfhidrico. Un organismo puede utilizar diversos sustratos incorporados en el medio; los diferentes sustratos metabolizados son utilizados para la diferenciacién entre varios prupos, géneros o especies, sobre todo entre las Enterobacteriaceae. El medio AHK contiene dos hidratos de carbono: lactosa, con concentracién del 1%, y glucosa, en concentracién del 0,1 %. Este medio puede sustituirse por AHTA; la diferencia fundamental es el agregado de un tercer hidrato de carbono, sacarosa, en con- centracién del 1 %. Sin embargo, los funda- mentos bioquimicos son los mismos y por eso s6lo trataremos con detalle el AHK. En el medio AHK, algunos organismos tienen la facultad de fermentar ambos hidratos de carbono; otros fermentan solamente la cosa; y otros, atin, no son capaces de fermentar ni la lactosa ni la glucosa. La fermentacién del hidrato de carbono puede producirse con produccién 0 no de gases (CO. + Ha) La fermentacién se produce aerdbicamente (en el pico de flauta) y anaerébicamente (en la capa inferior del cultivo). En el pico de flauta, el monosacirido glucosa es catabolizado inicialmente por medio del ciclo anerdbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar el intermediario clave, acido pirtivico. A su vez, este acido es degradado por medio del ciclo de Krebs, por los aerobios 0 anaerobios facultativos, para dar COs, H,O y energia, Ambos ciclos, el de Embden-Meyerhof y el de Krebs, comprenden etapas en serie que producen muchos intermediarios; en cada Pruebas con agar hierro de Kligler 113 etapa inter La lactosa es un disacirido formado por dos unidades de monosaciridos: glucosa y galactosa. Begalactosidasa Lactosa sglucosa + galactosa Ciclo de Krebs Ghucosao galaetosa <2 C01 + HO +energia En la capa profunda del cultivo en AHK, existen condiciones anaerébicas por la cuales es metabolizada la glucosa a través del ciclo de Embden-Meyerhof, en ATP y el intermediario clave, dcido pinivico, que después es convertido en diversos productos. finales estables; aicido ictico yiu otros acidos orgi- Idehidos, alcoholes, CO,, H, y energia, i ‘cidos orginicos Ghucoca Cit? de Emden Meyernae § ido ong ~~ anaersbico—”- Yaleoholes Con's He energta Las reacciones en AHK se utilizan primaria- ‘mente para la identificacién de miembros de las Enterobacteriaceae (entéricos) que son, por definicidn, bacilos gramnegativos catalasa positivos, todos los cuales fermentan el hidrato de carbono glucosa en Acido. Asimismo, existen muchos bacilos intestinales gramnegativos no entéricos, a cuya identificacion 0 separacion de las Enterobacteriaceae ayudan las reacciones en AHK. Se han observado tres formas basicas de fermentacién en el medio AHK: 1) fermentacidn de la glucosa solamente, 2) fermentacién tanto de la glucosa como de la lactosa, y 3) no fermentacién de la glucosa ni de la lactosa, Para los fines de identificacin es esencial que se interprete la fermentacin de los hidratos de carbono en todas los tubos con AHK, al término de 18 a 24 h de incubacién, Una interpretacién prematura o demorada dara formaside fermentacién no validas que llevaran a errores en el agrupamiento de organismos entre las Enterobacteriaceae 0 en la identificacién del género, 0 del género y la especie. Fermentacién de la glucosa solamente (alcalina/acida) La primera forma de fermentacién en AHK después de 18 a 24h de incubacién es tun pico “de, Mlauta alcalino yuna capa profunda acida (alcalina/acida), Esta reaccion se observa en los organismos capaces de fermentar solamente la glucosa; son no fermentadores de la lactosa114 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias EL pico de flauta es alcalino (rojo), lo que indiea que se ha producido la degradacién aerébica de la glucosa. Después de 18 a 24h de incubacién’ la baja concentracién de glucosa (0.1%) ha sido consumida por completo y el organismo comienza a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio para obtener los nutrientes para su cre miento. El catabolismo de la peptona produce la liberacion de amoniaco (NH,) dando un pH alealino con el rojo de fenol, indicador del PH incorporado en el medio. Sin embargo, en la capa profunda del AHK se observa un color amarillo debido a la degradacion anaerdbica de la glucosa. Aqui, la glucosa también es degradada después de 18a 24h de incubacion; sin embargo, se forman_ productos terminales cidos dando un pH dacido (color amarillo). Si se lee mas pronto un organismo fermen- ador de la glucosa en AHK, por ejemplo, 12h o menos, el pico de Mauta serfa dcido, dado que en tan breve tiempo la glucosa ain Eee eran isleceplcameni yee una reaccién falsa. El microbiélogo interpre- tarfa que el organismo es capaz de fermentar ambos carbohidratos, la glucosa y la lactosa. Del mismo modo, si no se lee el tubo con AHK hasta después de una incubacion de 48h o mis, tanto el pico de flauta como la parte profunda del cultivo serfan alcalinos (rojo), lo que indica que no se ha fermentado ninguno de los hidratos cde carbono. La acidez que se halla normaimente en la parte Resdiisia del culfende’ dake a la prodonsn de productos dcidos estables; sin embargo, eventualmente, estos productos se oxidan y el organismo se. desvia_utilizando peptonas como elemento nutritive para continuar su reproduccién, y dando un pH alcalino en todo el tubo con AHK (tanto en el pico de flauta como en la capa profunda). Fermentacién de la lactosa y la glucosa (acida/acida) Algunos organismos tienen la facultad de fermentar tanto la lactosa como la glucosa en busca de elementos nutritivos, dando una reaccién en el medio AHK de_un pico de flauta acido y una capa profunda acida (acida/acida), “después de 18 a 24h de Incubacién. La lactosa se encuentra en con- centracién del 1%, es decir, diez veces mas que la glucosa. En un periodo de 18a 24 hla concentracién de lactosa en mayor cantidad atin no se ha consumido y todavia existe una condicién acida, Si se leyera el mismo tubo AHK después de 48 h o mis, el pico de flauta se habria vuelto alcali Tacte 0 por deplecién de la sa y la utilizacion de peptonas. No fermentacién de Ia lactosa ni de la glucosa (alcalina/alcalina; alcalina/sin cambio) Algunas bacterias, sobre todo los bacilos no. entéricos. gramnegativos, son incapaces de fermentar la glucosa ola lactosa. Estas bacterias se encuentran en el tracto intestinal junto con miembros de las Enterobacteri ceae y es necesario identificarlas definida- mente como no entéricas. Como ellas som incapaces de obtener sus nutrientes de los hidratos de carbono, acuden a la peptona que Contiene el medio. Estos no entéricos pueden utilizar la peptona aerdbica 0 anaerdbicamente dando dos posibles reacciones en AHK. Un organismo que da un pico de flauta alcalino y una capa profunda alcalina (alea- linajalcalina) en un medio AHR, degrada la peptona tanto aerdbica como anaerdbicamente. Una reaccion de pico de flauta alcalino y sin cambio en la capa profunda (alealina/sin cambio) es el resultado de un organismo que solamente puede catabolizar la peptona en condiciones aersbicas: de alli que solamente el pico de flauta muestra el cambio de color (rojo). Cuando las peptonas son degradadas se ‘produce un pH. alcalino por la liberacién de amoniaco (NH), que Imparte al medio un color rojo intenso, acrébicamente FeO accibiamentd amoniaco (NH) Por lo tanto, puede interpretarse una reaccién en AHK de cuatro maneras, segin la bacteria en estudio: 1. Alcalina/acida: solamente es atacada la glucosa. Acidasacida: son atacadas la glucosa y la lactosa, Alcalina/alcalina: no es atacada la glucosa ni la lactosa; se utilizan las peptonas. Alcalina/sin cambio: no son atacadas ni la glucosa ni la lactosa; se utilizan las peptonas. observa el tubo de AHK. para determinar sila bacteria presente tiene capacidad para fermentar la lactosa y/o glucosa y también para ver si se produce gas como. producto terminal del metabolismo de los hidratos de carbono. Los gases producidos son anhidrido carbonico e “hidrégeno. La bacteria que produce gas se denomina aerogénica, lo que se manifiesta por el desdoblamiento del medio, una sola burbuja de gas, el desplazamiento 2 3. 4.total del medio del fondo del tubo dejando un area clara, o una ligera muesca del medio en el costado del tubo. La no produccién de gas se denomina anacrogénica. Otro sistema de diferenciaci6n es la presencia de indicadores del aicido sulfhidrico en el medio: una sal, el citrato férrico de amonio. y una sustancia quimica, el tiosulfato de sodio. ‘Ambos indicadores deben estar present puesto que el resultado final es un método en dos etapas. 1" etapa Bacteria (medio sivido) + tiosulfato de sedio > SH, gas t icido sulthidrico es un gas incolore; por lo tanto, es necesario un segundo indicador para detectar en forma visible su produccion 2° etapa SH, + iones férricos > sulfuro ferroso | (precipitado rhegro insoluble) Para tener una explicacién mais detallada de la bioquimica de la produccién del SH, véase el capitulo 13. EI precipitado negro del sulfur ferroso que indica la produccién de SH, puede ocular la condicién acida producida en la capa superior cel medio AHK: por lo tanto, st roduce SH» €s que existe una condicion acida, aun cuando no se la observe. Tittsler * asegura que existe un paralclo entre la capacidad de un organismo de producir gas SH» y los gases CO; y Hp por la fermentacién de los hidratos de carbono. No todos los monosacaridos son degradados por todas las especies bacterianas; sus formas de fermentacién y de produccion de SHe difieren, permitiendo la identificacion del grupo, género o especie. La fermentacion es un proceso anaerdbico y la mayoria de los fermentadores bacterianos son, por lo general, anaerobios facultativos.” Cuando se lee un AHK después de 18 a 24 h de incubaci6n, observar: 1) la fermen- tacién de la lactosa y/o la ghucosa; 2) la produccién de gases CO; y Hs por el metabolismo de los hidratos de carbono, y 3) la produccién de SH. IV, MEDIOS EMPLEADOS A) Agar hicrro wiplemente azucarado, véase el capitulo 13. sobre acido_ sulfhidrico, B) Agar hierro de Kligler, pH:7.4 1 Pruebas con agor hierro de Kligler 115 Dos variedades comerciales. a) Ingredientes, BB, 1. Polipeptona wg 2. Lactosa wg 3. Dextrosa (ghucosa) log 4. Cloruro de sodio (CINa) 5 og Citrato férrico de amonio (mezela 0) 05 ¢ a) Gitrato férrico (FeC«HsO;) b) Citrato de amonio: L(NH):CsH;02) 6 05 ¢ 7. Rojo de fenol 0,025 8. Agar bg 9 Agua destilada 1.000 ml b) Ingredientes, Difco.” 1. Extracto de carne 8 og 2. Extracto de levadura Bg 3. Peptona 1b g 4. Proteosapeptona 5g 5. Lactosa Wg 6. Dextrosa (glucosa) 1g 7. Sulfato ferroso (FeSO,) O2 ¢ 8. Cloruro de sodio (CINa) 5g 9. Tiosulfato de sodio (NazS:O;) 03 10. Rojo de fenol 0,024 g 11. Agar 2 og 12. Agua destilada 1.000 mi Hidratos de carbono. a) b) Lactosa, 1%. Glucosa, 0.1% Indicador del pH: rojo de fenol. a) b) ° Alcalino: rojo. Acido; amarillo, Medio no inoculado: 1) pH:7.4; 2) anaranjado rojizo. Indicadores del SH3. a) BBL.116 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bocterias 1. Tiosulfato de sodio. 2. Citrato férrico de amonio. b) Difco. 1, Tiosulfato de sodio. 2. Sulfato ferroso. Inhibidor: ninguno. oo Método de preparacién. a) Pesar exactamente las cantidades de acuerdo con las indicaciones del prospecto. Los diferentes productos pueden variar ligeramente. b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. ©) Calentar suavemente hasta su diso- luci6n 4) Distribuir en tubos, aproximad mente 5 ml por tubo. 7. Método de esterilizacién. a) Autoclave. b) 121°C, 15 libras, 15 min. 8. Dejar enfriar en posicién inclinada (pico de flauta) con una capa basal profunda. 3 9. Método de inocul: a) Cultivo puro, colonia tinica. b) Recoger el centro de la colonia con una aguja de inoculacién. ©) Tubo en pico de flauta: J) inocu- lacién en “cola de pescado"; 2) picadura de la capa profunda. Puede invertirse el orden, de acuerdo con las preferencias. 10, Incubacién. a) 35°C. b) 18 a 24 h, ni antes ni después. v. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en las Figuras 15-1 a 15-7 (Apéndice 1) VI. INTERPRETACIONES A) Utilizacién del hidrato de carbono. 1. Fermentacién de la glucosa solamente. a) En pico de flauta. Reaccién alealina. Color rojo. b) Capa profunda. Reaccién dcida. Golor amarillo. 1. Si también se produce gas SH» el precipitado negro puede ocultar la acidez. Existe ‘acidez en la capa profunda, que se registra como tal 2 Fermentacién, tanto de la glucosa como de la lactosa. a) Pico de flauta. Reaccién dcida. Color amarillo. b) Capa profunda. Reaccién Acida. Color amarillo. 1. El Gitrobacter freundii produce también SH, ademas de fermentar ambos hidratos de carbono. 2. Sin embargo, existe una condi- cién dcida en Ja capa profunda, que se registra como tal aunque no se observe No fermentacién de la glucosa ni de Ia lactosa (no entéricos). a) Pico de flauta, Reaccién alcalina. Color rojo. b) Capa profunda. 1. Organismo aerdbico. No se observa crecimiento. No hay cambio de color. El color es el mismo del tubo no inoculado. Color anaranjado rojizo. Si no hay segu dad, comparar con el tubo no inoculado. 22 Organismo facultativo. Reac- cién alcalina. Color rojo. No fermenta ni la glucosa nila lactosas bastante comin. a) Pico de fla 1. Crecimiento solamente 2. No hay cambio de color; el mismo del tubo no inoculado (color anaranjado rojizo). b) Capa profunda. 1. Crecimionto solamente.2. No hay cambio de color; el mismo del tubo no inoculado (color anaranjado rojizo). B) Produccidn de gas. 1. Aerogénico. a) Produccion de gases: COz y He. b) Se manifiesta por lo. siguiente: Una sole burbuja de gas. Burbujas en el medio lamiento del medio. zamiento completo del medio del fondo del tubo, dejando un area clara Ligera muesca del medio en el costado del tubo, Ae 2 Anaerog gases. ico: no hay produccién de C) Produccién de acido sulthidrico (SH.) la presencia de un precipitado negro (suil- furo ferroso) se manifiesta por 1. Un color negro distribuido por wda la capa profunda y que enmascara la acidez; puede haber una ligera evidencia en el pico de flauta. 2. Un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda. Un precipitaco negro distribuido por la capa profunda, pero que no oculta totalmente la acides. Cuando se interpreta un resultado en AHK puede observarse la combinacién de cualquiera de las reacciones antes mencionadas. Buscar siempre las tres cavacteristicas: 1) fermentaciGn de los hidratos de carbono; 2) produccién de gases (CO; y H,), y 3) produccion de SH», Registrar todas. las VII, PRECAUCIONES A) Es fundamental leer ¢ interpretar un tubo de AHK dentro de un periodo de incubacién de 18 a 24 h, Si se lee antes, por ejemplo, a las 12 in, puede obtenerse un resultado falsamente positive de Acidofacido, 0 el hidrato de carbono fermentado no habri producido atin bastante acido como para cambiar el indicador del pH (rojo de fenol) gue se halla incorporado al medio. Un tubo de B) Pruebas con agar hierro de Kligler 117 AHK leido después de 24 h puede dar un resultado falso de alcalino/alcalino del do a la utilizacién de peptonas por parte del organismo, lo que da un pH alcalino. Un organismo productor de SH; puede dar tal cantidad de precipitado negro de sulfuro ferroso que oculte completamente la acidez producida en la capa profunda. Sin embargo, si se forma SH, €s que existe en la capa profunda una condicién Acida, aun cuando no se observe, y debe ser registrada como tal. Los resultados del AHK se escriben siempre siguiendo un patrén. Primero la reaccién del pico de flauta seguida por la reaccién de la capa profunda, separada por una barra (reacciin pico de flautal reaccién capa profunda). La reaccion del pico de flauta se refiere a la presencia © no de acidez (fermentaci6n del hidrato de carbono). Cuando se interpreta la reaccién de la capa profunda observar: 1) la ausencia 0 presencia de acidez (fermentacién del hidrato de carbono) 0 utilizacion de las peptonas; 2) la presencia de gases CO: y Hs, y 3) la presencia de un precipitado negro que indica que se ha _producido el” gas SH. El acido sulfhidrico es un gas, pero como es incoloro, cs necesario el segundo indicador del mismo para detectar su presencia. El citrato férrico. de amonio reacciona con el gas SH, dando el precipitado negro de sulfuro ferroso observado en la capa profunda. Por lo tanto, cuando se registre la produccién de SH, no utilizar la palabra gas, sino el simbolo SHz, que indica su. produccién. Las diferentes reacciones del medio AHK que se observen, pueden ser es- critas en forma completa o por medio de abreviaturas comunes en todos los laboratorios de bacteriologia, La acidez se indica con la letra A; la alcalinidad ‘abreviatura Alc o el simbolo K. Los gases CO; y Hz pueden indicarse con la palabra gas, el simbolo G 0 rodeando con _un circulo la reaccion. de la capa profunda, El Acido sulthidrico se indi tinicamente con el simbolo SH». A continuacién damos las diferentes formas de registrar las reacciones AHK; recordar que siempre se registra primero la reaccién det pico de flauta, seguida por la reaccion de la capa profunda. 1. Acidofacido: A/A. 2. Acido/acido, gas.118 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias b) ay AJA, b) AVAL. 0 V®, 3. Alealino/acido. a) Ale/A. b) KIA, 4. Alealino/acido, gas, FE) a) Ale/A, gas. b) Ales, G. ©) Alei@. dd) K/AL gas. ©) WAG, 1 K® Alcalinoficido. gas, SH a) Alc/A, gas, SH. b) Ale/A, G, SH 6. Alcalinoficido, SH, a) Alc/A, SH. b) K/A, SHe. Alcalino/alcalino. a) Ale/ale. b) KK Fi © Alcalino/sin cambio, a) Ale/SC. b) KISC. in cambio/sin cambio: SC EI simbolo K que indica alcalinidad, aunque se acepta, no es de uso frecuente en los laboratorios ni en libros de referencia. Por lo tanto, antes de adop- tarlo, asegurarse de que es aceptado () generalmente, El agar hiervo de Kligler no contiene Inhibidor, por lo tanto cualquier organismo puede crecer en este medio, EL medio diferencial AHK en tubos se usa para la identificacién de todos los miembros de las Enterobacteriaceae (entéricos) 4) y los bacilos intestinales gramnegativos no entéricos, De alli que antes de inoculat un tubo de AHK con un organismo desconocido, asegurarse de que sea_un bacilo. gramnegativo, catalasa_ positivo. Si se inoculan otros organismos en el medio AHK se podra observar una variedad de reacciones, algunas que no se adaptan al patron del agrupamiento entérico: por ejemplo, sicida/alealina, acida/sin cambio, ete. Después de registrar los resultados del tubo de AHK, conservarlo (refrigerar) para inocular sustancias bioquimicas para la identificacién 6 confirmacién det gé nero, o del género y la especie, Colocar el tubo en una gradilla junto con las pruebas bioquimicas que ‘se van a_ino- cular, El tubo de AHK se incuba junto con las pruebas bioquimicas para mantener la continuidad del espécimen, ya que el tubo de AHK debera haber sido rotulado convenientemente para identi- arlo. Por lo general no se rotulan las sustancias bioquimicas que se inoculan a partir del tubo de AHK y por eso éste se coloca en el primer lugar de la gradilla, y se sigue un orden preestablecido con las pruebas. Esto permite asimismo mantener la continuidad cuando se inoculan los diferentes tubos. Sin embargo, des- pués, de la incubacidn de todos los tubos de la gradilla, no intentar interpretar nuevamente el tubo de AHK, lo que ya se ha hecho y anotado. Si hay algtin cambio en la reaccién, no tiene importancia. Elagar hierro de Kligler permite detectar dos tipos de gases: DCO. y Hs, que son los productos terminales del metabolismo de los hidratos de carbono, y 2) SH.. El gas acido sulfhidrico es incoloro y_ su presencia est indicada por un precipitado negro cuando el gas entra en contacto con la sal citrato férrico de amonio.o sulfato ferroso. Por lo unto, solamente los gases COs y Hz se anotan utilizando la palabra gas; y para indicar el gas acido sulfhidrico se emplea ¢l simbolo SH,. No usar la palabra gas para la producciin de SH. Si un opganismo es capas, de producir gas SHz su deteccion depende de la presencia de ambos indicadores del mismo: tiosulfato de sodio y citrato férrico de amonio 0 sulfato ferroso. Si uno de ellos esta ausente, no podré ser detectado el SH, ‘A menudo, un organismo que produce los gases COs y Ha no da muestras de estos gases en la capa profunda del AHK:J K) Ly M) burbujas, descomposicién del medio, una ligera muesca del medio sobre el costado del tubo, o desplazamiento del medio del fondo, dejando un espacio libre. Si no se observan gases con un organismo que normalmente los produce, no preocupar- se. Si se forma gas ello sera detectado cuando se realicen diversas pruebas con hidratos de carbono (principalmente glucosa) utilizando un tubo invertido de Durham 0 un medio semisélido. La Salmonella typhi produce por lo general un anillo de SH, cerca de la superficie de la capa profunda. Sin embargo, esta caracteristica no es suficiente para los fines de su identificacién. Deben realizarse pruebas bioguimicas y_de_tipificacion seroldgica para la identificacién y confir- macién, A veces, otros organismos que producen SHz dan un falso aspecto de anillo por la pequefa cantidad de SH: formado durante el periodo de incubacion de 18 a 24 h. No confiar en la presencia de un anillo de SH, para la definida identificacion de S. typhi No utilizar el asa de inoculacién para inocular un tubo de AHK. Si se hace la puncién de la capa profunda, se produce la desintegracién mecénica del medio dando una falsa apariencia de produccién de gases (COs y H2). BBL ! recomienda preparar los tubos de AHK el mismo dia que se van a usar para mayor precision de los resultados. Si esto no es posible, derretir el medio y volver a solidificarlo antes de su empleo. No dejar de hacer la puncién de la capa profunda del AHK durante el proceso de inoculacién, porque de no hacerlo se invalidardn los resultados. El orden de inoculacién del tubo de AHK: pico de flauta en cola de pescado, puncién de la capa profunda; 0 puncién de la capa profunda, pico de flauta en cola de pescado, no tiene importancia en tanto se haga la inoculacién completa. El orden depende de las preferencias del microbidlogo. fundamental usar un. cultivo puro cuando se inocula un tubo de AHK. Recoger siempre el centro de una colonia bien aislada en un medio sélido utilizando una aguja de inoculacién. Si se inocula el AHK con un cultivo mixto, después de la incubacidn las observacio- nes seran_irregulares; después de las pruebas bioquimicas son comunes las Teacciones mixtas que hacen imposible ubicar con precisién un organismo den- oO) P) Q Pruebas con agar hierro de Kligler 119 tro de_un_patrén determinado para la identificacion del grupo, el género o la especie. Los indicadores del SHz en el medio AHK no son tan sensibles como las tiras de acetato de plomo para detectar la produccién. de. dcido sulfhidrico. La determinaci6n del acido sulfhidrico utilizando el medio AHK debera limitarse alos miembros de las Enterobacteriaceae; ‘otros organismos requieren el método de la tira de acetato de plomo, mds sensible para detectar la formacién de SH,. Algunos organismos, especialmente los grupos Klebsiella-Enterobacter, producen tanta abundancia de gases (CO. y Hs) que el medio puede ser totalmente desplazado por los mismos, Tegando hasta la tapa del tubo. Si esto ocurre, manipularlo con mucho cuidado si se hace un subcultivo para evitar la contami- nacién del cultivo o la autocontaminacidn. La cantidad de SHz que producen algunos organismos es variable. Algunos producen gas en cantidades tan grandes que toda la capa profunda ‘aparece ennegrecida por el precipitado de sulfuro ferroso; otros producen una cantidad moderada que ennegrece la capa profunda pero deja visible la acidez producida, mientras que otros s6lo producen pequeiiisimas cantidades en_un periodo de incubacién de 18 a 24 h. Sin embargo, cualquier vestigio de ennegrecimiento de la capa profunda indica la produccién de SHz y debe registrarse como tal. A veces, el Proteus retigeri 0 el Proteus morganii muestran ennegrecimiento de la capa profunda del AHK, pero esto no debe Interpretarse como produccién de SHz. AA veces se observa después de la incu- bacién un AHK sin cambio/sin cambio. No apresurarse a desechar el tubo. Controlarlo con cuidado para ver si hay crecimiento. Si no hay crecimiento, es probable que el microbidlogo haya olvidado inocular el tubo; controlar si se ve la linea de puncién o las estrias en el pico de flauta, Algunas bacterias se desarrollan en AHK pero no muestran accién sobre los hidratos de carbono, dentro de las 24 h; tampoco se observa cambio en el indicador del pH hacia la alcalinidad. Si hay crecimiento, registrar la reaccion SC/SC continuar la inoculacién de sustancias bioquimicas para la identficacién. des pués de realizar una coloracién de Gram120 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias R) para confirmar la presencia de un bacilo gramnegativo. A veces un tubo de AHK muestra una Teaccion dcida en el pico de flauta, y sin cambio en la capa profunda. Esto podr' ser consecuencia de: 1) se ha usado para la inoculacién un organismo grampositivo capaz de utilizar la lactosa sdlo aerdbicamente, 0 2) el microbidlogo olvidé hacer ‘la puncién de la capa profunda. Controlar entonces ésta para observar la marca de la puncién, controlar la morfologia de la colonia en la placa utilizada para la inoculacion del AHK, y hacer una coloracién de Gram y una prueba de la catalasa del crecimiento que se encuentra en el pico de flauta, Los grupos Klebsiella-Enterobacter provocan por lo general una rapida reversion del pico de flauta, dentro de un periodo de incubacién de 18 a 24 h, Normal- mente estos grupos muestran tina reaccion A/A, gas, en el AHK. Hacer el informe de la reaccién exactamente como se observa; por ejemplo, con reversin alcalina/acida, gas. Si hay sospecha de reversion debido a la morfologia de la colonia, se escribir reversién entre pa- réntesis después de la reaccién del AHK: alcalinafacida, gas (reversion). Cuando se produce la reversidn, ella comienza por lo general en la parte superior del pico de flauta, con reversién hacia la alcalinidad. Sin embargo, esto no debe crear problemas si se controla la morfologia de la colonia en medios sdlidos y el pico de flauta de AHK. Por lo general, estos organismos son de apariencia sumamente mucode tanto en los medios en placa como en el pico de flauta AHK y por lo comtin producen abundantes gases haciendo desplazar el medio hasta la tapa del tubo. Siempre se haran las pruebas bioquimicas para la identificacin de los grupos, género, o género y especie. VIII. AGAR HIERRO TRIPLEMENTE AZUCARADO (MEDIO ALTERNATIVO) El AHK puede sustituirse por un agar hierro triplemente azucarado (AHTA). ‘La diferencia fundamental es el agregado de un tercer hidrato de carbono sacarosa. Sin embargo, el principio, los objetivos y las bases bioquimicas ‘son esencialmente las. mismas que para el AHK. Véase el capitulo 13, sobre Acido sulfhidrico, donde se encontrard el metodo de preparacin y utilizacién, observando las precauciones, El agrupamiento de las Enterobacteriaceae por las reacciones con AHTA varia ligeramente del que se realiza con el AHK, dado que algunos no fermentadores de la lactosa pueden fermentar la sacarosa dando como resultado una reaccién del pico de flauta diferente. Por ejemplo, el Proteus vulgaris es alcalinajécida en AHK, pero dcida/acida en AHTA, BIBLIOGRAFIA 1. BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5th od., Cockeysville, Mary- Innd: Division of BioQuest, Division of Becton, Dickinson and Company, 1968, p. 16. 2. Difco Manual, 9th ed., Detroit: Difco Lab- oratories, 1953, pp. 165 and 181. 3. Hugh, R., and Leifson, B. (1953) The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carboby- drates by various gram negative bacteria. J. Bacteriol., 65, 24. Tittaler. R. P. (1931) The effect of temper- ature upon the production of hydrogen sulphide by Salmonella pullorum. J. Bac- toriol., 21, 111.Prueba de la leche con tornasol I. PRINCIPIO Diferenciar organismos sobre la base de sus multiples reacciones metabélicas en un medio lacteo IL OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32 y 33.) A) Ayudar a la diferenciacién de las especies sobre todo para el género Clostridium: Clostridium cochlearium (sin crecimiento), C. difficile (sin crecimiento), C. putrefaciens (sin crecimiento), y C. tetanomorphum (sin crecimiento), de otras especies de Clostri- dium (crecimiento). B) Streptococcus bouis (crecimiento) de S. equinus (sin crecimiento), Ill. BASES BIOQUiMICAS La leche tornasolada es un medio diferencial que se emplea para determinar varias, funciones metabolicas de un organismo: 1) fermentacién de la lactosa, 2) casedlisis y 3) coagulaci6n de la caseina.® EI tornasol incorporado a la leche es un indicador del pH y un indicador Ep (oxidacion-reduccién) que hace que el medio pueda indicar diversas funciones metabélicas. La leche sola contiene el hidrato de carbono lactosa junto con tres importantes proteinas: caseina, lactalbumina y lactoglobulina.* Por lo tanto, un organismo puede mostrar una 0 varias propiedades metabélicas en la leche tornasolada, cada una de ellas propia de una especie determinada, ayudando asi a la identificacién bacteriana: 1) fermentacién de la Tactosa; 2) reduccién del tornasol; 3) formacién de codgulo; 4) peptonizacién (digestion); 5) formacién de gas. Fermentacién de Ia lactosa El tornasol como indicador del pH es rojo en solucién dcida (pH: 4,5) y azul en condiciones alcalinas (pH: 8,3). La leche tornasolada presenta un color azul purpireo (pH: 6,8) cuando no esta inoculada,* pero si un organismo es capaz de fermentar la lactosa, produciendo principalmente acido lactico, se produce una condicién acida indicada por el cambio de color del medio, que se vuelve rojo rosado. A veces el acido butirico es el producto final de la fermentacién de la lactosa.* Ciertas bacterias que forman alcalis no fermentan, lactosa, pero actian sobre las sustancias nitrogenadas que se encuentran en. la leche liberando amoniaco, y dando en consecuencia un pH alcalino que se manifiesta por un color purpura azulado. Lactosa —+ glucosa + galactosa Acido lactico Reduccién del tornasol EI tornasol es un indicador del pH y un indicador de oxidacién-reduccion (Ej). Algu-122 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias nos organismos son capaces de reducir el tornasol a una leucobase (blanca). Formacién de codgulo y digestion (peptonizacién) Las enzimas proteoliticas provocan la hi- drélisis de las proteinas de la leche de lo que resulta suv coagulacion; ka principal enzima responsable de la formacion de coagulo es Ta renina.® * La formacién de coagulo en un medio de leche tornasolada es Causada por una precipitacion de la casefna por lt formacion de dcidos, o por la conversion de la caseina en paracaseina por la enzima re La caseina, una fosfoproteina compleja, es la proteina mais importante de fa leche; "es una proteina globular, soluble en agu solucién acuiosa de acidos, bases 6 Formaciin de wn codgulo ficido La precipitacin de fa caseina provocada por los iicidos organicos a partir de la lactosa ® (Fedo (alae emia) np fcido) (Goluble) insoluble) en condiciones iicidas, produce un corigulo firme, gelatinoso® que no se separa de las paredes del tubo y es ficilmente disuelto cuando es sometido a condiciones alcalinas."” La leche fresca tiene un pH de 66 a 6.9 debido a la presencia de fosfatos. dcidos. Cantarow y Schepartz | aseguran que la caseina “se encuentra probablemente como, una sal (caseinato de calcio) ¥ precipita con kt idificacion como ocurre en el proceso de cuajado (fermentacidn por acido kieticoy”. La acidificacion de fa leche con um pH de 4.5 descompone el complejo proteina-caseina, para dar an precipitado.? Lat fermentacién de Ja lactosa con el indicador tornasol muestra un color rojo rosado con un pH de 4.5. La lactosa es fermentada dando acido kictico y otros acidos orginicos como productos fi nales de la glucdlisis. Estos, a stt_ver, se combinan con el caseinato de calcio, sal soluble en agua, para dar caseindgeno que precipita en forma de un coagulo insoluble." Seguin Burrows y Moulder~ la hidrolisis de la caseina por la actividad enzimatica produce una conversion final del precipitado easeind- geno en un liquide claro; el proceso. se G8, caseina (paracaseinato de calcio) requesén Cosel (Golubley a —> paracasein (soluble) denomina peptonizacién, y se manifiesta por una aclaracién acuosa del medio causada por la digestion del precipitado (coagulo) y las roteinas de la leche por las enimas proteo liticas. Sin embargo, sélo se produce la peptonizacién cuando la bacteria que se desarrolla en la leche tornasolada contiene la enzima proteolitica caseasa.” Cominmente, la peptonizacién se denomina digestidn. Formacién de un cuajo (codguto) Otra forma de coagulo es el cuajo, 0 sea el proceso de. cuajado. de la leche por la Conversién de la caseina en paracaseina por jas enzimas renina, pepsina 0 quimotripsina contenidas en la leche.* Sin embargo, la mis conocida es la renina * que, segtin Cantarow Schepartz,! es secretada como prorrenina y luego es activada por iones hidrégeno (H'). La renina provoca el cuajado de ka leche convirtiendo la sal de caseina soluble (casei- nogenato de_caleio) en una paracaseina insoluble (caseimato de calcio) que es el cuajo © requeson.' * Caseinn TANS paracaseina = euajada (Sal easeinogenate —__(Caseinato de calcio) de caleio) (soluble) (insoluble) Segiin Oser" la actividad de la renina “hidroliza un enlace peptidico por 10.000 en la caseina”, Harrow y Mazur *afirman que la accién de la renina es, probablemente, la extraccidn inicial de un enlace peptidico en la caseina seguido por la formacion de un coagulo o cuajo: el calcio presente es la sal que actita como agente estabilizador Sin embargo, Cantarow y Schepartz aseguran que la. caseina es hidrolizada en paracaseina soluble que, con cl calcio, es convertida en una caseina insoluble (un paracaseinato_de calcio) para formar un *requeson™.4 > La paracaseina es precipitada como paracaseinato dle calcio ** ® por arriba de un pH de 4,5. Este reques6n es blando, insoluble, no se distelve en condiciones de alcalinidad " y se separa de los costados del tubo después de algunas horas, dando un liquido residual de color grisiceo claro que se denomina “sue- No obstante, cuando se registra la forma- (insoluble)cen de coagulo, no importa para los fines de ‘sentificacién qué proceso enzimatico inter- smo; observar simplemente la presencia ausencia de coagulo. Formacién de gases Los gases (CO, y Hz) pueden formarse como resultado final de la fermentacién de la lactosa. Se produce una fermentacién turbu- fenta cuando hay abundancia de gases que descomponen un coagulo dcido, Esto puede scurrir con ciertas especies anaerdbicas de Clostridium y esta accion ofrece gran importancia para la identificacién de la especie. Las bacterias proteoliticas pueden hidrolizar la leche por accién enzimatica para formar un coagulo (cuajo) 0 producir una reacci6n alcalina." Algunos organismos producen la enzima lipasa que cataboliza las grasas (lipidos) que se encuentran en la leche, dando un liquido amarillo trasparente* En una sola bacteria puede producirse u: de estas reacciones metabélicas © una vari dad de combinaciones de las mismas. 1. Acido, coagulo, gas, , fermentacién turbulenta (ACGT). Acido solamente (A). ‘Acido con gas (AG). Acido con coagulo (AC). Acido, coagulo, gas (ACG). Acido, digestion (AD). Coigulo, digestion (CD). Digestion (D). igulo, gas (CG). slo (C). Reduccién (Red). PSS ONO wy i 1 Se utilizan simbolos o abreviaturas estin- dares con el fin de registrar todas las reacciones metabélicas que tienen lugar en la leche tornasolada Acido, A. Alcalino, Ale. Coagulo, C, Digestion, D. Gas, G. Fermentacién turbulenta, T. Reduecidn, R o Red. Sin cambio, SC, — o neg. eros aes IV. INDICADOR (SOLUCION DE TORNASOL) A) Ingredientes.* 1. Tornasol, granulado 250 g B) D) Prueba de la leche con tornasol 123 2. Alcohol etilico 40 % (CzH;OH) 1000 ml Método de preparacién del solvente alcohol etilica al 40% 1. Base: alcohol etilico al 95 % 2. Calculos. a) & necesario/% base: X/eantidad necesaria. b) 40 %/95 %: X/100 ml. ©) 4000/95: 42,1 ml de alcohol etilico al 95 % 3. Cantidad deseada de una solucién al 40 % a) 100 ml: 42,1 ml de alcohol etilico al 95 %, cs.p. 100 ml de agua destilada. b) 1000 ml: 421 ml de alcohol etilico al 95 %, csp. 1000 ml de agua destilada. Método de preparacién: soluciin de tornasol, 1. Moler el tornasol hasta obtener un polvo fino. 2. En un frasco de 2 litros, colocar 500 mi de alcohol etilico al 40 % y el tornasol en polvo. 3. Hacer hervir F min 4. Con cuidado, decantar el Kquido sobrenadante en otro frasco de 2 litros. Agregar los 500 ml restantes de alcohol etilico al 40 % al residuo del primer frasco. 6. Volver a hervir 1 min 7. Con cuidado, decantar el sobrenadante en el frasco que contiene los primeros 500 ml de liquido hervido. 8. Centrifugar el sobrenadante y decantar en un cilindro graduado de 1 fitro. Llevar a un volumen de 1000 ml con alcohol etilico al 40 %. 10. Agregar gota a gota, HCI1 N (acido clorhidrico) hasta que la solucién tome un color pairpura. © Prueba de control de la reaccién de tornasol.> 1. Hervir 10 ml de agua destilada. 2. Dejar ent 3. Agregar I goa de la solucién de tornasol y mexclar bien.124 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias 4, Siesta bien preparada, el agua tomara un color matva. La concentracién del indicador tornasol es de aproximadamente 25 %* V._ MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE LECHE TORNASOLADA, PH: 6,8 * A) Ingredientes. 1. Leche descremada, deshidratada 100g 2. Polvo de tornasol 0,75 g 3. Agua destilada 1000 ml a) Controlar el pH; corregir a 6,8 con el agregado de una pequena cantidad de tornasol, controlando después de cada adicion. b) En lugar del polvo, puede agregarse una solucién liquida de tornasol. En este caso, rehidratar la leche descremada’ con agua destilada y agregar después solu- cién de tornasol en cantidad suficiente (véase preparacién en la Seccién IV) hasta obtener un color azul purptireo (pH: 6,8). B) Indicador del pH: tornasol. 1. Acido: color rojo, pH: 4,5. 2. Alcalino: color azul, pH: 8,3. 3. No inoculado: a) pH: 6,8; b) color azul purpiireo. ©) Existen productos comerciales BBL? Difco. D) Método de preparacién. 1. Pesar exactamente las cantidades siguiendo las indicaciones del prospecto. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. BBL? recomienda lentar el agua a 50° C antes de usai para la rehidratacién. 8. Calentar suavemente hasta disolucién. 4. Mezclar bien para obtener una solucin homogénea. 5. Distribuir en tubos, aproximadamemte 5 ml por cada tubo con tapa a rosca; dejar las tapas sin ajustar E) Método de esterilizacién. 1. Autoclave. 2. Habitualmente: 121° C, 15 libras, 15 min. a) Difco* recomienda: 121° C, 15 libras, 15 min, b) BBL? recomienda: 113-115° C, 20 min. ©) Bailey y Scott? recomiendan: 10 libras, 10 min. d) Cowan y Steel * recomiendan dos métodos: 1, Autoclave: 115° CG, 10 min. 2. Vapor 30 min, 3 dias consecu- tivos. Durante el proceso de autoclave la leche tornasolada se reduce a una base de color blanco: sin embargo, al enfriarse, absorbe geno y vuelve el color azul purpiireo primitivo. F) Dejar enfriar antes de su empleo, ajustar las tapas y refrigerar para su conservacion (4-10° C). G) Inoculacién, 1. Crecimiento de un cultivo pura de 18 a 24 h; AHK © cualquier otro medio en placa conveniente. 2 Si se sospecha Clostridium agregar hierro estéril, por ejemplo, polvo de hierro, clavos, limaduras de metal, al tubo. H) Incubacién. 1, 33°C, 2. 18 a 24 hy pueden ser nevesarios periodos mas largos, hasta 14 dias.+ VI. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 16-1 (Apéndice 1). VII. INTERPRETACIONES A) Rojo rosado (A). 1. Reaccién dcida 2. Fermentacion de la lactosaB) Azul purptireo (SC) iL: 2. No hay fermentacin de la lactosa. No hay cambio en el indicador del pH tornasol; igual que el tubo no inoculado. C) Azul (Alc). 1 2. 5, Reacci6n: alcalina No hay fermentacién de la lactos: EI organismo ataca las sustancias nitrogenadas que se encuentran en el medio. D) Blanco (Red): reduccién del tornasol a una leucobase. E) Formacién de coagulo 0 cuajo (C): coagu- lacién de la proteina de la leche. F) Digestion (peptonizacidn): (D). i. 2 Se ha digerido la proteina de la leche. Aclaracién del medio. G) Gas (CO: y Hz) (G). 1 2. Burbujas en el medio. El coagulo puede desintegrarse. H) Fermentacién turbulenta (T): el coagule ci produccién lo es. fragmentado por la abundante le gas. VIII. PRECAUCIONES A) Cuando se calienta la leche tornasolada para disolverla después de su rehidrata- cién y durante el proceso de autoclave, evitar el sobrecalentamiento, ya que ello Prueba de la leche con tornasol 125 hara que se caramelicen los aziicares de la leche. B) La formacién de codgulo se registra simplemente, coagulo (C). No tratar de diferenciar entre la formacién de un coagulo 0 de cuajo. ©) La leche tornasolada debe tener un pH de 6,8. Si no se tiene la certeza en cuanto a las reacciones adecuadas que se producen en el medio, hacer controles antes de iniciar el uso generalizado del medio. Existen tres buenos controles que se obtienen facilmente, y dan un amplio espectro de resultados.’ 1, Alcaligenes faecalis: reacci6n alcalina, 2. Clostradium perfringens (C. welchii) a) Fermentacién turbulenta. b) El codgulo acido es desintegrado por el gas. 3. Proteus vulgaris: sin cambio. D) La leche homogeneizada no conviene para preparar el medio de leche tornasolada> és mada poner en el refrigerador (4-10° C) leche raseay dearla hast siguiente; separar después la leche descremada evitando la capa de crema. Someter al vapor la leche descremada durante una hora, enfriar a-4-10° C, filtrar y medir el filtrado® Al volumen de leche descremada agregar una cantidad suficiente de solucién de tornasol hasta que el medio tome un color azul purpiirco (pH: 6,8)> Distribuir en tubos, esterilizar y utilizar de la misma manera que la leche descremada deshidratada. BIBLIOGRAFIA 1. Bailey, R. W., and Scott, E. G. Diggnos- de Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. ‘V. Mosby Company, 1966, p. 306 2, BBL Manual of Products and Labora- ory Procedures, th ed... Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi. sion of Becton, Dickinson and Com- any, 1968, p. 117. 3. Burrows, W., and Moulder, J. W. Text. book of Microbiology, Vol. I, 19th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Com: pany, 1968, p. 524 4. Cantarow, A., and Schepartz, B. Bio- chemistry, 3rd od., Philadelphia: W. B. Saunders’ Company, 1962, pp. 273 and 792-198. 5. Cowan, 8, T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- Tia, Cambridge: Cambridge University 10, Press, 1966, pp. 93-94, 120, and 159- 160. . Difeo Manual, 9th ed., Detroit: Difeo Laboratories, 1953, pp. 192-199, Fieser, L. F., and Fieser, M. Organic Shemistry, dvd ed New Yark: Reinhold Publishing Corporation, 1956, pp. 417 and 461. mi Harrow, B., and Mazur, A, Textbook of Biochemistry, 9th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1966, p. 355. Oser, B. L. Hawk's Physiological Chem- istry, 1th ed., New York: McGraw-Hill Book Company, 1965, p. 374. Wilson, G. 8., and Miles, A. A. Topley and Wilson's Principles of Bacteriology and Immunity, Vol. I, 5th ed., Balti- more: The Williams & Wilkins Com- any, 1964, pp. 489-490,Prueba del malonato I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como tnica fuente de carbono, con la consiguiente alcalinidad. I. OBJETIVO (Véase también la Seceién II, Capitulos 33 y 34.) cién entre los gé- Ayudar a la diferenc neros. A) Alcaligenes faecalis (+) de Acinetobacter (Mima) (-). B) Arizona (+) de Salmonella (por lo general ~). ©) Grupos de Klebsiella-Enterobacter (por lo general +) de Escherichia coli (—) y especies de Serratia (generalmente —). D) Klebsiella (+) de Actinobacillus (—) III. BASES BIOQUIMICAS El malonato es un inhibidor enzima ico." ® ¥ Quastel y Wooldridge " fueron los primeros en demostrar la capacidad del icido malénico (malonato) de interferir en la oxidacion del acido succinico en acido fumarico, inhibiendo la accién catalitica de la enzima succinato-dehidrogenasa. El dcido mal6nico inactiva fa enzima por un proceso denominado inhibicién competitiva. La enzima succinato-dehidrogenasa trasfiere el hidrégeno a un compuesto aceptor adecuado en la conversidn del dcido succinico en fcido fumarico.+ ® " ® Sin embargo, esta reaccién puede ser inhibida por un compuesto orginico que estructuralmente es similar al sustrato normal, el Acido succinico." El acido malénico es estructuralmente analogo al acido succinico y compite por su lugar en la enzima. 1 Acido malénico difiere quimicamente del sustrato porque es un acido-3-carbono dicarboxilico, mientras que el Acido succinico es un cido-4-carbono dicarboxilico.» gow Goon Ch CH Coos ssboor Acido malénico Acido suceinico (malonato) El icido malénico se ung a la enzima, encerrando asi los sitios activos de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el dcido succinico. Esto ocasiona un bloqueo de la oxidaci6n del acido succinico." Para la activacién del sustrato e necesario un complejo enzima-sustrato, y si esti bloqueada Ia activacién no puede formarse un nuevo producto (Acido fumérico). B +8 2 complejo ES + B+ P Bloqueado por el malonato Donde E es la enzima, § el sustrato y P el producto. EI grado de inhi nest’ en relaciénPi Molonato 127 vate Acetileoenzima 8 pscral ean es Gitrato —~ Malgo ea Fameag ott . Inhibicin del malonato ve f Succinate — arcetoglutaraio Cielo de Krebs abreviado inversa con la proporcién de concentracién del inhibidor con el sustrato.* + El acido maldnico inhibe el dcido succinico porque es un andlogo del metabolito normal Acido succinico y este antagonismo posee la propiedad antibacteriana de inhibir el crecimier to.» + Sin embargo, la inhibicion competi tiva es una reaccion reversible." Si se agrega al medio la concentracién normal del sustrato (succinico) y se encuentra un aceptor de hidrdgeno,"# el malonato libera la enzima que entonces se encuentra libre para catalizar la oxidacion del dcido succinico en acido fumé- rico. La inhibicién del malonato por la succinato dehidrogenasa encierra a la enzima, ocasio- nando una reaccién estequiométrica® y una acumulacién de acido succinico.” " Seguin la concentracién del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de oxidacién del acido succinico © provocar su completa inhibicién. En el ciclo de Krebs, cada compuesto ‘icido es influido independientemente por enzimas especificas; se consume una molécula y se forma otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formacién de un acido, y no es reemplazado, como el acido fumarico, el cio de Krebs deja de funcionar# EI ciclo de Krebs suministra una gran cantidad de energia para el metabolismo bacteriano.? La célula bacteriana, entonces, debe recurrir al cido del acido glioxilico para la produccién de intermediarios, para la ulterior biosintesis en el metabolismo con- tinuo.? Por medio del ciclo glioxflico la célula bacteriana regula la cantidad de acetil- coenzima A introducida en el ciclo para su continuacidn, que ¢s controlada por la pro- duccién de la enzima isocitratasa.* No obstante, una mayor concentracién de acido succinico tambien inhibira a la enzima isocitratasa provocando la falta de formacién de Acido glioxilico y acido acético.* La mayoria de las bacterias pueden sintetizar una pequefa cantidad de tsocitratasa en cualquier situacién, pero esta sintesis es inhibicla por el agregado de Acido suceinico a un medio de cultivo: Por lo tanto, una acumulacién del acido succinico debida a la inhibicién de la succinato-dehidrogenasa interrumpe el ciclo de Krebs, privando a algunos organismos de su fuente de energia, e interfiere también en el 2 Acido acético + Acido oxalacético: Acido raion Acido actico F Acido glioxtieo — + Acieto succinico Ciclo del cio glioxiico® Acid citrco Isocitratasa | |128 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias ciclo del Acido glioxilico, impidiendo la roduccién de nuevos intermediarios para la iosintesis de nuevos compuestos necesarios para el metabolismo. El resultado final es que un organismo es incapaz de crecer y reprodu- citse & menos que pueda fermenter o utilizar * el malonato de sodio como su tinica fuente de carbono. Si dicha reaccién es esencial para la actividad metabélica de una bacteria, entonces el inhibidor malonato muestra una actividad antibacteriana. Leifson " describe la prueba del malonato de sodio como una fermentacién, mientras que Shaw * la denomina de utilizacion. Leif- son! demostré también que existe una correlacin entre la produccién de acetilmetilcarbinol (acetoina) y la fermentacién del malonato de sodio con la Escherichia coli y rupos de Klbsilla Enteretactr. Esta corre, facién no se aplica a otros miembros de las Enterobacteriaceae " (véase el cuadro 17-1) Cuadro 17.1 Escherichia coli Grupos Klebie- ea-EEnterobacter x ss + IV. MEDIO EMPLEADO: CALDO DE MALONATO, PH: 6,7 © 671 A) Ingredientes. Extracto de levadura Sulfato de amonio (NH,).80, Fosfato de potasio (KzHPO,) Fosfato. monopotisico (KH2PO,) Cloruro de sodio (CINa) Malonato de sodio Dextrosa (glucosa) Azul de bromotimol ‘Agua destilada a 3 siz Be wonogogagan 9 og on Besant ea) ee eNom Sw or B) Indicador del pH: azul de bromotimol (ABT). 1. Acido: color amarillo, pH: 6. Los fosfatos que se encuentran en el medio ajustan el pH en 6,7 (ligera acidez) dando al medio un color verde con el indicador del pH ABT. & # 2, Alcalino: color azul de Prusia intenso, pH: 7.6. 3. Medio no inoculado: a) pH: 6,7; b) color verde. G) Existen productos comerciales. 1. BBL: caldo de malonato, modificado r Ewing.» ® 2. Difco.* a) Caldo de malonato modificado. b) Caldo de malonato: sin extracto de levadura o dextrosa. D) Método de preparacién. 1, Pesar exactamente las cantidades, tal como se indica en el prospecto. Los diferentes productos comerciales pueden variar ligeramente. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. Calentar suavemente hasta disolucién: Distribuir en tubos, aproximadamente 3 ml por tubo. pe op E) Método de esterilizacién. 1. Autoclave. 2. 121°C, 15 libras, 15 mi F) Enfriar antes de su empleo y refrigerar para su conservacién (4-10° C). G) Inoculacién. 1. Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h: en AHK u otro medio de cultivo adecuado. 2. Inéculo poco denso. 1H) Incubacién. 1. 35°C. 2. 24 a 48 h; observar si se produce crecimiento al término de cada periodo.?” En el medio de malonato elaborado por Leifson,"' el malonato de sodio es la tinica fuente ‘de carbono de que dispone un organismo. Si un organismo es capaz de utilizar el malonato de sodio como su nica fuente de carbono, al mismo tiempo que utiliza el sulfato de amonio como fuente de régeno, se produce un aumento de la alcalinidad, que se debe a la formacion de hidréxido de sodio (NaOH). El extracto de levadura Recereaiea aes aila’el algunos organismos.* * la glucosa son crecimiento deV. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 17-1 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES A) Prueba positiva: color aml claro a azul de Prusia’ intenso en todo el medio. B) Prueba negativa: no se observa cambio de color (verde) 0 amarillo (tinicamente fer- mentacién de la glucosa). VII. PRUEBA RAPIDA. TIRAS IMPREGNADAS CON REACTIVO (PATHOTEC) A) Fabricante: General Diagnostics Division, Warner-Lambert Company. B) Identificacién rapida de las Enterobac- teriaceae; resultados dentro de las 4 h. ©) Método: seguir las indicaciones del fabricante. D) Correlaciones con las pruebas estandar: 98 %; % 99,5 %.” Malonato 129 VIII. PRECAUCIONES A) Algunos organismos malonato positivos producen solamente una ligera alcalinidad que hace dificil interpretar los resultados. Cuando haya dudas, com- arar con un tubo de malonato no Inoculado. Cualquier vestigio de color azul denota una prueba positiva al tér- mino de un periodo de incubacién de 48 h, No debe hacerse una interpretacion final negativa hasta no haber incubado los tubos durante 48 h. B) Algunas cepas malonato negativas producen un color amarillo.* Ello se debe a la fermentacién de la glucosa solamente, Jo que da un aumento de la acidez, y hace que el indicador del pH cambie a amarillo con un pH de 6. ©) La E. coli y los grupos Klebsiella-Entero- bacter no requieren en absoluto enriquecimiento de extracto de levadura ni de glucosa; sin embargo, cuando se trata de diferenciar las especies Salmonella del grupo Arizona, se recomienda incorporar estos dos enriquecimientos al medio de malonato. BIBLIOGRAFIA |. BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, Sth ed., Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi- sion of Becton, Dickinson and Com- pany, 1968, p. 120. 9 differentiation. U.S. Public Health Service Publication, No. 743, Greenberg, D. M. Metabohe Pathways, Vol. 1, 3rd ed., New York: Academie Press, 1967, p. 161, 2. Blazevic, D. J., Schreckenberger, P.C., 10. Gunsalus, I. C., and Stanier, R. Y, The and Matsen, WJ. M. (1973) Discrepant Bacteria, Vol. Il, New York: Academie test for hydrogen sulfide. Appl. Micro- Pross, 1961, p, 216. biol., 26, 886. 11. Leifson, #.'(1998) The fermentation of 3, Burrows, W., and Moulder, J. W. Text sodium malonate as a means of differen. book of Microbiology, Vol.'T, 19th ed., tiating Aerobacter and Escherichia. J. Philadelphia: W. B. Saunders Com Bacteriol., 26, 329. pany, 1968, pp. 129-191 and 201-202. 12, Mahler, H. R.. and Cordes, E. H. Biolog- 4. Cantarow, A., and Scheparts, B. Bio. ical Chemistry, New York: Harper and chemisiry, 3rd ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1962, pp. 263-264 and 674, ». Cowan, 8. T., and Steel, K. J. Manwal for the Identification of Medical Bacte- rial, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 31 and 159, Difeo Supplementary Literature, De- troit: Difeo Laboratories, 1968, pp. 218- 219, Bawards, P.R., and Ewing, W. H. Iden- Ufcetion of Bterbacteacea, Minne. apolis: Burgess Publishing Company, 1955, p. 248. |. Ewing, W. H. (1962) Enterobacteri- ‘aceae. Biochemical methods for group 13. 14 16. 16. Row, 1966, p. 527. Pelezar, M. J.. and Reid. R. D.. Microbi- ology, ind. ed., New York: MeGraw- Hill Book Company, 1965, pp. 120-121. Quastel, J. H., and’ Woodridge, W. R. (1928) LXXXIV. Some properties of the ehydrogenating enzyme® of bacteria. Biochem. J., 22, 689. Rosner, R. (1973) Evaluation of the PathoTec "Rapid I-D” system and two additional experimental reagent-impregnated paper strips. Appl. Micro- biel, 26, 890. Shaw, C. (1956) Distinction between Salmonella and Arizona by Leifeon’s sodium malonate medium. Int. Bull.Prueba de reduccién de la leche con azul de metileno, para enterococos PRINCIPIO Diferenciar organismos por su capacidad enzimatica de reducir el azul de metileno en un medio con leche. I. OBJETIVO (Véase también la Seccién TIT, Capitulo 32,) Esta capacidad enzimatica se utiliza fundamentalmente para diferenciar los enterococos (especies de Streptococcus del grupo D) de otros miembros del género Streptococcus. I. BASES BIOQUIMICAS EI sistema citocromooxidasa activa la oxida- cién del citocromo reducido por el oxigeno molecular," ® que a su vez acttia como un aceptor dé electrones en el periodo terminal del sistema de trasferencia de clectrones."" Cuando existen condiciones aerdbicas (presencia de oxigeno atmosférico), el oxigeno es el aceptor final del ion hidrégeno, produciendo agua o peroxido de hidrogeno (H;02) segiin la especie bacteriana y su sistema enzimatico. El sistema citocromo se encuentra, por lo comin, presente tinicamente en organismos aerébicos, lo que los hace ca- aces de utilizar el oxigeno como aceptor inal de hidrogeno para reducir el oxigeno molecular en perdxido de hidrégeno, el iiltimo enlace de la cadena de la respiraci6n aerdbica.® * Los sustratos artificiales, como el azul de metileno, pueden sustituir a los aceptores de electrones naturales en cualquier lugar de la cadena de trasporte de electrones, donde actiian como reductores del sistema citocromo ¢-citocromooxidasa.* ® "1 " El azul de metileno, sal bésica, es un indicador de la oxidacién-reduccién que, cuando es incorporado a un medio, indica los cambios en el potencial de oxidacién-reduc- cién producidos por un organismo. Algunos organismos, utilizando el oxigeno disuelto en un medio, son capaces de reducir el potencial de oxidacin-reduccién; la reduccién es catalizada por la enzima reductasa,"® "! que es una enzima respiratoria vinculada con la oxidacién celular. Cuando se agrega el colorante sintético, reducible, azul de metileno a un medio que contenga organismos metabolizantes, los elec trones producidos por un. sustrato oxidable son desplazados de su ciclo normal, si se produce®reductasa, y son utilizados para reducir el colorante."* Anaerébicamente, la forma oxidada de color azul del azul de metileno es reducida por un organismo a un compuesto incoloro, hidrogenado, leuco-azul de metileno."* ® Esta reduccién se produce en presencia de nicotinamida adenindinu- cledtide (NADH) (difosfopiridin nucledtido; DPN 0 DPNH) 0 succinato junto con el sistema oxidasa adecuado.” La enzima reductasa se clasifica como una dehidrogenasa, dado que se trasfieren dos hidrégenos de su sustrato normal al aceptor de electrones artificial, azul de metileno, sin que intervenga el oxigeno molecular.’ La reduccién del azul de metileno es como sigue:(CH).N*7 (CH), Anil de metileno (AND) la oxictado) color azul) Reduccién de la leche con azul de metileno 131 2H, N Redncrasa + ant Red Estado oxidado, AM Aerébicamente, el leuco-azul de metileno reducido es oxidado espontineamente, y cl oxigeno molecular sirve como aceptor de hidrogeno terminal. ® La oxidacién del azul de metileno reducido produce perdxido de hidrégeno como su producto final." Oxidacivin AM-H, ™ O AM + H,0, Por lo tanto, en presencia de oxigeno atmosférico, el azul de metileno interviene en el trasporte de electrones, mientras que el sistema citocromo es dejado de lado y no tienen lugar fosforilaciones oxidativas.'* En el stema de trasporte de electrones, la trasferencia de electrones se produce a nivel de la flavoproteina (flavina_adenin-dinuclestido; FAD). Sustrate + DPN(NADH) > pis Sy Nao. FAD — anal de metilens La mayoria de los organismos contiene la enzima catalasa, que degrada el peréxido de hidrégeno,? dado que su acumulacién es toxica. Sin embargo, las especies de Serepto- coccus no producen catalasa y si se permite que se acumule perdxido de hidrgeno, se produce la muerie del organismo. Los enterococos del grupo D comprenden tres especies de Streptococcus y sus varie= dades.* 7 (CH).N NCHS) Leuco-azul de metileno (AM-H, (estado reducido} (ineolore) eta MH Estado reducielo 1. Streptococcus faecalis a) S. faecalis var. liquefaciens. b) S. faecalis var. zymogens. 2. Streptococcus faecium; S. faecium var. casseliflavns. 3. Streptococcus duran. Dentro del género Streptococcus, solamente los organismos enterococos del grupo D son capaces, generalmente, de reducir el azul de metileno a su estado incoloro; la mayoria de las otras especies de Streptococcus no deco- loran el azul original del medio de leche con azul de metileno (LAM). IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE LECHE, PH: 6,4 * A) Ingredientes, base 1. Leche descremada, deshidratada 100 g 2. Agua destilada 1000 mi B) Existen, productos comerciales, base. 1. BBL. 2. Difco. C) Método de preparacién, base. 1. Pesar las cantidades, indica en el prospecto, 2. Rehidratar con agua destilada o des- tal como. se132 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias mineralizada, con preferencia calen- tada previamente a 50° C? 3. Calentar suavemente hasta su_diso- lucién; evitar la caramelizacién de la leche? D) Preparacién del indicador de la oxi cidn-reduccién: colorante azul de metileno. 1. Agregar el colorante en concentra- cién del 1 % (10 gilitro) al medio de leche rehidratada, o 100 ml de solucién acuosa al 1 % por 900 ml de base." a) Estado oxidado: azul. b) Estado reducido: incoloro. 2. Medio no inoculado. a) pH: 645 b) Estado oxidado: azul. E) Colocar en tubo medio de leche con azul de metileno, aproximadamente 10 ml por tubo con tapa a rosca. F) Método de esterilizacion 1, Autoclave. : 2. 113-115 C, 8 a 10 libras, 20 min? G) Enfriar antes desu empleo, ajustar la tapa a rosca y refrigerar para su concentracion (4-10° C) H) Inoculacién. 1. Inéculo denso. 2. Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h; una colonia unica en placa © un cultivo en caldo de una especie de Streptococcus confirmada (cocos rampositivos catalasa negativos, ais- fados, en pares, o en cadenas; hem6- lisis variable, insoluble en bilis; resistentes a la optoquina). 3. Agitar suavemente el tbo para suspender las bacterias. 1) Incubaci6n. 35° C. 18 a 24h. V. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 18-1 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACION A) Prueba positiva: reduccién. A) 1. Medio incoloro. 2. Por lo general, un organismo entero- coco (especie de Streptococcus del grupo D). Prueba negativa: no hay reduccién. 1, El medio se mantiene azul 2. Especies de Streptococcus, que por lo general no son enterococos. Vii. PRECAUCIONES Otros organismos, ademas de los enterococos (Streptococcus del grupo D) son capaces de reducir el azul de metileno. Por lo tanto es esencial confirmar que el organismo en estudio es una especie de Streptococcus antes de utilizar este método de prueba como medio para la diferen- ciacién dentro del género. Asimismo, dentro de las especies de Streptococcus del grupo D, otros organismos que no son enterococos se mostraron a veces capaces de reducir el LAM. Los estudios realizados por Facklam * demostraron que todos los enterococos del grupo D eran capaces de reducir el LAM a su estado incoloro, mientras que entre Ios estreptococos del grupo D no enterococos, el Streptococcus equinus era incapaz de reducir el medio LAM. El 60 % de las cepas de Streptococcus bovis reducian el LAM dando una reaccién variable, lo que limita la utilidad de este medio para diferenciar entre los enterococos del grupo D y los organismos del grupo D no enterococos (S. equinus y S. bovis) 0 entre los estreptococos del grupo D y otras especies de Streptococcus que no son del grupo D, Los estreptococos lacticos, del grupo N, también reducen el LAM lo mismo que algunas cepas del grupo E y G. Sin embargo, Facklam ® recomienda la no reduccién de LAM como medio de identificar el Streptococcus avium (grupo Q pero también reaccién débil del grupo D), ya que fisiolégicamente es similar al S. faecium. Para ‘identiticar los enterococos y no enterococos del grupo D y diferenciar entre ellos y los estreptococos que no son del grupo D, Facklam y Moody? recomiendan la ‘prueba de bilis esculeina como prueba de eleccion, seguida por una prueba con el caldo SF, y luego con LAM y de tolerancia de sal. La realizacion de una combinacién de pruebas, o de ellos cuatro métodos de prueba, favorecera la diferenciacién presuntiva entre los estreptococos del grupo D y los que no son del grupo D, y la diferenciacién dentro de dicho grupo entre las especies que son enterococos y las que no lo son. B) EI tiempo para la reduccién del azul de Reduccién de la leche con azul de metileno 133 metileno esti en relacin directa con el numero de bacterias presentes; * As espeso es el indculo de un orgai positivo mas corto sera el periodo para que tenga lugar la reduccién. No es raro que la reduccién se produzea a las pocas horas de incubacién. BIBLIOGRAFIA Bailey, R. W., and Scott, E. G. Diagnos- tic Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. V. Mosby Company, 1966, pp. 114-115 and 306. ology, Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1957, pp. 105 and 181 Gunsalus, I. C., and Stanier, R. Y. The Bacteria, Vol. I, New York: Academie 2. BBL Manual of Products and Labora- Press, 1961, pp. 895 and 341-342, tory Procedures, Sth ed., Cockeysville, 10. Harrow, B., and Mazur, A. Textbook of ‘Maryland: Division of BioQuest, Divi. Biochemistry, Sth ed., Philadelphia: W. sion of Becton, Dickinson and Com. _B. Saunders Company, 1966, pp. 168- pany. 1968, p. 162. 169. 3. Burrows, W., and Moulder, J. W. Teet. 11. Mahler, H.R., and Cordes, E. H. Biolog. book of Microbiology, Vol. i, 19th ed., ical Chemistry, New York: Harper and Philadelphia: W. B. Saunders Com: Row, 1966, pp. 286 and 557-558. pany, 1968, pp. 110-111 and 328. 12, Oser, B. L: Hawk's Physiological Chem- 4. Cantarow,'A., and Schepartz, B. Bio- istry, 1dth ed., New York: McGraw-Hill chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W.B. Book Company, 1965, p. 428. Saunders Company, 1962, p. 985. 18, Stanier, R. ¥., Doudoroff, M., and Adel- 5. Difeo Manual, 9th’ ed., Detroit: Difeo berg, E. A. The Microbial World, 2nd Laboratories, 1953, pp. 74-75. ed., Englewood Cliffs, N.J.: Prentice- 6. Facklam, R. R. (1972) Recognition of Hal Ine., 1963, pp. 266-257. group D streptococcal species of human 14. Steel, "J. (1961) The oxidase reaction origin by biochemical and physiological ‘onomic tool. J. Gen. Microbiol., tests, Appl. Microbiol. 29, 1181. rs 7. Facklam, R. R., and Moody, M.D. 18. Wilson, G. 8., and Miles, A. A. Topley (1970) Presumptive identification of group D streptococci: the bile-esculin test. Appl. Microbiol., 20, 245. Frobisher, M. Fundamentals of Microbi- ‘and Wilson's Principles of Bacteriology and Immunity, Vol. I, 5th ed., Balti- more: The Williama é& Wilkins Com- pany, 1964, p. 498.Prueba del rojo de metilo 1. PRINCIPIO A) Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales acidos de la fermentacin de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema, B) Es una prueba cualitativa de la produccion de acido (determinacién del pH); algunos organismos producen mas acidos que otros. I. OBJETIVO (Véase también Ja Seccién 111, Capitulos 33 y 34.) A) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros. 1. Escherichia coli (+) del Enterobacter aerogenes (—), Enterobacter cloacae (=) y Klebsiella (por lo general —) 2. Especies de Yersinia (+) de otros bacilos no entéricos_gramnegativos 1a B) Ayudar a la identificacién de la Listeria monocytogenes (+). Ill. BASES BIOQUIMICAS La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador del pH, rojo de metilo, para determinar la concentracién de iones hidrégeno (pH) presente cuando un organismo fermenta la glucosa."* La concentracion de hidrogeniones depende de la relacidn gaseosa (CO; y Hz), que a su vez es un indice de los diferentes ciclos del metabolismo de la glucosa que muestran diversos organismos. Las diferentes formas de fer- mentacién se deben a variaciones en las enzimas vinculadas con el metabolismo del Acido pirivico que se encuentran en cl organismo! Todos los miembros de las Enterobacte- riaceae son, por definicion, fermentadores de la glucosa. En el caldo RM/Voges-Proskauer (VP), después de 18 a 24h de incubacién, la fermentacién resultante da productos secundarios metabélicos acidos; por lo tanto, inicialmente todos los entéricos darén una reacci6n positiva con el rojo de metilo.t: + Sin embargo, después de mas tiempo de incubacién como lo exige la realizacién de la prueba (de 2 a 5 dias), aquellos organismos que son rojo de metilo positives continian produciendo mis acidos, y dan como resultado un bajo pH terminal, venciendo al sistema amortiguador de fosfato, y manteniendo un medio acido (pH: 4,2 0 menos). Los organismos rojo de metilo negatives continéan metabolizando los products iniciales de la fermentacién por decarboxi- lacién, produciendo acetilietilcarbino (acetoina) neutro, lo que da un elevado pH terminal que disminuye la acidez del medio, elevando el pH hacia la neutralidad (pH: 6 © mas).!"4 La E. coli y otros organismos RM positivos producen un alto volumen de dcidos: lictico,Prueba del rojo de metilo 135 2 Glucosa + H,O — 2 dcido ldctico +4cido aeético+ aleohol etic + 2 CO: + 2 He (Acido formico > He + CO.) succinico, acético y formico; la descompo- sicién del acido férmico es la Have para la produccién de hidrégeno y anhidrido carbé- nico." La E. coli produce cantidades iguales (relacién 1:1) de Hy y CO, a partir del metabolismo de la glucosa.® La reaccién general del metabolismo de la glucosa por la E. coli es la indicada arriba. Los organismos rojo de metilo positivos producen acidos estables,? manteniendo una alta. concentracién de jones hidrégeno ® hasta alcanzar cierta concentracién y entonces cesa toda actividad Los organismos rojo de metilo negativos también producen Acidos (acético, lactico y férmico), pero tienen una menor concen- tracién de iones hidrégeno porque hay una reversién hacia la neutralidad debida a la nueva degradacion de los cidos organicos en carbonatos, y al anhidrido carbénico, y posiblemente a la formacién de compuestos de amonio por las proteinas que se encuentran en el medio." Asimismo, por debajo de un pH de 63, el acido acético es convertido en acetoina y 2,3-butanediol,? productos finales neutros; cesa la produccién de Hz mientras que aumenta la acumulacién de COs. Las especies de Klebsiella-Enterobacter (E. cloacae y E. aerogenes) rojo de metilo negativas producen mis alcohol etilico que la E. coli, menos acidos, y el doble de CO, y Hz (relacion gaseosa 2:1). La falta de produccién de hidrégeno se debe a la ausencia de la enzima hidrogeno liasa.? La reaccién general del metabolismo de la glucosa por los grupos Klebsiella-Enterobacter es: * Ghucosa + 1/2 O > 2.5-butanedio! + HO + 2 CO, (Acetoi -butanediol) La validez de la prueba del rojo de metilo depende de un tiempo de incubacién suficiente como para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de la glucosa."” Los organismos en estudio se incubaran por lo menos 3 dias a 35-87° C* lo que permite que todos los organismos con baja proporcién gaseosa (RM +) muestren su limite en la concentracién de iones hidrégeno (bajo pH terminal), mientras que los que tienen una alta relacién gaseosa (RM —) mostraran una menor concentracién de hidrogeniones (alto pH terminal)? IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE, CLARK Y LUBS (CALDO RM/VP), PH: 6,9* A) Ingredientes. 1. Polipeptona o peptona amortiguada * 7¢ 2. Dextrosa (glucosa) 5g 3. Fosfato de potasio (KsHPO,) (buffer) 5g 4, Agua destilada 1000 ml B) Productos comerciales. 1. BBL. 2. Difco. C) Método de preparacién. 1. Pesar exactamente las cantidades, de acuerdo con las indicaciones del prospecto. Los diferentes productos pueden variar ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 8. Calentar suavemente hasta disolucién. 4. Distribuir en tubos, aproximadamente 5 ml por tubo. D) Método de esterilizacién. 1, Autoclave. 2. 121°C, 15 libras, 15 min. E) Enfriar antes de su empleo y refrigerar para su conservacién (4-10° C). F) Inoculacién. 1. Crecimiento de un cultivo puro en AHK, de 18 a 24h. 2. Indéulo poco espeso. G) Incubacion. 1. Minimo absoluto. a) 85°C. b) 48h. 2. Recomendada.* * a) 30°C b) De 3.a5 dias. H) Agregar indicador del pH rojo de metilo136. Pruebos bioquimicas para Ia identificacién de bacterias directamente a una alicuota_incubada antes de intentar la interpretacién. EI medio RM/VP que se encuentra en el comercio ¢s una modificacién del medio de Clark y Lubs. Clark y Lubs utilizaron una concentracidn del I % de peptona y glucosa, ro como wna concentracién menor de no menos del 0,5 % ¢s el minimo satisfactorio, por lo tanto los organismos rojo de metilo hegativos no alcanzan la elevada concentra- cién de iones hidrégeno limitante.” Una concentracién del 0,5 % de peptona da menos color al medio, haciendo mas facil interpretar la reaccién de color. V. REACTIVO EMPLEADO: INDICADOR DEL PH ROJO DE METILO ‘A) Método de preparacién. 1. Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 ml de alcohol etilico de 95°. 2. ‘Agregar 200 ml de agua destilada a la mezela alcohol-indicador. 1. El medio inoculado de Clark y Lubs se emplea también para la reaccién de VP, que se determina después de 24 a 48 h de incubacién. 2. Asépticamente, con pipeta, retirar una alicuota de 2,5 ml para la determi- naci6n del rojo de metilo. 3. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo a la alicuota. 4, Interpretar el resultado de color inmediatamente. ©) Control de calidad: El reactive debe controlarse con cultivos positivos y negativos conocidos antes de disponer su empleo. E. coli y especies de Klebsiella son buenos controles, porque se obtienen facilmente y no crean problemas cuando se los mantiene como cultivos madre: E. coli: rojo de metilo positivo; especies de Klebsiella: rojo de metilo negativo. Conservacién: Guardar el reactivo en un refrigerador (4° C) mientras no se usa. Quimica de la accién del reactivo: El rojo de metilo es un indicador que ya es acido € indicara los cambios en el grado de acidez por reacciones de color, en una escala de pH 4,4 a 6. Con un pH de 4,4 © menos en el medio, el reactivo se mantiene rojo, mientras que con dismi- nucién de la acidez y con un pH de 6, D) A) B) © A) c) D) el indicador rojo de metilo vira aun color amarillo, que denota asimismo acidez, pero la concentracién de iones hidrogeno es mucho menor. Con un pH de 5 a 5,8 se producen diferentes tonalidades de anaranjado.! VI. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 19-1 (Apéndice 1). VII, INTERPRETACIONES Prueba RM positiva: el cultivo es suficientemente acido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un definido color rojo (pH: 4,4) en la superficie del medio. Prueba RM negativa: color amarillo (pH: 6) en la superficie del medio. Reaccién retardada: color anaranjado. Continuar la incubacién hasta 4 dias y repetir la prueba. VIII. MICROTECNICA RAPIDA Método de Barry y col.! Detecta organismos rojo de metilo positivos en 18h. Medio: caldo RM/VP.* 1. Guardar en tubos con tapa a rosca (16 x 125 mm). 2. Inmediatamente antes de su empleo, pasar asépticamente con una pipeta alicuotas de 0,5 mi en pequeiios tubos de ensayo (13 X 100 mm). Método. 1. Inéculo. a) Recoger el centro de una sola colonia (cultivo puro). b) Cultivo de un crecimiento de 18 a 24 h en EAM, MAC o ASC. 2. Incubacién. a) 35°C. b) 18a 24h. 3. Después de la incubacién agregar una gota de reactivo RM a cada tubo deensayo ya preparado. 4, Interpretacion, a) RM positive: color rojo brillante. b) RM negativo: color amarillo definido, La _microtécnica de Barry y col! ha permitido disminuir el periodo de incubacién con relacién al método comin (2 a 5 dias), Los estudios' demostraron que utilizando menores voltimenes de caldo para la prueba, os organismos en estudio sufrian una mejor exposicién al oxigeno aumosférico que hacia que los organismos RM negativos revirtieran al pH acido inicial con’ mayor rapidez. IX. PRECAUCIONES A) La peptona que se encuentra en el medio puede afectar los resultados del rojo de metilo. Antes de su empleo, debe hacerse un control de calidad con cada lote utilizando organismos rojo de metilo positivos y negatives conocidos.* B) La reaccién del rojo de metilo no puede acelerarse aumentando la concentracién de glucosa en el medio. # ©) No debe intentarse interpretar un resultado con el rojo de metilo después de menos de 48 h de incubacién.® Si se realiza la prueba demasiado pronto, los resultados seran a menudo equivocos 0 falsamente positivos, dado que los orga- D) E) Prueba del rojo de metilo 137 nismos RM negatives no habran tenido tiempo suficiente para metabolizar por completo los productos cidos iniciales acumulados por fermentacién de la glucosa.! Después de slo 18 a 24 h de incubacién todos los resultados son RM ositivos. i no se dispone de medio comercial, cualquier medio sera conveniente en tanto contenga no menos del 0,5 % de ucosa y peptona, junto con un buffer fosfato, y se haya realizado un control de calidad. Evitar la prueba con’ una mezcla caldo- inéculo demasiado turbia; el crecimiento bacteriano es inhibido si el inéculo excede la concentracién celular maxima de alrededor de 10° células viables por ml.! Con cada disminucién logaritmica del tamatio del inéculo hay un aumento en el tiempo necesario para que los organismos RM positivos acumulen suficientes productos acidos como para superar el sistema amortiguador, Cada laboratorio debe fijar sus patrones en cuanto a las siguientes variables para obtener resultados éptimos y reprodu- cibles: 1) la densidad del indculo; 2) el volumen total de caldo, y 3) el tamario del tubo de ensayo que se emplee. A menudo se produce una reaccién de color anaranjado cuando se ha utilizado un volumen ‘demasiado grande de caldo, y ello hace que Ja interpretacin sea’ subjetiva y menos reproducible,! IBLIOGRAFIA 1. Bany, A. L., Bemsohn, K. L., Adams, A. P.. and Thrupp, L. D. (1970) Im: proved 18shour methyl red test. Appl Microbiol, 20,, 866. 2. Branson, D. Methods in Clinical Bacteri- ology, Springfield, Ill.: Charles C ‘Thomas, Publisher, 1972, pp. 32-33. 3. Clark, W. M., and Lubs, H. A. (1915) ‘The differentiation of bacteria of the co- Ion-aerogenes family by the use of indi- ators, J. Infect. Dis., 17, 160. 4. Cowan, S. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medica Bacte- ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, p. $2. 5. Doelle, H.’ W. Bacterial Metaboliem, New York: Academie Press, 1969, pp. 284-286 and 291, 6. Edwards, P. R., and Ewing, W. H. Iden- tification’ of Enterobacteriaceas, Minne- apolis: Burgess Publishing Company, 1955, pp. 248-249, 7. Gunsalus, I. G., and Stanier, R. Y., The Bacteria, Vol. It, New York: Academic Press, 1961, pp. 84-89. 8, Harden, A. (1901) The chemical action of Bacillus coli communis and similar organisms on carbohydrates and allied compounds. J. Chem. Soc., 79, 610. 9. Jennens, M. G. (1954) The methyl red test in peptone media, J. Gen. Micro: biol., 10, 121. 10. ‘Ruchhoft, C. C., Kallas, J. G., Chinn, B., and Coulter, E. W. (1931) Coli Acrogenes differentiation in water analysis. II. The biochemical differential ‘tests and their interpretation. J. Bacte- riol., 22, 125. 11. Sokatch, J. R., Bacteral Physiology and “Metaboliem, New York: Academic Pross, 1969, p. 79. 12. Stokes, J. L. (1949) Fermentation of glucose by suspensions of Kecherichia coli. J. Bacteriol., 67, 147. 33. Wilson, G. 8., and Miles, A. A., Topley and Wilson's Principles of Bacteriology and Immunity, Vol 1, 5th ed., Balti- more: The Williams & Wilkins Com- any, 1964, pp. 815-81620 Prueba de la moti I. PRINCIPIO A) Determinar si un organismo es mévil 0 inmévil. B) Las bacterias tienen motilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran princi- Imente entre los bacilos (bacterias en forma de bastoncillo); sin embargo, algunas formas de cocos son méviles.* Las bacterias méviles pueden contener un solo flagelo o muchos; ademés su localizacién varia con la especie bacteriana y las condiciones de cultivo? A veces, las bacterias con motilidad producen variantes no méviles que parecen ser estables raramente se revierten en formas méviles.? Los organismos no mé- viles carecen de flagelos. Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32.2 34.) A) Incubacién: 87° G. if ‘Ayudar a la diferenciacién entre los géneros, a) Escherichia coli aerogénica (+) de la variedad anaerogénica de E. coli (-). Alkalescens-Dispar, clasificada ahora como E. ‘coli anaerogénica (que no produce gas). b) Enterobacter (por lo general +) del Klebsiella (—). ©) Vibrio (+) del Actinobacillus (—-). Ayudar a la diferenciacién en especies. a) Bacillus anthracis (—) de otras especies de Bacillus (generalmente +). b) Bacteroides serpens (+) de otras especies de Bacteroides (—). ©) Bordetella bronchiseptica (+) de otras especies de Bordetella (—). d) Pseudomonas mallei (—) de otras especies de Pseudomonas (por lo general +). ¢) Salmonella pullorum (-) y Salmo- fgla allinariun (C) de efron espe cies de Salmonella (+). B) Incubacién: 22° C (temperatura del ambiente). Ayudar a la diferenciacion entre los géneros: Listeria (+) de especies de Conmebacterivn (por lo general —). Ayudar a la diferenciacién en especies. a) Corynebacterium aguaticum (+) de otras especies de Corynebacterium ie) b) Yersinia pseudotuberculasis (+) y ¥. enterocolitica (+) de la ¥. pestis (-). III. MEDIOS EMPLEADOS: MEDIO PARA LA PRUEBA DE MOTILIDAD (SEMISGLIDO) A) Dos variantes.1. Ingredientes, pH: 7,31 a) Extracto de carne 3g b) Peptona 10g ©) Gloruro de sodio (CINa) 5 g a) Agar 4g ©) Agua destilada 1000 ml 2. Ingredientes, pH: 7,2.6 a) Triptosa 10 g b) Cloruro de sodio 5g ©) Agar be d) Agua destilada 1000 ml B) Existen productos comerciales. 1. Difeo. | 2. BBL. ©) Método de preparacién. 1. Pesar las cantidades exactamente, tal como se indica en el prospecto. Los diferentes productos pueden diferir ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Galentar suavemente hasta su diso- lucién. 4, Distribuir en tubos, aproximadamente 5 ml por tubo. D) Método de esterilizacién. 1. Autoclave. 2. 121°C, 15 libras, 15 min. E) Dejar enfriar en medio en_ posicién vertical y refrigerar para su conservacién (410° C). F) een 1. Crecimiento de un cultive puro de 18 a 24 h: AHK u otro medio de cultivo adecuado. 2. Hacer la puncidn del centro del medio con una aguja de inoculacién hasta una profundidad de 1,2 cm. G) Incubacién. 1. 35°C, 2. 24a 48 h; si resulta negativo, incubar a 21-25° C durante 5 dias. 7 La temperatura de incubacién es fundamental, dado que muchos organismos con motilidad lo son a 15-25° C, pero no Motilidad 139 a 87° C, que es su temperatura éptima de crecimiento. Si se sospecha que un organismo puede mostrar motilidad con una temperatura inferior, inocular dos tubos simultineamente; incubar uno. a 35° C y el otro a la temperatura del ambiente (22-25° C). H) Si se desea, utilizar sales de tetra: en el medio para la prueba de m sin embargo, este reactivo es inhibidor para ciertos organismos. 1. Preparar una solucién acuosa de doruro de 2,8,5-trifeniltetrazolium (CTT) al 1%. 2. Dos métodos de esterilizacién. a) Filtrado. 1. Filtro de Seitz. 2. Filtro de membrana Millipore, membranas con poros de un diametro de 0,45 micrones. 3. Asépticamente agregar 8 ml de CTT al 1 % estéril, por litro de medio para la prueba de motilidad, estéril b) Antes de someter al autoclave, agregar 0,05 g de CTT/litro de medio de motilidad ¢ 5 ml de una solucion al 1%. * Kelly y MacDonald * recomiendan el agregado de 0,005 % de sal de tetrazolium para ayudar a detectar la motilidad, sobre todo cuando hay dificultad para hacer una interpre- tacién. Afirman que el empleo de CTT reduce al minimo los errores y elimina la necesidad de compararla ‘con un tubo no inoculado. Las sales de tetrazolium son incoloras, pero a medida que el organismo crece el colorante es incorporado a las células bacterianas, donde es reducido a un pigmento rojo insoluble, formazin.* El color rojo s6lo se forma en el area del medio, donde se estan desarro- Mando las bacterias.* Las sales de tetrazolium son monotetra- zoles * que contienen dos bases dei grupo azo (R-N=N-OH). El grupo azo (-N=N-) es un croméforo bisico que imparte color al compuesto en que se produce.* El tetrazolium és una sal de una base coloreada, por lo general cloruro*140 Pruebas bioquimicas para | identificacién de bacterias N—N-R wid \ AR, f+ Grupo azo a Estructura bisica El tetrazolium o cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium tiene un anillo benceno unido a los 4tomos de hidrégeno. £ H or Benceno (CoH) Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium cm La sal de tetrazolium puede actuar como un aceptor de electrones artificial para las enzimas enlazadas con el piridin nuclectido, por ejemplo la succinato-dehidrogenasa, la Citocromo-oxidasa, NAD (DPN) y NADP (TPN) en la cadena oxidativa biolégica> * La sal es reducida por el citocromo 6 0 ¢ 0 puede competir por los electrones de la Gitocromo-oxidasa.* La oxidacién se produce r la reduccién de dehidrogenasas especi- Reas por medio del sistema de trasporte de electrones. EI tetrazolium es un compuesto soluble, incoloro, que es captado por las células bacterianas donde es reducido en el sitio de las oxidaciones enzimaticas* liberando el cid formazan, que es un compuesto insoluble, intensamente pigmentado (rojo). Véase la formula al pie de la pagina. El medio para la prueba de motilidad * fabricado por Difco * es una modificacién del medio original ideado por Tittsler y Sand- holzer."° E} producto BBL ' es una modifi- cacién del_medio original efectuada por Edwards y Ewing.” Estos medios son semisélidos y permiten interpretaciones macroseépicas de la moti- es \ ots (CooHsNCD Sal tetrazolium (CTT) Cloruro de 23,5-trifeniltetrazolium Incoloro-soluble-oxidado + Células bacterianas! lidad.” Utilizando un medio semisélido Titts- ley y Sandholzer " hallaron cepas méviles de bacterias que habian sido clasificadas como no méviles con el método de la gota pendiente. Afirman que después de 24 h de Incubacién, las determinaciones de motilidad en medios’ semisdlidos eran idénticas a las determinadas por el método de gota pendiente, pero después de 48 h de incubacién se obtenia un 4 % mas de cultivos de motilidad positiva. Debe efectuarse un control no inoculado cuando se incorpora al medio para la prueba de motilidad el CTT. IV. RESULTADOS Los fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 20-1 (Apéndice 1). , INTERPRETACIONES A) Medio de motilidad. 1. Prueba positiva (motilidad): los organismos méviles migran de la linea de siembra y se difunden en el medio, provocando turbiedad. Pueden mos- tar un. crecimiento en estrias vello- he 2. Prueba negativa (sin motilidad): cre- cimientobacterianoacentuadosiguien- do la linea de siembra ' %; el medio circundante se mantiene claro. 3. Medio de control (no inoculado): no hay crecimiento, el medio se mantiene incoloro y claro. B) Medio de motilidad con sal de tetrazolium (CTT). 1. Prueba positiva (motilidad): los organismos méviles muestran una nubosi- te Getta, ne, reduccién extrac He Formazin Pigmentado de rojo-insoluble-reducidoA) c) dad turbia rosada que se difunde por todo el medio.* 2. Prueba negativa (sin motilidad): el crecimiento bacteriano produce una linea rojo brillante limitada a seguir la linea de siembra;* el medio que la rodea se mantiene claro. 3. Medio de control (no inoculado): no hay crecimiento, el medio se mantiene incoloro y claro. VI. PRECAUCIONES El 6rgano de locomocién, el flagelo, es de naturaleza proteica y esta sujeto a desna- turalizacién por el calor excesivo."' Si se calienta un cultivo antes de la prueba de la motilidad se produciré un resultado falsamente negativo. Los resultados de motilidad son de dificil determinacién en bacterias anaerébicas. Solamente tiene cierta importancia un resultado positivo (motilidad).s Los flagelos pueden ser destruidos o fragme ntados por la agitacién violenta de un tubo de cultivo bacteriano, lo que dara una prueba de motilidad débilmente Motilidad 141 positiva o un resultado falsamente negativo. D) Los organismos méviles, conservados en cultivos madre en un’ medio artificial durante un largo tiempo, muestran tendencia a la pérdida de su motilidad? E) Muchas bacterias son méviles a una temperatura € inméviles cuando se las cultiva a otra.? Un organismo que resulte negativo después de 48h de incubacién a 35°C debe ser incubado a 21-25°C durante 5 dias *" para confirmar la falta de motilidad. F) Si es dificil interpretar una prueba de motilidad, compararla con un tubo no oculado. El uso de una sal de tetrazolium en el medio puede ayudar a la interpretacién* Si atin asi hay dudas, realizar un preparado en gota pendiente con un inéculo denso tomado con un asa de un cultivo de 18 a 24h, G) A veces, un cultivo mévil puede hallarse en un estado temporariamente inmovil porque sdlo hay algunas bacterias con motilidad. En este caso un cultivo positivo mostrard sélo algunos penachos o rosetas, que a menudo no se toman en cuenta como indice de motilidad. BIBLIOGRAFIA BBL Manual of Products ana Labora- tory Procedures, 5th ed., Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi- sion of Becton. Dickinson and Com- pany, 1968, p. 126, . Burrows, W., and Moulder, J. W. Text- book of Microbiology, Vol. I, 19th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Com: pany, 1968, pp. 44 and 223. Cantarow, A., and Scheparts, B. Bio- chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1962, pp. 385-386. Conn, H. J., and Lillie, R. D. 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Topley and Wilson's Principles of Bacteriology and Immunity, Vol, I, 5th ed., Balti- more: The Williams & Wilkins Com- pany, 1964, pp. 32 and 36.Prueba de reduccién del nitrato I. PRINCIPIO Determinar Ia capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrégeno libre. IL, OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32 a 34.) A) Ayudar a la diferenciacion de las especies. 1. Haemophilus ducreyi (—) y Haemophilus vaginalis (—) de otras especies de Haemophilus (+). 2. Branhamella catarrhalis (+) y Neisseria mucosa (+) de otras especies de Neisse- ria (-). B) Ayudar a la identificacidn de: Enterobac- teriaceae (por lo general +). itl. BASES BIOQUIMICAS La reduccién del nitrato (NO5~) en nitrito (NO) y en gas nitrégeno (Nz) tiene lugar eneralmente en condiciones anaerdbicas, en fas cuales un organismo obtiene su oxigeno del nitrato.s™ El oxigeno sirve como un aceptor de hidrégeno,"* por ejemplo, el aceptor final de protones y ¢lectrones."" ta mayorfa de las bacterias aerobicas son anacro- bios facultativos y s6lo pueden reducir el nitrato en ausencia de oxigeno."* Esta respira- cién anaerdbica es un proceso de oxidacién por el cual las sustancias inorgénicas, espe- Galmente nitrato y sulfato, 0 raramente hidratos de carbono proporcionan oxigeno para que sirva como aceptor de electrones para suministrar energfa."" En la reducci6n del nitrato, los citocromos bacterianos tras- portan electrones a moléculas aceptoras especificas.®"* Gunsalus y Stanier ® aseguran que hay prucbas de que el nitrato acttia como, cl oxidante final en los sistemas citocromo. La caracteristica del nitrato de reducir un: especie en particular es mas 0 menos constan- eat Reduccién del nitrato en nitrito * NO; + 22@+2H*t— NO + H,0 Nitrato Nitto Sin embargo, las posibilidades del producto al de reduccién del nitrato son muchas: nitrito (NO,), amoniaco (NH), nitrégeno molecular (N2), 6xido nitrico (NO), dxido nitroso (N.O), 0 hidroxilamina (R. NH OF)! El producto final de la reducci6n, que se forme depende de la especie bacteria na.” El mas comin es nitrégeno molecular (un_ gas) por medio de la reduccién del nitrito.'® Estos productos, segtin las condiciones del medio, ya no son mas oxidados 0 asimilados en el metabolismo celular, sino que se excretan en el medio circundante.!"- La reduccién del nitrato en gas nitrégeno (N.) uw éxido nitroso (NO) se denomina desnitrificacion." " El nitrato sirve como un. aceptor de clectrones; por cada molécula denitrato_reducido, se aceptan cinco ele: trones.'® Nitrato en nitrégeno molecular * 2NOs +106 + 12H* +N, +610 En el proceso de desnitrificaci6n, el 6xido nitroso (un intermediario) puede acumularse si Ja concentracién de nitrato es elevada; sin embargo, cuando ésta es baja, el éxido nitroso s reducido nuevamente a’ nitrégeno molecular." En la reduccién del nitrato pueden producirse varios procesos para la utilizacién de los productos terminales formados. El amoniaco 6 la hidroxilamina pueden ser asimilados en componentes celulares que contengan nitré- geno (proteinas y acidos nucleicos) para la sintesis de nuevos compuestos."* La reduccién, por lo tanto, en la prueba de reduccién del nitrato, se manifiesta por la presencia de un producto final catabélico 0 la ausencia de nitrato en el medio. IV. MEDIOS EMPLEADOS: MEDIO DE NITRATO DE POTASIO, DOS VARIANTES A) Caldo con nitrato: pH: 74 B) Agar con nitrato: pH: 6,8.° ©) Ingredientes: cualquiera de los dos me dios. 1. Extracto de carne 8g 2. Peptona 5g 3. Nitrato de potasio (KNO,) 1 § 4. Agar (para el medio de agar con nitrato solamente) 12 g 5. 's 1000 ml D) Productos que existen en el comercio: Difco. 1. Caldo con nitrato. 2. Agar con nitrato. E) Método de preparacién. 1. Pesar exactamente las cantidades, tal como se indica en el prospecto. Rehidratar con agua destilada desmineralizada Calentar suavemente hasta disolucién. Distribuir en tubos, aproximadamente: ae Ny a) Agar con nitrato: 5 ml por tubo. b) Caldo con nitrato: 1 ml por tubo.! Reduccién del nitrato 143 F) Método de esterilizacin, 1. Autoclave. 2. 121° G, 15 libras, 15 min, G) Dejar que solidifique el medio de agar con nitrato en pico de flauta. H) Dejar enfriar cualquiera de los medios antes de su empleo y refrigerar para su conservacion (4-10° C), 1) Inoculacién. 1. Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h: AHK u otro cultive adecuado. 2. Medio de caldo: inéculo denso2* 3. Medio de agar en pico de flauta: colade pescado en el pico de flauta y puncién en la capa profunda’ 4. Deben hacerse simul controles, Aneamente dos a) Tubo de control 1: inoculade con un organismo nitrato positivo conocido."* b) Tubo de control 2: no inoculado, pero tratado en las mismas condi- Giones que el inoculado. Controlar para determinar si hay nitrito en el medio.” J) Incubaci6n 1. 35°C. 2 De 12 a 24h; * raramente puede ser necesaria una incubacién prolongada de hasta 5 dias.® 3. Agregar reactivos de nitrato antes de hacer la interpretaci6n, La mayoria de los organismos capa ces de reducir el nitrato, lo hacen dentro de las 24 h. Daubner? afirma que todos los miembros de Enterobac- teriaceae que sometié a prueba podian reducir el nitrato dentro de las 8 h, con excepcidn de dos especies de Erwinia, El medio con nitrato puede utilizarse como caldo © como agar en pico de flauta, Sin embargo, ZoBell“! y Hitchens ® recomiendan el uso de un medio semisélido que contenga 0,2 a 0,4 % de agar. ZoBell® asegura que un medio semisdlido favorece la reproduccién, permite el movimiento de los organismos con motilidad, difunde rapidamente los nutrientes y productos de desecho y aumenta las actividades reductoras de un organismo. ZoBell afirma tambien: 1) que muchos organismos no reducen el nitrato en un medio liquido o sélido, pero silo hacen en un medio semisdlido; 2) que algunos pats-144 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias genos microaerofilicos no se reproducen sino en un medio de tipo semisdlido. Segin los estudios de ZoBell * la reducci6n del nitrato Megaba al ‘maximo, tanto en grado como en porcentaje de reacciones positivas cuando los Cultivos se hacian en un medio semisdlido, en comparacién con el minimo que respondia al medio liquido. Hitchens " efectué dos obser- vaciones relacionadas con el empleo para el cultivo del medio semisélido: 1) muchos organismos rebeldes se reproducen en éste, cosa que no ocurria en un medio liquide 0 slide, y 2) en un medio semisdlido, se retarda la difusién del oxigeno dando todos los grados de aerobiosis en alguna zona del tubo. Cualquier medio bisico es conveniente en tanto contenga una concentracién del 0,1 % de nitrato de potasio (KNO;)," favorezca el crecimiento," y ofrezca las condiciones anaerdbicas suficientes necesarias para que sea activada la enzima nitratasa sensible al oxigeno. Junto con los tubos inoculados se incubard y Se hard la prueba de un tubo de control no inoculado, y antes de interpretar los resultados se haran comparaciones.* V. REACTIVOS EMPLEADOS A) Reactive A: dos elecciones.' ® 1. q@naftilamina, 0,5 %. 2. Dimetil-a-naftilamina, 0,6 % a) Ingredientes. 1, a-naftilamina 5g (0 dimetil-a-naftilamina) 6 g 2. Acido acético (8 N), 30 % 1000 mi b) Método de preparacién. 1. Disolver cualquiera de ambas sustancias en menos de 1000 mi de acido acético 5 N, por medio de un suave calentamiento. a) Acido acético 30 ml b) Agua destilada, csp. 1000 ml 2. Pasar la solucién aun frasco volumétrico de 1 litro y agregar Acido acético 5 N cs.p. 1000 ml 3. Filtrar la solucién con un al- godén absorbente. 4. Guardar en frasco de vidrio de color caramelo, «apado.! 5. Rotular correctamente. B) Reactivo B: Acido sulfanilico, 0,8 %." * Ingredientes. a) Acido sulfanilico (écido paraaminobenceno- sulfénico) 8¢ b) Acido acético (5 N), 30 % 1000 ml 2. Método de preparacion. a) Disolver el acido sulfanifico en menos de 1000 ml de acido acético BN. b) Traspasar la solucién a un frasco volumétrico de un litro y agregar acido acético 5 N c.s.p. 1000 ml. ©) Guardar en un frasco de vidrio de color caramelo, tapado." d) Rotular correctamente. C) Método de utilizaci6n. Fase 1. a) Agregar directamente a un cultivo de nitrato incubado: 1. Reactivo A: I ml, 2. Reactivo B: | ml. b) Un resultado positive (color rojo) dentro de los 80 seg * indica una prueba completa; desechar el tubo. ©) Si es negative (no aparece color) continuar con la fase 2. 2. Fase2: método de reduccién del cine. a) Agregar directamente al tubo que contiene los reactivos A y B, una pizca (aproximadamente 20 mg) de polvo de cine (Zn). * b) El polvo de cine debe estar exento de nitratos 0 nitritos.* ©) Observar la interpretacién-final. El * color se produce en el término de 30 seg D) Control de calidad. Ambos reactivas A y B, deben ser controlados con cultivos positives y negativos conocidos antes de su uso general. SonReaccién de la fase 1" NH, aS 1+ + HNO, + SOsH NH, icido nitroso eenaftilamina {incoloro) Acido sulfanttico (incoloro) Reaccién de Ia fase 2% SO.H Ni psulfobenceno-aino- ecnaftilamina (Compuesto diazoivo coloreado) Acido acético Reducci6n del nitrato 145 N- CO +2 10 SO NH, prsulfobencenoazo- e-naftilamina (rojo) te reduce : eRe Tae CuLNHNHL-OSO4H Avithidracina (compuesto coloreado) Quimica de ta accién de tos reactivns buenos controles la Escherichia cali y el Acinetobacter calcoaceticus porque se obtienen ficilmente y su conservacion en forma de cultivos madre no ofrece inconvenientes. E. coli: reduce los nitratos (+). Acinetobacter caleonceticus (antigua clasi cacion Mima y Herellea): no reduce los nitratos (—)2 E) Conservacién: Guardarambos reactivosen el refrigerador (4°C) mientras nose los usa. Por lo’ general estos reactivos se mantienen estables clurante por lo menos 3 meses.' Sin embargo, peridicamente se hara un control de calidad, desechin- dolos si dan una reaccién negativa 0 débil con un organismo positivo conocido. F) Quiinica deta secion de bos reactirese La n del nitrato (NOs7) en nitrite >) esti indicada por la aparicién de color cuando el nitrito reacciona con los dos reactivos: jicido sulfanilico y a-nat- tilamina (0 dimeti-a-naftilamina). La re- accién de color resultante se debe a la formacién de un compuesto diazoico "™ p-sulfobenceno-azo-e-naftilamina.! El enlace del grupo azo —N=N— da como resultado un compuesto coloreado "por medio de una reaccién nitrosa.? El colorante diazoico se forma por acoplamiento a wav de un enlace azo de una amina aromitica con un compuesto de tipo fendlico, por lo general ena posicion para de un grupo oxhidrilo(OH) © amino (NH,)." ™ En este caso el acoplamiento se produce en la posicién para de un grupo amino. La reduccién de la sal diazoica por el agente reductor polvo de cine, en presencia del dicido acético, produce un compuesto coloreado. la arilhidracina.® El metodo del cido sulfanilico-a-natiil- amina desarrollado por Conn! muestra a menudo un debilitamiento o desaparicion del color en una reaccién positiva.” La decoloracién se manifiesta con un color amarillo pardusco.” Wallace y Neave " hall ron que esta inestabilidad del color tenia correlacion con la produccion de acido sulfhidrico (SH). lo que determinaron por medio del método de la tira de acetato de plomo, que es muy sensible. Wallace v Neave ™ afirman que el desarrollo maximo del color esti determinado en aquellos organismos capaces de reducir el nitrato y al mismo tiempo producir SH, debido prob: blemente ala destruccién de parte de la molécula de? acide nitroso (HNO). Sin embargo, la produccion de SH2 no es lacausa directa'de la decoloracién."* La produceisn de iicido sulfhidrico es eliminada util peptona libre de cisteina euando se prepara el medio." La cisteina contiene enlaces —SH. Hfuro) y sti remocién del medio elimina ka formacién de SH, aando, NH,—CHCOOH CHSH ist Wallace y Neave ™ observaron asimismo que la decoloracién se procuce mis rapids.146 Pruebas bioquimicas para la identificaci6n de bacterias mente ei: un organismo fuertemente nitrato positive cuando una sola gota de cada Teactivo dio una reaccién positiva. Aumen- tando la cantidad de ambos reactivos el color se mantenia estable. Cuando se forma SH: se produce un aumento en la concentracién de nitritos (NO,") lo que causa la destruccién completa de la reaccién de color." Este exceso de acido nitroso es directamente responsable de la destruccién del color debido a su accién sobre el grupo paraamino de la sal diazoica, lo que provoca el desdoblamiento en un derivado hidroxiazo."” En vista de los problemas que pueden producirse, Wallace y Neave ™ recomiendan sustituir la @-naftilamina estandar por la lisrenl-a-cnalilamnins eft it eartioa, Ue eo~ plamiento para el desarrollo del color. La dimetil-a-naftilamina no se decolora, ni es destruida en presencia de una mayor concen- tracién de nitritos (NO."), ya que esté protegido el grupo amino." Sin embargo, con una mayor concentracién de NOs” este compuesto coloreado puede precipitarse, aunque una reaccién positiva dara lo mismo un color ro,” La baja concentracign de NOs hace que el desarrollo del color se produzca con un ritmo més lento." Tanto la a-naftilamina como la dimetil-a- naftilamina son sensibles a una parte del nitrito nitrdgeno en 100 millones de partes de solucion.! VI. RESULTADOS Los fotografias en colores de los resultados pueden verse en lo Figura 21-1 (Apéndice 1). VIL. INTERPRETACION * el 1. Prueba positiva. a) Color rosado a rojo intenso. b) Nitrato (NO,-) reducido a nitrito (NO2>) por el organismo. ©) Prueba completa. 2. Prueba negativa a) No se ha desarrollado color. b) Seguir con la Fase 2. B) Fase 2: prueba de la reduccién del cine. 1. Prueba positiva a) No se desarrolla color. b) Ausencia de nitrito (NOs-) en el medio. ©) El organismo redujo el nitrato (NO,") en nitrito (NO,-) y luego redujo nuevamente el nitrito. 2. Prueba negativa. a) Color rosado a rojo intenso. b) Nitrato presente; no ha sido reducido por el organismo, ©) Elcine redujo el nitrato (NO,-) en nitrito (NO» >). VIII, PRUEBA RAPIDA: PRUEBA DE LA TIRA IMPREGNADA CON REACTIVO (PATHOTEC) A) Fabricante: General Diagnostic Division, Warner-Lambert Company. B) Método: seguir las indicaciones del fabricante. C) Resultados después de 2 h de incubacion (excepcidn, Staphylococcus epidermidis; véa- se VIII, D, 3, b, [2], mas adelante). D) Correlacién con los tests estandar. 1. Elevada; se estudiaron 506 aislados."” 2. Falsos positivos."” a) 18%. b) Una cepa Gaffioa. 3. Falsos negativos.” a) 45%. b) No hay correlacién, sobre todo con el S. epidermidis 1, Prueba repetida de los negativos 2. Aumento de la incubacién a th. 3. La mayorfa viraron a positivos. IX. PRECAUCIONES A) Cuando se realiza la prueba de reduccién del nitrato _utilizando a-naftilamina, el color producido en una reaccién positiva puede desvanecerse rapidamente." In- terpretar los resultados inmediatamente,B) ©) D) sobre todo cuando se efectian varias determinaciones. Eliminar la decoloracion 0 destruccién del desarrollo del color por los organismos que producen dcido sulfhidrico (SH) utilizando un medio de peptona que no contenga azufre. Un organismo reductor del nitrato fuertemente positivo puede mostrar un preci pitado castario inmediatamente después del agregado de los reactivos. Se hara la prueba de un tubo de nitrato no inoculado, con los reactivos, para determinar si el medio esta exento de nitritos."® Algunos organismos son capaces de reducir el nitrato en nitrite, aunque destruyen el nitrito con la misma rapidez con que se formé, dando un resultado falsa- F) G) H) 4, Bachmann, B., and Weaver, RH. (1951) Rapid microtechnics for identification of cultures. V. Reduction of nitrates to nitrites, Am. J. Clin, Pathol., 2:, 195 2. Breed, R. 8., Murray, E.G. D., and Smith, N. R. Bergey's Manual of Deter ‘minative Bacteriology, 7th ed., Bal more: The Williams & Wilkins Com- pany, 1957, pp. 336 and 466-467. 4, Burrows, W., and Moulder, J. W. Text book of Microbiology, Vol. I, 19th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Com- pany, 1968, pp. 15 and 141, 4, Conn, H. J., Harding, H. A., Kligler, I J., Frost, W. D., Prucha M. J., and ‘Atkins, K. N. (1918) Methods for pure culture study. Preliminary report of the committee on the chart for identifica tion ef bacterial species. J. Bacteriol.,3, 118. 5. Conn, H. J. (1936) On the detection of nitrate reduction. J. Bacteriol., 21, 225. 6. Cowans, 8. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 33, 12, 148, and 161 7. Daubner, I, (1962) Die reduktion der nitrate durch bakterien der familie Enter- obacteriaceas. Arch. Hyg. Berlin, 146, Mt. 8. Difeo Manual, 9th ed., Detroit: Difco Laboratories, 1953, pp. 184-185. Reduccién del nitrato 147 todos se produjo la reduccién de nitratos. Una prueba positiva de reduccién del cine *¥ indica que el nitrato fue reducido en nitrito y vuelto a reducir. No ha muestras de acumulacién de nitrito. Sin embargo, el nitrito, en el proceso de reduccidn, pudo haber sido asimilado por la célula bacteriana o convertido directamente en nitrégeno celular, pero no reducido.> #4 ZoBell ® asegura que algunos organismos pueden causar la destruccién del KNOs al 0,01 %, que se encuentra en el medio después de un periodo de incubacién de 2 dias Conn afirma que en algunos casos el nitrato puede estar sélo’ parcialmente reducido, 0 que un organismo puede perder temporariamente su capacidad de reducir el nitrato. mente negative?" Esta reduccién del 1) En todos los cultives que no contienen nitrito es evidente en muy pocasbacterias, _nitritos, cuando se utilizan los reactivos sobre todo en algunas Salmonella y espe- —_a-naftilamina (0 dimetil-a-naftilamina) y cies de Psendomonas y en la Brucella suis?" cido sulfanilico, agregar polvo de cinc ZoBell y Meyer hicieron la prueba de directamente al tubo antes de hacer la 400 cultivos de Brucetla y afirman que en _interpretacién final. BIBLIOGRAFIA 9. Gunsalus, I. C., and Stanier, R. ¥. The Bacteria, Vol. It, New York: Academic Press, 1961, pp. 375, 416-417, and 452- 453. 10. Hitchens, A. P. (1921) Advantages of culture mediums containing small per- centages of agar. J. Infect. Dis., 29, 390. 11, Mahler, H. R., and Cordes, E. H. Biolog- ical Chemistry, New York: Harper and Row, 1966, pp. 655-656. 12, Noller, C. R. Chemistry of Organic Com- pounds, 3rd ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1965, pp. 544-545 and 743. 18, Nussenbaum, 8. Organic Chemistry, SBoaton: Allyn and Bacon, Inc., 1963, pp. 444445. 14, Pelezar, M. J., and Reid. R. D. Microbi- ‘ology, 2nd ed., New York: MeGraw-Hill Book Company, 1986, p. 567. 15, Smith, D. T., Conant, N. F., and Wile lett, H. P. Zinsser Microbiology, 14th wed, New York: Appleton-Century- Crofts, 1968, pp. 116-117. 16. Stanier, R. ¥., Doudoroff, M., and Adel- berg, E. A. The Microbial World, 2nd ed., Englewood Cliffs, N.J.: Prentice Hall, Ine., 1963, pp. 271-272. 17. Yu, P., Birk, R. 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La susceptibilidad a la optoquina pone a prueba la fragilidad de Ja membrana celular bacte- rianat I. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulo 32.) Se usa especiticamente el disco de optoquina para diferenciar entre el Streptococcus pemumoniae (sensible) y otras especies de a Streptococcus (resistentes). IIL BASES BIOQUIMICAS La optoquina es un compuesto quimico, clorhidrato de etilhidrocupreinat La etilhidrocupreina, que forma la base del disco de optoquina," es insoluble en agua?" pero el clorhidrato de etilhidrocupreina és completamente soluble en agua.® El clorhidrato de etilhidrocupreina (optoquina) es un derivado del alcaloide hidroquinina," que se prepara por hidrogenacidn, cdemetilaci6n y etilacién de la quinina."* Clorhidrato de etihidrocupreina (optoquina) Se impregnan discos de papel de filtro de 6 mm con 0.02 ml aproximadamente de dilucion acuosa 1:4000 de la sustancia quimica,® * y se deja secar a 37° C.5 La concen- optima del clorhidrato de etilhidrocupreina para el S. pneumoniae es una dilucion acuosa de 1:4000.4 La optoquina tiene una sensibilidad espe. cifica para el S. pnewmoniae' y es bacte- riostatica en concentracién de 1:500.000 a 1:100.000."* Las otras especies a-Streptococcus requieren una concentracién de 1:5000 0 mayor para inhibir el crecimiento." IV. METODO A) Inoculacién del organismo en estudio. 1. Colonia pura. 2. Medio: placa de agar sangre al 5 %. a) Recomendada; sangre de carnero. b) Alternativa: sangre humana de fecha vencida (banco de sangre). Debe utilizarse una placa’ de agar sangre para la prueba de la optoquina, dado que todas las especies de Streptococcus son organismos rebeldes y requieren enriquecimiento para su desarrollo. ~ Método de inoculacién para obtener un crecimiento maximo; dos opciones. a) Subcultivo en caldo con tripticasa de soja; colonia aislada. 1. Incubacién.150 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterios a) 35°C. b) 18a 24h. 2. Aplicacién del organismo. a) Por medio de hisopo estéril b) Pasar el hisopo por toda la placa de agar sangre, en los cuatro sentidos. b) Inoculacién directa. 1. Colonia aislada. 2 Estriar toda la placa de agar sangre con el asa de inoculacion; en los cuatro sentidos. 3. Método de la estria en cuatro direcciones: Si se desea hacer la prueba de sensibilidad a la optoquina de varios organismos puede dividirse una placa de agar sangre en cuatro cuadrantes (placa fraccionada) y efectuar cuatro determinaciones por separado. Marcar los cuatro cuadrantes sobre el fondo de la mitad de la capsula que contiene el medio de cultivo, Antes de la inoculacién, rotular convenientemente cada sector para evitar confusiones al interpretar los resultados ‘No debe intentarse usar mas de cuatro discos r placa. El empleo de la placa fraccionada (Fig. 22-0) exige el método de inoculacin por estrias para obtener el miximo crecimiento. Fig. 22,0. Placa fraccionada B) Disco de optoquina (5 1g). 1. Existen productos en el comercio. a) Difco: Discos de optoquina.? b) BBL: Discos Taxo P.? 2. Conservacion. a) En refrigerador (4-10° ©). b) En frascos con tapa a rosca. Bowers y Jeffries ® afirman que los discos de optoquina son estables por espacio de 9 meses si se Jos conserva en refrigerador (4° ©) a la temperatura del ambiente (25°C). Sin embargo, se reco mienda mantenerlos refrigerados permanentemente mientras no se san. Periddicamente se hara un control de calidad, retirandolos del uso si muestran una reaccién negativa o débil con un organismo S. pneumoniae de sensibilidad conocida. Si los discos de preparacién comercial no reaccionan en forma adecuada en el control de calidad, debe reponerse todo el lote. 3. Aplicacién de los discos. a) Asépticamente, con una pinza pasada por la llama, retirar un disco de optoquina y aplicarlo al centro de una placa de agar sangre estriada, oa un sector de la placa fraccionada. 1. No colocarlo préximo al borde de la placa. 2. Aplicar una suave presién al disco para que se adhiera a la superticie de la placa, aunque no debe hundirse en el medio. b) Después de su aplicacion, puede colocarse sobre el disco una gota de agua destilada estéril. Bowen y colt demostraron que la zona de inhibicion de un organismo sensible aumentaba de 2 a 3 mm de diimetro cuando se empleaban discos humedecidos en compara- cién con los deshidratados. La humedad hace que la optoquina se difunda mas rapidamente en el medio. © Mantener tapado el frasco que contiene los discos, mientras no se use. CC) Incubacién. 1, Placa invertida, 2 Frasco bujia; CO, aumentando en un 2a3%.A) B) A) B) 3. 35°C. 4. 18a 24h, Vv. RESULTADOS Tas fotografias en colores de los resultados pueden verse en las Figuras 22-1 y 22-2 (Apéndice 1) VI. INTERPRETACION Sensible (8): 8. pneumoniae. 1. Hay inhibicién del crecimiento alrededor del disco, 2. Una zona clara alrededor del disco. Resistentes (R): otras especies de a-Strep- tococcus. 1. El crecimiento no es inhibido alrededor del disco 2. Grecimiento alrededor del disco. EI tamaiio de la zona de inhibicién que muestra el 8. pneumoniae varia entre 15 y 30 mm, con limites bien mareados.® # VII. PRECAUCIONES Para la interpretacion de la prueba del disco de optoquina deben utilizarse los términos sensible o resistente. Se aceptan las abreviaturas S y R para indicar los resultados, siempre que el laboratorio haya hecho las aclaraciones previas. No usar la clasificacion de positivo (+) 0 negativo (—) para los resultados con la optoquina, ya que un resultado positivo no es lo. suficientemente explicativo; podria significar inhibicion del crecimiento o simplemente que el organismo se desarrolld en el agar sangre pero no actué con la optoquina. La prueba de la optoquina sélo se emplea ara diferenciar entre el S. pneumoniae o- emolitico y otras especies de a-Streptoco- ccus. Sin embargo, cuando haya dudas en cuanto al modelo hemolitico que presenta una posible especie de Streptococcus debe hacerse la prueba de optoquina. Suele ser dificil diferenciar por su morfologia del Gramy su morfologiadelacolonialasespe- cles de a-StreptococcusyelS. pneumoniae; por lo tanto requieren otras pruebas para su. E) Disco de optoquina 151 diferenciacién (pruebas de la optoquina y/o de solubilidad en bilis). Sin embargo, €lS. pneumoniae y todas las dems especies de Streptococcus, independientemente de su modelo hemolitico, son catalasa negativas y'esta determinacion deberd hacerse antes de efectuar la prueba de la optoquina. Bowen y colt afirman que no hay correlacién entre el tamario de las zonas de inhibicién que muestra el 5. pneumoniae y sus tipos serologicos. Cruickshank * sostiene que, a veces, algunas pocas colonias de S. pneumoniae optoquina resistentes pueden verse dispersas en una amplia zona de inhibicion. Para asegurarse un cultivo puro, hacer un subcultivo de las colonias resistentes en una placa de agar sangre y determinar lo siguiente: reaccién’ de la catalasa, morfologia con coloracién de Gram y morfologia de colonia. Repetir entonces la prueba de la optoquina antes de hacer una interpretacién final, Cowan y Steel” indican que, a veces, una especie de a-Streptococcus puede mostrar una zona de inhibicién muy pequetia (de 1a 2mm de diémetro). El $. pneumoniae muestra una zona de inhibicién de 5 mm per lo menos o mas de didmetro.” Bowers y Jeffries ® aseguran que si la concentracién del clorhidrato de etilhidrocupreina es de menos de 1:8000 existe 1a posibilidad de que el microbi logo inexperto no observe las pequefias zonas de inhibicién. Para los fines diag- nésticos de rutina se emplea una concen- tracién de 1:4000, la que dara amplias zonas de inhibicién con el S. pmeumoniae para diferenciarlo de las cepas de a-Strep- fococcus insolubles en bilis que pueden presentar una inhibicién muy reducida.* Ragsdale y Sanford ® demostraron que el S. pneumoniae puede mostrar una reduccién en el tamatio de la zona de inhibici6n de la optoquina cuando se incuban las placas en CO, al 5 %. Estos estudios mostraron un didmetro medio de la-zona de inhibicin de 21,9 mm cuando las placas eran incubadas en el aire del ambiente; en CO, 6 %) el diametro medio era de 16,3 mm. Sin embargo, los estreptococos. son organismos rebeldes y su crecimiento inicial (metabolismo) resulta. muy. favorecido por la incubacién en 2a 3 % de CO2 por lo menos. Puede utilizarse una incubadora de CO; o un frasco bujia, por medio152 Pruebas bioquimicas para Ia identificacién de bacterias del cual parte del nitrégeno es reemplazado por COs, Los estudios de Austrian y Collins! mostraron que el 8 % de los organismos S. pneumoniae requieren un aumento de Ja tension del CO, que proporciona la atmésfera, para el aislamiento inicial en un medio en placa. Martin y Niven y Wright" muestran que la entrada del CO, en el ciclo metabélico para facilitar el crecimiento del S. pneumoniae se produce por la condensacién de un compuesto monocarbonado con un compuesto tricarbonado, formando acido oxalacético que a su vez es aminado, produciendo Acido aspartico. Cuando no existe acido oxalacético los neumococos precisan un aumento del CO, para la sintesis del acido Artico.” Los neumococos necesitan cido oleico, o un aumento de la tension del CO, para su crecimiento en un medio hidrolizado de caseina." Los estudios realizados por Martin y Niven demostraron que los estreptococos cultivados en un medio hidrolizado de caseina, que carecian del oleato pero contenian acido aspartico, necesitaban del CO, para su crecimiento. El aumento del CO, era necesario para la sintesis del aspartato."” No obstante, los mismos estudios permi- tieron demostrar que cuando se encon traban tanto el oleato como el cido aspartico, no se producia la sintesis del aspartato, dado que la cantidad de éste en el medio era suficiente para el cre- 1, Austrian, R., and Collins, P. (1966) Im- portance of carbon dioxide in the isolation of pneumococci. J. Bacteriol., 92, 7 1281, cimiento. El mecanismo no esti bien definido; con todo, ha quedado demostrado que es necesario el Acido oleico (oleato) 0 un aumento del CO, para el desarrollo de los estreptococos."* EI crecimiento escaso de un aislamiento hace dificil la exacta interpretacién de los resultados. El criterio minimo para la interpretaci6n de sensible a la optoquina para el S. pneumoniae es generalmente luna zona de inhibicién de 15 a 16 mm o mas (medida desde el borde del disco). Si la zona de inhibicién es de menos de 15 mm, es prudente efectuar también como confirmacién una prueba de solubilidad en bilis. Ragsdale y Sanford " recomiendan el aislamiento inicial de las especies de Strepto- coccus con el 5 % de COs, salvo la incubacién para la prueba de susceptibilidad a la optoquina en una incubadora con el aire ambiente sin aumentar la tension de CO;. Si no se produce cre miento en el agar a la temperatura del ambiente, se hara una prueba de solubilidad en bilis.* Sin embargo, cuando se efectiia la incubacién con aumento del COz, Ragsdale y Sanford * recomiendan la determinacién de los tamafis estandar de las zonas. Branson * recomienda preparar las pruebas de susceptibilidad a la optoquina en agar sangre con azida, porque ello permite definir con mayor claridad las zonas de inhibicién. BIBLIOGRAFIA ology. Springfield, 1: Charles C Thomas, Publisher, 1972, p. 38. . Cowan, S. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- 2. Bailey, R. W., and Seott, E. G. Diagnos- tic Microbiology, Ind. ed., St. Louis: C.V. Mosby Company, 1966, p. 119. 3. BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures. Sth ed.,. Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi sion of Becton, Dickinson and Com- pany, 1968, p. 173. 4. Bowen, M. K., Thiele, L. C., Stearman, B.D., and Schaub, I. G. (1957) The optochin densitivity test: a reliable method for identification of pneumococci. J. Lab. Clin. Med., 49, 641, 5. Bowers, E. F., and Jefferies, L. R. (1955) Optochin in the identification of Str. pneumoniae. J, Clin, Pathol.,8, 58. 6. Branson, D. 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Brucella neotomae (=) y Brucella ovis (~) de otras especies de Brucella (+). 2. Pseudomonas maltophilia (-) de otras especies de Pseudomonas (por lo general +). F) Ayudar a la identificacion de: 1. Aeromonas (+) 2) Neisseria (+) 3. Pseudomonas (por lo general +) Alealigenes +) Branhamella (+) (Neisseria catarrhalis) Moraxella (+) Enterobacteriaceae (—) Yersinia (=) SIT oe III. BASES BIOQUIMICAS La prueba de la oxidasa esta basada en la produccién bacteriana de una enzima oxidasa. Esta reacci6n de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacién del citocromo redu- cdo por cl oxigeno molecular, el que a su vez acttia como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema dle trasferencia de electrones.** ‘Todas las bacterias aerébicas obtienen su energia por la respiracion, proceso responsable de la oxidacion de diversos sustratos. El oxigeno molecular oxida un sustrato con la intervencién del sistema de trasporte de electrories.'* El oxigeno es el aceptor de hidrégeno final, produciendo a partir del hidrégeno agua 0 perdxido de hidrégeno, segtin la especie bacteriana y su sistema enzimatico.”” EI sistema citocromo s6lo se encuentra por lo general en.los organismos aerébicos,” lo que los hace capaces de utilizar el oxigeno como un aceptor de hidrégeno final para reducir el oxigeno molecular en perdxido de hidrégeno, el tiltimo enlace de la cadena de la respiracién aerébica.* 7 Steel ™ demostro que todos los organismos oxidasa positivos jue estudid eran aerdbicos, 0 anaerbicos facultativos, excepto el Vibrio fetus, que tieneun requerimiento de oxigeno mucroaero- filico, Gordon y McLeod" aseguran que la reaccién oxidasa positiva esti limitada a aquellos organismos capaces de desarrollarse en presencia de oxigeno y producir, al mismo tiempo, la enzima catalasa, La enaima catalasa degrada el peroxido de hidrogeno,’ dado que str acumulacidn es toxica 2H.0, —Helts_ 5 9 H,0 + 0, Peroxido de hidrogeno Los organismos obligadamente anaerdbicos carecen de actividad 6xidasa porque no pueden vivir en presencia del oxigeno atmos- lérico y no poseen el sistema citocromooxidasa. 1%" Deibel_y Evans ® mostraron también esta ausencia de actividad enzimética en el Lactobacillus. Poco se sabe acerca de la funcién exacta de los diversos citocromos bacterianos, ya que el sistema citocromooxidasa varia entre las especies bacterianas.”’ Sin embargo, es sabido que su papel en la respiracién aerdbica es importante, En otros tiempos se crefa que existian dos enzimas oxidasas, separadas y diferentes, que eran responsables de una reaccién oxidasa positiva; la produccién de estas enzimas diferia en los diversos géneros. Se creia que las especies de Neisseria producian indofenol oxidasa, mientras que la Gtocromo-oxidasa era producida por especies de Pseudomonas. Los estudios espectrofotométricos han demostrado que la citocromo-oxidasa de War- burg y la indofenol-oxidasa son la misma.* Gaby y Hadley ® afirman que la enzima citocromo-oxidasa ha recibido otros nombres: atmungsferment, citocromooxidasa ¢, citocromooxidasa ag, y citocromooxidasa a. Castor y Chance * mostraron por medio de métodos fotoquimicos que existen cuatro pigmentos bacterianos que actian como enzimas respi- ratorias citocromooxidasa terminales: citocromo ay, citocromo as, ctocromo.a; y un pigmento que liga el monoxido de carbono denominado citocromo 0. La variedad de Gitocromos son pigmentos respiratorios que contienen compuestos de ferroporfirinas.” La distribuci6n de los diferentes citocromos varia en cada especie bacteriana; algunos organismos poseen solamente una oxidasa, en tanto que otres pueden producir dos 0 tres3* ‘Todas las especies de Pseudomonas y Neisseria producen una enzima oxidasa que, cuando se encuentra en presencia del oxigeno atmos- férico, citocromo ¢, y un reactive oxidasa, oxidan al réfictivo para formar un compuesto Pruebo de Ia oxidaso 155 coloreado, indofenol.* ™ La mezcla del citocromo a y el citocromo a se denomina citocromo-c-oxidasa.™" Un resultado oxidasa positivo est formado por una serie de reacciones en la cual un componente autooxidable del sistema citocromo es el catalizador final.*” Pueden sustituirse los aceptores clectrénicos naturales por sustratos arbificiales, en cualquier sitio de la cadena de trasporte de electrones, donde acttian como reductantes del sistema citocromo -c-citocromooxidasa." 2 Los diversos colorantes para la prueba de la oxidasa son aceptores de electrones artificiales; el reactivo parafenilendiamina y el indofenol son a la vez aceptores y dadores de clectrones.* Estos sustratos artificiales son incoloros 0 colo- reados segtin el estado en que se encuen- tren; * la reaccién oxidasa final muestra un producto coloreado. IV. REACTIVOS EMPLEADOS A) Reactivos para la oxidasa, varias opciones. 1. Reactive de Kovacs: *! Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 1 %. 2. Reactivo de Gordon y McLeod: ® ® Diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina (denominado también N-dimetil- ‘p-fenilendiamina 0 monoclorhidrato de-p-aminodimetilanilina). 3. Reactivo de Nadi: 2 Una mezcla Por partes iguales de a-nafiol al t % en alcohol etilico (etanol) de 95° y aminodimetilanilina al 1% 4, Reactivo de Carpenter, Suhrland y Morrison: 7 Oxalato de p-aminodimetilanilina al 1% Discos impregnados con oxidasa a) Difco: Discos Bacto-Differentia- tign, de oxidasa.” b) BBL: Discos Taxo N.* o B) Método de preparacion de los reactivos. 1. Disolver 1 g del reactivo deseado en menos de 100 mi de agua destilada {con excepcién del -naftol). a) anaftol (1-naftol) lg b) Alcohol etilico absoluto 100 ml 2. Calentar suavemente hasta su disohu- Gon. 3. Pasar a un frasco volumétrico_ y agregar un diluyente adecuado (agua © alcohol etilico) ¢s.p. 100 ml156 Pruebas bioquimicas para la idemtficacién de bacterias 4. Dejar descansar 15 min antes de su empleo.' Guardar en frasco de vidrio de color caramelo, tapado. Evitar la innecesaria exposicidn a la luz" 6. Rotular correctamente. El reactivo de Kovacs, solucién acuosa al 1% de tetrametil-p-fenilendiamina, es menos t6xico y sumamente sensible en comparacion con el compuesto dimetilo, pero es mas costoso.4 + + #4 32 Este reactivo imparte un color lavanda a las colonias oxidasa positivas que gradualmente vira a un pirpura-ne- gruzco intenso, pero también puede impartir Color al medio que las rodea." El reactive de Gordon y McLeod." solucién acuosa al | a 1,5 % de dimetil-p-fenilendiamina, ¢s mas estable que el compuesto tetrametilo™ Todos los compuestos p-fenilen son relativamente inestables.® EI reactive oxalato de p-aminodimetilanilina tiene una ventaja sobre los reactivos de Kovacs o de Gordon y McLeod, porque es sumamente estable, tanto en forma de polvo como en solucién; la solucién acuosa se mantiene estable por lo menos 6 meses." Fl p-aminodimetilanilina es un poco menos soluble que los clorhidratos, pero un ligero calentamiento permite su disolucién, Otra ventaja es que la sal oxalato no forma precipitado negro cuando se baiian con el Teactivo las colonias que se desarrollan en agar chocolatado, como ocurre a veces con los clorhidratos."' El empleo de discos impregnados con oxidasa, que se encuentran en el comercio, evita la necesidad de preparar reactivos frescos. Ninguno de estos reactivos inter reaccion de coloracién de Gram. C) Método de utilizacién. mina re la 1. Solucién de reactivo. a) Método en placa directa 1, Agregar directamente 2 0 3 gotas de reactive a algunas Colonias sospechasas que se desarrollan en un medio en placa, por ejemplo, agar sangre 0 agar chocolatado. 2. No imundar toda la placa con el reactive 3. No invertir la placa 4. Observar los cambios de color b) a) b) a) Reactivo de Kovacs: reac- Gién de color dentro de los 10 a 15 seg.» b) Reactive de Gordon y Mc Leod: reaccién de color dentro de los 10 a 30 reeelian S Método indirecto de Kovacs sobre papel.2* 1. Colocar un trozo de 6 cm* de papel de filtro de Whatman Ne Len una capsula de Petri 2. Agregar de 2 a 3 gotas de reactivo de Kovacs en el centro del papel Hacer un extendido con el asa de inoculacin de una colonia sospechosa, en el papel im- pregnado con reactivo siguiendo una linea de 3 a 6 cm de longituel 4, La reaccién de color positiva se produce a los 5 a 10 seg. 1s de oxida’ Método directo en placa. 1. Humedecer los discos impreg- nrados con agua destilada et nil 2. Colocar el disco sobre algunas colonias sospechosas de un mectio en placa, por ejemplo, agar sangre 0 agar chocolatado. 3. No invertir la placa 4. Reponer la placa en una incubadora a 35° C durante 20 a 30 min. La prueba puede ser \cubada a la temperatura del ambiente (25° C) 0 en relrige- rador (4-10° G), pero la reac- ci6n es mus lenta. 5. Observar los cambios de color que se produzcan. Método indirecto.* 1. Dos variantes. a) Humedecer el disco. con agua destilada estérit, colocar en una capsule de Petri V agregar después la cantidad’ reeogida con un asa de-una colonia sospechosa cultivada en un medio s6- lo,1D) Control de calidad: FE) b) Humedecer el disco con un. cultivo en caldo del orga- hismo sospechoso. 2. Observar si se producen cambios de color: la reaccion post tiva debe ocurrir a los. pocos segundos. Cualquiera de los reactives 0 discos empleados debe ser controlado con cultives positives y negativos conocidos antes de su empleo general. La Escherichia cali, cualquier especie de Neisseria 0 de Pseudomonas aeruginosa constituyen un buen control, dado que se obtienen ficilmente y no ofrecen problemas para su conservacién en cultivos madre: E.coli, reaccion oxidasa negativa: especies de Neisseria y P. aeruginosa, veaccion oidasa positiva. Conservacién: Guardar todos los reactivos y discos en un refrigerador (4° C) mietitras no se usen; calentar los reactivos antes de su empleo." Barry y Bernshon ? recomiendan congelar los reactives en voltimenes de 1 at 2 ml para reducir La autooxidacién y prolongar su actividad. Todos los reactivos deben ser recién preparados antes de su empleo, puesto queen solucién se desactivan ripidamente. Si estin refrigerados pueden man- tenerse estables desde 5 dias a 2 semanas.” Los Laboratorios Difco |! ase- veran que el reactivo de oxalato de p- ninodimetilanilina es estable por lo menos durante 6 meses. Sin embargo, HC CH, NH. ecnafiol Diver fenleiin Prueba de la oxidaso 157 como la estabilidad de estos reactivos varia, es aconsejable efectuar todas. las semanas un control de caliclad, desechiin- dolos cuando muestren una reaccién débil o negativa con un organismo posi tivo conocido, La actividad oxidasa di minuye si los discos se han oscurecido por una prolongada conservacién2 Cuan- do los discos de preparacién comercial no reaccionan convenientemente en el con trol de calidad, se devolvera todo el lote al laboratorio productor, para su repo- sicion, F) Quimica de la accién reactiva: Los colorantes p-fenilendiaminas son aminas aro- maiticas primarias2* diaminoderivados det benceno."* ee O pfenilendiamina La citocromooxidasa, en presencia del oxigeno atmosférico, oxida el reactivo fenilendiamina oxidasa para formar un compues- to coloreado, el indotenol.*: * Si el reactivo oxidasa se prepara con a-naftol, se forma azul de indofenol; * sin embargo, el -naftol no es necesario para que tenga lugar la reaccion, El indofenol es w de la quinona en la cual © ambos grupos =O. colorante, un N-analogo N reemplaza a uno i ao Go Aaul de indofenol*158 Pruebas bioquimicas pora la identificacién de bacterias EI reactivo clorhidrato de fenilendiamina forma un grupo diclorimida (CIN=CaHi= NCD; el =NCI es reducido a —NH2, 0 hidrolizado en =O. V, RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en las Figuras 23-1, 23-2 y 23-3 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACION A) Colonias oxidasapositivas: la colonia toma un color rosado, después marrén y Finalmente negro. 1. Colonias rosadas. a) Bacterias viables. b) Periodo para el subcultivo. 2. Colonias negras: bacterias no viables. Cuando se emplea una mezcla de reactive dimetil-p-fenilendiamina-e-naftol, la reaccién oxidasa positiva esta indicada por un color azul! B) Colonias oxid: a negativas. 1. No se produce cambio de color en las colonias, 0 s6lo adquieren un color rosado pilido por el reactivo. 2. Puedg producirse una coloracién negra del medio civcundante Si se emplea cl reactivo de Kovacs, la reaccion oxidasa positiva esta indicada por un color negro purptireo que se desarrolla en el término de 10 seg; la reaccion positiva dentro de los 10 a 60 seg se considera un resultado retardado.* Stee! * asegura que el desarrollo tardio del color, pasado un periodo de 60 seg, indica una prueba oxidasa negativa VII. TIRAS IMPREGNADAS CON REACTIVO PARA LA PRUEBA DE LA OXIDASA A) Tiras para la prueba de la citocromooxidasa (PathoTec). 1 Fabricante: General Diagnostic Divi- sion, Warner-Lambert Company Resultados dentro de los 30_ seg. Principio: dimetil-p-fenilendiamina + a-naftol > azul de indofenol (color azul intenso). 4, Método: seguir las indicaciones del fabricante. Correlacién con las pruebas standard: 100 G2 2 30, o B) Método de Barry y Bernsohn? Preparacion de la tira. a) Papel de filtro de Whatman N° 1. 1. Cortar en tiras de 6 a 8 em de diametro, 2. Saturar con una solucién acuosa de oxalato de dimetil-p- fenilendiamina al 1%. b) Secar ripidamente. 1. Colgar en cuerdas 0 varillas de vidrio. 2. Evitar el contacto con ganchos © cualquier objeto de metal ©) Guardar en frascos con tapa a rosea que contengan una cantidad abundante de un desecante. 4) Conservar en refrigerador; estable hasta 6 meses. 2. Método. a) Extender una colonia pura sobre una tira seca. b) Puede hacerse la prueba simultinea de varias colonias en una misma tira. s Interpretacién. a) Resultados a los 10 seg. b) Positivo: color rojo. VIII. PRECAUCIONES A) La prucba de la oxidasa se usa como rutina para la identificacién del género Neisseria, No obstante, otros géneros: pueden mostrar también una reaccién oxidasa positiva. 1. Moraxella wrethratis (antigua Mima poly- morpha var. oxida).B) c) Alealigenes faecalis." ® Algunas especies de Pseudomonas.* Algunas especies de Haemophilus. Algunas especies de Bordetella. Algunas especies de Pasteurella.” Vibrio comma.* Especies de Aeromonas ‘Algunas especies de Brucella.” Algunas especies de Bacillus. Bees omsen Ellingworth y col." hallaron que el Haemophilus influenzae era oxidasa neg: tivo utilizando dimetil-p-fenilendiamina, pero posit se usaba el reactivo de Kovacs mas sensible, tetrametil-p-fenilendiamina. Castor y Chance * afirman que la Pseudomonas mattophilia da a menudo una reaccién oxidasa positiva retardada y que no todas las especies de Pseudomonas son ositivas. Recomiendan que no se emplee [ijreassondes WA oxides anne aes cién del género Pseudomonas. Para utilizar la prueba de la oxidasa en la identificacién del géncro Neisseria, debe realizarse una coloracién Gram en todas las colonias oxidasa positivas. Todas las especies de Neisseria son diplococos gram negativos en forma de grano de café mientras que otros organismos que puc- den mostrar una reaccidn oxidasa positiva son bacilos gramnegativos 0 cocobacilos gramnegativos. Sin embargo, la Moraxella urethralis puede tener una_morfologia Gram similar a la Neiseria. Por lo tanto, se deben utilizar pruebas de fermentacion de los hidratos de carbono para la identi- ficacién final de las especies de Neisseria No debe intentarse realizar una prueba de oxidasa de las colonias cultivadas en un medio que contenga glucosa, ya que su fermentacion inhibira la actividad de la enzima oxidasa, y dara posibles resultados falsamente negativos. Lautrop ® indica que pueden producirse resultados falsamente positives con. la Bordetella pertussis si se cultiva en medios que contengan una elevada concentracién de sangre. 1. Bailey, R, W., and Seott, E, G, Diagnos- tic Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 'Y. Mosby Company, 1966, pp. 329-330. 2. Barry, A. L., and Bernsohn, K. 1. (1969) Methods for storing oxidase test reagents. Appl. Microbiol., 17, 933. Prueba de la oxidesa 159 D) Se recomienda el empleo de asa o aguja de inoculacién de platino para retirar las colonias para la prueba de la oxidasa. En este sentido Steel * afirma que la presencia de un simple vestigio de hierro puede por sé solo catalizar la oxidacién del reactive fenilendiamina, dando una reac- Gon falsamente positiva Pueden producirse resultados falsamente un cultivo mixto contiene los dos géneros Pseudomonas y Neisseria Las especies de Pseudomonas producen ancia inhibidora que impide la produccién de oxidasa en las especies de Neisseria. Una prueba de oxidasa negativa puede dar una coloracién negra en el medio que rodea a las colonias, pero no en éstas. Este color no tiene importancia. Se puede producir un precipitado negro en el medio circundante en un agar chocolatado cuando se usa como reactivo un clorhidrato viejo." La. sal oxalato no forma este precipitado."* No rotular simplemente como reactivo de Kovacs el de diclorhidrato de tetrametil- p-fenilendiamina, sino reactivo de oxidasa de Kovacs, ya que existe también un reactivo de indol de Kovacs. Los reactivos de oxidasa se autooxidan pidamente y pierden su sensibilidad La autooxidacién es reducida agregando una solucién de acido ascérbico al 0,1 % directamente al reactivo® durante su preparacidn. Los reactivos se desecharan si se forma un precipitado.'' Evitar la innecesaria exposicidn a la luz, El reactivo de tetrametilo de Kovacs debe ser incoloro y se desechara cuando toma un color azul intenso.” La confiabilidad del reactivo de tetrametilo de Kovacs se limita al tiempo en qu puede producirse un resultado positivo (hasta 60. seg)."* No obstante, el reactivo dlimctilo ubile wneceshar entreil0' 30 min para que se produzca una reaccién positiva Los estudios espectrofotométricos han demostrado que la citocromooxidasa. y la indofenol-oxidasa son Ia misma enzima.”* * E) F) G) H) BIBLIOGRAFIA 3. BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, sth ed., Cockeysville. Maryland: Division of BioQuest, Divi sion of Becton, Dickinson and Com- pany, 1968, pp. 22 and 172-173 4, Blazevic, D. J., Schreckenberger, P. C.,160 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias 10 ML. 2 2B. Fre 16, M1 18. 18. 21 . Burrows, and Matsen, J. M. (1973) Evaluation of the PathoTee "Rapid I-D” system. Appl. Microbiol. 26, 886, ., and Moulder, J. W. 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Alcaligenes faecalis: no fermentan ni oxidan la glucosa (inertes). B) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros de las Micrococeaceae. 1. Especies cle Micrococcus: por lo genera oxidan la glucosa ; 2. Especies de Staphylococcus: fermentan la glucosa C) Ayudar a la identificacin de otros organismos, por ejemplo, Brucella (oxidante) D) La determinacion de la reaccién oxica- cién-fermentaci6n (OF), env el laboratorio de diagnéstico, ayuda a la identificacion de bacterias aerdbicas.' Ill. BASES BIOQUIMICAS La utilizacion que una bacteria hace de los hidratos de carbono tiene lugar por alguno de dos procesos, de fermentacion 0 de oxidacién. Algunas bacterias son capaces de metabolizar un hidrato de carbono (manites- tada_por la produccién de acide) solo en condiciones aerdbicas, mientras que otras roducen acido tanto aerdbica como anaerd- tan te." Las bacterias que pueden crecer, metabolizarse y reproducrise en condiciones aerdbicas (presencia de oxigeno atmostérico) © anaerdbicas (ausencia de oxigeno atmosté- rico) se denominan anaerobios facultativos. La mayoria de las bacterias que tienen importancia en clinica son anaerobios facul- tatiyo: 1 fermentacion es un proceso anaerdbico y los fermentadores bacterianos de un hidrato de carbono son por lo general anaerobios facultativos.” Por medio del proceso. de fermentacién, un hidrato de carbono es metabolizado (0 fermentado) y desdoblado en dos moléculas triosa de carbono "que a su vez son conyertidas en cierto mtimero. de compuestos con 1, 2, 3.0 4 carbonos;? el intermediario clave es el acido pirtivico. Los productos finales de la fermentacién varian en cada especie bacteriana, segiin el sistema enzimatico de la especie y las condiciones del medio ambiente.’ No obstante, el criterio inportagicies qpe ancy del desdoblamiento del azticar glucosa, es fosforilada en un compuesto glucosa-6-fosfato® La. fermentacion requiere un compuesto organico como. aceptor de electrones terminal.” El ciclo fermentativo principal de la glucosa162 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bocterios 1 mol gincost —Leslorilaciin 6- Acide 6-Lostoghiconiee: Devivrcitn pentose 1 Ribuloss 5-fostiata co, = Acido pinivieo Meoho! etilieo co, Acido piravieo Glucosa-H-fostiato Cielo de Emden Meverhof Fructostfctostate Fructosss 1G-difosfito 2 moles glicevaldehide 3-fostato 2 moles sicko pintvices ieee Ciclo de Entner-Dowdoroff Acido 2-ce10-3-desoxi-6-fosfoglucénico Cliceraldehido $-fosfiuer por medio del Ciclo de Embdle Meyerhof 2 moles icido pirdvieo Tres cielos de fermentaciin can fosforiacion® es el ciclo de Embden-Meyerhof, aun cuando puede producirse la degradacién por medio de la derivacién pentosa o por el ciclo de Entner-Doudoroff.? Sin embargo, los tres Giclos requieren la fosforilacién de la glucosa como paso inicial, antes de que pueda producirse la degradacié La oxidacién de la glucosa por una de las vias de derivacién es un proceso aersbico y los oxidadores bacterianos de un hidrato de carbono son por lo general aerobios obli- gados (estrictos)."” En el proceso de oxida- Gién, la glucosa u otro hidrato de carbono no son 'degradados ni desdoblados en dos moléculas triosa de carbono; " al contrario, el grupo aldehido es oxidado directamente en Un grupo carboxilo formando Acido glucsnico ue es oxidado a su vez en un acido Jectoglucdnico." * © BI dcido 2-cetoglucé nico puede acumularse o degradarse nuevamente ! para formar dos moléculas de acido piravico. Contrariamente a la fermentacién, Sebek y Randles,"® y Norris y Campbell hallaron que el proceso de oxidacion no requiere la fosforilacién inicial de un hidrato de carbono antes de su degradacién. Sebek y Randles ® aseguran que la falta de fosfori- lacién en el periodo inicial de oxidacion se debe a la incapacidad del adenosintrifosfato (ATP) de penetrar en la célula bacteriana. L. oxidaci6n requiere oxigeno 0 un compuesto inorganico como aceptor de electrones terminal? Glucosa Aet gucaney Acide 2cetoglucsnico to Doin’ eal lactrlen 2 moles deito pindvico Ciel exidion: in feelin inci La diferencia principal entre el metabolismo fermentativo y el metabolismo oxidativo de un hidrato de carbono depende de los requerimientos de oxigeno atmosférico y de Ja fosforilacién inicial. La fermentacion es un proceso anaerébico que requiere la fosfori- laci6n inicial de la glucosa previamente a su degradacién, mientras que la oxidacién, en ausencia de compuestos inorganicos como nitrato y sulfato, es un proceso estrictamente aerdbico que comprende la oxidacién directa de una molécula de glucosa no fosforilada (inicialmente)."” La fermentacién produce una acidez mas elevada que el proceso metabolico oxidativo."”IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO BASICO OF DE HUGH Y LEIFSON, A) Cc) D) E) F) G) PH: 7,12 8% 10 Ingredientes. tilada 1600 ml 1. Peptona (triptona) rig 2. Cloruro de sodio (CINa) 5g 3. Fosfato de potasio (KsHPO,) 03 ¢ 4. Agar Bee 5. Azul de bromotimol —0,03-0,08 ¢ 6. ‘Agua des Indicador del pH: azul de bromotimol 1, Acido: color amarillo, pH: 6. 2. Alcalino: color azul de Prusia intenso, pH: 7.6. 3. Medio no inoculado: a) pH: 7,1; b) color verde. Existen productos comerciales 1. Difco: Medio basico Bacto-OF* 2. BBL: Medio basico OF? Método de preparacién: medio basco. 1. Pesar las cantidades con precision, como se indica en el prospect. Los diferentes productos pueden. variar ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar suavemente lucién hasta su diso- Método de esterilizacién, medio bisivo. 1. Autoclave. 2. 121° C, 15 libras, 15 min, Enfriar el medio basico esterilizado hast 40-45¢ C en un bano de agua. Agregado de hidratos de cirbono, dos opciones. 1. Soluciones acuosas, al 10%. a) Hidratos de carbono: 1) glucosa: 2) lactosa; 3) sacarosa; 4) maltosa, b) Método de esterilizacion: 1. Filtraci6n, recomendada."” Método del filtro de membrana Millipore. Membr: diametro del poro 0,4: crones. 2. Método alternativo.* H) Enfy 1) Prueba de oxidacién-fermentacion 163 Una concentracién del 1 % del hidrato de carbono elegido agregado al medio basico antes de la esterilizacion, Autoclave: 118° C, 10 min. Si se agrega el hidrato de carbono al medio bisico antes del proceso de autoclave, la temperatura provocara su des composicién."” Sin embargo, Hugh y Leifson" aseguran que pueden ponerse en autoclave los hidratos de carbone si se usa una solucion acuosa al 10 %. Con todo, se recomienda que se esterilicen por fil uacion, ©) Agregar a una alicuota de 100 ml de medio basico fundido estérif 10 ml del hidrato de carbone elegido, esterilizady (filtrado)2: * d) Asépticamente distribuir en tubos. aproximadamente 5 ml por cada tubo con tapa a rosca, esterili- zalo2* 2. Discos de hidrato de carbone comer ciales, estéviles, a) Fabricante: BBL, Difco, b) Medio biisico, 1, EL mismo empleado para las soluciones acuosas de carbohidratos. 2. Agregar discos de hidratos de catbono al medio estrril, distribuido en tubos, en forma asép- fica y siguiendo las indicaciones del fabricante. Wr antes de su empleo y refrigerar para su conservacién (4-10? C). Inoculacién, prucba standard en dos tubos: 1. Crecimiemo de un cultivo puro de 18 4 24 h; AHK u otro pico de flauta de agar conyeniente? 2. Para cada hidrato de carbono que se use, inocular un par de tubos OF para cada organismo en estudio, Rotular uno abierto y el otro cerrado (sellado) 3. Indculo poco denso.** a) Aguja de inoculacién. b) Picar ambos tubos aproximadamente hasta 0,6 mm del fondo,4. Cubrir todos los tubos cerrados (0 sellados), con 1 a 2 ml de vaselina 0 parafina fundida estéril, para excluir el oxigeno. Incubacién. 1, 35°C. 2. 48 ho mas; ® puede necesitar de 3 a 4 dias* ° o hasta 14 dias de incubacién protongada.* El medio OF de Hugh y Leifson contiene una elevada concentracién de hidrato de carbono con una baja concentracién de peptona para obviar la posibilidad de que un organismo aerébico utilice la peptona, produ- Giendo asi una condieion alcalina que neutraliza la més ligera acidez producida por un organismo oxidativo. Hugh y Leifson ! afirman que ciertas peptonas pueden no ser convenientes y la que recomiendan es un digesto pancredtico de caseina El fosfato de potasio agregado al medio favorece la fermentacién y acttia como buffer para controlar él pH.” El cloruro de sodio favorece el crecimiento de las especies de Bruce- Te. La concentracién de agar empleado ermite también la determinacién de la motilidad, ademas de la capacidad oxidativa o fermentativa de un organismo. La presencia de agar ayuda asimismo a la distribucién por todo el tubo del acido producido en la superficie del medio." La glucosa se emplea mas habitual mente en el medio basico OF; sin embargo, a veces un organismo en estudio no puede metabolizar la glucosa pero puede atacar otros hidratos de carbono." Se empleara una bateria compuesta por glucosa, lactosa_y sacarosa, y a veces, maltosa.® Durante su conservacién, el medio puede absorber un pequeiio volumen de oxigeno, pero Hugh y Leifson " afirman que esta pequeia cantidad no afecta en grado apreciable las reacciones OF. Cowan y Steel * aseguran que el oxigeno absorbido por ¢l medio OF durante su conservacién puede ser extraido sometiendo primero al vapor el medio y enfriéndolo rapidamente antes de su empleo, A) B) A) B) 164 Pruebas bioquimicas para fa identificacién de bacterias V. RESULTADOS las fotografias en colores de los, resultados pueden verse en las Figuras 24-1 y 24-2 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACION: PRUEBA DE LOS DOS TUBOS Ademis de la utilizacién de los hidratos de carbono, puede detectarse con un medio OF la produccién de gases y la motilidad.* Registrar la produccién de gas y/o Acido y la reaccién de motilidad de cada tubo, utilizando las siguientes abreviaturas: 1. Reacciones con hidratos de carbono. a) Acido: A. b) Acido y ©) Sin SCo-. s: AG, 0 © reaccién alcalina: 2. Determinaciones OF. a) Fermentativa: F, b) Oxidativa: O. ©) Ni oxidativa ni fermentativa: —. 3. Motilidad. a) Con motilidad: + (crecimiento que se aleja de la linea de pun- n) in motilidad: — (crecimiento limi- tado a la linea de puncién). by Formas de utilizacién OF de los hidratos de carbono.* " (Véase el cuadro 24-1.) VII. PRUEBA DE OXIDACION- FERMENTACION EN UN TUBO, DOS OPCIONES Medio, cualquier método, 1, El mismo que para el método en dos tubos (véase la Seccién IV; A a G,2) 2. Noes necesario recubrir con sustancias que retarden el oxigeno (vaselina, parafina). Dos métodos. 1, Método de Porres y Stanyon."Prueba de oxidacién-fermentacién 165 Cuadro 24.1 Tubo con reuecién Tubo abierto Tubo cubierto (sellado) 1. Oxidacién (0) Abierto Amarillo (A) Verde (=) 2. Fermentacién (F) (at é Gubierto Annarillo (A) Amarillo (A) 3. Fermentacién (F) Amarillo (AG) Amarillo (AG) 4. Nifermentacién ni Azul o verde (~) Verde (—) 5. Fermentacidn y oxidacién(O+F) —— Ambos Amarillo (4-0 AG) Amarillo (A @ AG) a) Medio en tubo. 1, Tubos con tapa a rosca de 16 x 125 mm 2. Medio BBL: 10 ml/tubo. 3. Concentracién de los hidratos de carbono, 10 %. b) Inoculacién: puncién hasta el fondo del tubo, ©) Incubacién. 37° C. 48 h. d) Interpretacion. 1. Oxidacién. a) Produccién de a b) Color amarillo. Se extiende sobre el tercio al cuarto superior del medio. En_ algunos casos, la mitad superior, pero nunca mas. 2. Fermentacién, a) Produccién de acido, b) El color amarillo se extiende por todo el medio, e) Correlacién con el método standard en dos tubos: 100 %." 2. Método de Brown. a) Medio en tubo. 1. Tubos con tapa a rosea, estrangulados, 2. Medio de Difco: 10 mi/tubo. 3. Concentracién de los hi LOS, de carbono: 1 %. b) Inoculacién: puncién hasta el fondo del tubo. ©) Incubacién. 35° C. En total, 7 dias; examinar diariamente, ¢) Correl: d) Interpretacion. 1. Oxidacién. a) Produccién de Acido. b) Color amarillo, En el medio sélo por arriba de la estrangulacion. Corresponde al no cubierto {abierto) del método conven- cional en dos tubos. 2. Fermentacién. a) Produccién de Acido. b) Color amarillo. En el medio solamente por debajo de la estrangulacién. Corresponde al cubierto (se~ lado) del método convencio- nal en dos tubos. n con el método standard en dos tubos: 100 %.! Los estudios de Porres y Sta- nyon mostraron_variaciones en el grado de reactividad entre diferentes medios OF comerciales ya distribuidos en tubos, Brown! tu- vo dificultad para leer las reacciones cuando uso el medio basico OF de BBL. Sus estudios sefialan ‘asimismo problemas de algunas reacciones de fermentacién falsamente positivas con medio OF de preparacién comercial ya distribuido en tubos convencionales, que solucioné utilizando medios recién preparados, tanto en tubos convencionales como estrangulados. Como parece que existen variaciones entre los medios comerciales en tubos, Porres y Stanyon " recomiendan fijar los patrones de reac tividad del Laboratorio, evaluando Ia composicién del medio, el tipo de ingredientes nutritives y el pH final166 Pruebas bioquimicas para la identificacion de bacterias A) B) D) E) G) VIII. PRECAUCIONES Deben usarse abreviaturas correctas para anotar las reacciones OF. No basta usar positivo (+) 0 negative (—) para indicar oxidacion (O) o fermentacién (F), ya que ello puede confundir, indicando ‘quizas el resultado de la prueba de motilidad o imposibilitando determinar si el hidrato de. carbono resulté negative para la oxidacién 0 la fermentacién, 0 para ambos procesos En la mayoria de los textos se registran las reacciones OF de muchos organismos como OJ— lo que indica que dichos ‘organismos tienen una reaccion OF vari ble, y son oxidativos o no son ni oxidativos ni fermentativos (no utilizacién del hidra- to de carbono glucosa, inerte). ‘A veces se agrega al medio una solucion acuosa (en agua) del indicador del pH, 3 ml de una concentracién al 1 % por litre. No deben usarse las soluciones aleohdlicas, ya que un organismo puede producir acido a partir del alcohol "™ dando una reaccién de fermentacion u oxidacién falsamente positiva. Cowan y Steel® afirman que algunos organismos son incapaces de crecer en el medio de Hugh y Leifson. Si esto ocurre, repetir la prueba OF utilizando el medio basico de Hugh y Leifson ” al que se habré agregado un enriquecimiento, ya sea 2% de suero 0 0,1 % de extracto de levadura." Hugh y Leifson ® afirman que el nitrato es reducido por la mayoria de los organismos fermentativos; sin embargo, es comiin entre los no fermentadores la no reduccion del nitrato, Hugh y Leifson ® hallaron que un organismo que solamente oxida el hidrato de carbono glucosa no fermentara ningin otro carbohidrato (solamente lo oxidara); por lo tanto, cuando se hace la prueba de otros hidratos de carbono, se omitira el tubo cubierto (sellado). Un organismo que no sea oxidative ni fermentativo (—) producira una ligera alealinidad en el tubo abierto (color azul verdoso), pero el tubo cubierto no dara cambio de color (verde)."" H) Algunos organismos pueden crecer en ambos tubos OF sin que haya produccién de acido. Si esto ocurre, Cowan y Steel ® recomiendan confirmar la reaccién negativa utilizando otro medio bisico que contenga glucosa. 1) Algunos organismos requieren una incu- bacién prolongada antes de que. sea visible la produccién de acido.® # Leder- berg ® afirma que la reaccién retardada se debe a una incapacidad de un hidrato de carbono de penetrar en Ia célula bacteriana. Recomienda efectuar la prueba de la galactosidasa (ONPG) para determinar la potencial capacidad fermentativa, J) Hugh y Leifson demostraron en sus estudios que la reaccién OF de la mayoria de las bacterias negativas es oxidativa 0 fermentativa; sin embargo, sus reacciones. pueden causar certa confusion, ya que a menudo son lentas o débiles. Hugh y Leifson aseguran que las bacterias paracolénicas pueden oxidar y fermentar los hidratos de carbono, y en este caso la oxidacién no se manifiesta, a menos que la fermentacidn sea débil © lenta. Las bacterias paracolonicas (grupos Arizona y Citrobacter) son capaces de la oxidacion de la lactosa, © de la fermen- tacién, 0 de ambas cosas." ,” organismo_ fermentativo mostrara una reaccién acida en todo el medio en ambos tubos. Sin embargo, la produccién de cido de un organismo oxidative se hi lente primero solamente en la ie del medio del tubo abierto y poco a poco se extiende por todo el tubo." St la reaccién oxidativa es retai dada o débil puede observarse una disinntadeiene it superficie del tubo abiertop lo que provoca a menudo una mala interpretacién de la reaccién/OF como negativa (ni oxidativa ni fermentativa). No obstante, con la incubacién prolongada por varios dias, la reaccién alcalina vira a Acida."” Por lo tanto, todas las reacciones OF negativas deben ser sometidas a una incubacién prolongada de 3.a4 dias.Prueba de oxidacién-fermentacién 167 BIBLIOGRAFIA 1. Bailey, R, W., and Seott, B. G. Diggnos- tic Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. V. 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BASES BIOQUIMICAS El aminodcido aromitico fenilalanina sufre la desaminacién oxidativa catalizada por un jasa, una flavoproteina *' para producir el acido cetonico, acido fenilpirii- vico. La desaminacién oxidativa da como resultado la extraccién del grupo amino (NH) del aminoacido para formar un doble enlace -a-cetoacido y libre de amoniaco (NH;). Es éste un proceso en dos etapas; en un principio, es extraido el hidrdgeno dando un iminoacido y el hidrégeno se combina con el oxigeno para formar agua, luego el imino- dcido es hidrolizado en’ un cetoacido."” La fenilalanina es’ desaminada a acido fenilpirivico, el que luego es reducido a Acido fenilactico mediante incubacién. Este ultimo RCHNH,COOH + "20 —>2H- ronucoon —#9+ cocoon + NH, Ammaicido Reaccién neta: Iminoicido Cerwiicid ¢x4—eHt coon CH, -¢-coon AC Att é C 7 + 120 tH + NH, ee Tevgproicc Fenilaanina Acido Amoniaco fenilpinivieoReconvertido L CH,—-CH-CooH i o* 7 fenilalanina (PA) Revonvertido, (Copiado de Harrow, B., y Mazur, A. (1965), Co., Filadelfia.) ede ser reconvertido en fenilalanina, con el ciclo de la desaminacién vuelve a Una pequenta cantidad de acido vico es susceptible de ser descarbo- xilado a acido fenilacético, el cual también puede ser reconvertido en fenilalan is IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE FENILALANINA ® ** A) Ingredientes, pH: 7.3 1. DL-fenilalanina 2Q¢ 2. Extracto de levadura 3g 3. Cloruro de sodio bg 4. Fostato de sodio (NasHPO) 1 g¢ B.A 12g 6. Agua destilada 1000 ml isten productos comerciales. 1. Difco. 2. BBL. ©) Método de preparacién. 1. Pesar las cantidades exactamente, si guiendo las indicaciones del prospecto. D) Prueba de la fenilalanina-desaminasa 169 CH,CHOHCOOH O Acido fenikietieo | Q° Acido fenilpinivico (PPA) Acido fenilacético Textbook of Biochemistry, 9 ed.. con autorizacidn de W. B, Saunders 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar suavemente hasta disolucién. 4. Distribuir en tubos, aproximadamente 4 mlftubo, en pico de flauta largo, Método de esterilizacin. 1. Autoclave. 2. 121°C, 15 libras, 15 min, que el medio se solidifique en mn oblicua. F) Enfriar antes de su empleo y conservar refrigerado (4-10° © G) Inoculacién 1. Indculo denso.* 2. Crecimiento de un cultive puro de a 24h (AHK). H) Incubacién: 35° ©. 4 horas 0 18 a 24 horas. 1) Agregar directamente el reactive al tubo incubado antes de intentar la interpreta- cién y hacer que el reactive se deslice suavemente sobre el pico de flauta.170 Si no se obtiene el medio de fenilalanina comercial, y se utiliza 1-fenilalanina en lugar de la mezcla del isémero DL solo es necesario 1 g (1 %).° La forma L (+). de fenilalanina es degradada m rapidamente por Proteus y Providencia que Ta mezcla DL." V. REACTIVOS EMPLEADOS A) Dos elecciones 1. Solucién acuosa de cloruro férrico (FeC),) al 10%. . a) Ingredientes, dos tipos. Adidificado, recomendado. Cloruro férrico (FeCh) 2 g b) Acido clorhidrico concentrado (HC) 2,5 ml ©) Agua destilada, csp. 100 ml 2. No acidificado. a) Cloruro férrico (FeCl) 10 g b) Agua de 100 ml 2. Sulfato de hierro y (NH4)2SO,4 B) Métodos de uti monio [FeSO, HO] semisaturado.” 1. Cloruro férrico, cualquier tipo. a) Agregar 4 a 5 gotas de FeCk directamente a un tubo incubado de 18 a 24h. Si el tubo es inoculado densamente, serin suficientes 4h de incubacion? Hacer rotar suavemente el tubo : el crecimiento se separe. rmino de 1 a 5 min se produce una reaccién positiva de color verde en el pico de flauta, yen el liquido de sinéresi 2. Sulfato de amonio férrico.* Acidificar con acido (H.SOy al 10 % wiliz indicador rojo de fenol. a) sulftirico indo como 1. Alcalino: rojo. 2. Acido: amarillo. o) D) E) Pruebas bioquimicas para Ja identificacién de bacterias b) Agregar de 4a 5 gotas de sulfato ferrico de amonio semisaturado. ©) Agitar suqvemente el tubo. d) Una reaccién positiva de color verde se produce dentro del tér- mino de I min. 3. Cualquier reactivo: interpretar la re- accién inmediatamente, dado que el color producido es ‘inestable y se desvanece ripidamente.® * Control de calidad: Los reactivos deben ser controlados con cultivos. positivos y negativos conocidos antes de su empleo general. Son buenos controles la Escheri- chia coli y las especies de Proteus, dado que se obtienen facilmente y su conservacién en cultivos madre no crea problemas. coli: reaccién de la fenilalanina negativa: especies de Proteus: reaccién de la fenilalanina positiva Conservacién: Guardar los reactivos en un refrigerador (4° C) mientras no se usan. Estos reactivos deben ser colocados en_frascos oscuros para evitar la expo- sicién a la luz. Su estabilidad es variable; por lo tanto, se hard todas las semanas un control de calidad desechando los que muestran una reaccién negativa o débil con un organismo positive conocido. Quimica de la accién reactiv: fenilalanina esti desaminada, el color producido comio consécuericia del agregado de cloruro férrico (FeCl) al 10% se debe a la formacién de un cetoacido, cl acide. fenilpirivico" Henecka ® y Houben-Weyl " demostraron que los a- y B-cetoacidos dan una reaccién de color positiva tanto con la solucién alcohélica Como la como con la acuosa de FeCl. El aicido pirtivigo es un «-cetoicido. Singer y Volcani® afirman que la reaccién positiva del ChFe se debe a la formacion de una hidrazona, La hidra- cima (RNHNH) es un derivado del amonfaco agregado a un grupo carbonilo: uno de los hidrégenos. esti unido al oxigeno, mientras que un nitrégeno esta ligado a'un sitomo de carbono.” Cuando se condensa un aldehido 0 una cetona con una hidracina, se produce una hidrazona 0 un compuesto de tipo hidra~ vont (un nitrogen no saturado que contiene el derivado), y se elimina ef agua. teA) B) © hidvaci annie ° M Cetona CH, ¢-COOK Acido Fenitpivivico —— Hidrae El niicleo guanidina de la peptona [CONVENE] es un amoniaco, yun derivado hidracina del Acido Los compuestos de tipo ceténico son incoloros, pero si se conjuga un grupo ceto (C=O) con otro grupo ceto 0 con =C—C= u otras ligaduras dobles, puede producirse color. El cloruro férrico (FeCl) es un agente oxidante y el ion férrico (Fe***) 1 solucién acida con la hidracina, formar: (por medio de una hidrazona) nitrogeno y amonfaco como productos terminales, teduciendo el ion férrico. N.H,t + Fett NH,* + 1/2 Ny + Ht + Fett El cloruro férrico actéa como agente quelante; lo hace con el acido fenilpira- vico para formar un color verde." Cuando se expone al oxigeno atmosfé- rico un tubo de cultivo con fenilalanina después del agregaco de FeCl, aumenta la velocidad de produecién y la intensidad de la reaccién positiva."* VI. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 25-1 (Apéndice 1), VII, INTERPRETACION Prueba positiva: Formacién de un color rojo claro a intenso en el pico de flauta y en cl liquido de sinéresis.* Prueba negativa: no se produce cambio de color; se mantiene amarillo por el color del reactivo cloruro férrico. VIII. PRUEBAS RAPIDAS Prueba de la fenilalanina con tira impregnada de reactivo (Patho Tec). Prueba de la fenilalanina-desaminasa 171 © il N—NHR Hidrazona * CH, -¢-COOH ina Fenithideavona, 1. Fabricante: General Diagnostics Divi- sion, Warner-Lambert Company 2. Resultados: dentro de los 5 a 10 min de incubacié Método: seguir las indicaciones del fabricant 4. Correlacién con la prueba standard, a) 100 %;* ™ 9 90 G4 b) Falsos negativos 1. Dos cepas de Proteus morganii que no fueron influidas’ por una incubacién prolongada de 30 min Una cepa de Proteus mirabili Una cepa de Providencia."* sos positivos, con dificultades de interpretacién. 1. El pigmento de color oscuro producido por el organismo puede interpretarse como una falsa reaccién positiva. Esto se evita ® empleando un indculo denso y htimedo. Ademis, frotar el inéculo en parte sobre la zona de reactive y en parte fuera de ella, para comparacién, 2. Interferencia del acido sulfhidrico (SH). Evitar tomar el inéculo de AHTA/AHK; usar un cultivo de agar nut B) Tabletas [PA de Key 1, Fabricante: Ke Company Scientific Products 2. Determina dos pruebas bioquimicas: del indol y de la fenilalanina. 3. Método: seguir las indicaciones del fabricante,172. Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias IX. PRECAUCIONES (A) Una prueba de la fenilalanina positiva debe sey interpretada inmediatamente des- pués del agregado del reactive. FeCl. porque el color verde se desvanece ripi damente.” La interprétacion de positive © negativo debe hacerse dentro de los primeros 5 min. Haciendo que cl Chk xe deslice sobre el pico de Mauta, permite obtener una reaccion mis rapida con un color mas: pronunciado. B) Algunos laboratorios utilizan a menudo las iniciales PA_para indicar el medio de fenilalanina. Sin embargo, ello puede representar también agar con peptona y tanto éste como el agar con fenilalanina tiene un aspecto idéntico, Cuando se tenga duda en cuanto al medio que se ha querido representar con abreviatura PA, hacer un control de calidad) con un organismo fenilalanina positive antes de disponer el uso de dicho medio. BIBLIOGRAFIA Audrieth, L. F., and Ackerson, B. The bonyl-Verbindungen, Berlin: Springer, Chemistry of Hydrazine, New York; 1950, pp. 110-129, John Wiley and Sons. Inc., 1951, pp. 122,14, Henriksen, S. D., and Closs, K. (1938) and 214-215. ‘The production of phenylpyruvie acid by 2. BBL Manual of Products and Labora- bacteria. Acta Pathol. Microbiol. ‘ory Procedures, 5th ed. Cockeysville, Seand., 15, 101 Maryland: Division of BioQuest, Divi- 15, Houben-Weyl, Methoden der Organ- sion’ of Becton, Dickinson and’ Com- ischen Chemie, Vol. TI, 4th ed., Stutt- pany, 1968, p. 132, gart: George Thieme, Publisher, 1953, 3, Blazevic, D. J., Schreckenberger, P. 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Crofts, 1968, p. 117. 11, Handbook of Clinical Laboratory Data, 22. Weaver, D. K., Lee, E. K. H., and 2nd ed., Cleveland: The Chemical Rub- Leahy, M. 8. (1968) Comparison of re- ber Company, 1958, p. 321 agent-impregnated paper strips and eon- 12, Harrow, B., and Mazur, A. Textbook of ventional methods for identification of Biochemistry, Sth ed., Philadelphia: W. Enterobacteriaceae. Am, J. Clin, Pa- B. Saunders Company, 1966, p. 405, thol., 49, 494, 13, Henecka, H. Chemie’ der-Beta-Decar-Prueba de la fosfatasa I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de producir la enzima fosfatasa en cantidad suficiente como para desdoblar el difosfato de fenolftaleina, Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulo 32.) Determinar fundamentalmente las cepas patogenas de las especies de Staphylococcus (Staphylococcus aureus coagulasa positivo) Ill. BASES BIOQUIMICAS La produccién de fosfatasa esti determinada por la liberacién de fenolftaleina, indicada por un cambio de color en el medio.* La fenolftaleina liberada reacciona con un alcali para dar un color rojo rosado brillante. Fosfatasa Difosfato de fenolftalefna — fenolftaleina libre (al de sodio) Fenolfialeina + aleali = rojo rosado brillante La ftaleina es un compuesto de anhidrido fidlico con un fenol o un derivado fendlico ? que contiene un anillo lactona de cinco lados. EI anhidrido ftélico combinado con dos moléculas de fenol forma el compuesto fenolftaleina. Anhidrido Fenol fualico Fenolfialeina Cuando la fenolfialeina es neutralizada el aleali se une al grupo C=O rompiendo el anillo lactona y forma una estructura quinoide en uno de los anillos benceno* ° ° oy OO Ww i a . 0 0 Aniillo benceno SiH Estructura quinoide (quinona) CeH,O, Anillo Fictona (cinco hides) Fenolftaleina {incoloro en seid} CyyH sO, Fenolfialeina ojo en alealino)174 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias Algunos radicales fundamentales, conocidos como croméforos, son responsables del color producido por ciertos compuestos n=C, C=O, C=8, C=N, N=N, N=O y NO;. Cuanto mayor es el mimero de estos grupos cn el mismo compuesto, més intenso sera el color producido* En los compuestos bencenos los radicales croméforos se denominan cromégenos, un compuesto coloreado pero no un colorante, ya que no tiene afinidad con los tejidos ni con las fibras.* En la fenolfialeina el cromégeno es la estructura quinoide (0 quinona) que contiene dos grupos C=O. La presencia de la estructura quinoide da al compuesto un color la_de la estructura quinoide y el testablecimiento de la forma fendlica.® La fenolftaleina puede formar sales, por lo general la sal sddica, ya que es mas estable. Los auxocromas son el grupo de colorantes y cromégenos, aicidos 0 basicos, que forman sales. Se halla presente cl grupo carboxilo dcido (~COOH) de la fenolftaleina, pero la sal sddica se encuentra como —COONa, su auxocromo caracteristico, La fenolftaleina se usa sobre todo como un indicador acido-basico: en un medio iicido neutro es incolora, y de color rosado a rojo en medio alcalino.® No obstante, hay que tener rojo rosado; no obstante, este color dlesapa- en cuenta que este indicador tiene una rece sila solucin vuelve a acidificarse, por la variedad de colores, segin su pH. oH ; fF] uo \-¢—o » a ° aA Incoloro [| Rosado pe ut low © j i \ 0 yee oO F \ Acino ALCALINO © | 83.190 / pKa 0 “ 0 i seas, 3 tvobone en la csc teatina ena de een falta (Copiago de Nusenhaum, 8, Cneunie Comins Pimeles nel abptction, NB, co gulTzgsy eh NI te con, Ine,. Toston.)IV, MEDIOS EMPLEADOS: MEDIO DE DIFOSFATO DE FENOLFTALEINA (PDP) A) Sustrato, concentracién al 0,5 %. 1. Fabricante: Sigma Chemical Com- pany (véase el Apéndice V). 2. Ingredientes. a) Sal s6dica difosfato de fenolfialeina 05g b) Agua destilada o deionizada 100 ml 3. Método de esterilizacién.* a) Filtracién (Millipore 0 Seitz). b) Filtro de membrana, 0,22 ym. B) Medios, dos opciones. 1. Caldo nutritive PDP, pH: 7,5.% 7 a) Ingredientes. 1. Extracto de carne 3g 2. Peptona 5g 3. Agua destilada 1000 mi b) Existen productos comerciales. 1. BBL. 2. Difeo. ¢) Método de preparacion. i. Pesar exactamente las _canti- dades siguiendo las indicaciones del prospecto. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada 3. Calentar suavemente hasta diso- lucién, 4. Distribuir en tubos, aproximadamente 3 ml/tubo. d) Método de esterilizacion. 1. Autoclave. 2 115° C, 15 libras, 15 min. ©) Enfriar antes de su empleo y refrigerar para su conservacion (4-10° ©). f) Justamente antes de su empleo agregar solucién PDP al 0,5 %. 1. Asépticamente. Prueba de la fosfatasa 175 2. Una gota (0,05 ml) en cada tubo. * 3. Mezclar suavemente; agitar el fondo del tubo, con los dedos. itll g) Inoculacién. 1, Dos tubos simulténeamente, para cada organismo en estudio. 2. Rotular los Tubos A y B. 3. Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h. 4, Inéculo espeso. h) Incubacién, ambos tubos. 1, 35°C 2. 6h, i) Después de ta incubacién, agregar hidréxido de sodio (NaOH) antes de inientar hacer la interpretacin, Agar nutritive PDP, 1,5 %.% * a) Ingredientes, pH: 7,3. 1. Extracto de carne 3g | 2. Peptona bg | 3. Cloruro de sodio | (CiNa) 8g 4. Agar 1b g 5. Agua destilada 1000 ml b) Existen productos comerciales. 1. BBL. 2. Difco. ©) Método de preparacién. 1° Pesar exactamente las cantidades, segtin las indicaciones. 2. Rehidratar con agua destilada © desmineralizada, 3. Calentar suavemente hasta diso- lucién. d) Método de esterilizacién, 1, Autoclave. 2. 115° C, 15 libras, 15 min. e) Enfriar hasta 45-50° C. 1, En baiio de agua. 2. A3TPC.176 Pruebos bioquimicos pora la identificacién de bacterias 3. Vigilar el descenso de la tem- para evitar que vuel- lificar. 1) Agregar el sustrato, asépticamente Dilucién final: 1/10.000. 1. Sal sddica difostato de fenolfialeina 5 % = 2 ml 2. Agar nutritive fundido, 45-50° C 98 ml Mezclar suavemente, haciendo givar el frasco con lentitud. Evitar la formacién de burbujas. g) Asépticamente volear en: 1. Céipsulas de Petri. 2 Aproximadamente 12 a 15 ml/cipsula h) Dejar enfriar antes de su empleo y tefrigerar para su conservacién (4-10° C). 1. Enfriar: en posicién vertical (con la tapa hacia arriba), 2. Conservar: en posicién invertida (con la tapa hacia abajo). i) Inoculaci6n, 1. Crecimiento de un cultive puro de 18 a 24h, 2. Inéculo poco denso." 3. Estriar para el aislamiento (colonias discretas)." i) Incubacion, 1. Posicién invertida, con la tapa hacia abajo. 2. A 35°C. 3. 18a24h2 Segiin los estudios de Baird-Parker se obtienen muchos cultivos positives cuando se extiende la incubacién a3 a5 dias, a 30° C. k) Después de la ineubacién, exponer las colonias al vapor de amoniaco antes de hacer la interpretacién. V. REACTIVOS EMPLEADOS A) Hidréxido de sodio (NaOH) 10 N (al 40 %). 1. Ingredientes. a) NaOH, libre de carbonato, R.G. 40g b) Agua destilada 100 mi 2. Método de preparacion. a) Pesar ripidamente el hidroxide de sodio y disolver en. menos de 100 mi de agua destilada, en un ste reactive es muy higros- el vaso en un baio de agua frfa cireulante para controlar la temperatur ©) Enfriar y trasvasar la solucién de NaOH a un frascovolumétrico de 100 ml y agregar agua destilada, cs.p. 100 ml, d) Guardar en un frasco de vidrio para reactivo, cubierto por polietileno o parafina. 3. Método de utilizaci6n. a) Medio de caldo, en tubos. b) Después de la incubacién, agregar 1 gota de NaOH al 40 % al Tubo A. L. Si da_ positive, resultado. 2. Si da negative, continuar la incubacion del Tubo B, a 35° C, 18. 24h. Agregar reactivo al Tubo B y registrar el resultado. registrar el B) Vapor de amoniaco (NHb). 1. Hidréxido de amonio. concentrado (NH,OH), peso especifico 0,880, 2. Método de utilizacion a) Medio en placa b) Dos métodos. 1, Mantener el crecimiento sobre un frasco abierto de vapor de amoniaco 2. Agregar 1 ml de amoniaco a la tapa de una capsula de Petri ¢ invertir sobre ella el medio, EI hidr6xido de sodio y el hidroxido de amonio son sumamente catisticos, por eso hay que evitar el contacto con la piel para que no se produzcan dolorosas quemaduras.VI. _INTERPRETACION: ? CON CUALQUIER REACTIVO A) Prueba positiva: caldo 0 colonias de color rojo rosado brillante. B) Prueba negativa: no se produce « de color; el caldo 0 las colonias mantienen claras 0 blaneas. Aun cuando la prueba de la fosfatasa se utiliza sobre todo para ka prucha de cepas patdgenas cle Staphylocaccus, se ha hallado que otros organismos producen la enzima fosfatasa. Vords y col! observaron que los organismos Proteus Prowidencia producen la enzima fosfatasa, cn tanto que Cowan y Steel ® mencionan pruebas de su produccién en esos dos géneros ademas de Salmonella, Shigella, Klebsiella v Eschevichia. Segiin Lewis." los métodos del tubo y de a placa’ son iguales en sensibilidad para los estafilococos coagulasa positivos. Sin embargo, sus estudios demostraron que el metodo de la placa no indica las cepas patogénicas, pero es mejor que el método del caldo para los estafilococos coagulasa negativos, mientras que el método del caldo dio menos cepas fosfatasa positivas coagulasa negativas. Los estudios de Morton y Cohn ® mostraron escasa correlacién entre la produccién de fosfatasa y coagulasa; 224 cepas eran coagulasa positivas, de lay cuales 200 producian’ fosfatasa, y 96 cepas eran coagulasa negativas y 19 de ellas producian fostatasa. El método del caldo puede utilizarse tanto para la prueba de la fosfatasa como la de la coagulasa” Abio se AVE B) cy Prueba de la fosfatasa 177 VII. PRECAUCIONES color _producido por el indicador fenolftaleina varia con su pH.t Agregar los reaetivos en las cantidades correctas porque la escasez, 0 el exceso de aleali, puede dar falsos resultados. positivos 6 falsos negativos. Las colonias en las que se hizo la prueba de la produceién de fosfatasa con vapor de amoniaco son viables: durante un periodo muy breve y, cuando cs neces rio, se hard el subcultivo inmediatamente después de anotar los resultados.! Tratar de evitar rotular los dos tubos de caldo como ‘Tubo Ly Tubo 2 cuando se hace ka prucha simultinea de un solo organism, ya que en la mayoria de los laboratories se numeran los especimenes. Fl uso de A y B, u otras leas comp: rables, evita li posibilidad de confundir el ntimero del espécimen con el niimero del tubo. EI método del caldo silo puede ser usado después d_que se ha aislado el organismo en un cultivo puro.® La prueba de la fosfatasa para la deter minacion de la patogenicidad del Staphy- lococeus no debe ser confundida con la prueba de la fosfatasa que se emplea para determinar el efecto de la pasteurizacién en la leche: las dos pruebas no son la misma." BIBLIOGRAFIA Baird-Parker, A. C. (1963) A classifica tion of micrococei and staphylococci based on physiological and biochemical for the Identification of Medical Bacte- ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp, 34-35 and 162 tests. J. Gen. Microbiol., 90, 409, 7. Difeo Manual, 3th ed,, Detroit: Difeo 2. Barber, M., and Kuper, S. W. A. (1951) Laboratories, 1953, pp. 29 and 127, Wdentification of Staphylococcus py- 8. Lewis, B. (1961) Phosphatase produc- ‘ogenes by the phosphatase reaction, J. tion by staphylococci—a comparison of Pathol. Bacteriol., 69, 65, ‘two methods. J. Med. Lab. Technol., 18, 3, BBL Manual of Products and Labora- 112. tory Procedures, 5th ed., Cockeysville, 9. Morton, H. E., and Cohn, J. (1972) Coag- Maryland: Division of BioQuest, Div: uulase and deoxyribonuclease activities sion of Becton, Dickinson and Com- of staphylococci isolated from clinical any, 1968, pp. 94 and 129, sources. Appl. Mierobiol., 29, 725. 4, Branson, D. Methods in Clinical Bacteri- 10, Nussenbaum, S. Organic Chemistry: ology, Springfield, Il: Charles C Principles and Applications, Boston: Al- ‘Thomas, Publisher, 1972, pp. 43~44 Conn, H. d.. and Lillie, R, D. Biological Stains, 8th’ ed., Baltimore: The Wil- liams & Wilkins Company, 1969, pp. 17-18, 20, and 208-210. Cowan, 8. T., and Steel, K. J, Manual u. lyn and Bacon, Inc., 1963, p. 458 Vords, 8., Angyal, T., Németh, V., ‘and Kontrohr, ‘T. (1961) The occurrence and significance of phosphatase in enteric bacteria. Acta Mierobiol. Acad. Sci. Hung., 8, 405.Prueba del cianuro de potasio PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de potasio. UL. OBJETIVO (Véase también la Seccién II, Capitulos 33 y 34.) Sobre todo diferenciar entre los géneros. A) Gitrobacter freundir (crecimiento) del grupo Salmonelta-Avisona (sith crecimiento) B) Grupos Klebsiella-Enterobacter (crecimien- to) de Escherichia coli (Sin crecimiento) ©) Bacilos intestinales gramnegativos no en téricos Pseudomonas aeraginosa (erecimien- to) y especies de Acinetobacter (variables) de La Alealigenes facculis (sin crecimiento). I. BASES BIOQUIMICAS La respiracién aerdbica es un proceso bioligico de oxidacion-reduccion que produce energia y por medio del cual un sustrato orgiinico (el dacior de bidrogeno} es oxidado; el mismo trastiere electrones y iones hidrogeno por medio del sistema de trasporte de electrones, al aceptor de hidrégeno final, e ixigeno molecular.’ El proceso produce agua © peroxide de hidrdgeno, segin la especie bacteriana y su sistema enzimitico.* La mayoria de los organismos aerdbicos poseen la enzima citocromooxidasa que los vuelve capaces de wilizar ¢! oxigeno camo un aceptor de hidrégeno final pa oxigeno molecular en peroxide de hidr geno, el ditimo enlace de la cadena de la Tespiracion aerébica.® * Los organismos ana- crdbicos no pueden vivir en presencia de oxigeno atmosférico. y no producen_ un sistema citocromooxidasa.* La mayoria de las especies bacterianas aerdbicas producen tambien la enzima catalasa que vuelve a descomponer el peroxido de hidrégeno,? dado que su acumulaci6n es t6xica. Caras 2 H,0, —__—_—- 2H,0 + 0, Perivide de hidrégeno EL papel del sistema citocromooxidasa en la respiracidn aerdbica es importante puesto que ¢s sabido que en la mayorfa de los organismos que contienen alguna parte del sistema citocromo, el ion cianuro (CN) puede inhibir la respiracién> " Esta inhibicdn se produce bloqueando ta actividad del sistema Gitocromo. El cianuro es un inhibidor ce la citocromooxidasa.”” Muchas de las enzimas que se encuentran en una célula bacteriana requieren para su actividad un ion metalico.'® El cianuro (CN) tiene afinidad con el ion metilico formando un complejo." Las enzimas que contenen hierro son inhibidas por el cianuro; éste encierra el hierro inactivando a la encima. La Citocromooxidasa es un pigmento de metal pesado: la eitocromooxidasa ferrosa," con ta cual se combina el cianuro, interrumpe el sistema de tasporte de electrones " y provoca el cese de la respiracior La inhibicién del cianuro es de tipo no competitivo, ya quecl canuro no compite con cl sustrato en busca de un sitio activo en la superticie de la enzima.” La inhibicion no competitiva es irreversible. El grado de inhibicion producido por el cianure depende de su concentracién, pero es independiente del volumen de oxigeno presente." La respiracion de algunos organismos es inhibida por una solueién de cianuro tan pequena como de 0,00L M." Sin embargo, la respiracion de algunos orginismos aerdbicos no. es sensible al cianuro: son resistentes al inhibidor. Pett ™ y Dubos y Hirsch > afirman que esta resistencia al Ganuro se debe probablemente a un sistema de respiracion Mavoproteica, Su con- sumo de oxigeno se debe a la presencia de enzimas favoproteicas.” Gunsalus y Stanicr afirman que los extractos de algunos org: hismos cianuro resistentes_ contienen las oxidasas difosfopiridin-nucledtide (DPNID reducida y trifostopiridin-nuclestide (TPNH) reducida, insensibles al cianuro. La propiedad resistente del cianuro de potasio (KCN) se utiliza sobre todo para diferenciar entre organisios de las Entero- bacteriaceae: Citrobacter freundii (vesistente a la inhibicién del KCN) de los grupos Salmo- nella-Arizona (sin crecimiento, sensibles). Sin embargo, hay otros miembros de las Entero- bacteriaceae que son resistentes al KCN y qu pptien ser Kena heaios miss facimienks por procedimientos mas simples. Son ejemplos de organismos, aparte de las Enterobacteriaceae, resistentes al KCN, el Lactobacillus y el Streptococcus pneumoniae? IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Caldo KON! 47 1, Caldo KCN basico, pH: 7, a) Ingredientes. 1. Peptona g 2 Cloruro de sodio (CINa) g Fosfato de potasio monobasico (KHsPO) (anh) 0,225 g 4. Fosfato dibasico de sodio (NasHPO,.2H,0) Agua destilada 64 1000, mi b) Productos que existen en et comercio. 3. Prueba de! cianuro de potasio 179 1. Difco: Caldo KCN basico, 2. BBL: Caldo de KCN de Mé- Mer bisico. ©) Método de prepa sico. on, KCN ba- 1. Separar el medio basico en dos alicuotas, una parte que contenga KCN, y la otra para control 2. Pesar amente las cantidades siguiendo las indicaciones del prospecto. Los dife- s productos pueden. variar ligeramente. 3. Rehidratar con agua destilacs o desmineralizada. 4. Calentar swavemente hasta diso- lucién, d) Método de basico, KON esterilizacion, 1. Autoclave, 2 121° C, 15 libras, 15 1 ©) Enfriar el medio bisico es hasta 20° C44 1, Puede refrigerarse hasta que se enfrie, 2. No agregar el KCN hasta que el medio esté completamente {rio Cianuro de potasio, 0,5.%.* a) Ingredientes. 1. Preparar en un frasco con tapa a rosea estéril. 2. Cianuro de potasio >, (KCN) 05 g “3. Agua destilada estéril, fria 100 ml b) No absorber la solucién de KCN con la pipeta por boca. Usar en cambio una pipeta de jeringa o bulbo.* E} cianuro es suimamente venenoso y puede causar la muerte instan- tinea. No inhalar sus vapores. Tra- bajar bajo una campana de seguridad. A una porciin del medio basico frio agregar una solucién de KCN’ al 05 %.180 la Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias a) Crilisando una pipeta de bulbo b) Mezclar bien, ©) Proporcién: 1,5 ml/ 100 ml. concentracién final del medio de KCN con peptona tamponado es de 1:13.000.% 4. o ) Asépticamente distibuir en tubos. 1. Tubos con tapa a rosca de 5 mil, esteriles: 2. Aproximadamente 1 ml/iubo# 3. Puede usarse un corcho sellin dolo con. parafina caliente, pero es cil manipular los tubos con tapa a rosea 4. Ajustar las tapas. Distribuir en tubos el medio bisico de control, sin agregar KCN. a) Puede distribuirse | ml/tubo ares de someter al autoclave, b) Distribuir 1 ml/tubo estéril, despues de someter al autochave. ©) Cuando esté frfo, ajustar las tapas. Refrigerar_para su conseryacin (4° C). El medio de KCN puede conservarse por lo menos 30 dias a 4° C sin que se deteriore el cianuro 0 se altere el valor del cultivo." # Sin embargo, periddicamente, después de 2 semanas de conservacion, se realizard un control de calidad con cultivos positivo y negativo conocidos antes de su empleo general. La Escherichia coli y el Enterobacter avrogenes. son buenos controles porque se obtienen facilmente y se pueden mantener sin problemas como cultivos madre. E. coli: sensible al KCN (sin crecimiento): E. aerogenes: resistente al KCN (crecimiento). Inoculacién. a) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h, por ejemplo, caldo de indol u otro «aldo nutritive adecuado. b) Inocular cada organismo en estudio en dos tubos rotulados P el de la prueba y G el de control. 1. Tubo P: Caldo KCN basico que contenga 0,5 % de KCN. 2. Tubo C: Caldo KCN basico sin KCN (control). 6} Indeulo poeo dense." Incubacion, ambos tubos, ay 35°C. b) Observar el crecimiento después de 24 a 48h; puede necesitarse una incubacion protongada, hasta de 4 dias.? Medio semisolide de agar con sal de tetrazolio (agar KON-CUT). Método de Munson." KON hasico semisclido. a) Ingredientes. 1. Caldo de KCN bisico (BBL) (véase antes) 1 litro 2 Agar 12 g b) Esterilizacion: 121° C, 15 min. ©) Después de enfriar, agregar m diante una pipeta Pro y” seguin indicaciones anteriores: 1. Soluci6n de KCN (0.5 %) 15 ml 2. CIT (1 %) (para su preparacion véase el Capitulo sobre motilidad) 5,5 ml d) Distribuir en tubos con tapa a rosea (13 x 100 mm). 1. Medio KCN-CTT, 10 ml/tubo. 2. Vaselina estéril, 3 ml/tubo. e) Refrigerar para su conservacién (4° C). 1) Inoculacién. 1. Picos de flauta de 24 h; pun- Gién hasta tres cuartos de la profundidad del agar en el tubo. Hacer la puncién en el centro evitando las paredes del tubo. Seguir el mismo camino al retirar la aguja, Inéculo suficiente como para dejar restos visibles siguiendo. la linea de puncién. 8) Incubacién. 35° C. 48 h.Segiin Munson " el agar semisélido con sal de tetrazolio tiene muchas ventajas: 1) es mis facil de interpretar; 2) puede ser conservado durante un periodo mas prolongado, y 3) el tamafio del inéculo es menos fundamental que en el medio de caldo de KCN de Maller. El medio de Munson contiene CTT como indicador del crecimiento y agar para loca- lizar los modelos de crecimiento." Gershman * recomienda el agregado de 0,005 % de sal de tetrazolio para ayudar a detectar el crecimiento, sobre todo cuando hay dificultades de interpretacién. Las sales de tetrazolio son soluciones incoloras redu- cidas en formazin, un pigmento insoluble de color rojo, cuando se hallan en presencia de células “viables.” Véase el capitulo sobre Motilidad, donde se hallaré una explicacin mis detallada de la quimica de la reaceién del Gre La vida del medio de caldo de KCN conservado es muy breve, debido a la posible evaporacién del cianuro como HCN." Asi- mismo, a menudo es dificil imerpretar los cultivos positives en el caldo, y lo mejor es un inéculo poco denso para evitar la wurbiedad nicial que impedira la interpretacion de los resultados finales, aun cuando Edwards y Fife? y Mdller® recomiendan un indculo espeso. Si hay dudas, comparar siempre con un tubo no inoculado. Edwards y Fife * hallaron que una concen- traci6n del 0.3 % de Bacto-proteosa peptona Y° 3 es la mas conveniente para mantener el crecimiento; no obstante, puede recurrirse a otras peptonas de origen comercial, con la misma seguridad. No siempre se utiliza el medio KCN en el laboratorio para la identificacién bacteriana de rutina. Si después dle realizar una bateria de pruebas bioquimicas, se sospecha una posible especie de Salmonella, entonces se podra inocular un tubo de KEN y uno de control tomado del tubo de indol anes del agregado del reactive indol.” El medio de indo! satisface todos los requerimientos para el crecimiento de un organismo KCN positivo y al mismo tiempo elimina la necesidad de un medio de subcultive adicional.? Kauffmann y Mdller" recomiendan realizar el método del KCN en wdos los organismos que no fermenten la lactos dentro de las 24 h. La diferenciacion de Salmonella-Arizona de un posible Citrobacter freundii puede determinarse con precision con el uso de las dos pruchas, si el AHK es alcalinofacido con SHy. Kauffmann y Mo- ler # recomiendan realizar las pruebas de la lisina decarboxilasa y del KCN (cuadro 27.1). Prueba del cianuro de potasio 181 Cuadro 27.1"! “AK: aleve dela SU, oo Tinie Expecies de Salona : Grupn Aroma \ : Citrobacter fruit ———E— Kauffmann y Mller " hallaron que todas las especies de Salmonella no tienen crecimiento en KGN, mientras que todos los grupos Citrobacter crecieron vigorosamente dentro de las 24 h. Todas las cepas KCN negativas (sensibles) deberain mostrar un crecimienta favorable en los tubos de control (medio hiisica sin KCN) V. RESULTADOS En la Figura 27-1 (Apéndice 1) Puede verse la fotografia en colores de los resultados. VI. INTERPRETACIONES A) Medio de caldo de KEN 1. Prueba positiva (resistente). a) Tubo de KEN: crecimiento (turbiedad). b) Tubo de control: crecimiento (tur biedad). 2. Prueba negativa (sensible) a) Tubo de KCN: sin crecin nto (claro). b) ‘Tubo de control: crecimiento (ter biedad). B) Medio semisolide de KCN con sal de tetrazolio (Agar KCN-CUT), 1. Prueba positiva (resistente). a) Tubo de KCN: crecimiento con reduccion del indicador, produciendo coloracion roja a lo largo dle toda la linea de puncidin,” b) Tubo de control: crecimiento con un precipitade rojo (turbiedad). 2. Prueba negativar (sensible) ) ‘Tubo de KCN: sin crecimiento, sin precipitado (claro). b) Tube de control: crecimiento con un. precipitado rojo durbiedad)182 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterios B) c) 3. Medio de control: sin crecimiento; el medio se mantiene incoloro. D) KCN. La falta de crecimiento invalida toda la prueba La concentracién de peptona en el medio de KCN bisico debera ser de 0,3. % Edwards y Fife? observaron que si se VII, PRECAUCIONES aumentaba la concentracién de peptona al 1%, las especies de Salmonella podtian EL KCN es sumamente venenoso (t6xico) dar a veces un resultado dudoso (ligera y debe ser guardado bajo lave. El KCN turbiedad) después de 3a 4 dias’ de de todos los tubos, hayan sido usados 0 desechados por envejecimiento, deben ser destruidos antes de sometidos al autoclave. E] KCN puede ser destruido con el hupegnes de alien femiae ¢ ima Heal acada tubo, un cristal de FeSO, y 0,1 ml de KOH al 40 % por tubo! incubaci6n. Para una correcta interpretacién, cuando se tienen dudas en cuanto a si un tubo de KCN muestra crecimiento 0 no, compararlo con un tubo de control no inoculado, Si persisten las dudas, inocular el medio de KCN que contenga una sal de 1. BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, Sth ed., Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi- sion of Becton, Dickinson and Com- pany, 1968, pp. 125 and 162. 2. Burrows, W., and Moulder, J. W. Text. book of Microbiology, Vol. I. 18th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Com- pany, 1968, p. 111 3. Cowan, 8. T., and Steel, K. J., Manual for the Identification of Medical Bacte- ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 30-31. 4. Difeo Supplementary Literature, De troit: Difco Laboratories, 1968, p. 183, 5. Dubos, R. J., and Hirsch, J. G., Bacte- rial and Mycotic Infections of Man, 4th ed., Philadelphia: J.B. Lippincott Com- pany, 1965, pp. 93-94. 6, Edwards, P.R., and Ewing, W. H.,Iden- tification of Enterobacteriaceae, Minne- apolis: Burgess Publishing Company, 1955, p. 255. 1, Edwards, P. R., and Fife, M. A, (1956) Cyanide media in the differentiation of enteric bacteria. Appl. Microbiol..4, 46. 8, Frobisher, M. Fundamentals of Micrabi- ology. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1957, p. 181, 9. Gershman, M. (1961) Use of a tetrazolium salt for an easily discernible KCN reaction. Can. J. Microbiol., 7, 286. Jamis debe absarberse el KCN con pipeta por tetrazolio como indicador del crecimiento. boca, Es sumamente toxico y puede causar F) Por lo general el medio de KCN se la muerte inmediata. Usar siempre una mantiene estable hasta 4 semanas si se Piprta de bulb o ering (pita Pov. Ech conserva en refrigerador a 4° C. Una las jeringas y pipetas en una solucion de temperatura elevada leva al_acelerado sulfato Terroso. y- aleali de la misma deterioro del KCN del medio. manera que cuando se wata de destruir G) Evitar un indculo espeso cuando se utiliza el medio KCN en tubo. caldo de KCN; un inéculo demasiado Todo organismo en el cual se prueba la denso provoca una turbiedad inicial y/o resistencia (+) 0 sensibilidad (~) al KCN un sedimento en el fondo del tubo, que debe mostrar un crecimiento apreciable pueden ser falsamente interpretados co- en el tubo de control que no contiene mo prueba del KCN positiva." BIBLIOGRAFIA 10, Gunsalus, I. C,, and Stanier, R. Y., The Bacteria, Vol. 1, New York: Aca- demic Press, 1961, pp. 79, 344, and 370. 11. Kauffinann, F., and Meller, V. (1955) On amino acid decarboxylases of Salmo- nella types and on the KCN test. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 36, 175. 12, Moller, V. (1954) Diagnostic use of the Braun KCN test within the Enterobac- teriaceae. Acta Pathol. Microbiol, Seand,, 34, 115. 18, Munson, T. E. (1974) Improved KCN medium. Appl. Mierobiol.,.27, 262. MOginsy, E. L., and Umbreit, W. W An Introduction to Bacterial’ Physiol. ogy, 2nd ed,, San Francisco: W. H. Free man and Company, 1959, p. 215. 16. Pelezar, M. J., and Reid, R. D., Mfierobi- ology, 2nd ed., New York: McGraw-Hill Book Company, 1965, pp. 121 and 131 16..Pett, L. B. (1936) Yeast grown in cyanide, Biochem. J., 90, 1438, 17. Report (1958) Report of the Enterobac- teriaceae Subeommittee of the Nomen: clature Committee of the International Association of Microbiological Socie- ties. Int, Bull. Bacteriol, Nom. Tax., 8, 25, 18, Stanier, R. Y., Doudoroff, M., and Adel- berg, E. A., The Microbial World, 2nd ed., Englewood Cliffs, N. J.: Prentice. Hail Inc., 1963, p. 351Reaccién de la I, PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar ia urea, formando dos molé- culas de amoniaco por accién de la enzima ureasa, I, OBJETIVO (Véase también la Seccién I, Capitulos 33 y 34.) A) Esta actividad enzimatica es caracteristica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar los organi mos Proteus rapidamente ureasa positivos de otros miembros de las Enterobacte- riaceae: otros géneros pueden ser positivos retardados. psiella (+) de 2. Proteus (+, rapi escherichia (—) (0) de Providencia (~) B) Ayudar a la diferenciacién en especies. 1. Bordetella pertussis (—) de B. paraper- tussis (+) y B. bronchiseptica (+). 2. Moraxella phenylpyrowvica (+) de otras pecies de Moraxella (por lo gene- =) + 2 HOH Cor + He Anhidride earhonico ureasa 3. Pastewrella pnewmatropica (+) y P. ureae (+) de P, multocida (~) y P. haemoly- tiea (=). A. Fersinia pestis (—) de Y. pseudatubercu- lasis (C4) y ¥. enterocolitica (+). ©) Ayudar a la identificacion de: 1. Bacitlus lentus +). 2! Pseudomonas cepacia (P. maultivorans) (+). If, BASES BIOQUIMICAS El sustrato urea es una diamida del aicido carbonico, a la que frecuentemente se menciona como carbamida.® " Todas las amidas (RCO—NH,) son ripidamente hidrolizadas."* La hidrolisis de la urea es catalizada por una envima especifica, la ureasa, para dar dos moléculas de amoniaco. En solucion, la urea se hidroliza, dando carhonato de amonio como producto final * (Véase al pie.) La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicién de los compuestos orginicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en constitutivas 0 adaptativas. Una cnzima adaptativa 0 inducida es aquella que es producida por una +2 NH, (NCO, Carbonate de amonio Amwnisess184 Pruebas bioquimicas pora la identificacién de bacterios bacteria solamente cuando se encuentra presente su sustrato especifico.’ La ureasa es considerada una enzima_constitutiva dado que es sintetizada por ciertas bacte tener en cuenta la presencia o ausenc sustrato, la urea.* Existen dos grandes divisiones de las ensimas: 1) hidrolasas, que estén vinculadas con la hidrélisis (agregado de agua) de los teres, hidratos de carbono, proteinas y amidas, y 2) las que estin relacionadas co diversas reacciones de oxidacin-reduccién." La, ureasa se clasifica como una amidasa, catalizando la hidrdlisis de las amidas." Op- enheimer " incluy6 en las amidasas a todas hidrolisis, el enlace entre el nitrogeno y el carbono. En el caso de ka ureasa, el nitogeno es disociado en amoniaco (NH)! Lat ureasa (0 urea amidohidrolasa) ™ ® acta sobre los enlaces C=N del compuesto, con excepeién de los que contienen enlaces. peptidicos."” EI pH 6ptimo para la actividad de la ureasa es 7.4 IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Caldo de ure: 1 de Rustigian y Stuart, pH: 68.6% 1. Ingredientes. a) Fosfato. monopotisico (KH2PO,) 91 g b) Fosfato de sodio (NazHPO,) (buffer de Sorensen) 95 ¢ ©) Extracto de levadura 01 g a) ma pureza, 20 €) Rojo de fenol O01 g 1) Agua destilada 1000 ml 2. Indicador del pH: rojo de_ fenol a) Acido: color amarillo, pH: 68. b) Alcalino: color rojo rosado, pH: 84. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 68; 2) color amarillo anaranjado. 3. Productos comerciales. a) Difeo: caldo de urea. b) BBL: ealdo para la reaccién de la ureasa, 4. Método de preparacion. a) Pesar las cantidades exactamente de acuerdo con las_indicaciones. b) Rehidratar con agua destilada 0 desmineralizada ©) No calentar para disolver. La urea se descompone con el calentamiento. 5. Método de esterili dado, ci6n_ recomen- a) Filtracién. 1. Método del filtro de membrana Millipore. 2. Membranas: 0,45 « diimetro del poro. b) Asépticamente, distribuir en tubos aproximadamente 3 ml" por tubo estéril ©) Si el medio es preparado ¢ inoculado inmediatamente, no es necesaria la filtracién; pueden obtenerse resultados confiables.! d) El medio basico puede ser rehidratado en 900 mi de agua destilada y esterilizado en autoclave a 121° C, 15 libras, durante 15 min. Mi tras se est enfriando se agregan 100 ml de a solucién de urea estéril (filtrada) al 20%, y- se distribuye en tubos (en volamenes de 3 ml por tubo estérid.” 6. Dejar enfriar antes de su uso y refrigerar para su conservacién (4- 10° ©). 7. Tnoculacién a) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h (AHK u otro cultivo adecuado) b) Inéculo denso: la cantidad recogida con el asa de inoculacion (de 2 mm) tres veces.) 21 ©) Agitar suavemente el tubo para lograr la suspensién de bacterias.8. Ineubacién a) Incubadora 0 batio de agua a ype cana b) Observar las reaceiones despué de 8, 12, 24 y 48 h de incubacion, ©) Con el cambio de la temperatura se_producen cambios en la velocidad de produccién de ureasa El caldo de urea de Rustigian y Stuart es un medio muy amortiguado en el cual la deteccisn de utilizacion de la urea despues de 48 ho menos de incubacién esta limitada a la produccién de ureasa de las especies de Proteus solamente2" Otros organismos, sobre todo especies Enterobacter (Aerobacter), son capaces de atacar ta urea lenta y débilmente, pero con el caldo de urea de Stuart no resulta demostrable su deteccién de ureasa dentro de las 48 h de incubacion 2# EL extracto de levadura incorporado en el medio suministra los factores de crecimiento esenciales que requieren las especies Proteus, Las especies de Proteus son capaces de utilizar el nitrogeno de la urea, pero otros organismos que producen ureasa requieren una fuente adicional de nitrogeno.* EI indicador del ion hidrogeno, rojo de fenol, demuestra la produccién de ureasa por el género Proteus, mostrando. una. dismi- hucion en la concentraci6n del ion hidregeno debido a la formacion de dos moléculis de amoniaco (NH) B) Agar urea de Christensen, pH: 68.17% 1. Ingredientes. a) Peptona Ig b) Cloruro de sodio 5g ©) Fostato_ monopoti (KH:PO,) 2 ¢g d) Glucosa (dextrosa) (OL %) Do Oy ¢) Urea (20 %) 2g 1) Rojo de fenol 0,012 g g) Agar 2000 g h) Agua destilada 1000 ml 2. Indicador del pH: rojo de fenol a) Acido: color amarillo, pH: 6.8 b) Alealino: rojo rosado, pH: 8.4 ©) Medio no inoculado: 1) pH: 6.8: 2) color amarillo a piel de ante Productos que existen en el comercio, a) Difeos agar con urea basico. b) BBL: agar con urea bisico. Reaccién de la ureaso 185 Método de preparacion y esterilizae cin. # a) Urea hiisiea deshidratada. 1. Pesar exactamente 20 g de la base deshidrataca y disolver en 100 ml de agua destilada 0 desmineralizada, 2. No calemar la solucion, La urea se descompone con el calor 3. Esterilizar por filtracién. Mi do del filtro de membrana Millipore. Didmetro del_poro AB a. b) Agar Disolver 15 g de agar en 900 ml de agua destilada 0 desmi- neralizad: 2. Autoclave: 121° ©, 15 15 min. Enfriar hasta 50° . ‘bras, © Agregar los 100 ml de base de urea estéril, por medios ase pticos, al agar ya la mezcla acuosa 4) Distribuir ef medio asépticamente en tubos esténiles, aproximadamente 4a 5 ml/tubo (pico de flauta largo, capa profunda reducida). ©) Si se desea, este medio puede ser empleado en forma liquida."” Dejar entriar oblicua. Enfriar antes de su uso y refr para su conservacion (4-10 C), Inoculacién. cl medio en posicién gerar nto de un cultivo puro de a 24h (AHK u otto cultive conveniente) b) Inéculo denso,* * ™ en cola de pescado, en toda la superficie del pico de fauta. ©) No hacer puncion de la capa profunda, porque ella sitve para control del color." Incubacién, a) 35 b) De 6 a 24 hy todos los dias siguientes durante 6 dias.” A veces es necesarie un periodo mas prolongado.186 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias El agar urea de Christensen se usa para kt deteccion rdpida de la actividad ureasa de todas kas especies de Proteus, Este medio detecta asimismo la actividad ureasa detinida en las expecies de Enterobacter y otros mien bros de las Enterobacteriaceae * que muestran una reaccién de fa ureasit retarclada. Es sibido que las especies de Enterobacter. son capaces de utilizar kt urea come si tinier fuente de nitrégeno2! Las especies de Entera- acter pueden perder su capacidad de utilizar el amoniaco (NH) ureico como sul tities fuente de nitrogen, pero ne pueden retener © reeuperar sit capacidad de hidvolizar lt urea? El medio de Christensen elimin necesidad de un organismo de utilizar los productos derivades de li urea Gumoniaco! como su tinica fuente de nitrégeno y muestra también actividad ureasa en organismos cuyo requerimiento de nitrogeno es mis complejo. En el medio de urea de Rustigian y Stuart 2 existen tan pocos elementos nutritivos que si un organismo no puede utilizar el amoniaco, debe recurrir al exmacto de levadura que se encuentra en eb medio para Gblener de él el nityegeno el carbon. Si los nutrientes suministrados por ct extracto de levadura se han consumido antes de que el organisine miuestre un crecimicnto apre- Gable, no podria determinarse con exactitud sui capacidad de hidroliaar la urea.” Si_un organismo es capa de hidrolizar ka urea pero no de atilizay cl amoniaco como fuente de nitrogeno, no se produce el crecimiento ¥ es posible observar_ un resultado falsamente negative.” Fl medio de Rustigian y Suuart est muy amortiguado y ello puede ocultar tas reacciones positivas de organismos con una actividad ureasa mocerada? El medio de Christensen evita kt necesiclad de que un organismo utilice el amoniaco como su tinica fuente de nitrogeno, asi como permite la deteccion de la hidrolisis de la urea Causada por otros miembros de las Entero- bacteriaceae, cuya actividad ureasa cs muy leve y retardada.? Esto se produce por: 1) el agregado de ghucosa al medio. 2) disminucion de li concentvacion de peptoma y 3) disminucion del sistema buffer. ‘Todos los miembros de las Enterobacteriaceae son fermentadores de la glucosa por definicién, y la acide resultante contrarrestara Ia alcalinidad producida por la descomposicion dela peptona: por lo tanto, la glucosa suministra una fuente de energia de la que puede disponer, dejando intaeta a la peptona.? El agregado de glucosa evita las posibles reac- Giones falsamente negativas y estimuka la actividad ureasa en aquellos organismos que hidrolizan Jentamente la urea? La energia suministrada por la fermentacion de- kt ghicosa estimula [a envima urease aumentando la velocidad del metabolismo vy kt reproduccin celular.” Elagregado de ghost no aumenta de manera apreciable Ta actividad ureasa del género Proteus, lo qu sugiere que su_ureasa es una enzima constitutiva Gon el medio de Christensen la velocidad de hidrélisis de ka urea permite dilerenciay entre especies de Protens ¥ otros organismos ureasa positives. Todas las especies de Proteus muestrin una reaceién positiva en ef pico de flauta dentro de un periodo de incubacion de 1a 6h? con el caracteristico color rojo viokiceo (rojo vosude) que se extiende por todo el_medio al término de 6 h de Incubacién. No es rare que un organismo Proteus muestre una reaccion positiva despucs, dle 30 min solamente de incubacion, ya que su actividad ureasia es muy ripida cn el medio de Christensen, El grado y velocidad de penetracién del color en todo cl medio es una medida de la actividad ureasa de an organismo.’ 'Vodas las especies de Proteus dan una reaceion +4 después de 24h de incubacion No hay diferencia en la velocidad de hidvo- lisis cle ka urea entre las especies de Proteus en el medio de Christens Los organismos ureasa positives retardados como especies de Klebsiella 0° Enterobacter varian en cuanto a su velocidad de hidvalisis de la urea, Algunos presentan una reaccion +1 después de 6 h de incubacion que puede raluna reaccion +4 después de 3 a5 dias: incubacion, mientras que otros solamente dan una reacci6n +1 al cabo de 6 dias.? V. RESULTADOS Las folografias en colores de los refultodos pueden verse en lo Figura 28-1 (Apéndice 1) \TERPRETACIONES A) Caldo de urea de Stuart 1. Reaceién positiva a) Color rojo rosado intenso en todo el caldo. b) Solamente especies de Proteus. 2. Reaccion negativa: no se produceB) A) cambio de color (amarillo jado) naran- ristensen. Agar urea de C 1. Reaccién positiva: color rojo resado intenso (rojo viokiceo) en el pico de flauta. El color puede penetrar en el agar i a) Positiva ripida: de 1a 6 h para todas las especies de Proteus, b) Positiva retardada: de 24 h a 6 dias de incubacién o mas. 1. Alguna: de_ Klebsiella 2. Algunas cepas de Enterobacter 3. Algunas cepas de Citrobacter. 4. Otras bacterias que no son Enterobacteriaceae, por ejemplo, algunas especies de Bor detella ¥ todas las especies de Brucella. cepas 2. Reaccién negativa: cambio de_ color amarillo palido) no se produce (color de ante a VIL, PRUEBAS RAPIDAS Reaccién de la ureasa con tira impregnada con reactivo (PathoTec). 1. Fabricante: General Diagnosties Divi- sion, Warner-Lambert Company Resultados dentro de las 2h de incubacién. Método: seguir las indi fabricante 4. Correlacién con el método standard de Christensen. iones del s a) Deteccion positiva. 1 Entre las Enterobacteri ‘eae. a) Solamente especies de Pro- tes.” b) Especies de Proteus, Klebsie- Ua y Enterobacter** ©) Todas las especies de Kleb- siella y algunas de Serratia, Citrobacter y Proteus. 2. Ouras bacterias gramnegativas no fermentadoras. a) Herallea * (actualmeme especies de Acinetobacter). Reaccién de la ureosa 187 b) Pseudomonadaceae.*" b) Correlacién, 1. 100 %,* 97.2 %P 90,2 %2! 90%? complementarias.® 2. Falsos negativos: ** Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. 3. Falsos positivos: Klebsiella.** Borchardt y Weaver y col.® observaron que la reacci6n de la tira era mas sensible que el medio de Christensen; sin embargo Bla- zevic y col2 hallaron que la primera era menos sensible. Matsen y Sherris® reeo- miendan que se utilicen tanto tiras de ureasa y fenilalanina para la identificacién presuntiva de especies de Proteus (ureasa positivas, fenilalanina positivas) B) Tabletas para la reaceién de la ureasa de Key 1. Fabricante: Key Scientific Products Company. Formula de Christensen. Resultados dentro de las 6 a 12 h de incubacion. Método: seguir fabricante. * »K las indicaciones del C) Discos de urea, Fabricante: Difco Laboratories. Resultados dentro de 1 a 4 h de neubacibn. 3. Método: seguir las indicaciones del fabricante. ta VII. PRECAUCIONES A) Caldo de urea de Stuart. 1. El elevado sistema buffer oculta la actividad ureasa en organismos que son positivos retardados; por lo tanto, se destina este medio tinicamente para la deieccién de la actividad ureasa en todas las especies de Proteus.” 2. El Proteus morganii es un hidrolizador lento de la urea’ y después de 24h de incubacién la reaccién puede mostrar apenas un color rosado muy piilido. Cuando haya dudas en cuanto al resultado, compararlo con un tbo de medio no inoculado 0 volver a Incubar durante otras 24h. El P. morganié requiere por lo general apro-188 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias Cuadro 28.1 Reacciones pH ” Pevioto de incubacin hs 6: a 9 2-9 1 Todas las especies de Prot. ximadamente 36 h de incubacién 5. Pueden producirse resultados falsa- para que dé una reaccién ureasa mente negativos si la cantidad de Intensamente positiva.* NH formado es tan escasa que no La reaccién de la ureasa intensa- puede cambiar la concentracién del mente positiva para las especies de ton hidrégeno del elevado sistema Proteus se produce cuando el pH llega buffer y no puede alcanzar un pH a 81 o mas Existen_ variaciones alcalino para hacer que el indicador en la reaccién del pH segiin el rojo de fenol indique un cambio de periodo de incubacién y la especie color en el medio. de Proteus en estudio (véase el cuadro 28-1). Agar urea de Christensen. El Proteus vulgaris y el Proteus mirabilis daran una reaccién ureasa 1. Las especies de Proteus vuelyen alea- positiva (pH: 8,1) después de aproxi- 10 (rojo rosado) el medio de Chris- madamente 8 h de incubacin. El tensen poco después de la inoculacién. Proteus retigeri ataca rapidamente a la Para que los resultados sean vilidos urea, dando un resultado. positive para la deteccién de especies de en unas 12 h, El P. morganii requiere Proteus, deben ser leidos dentro del aproximadamente 36 h de incubacion intervalo de las primeras 2 a 6 h de para que se produzca una reaccién incubacién. El Citrobacter freundii y ureasa fuertemente positiva™ la Klebsiella pneumoniae pueden con- 38. Pueden producirse variaciones en el vertir el agar urea de Christensen PH de las reacciones positivas debido dentro de las 24 a 48 h. Este medio a las diferencias en el tamaiio del detecta la actividad ureasa rapida inéculo utilizado, o a diferencias en de las especies de Proteus tinicamente. la velocidad de actividad ureasa de las 2. El medio de urea de Christensen diferentes cepas de Proteus: Aumentando el indculo de una suspension bacteriana en solucién fisiologica de Proteus, de 0,01 a 0,1 ml, disminuye el tiempo necesario para alcanzar un pH de 8,1; sin ‘embargo, un indculomasdenso no provoca mayor aceleracién. El inéculo tipo aceptado es de 0,1 ml, lo que dar un resultado positive aproximadamente 3 h antes que si se usa un indeulo de 0,01 ml? 4. El volumen de sustrato empleado yfo la temperatura de incubacion pueden alterar la velocidad de pro- duccién de ureasa por la especie de Proteus.” Utilizando un inéculo constante, y variando el volumen del medio por tubo, de 15 a3 y de 45 a ml, Stuart y_ col. demostraron que el tiempo necesario para que se produjera una reaccién positiva aumentaba con el volumen. El minimo aceptable de medio por tubo, para una interpretacién exacta. es de 1,5 mi no se usa para determinar la velo: Gidad absoluta de actividad ureasa, Muchos organismos ureasa_ positives que no son Proteus pueden hidrolizar la urea dentro de las 24 hy seguir después descomponiendo lentamente la urea. Esto se manifiesta por el color alcalino que penetra por todo el medio, tanto en el pico de flauta como en la capa profunda, Esta nue degradacién de’ la urea puede ser debida a la falta de tolerancia de algunos organismos al aumento del pH alcalino, lo que da como resultado consiguiente _disminuc idadt ureasa.?10. 11 12, 13, M4 Reaccién de fa ureasa 189 BIBLIOGRAFIA BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, ath ed., Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi. sion of Becton, Dickinson and Com- pany, 1968, p. 154. Blazevic, D. J., Schreckenberger, P. C.. and Matsen, J. M. (1973) Evaluation of the PathoTec "Rapid I-D” system. Appl. Microbiol, 26, 83% Borchardt, K. A. 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A) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros; Klebsiella pneumoniae (+) y Ente robacter (generalmente +) de Escherichia coli (—). B) Ayudar a la diferenciacién en esped Klebsiella pneumoniae (+) de K. o2aenae (~) y K. rhinascheromatis (—)- C) Ayudar a la identificacion de: 1. Enterobacter haf (generalmente +). 2. Yersinia enterocolitica: 25° C (+), 37°C ae ie? 25° C (4); 87°C ILL. BASES BIOQUIMICAS jon de Voges-Proskauer (VP) se en la deteccién del acetilmetitcarbinol {acetoina), un producto final neutro derivado del metabolismo de la ghucosa. Esta es metabolizada en dcido piruvico, intermediario clave en la glucélisis, A partir del acido pirdivico, una bacteria puede seguir muchas vias. La produccidn de acetoina es uno de los ciclos para la degradacién de la glucosa en las bacterias.* La reaccion de Voges-Proskauer para la acetoina se usa sobre todo para separar a la E coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter, aun cuando otros miembros de las Enterobacte- riaceae son capaces de producir una reacci6n de VP positiva. Las Enterobacteriaceae se clasifican caracteristicamente como fermentadoras de dcidos mixtos 0 del dcido formico, Jo cual indica que sus productos terminales jor la fermentacién de la glucosa son acidos Acido formico, acido acético, Acido succinico, alcohol etilico, hidrégeno y anhidrido carbé- nico, Acido ltetico i Dxalacetato—+ Acidosuccinico cnvima Axa Acido acético Acetilovenzima A
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