VILNIAUS KOLEGIJA

SVEIKATOS PRIEŽIŪROS FAKULTETAS

Studijų programa BIOMEDICININĖ DIAGNOSTIKA I kursas

Citologinių ir histologinių preparatų gamyba

Savarankiškas darbas

Vilnius 2010
 ĮPRASTINIO CITOLOGINIO TEPINĖLIO PARUOŠIMO
BŪDAI

PAP TYRIMAS
Citologinis gimdos kaklelio tyrimas parodo, ar nėra pakitusių ląstelių,
kurios vėliau gali išsivystyti į vėžį. Sutrumpintai šis tyrimas vadinamas PAP
testu, PAP tepinėliu arba citologiniu tyrimu.

• Siekiant išvengti Pap tepinėlio užteršimo krauju, Pap tyrimas atliekamas

praėjus 2 savaitėms nuo paskutinės mėnesinių dienos (optimaliausia 10-20
mėnesinių ciklo dieną).
• Moteris neturi naudoti tamponų, intravagininių preparatų, vengti lytinių
santykių ir neplauti makšties 48 val. prieš Pap tyrimą.
• Tepinėlis tinka tyrimui, kai jame yra egzo ir endocervikinės gimdos
kaklelio srities medžiagos.
• Medžiaga tyrimui yra imama prieš acto rūgšties ir liugolio panaudojimą.
• Vatos tamponu švelniai nusausinamas gleivių ir paviršinio eksudato
perteklius.
• Makšties skėtiklis gali būti suvilgytas tik šiltu vandeniu, kai yra imama
citologinė medžiaga.

PAP TEPINĖLIO CITOLOGINĖS MEDŽIAGOS PAĖMIMAS

A. Tepinėlio paruošimas naudojant mentelę ir

šepetėlį

1. Paženklinamas objektinis stiklelis: paprastu pieštuku objektinio stiklelio

šlifuotoje dalyje užrašoma ligonio pavardė ir vardas.
2. Kai medžiaga imama mentele ir šepetėliu,pirma naudojama mentelė.
3. Ilgesnis mentelės galas įvedamas į gimdos kaklelio žiotis.
4. Mentelė sukama vieną kartą visu gimdos kaklelio paviršiumi.
5. Gauta medžiaga braukiamuoju judesiu paskleidžiama vienoje objektinio
stiklelio dalyje ir nedelsiant fiksuojama.
 Vardas Vardas
Pavardė Pavardė

6. Svarbu, kad citologinis fiksatorius nepatektų į priešingą stiklelio dalį,

todėl citologiniu fiksatoriumi fiksuojama tik ta stiklelio pusė, kurioje yra
uždėta citologinė medžiaga.
7. Vėliau naudojamas šepetėlis. Jis kišamas į endocervikinį kanalą, kad
būtų matomi galiniai jo šereliai.
Per giliai įkištas šepetėlis paima apatinio gimdos kūno segmento liaukinių
ląstelių.
8. Šepetėlis švelniai pasukamas 1/4 gimdos kaklelio kanalo paviršiumi, nes
kraštiniai šepetėlio šereliai kontaktuoja su visu gimdos kaklelio kanalo
paviršiumi. Sukant šepetėlį visu gimdos kaklelio kanalu
sukeliamas kraujavimas, vėliau uždegimai.
9. Gauta medžiaga nuo šepetėlio piešiamuoju judesiu paskleidžiama
priešingoje stiklelio dalyje ir nedelsiant fiksuojama.
Vardas Vardas
Pavardė Pavardė

10. Taip pat tepinėlį galima pagaminti ir paeiliui vieną po kitos

paskleidžiant medžiagą per visą objektinį stiklelį ir tuomet užfiksuoti.

B. Tepinėlio paruošimas naudojant šluotelę

1. Paženklinamas objektinis stiklelis: paprastu pieštuku objektinio stiklelio

šlifuotoje dalyje užrašoma
ligonio pavardė ir vardas.
2. Ilgieji šluotelės šereliai įvedami į endocervikinį kanalą taip, kad šluotelės
trumpieji
šereliai kontaktuotų su išorine gimdos kaklelio dalimi.
3. Šluotelė sukama 3-5 kartus laikrodžio rodyklės kryptimi.
4. Paimta medžiaga piešiamuoju judesiu paskleidžiama nuo abiejų šluotelės
pusių ir nedelsiant
fiksuojama.
 Vardas
Pavardė

.
TEPINĖLIŲ FIKSAVIMAS

Paruoštas tepinėlis nedelsiant fiksuojamas vienu iš šių metodų:

• Arozoliniu fiksatoriumi–purškiama iš 25-30 cm atstumo (2-3
paspaudimai). Palaukiama, kol nudžius.
• 10-15 min. tepinėlis merkiamas į 96° etilo alkohol į.
• Fiksatoriumi, kurio sudėtyje yra polietilenglikolio (ant tepinėlio
užlašinama 6-7 lašai pasirinkto tirpalo).

Tepinėlio kokybę dažnai nulemia skubi fiksacija per kelias sekundes.

Džiuvimo ore artefaktai, laiku nefiksavus tepinėlio deformuoja ląsteles ir
sunkina jų interpretaciją.

TEPINĖLIŲ DAŽYMAS

Gimdos kaklelio ir makšties citologiniai tepinėliai yra dažomi

Papanicolaou b ūdu . Visų dažų dažomosios savybės patikrinamos prieš
pradedant kasdieninį darbą.
Tepinėlio nusidažymo rezultatai:
1. L ąsteli ų citoplazma (EA-50 ir oranžinis-G tirpalas):

a) Plokščiojo epitelio paviršinių ir tarpinių sluoksnių ląstelių citoplazma-

skaisčios rožinės arba žalios spalvos.
b) Liaukinio epitelio ląstelių citoplazma blyškios žalios ar mėlynai-žalios
spalvos.
c) Paryškėjusių branduolėlių spalva rožinė ir raudona.
d) Ląstelių citoplazma permatoma (tame tarpe ir parabazinio sluoksnio bei
metaplazavusių plokščiojo epitelio ląstelių.
e) Normaliame tepinėlyje nėra oranžinės spalvos. Tokia spalva nusidažo
paviršinės suragėjusios plokščiojo epitelio ląstelės.
f) Pilnai ragėjančio plokščiojo epitelio ląstelės nusidažo skaisčia oranžine
spalva.
2. L ąsteli ų branduolys (Hematoksilino dažai):

a) Branduoliai nusidažo nuo mėlynos iki tamsiai purpurinės spalvos.

b) Branduolio kontūras ryškus ir aiškus, jis kontrastuoja su citoplazma.
c) X-chromatino kūneliai aiškiai matomi, jie su ryškiu kontūru.
d) Normalių vezikulinių branduolių parachromatinas-švelnus.
e) Neutrofilinių leukocitų branduolių sąsmaukos-aiškiai matosi.

MIKROSKOPINIS TYRIMAS

a) Patikrinama ar sutampa Pap tepinėlio ir siuntimo tirti blanko tyrimo

registracijos numeriai.
b) Mikroskopinis tyrimas atliekamas pasitelkus vidutinio padidinimo
mikroskopo objektyvą (10 x).
c) Tepinėlis mikroskopuojamas nuosekliai vertikalia ar horizontalia
kryptimi (pasirinktinai) ir atidžiai
apžiūrimas kiekvienas regos laukas.
d) Rekomenduojama dubliuoti, t.y. pakartotinai apžiūrėti regos laukų
kraštus.
e) Mikroskopuojamas visas tepinėlis.
f) Kai aptinkama pakitusių ląstelių, tuomet mikroskopuojama pasitelkus
didesnius objektyvo padidinimus (40 x; 60 x).

KOKYBĖS KONTROLĖ

• Gimdos kaklelio citologiniai preparatai archyvuojami ne mažiau nei 5

metus.
• Gimdos kaklelio citologinių tyrimų diagnozes ( reparaciniai, radiaciniai
pakitimai, atipinių plokščiojo epitelio ląstelių (ASC), endometriumo
ląstelių, atipinių liaukinių ląstelių (AGC), nežymių plokščialąstelinių
intraepitelinių pakitimų (LSIL), žymių plokščialąstelinių intraepitelinių
pakitimų
(HSIL), adenokarcinoma in situ – (AIS), įvairios karcinomos) pasirašo
gydytojas patologas.
• Atliekama citologinių tyrimų statistinė analizė, citologinių ir
histologinių gimdos kaklelio tyrimų koreliacija (palyginimas).
• Dalyvaujama išorinėse mikroskopinio tyrimo kokybės gerinimo
programose.
Kokie yra paprasto tepinėlio trūkumai? Ar galima pagerinti jo
kokybę?
Taip, tepinėlio kokybę galima pagerinti. Paprastame tepinėlyje ląstelės
dažnai yra susigrūdusios, jos persidengia, dalis ląstelių būna sutraiškytos,
todėl jų visų negalima apžiūrėti. Dažnai paprastame tepinėlyje būna gausu
pašalinių priemaišų, uždegimo, gleivių, kraujo. Mokslininkai nustatė, kad ne
visos nuo instrumento paimtos ląstelės gaminant tepinėlį patenka ant
stiklelio. Dalis ląstelių tiesiog išmetama su instrumentu. THINPREP® PAP
buvo sukurtas siekiant pagerinti paprasto tepinėlio savybes.

THINPREP® PAP skystoji terpė

Pastaruoju metu jau ruošiami ir citologiniai skystų terpių preparatai –

ląstelės, paimtos nuo gimdos kaklelio, dedamos į skystą terpę. Tiriant tokius
preparatus įmanoma aptikti ne tik ląstelių pokyčius, bet kartu iš tos pačios
medžiagos nustatyti ir ŽPV DNR.

Kuo skiriasi THINPREP® PAP tyrimas nuo paprasto tepinėlio?

Ląstelės nuo gimdos kaklelio paviršiaus surenkamos tokiu pačiu būdu.

Skiriasi ląstelių paruošimo tirti būdas. Vietoj paprasto tepinėlio ruošimo
gydytojas instrumentą su ląstelėmis nuplauna į specialų ląsteles išsaugantį
tirpalą ir visos ląstelės lengvai patenka į skystį. Skystyje esančias ląsteles
surenka ir paruošia vianasluoksnių ląstelių preparatą laboratorijoje esantis
kompiuterinis įrenginys.Taip paruoštos gimdos kaklelio ląstelės yra gerai
apžiūrimos tyrėjo mikroskopu.

Kokio amžiaus moterys turi atlikti THINPREP® PAP tyrimą?

Kiekviena moteris nuo 18 m. ar nuo pirmųjų lytinių santykių turi reguliariai

tikrintis ir atlikti šį tyrimą kas 1-2 metus.

Ar yra įrodyta, kad THINPREP® PAP tyrimas yra gerokai efektyvesnis

už paprastą tepinėlį?

THINPREP® PAP tyrimas buvo išrastas analizuojant paprasto tepinėlio

trūkumus. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad atliekant THINPREP® PAP
randama daugiau ikivėžinių gimdos kaklelio pakitimų. Papildomai Iš skystos
terpės likusios po tyrimo galima nustatyti žmogaus papilomos virusą -
pagrindinį ikivėžinių pakitimų sukėlėją.

ThinPrep® PAP tyrimo privalumai

Daugiau nei 10 metų buvo vertinamas ThinPrep tyrimo efektyvumas. Atlikta

170 nepriklausomų studijų, kurių rezultatai buvo publikuoti medicininėje
literatūroje. Juose įrodyti šie privalumai:

 tikslesnė diagnozė;
 aptinkama 18 proc. daugiau ikivėžinių pakitimų nei įprastiniu metodu;
 nėra netinkamų tyrimų;
 sumažėja neapibrėžtų paribinių ASC diagnozių procentas;
 sumažėja klaidingai neigiamų atvejų skaičius;
 retesnis patikros intervalas (įprastai - kiekvienais metais, su ThinPrep® -
kas 2 metus)
 net 39 proc. sumažinamas klaidingai neigiamų tyrimų skaičius;
 atsiperkamumas.

Paprastas PAP tepinėlis ar ThinPrep® PAP tyrimas

Paprasto tepinėlio paruošimas

Ruošiant paprastą tepinėlį, ne visos ląstelės nuo instrumento patenka

(paskleidžiamos) ant stiklelio. Pakitusios displazinės ląstelės gali nepatekti
ant stiklelio, jos su instrumentu išmetamos prieš tai neištyrus mikroskopu.
Paprastame tepinėlyje ląstelės gali būti užteptos storu sluoksniu, ar
pasislėpusios tarp kraujo ir uždegimo, taip pat nepakankamai fiksuotos,
todėl jos blogai nusidažo. Tiriant tokias ląsteles mikroskopu paprastai
ląstelės per mikroskopą yra neapžiūrimos, ar net nepastebimos.

ThinPrep® PAP preparato paruošimas

90 proc. visų Jungtinėse Amerikos Valstijose atliekamų tyrimų atliekama

ThinPrep metodu. Skirtingai nei paskleidžiant ląsteles ant objektinio
stiklelio, ThinPrep® PAP metodu ląstelės nuo instrumento išskalaujamos į
transportinę terpę, tai konservuoja ląsteles, preparatuose ląstelės visuomet
gražiai atrodo.
1.3. (Kadangi Valstybinis patologijos centras neturėjo medžiagos Pap
dažymo būdui, nudažėme kraujo audinį Giemzos būdu.)

Gie - GIEMSA DAZYMO METODAS (HEMACOLOR)

Tikslas: išryškinti ore fiksuotu tepinėliu neepitelinius elementus, esant

neepiteliniu naviku įtarimui, diferencijuotai išryškinti kraujo gamybos
organų retikulinio jung. audinio ląsteles.

Principas: molekulines sąveikos tarp eozino Y ir azuro B - DNR komplekso

dėka ląstelių branduoliai nusidažo būdinga purpurine/violetine spalva. Abu
dažai sudaro kompleksą vėliau.

Kokybės kontrolė: dažymo intensyvumas priklauso nuo azuro B kiekio ir

nuo azuro B/eozino Y santykio. Dažymo rezultatus gali įtakoti keli faktoriai,
tokie kaip dažų tirpalų ir buferinio tirpalo pH, fiksacija, dažymo laikas.

Tiriamoji medžiaga: ore fikuoti tepinėliai, trepanobioptatų antspaudai.

Reagentai: metanolis - CAS Nr. 67-56-1,hemacolor tirpalas 2- CAS

Nr.netaikomas, Hemacolor tirpalas 3- CAS Nr. netaikomas, darbinis
fosfatinis buferis pagal Veisa,pH 7.2 (fosfatinis buferis)- cheminių reagentų
ruošimo kab.,Ksilenas,izomerų mišinys(ksilenas)- CAS Nr. 1330-20-7,
permanentinė dengiamoji medžiaga- CAS Nr. Netaikomas.
1.4. Histologinio mikropreparato paruošimo schema.

Fiksacija
(esant reikalui-dekalcinacija)
Tai pirmoji ir kritiškiausia parafininės audinių paruošimo technologijos
dalis.Kokybė priklauso nuo kelių veiksnių. Fiksuojamosios medžiagos tūris
turi būti pakankamas, mėginio matmuo,skvarba(didžiausia skvarba pasižymi
formaldehidas), fiksavimo pradžia ir trukmė(24val), temperatūra (18-24°C)
bei ph(6-8). Universalus fiksatorius yra 10% buferinis formalino tirpalas.
Fiksatoriai užkerta kelią ląstelių baltymų autolizei ir bakterijų bei pelėsių
ardomajam poveikiui,sutvirtina audinius,tirpius baltymus paverčia netirpiais,
dėl to visas audinys tampa mechaniškai tvirtas.Dekalcinacija tai mineralinių
medžiagų pašalinimas iš kaulinio audinio.

Dehidratacija
Jos metu iš audinio pašalinamas fiksatorius ir vanduo, audinys prisotinamas
dehidratantu. Audinys panardinamas į vis didėjančios koncentracijos etilo
alkoholį, tol, kol įvyks visiška dehidratacija.

Skaidrinimas
Iš audinio išstumiamas dehidratantas, jis pakeičiamas tirpalu, puikiai
sąveikaujančiu su impregnuojamąja medžiaga. Ksilolas- skaidrinamoji
medžiaga, jis palengvina parafino infiltraciją į audinius.

Impregnacija
Išskaidrintas audinys keletui valandų įmerkiamas į skystą maždaug 60°C
parafiną.
 Audinių paruošimo protokolai
Fiksuoti audiniai mikroskopinio tyrimo metu pjaustomi 2-3mm storio
gabalėliais ir dedami į histologines liejimo kasetes. Histokasetės sudedamos
į procesoriaus kasečių krepšelius, krepšeliai- į krepšelių laikiklį, laikiklis- į
procesoriaus reakcijų talpą.

Parafino blokų formavimas

Pasibaigus automatiniam audinių paruošimo etapui procesoriuje, mėginiai
kartu su krepšeliais perkeliami į blokų formavimo centre esančią mėginių
laikymo talpą.Svarbu, kad mėginiai iš šiltos procesoriaus reagentų talpos
būtų perkelti į šiltą parafiną.Mėginių blokai formuojami eilės
tvarka.Atidarius histokasetės dangtelį,joje esantis mėginys dedamas į šiltą
blokavimo formelę.Kad visas mėginio paviršius išsidėstytų vienoje
plokštumoje, mėginys pincetu prispaudžiamas prie kasetės dugno ir truputį
pašaldomas.Vėliau parafino dozatoriumi blokavimo formelės tūris visiškai
užpildomas parafinu šiltu, mėginys uždengiamas ta pačia histokasete.
Formelė perkeliama ant šaldymo plokštės, ir laikoma tol, kol sustings
parafinas.Atvėsę parafino blokai lengvai išimami iš blokavimo formelių ir
papildomai atvėsinti pjaunami plonais pjūviais.

Parafinini ų pj ūvi ų ruošimas

Ploni parafininiai pjūviai pjaunami mikrotomu. Papildomos priemonės yra :
parafino blokų šaldymo plokštė( prieš mėginių pjovimą parafino blokai
atvėsinami, kad įgytų reikiamą mėginio tvirtumą, kuris ypač svarbus
blokus pjaunant plonais pjūviais.Mikrotominiai peiliai,termostatinė vandens
vonelė( ji skirta atpjautiems pjūviams tiesinti. Atpjauti pjūviai atsargiai
pernešami ir paguldomi į šiltą distiliuotą vandenį termostatinėje vandens
vonelėje.), objektiniai stikleliai( pjūviai iš vonelės perkeliami ant jų.),
kaitinimo plokštės (tam, kad parafininiai pjūviai dažymo metu nenukristų
nuo objektinių stiklelių, būtina gerai išdžiovinti.), priemonės pjūviams
pernešti (šepetėliai,lazdelės, adatėlės, pincetai.)
 Parafinini ų pj ūvi ų pjovimas mikrotomais
Atvėsintas mėginio blokas įdedamas į mikrotome esantį mėginio
laikiklį.Dideli mėginių blokai pradedami pjauti 20-50 mikronų storio
pjovimo žingsniu ir pjaunami iki visiško tiriamosios medžiagos išryškėjimo.
Toliau mėginiai pjaunami 2-3 mikronų storio pjovimo žingsniu formuojant
parafino juostą. Metaline adatėle, šepetėliu ar lazdele atskirti
reprezentatyvūs pjūviai eilės tvarka nesuardžius pjūvių pjovimo sekos,
išdėstomi ant objektinių stiklelių po vieną kiekvienam paskirtam dažymo
metodui.

Dažymas
Kad ląstelės ar audinio struktūros taptų kontrastingos ir matomos,
bendriausiai informacijai gauti naudojamas įprastas histologinis dažymo
metodas-hematoksilino eozino reakcija. Šis metodas leidžia paprastai ir
aiškiai atskirti ląstelių struktūras.Naudojant specialius dažymo būdus galima
išryškinti ląstelių organoidus, skaidulas, tarpląstelinę medžiagą.

Paruoštų objektinių stiklelių uždengimas

Norint ilgai išsaugoti paruoštą, ant objektinio stikliuko esantį nudažytą
audinio pjūvį, reikia jį padengti polistireno dengiamuoju stikliuku.
Dengiamasis stikliukas apsaugo audinį nuo išdžiūvimo ir kitokių pažeidimų.
Dengiamasis stikliukas klijuojamas įvairiomis lipniomis medžiagomis. Tos
medžiagos šviesos lūžio rodiklis atitinka stiklo lūžio rodiklį, todėl jos
netrugdo tirti preparato.

1.5
Hematoksilino-eozino dažymo metodas yra plačiausiai palitęs
histologinis audinių tyrimo būdas.Jis gana paprastas, universalus ir labai
išsamus,aiškiai atskleidžiantis pačias įvairiausias audinių struktūras.

Taikant HE dažymo metodą, hematoksilino dažų komponentas nudažo

ląstelių branduolius puikiai išryškindamas vidines branduolio struktūras, o
eozino dažai nudažo ląstelių citoplazmą ir įvairiais atspalviais išryškina
daugelį jungiamojo audinio skaidulų. Reakcijos principas paprastas-baziniai
hematoksilino dažai jungiasi su ląstelių branduoliais ir kitomis bazofilinėmis
ląstelių struktūromis, nudažydami jas mėlyna spalva. Rūgštiniai eozino dažai
jungiasi su acidofilinėmis-eozinofilinėmis ląstelių struktūromis.,
nudažydami jas rožine-raudonos spalvos atspalviais.

HE dažymo metodas, taikomas šaldomiesiems ir parafininiams pjūviams

dažyti, skiriasi pradiniu šios reakcijos etapu. Šaldomieji pjūviai trumpai
fiksuoti, iškart dažomi hematoksilino dažais. Tuo tarpu dažant parafininius
pjūvius, HE dažymas,pradedamas pjūvių deparafinavimo-parafino, esančio
pjūvyje, pašalinimo-procedūra.

Pjūvių deparafinavimas
1. Ksilenas-3min.
2. Ksilenas-3min.
Reakcijos metu naudojami vandeniniai tirpalai, todėl pašalinus parafiną
audinius būtina prisotinti vandeniu- hidratuoti audinių pjūvius.
Rekomenduojama pradėti bevandeniu izopropilo alkoholiu. Vėliau
laipsniškai mažinami etilo alkoholio tirpalų koncentracija.

Pjūvių hidratavimas:
3. Izopropilo alkoholis-1min
4. Izopropilo alkoholis-1min
5. 96% etilo alkoholis-1min
6. 96% etilo alkoholis-1min
Prieš dažymą hematoksilino dažais pjūviai skalaujami vandentiekio
vandeniu, kuris pašalina audiniuose esantį alkoholį.

Pjūvių dažymas hematoksilino dažais:

7. Kambario temperatūros tekantis vanduo-1min.
8. Mayer hematoksilinas-5min.
Pjūvių melsvinimas:
9. 0,9% amonio vanduo-1min.
 10.Eozino tirpalas (alkoholinis)-1min.
11.
Pjūvių dažymas eozino dažais:
12.96% etilo alkoholis-1min.
13.Izopropilo alkoholis-1min.
Nudažius pjūvius eozino dažais baigiamas HE dažymo metodo procesas.
Dažyti mėginiai dažniausiai uždengiami dengiamaisiais stikleliais, naudojant
dengiamąją terpę.

Pjūvių dehidratavimas:
14.96% etilo alkoholis-1min.
15.Izopropilo alkoholis-1min.
Dehidratuoti pjūviai skaidrinami-pjūviuose santis alkoholis pakeičiamas
skaidrinamosiomis medžiagomis, kurios kontaktuoja su natūralios ar
sintetinės dervos dengiamosiomis terpėmis.

Pjūvių skaidrinimas:
16.Ksilenas-2min.
17.Ksilenas-2min.
18.Ksilenas-2min.
Nuskaidrinti pj8viai dengiami dengiamaisiais stikleliais, naudojant ilgalaikio
saugojimo dengiamąją terpę.

Rezultatas:
Branduoliai ir kitos bazofilinės struktūros nudažomos mėlyna spalva.
Eritrocitai, eozinofilinės granulės, citoplazma ir kitos acidofilinės struktūros
nudažomos nuo skaisčiai rožinės iki raudonos spalvos.

Literatūros sąrašas:
1)Žalgevičienė V. Bendrosios kistologijos pradmenys, V., 2005
2)Laurinavičienė A. Histologinių technologijų vadovas, V., 2007
3) http://nmc.lt/lt/citopatologiniai/203
4) www.vpc.lt