World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154

https://doi.org/10.1007/s11274-018-2518-4

Improved bioethanol production using CRISPR/Cas9 to disrupt

the ADH2 gene in Saccharomyces cerevisiae
Ting Xue1,2,3 · Kui Liu1,2 · Duo Chen3 · Xue Yuan1,2 · Jingping Fang1,2 · Hansong Yan4 · Luqiang Huang1,2 ·
Youqiang Chen1,2,3 · Wenjin He1,2,3

Received: 3 May 2018 / Accepted: 11 August 2018

© Springer Nature B.V. 2018

Abstract
Bioethanol, as a form of renewable and clean energy, has become increasingly important to the energy supply. One major
obstacle in ethanol production is developing a high-capacity system. Existing approaches for regulating the ethanol
production pathway are relatively insufficient, with nonspecific genetic manipulation. Here, we used CRISPR/Cas9
technology to disrupt the alcohol dehydrogenase (ADH) 2 gene via complete deletion of the gene and introduction of a
frameshift mutation in the ADH2 locus. Sequencing demonstrated the accurate knockout of the target gene with 91.4% and
near 100% targeting efficiency. We also utilized genome resequencing to validate the mutations in the ADH2 mutants
targeted by various singleguide RNAs. This extensive analysis indicated the mutations in the CRISPR/Cas9-engineered
strains were homozygous. We applied the engineered Saccharomyces cerevisiae strains for bioethanol production. Results
showed that the ethanol yield improved by up to 74.7% compared with the yield obtained using the native strain. This work
illustrates the applicability of this highly efficient and specific genome engineering approach to promote the improvement
of bioethanol production in S. cerevisiae via metabolic engineering. Importantly, this study is the first report of the disruption
of a target gene, ADH2, in S. cerevisiae using CRISPR/Cas9 technology to improve bioethanol yield.

Keywords CRISPR/Cas9 · Saccharomyces cerevisiae · Bioethanol production · ADH2 · Metabolic engineering

Ting Xue and Kui Liu have contributed equally to this work. Abbreviations
CRISPR Clustered regularly interspaced short
Electronic supplementary material The online version of this article
(https ://doi.org/10.1007/s1127 4-018-2518-4) contains
palindromic repeat PAM Protospacer adjacent motif
supplementary material, which is available to authorized users. sgRNA Single-guide RNA DSB Double-strand break
OD600 Optical density at 600 nm
PCR Polymerase chain reaction
* Youqiang Chen
459224082@qq.com ADH A lcohol dehydrogenase
GC G as chromatography
* Wenjin He biohwj@fjnu.edu.cn
WT W ild type
1
The Public Service Platform for Industrialization Development TALEN T ranscription activator-like effector nuclease
Technology of Marine Biological Medicine and Product of State DSB Double strand break
Oceanic Administration, Fujian Normal University, Fuzhou HR H omologous recombination
350117, China
2
Center of Engineering Technology Research for Microalgae
Germplasm Improvement of Fujian, Southern Institute of
Oceanography, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China Introduction
3
Key Laboratory of Developmental and Neural Biology,
College of Life Sciences, Fujian Normal University,
Los combustibles fósiles se están agotando continuamente,
Fuzhou 350117, China y conducen problemas mundiales como la contaminación
4
FAFU and UIUC-SIB Joint Center for Genomics and
ambiental, la pérdida de la biodiversidad y el calentamiento
Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry global (Zabed et al. 2017; Rastogi y Shrivastava 2017).
University, Fuzhou 350002, China Estos factores han aumentado la demanda de una fuente de
energía sostenible, renovable y ecológica. (Zabed et al.
2017). El bioetanol, como biocombustible limpio, Ha sido

Vol.:(0123456789) 1
3
154 Page 2 of 14 World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
reconocida como la alternativa más prometedora.Al
Combustibles fósil en muchos países (Manochio et al.
2017). Ofrece Varias ventajas sobre la gasolina en la
reducción de efecto invernadero. Emisiones de gases y
contaminación ambiental (Balat y Balat 2009). Sin embargo,
la producción tradicional de bioetanol tiene desventajas De
bajo rendimiento, bajo índice de conversión y alto costo. (Ye
et al. 2016). Saccharomyces cerevisiae juega un importante
Papel en la producción de bioetanol debido a su alto
contenido de etanol. Tolerancia, antecedentes genéticos
claros y capacidad de fermentar un amplia gama de azúcares
(Demeke et al. 2013). Sin embargo, hay algunos problemas
en la producción de bioetanol durante fermentación de
azúcar cuando se utiliza una levadura de tipo salvaje (WT).
Un obstáculo son los subproductos no deseados, incluido el
glicerol y ácidos orgánicos (He et al. 2014). Esto puede
llevar a una baja tasa de conversión y bajo rendimiento en la
producción industrial de etanol.
Por lo tanto, es crítico modificar la regulación metabólica en
S. cerevisiae para reducir la acumulación de los principales
subproductos y así mejorar la producción de bioetanol.
Las deshidrogenasas de alcohol (ADH) desempeñan un
papel fundamental en metabolismo del azúcar (de smidt et
al. 2008). Constituyen un gran familia de enzimas
responsables de la oxidación reversible de alcoholes a
aldehídos con la reducción concomitante de NAD + o
NADP + (de Smidt et al. 2008). A la fecha, siete se han
identificado isozimas ADH de S. cerevisiae y Caracterizado
(de Smidt et al. 2012). ADHII está codificado por el gen
ADH2, y su función principal es catalizar la conversión de
etanol a acetaldehído (Beier et al. 1985; Russell et al. 1983).
Pero la función de las otras ADHs puede ser opuestos, ya
que pueden catalizar la conversión de acetaldehído. al etanol
(de Smidt et al. 2012). Por lo tanto, puede ser posible
mejorar la producción de etanol por interferencia con la
función de ADHII. Hasta la fecha, mucha ingeniería
genética se han aplicado métodos para alterar la expresión.
del gen ADH2 en S. cerevisiae, incluyendo antisentido
técnicas (Ting et al. 2015), la recombinación Cre / LoxP
Sistema y transcripción activador similar a la nucleasa
efectora. (TALEN) (Ye et al. 2016). Tanto las técnicas
antisentido como los sistemas de recombinación Cre / LoxP
son sistemas basados en plásmidos.
Con inestabilidad significativa, alta heterogeneidad y
relativamente baja eficiencia. La tecnología TALEN es una
herramienta de edición de genes que ha sido utilizado con
éxito para apuntar a un sitio específico, a saber, una Región
de 17 pb en el gen ADH2. TALEN, sin embargo, requiere
programación cuidadosa (Boettcher y McManus 2015).
Un nuevo método de ingeniería genética que permite
Fácil programabilidad y es altamente específico y eficiente.
Por eso es importante para regular la expresión de ADH2.
13
en S. cerevisiae.
CRISPR / Cas9 ha experimentado un rápido desarrollo
durante los últimos años para la edición del genoma y ha
sido adoptado ampliamente en diferentes organismos para
manipular secuencias de ADN (Finnigan y Thorner 2016).
El uso de CRISPR / Cas9 proporciona una base para una
potente herramienta de ingeniería del genoma (DiCarlo et al.
2013). Muchas aplicaciones más recientes, como la
interrupción multiplex (Bao et al. 2015; Jakociunas et al.
2015a), multigene de integración (Finnigan y Thorner 2016;
Kang et al. 2016; Jakociunas et al. 2015b; Horwitz et al.
2015; Ronda et al. 2015; Jessop-Fabre et al. 2016; Sasano et
al. 2016) y otros aplicaciones interesantes (Tsarmpopoulos
et al. 2016; Biot-Pelletier y Martin 2016), han promovido el
desarrollo de los sistemas CRISPR / Cas9 como tecnologías
de edición del genoma.
El sistema CRISPR / Cas9 se considera más preciso y
más fácil de programar que la técnica de nucleasa con dedos
de zinc (ZFN) y técnicas TALEN (Chin et al. 2016). Sin
embargo,no hay ningún informe relacionado sobre el uso del
sistema CRISPR / Cas9 para la interrupción del gen ADH2
para mejorar el Rendimiento en la producción de bioetanol
en S. cerevisiae.
Aquí, utilizamos un sistema CRISPR / Cas9 para lograr
altamente la interrupción eficiente y precisa del gen ADH2
en S.cerevisiae, incluida la eliminación de todo el gen
ADH2 y la introducción de una mutación de desplazamiento
de marco en el gen ADH2 en el cromosoma de la levadura.
Los resultados de la secuenciación, RTqPCR, y el ensayo de
actividad ADHII indicó el nocaut del gen diana. En
consecuencia, los mutantes ADH2 produciran niveles de
bioetanol significativamente más altos que la cepa nativa.
Este estudio podría ampliar la aplicación de bioetanol y
promover el desarrollo de la tecnología CRISPR / Cas9 para
Ingeniería del genoma en levaduras.
Materiales y métodos
Cepas, plásmidos, medios y primers.
Se utilizó la cepa Y1H de S. cerevisiae (MATα ura3-52 his3-
200 ade2-101 trp1-901 leu2-3,112 gal4Δ gal80– met–
MEL1) en este estudio. Se usó Escherichia coli DH5α para
la clonación y propagación de plásmidos. Las cepas
recombinantes de E. coli se cultivaron en medio Luria-
Bertani (LB) a 37 ° C que contenía 100 µg / ml de
ampicilina. Las células de levadura se cultivaron en medio
YPDA (2% de peptona, 2% de glucosa, 1% de extracto de
levadura y 0,5% de adenina) antes de la transformación.
Después de la transformación, las células de levadura se
cultivaron en medio de eliminación de leucina completo
sintético (SC-leu, 0,67% de nitrógeno de levadura). base,
2% de glucosa, con los aminoácidos apropiados que carecen
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
de leucina) a 30 ° C. El medio de fermentación [17% p / v
sacarosa, 0,5% p / v
(NH4) 2SO4, 0.2% p / v KH2PO4, y 0.8% p / v de extracto
de levadura] se usó para fermentar las cepas de levadura para
producir etanol. Todos los cebadores utilizados en este
estudio se enumeran en el archivo complementario 1.
El plásmido pML107 (# 67639), que contiene Cas9 y un
casete de expresión de ARN de una guía (sgRNA), se
compró en el repositorio de AddGene (http: //www.addge
ne.org). El vector de clonación pMD-19T se compró en
Takara (Dalian, China).
Protocolo de clonación y selección de secuencias
guiada por CRISPR ‑ Cas9
Primero, analizamos el gen objetivo mediante PCR para
verificar su integridad, y luego se utilizó la herramienta de
diseño CRISPR (http: // CRISP R.dbcls .jp /) (Naito et al.
2015) para seleccionar secuencias de guía CRISPR únicas.
Se buscó una secuencia de 20 unidades junto con una
secuencia de motivo adyacente (PAM) protoespacial de
NGG (N 20 NGG) en ambas cadenas de la secuencia del gen
diana. De estos resultados, solo se consideraron las
posiciones de destaque resaltadas para su uso. Las
herramientas en línea para la clonación de secuencias de
ARN guiadas por CRISPR-Cas9 (http: // wyric kbioi
nfo2.smb.wsu.edu/CRISP R.html) también se utilizaron
para clonar secuencias de guía en el casete que expresa
ARNhc.
El plásmido ADN pML107 se preparó a partir de la cepa
ET12567 (ATCC) de dam-E. coli, y los plásmidos se
digirieron con SwaI (Takara) durante la noche a 30 ° C,
seguido de inactivación por calor durante 30 minutos a 65 °
C. Posteriormente, se añadió BclI (Takara) a la reacción de
digestión y se incubó durante 6 horas a 37 ° C. Los
plásmidos digeridos se purificaron utilizando un kit de
purificación de ADN universal (Tiangen Biotech, China). El
plásmido digerido se usó para clonar secuencias de guía de
20 mer específicas. El protocolo guía de clonación de ARN
se realizó como se describió anteriormente (Laughery et al.
2015).
Diseño de un donante de recombinación homóloga
(HR)
Para la interrupción de un solo sitio por CRISPR / Cas9, se
estudió la longitud óptima de un donante de alteración de la
FC como se describió anteriormente (Bao et al. 2015;
Sasano et al. 2016). Una secuencia donadora de 100 pb con
dos brazos de homología de 50 pb que flanquean el sitio de
Page 3 of 14 154
corte de Cas9 se diseñó mediante PCR solapada e incorporó
varias bases para la eliminación, incluida la secuencia PAM,
introduciendo así una mutación de cambio de marco después
de la FC (Bao et al. 2015). Para eliminar todo el gen ADH2
en el cromosoma de la levadura, se utilizaron dobles
sgRNAs para crear dos roturas de doble cadena (DSB) en el
locus genómico objetivo, y el fragmento donante estaba
flanqueado por brazos de homología de 798 pb y 778 pb.
Transformación de la levadura
La transformación del plásmido de Y1H (5 µg de cada
plásmido por transformación) para la edición del gen
CRISPR-Cas9 se realizó utilizando un método estándar de
ADN / PEG portador LiAc / SS (Gietz y Schiestl 2007).
Después de la transformación, las células se recuperaron en
1 ml de YPAD a 200 rpm y 30 ° C durante 2 h, y se colocaron
en placa 100 μl de 1 03 -3-cultivo celular diluido en medio
selectivo (SC-Leu). Las placas se incubaron durante 3 días
a 30ºC hasta que aparecieron colonias
Verificación de mutantes ADH2
Para confirmar la presencia de mutantes ADH2 después de
la transformación CRISPR-Cas9, se seleccionaron al azar
colonias para cada diana simple y doble de cada placa de
transformación. Para el análisis de secuencia, la extracción
de ADN genómico se realizó mediante un protocolo rápido
y de bajo costo (Looke et al. 2011). Se realizó una PCR para
amplificar cada locus ADH2 dirigido. Las regiones para loci
de objetivo simple y doble se amplificaron utilizando los
cebadores de genotipado ADH2-F / ADH2-R1 y O-1F / O-
2R, respectivamente. Los productos de PCR se purificaron
utilizando un kit de extracción de gel y limpieza de PCR
(TIANGEN BIOTECH, China) y se utilizaron como
plantillas para la secuenciación de ADN.
13
154 Page 4 of 14 World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
Extracción de ADN y secuenciación de próxima
generación
El ADN genómico de alta calidad (> 100 ng / µl, OD260 /
280 cerca de 1.8) se extrajo de varias cepas de levadura
utilizando el kit de ADN de levadura TIANamp
(TIANGEN Biotech, China) siguiendo las instrucciones del
fabricante. La secuenciación de ocho cepas mutadas de
levadura y la cepa WT Y1H se realizó en el FAFU y el
Centro Conjunto UIUC-SIB para Genómica y
Biotecnología en la Universidad de Agricultura y Bosques
de Fujian (FAFU). El ADN genómico de cada cepa se
cortó al azar hasta un tamaño medio de 500 pb utilizando
un ultrasonicador (Covaris M220). Para preparar la
biblioteca de resecuenciación, se utilizó un kit de
preparación de biblioteca Ultra DNA, NEBNext de
Illumina (New England BioLabs Inc.). Los fragmentos de
ADN se sometieron a una reparación de extremo, una cola
de A, una ligadura de adaptador, una selección de tamaño
de 400–500 pb y una amplificación por PCR durante más
de 12 ciclos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nueve cebadores de índice de 6 pb se vincularon a varias
muestras. Posteriormente, la concentración de ADN se
estimó con un fluorómetro Qubit 2.0 aplicando el kit de
ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen, Life Technologies,
Oregon, EE. UU.). Las nueve bibliotecas de ADN
resultantes con varios índices se secuenciaron en un solo
carril del Illumina HiSeq 2500 utilizando lecturas de 150 nt
de PE. Una vez completadas las reacciones de
secuenciación, se utilizó el análisis de Illumina (CASAVA
v1.8.2) para separar muestras de varias bibliotecas por su
índice molecular.
Alineación de extremo emparejado y llamada SNP
Las alineaciones se ejecutaron utilizando BWA (Burrows-
Wheeler Aligner) versión 0.7.15 (Li y Durbin 2009) con el
algoritmo BWA – MEM y la configuración predeterminada.
BWA – MEM está diseñado para lecturas en secuencia de
Illumina de 70 pb a 1 Mbp y se recomienda para consultas
de alta calidad, ya que es más rápido y más preciso. Las
lecturas de la cepa WT y ocho cepas mutadas se alinearon
independientemente con el genoma de referencia, a saber, el
genoma de levadura S288C lanzado más recientemente
(https: //downloads.yeastg eno me.org/sequen ce / S288C_
reference / genome _rele ases /). Las alineaciones se
generaron en formato SAM y se transformaron en formato
BAM. El paquete de herramientas de Picard (http: // broad
insti tute.githu b.io/picar d /) se utilizó para procesar los
resultados de alineación. Las secuencias de alineación se
reordenaron con el programa Picard SortSam y se marcaron
para duplicados de PCR con el programa Picard
MarkDuplicates. Para corregir desalineaciones debidas a la
13
presencia de indels, se aplicaron los programas GATK
(versión 3.6.0) (http: //www.broad insti tute.org/gatk/)
RealignerTargetCreator e IndelRealigner para identificar
pequeños intervalos sospechosos y realinear las lecturas
asignadas alrededor de los sitios de indel. Para cada archivo
bam realineado, las llamadas SNP se realizaron utilizando
los comandos "mplieup" y "bcftools" del paquete SAMtools
(versión 1.3.1) (Li et al. 2009). Los resultados de SNP se
guardaron en los archivos de formato de llamada variante
(VCF). En un archivo VCF de salida para organismos
diploides, el genotipo “0/0” representa homocigotos del
alelo de referencia, con “0/1” para los heterocigotos, “1/1”
para los homocigotos del alelo alternativo y “./” para
genotipos desconocidos. JBrowse (Skinner et al. 2009), un
explorador de genoma de código abierto, rápido y con todas
las funciones construido con JavaScript y HTML5, se utilizó
para visualizar los SNP e InDels en la web.
Aislamiento de ARN y PCR cuantitativa en tiempo
real.
El ARN total se extrajo de los mutantes nativos y ADH2
utilizando el kit de ARN de levadura E.Z.N.A.® (Omega
Biotek, EE. UU.) Según las instrucciones del fabricante. La
transcripción inversa se realizó con TransScript One-Step
gDNA Removal y cDNA Synthesis SuperMix (TransGen
Biotech, China) siguiendo el protocolo recomendado. Los
cebadores específicos ADH-F2 y ADH-R2 se combinaron
con cDNA y se utilizó 2 × TransStart Top Green SuperPix
qPCR, y se usó un Colorante de Referencia Pasivo (50x)
(TransGen Biotech, China) para amplificar un fragmento de
115 pb, con β-actina. como gen de referencia. La PCR
cuantitativa en tiempo real se realizó en un termociclador
(ABI StepOnePlus, EE. UU.). Cada reacción se realizó por
triplicado biológico. Los cebadores directos e inversos se
enumeran en S1. Los valores del ciclo de cuantificación (Cq)
se determinaron utilizando el software StepOne ™ v2.3. La
cuantificación relativa del gen objetivo se calculó como se
describe en otro lugar (Soni et al. 2008).
Producción de extracto enzimático y ensayo de
actividad ADH.
Las células de los mutantes nativos Y1H y ADH2 se
recogieron mediante centrifugación durante 4 minutos a
3000 xg y 4 ° C. Las células de levadura se lavaron dos veces
con agua esterilizada en frío y se resuspendieron en un
volumen suficiente de tampón fosfato 0,2 M (pH 7,4) que
contenía β-mercaptoetanol 5 mM (Blandino et al. 1997). Las
proteínas de las células resuspendidas fueron liberadas por
un triturador de células de baja temperatura y presión
ultraalta (JNBIO, China) bajo 1100 bar durante tres ciclos
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
(Ye et al. 2016). Los restos celulares se eliminaron por
centrifugación a 10,000 xg durante 5 min a 4 ° C. El
sobrenadante (extracto enzimático) se usó para la
determinación de la actividad ADH.
La actividad de ADH se determinó por espectrofotometría.
La mezcla de reacción contenía 5,5 mM de NADI, 7,5 g / l
de tampón de glicina (pH 9,0), etanol 17 M y una
preparación enzimática (Ye et al. 2016). Finalmente, la
reacción se detuvo calentando las mezclas de reacción
durante 5 minutos a 80 ° C en un baño de agua (Baré et al.
2002). La absorbancia de la mezcla de reacción se controló
a 340 nm con un lector de microplacas (BioTek, EE. UU.).
La actividad enzimática se definió como 1 µmol de NADH
formado por minuto a 37 ° C.
Las concentraciones de proteína en la extracción de enzimas
en bruto se determinaron utilizando el método de Bradford
(Bradford, M. M 1976) con albúmina de suero bovino como
estándar.
Ensayo de rendimiento de etanol en diversas cepas
Y1H
WT Y1H y los mutantes se cultivaron primero en YPD
líquido a 30ºC. Cuando se cultivaron hasta la fase
logarítmica (hasta un O D600 de aproximadamente 1.0), las
células se inocularon (1:20) en 100 ml de medio de
fermentación en un matraz de 250 ml a 30 ° C a 150 rpm.
Luego, se retiró 1 ml de líquido de fermentación cada 12 h
y se centrifugó a 10.000 xg y 4 ° C para sedimentar las
células. El sobrenadante se eliminó y se utilizó más para los
análisis de cromatografía de gases (GC) (Agilent 7890B,
EE. UU.).
Se usó un estándar externo para determinar el contenido de
etanol. Los sobrenadantes se separaron en 30 m x 0,32 mm
i.d. (df = 1.0 µm) LZP-930 columna capilar de espíritu
blanco (Tengzhouzhongkepu, China). El caudal del gas
portador de nitrógeno fue de 30 ml / min, y se inyectó 1 µl
de extracto. La temperatura del inyector fue de 300 ° C, y la
temperatura del horno se programó a 60 ° C, se mantuvo
durante 3 minutos y se incrementó de 10 ° C / min a 90 ° C.
El rendimiento de etanol se identificó de acuerdo con las
áreas pico de las muestras y un estándar de etanol. Cada
análisis se realizó por triplicado.
Page 5 of 14 154
Análisis estadístico
El análisis de la varianza (ANOVA) se realizó con el
conjunto de pruebas de rango múltiple de Tukey a un nivel
de confianza del 95% mediante el software SPSS 16.0. Los
datos de la actividad de ADH2 y el contenido de etanol son
un promedio de 3 réplicas biológicas con barras de error
que representan la desviación estándar y que denotan una
diferencia significativa (p <0.05) de la de tipo salvaje
(WT).
Resultados
Selección de objetivos CRISPR / Cas9 del gen ADH2
para la ingeniería de la vía metabólica del etanol
engineering
En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar y aplicar
CRISPR / Cas9 para la ingeniería de la ruta metabólica del
etanol. ADH2, como un gen dirigido, se usó para una
extensa investigación en S. cerevisiae (de Smidt et al. 2012;
Russell et al. 1983; Ciriacy 1975; Lutstorf y Megnet 1968).
Por lo tanto, decidimos apuntar a este gen como un banco de
pruebas para la ingeniería de la vía metabólica del etanol
utilizando CRISPR / Cas9 [Fig. 1 (Steyn et al. 2015)].
Para la interrupción de un solo sitio por CRISPR / Cas9,
se seleccionaron tres sitios en el gen ADH2, sin
contrapartida detectable en el genoma de interés. El gRNA
ADH2.X se diseñó para apuntar al área 131 pb corriente
abajo del codón de inicio de ADH2, mientras que el gRNA
ADH2.Y el sitio objetivo genómico se ubicó 36 pb corriente
abajo del codón de inicio. GRNA ADH2.Z, que estaba 103
pb corriente abajo del codón de inicio (Fig. 2c), también fue
elegido para la orientación. Para eliminar completamente el
gen ADH2 del cromosoma de S. cerevisiae, se diseñaron dos
gRNA específicos, gRNA ADH2.A y gRNA ADH2.B,
dirigidos a la misma región de ~ 1.4 kb, basados en las
secuencias del gen ADH2 ubicado en 220 pb. aguas arriba
del codón de inicio de ADH2 y 180 pb corriente abajo del
codón de parada (Fig. 3b).
Diseño de donante de recursos humanos para la
edición CRISPR / Cas9
Para interrumpir el gen ADH2, diseñamos varias
alteraciones de HR. donantes para tres diferentes sgRNAs
(Fig. 2c), que contenía varias supresiones de pares de bases
(10, 5 y 8) en el medio para recombinarse con los sitios
genómicos objetivo (por ejemplo, Fig. 2b). Una vez que el
donante de interrupción de la FC se recombina con el lugar
de destino para reparar plantillas, introduce un cambio de
13
154 Page 6 of 14
marco. mutación para abolir la traducción normal de
proteínas. Golpear el gen ADH2 completamente usando otro
enfoque, nosotros diseñó un donante de HR más largo, un
brazo derecho de 798 pb y un 778 pb.
pb brazo izquierdo que flanquea el sitio de corte Cas9 (Fig.
3a). Dos sgRNAs específicos crean dos DSB
simultáneamente a dos objetivos loci genómicos. Entonces,
como se describe anteriormente, el donante de recursos
humanos es recombinado con el locus objetivo para obtener
un ADH2 eliminado mutante Para las secuencias de
nucleótidos del ADN del donante, consulte el apartado
archivo 2
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
la interrupción de HR donante. Sin embargo, cuando el
pML107 (expresión de sgRNA vacíocasete) con donante
HR fue co-transformado, el ADH2 el gen también fue
alterado. Sin embargo, tiene baja eficiencia y es inespecífico
para HR (para alineaciones de secuencias, consulte la
sección Suplementarios archivo 3). Este resultado demostró
además que la tecnología CRISPR / Cas9 es altamente
específica y eficiente.
Fig. 1 Vía biosintética del etanol. Producción en
Saccharomyces cerevisiae

Aplicación del sistema CRISPR / Cas9. para la alteración

de un solo locus del gen ADH2

Como prueba de concepto para la aplicabilidad de CRISPR

/ Cas9 Para la ingeniería metabólica, primero probamos una
sola interrupción del gen diana en tres sitios con diferentes
brazos de homología (Fig. 2a). Después de la
transformación, las tasas de eliminación exitosa de los tres
sitios objetivo fueron 60%, 100% y 90%
(n = 10 colonias probadas). Hemos secuenciado las colonias
seleccionadas y confirmó la introducción de la supresión
prevista en el locus objetivo en los clones mutantes (Fig. 2d),
lo que indica que la eliminación de varios pares de bases fue
causada por CRISPR /Cas9 asistida por HR con el donante
de HR. La alteración del gen ADH2 no fue detectable en la
expresión de sgRNA vacío casete o el sgRNA específico sin

13
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154 Page 7 of 14 154

Fig. 2 Plásmido único del sistema CRISPR / Cas9 para un gen único. Interrupción en Saccharomyces cerevisiae. Un esquema
del Sistema CRISPR /Cas9. El único plásmido pML107 que alberga Cas9 y específico se transforma el casete que expresa
sgRNA, con el donante HR en la cepa Y1H. Después de la transformación, los DSB son inducidos por CRISPR / Cas9 cerca
del sitio objetivo en células transformadas. La reparación de HR sin errores se inicia utilizando un donante de HR co-
transformado como un plantilla de reparación que une las regiones flanqueantes de la rotura y elimina varios nucleótidos
para introducir simultáneamente un cambio de marco en el gen diana. Las cajas negras y moradas representan homología.
secuencias para la recombinación, y el cuadro amarillo representa el par de bases supresión. Leu2 representa marcadores
seleccionables. b Esquema del diseño del donante de RH de 100 pb para el sitio ADH2.X. La eliminación de 10 pb incluye
la secuencia PAM de 3 pb y la otra secuencia de 7 pb detrás PAM. Otros dos donantes de recursos humanos para el sitio
ADH2.Y y el sitio ADH2.Z son similares a los de arriba; La diferencia es la duración de la eliminación, a 5 y 8 pb,
respectivamente. c El esquema superior muestra el ADH2.X, ADH2.Y y ADH2.Z secuencias genómicas diana y respectivas
Secuencias de PAM en el gen ADH2. La tabla resume los Guía y secuencia de PAM de cada sitio objetivo. d Alineación de
ADH2 secuencias genéticas de diez colonias seleccionadas al azar contra WT secuencias La secuencia subrayada es el gen
ADH2 de referencia WT, mientras que las siguientes diez secuencias son de Leu2 + colonias la secuencia guía de gRNA se
resalta en verde, mientras que la PAM la secuencia está resaltada en púrpura

13
154 Page 8 of 14
Aplicación del sistema CRISPR / Cas9 para completar
supresión del gen ADH2
Como la mayor eficiencia de interrupción de ADH2 fue
(100%) Obtenido de un solo sitio, decidimos apuntar a
dos loci genómicos utilizando simultáneamente el sistema
CRISPR / Cas9 para eliminar todo el gen ADH2 en el
cromosoma de levadura (Fig. 3a), junto con la co-
transformación de pML107- gRNA ADH2.A, pML107-
gRNA ADH2.B y un HR donante en la cepa Y1H. Bajo
el sistema de dos plásmidos, similar a la utilizada para una
sola interrupción, los dos DSB son reparado por
recombinación con el donante HR. Por consiguiente,
colonias sin integración del donante de recursos humanos.
Generar un amplicón con un tamaño de aproximadamente
3 kb de la amplificación del locus nativo, mientras que la
HR donante de interrupción recombinado con el locus
objetivo debe ceder un amplicón con un tamaño de
aproximadamente 1.6 kb. Para probar los mutantes
eliminados de ADH2, 24 colonias de las placas SC-leu−
se parchearon para analizar el genotipo de los genes diana
mediante PCR. El análisis con 1.0%. La electroforesis en
gel de agarosa mostró que 22 de 24 colonias se encontró
que habían eliminado el gen objetivo (Fig. 3c).
Del mismo modo, no se detectó la eliminación de genes
cuando solo el Casete de expresión de sgRNA vacío con
el donante HR y sgRNA específico sin donante HR
estaban presentes (Fig. 3d).
En la secuenciación de cinco colonias, cuatro confirmaron
la supresión del gen ADH2 por HR (Fig. 3e). Así,
nosotros logramos construir el mutante ΔADH2 usando
el Sistema CRISPR-Cas9.
Secuenciación genómica análisis de datos y mutación.
identificación
Con la tecnología CRISPR / Cas9, cada copia funcional
de un gen objetivo debe ser interrumpido para eliminar al
Gen completamente (Boettcher y McManus 2015). A
investigar si la mutación directa mediada por CRISPR
en cada cepa mutada fue homocigoto, secuenciamos
Ocho cepas mutadas y la cepa WT Y1H. Un total crudo
conjunto de datos de 85.1 millones de lecturas de extremo
pareado (hasta 12.8 Gbp) se generó utilizando Illumina
HiSeq2500, con una secuenciación Profundidad por
muestra desde 107 × hasta 131 × genoma equivalentes
después de recortar las secuencias del adaptador y
eliminar secuencias de baja calidad, más de 79.6 millones
de pares emparejados.
13
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
Se conservaron lecturas limpias (11.9 Gbp) para todas las
muestras.
La profundidad media de secuenciación para cada
muestra fue mayor 100 × (archivo complementario 4).
Posteriormente, lecturas limpias de nueve cepas fueron
mapeadas al genoma de referencia. Los resultados de las
llamadas SNP (archivos VCF) mostraron que todos los
SNP genotipos determinados entre ocho mutantes y la
referencia genoma eran "1/1", mientras que el genotipo
entre la cepa WT Y1H y el genoma de referencia era "0/0"
en los loci genómicos objetivo, lo que indica que todas las
mutaciones causadas por CRISPR / Cas9 en todos los
mutantes fueron homocigotos.
Entonces, el programa JBrowse basado en la web se
configuró para visualiza las pequeñas variantes
estructurales en los ocho mutantes.
En comparación con la cepa salvaje y el genoma de
referencia.
El análisis reveló la eliminación esperada en el objetivo.
sitios en los ocho clones mutantes (Fig. 4), y ninguna
similar se encontraron mutaciones en cualquier otra
región genómica. Los análisis anterior demostró aún más
la alta especificidad y eficiencia de la tecnología CRISPR
/ Cas9.
Impacto de la interrupción o eliminación completa
del gen ADH2 en la actividad ADHII
El gen ADH2 que codifica para ADHII cataliza la
conversión de etanol a acetaldehído (fig. 1). Para medir el
efecto de interrupción o eliminación en la actividad ADH,
primero analizamos los niveles de expresión relativos de
ADH2 en Y1H nativo y mutantes ADH2 por RT-qPCR.
Como se muestra en la Fig. 5a, la relativa los niveles de
expresión en los mutantes, que fueron interrumpidos por
el gen ADH2, se redujeron en un 32.8–54.1% en
comparación con los niveles en la cepa original de S.
cerevisiae. Los la cepa eliminada por ADH2 (ΔADH2)
mostró una disminución del 99,4% en niveles de
expresión relativos. Estos resultados son más probados
que el gen ADH2 en estas cepas había sido interrumpido
y eliminado por completo
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154 Page 9 of 14 154

Fig. 3 El sistema de dos plásmidos CRISPR / Cas9 mediado completo

Deleción del gen ADH2 en Saccharomyces cerevisiae. un flujo de trabajo de la sistema de dos plásmidos CRISPR / Cas9 y
HR con ADH2 genómico. Los cebadores de PCR (flechas) están diseñados de tal manera que una tensión con el ADH2 gen
completamente eliminado producirá productos de PCR de aproximadamente 1.6 kb, y ninguna eliminación producirá una
banda única de aproximadamente 3 kb. La guía y las secuencias PAM de cada sitio están resumidas en la mesa. B Diagrama
de dos regiones diana genómicas de gRNA y respectivas secuencias PAM. Los sitios dirigidos se resaltan en verde, la
secuencia PAM en púrpura, inicia el codón en rojo y detiene el codón en azul. C Resultados de genotipado basados en PCR
de la transformación dirigida el locus ADH2. Los carriles 1–24 muestran los resultados de la PCR de 24 al azar colonias
seleccionadas. La eliminación exitosa de ADH2 da como resultado un fragmento de PCR con una longitud de 1.6 kb (carriles
1–16, 18 y 20–24), mientras que sin eliminación en ADH2 produce una banda de aproximadamente 3 kb (carriles 17 y 19);
Carril M, DL5,000 Marcador de ADN. d ADH2 eficiencias de eliminación calculado después de la transformación
E Secuenciación por PCR de cuatro clones.
El sitio de orientación está resaltado en verde, la secuencia PAM en rojo y regiones eliminadas en azul. Los cebadores O-1F
/ O-2R se utilizan para cribar para la orientación de genes

13
154 Page 10 of 14 World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154

Fig. 4 Visualización de InDels del gen ADH2 en la web JBrowse software.

A – C Los mutantes ADH2-X, ADH2-Y y ADH2-Z con deleciones de 10, 5 y 7 pb, respectivamente, del gen ADH2
comparado con el WT y las secuencias de referencia. La profundidad de secuenciación para cuatro cepas fue superior a 55×.
La caja negra representa la región de supresión de par de bases en comparación con las secuencias WT y de referencia.
D El gen ADH2 se eliminó completamente en l-1, l-2, l-3, l-4 y l-5
En comparación con la cepa WT Y1H. La región eliminada del genoma es al 873079-874551. El cuadro negro muestra la
región eliminada en comparación con la secuencia WT
17.0–60.5% comparado con el de la cepa huésped, y el
ADH2 eliminado la tensión mostró una actividad ADHII
disminuida en 11.7–30.1% (Fig. 5c), una diferencia
En segundo lugar, para seguir explorando la influencia de significativa a p <0.05. Podemos concluir ese gen ADH2
la interrupción y supresión del gen ADH2 en los niveles en estas cepas podría estar alterado y eliminado, lo que
de ADH, célula completa se prepararon extractos de condujo a una reducción en la actividad ADHII.
acuerdo con los resultados mostrados en Fig.5b, en la Cuando se fermenta durante 36 h, la actividad de la
fermentación inicial, alcohol deshidrogenasa II. la alcohol deshidrogenasa II disminuyó en un 32.2–45.5% y
actividad en cepas de disrupción única disminuyó en un 15.0–35.9% en ADH2 solo disgregación y eliminación de

13
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
las cepas, respectivamente. Se encuentra que la actividad
ADHII del mutante ADH2-Y es mayor que la de el WT y
otras cepas mutantes. Después de 72 h de fermentación,
casi no hubo actividad enzimática en todas las cepas
debido a el período de decadencia.
Comparación del rendimiento de la fermentación de
etanol entre la levadura mutante y las cepas
parentales.
Para confirmar si la formación de etanol ha mejorado.
por inactivación mediada por CRISPR / Cas9 del gen
ADH2, los cultivos en matraz se hicieron crecer en el
medio de fermentación. Nosotros detectado el
rendimiento de etanol en líquidos de fermentación en
varios Y1H se deforma cada 12 h por GC, cuantificada
por el externo. Método estándar (archivo complementario
5). De acuerdo a los resultados mostrados en la Fig. 5d,
con aproximadamente 36 h de fermentación, el contenido
de etanol de S. cerevisiae ADH2-Y aumentó en un 75,5%
Page 11 of 14 154
y el l-3, l-5 aumentó en un 8.5–14.3% (p <0.05)
comparado con el del huésped. De la Fig. 5d, la el
rendimiento de etanol de ADH2-Y aumentó más
significativamente, y su actividad ADHII fue mayor que
la del WT y otras cepas mutantes. Se informó que la
regulación al alza de Lachancea fermentati ADH2 en
presencia de glucosa y el etanol mostró que el ADH2
permitía tanto la Utilización de glucosa y producción de
etanol para ocurrir simultáneamente.
(Norhayati et al. 2016). Una de las razones puede deberse
a la regulación al alza de actividad ADH2 que podría
consumir más azúcar, produciendo así más etanol.
El contenido de etanol en la cepa l-1, l-3, l-5 aumentó
significativamente por 5.79–22.8% y el mutante ADH2-
Y fue 71.1% superior a la de la levadura original (p <0.05)
después de 72 h de fermentación, indicando además que
CRISPR / Cas9 mediada la inactivación del gen ADH2
condujo a un mejor rendimiento de etanol durante el
proceso de fermentación de la levadura.

Fig. 5 Análisis de qRT-PCR, actividad de ADH y producción de etanol en diferentes cepas mutantes. Un nivel de expresión
relativa del ADH2. gene. B Actividades específicas de mutantes de alteración del gen ADH2 contra la cepa WT. C
actividades enzimáticas del mutante de eliminación completa del gen ADH2 comparado con la cepa WT. D Etanol produce

13
154 Page 12 of 14
en la cepa nativa y los mutantes de interrupción única.E etanol producción de cinco mutantes de eliminación completa y la
cepa WT como control. Todos las barras de error indican desviaciones estándar de tres repeticiones biológicas, y * denota
niveles de actividad ADH significativamente diferentes (p <0.05) en comparación con los niveles de WT
Discusión
En este estudio, el gen ADH2 en Y1H se rompió por
primera vez y eliminado completamente utilizando
CRISPR / Cas9 mediada DSB (s) y reparación dirigida
por homología. El rendimiento de etanol en Y1H se
mejoró significativamente, en un 74.7%, a través de la
inactivación del gen ADH2. Por lo tanto, con éxito aplicó
un sistema mediado por CRISPR / Cas9 para
metabolismo metabólico. Ingeniería en S. cerevisiae.se
han construido muchas cepas de S. cerevisiae diseñadas
para mejorar la producción de etanol utilizando diversos
enfoques (Ye et al. 2016; He et al. 2014; Xue et al. 2015;
Reis et al. 2012). Sin embargo, estas modificaciones han
mostrado menor eficiencia y menor especificidad del sitio
además, el mayor rendimiento de etanol obtenido por Ye
et al. (2016) fue aproximadamente 1.52 veces (14.6 g / L)
más alto que la obtenida de la cepa WT debido a la
interrupción del Gen ADH2. Aunque no es directamente
comparable, muestra más alta la acumulación de etanol
fue de 1,74 veces (aproximadamente 3.005 ± 0.007 g /
100 mL) mayor que la obtenida dela cepa parental
(aproximadamente 1.720 ± 0.014 g / 100 ml)
(Fig. 5d). Este resultado indica que al interrumpir el
ADH2 el gen puede ser un enfoque válido para mejorar la
producción de etanol.
Además, este resultado es útil para la ingeniería posterior
de cepas productoras de etanol de alto rendimiento.
Varios poderosos enfoques, a saber, mediado por PCR, el
sistema Cre / LoxP y la tecnología TALEN, han sido
confirmados para integraciones genómicas y edición de
genes usando marcadores de antibióticos (Ronda et al.
2015). Sin embargo, tales enfoques han sido limitado en
la industria alimentaria debido a los marcadores de
antibióticos se mantienen en la levadura manipulada
después de la modificación.
Además, la levadura modificada puede ser etiquetada
como genéticamente modificada Organismo (OGM) en
aplicaciones industriales (Chin et al. 2016). En el presente
estudio, el gen ADH2 en Y1H fue interrumpido por un
nuevo sistema CRISPR / Cas9 sin salir Marcadores
antibióticos o secuencias residuales en la vecindad del
gen ADH2. Además, la resecuenciación de todo el
genoma.
los resultados revelaron que todas las mutaciones eran
homocigotas , edita los genomas de levadura, y la
proporción creciente de etanol.
La producción fue más alta que otras reportadas
previamente (Ye et al. 2016; Ting et al. 2015).
13
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
Además, nuestro estudio también reveló algunos
hallazgos interesantes.
En primer lugar, la actividad ADHII todavía se detectó en
el ADH2- Tensión eliminada, pero no dio lugar a una
reducción significativa en la actividad específica de
ADHII. En segundo lugar, la función primaria de ADH2
es oxidar el etanol al acetaldehído, pero nosotros no
obtuvimos resultados experimentales ideales utilizando el
mutante.
Cepas para la fermentación del etanol. Los ADHs de S.
cerevisiae se han estudiado intensivamente durante
muchos años. Una alta Homología de secuencia de
nucleótidos entre ADH1 y ADH2 (90%) mostró una
identidad del 73% al 74% con ADH3 y del 76 al 77% con
una identidad de secuencia con ADH5 (de Smidt et al.
2008) se informó que las isozimas ADH de S. cerevisiae
sustituyen Funcionalmente el uno para el otro y aportar
nueva información.
(de Smidt et al. 2012). Por ejemplo, una cepa que expresa
sólo ADH3 produjo y asimiló etanol concomitantemente,
imitando así la función de ADH1 y cumpliendo una
función similar a ADH2 en un fondo de eliminación (de
Smid et al. 2012). Por otra parte, se informó que ADH1
convierte etanol acumulado a acetaldehído durante el
crecimiento aeróbico, aunque presumiblemente menos
eficiente, y su función podría sustituto de ADH2 (Wills
1976). Además, algunos los informes muestran que
ADH1 y ADH2 pueden estar intersustituidos (de Smidt et
al. 2008). Por lo tanto, ADHII residual actividad puede
derivarse de la sustitución funcional con el otras isozimas
ADH, ya sea ADH1 o ADH3. De otra manera,existe una
compleja regulación del gen estructural Adh2p en S.
cerevisiae. El primer gen asociado a esta función.
era ADR1, un gen regulador positivo que activaba
específicamente la expresión del gen estructural ADH2
(Ciriacy 1979). Además, otros elementos participan en la
regulación ADH2.Se indican análisis genéticos y
bioquímicos constantes.
que al menos otros 24 elementos genéticos o proteínas no
vinculados Participar en la regulación de la expresión del
gene ADH2 la mayoría de los cuales influyen en la
expresión de ADH2 principalmente en una manera
directa. Varios de los genes parecen ser capaces de
hacerlo a través del control de ADR1, ya sea por
traducción de ARNm fosforilación o interacción de
proteínas (de Smidt et al. 2008) de lo contrario, se
informó que la regulación al alza de Lachance fermentati
ADH2 en presencia de glucosa y etanol mostró que el
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
ADH2 permitió la utilización de glucosa y La producción
de etanol ocurrirá simultáneamente (Norhayati et al
2016). Así, podemos concluir que aunque la supresión de
ADH2 disminuye el metabolismo del etanol de S.
cerevisiae, la oxidación del etanol puede recuperarse a
través de la regulación positiva de los genes.
Codificar otras isozimas ADH o elementos genéticos no
vinculados o proteínas, cuya expresión se reprime en el
WT.
En resumen, el sistema CRISPR-Cas9 es útil para el
metabolismo metabólico ingeniería para eliminar un gen
objetivo que produce una subproducto dañino o no
deseado en la producción de bioetanol. Eso puede
reemplazar los métodos convencionales de ingeniería
genética. Debido a su alta especificidad y eficiencia a lo
mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe
de la interrupción de la Gen ADH2 utilizando la
tecnología CRISPR / Cas9 para mejorar la producción de
etanol durante las fermentaciones de etanol de levadura.
Agradecimientos Agradecemos a Liangyi Zhou por su
ayuda en la verificación de mutantes ADH2, Heqi Shao
por su asesoramiento en la producción de enzimáticos
extraer.
Agradecemos a Nature Research Editing Service (ID de
pedido:343TY1W5) para editar el texto en inglés de un
borrador de este manuscrito.
Contribuciones de los autores Ting Xue, Kui Liu y
Youqiang Chen diseñados el proyecto; Kui Liu llevó a
cabo los experimentos; Kui Liu, dúo Chen, Xue Yuan y
Jingping Fang analizaron el GC y la resecuenciación del
genomadatos; Kui Liu escribió el manuscrito; Ting Xue,
Colmillo Jingping, Luqiang Huang, Youqiang Chen,
Wenjin Él editó el manuscrito;Todos los autores leyeron
y aprobaron el manuscrito final financiamiento este
trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias
Naturales de la provincia de Fujian (subvención No.
2017J01622), el National Sugar Sistema de Investigación
de Cultivos (Grant No. CARS-170501), y la Educación
Proyecto de Departamento de la Provincia de Fujian
(Subvención No. JAT160114).
Referencias
Balat M, Balat H (2009) Recent trends in global production and
utilization of bio-ethanol fuel. Appl Energy 86:2273–2282
Bao Z, Xiao H, Liang J, Zhang L, Xiong X, Sun N, Si T, Zhao H
(2015) Homology-integrated CRISPR-Cas (HI-CRISPR)
system for one-step multigene disruption in Saccharomyces
cerevisiae.
ACS Synth Biol 4:585–594
Baré G, Swiatkowski T, Moukil A, Gerday C, Thonart P (2002)
Purification and characterization of a microbial
dehydrogenase. Appl
Biochem Biotechnol 98:415–428
Page 13 of 14 154
Beier DR, Sledziewski A, Young ET (1985) Deletion analysis
identifies a region, upstream of the ADH2 gene of
Saccharomyces cerevisiae, which is required for ADR1-
mediated derepression. Mol Cell Biol 5:1743–1749
Biot-Pelletier D, Martin VJ (2016) Seamless site-directed
mutagenesis of the Saccharomyces cerevisiae genome using
CRISPR-Cas9. J
Biol Eng 10:6
Blandino A, Caro I, Cantero D (1997) Comparative study of alcohol
dehydrogenase activity in flor yeast extracts. Biotechnol Lett
19:651–654
Boettcher M, McManus MT (2015) Choosing the right tool for the
job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell 58:575–585
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254
Chin YW, Kang WK, Jang HW, Turner TL, Kim HJ (2016) CAR1
deletion by CRISPR/Cas9 reduces formation of ethyl
carbamate from ethanol fermentation by Saccharomyces
cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol 43:1517–1525
Ciriacy M (1975) Genetics of alcohol dehydrogenase in
Saccharomyces cerevisiae. II. Two loci controlling synthesis
of the glucoserepressible ADH II. Mol Gen Genet 138:157–
164
Ciriacy M (1979) Isolation and characterization of further cis- and
trans-acting regulatory elements involved in the synthesis of
glucose-repressible alcohol dehydrogenase (ADHII) in
Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet 176:427–431
de Smidt O, du Preez JC, Albertyn J (2008) The alcohol
dehydrogenases of Saccharomyces cerevisiae: a
comprehensive review.
FEMS Yeast Res 8:967–978
de Smidt O, du Preez JC, Albertyn J (2012) Molecular and
physiological aspects of alcohol dehydrogenases in the ethanol
metabolism of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res
12:33–47
Demeke MM, Dietz H, Li Y, Foulquié-Moreno MR, Mutturi S,
Deprez S, Abt D, Bonini T, Liden BM, Dumortier G,
Verplaetse F, Boles A, Thevelein E, J.M (2013) Development
of a D-xylose fermenting and inhibitor tolerant industrial
Saccharomyces cerevisiae strain with high performance in
lignocellulose hydrolysates using metabolic and evolutionary
engineering. Biotechnol Biofuels 6:89
DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (2013)
Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-
Cas systems. Nucleic Acids Res 41:4336–4343
Finnigan GC, Thorner J (2016) mCAL: a new approach for versatile
multiplex action of Cas9 using one sgRNA and loci flanked by
a programmed target sequence. G3 6:2147–2156
Gietz RD, Schiestl RH (2007) High-efficiency yeast transformation
using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2:38–
41
He W, Ye S, Xue T, Xu S, Li W, Lu J, Cao L, Ye B, Chen Y (2014)
Silencing the glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene in
Saccharomyces cerevisiae results in more ethanol being
produced and less glycerol. Biotechnol Lett 36:523–529
Horwitz AA, Walter JM, Schubert MG, Kung SH, Hawkins K, Platt
DM, Hernday AD, Mahatdejkul-Meadows T, Szeto W,
Chandran SS, Newman JD (2015) Efficient multiplexed
integration of synergistic alleles and metabolic pathways in
yeasts via CRISPR-Cas. Cell Syst 1:88–96
Jakociunas T, Bonde I, Herrgard M, Harrison SJ, Kristensen M,
Pedersen LE, Jensen MK, Keasling JD (2015a) Multiplex
13
154 Page 14 of 14 World Journal of Microbiology and Biotechnology (2018) 34:154
metabolic pathway engineering using CRISPR/Cas9 in multiple chromosome splitting in Saccharomyces cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae. Metab Eng 28:213–222 Sci Rep 6:30278
Jakociunas T, Rajkumar AS, Zhang J, Arsovska D, Rodriguez A, Skinner ME, Uzilov AV, Stein LD, Mungall CJ, Holmes IH (2009)
Jendresen CB, Skjodt ML, Nielsen AT, Borodina I, Jensen JBrowse: a next-generation genome browser. Genome Res
MK, Keasling JD (2015b) CasEMBLR: Cas9-facilitated 19:1630–1638
multiloci genomic integration of in vivo assembled DNA parts Soni KA, Lu L, Jesudhasan PR, Hume ME, Pillai SD (2008)
in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synth Biol 4:1226–1234 Influence of autoinducer-2 (AI-2) and beef sample extracts on
Jessop-Fabre MM, Jakociunas T, Stovicek V, Dai Z, Jensen MK, E. coli O157:H7 survival and gene expression of virulence
Keasling JD, Borodina I (2016) EasyClone-MarkerFree: a genes yadK and hhA. J Food Sci 73:M135–M139
vector toolkit for marker-less integration of genes into Steyn L, Du Preez J, de Smidt O, Albertyn J (2015) The use of
Saccharomyces cerevisiae via CRISPR-Cas9. Biotechnol J multiple deletion mutants for determining the physiological
11:1110–1117 role of alcohol dehydrogenase isozymes in Saccharomyces
Kang HS, Charlop-Powers Z, Brady SF (2016) Multiplexed cerevisiae. https: //doi. org/10.13140 /RG.2.1.5014.8324
CRISPR/ Cas9- and TAR-mediated promoter engineering of Tsarmpopoulos I, Gourgues G, Blanchard A, Vashee S, Jores J,
natural product biosynthetic gene clusters in yeast. ACS Synth Lartigue C, Sirand-Pugnet P (2016) In-yeast engineering of a
Biol 5:1002–1010 bacterial genome using CRISPR/Cas9. ACS Synth Biol 5:104–
Laughery MF, Hunter T, Brown A, Hoopes J, Ostbye T, Shumaker 109
T, Wyrick JJ (2015) New vectors for simple and streamlined Wills C (1976) Production of yeast alcohol dehydrogenase
CRISPR-Cas9 genome editing in Saccharomyces cerevisiae. isoenzymes by selection. Nature 261:26–29
Yeast 32:711–720 Xue T, Chen D-C, Liu Y, Su X-M, Lin R-H, Chen Y-Q (2015)
Li H, Durbin R (2009) Fast and accurate short read alignment with Anthocyanin antisense interference of ethanol dehydrogenase
Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25:1754–1760 II in Saccharomyces cerevisiae and its influence on ethanol
Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth fermentation. Mod Food Sci Technol. https
G, Abecasis G, Durbin R (2009) The sequence alignment/map ://doi.org/10.13982 /j.m fst.1673-9078.2015.11.022
format and SAMtools. Bioinformatics 25:2078–2079 Ye W, Zhang W, Liu T, Tan G, Li H, Huang Z (2016)
Looke M, Kristjuhan K, Kristjuhan A (2011) Extraction of genomic Improvement of ethanol production in Saccharomyces
DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques cerevisiae by high-efficient disruption of the ADH2 gene
50:325–328 using a novel recombinant TALEN vector. Front Microbiol
Lutstorf U, Megnet R (1968) Multiple forms of alcohol 7:1067
dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. I. Physiological Zabed H, Sahu JN, Suely A, Boyce AN, Faruq G (2017) Bioethanol
control of ADH-2 and properties of ADH-2 and ADH-4. Arch production from renewable sources: current perspectives and
Biochem Biophys 126:933–944 technological progress. Renew Sustain Energy Rev 71:475–501
Manochio C, Andrade BR, Rodriguez RP, Moraes BS (2017)
Ethanol from biomass: a comparative overview. Renew
Sustain Energy Rev 80:743–755
Naito Y, Hino K, Bono H, Ui-Tei K (2015) CRISPRdirect: software
for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target
sites. Bioinformatics (Oxford England) 31:1120–1123
Norhayati Y, Shukuri MAM, Bakar SA, Aini ARN (2016) Effects
of glucose, ethanol and acetic acid on regulation of ADH2 gene
from
Lachancea fermentati. Peerj 4(12):e1751
Rastogi M, Shrivastava S (2017) Recent advances in second
generation bioethanol production: an insight to pretreatment,
saccharification and fermentation processes. Renew Sustain
Energy Rev 80:330–340
Reis VC, Nicola AM, de Souza Oliveira Neto O, Batista VD, de
Moraes LM, Torres FA (2012) Genetic characterization and
construction of an auxotrophic strain of Saccharomyces
cerevisiae JP1, a Brazilian industrial yeast strain for bioethanol
production. J Ind
Microbiol Biotechnol 39:1673–1683
Ronda C, Maury J, Jakociunas T, Jacobsen SA, Germann SM,
Harrison SJ, Borodina I, Keasling JD, Jensen MK, Nielsen
AT (2015) CrEdit: CRISPR mediated multi-loci gene
integration in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol
Biotechnol 14:97
Russell DW, Smith M, Williamson VM, Young ET (1983)
Nucleotide sequence of the yeast alcohol dehydrogenase II
gene. J Biol Chem 258:2674–2682
Sasano Y, Nagasawa K, Kaboli S, Sugiyama M, Harashima S
(2016) CRISPR-PCS: a powerful new approach to inducing

13