Arch Med Vet 43, 111-116 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

Detección de Cryptosporidium spp. en terneras de lecherías de la Región Metropolitana

mediante Ziehl Neelsen y confirmada por inmunocromatografía y ensayo molecular#

Detection of Cryptosporidium spp. in calves by using a acid fast method and confirmed
by immunochromatographic and molecular assays

P Muñoza, F Fredesb*, A Díaz-Leeb, R Mercadoc, LS Ozakid

aLaboratorio de Parasitología Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
bUnidad de Parasitología, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.
cUnidad Docente de Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

dDepartment Microbiology & Immunology, Medical Center, Virginia Commonwealth University, Virginia, USA.

SUMMARY

From an animal production point of view, Cryptosporidium can cause great economic losses in systems that involve the raising of cattle by producing
various degrees of diarrhea, particularly in calves that are less than 30 days of age. The main objective of this study was the detection of Cryptosporidium
spp. oocysts in faecal samples of diarrheic calves of less than one month of age from two milk farms in the Metropolitan Region of Chile. For the first
time in the country, an immunochromatographic and a molecular assay were used to confirm the microscopical observation of Cryptosporidium spp.
oocysts in the bovine samples studied. A total of 205 fecal samples were stained with acid-fast method (Ziehl Neelsen, ZN) and 102 (49.8%) were found
to have parasite oocysts. From these ZN positive samples, 58 were randomly selected and were all confirmed positive by the immunochromatographic
test (IC). Conversely, 10 ZN negative samples were all negative by using IC test. A genus-specific molecular assay (18S ribosomal RNA PCR) was
designed and carried out in the study of the 58 ZN/IC positive and the 10 ZN/IC negative faecal samples for the detection of Cryptosporidium spp. 37
(64%) samples were confirmed positive by this genus-specific PCR assay while all the 10 ZN/IC negative samples yielded no amplification. Detection
limit of the genus-specific PCR was compared with the ZN staining method. Fewer parasites were detected by PCR (104 oocysts/mL) when compared
to ZN (2 x 104 oocysts/mL). The results showed that cryptosporidiosis continues to be a parasitic infection of high frequency in dairy farm cattle in the
Metropolitan Region. The ZN stain method is extremely operator dependent, but this disadvantage can be reduced by combining ZN with the IC test.
Further studies are needed to improve the yield of the genus-specific PCR method as a diagnostic tool for bovine Cryptosporidium. Molecular tests also
contribute to define the veterinary epidemiology of this parasitic infection in a specific geographical area.

Palabras clave: Cryptosporidium, Ziehl Neelsen, PCR, terneros.

Key words: Cryptosporidium, Ziehl Neelsen, PCR, calves.

INTRODUCCIÓN en esta especie animal tales como: C. andersoni, C. bovis

Protozoos del género Cryptosporidium son agentes
causales de severos cuadros de diarrea en humanos,
rumiantes recién nacidos y otros animales domésticos
o silvestres. Esta parasitosis zoonótica se ha descrito en
todos los continentes incluido el Antártico (Hunter y col
2003, Fredes y col 2007).
Tyzzer (1907) propuso el nombre del género, enumeró
sus principales características morfológicas y describió a
Cryptosporidium parvum como la especie involucrada en
cuadros diarreicos de roedores (Tyzzer 1912). Actualmente
se reconocen 19 especies de Cryptosporidium (Fayer 2010),
pero en el caso específico del ganado vacuno la infección
es causada principalmente por el patógeno zoonótico
C. parvum (Fayer 2004, Sunnotel y col 2006). Sin embargo,
también se describen otras especies que producen infección
Aceptado: 27.10.2010.
# Proyecto DI MULT 06/17-2, Universidad de Chile.
* Casilla 2 Correo 15, La Pintana, Santiago, Chile; ffredes@uchile.cl
y C. ryanae o C. parvum genotipo deer-like (Geurden y
col 2006, Feng y col 2007, Fayer 2010). Los dos últimos
han sido identificados recientemente en Estados Unidos
en ganado bovino (Feng y col 2007).
En el hombre se han descrito al menos ocho especies que
provocan infección: C. hominis, C. parvum, C. meleagridis,
C. felis, C. canis, C. muris, C. suis y Cryptosporidium
genotipo cervine (Cama y col 2008). Los más frecuentes
son C. hominis y C. parvum (Xiao y Ryan 2004, Sunnotel
y col 2006, Mercado y col 2007, Cama y col 2008); en
cambio, C. meleagridis ha sido detectada tanto en pacientes
inmunocompetentes como inmunodeficientes, pero en una
menor tasa (Mercado y col 2007).
En Chile el agente se considera endémico, afectando
varias especies animales como equinos, bovinos, ovinos,
caprinos, llamas, alpacas, cerdos, perros, gatos, aves
(gallinas y palomas) y a humanos (Atías 1998, Alcaíno y
Gorman 1999). Hay escasos estudios sobre las especies
de Cryptosporidium que estarían infectando a bovinos
(C. parvum) y humanos (C. hominis) las que se determinan

111
P muñoz y col
mediante pruebas moleculares (Neira y col 2005, Mercado
y col 2007).
La transmisión de este parásito es directa, vía fecal
oral por ingesta de alimentos y agua contaminada con
ooquistes de donde salen esporozoitos que se desarrollan y
multiplican en las células epiteliales del intestino delgado
(Tyzzer 1910, Soulsby 1987, Barriga 2002, Fayer 2004).
En el caso particular de rumiantes y principalmente en
el bovino afecta especialmente a animales menores de
30 días de edad provocando distintos grados de diarrea de
tipo no hemorrágica cuando es el único agente presente,
así como anorexia, dolor abdominal, pérdida de peso,
postración y fiebre con la excreción de un gran número de
ooquistes por las heces (Ortega y col 1999, Barriga 2002,
Sunnotel y col 2006).
Desde el punto de vista productivo, Cryptosporidium
causa pérdidas económicas en sistemas que involucren
la crianza de bovinos producto del natural retraso en el
crecimiento de los animales y la aplicación de tratamientos
con antiparasitarios y antibióticos inespecíficos que no son
efectivos contra este agente (Smith y Nichols 2009).
A partir de la descripción realizada por Henricksen y
Pohlenz (1981) según la cual los ooquistes de Cryptosporidium
poseen la propiedad de ser microorganismos ácido alco-
hol resistentes, la utilización de exámenes de laboratorio
basados en esta propiedad, en especial la tinción modifi-
cada de Ziehl Neelsen (ZN), pasaron a ser las pruebas de
laboratorio más utilizadas para su diagnóstico (Elliot y
col 1999, Fayer y Xiao 2008). Sin embargo, la principal
desventaja de este método morfológico-microscópico radica
en ser extremadamente operador-dependiente debiendo
ser ejecutada por profesionales experimentados (Bowman
2004, Luján y Garbossa 2008).
En Chile, Gorman y col (1989) usando ZN deter-
minaron que un 2,2% de bovinos sanos y un 23% de
animales diarreicos en la Región Metropolitana eliminaban
ooquistes del parásito, y en 1997 se reportó en las regiones
VII, IX y X un 30,6% de prevalencia de infección para
Cryptosporidium (Campano 1997).
El propósito del presente estudio fue determinar me-
diante ZN la frecuencia de hallazgo de Cryptosporidium
spp. en terneras diarreicas de dos lecherías de la Región
Metropolitana, para contribuir al conocimiento epidemioló-
gico veterinario de esta parasitosis. Complementariamente,
por primera vez en Chile se confirmaron los diagnósticos
mediante ZN con una prueba inmunocromatográfica (IC)
y una molecular (PCR), determinándose la sensibilidad
analítica de ZN frente al método molecular.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se recolectaron un total de 205 muestras fecales de ter-
neras diarreicas entre 1 y 30 días de edad, de dos lecherías
de la Región Metropolitana (Fundo la Macarena, El Monte,
33°38’S, 70°59’O y fundo Pahuilmo, Mallarauco, 33°34’S,
71°06’O), durante el año 2008. Las muestras se obtuvieron
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desde el recto de cada animal y fueron depositadas en tubos
plásticos con tapa rosca de 50 ml. Las muestras obtenidas
fueron depositadas en dos tubos, uno con etanol al 70%
para análisis molecular y otro con formalina al 10% para
el estudio microscópico de ZN. Cada muestra para ZN fue
mantenida a 4 °C, en tanto que para el caso de PCR se
mantuvo a –20 °C hasta ser examinada en el Laboratorio
de Parasitología de la Facultad de Ciencias Veterinarias
y Pecuarias, Universidad de Chile.
El método ZN se realizó de acuerdo a lo descrito por
Henricksen y Pohlenz (1981) y adaptado por Fayer y
Xiao (2007).
Para el estudio inmunocromatográfico (IC) se empleó
el Kit comercial Crypto-Strip® de laboratorio Coris
(Bélgica), siguiendo las instrucciones del fabricante. Esta
prueba permite detectar ooquistes de C. parvum en mues-
tras fecales concentradas o no concentradas. La prueba se
basa en la utilización de un sistema inmunocromatográ-
fico con partículas de oro coloidal. Es provisto en un kit
comercial que se encuentra listo para ser utilizado y sólo
requiere una dilución de la muestra fecal en una solución
tampón proporcionada por el fabricante, que es puesta en
contacto con una tira reactiva (membrana de nitrocelulosa
sensibilizada con anticuerpos anti C. parvum). La espe-
cificidad de la prueba se asegura mediante el empleo de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos de
superficie de la membrana del ooquiste y conjugado con
el oro coloidal.
La extracción de DNA se hizo de acuerdo a lo des-
crito por Mercado y col (2007), con modificaciones. Las
muestras fecales preservadas con etanol, previo tamizaje
y centrifugación (1.500 g x 15 minutos), fueron descon-
geladas a temperatura ambiente. Se utilizaron 300  µl
de heces a los cuales se le adicionó 300 µl de buffer TE
(10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0). Fueron so-
metidas a ebullición por un minuto, para luego añadirle
300 µl de SDS 10% más 20 µl de proteinasa K 10 mg/ml.
Las muestras se incubaron durante toda la noche a 65 °C
y posteriormente se guardaron a –20 °C, hasta la extrac-
ción de DNA mediante cloroformo-fenol. El DNA fue
precipitado con acetato de sodio y posteriormente lavado
con etanol 70%. El pellet obtenido fue disuelto en 50 µl
de agua estéril para PCR y el volumen utilizado para cada
amplificación fue de 3 µl.
Para la PCR se diseñaron y utilizaron  partido­
res género-específico, que amplifican un segmento
de la subunidad 18S del gen RNA ribosomal de
Cryptosporidium spp. denominados CR18S3543F
5’-GTTAAGTATAAACCCCTTTACAAGTATC-3’ y
CR18S31078R 5’-CCTCCAATCTCTAGTTGGC-3’. El
volumen de DNA utilizado para electroforesis fue de 10 µl.
Se consideró a una PCR positiva por la presencia de una
banda de DNA de 522 pb, en un gel de agarosa al 1,5% en
buffer TAE y teñido con bromuro de etidio (0,5 μg/ml).
Las muestras a estudiar fueron amplificadas en un vo-
lumen de 25 µl con la adición de: 20 ng/µl de cada primer,
 Cryptosporidium, Ziehl Neelsen, PCR, terneros

250 µM de cada nucleótido dNTP (dATP, dCTP, dGTP
y dTTP), una unidad de DNA Polimerasa (Paq5000™,
DNA Polymerase, Stratagene) en buffer 1X provisto por
el fabricante. La amplificación de PCR fue realizada en
termociclador Swift Maxi Thermal Cycler ESCO. El
DNA fue inicialmente denaturado a 95 °C por 5 minutos,
y luego 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 55 °C por 30
segundos y 72 °C por 30 segundos. La extensión final fue
de 72 °C por 5 minutos.
El tamaño muestral requerido para detectar la enfer-
medad mediante el ensayo de PCR se calculó de acuerdo
a lo descrito por Thrusfield (2005), que considera que la
proporción esperada de positivos cuando la prevalencia en
los enfermos es de un 25% (Gorman y col 1989); y cuando
el tamaño de la población es de 200 terneros diarreicos,
tabularmente se precisa de una muestra de 11 terneros,
para que con una seguridad del 95% se detecte a lo menos
un ternero positivo.
Para determinar la sensibilidad analítica de las pruebas
ZN y PCR se realizó un recuento en cámara de Neubauer
del número de ooquistes presentes en una muestra PCR
positiva, utilizando una rejilla de bronce fosfórico. Luego,
a través de diluciones crecientes, se ajustó la concentración
de los ooquistes del parásito y finalmente se diluyó nue-
vamente al doble hasta que éstos no fueron detectados.
Cada dilución obtenida fue sometida a tinción mediante
ZN y a PCR.
RESULTADOS
Del total de muestras (n = 205), 102 (49,8%) resulta-
ron positivas a ZN. De estas muestras, se seleccionaron
al azar 58 de las ZN positivas y 10 de las ZN negativas.
Estas muestras fueron procesadas mediante IC y PCR
género-específica. Todas las muestras ZN positivas tam-
bién fueron positivas a la prueba IC. De igual manera, las
10 muestras ZN negativas no dieron reactividad con las
tiras de IC. Mediante PCR, 37 (64%) muestras fecales de
terneros diarreicos dieron una banda de amplificación del
gen 18S rRNA de 522 pb correspondiente a la secuencia
blanco del protozoo (figura 1).
Con respecto al límite de detección entre PCR y ZN,
la muestra fecal original contenía 365.000 ooquistes/ml.
Para la realización de PCR y ZN se utilizaron 200 µl de
la muestra, es decir, 73.000 ooquistes. En el cuadro  1
es posible observar el resultado del límite de detección

Cuadro 1. Límite de detección de las pruebas de Ziehl Neelsen y PCR para ooquistes de Cryptosporidium spp. presentes en una
muestra de heces de ternera diarreica.
Acid fast stain and PCR detection limit for Cryptosporidium spp. oocyst present in a fecal sample of a diarrheic calf.

Ooquistes en muestra Ooquistes por Detección Detección

  (200µl) ml aprox. mediante ZN mediante PCR
Sin dilución 73.000 365.000 Positivo Positivo
1a dilución 36.500 182.500 Positivo Positivo
2a dilución 18.250 91.250 Positivo Positivo
3a dilución 9.125 45.625 Positivo Positivo
4a dilución 4.563 22.813 Positivo Positivo
5a dilución 2.281 11.406 Negativo Positivo
6a dilución 1.141 5.703 Negativo Negativo
7a dilución 570 2.852 Negativo Negativo

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR para la detección del gen 18S rRNA de Cryptosporidium (522 pb)
en muestras de heces de terneras diarreicas. a: marcador molecular. b: control positivo. c: muestras positivas a Cryptosporidium spp.
d: DNA de Toxoplasma gondii. e: agua de PCR. f: pool de muestras de heces negativas a Cryptosporidium spp.
Agarose gel electrophoresis of PCR products of Cryptosporidium 18S rRNA gene (522 bp) in faecal samples from diarrheic calves. a:
molecular marker. b: positive control. c: positive samples for Cryptosporidium spp. d: Toxoplasma gondii DNA. e: PCR water. f: pooled stool samples
negative for Cryptosporidium spp.

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P muñoz y col
mediante PCR y ZN. La máxima dilución detectada por
ZN equivale a 4,6 x 103 ooquistes (22.813 ooquistes/ml),
en tanto que mediante PCR, fue posible detectar al pará-
sito en una dilución aun mayor, equivalente a 2,3 x 103
ooquistes (11.406 ooquistes/ml) (figura 2).
DISCUSIÓN
La cifra de infección por Cryptosporidium spp. de
49,8% encontrada en los animales que cursaban un cuadro
de diarrea fue mayor que las descritas por Gorman y col
(1986, 1989) de 23%, para la Región Metropolitana de
Chile. Esto contribuye a la contaminación ambiental de
tierras y agua de los predios, con el consecuente riesgo
de salud pública que esto pueda significar.
El control de esta parasitosis en los animales es muy
difícil, ya que prevenir la exposición de los terneros a la
contaminación es complicado. Las medidas sanitarias y
de higiene ayudan a prevenir la presentación de la enfer-
medad, a disminuir su prevalencia en zonas endémicas
y/o a atenuar el riesgo zoonótico (Ortega y col 1999).
Sin embargo, la sobrevivencia y diseminación de este
parásito es muy probable: primero, ya que los ooquistes
son inmediatamente infectantes al salir de su hospedero;
segundo, los ooquistes en el ambiente son muy resistentes
y pueden permanecer infectivos por dos a tres semanas,
incluso pueden sobrevivir en el suelo por más de 50 días
a temperaturas inferiores a los –10 °C (Kato y col 2002),
y tercero, los ooquistes son muy pequeños y resisten a la
cloración (Atías 1998, Sturbaum y col 2001, Krewski y
col 2004).
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de
PCR para la detección del gen 18S rRNA de Cryptosporidium
(522 pb) en muestras de heces de terneras diarreicas. a: marcador
molecular. b: muestra sin diluir equivalente a 365.000 ooquistes/ml.
c: primera dilución, 182.500 ooquistes/ml. d: segunda dilución,
91.250 ooquistes/ml. e: tercera dilución, 45.625 ooquistes/ml. f:
cuarta dilución, 22.813 ooquistes/ml. g. quinta dilución, 11.406
ooquistes/ml. h: sexta dilución, único carril en que no se observa
banda de amplificación.
Agarose gel electrophoresis of PCR products of Cryptospo-
ridium 18S rRNA gene (522 bp) in faecal samples from diarrheic calves.
a: molecular marker. b: samples without dilute, 365,000 oocysts/ml.
c: first dilution, 182,500 oocysts/ml. d: second dilution, 91,250 oocysts/
ml. e: third dilution, 45,625 oocysts/ml. f: fourth dilution, 22.813 oocysts/
ml. g: fifth dilution, 11,406 oocysts/ml. h: sixth dilution, no amplification
band was observed.
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Por lo tanto, las altas tasas de infección intrapredial
por Cryptosporidium spp. en predios lecheros analizados
en esta región pueden deberse a varias causas. Por una
parte, ha habido una mayor intensificación de los siste-
mas productivos, lo que se traduce en un mayor número
de animales, hacinamiento de éstos, sumado a posibles
deficiencias en las condiciones de higiene e inadecuadas
medidas de manejo. Así, por ejemplo, en este estudio,
ambos predios muestreados presentaban similares condi-
ciones de higiene y manejo, con terneros estabulados de
forma individual, pero con contacto directo entre ellos y
separados de la madre al momento de nacer, sin embargo
con adecuada administración de calostro. Las medidas de
higiene se basaban en la limpieza diaria de los corrales, con
extracción del material de cama y las deposiciones, pero
sin la aplicación de sustancias desinfectantes. Además,
a los animales que presentaban diarrea se les aplicaba
tratamiento antibiótico, pero en aquellos en que la diarrea
no cedía con éste, no se aplicaba ningún tratamiento o
medida adicional, tampoco se hicieron análisis o exámenes
de laboratorio, salvo los que finalmente se llevaron a cabo
debido a este estudio.
Como está descrito, un punto importante en la prevención
y el control de esta parasitosis es la eficiencia en las medidas
de manejo de los animales, tanto de tipo alimentario como
sanitario (Ortega y col 1999, Duszynski y Upton 2001).
Para lograr un óptimo resultado es muy importante contar
con el personal adecuado, tanto en la capacitación, como
en el compromiso con su trabajo. Este punto fundamental
no se cumplía a cabalidad en ninguno de los dos predios
muestreados, ya que en ambos el personal a cargo no era
estable porque no creaban un verdadero compromiso con
la actividad desempeñada.
Las medidas de manejo sugeridas en la literatura para
la prevención de la criptosporidiosis son: la destrucción de
ooquistes mediante aplicación de desinfectantes eficaces en
las zonas que habitan los animales, separación de animales
enfermos de sanos, instalar bebederos y comederos altos
para evitar la contaminación de éstos con heces. También
se aconseja la remoción diaria de materia fecal, controlar la
entrada de animales portadores de otras especies (perros,
ratones, etc.), mantener las maternidades limpias y des-
infectadas, controlar la temperatura y humedad de estos
lugares, y procurar que la ingestión de calostro y leche sea
la adecuada (Ortega y col 1999, Fayer 2004).
Es necesario recalcar que actualmente la criptospori-
diosis se considera tanto en los seres humanos, como en
algunos animales, una zoonosis reemergente (Almeida
y col 2006, Sunnotel y col 2006); lo anterior debido al
gran aumento de factores que pueden llegar a afectar el
sistema inmune, provocando inmunodepresión, la cual es
una condición preponderante en la presentación humana y
animal de esta enfermedad (Fayer y Xiao 2008).
En este estudio se confirmaron los diagnósticos micros-
cópicos (ZN) en muestras positivas y negativas seleccionadas
al azar usando una prueba IC diseñada originalmente para

detectar infecciones por C. parvum en muestras fecales hu-
manas. Esta indica que la especie presente en estos terneros
sería C. parvum. Sin embargo, para confirmar lo anterior
es necesario realizar estudios moleculares que validen
estos resultados; o bien enfrentar este test diagnóstico a
otras especies de Cryptosporidium descritas en bovinos,
previa identificación por biología molecular, en búsqueda
de presencia o ausencia de reacciones cruzadas.
Este es el primer reporte de uso de IC dentro del ámbito
veterinario en Chile para confirmar infecciones por este
protozoo en bovinos. Existe al menos un trabajo extranjero
que utilizó un kit IC, pero de diferente proveedor al utili-
zado en este estudio, con tan buenos resultados como los
aquí descritos, encontrándolo rápido, simple y amigable
(Trotz-Williams y col 2005).
Por otra parte, se desarrolló y estandarizó por primera
vez en Chile, en un laboratorio de diagnóstico veterinario,
un PCR género-específico para el diagnóstico de infecciones
por Cryptosporidium spp. en muestras de origen animal.
Mediante esta prueba molecular fue posible confirmar la
existencia de la infección en el 64% de las 58 muestras
ZN positivas procesadas. Posibles explicaciones para
los resultados PCR negativos en el restante 36% de las
muestras fecales serían: a) inadecuada extracción del DNA
desde los ooquistes del parásito (Wiedenmann y col 1998,
Nikaeen y col 2005); b) degradación del DNA extraído
y c) inhibición del PCR. En relación a estas dos últimas,
es posible afirmar que el material fecal puede contener
DNAsas bacterianas que pueden degradar el material
genético liberado. Además, se consideran inhibidores del
PCR a las sales biliares, bilirrubina y algunos complejos
polisacáridos (Wiedenmann y col 1998, Scorza y col
2003, Jaramillo y col 2008). La concentración de estos
inhibidores en las heces es muy variable y depende de
muchos factores como la dieta y flora intestinal de los
individuos. Otro inhibidor importante es el fitato (myo-
inositol hexafosfato), sustancia que se encuentra de forma
natural en cantidades importantes en el germen y en la
cutícula de las semillas vegetales; y que está presente en
grandes concentraciones en las heces de los animales
herbívoros, actuando como un potente inhibidor del PCR
(Thornton y Passen 2004). Los resultados obtenidos
muestran que es muy importante frente al uso del PCR,
como herramienta diagnóstica de agentes infecciosos en
muestras fecales de bovinos, considerar que la inadecuada
extracción y degradación del DNA blanco e inhibición
afectan la sensibilidad de la prueba.
A pesar de lo anterior, mediante el ensayo de PCR
desarrollado, el límite de detección fue superior que
al de ZN, ya que se logró detectar aproximadamente
104 ooquistes/ml de heces, equivalente a 2,3 x 103 ooquistes
totales en los 200 µl de muestra analizada; versus a los
2 x 104 ooquistes/ml de heces detectados, equivalente a
4,6 x 103 ooquistes totales en los 200  µl de muestra
analizada. Esto demuestra que el PCR es un método más
sensible, al ser capaz de detectar una menor cantidad de
ooquistes que el método microscópico evaluado.
Cryptosporidium, Ziehl Neelsen, PCR, terneros
Por último, se desea enfatizar que las infecciones por
Cryptosporidium spp. en terneros diarreicos continúan
siendo de elevada frecuencia en la Región Metropolitana
del país, lo que probablemente ocasiona un daño de magni-
tud en estos animales jóvenes de lechería. La observación
microscópica de muestras fecales, procesadas mediante ZN
en bovinos diarreicos, es útil para diagnosticar la infección
en animales. Sin embargo, dada su elevada dependencia
con el operador de la prueba, podría ser complementada
con el uso de tiras inmunocromatográficas o el empleo de
PCR, mejorando en este último la extracción y conservación
del DNA del agente.
Lo anterior, a pesar del mayor costo de implementa-
ción, permite confirmar los diagnósticos microscópicos
así como avanzar en el estudio epidemiológico molecular
de las especies del parásito que infectan a los animales y
al hombre. Desde el punto de vista de éxito terapéutico,
siempre es importante definir y confirmar que agentes
infecciosos causan cuadros diarreicos en los distintos
hospederos, en particular de aquellos agentes que tienen
una dificultad terapéutica como el aquí estudiado.
RESUMEN
Cryptosporidium causaría gran pérdida económica desde el punto
de vista productivo, sobre todo en sistemas que involucren la crianza de
bovinos afectando especialmente a animales menores de 30 días de edad
con distintos grados de diarrea. El propósito de este estudio fue detectar
Cryptosporidium spp. en muestras fecales de terneras diarreicas menores
de un mes de edad en dos predios lecheros de la Región Metropolitana.
Por primera vez en Chile se usó una prueba inmunocromatográfica (IC)
y una molecular (PCR) para confirmar la observación microscópica de
los ooquistes de Cryptosporidium spp. en la muestras fecales de bovinos
estudiadas. En 49,8% (102/205) de las muestras fecales se observaron
ooquistes de Cryptosporidium spp usando Ziehl Neelsen (ZN). De estas
muestras positivas se seleccionaron al azar 58 para confirmar los diagnósticos
mediante IC y todas resultaron también positivas. Diez muestras fecales
ZN negativas también fueron confirmadas como negativas mediante IC.
Mediante PCR en 37 de la 58 ZN positivas (64%) se obtuvo un resultado
positivo. La PCR también fue realizada en las diez muestras IC negativas
sin obtener amplificación. La técnica molecular fue capaz de detectar
muestras con menos ooquistes (104 ooquistes/ml) en comparación con
ZN (2 x 104 ooquistes/ml). Los resultados obtenidos permiten afirmar
que la criptosporidiosis bovina sigue siendo una infección parasitaria de
alta frecuencia en predios lecheros en la Región Metropolitana. Desde
el punto de vista diagnóstico, la combinación de ZN con IC permitiría
reducir la desventaja de ZN de ser una prueba operador dependiente.
Se requiere de nuevos estudios que busquen incrementar el rendimiento
de la PCR como prueba diagnóstica en la criptosporidiosis bovina. La
implementación de pruebas moleculares también contribuye al estudio
epidemiológico veterinario de esta parasitosis en una determinada área
geográfica.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer al Dr. Leonardo Sáenz, Centro
Biotecnológico Veterinario de la Facultad de Cs. Veterinarias y Pecuarias,
Universidad de Chile, por su apoyo y orientación en la estandarización
de la prueba molecular. Además, se agradece a los propietarios y al
personal de las lecherías en cuestión por su colaboración, incluidos los
Dres. Luis Moraga y Mario Duchens.
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P muñoz y col
REFERENCIAS
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