Enginyeria genètica – Albert Anna Martín Lujano

Indicadors

Els indicadors més emprats són:

 Digoxina
 Biotina

Com que ambdues són molècules molt grans, posem

uns separadors al mig. Si és DNA, el separador serà
digoxina-11- dUTP o biotina-16-dUTP. En el cas de que
tinguessim RNA, emprariem UTP.

Cal tenir en compte, que la digoxina s’empra com un anticòs

i la biotina com a streptavidina. (¿)

En quant a l’adaptador o marcador, tenim:

 La sonda de biotina s’uneix amb avidina o
estreptavidina conjugada amb un flurocrom. En
aquest cas, la constant d’afinitat per la avitina per la
biotina són de 10^-15 (de les més altes que
existeixen). Es detecta per fluorometria:
o Fosfatasa alcalina (AP)
o Peroxidasa (HRP)
o Fluoresceïna o rodamina

 La sonda marcada amb digoxenina en forma d’anticòs s’uneix conjugat a un enzim. Aquest enzim dona lloc
a un producte. L’addició de substrat es transforma en un producte colorejat o luminiscent. Es pot dur a
terme per detecció:
o Detecció colorimètrica
o Fluorimètrica
o Quimioluminiscent.

Transcriptòmica
És l’estudi del transcriptoma a nivell massiu.

Northern Blot: ens permet detectar els nivells de DNA. A partir d’un gel. La mostra és RNA. Actualment es fan
per la PCR a temps real (quantitativa).

Amb el temps hi ha tècniques per detectar desenes de gens. Anteriorment es podien emprar dot blots o slot
blots. Actualment s’empra la PCR a temps real. S’empra un fluidigim (permet fer una PCR de 46 gens). El sistema
s’ha automatitzat.

Actualment ens permeten detectar l’expressió de tots els gens d’un genoma. És que s’entèn per
transcriptòmica. Hi trobem: arrays, NGS…

MRNA levels compared in many different contexts

Enginyeria genètica – Albert Anna Martín Lujano

RNA dot blot

S’analitzen ratolins transgènics,que tenen sobreexpressada una
proteïna MEK1. Hi ha diferentst línies de ratolins transgènics. S’ha
aïllat el RNA del color i s’han analitzat difernets gens, per a veure
com l’exressió d’un aproteïna influeix en la expressió dels altres
gens. En cada pouet s’ha posat la mateixa quantitat de sang.
En tots els punts tenim la mateixa quantitat de mostra, sobre un
filtre. S’hibriden les sondes amb les mostres. Del gen ANF, es
sobreexpressa. El beta miosina HC, no es sobreexpresa. El GAPDH
és el gen control, perquè és un housekeeping (s’expressa al mateix
nivell, mateixa quantitat independentment del tractament que li
fem). El resultat del GAPDH ens indica que les mostres són
uniformes i que realment hem posat la mateixa quantitat. Ens
permeten normalitzar. Dona idea de la variabilitat entre les
diferents mostres.

El gen ANF és el que més s’expressa respecte el control.

RNA ARRAYS / GENE CHIPS

Colecció de molècules de DNA (fins >10^6) de seqüència coneguda (sonda) unides permanentment a un suport
sòlid (platform) i ordenades en celdes (features or spots) que s’hibriden amb la mostra que conté la població de
mRNAs (target), els nivelld d’expressió dels quals volen analitzar-se (cualitativa o quantitativa).

Array = suma de sondes de DNA

Les sondes estan inmobilitzades, ben enrassades.

Les sondes les hibridem amb la mostra.

En el cas dels arrays, les sondes estan inmobilitzades i marquem les mostres. És justament el contrari.
Per treballar amb un array:
 Fixar les sondes sobre el suport sòlid
 Preparar la mostra per a la detecció
 Hibridar amb la sonda
 Registrar el resultat
 Analitzar les dades

Hi ha dos grans tipus d’arrays: PRINTED i IN SITU.

Depenen de la manera en què les sondes de DNA s’inmobilitzen:

- Printed o spotted arrays: les sondes es llencen contra el suport sòlid. Permet “imprimir” el xip.
Podem tenir sondes de dos tipus:
o Fragments de cDNA llargs: el suport sòlid pot ser una membrana de nylon o un porta de vidre.
Depenent de la quantitat de sondes que s’enganxin, tenim arrays de baixa o alta densitat. En el cas
de nylon, màxim 1.000 sondes (baixa densitat). El portaobjectes permeten 10.000.

o Oligonucleòtids: de 25 a 80 bases. Sempre s’utilitzen portaobjectes de vidre.

Preparació de la mostra: hibridació competitiva: tenim una mostra A (control) i una mostra B (problema). En
ambdos casos obtenim l’mRNA. Les convertim en cDNA. Durant el procés aprofitem per a marcar-les (amb
marcadors diferents). Incorporem nucleotids:
 Cy3 -> verd
 Cy5 -> vermell
Enginyeria genètica – Albert Anna Martín Lujano
Es barrejen quantitat iguals (1:1) de les dues mostres i s’hibrida amb les sondes. Es renta per elimina la mostra
que no ha quedat hibridada. S’ilumina amb un làser que estimula el Cy3, de manera que tindrem color verd. Si ho
fem amb una longitud d’ona diferent, s’excitarà el vermell. Ho tenim per separat. Es superposen les dues imatges
i convinar-les.
Durant el procés hi ha una competència. Si un determinat RNA només està present en el RNA marcat verd,
només tindrem color verd. Si tenim la mateixa quantitat de RNA, tindrem una proporció 50% de cada color. Al
juntar les imatges donarà color taronja.
Si estan més representades en el color verd, donaran un color verd més intens i el mateix per al color verd.

- In situ synthesized microarrays: les sondes es construeixen sobre el suport sòlid.

TEMARI BEA

Les representacions no només es poden emprar per anàlisi d’expressió gènica.

La densitat de dades que s’arriba a donar pot ser realment gran. És una
analítica feta amb pacients que pateixen o patiran la malaltia de
Huntington.
Els resultats segueixen grans patrons.

Hi ha 14 persones control, 5 persones diagnosticades sense clínica i 12

pacients simptomàtics. Cal veure que realment es poden estableir
correlacions de patrons globals d’expressió amb relació al prognòstic i
evolució d’una determinada malaltia.
Els control estan regulats a la baixa. En gent simptomàtica els gens es
troben sobreexpressats.
Una analítica d’aquest tipus pot ajudar a diagnosticar si aquestes persones
patiran o no la malaltia (per si sol no és diagnòstic, però podria ser útil per a fer un diagnòstic precoç juntament
amb altres proves).

Gens affimètrics
Poden haver-hi un milió de sondes diferents. No hi ha cap animal que tingui tants gens. Aquest excés d’oferta
davant d’una demanda més petita té sentit perquè
Ens permet detectar els canvis de nivells de mRNA.
La utilització de gens de DNA es basa en la tècnica de la hibridació.
Quan es dissenyen les sondes, es fa un disseny teòric, i pot no funcionar o donar hibridació creuada. Si en cada
xip es posés només una sonda per cada gen que volem detectar, correm el risc de que no hibridi correctament,
Enginyeria genètica – Albert Anna Martín Lujano
perquè la hibridació és un procés depenent de seqüènica. Es col·loquen varies sondes per a cada RNA, de
manera que és improvable que totes les sondes funcionin incorrectament.
En el cas dels xips afimètrics, s’acostumen a posar entre 11 -14 sondes per cada gen. A la part superior veiem les
diferents posicions a les quals s’han fet les sondes al llarg del gen.
Es posa un segon joc de sondes que ocupen exactament la mateixa zona però tenen una diferència d’un sol
nucleòtid.
Trobem:
- Perfect match: són 100% complementàries al RNA diana.
- Mismatch: és igual a l’anterior excepte una posició (que acostuma a estar centrada).
La finalitat és confirmar que la perfect match hibrida
perfectament i la mismatch no dona senyal perquè hi ha
un nucleòtid no complementari (al trobar-se central, té un
gran efecte desestabilitzador).

El resultat es troba a l’esquema inferior, que indica la

intensitat de fluorescència.
 Quadrats blancs: fluorescència màxima
 Quadrats negres: no han hibridat, no hi ha
fluorescència.

Idealment esperariem que tots els superiors fossin blancs

i els inferiors negres. Però hi ha parelles en que les dues
sondes donen una senyal intermitja, el que vol dir que la sonda no discrimina. La sonda hibrida de forma poc
específica.
Del conjunt de sondes, hi ha unes quantes que no serveixen. Si només haguesism posat aquella sonda, no es
podriem fiar del resultat, cosa que no sabriem perquè no tindriem les altres de referència. Quan es captura la
fluorescència, es marquen uns llindars i ja no es consideren per fer els càlculs posteriors.

Aplicacions dels arrays

 Identificar nous gens que poden estar implicats en el desenvolupament d’una patologia.
 Identificar els culpables per associació. Trobar els gens que canvien la seva expressió quan hi ha patologia.
 Ajudar a assistir en el diagnòstic diferencial de malalties, que per la seva clíncia no són diferenciables.
Relevant en malalties del SNC. Poder distingir una demència vs Alzheimer. Els anàlisi de perfil gènica ajuden
però no són definitius per si sols!!
 Estudiar els efectes dels fàrmacs al genoma —> farmacogenòmica. Veure canvis en el patró d’expressió
gènica després d’administrar un determinat fàrmac. Poden arribar a entendre possibles efectes adversos,
toxicitat, vies de metabolització, mecanisme d’acció.
 Identidicar les signatures d’expressió o biomarcadors per predir el curs de la malaltia i assistir en la teràpia.

Exemple càncer de mama

Canvis en el patró d’expressió de 61 gens, que es consideraven els més
adicents per fer un prognòstic de pacients que patien càncer de
mama.
Es van establir 5 grans grups d’expressió gènica. Es va establir una
relació entre els patrons d’expressió gènica i la taxa de supervivència
al llarg de 48 mesos. Hi ha clarament una associació.

Cal altres eines diagnòstiques i pronòstiques.

Enginyeria genètica – Albert Anna Martín Lujano
Exemple de càncer de mama 2
Cas de pacients amb càncer de mama. A partir d’aquesta analítica es
van poder classificar en dos grans blocs: bon i mal prognòstic. Es van
analitzar diferents gens i a partir de la línia groga hi ha una diferència
del patró d’expressió.
Els patrons es correlacionen amb l’evolució de la malaltia.
La taca negra (barra horitzontal dreta) representa dones que al llarg de
cap de 5 anys de dona que estaven lliure de la malaltia. Per sota, mal
prognòstic.

Anàlisi del genoma (DNA)

La mostra és DNA. Una de les aplicacions és analitzar polimorfismes. Estem dins de l’àmbit de la
farmacogenètica: de quina manera la genètica actua sobre els fàrmacs. Ens pot explicar perquè hi ha gent que
toleren bé fàrmacs i d’altres no, efectes adversos…

Mirar del Campus – matèria avaluable:

Mirar videos campus
Figura 2a – peu de lletra (artícle)
2 animacions de com s’utilitzen arrays.

Els arrays que emprem per analitzar el DNA són de oligos i poden ser de dos tipus:
- De genoma complet o tiling (enrajolats): són oligonucleòtids curts que poden estar situats de manera que
són adjacents (no queden gaps entre sondes). Per cobrir tot un
genoma, s’han de posar varios arrays. En molts casos es troben solapats
(hi ha una regió comuna) i en alguns casos extrems, el solapament es
tan extrem, que la diferència entre sondes és d’una sola base. Quan
més solapats són, més resolució a nivell de seqüència tenen. Per a
cobrir tot un genoma, necessitem moltíssims arrays. El tipus d’array
depèn del que volguem investigar.
- Gairebé genoma complet: el conjunt de sondes no cobreix la totalitat
del genoma. Es troben espaiades.

Exon discovery
L’objectiu de l’experiment era confirmar uan predicció
teòrica d’axons d’un gen determinat (cromosoma 22). Es va
dissenyar un array que cobria les 10 kbases. L’array tenia
oligos de 60 bases que tenien un desplaçament de 10 bases
respecte l’altre. Un grau de resolució bastant alt. Es va
hibridar l’array amb cDNA. El resultat indica que hi ha tot un
conjunt de sondes que donen senyal i anterior i
posteriorment no donen cap tipus de senyal.

Si fem una apliació, es veu que hi ha sondes que troben

senyal. Quan la seqüència es va comprar amb la seqüència
predita de l’exó, aquesta és ideal.

Si analitzem l’exó 3, una de les regions cap a l’esquerra

també hibridaven. En realitat l’exó 3 comença 2 parells de
bases cap a 5’ del que estava predit.

Immunoprecipitació de cromatina
CHIP on chip
CHIP: immunoprecipitació de cromatina.
Enginyeria genètica – Albert Anna Martín Lujano
L’experiment s’acaba amb un xip d’un array.
L’objectiu dels experiments és detectar seqüències del DNA on
interaccionen proteïnes.
La cromatina és el DNA amb totes les proteïnes que hi estan
interaccionant (principalment les histones).