ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF

MICROORGANISM

Nama : Adib Ramadani

NIM : B1A016093
Rombongan :I
Kelompok :2
Asisten : Destalinda Rika Safira

PRACTICAL REPORT OF MICROBIAL SYSTEMATICS

MINISTRY OF RESEARCH, TECHNOLOGY, AND HIGH EDUCATION

JENDERAL SOEDIRMAN UNIVERSITY
BIOLOGY FACULTY
PURWOKERTO
2019
 I. INTRODUCTION

Microorganism isolation is a method to separate or move certain microbes

from the environment so that we get pure culture. Pure culture is a culture in which
microbial cells originate from the division of a single cell. Pure culture is very useful
in microbiology, namely to examine and identify microorganisms in microbiology
(Pelczar & Chan, 2007).
Characterization is an activity that aims to determine the morphological and
physiological nature of a living creature. Characterization of microorganisms can be
done by several methods such as macroscopic observation of colonies, microbial
staining to determine the microscopic appearance of cells and to distinguish groups of
microorganisms, as well as characterization by a series of biochemical tests that reflect
the enzymatic metabolic activity of microorganisms (Capuccino & Sherman, 1992).
Characteristics of microorganisms can be done by several methods such as
microscopic observation of colonies, microbial staining, to determine the appearance
of microscopic, cell and distinguish groups of microorganisms, as well as
characteristics with a series of biochemical tests that reflect the metabolic activity of
microorganisms (Yanti, 2016).

Tests conducted on the practicum, isolation and characterization of

microorganisms includes: observation of colony morphology, this observance is done
after getting pure culture. Macroscopic observations include the shape, color, edges
and elevation of bacterial colonies. The surface of the colony can be seen from the
side, and the edge of the colony can be seen from the top of the petridish (Ismail et al.,
2017). Morphological test was done by motility test and Gram staining. Gram staining
is done by making dry curvature on the slide. Bacterial dry spots are dripped with
purple crystalline coloring and flooded for 1 minute, then rinsed with distilled water.
Furthermore, iodine gram dips for 2 minutes, then rinsed again. Then blanched by
dripping 95% alcohol onto the bacterial incapacity until the remaining purple krital
dye dissolves. Next, drop with safranin coloring for 30 seconds then rinse. The dyes
that have been stained are observed under a microscope at 1000x magnification
(Apriani, 2015). The motility test was carried out with semi-solid media, taken as
much as one ose of bacterial isolates and vertically inoculated on the SIM media. Then
incubated for 48 hours at 37 ° C. Positive bacterial motility test results can be seen with
the growth of bacteria on the surface of the media or not only the marks on the
puncture, while non-motile bacteria grow along the puncture (Amaliah et al., 2018).

Endoenzyme test is done in two ways, namely oxidase test and catalase test.
Oxidase test The oxidase test is carried out by means of filter paper measuring ± 2-3
times the size of the colony with tetramethyl paraphenildiamin reagent, then the filter
paper is placed directly above the colony and left for 10 minutes. This test shows a
positive response if a colony changes color to a dark purple color, whereas a negative
response is indicated by no occurrence discoloration (Putri et al., 2017). The catalase
test was carried out using hydrogen peroxide (H2O2) 3%. The isolate is taken from the
culture stock and placed on the slide. One to two drops of 3% H2O2 are added to the
isolate. If bubbles form indicates catalase-positive bacteria, and if not then it indicates
catalase-negative bacteria (Amaliah et al., 2018).

The purpose of this practicum is to know the steps of microbial isolation to

separate the microbes from the mixture so that they get pure culture and know the steps
or stages of bacterial characterization, namely morphologically, enzymatically,
physiologically, and biochemically.

II. MATERIALS AND METHODS

A. Material
 The tools that used in this practical activity are sterile spoons, sterile plastic bag,
aluminum foil, tube racks, test tubes, bunsen burners, measuring pipette, sprayers,
fillers, dropper pipettes, petri dishes, drugalsky rods, ose needles, glass objects,
durham tubes, sterile tubes, paper straw, and microscope.
The materials that used in this practical activity are paddy field soil samples,
distilled water, alcohol, Gram A (crystal violet), Gram B (Lugol's iodine), Gram C
(Ethanol 96%), Gram D (safranin), Nutrient Agar (NA) medium, Nutrient Broth (NB)
medium, Mineral + Fat medium, Skim Milk Agar (SMA) medium, Starch Agar (SA)
medium, Carboxyl Methyl Cellulose (CMC) medium, sugar test medium (lactose,
arabinose, galactose, glucose , fructose and sucrose) and Sulfide Indole Motility Agar
medium (SIMA), H2O2 catalase reagent, oxidase reagents
(tetramethyl-p-phenylenediaminedihidrochloride).

B. Method
B.1 Soil Isolation

One gram of paddy soil is taken with a depth of 30 cm. Soil samples were
stratified using 9 ml of distilled water up to 10-5. The last three dilutions were platting
on NA medium by spread plate and incubated at room temperature for 2 x 24 hours.
The growth colonies were selected by 5 isolates and quadrant streaked and incubated
for 2 × 24 hours to produce purified isolates. The purified colony was inoculated on
the NA sloping medium streaked continuously and on NB media by dipping the
isolate into the medium and incubating at room temperature for 2 x 24 hours.

B.2 Characterization

B.2.1 Morphology

a. Macromorphology
Purification colony was observed its morphological macro characters,
namely shape, color, elevation, edge, surface, and size of the colony.
b. Motility test
Solid isolates were inoculated on the SIM A medium medium sterile tube
using a sterile prick and incubated for 1 × 24 hours at room temperature.
c. Micromorphology
Purification colonies were observed for their micromorphological characters by
observing the properties of grams and cell shapes. Observation of gram properties can
be done by methods including each isolate from incubation results (A, B, C, D, E)
reviewed on a glass object that has previously been dripped with sufficient distilled
water and fixed 2-3 times over bunsen fire, isolates dropped with Gram A (crystal
violet) and allowed to stand for 60 seconds, rinse with distilled water and then
washed-dry-air-dry, isolate drops with Gram B (Lugol's iodine) and allowed to stand
for 60 seconds, rinse with distilled water and then washed-dry-wind- the isolate was
rinsed with Gram C (ethanol 96%) until clean, then washed-dried-air-dried, the isolate
was dropped with Gram D (Safranin) and allowed to stand for 45 seconds, rinsed with
distilled water and then washed-dried-air-dried, After staining, isolates were observed
under a microscope to find out the cell shape and gram type.
B.2.2 Biochemistry
B.2.2.1 Exoenzyme
a. Amylolytic Assay
Recultured solid isolates on NA (Nutrient Agar) medium were taken using
an ose needle and then streaked with ½ quadrant streak on the SA (Starch
Agar) medium aseptically and incubated for 1 × 24 hours at room temperature.
b. Proteolytic Assay
Recultured solid isolates on NA (Nutrient Agar) medium were taken using
an ose needle and then streaked with ½ quadrant streak on the SMA (Skim
Milk Agar) medium aseptically and incubated for 1 × 24 hours at room
temperature.
c. Lypolytic Assay
Recultured solid isolates on NA (Nutrient Agar) medium were taken using
an ose needle and then streaked with full quadrant streak on the MM+lipid
medium aseptically and incubated for 1 × 24 hours at room temperature.
d. Cellulose Assay
Recultured solid isolates on NA (Nutrient Agar) medium were taken using
an ose needle and then streaked with ½ quadrant streak on the CMC medium
aseptically and incubated for 1 × 24 hours at room temperature.
.

B.2.2.2 Endoenzyme
a. Oxidase Assay
 Solid isolate were taken using an ose needle then swab on filter paper in
the object glass aseptically. Isolates were dropped by oxidase reagent
(tetramethyl-p-phenylenediaminedihidrochloride) and observed by
interpretation if positive (+) dark blue discoloration occurs on the paper filter,
while negative (-) color changes do not occur on filter paper.
b. Catalase Assay
Solid isolates were taken using an ose needle and then aseptically swab on
the glass object. The isolate drops with catalase reagent (H2O2) then observe
with interpretation when positive (+) bubbles form, while negative (-) bubbles
do not form.

B.2.3 Physiologic
a. Effect of PH on Bacteria
Liquid isolates were inoculated on Nutrient Broth medium with a pH of 3,
7, and 11 using a 0.1 ml measuring pipette and incubated for 1 × 24 hours at
room temperature. Interpretations observed if the positive (+) medium will be
cloudy/ turbid and if the negative (-) medium remains clear.
b. Effect of Temperature on Bacteria
Liquid isolates were inoculated in NB medium as much as 0.1 ml
aseptically and incubated at 4o C, RT, and 60o C for 1 × 24 hours.
Interpretations observed if the positive (+) medium will be cloudy/ turbid and if
the negative (-) medium remains clear.
c. Effect of Osmotic Pressure on Bacteria
Liquid isolates were inoculated in NB medium with different osmotic
pressures of 0.5%, 2%, and 3% using a 0.1 ml measuring pipette and incubated
for 2 × 24 hours at room temperature. Interpretations observed if the positive
(+) medium will be cloudy/turbid and if the negative (-) medium remains
clear.
B.2.4 Acidform
a. Sugar Assay
The incubated isolates (A, B, C, D, E) were taken as much as 0.1 ml and each
of them was put into a medium containing types of sugars (glucose, sucrose,
lactose, fructose, galactose, and arabinose) and then incubated during 2 x 24
hours at room temperature. Positive interpretation (+) occurs if there are
 bubbles in the Durham tube and the media turns yellow and negative (-) if there
is no change.
b. Uji Oksidatif-Fermentatif
Tusuk steril dicelupkan ke dalam isolat cair hasil inkubasi (A, B, C, D, E)
kemudian dilakukan stab inoculation ke dalam 2 medium OF basal. Salah satu
medium OF ditambahkan dengan 2-3 tetes parafin cair, lalu diinkubasi selama
2 x 24 jam dalam suhu ruang. Interpretasi positif (+) jika kedua medium terjadi
perubahan warna menjadi kuning dan terbentuk gas dan negatif (-) jika tidak
ada perubahan warna dan gas.

III. RESULT AND DISCUSSION

 Tabel 3.1 Characterization Observation Test Results
Test Isolate
A B C D E
Gram positive + + + - +
Gram negative - - - + -
Basil - - - - +
Coccus + + + + -
Motility + + + - -
Catalase - - - - -
Oxidase + - + + +
Protease - + + + +
Lipase - + + + -
Amylase - - - + +
Cellulose - - - + +
Oxidative - + + + +
Fermentative + + + + +
Oxidative- fermentative - + + + +
Temperature 4o + + + + +
SR + + + + +
50o - - - - -
60o - - - - -
Osmotic 1% + + + + +
Pressure
2% + + + + +
3% - + + + +
pH 3 - - - - -
7 + + + + +
11 + + + + +
Gula Glucose + + + + +
Fructose + + + + +
Galactose - + + - +
Lactose + + + + +
Arabinose - + + - +
 Sucrose + + + + +
Nutrisional Glucose + + + + +
Fructose - + + - +
Galactose + + + + +
Lactose + + + + +
Arabinose + + + + +
Sucrose - + + - +

Table 3.2 Observation Result of Isolate Morphology Group 2 Entourage II

Isolate
Character
A B C D E
Color Putih Putih susu Putih susu Opaque Putih
Shape Irregular Circular Circular Irregular Circular
Size Moderate Kecil Kecil Moderate Moderate
Margin Undulate Rata Rata Undulate Rata
Surface Mengkilap Mengkilap Berkerut Mengkilap Mengkilap
Elevation Rassed Flat Cembung Raised Convex
Gambar 3.2 Hasil Pemurnian
Isolat C

Gambar 3.1 Hasil Pemurnian

Isolat A

Gambar 3.3 Hasil Pemurnian

Isolat B
Gambar 3.4 Hasil Pemurnian
Isolat D
Gambar 3.5 Hasil Pemurnian Gambar 3.6 Hasil Isolat A, B, C, D, dan E
Isolat E
Hasil pengamatan dari karakter makromorfologi menunjukkan adanya lima isolat
yang terdiri dari isolat A, B, C, D, dan E. Lima isolat tersebut memiliki permukaan
yang sama yaitu mengkilap kecuali yang C memiliki permukaan yang berkerut.
Elevasi isolat A dan D adalah raised, sedangkan untuk isolat B, C dan E
masing-masing memiliki karakter yang berbeda yaitu flat, cembung dan convex.
Tepinya rata dan bentuknya circular untuk isolat B, C dan E, sedangkan untuk isolat A
dan D adalah tepi undulate dan bentuknya irregular. Ukuran isolat B dan C small
sedangkan isolat A, D dan E memiliki ukuran yang moderate. Warnanya pun sedikit
berbeda pada isolat D berwarna opaque sedangkan yang lain berwarna putih susu
untuk isolat B dan C, putih untuk isolat A dan E. Hasil tersebut sesuai dengan
pernyataan Dwijoseputro (2005), bahwa koloni bakteri memiliki sifat-sifat khusus
dalam media padat. Pada agar lempengan bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik,
bulat, berbenang, tak teratur, serupa akar dan kumparan. Permukaan koloni dapat
rata, timbul datar, melengkung, mencembung, membukit, dan serupa kawah.
Sedangkan tepian koloni dapat berbentuk utuh, berombak, berbelah, bergerigi,
berbenang, dan keriting. Pada warna, koloni bakteri sebagian besar berwarna
keputihan atau kekuningan, akan tetapi dapat juga berwarna lain seperti kemerahan,
coklat, jingga, biru, hijau dan ungu. Isolat yang dipilih untuk karakterisasi
merupakan koloni bakteri yang dispekulasikan berbeda spesies. Koloni yang dipilih
juga sebisa mungkin koloni yang saling terpisah dan bukan spreader.
 Gambar 3.7 Hasil Uji Motilitas
Karakterisasi morfologi bertujuan untuk mengamati baik morfologi koloni
maupun morfologi sel bakteri pada isolat bakteri yang telah lolos seleksi. Ketika
ditumbuhkan dalam media yang bervariasi, mikroorganisme akan menunjukkan
penampakan makroskopis yang berbeda-beda pada pertumbuhannya. Perbedaan ini
disebut dengan karakteristik kultur, yang digunakan sebagai dasar untuk memisahkan
mikroorganisme dalam kelompok taksonomik. Isolat bakteri yang diperoleh diamati
morfologi koloni dengan melihat bentuk koloni, warna, tepian dan elevasi pada
medium agar lempeng, agar tegak dan agar miring. Sedangkan morfologi sel
ditentukan dengan melihat olesan biakan yang sudah diwarnai dibawah mikroskop
dan melihat bagaimana bentuk sel, sifat gram dan kemampuan membentuk spora dari
bakteri tersebut (Capuccino & Sherman, 1992). Isolat A, B, C, D, dan E setelah
diamati makromorfologinya dilihat pergerakannya atau uji motilitas, dimana isolat A,
B, dan C menghasilkan interpretasi positif atau koloni yang menyebar, sementara
isolat D dan E negatif atau koloninya tidak menyebar.

Gambar 3.8 Hasil Uji Amilolitik Gambar 3.9 Hasil Uji Lipolitik
Uji amilolitik adalah uji untuk mengetahui aktivitas enzim amilase dalam
menghidrolisis amilum. Uji ini menggunakan pati sebagai nutrisi mikroba yang
dihidrolisis menjadi bentuk yang lebih sederhana, yaitu glukosa. Enzim amilase
memecah ikatan glikosidik dari pati. Ikatan tersebut terletak di α-1,4 rantai glukan
pati sehingga menghasilkan glukosa yang akan terlarut dan masuk kedalam sel. Hal
tersebut dapat dilihat dengan memberikan reagen lugol’s iodine pada koloni. Pati
akan bereaksi dengan lugol’s iodine dan membentuk kompleks biru-hitam pada
media. Terbentuknya zona jernih disekitar koloni yang tumbuh menunjukkan bahwa
isolat tersebut dapat menghidrolisis pati (Rehm, 1987). Berdasarkan hasil yang
diperoleh hanya isolat D dan E yang memiliki interpretasi positif ditunjukkan dengan
terbentuknya zona jernih di sekitar koloni. Isolat A, B dan C tetap berwarna
biru-hitam yang menunjukkan bahwa isolat tersebut tidak dapat menghidrolisis pati.
Uji lipolitik adalah uji untuk mengetahui kemampuan sel dalam menghasilkan
lipase untuk menghindrolisis lemak. Untuk mendpatkan nutrisi dari lipid, terlebih
dahulu sel harus menghidrolisis lemak. Pecahnya trigliserida dikarenakan putusnya
rantai – R = hidrokarbon. Media yang biasa digunakan adalah media mineral (MM)
yang ditambahkan lemak (Rehm, 1987). Berdasarkan hasil yang diperoleh dari uji
lipolitik yaitu interpretasi positif di dapatkan dari isolat B, C, dan D karena terbentuk
bintik-bintik merah dibawah koloni dan media berubah warna menjadi sedikit
kekuningan. Sedangkan untuk interpretasi negatif didapatkan pada isolat A dan E
karena tidakterbentuk bintik-bintik merah dibawah koloni. Umumnya olive oil
dipilih sebagai sumber lemak. Media atersebut juga mengandung indikator pH
neutral red, sehingga apabila sel dapat menhidrolisis lemak, media akan berubah
warna menjadi kuning atau kekuningan dengan bintik-bintik merah terbentuk
dibawah koloni yang tumbuh (Dwidjoseputro, 2005).

Gambar 3.10 Hasil Uji Gambar 3.11 Hasil Uji

Selulolitik Proteolitik
Selulosa adalah senyawa organik yang paling melimpah di biosfer, terhitung
lebih dari setengah dari semua karbon organik di planet ini. Mengenai hal ini,
perkembangan teknologi yang menggunakan polisakarida ini sebagai sumber energi
untuk menggantikan bahan bakar fosil kepentingan mendasar untuk pemeliharaan
manusia di planet ini (Cassia, 2014). Hasil uji selulolitik yang diperoleh dari
berbagai isolat didapatkan bahwa interpretasi positif karena terbentuknya zona
bening disekitar koloni ditunjukan oleh isolat D dan E. Sedangkan untuk isolat A, B
dan C menunjukan hasil interpretasi yang negatif karena tidak terbentuknya zona
bening disekitar koloni.
Uji protease adalah uji untuk mengetahui kemampuan menghasilkan protease
untuk menghidrolisis protein menjadi asam amino. Proses hidrolisis protein
berlangsung secara bertahap sebelum akhirnya menjadi asam amino. Reaksi hdrolisis
protein akan memutuskan ikatan peptida. Proses tersebut disebut peptonisasi atau
proteolisis dan dilakukan menggunakan enzim ekstraseluler protease (Wilbraham &
Michael, 1992). Aktivitas proteolitik dikatakan berhasil apabila terbentuk zona
bening disekitar koloni yang tumbuh pada media protease agar. Pembentukan zona
bening dikarenakan isolat bakteri mikroorganisme dapat memecah sebagian kasein
yang terdapat pada media menjadi molekul yang lebih sederhana untuk kemudian
dapat diserap (Pelczar & Chan, 1986). Berdasarkan hasil yang diperoleh
menunjukkan bahwa uji yang dilakukan positif pada isolat B, C, D dan E, sedangkan
untuk isolat A menunjukan bahwa uji tersebut negatif karena tidak terbentuknya zona
bening.

Gambar 3.12 Hasil Uji Gambar 3.13 Hasil Uji

Katalase Oksidase Isolat A dan B

Gambar 3.14 Hasil Uji

Oksidase Isolat C, D, E
 Uji katalase merupakan suatu pengujian untuk mengetahui apakah bakteri yang
diuji merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob. Bakteri aerob akan
menghasilkan hasil metabolik sekunder yang sebenarnya merupakan zat toksik bagi
bakteri itu sendiri, yaitu gas hidrogen peroksida (H2O2). Selain itu, uji ini juga dapat
membuktikan bahwa bakteri aerob tersebut masih tetap dapat bertahan hidup karena
dapat menghidrolisis hidrogen peroksida dengan bantuan enzim katalase. Reaksi
yang terjadi adalah : H2O2 2H2O + O2. Bakteri tersebut dikatakan positif
aerob atau dapat menghidrolisis H2O2 apabila setelah diberi reagen katalase (H2O2)
terbentuk gelembung gas (Hadioetomo, 1993). Hasil uji katalase yang diperoleh dari
berbagai isolat didapatkan bahwa interpretasi negatif ditunjukan oleh semua isolate
karena tidak mampu menghidrolisis H2O2sehingga terbentuk gelembung gas.
Sedangkan hasil uji oksidase yang diperoleh dari berbagai isolat didapatkan
bahwa interpretasi positif ditunjukan oleh isolat A, C, D dan E karena terbentuk
warna biru tua, sedangkan untuk isolat B dan E memiliki interpretasi negatif. Hal ini
sesuai dengan pernyataan Cappucino & Sherman (1992), bahwa isolat bakteri dapat
memproduksi sitokrom oksidase. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob,
fakultatif anaerob dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen
sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat menjadi energi.
Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi
yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni. Reagen yang biasa
digunakan adalah tetramethyl–p–phenylenediamine dihidrocloride. Reagen ini
mendonorkan elektron pada enzim untuk dioksidasi membentuk kompleks warna
biru marun.

Gambar 3.15 Hasil Pewarnaan Gambar 3.16 Hasil Pewarnaan

Gram Isolat A Gram Isolat B
Gambar 3.17 Hasil Pewarnaan Gambar 3.18 Hasil Pewarnaan
Gram Isolat C Gram Isolat D

Gambar 3.19 Hasil Pewarnaan

Gram Isolat E
Karakterisasi dilakukan secara makroskopi dan mikroskopi. Dimana Pengamatan
makroskopis bakteri dilakukan dengan melihat bentuk dan warna koloni bakteri,
bentuk koloni di lihat dari atas untuk melihat bentuk koloni secara menyeluruh, dari
samping untuk melihat penonjolan koloni dan dilihat bentuk tepi koloni. Pengamatan
mikroskopi yaitu Pewarnaan gram dengan menggoreskan 1 ose isolat bakteri di atas
object glass, lalu diberi beberapa zat warna dan kemudian di amati di bawah
mikroskop, perbedaan warna pada dinding sel bakteri menunjukkan golongan bakteri
tersebut. Apabila berwarna ungu maka bakteri tersebut termasuk golongan gram
positif, jika berwarna merah maka bakteri tersebut termasuk gram negatif (Hairdiana,
2016). Isolat D merupakan satu-satunya isolat bakteri Gram negatif. Hal ini dapat
diketahui dengan melihat hasil uji yang berwarna kemerahan. Sedangkan untuk hasil
isolat A, B, C, dan E merupakan isolat gram positif, karena dapat diketahui denan
melihat hasil uji yang berwarna ungu.
Gambar 2.20 Hasil Uji Gula Gambar 3.21 Hasil Uji Gula
dan Acid Form Isolat A dan Acid Form Isolat B

Gambar 3.22 Hasil Uji Gula Gambar 3.23 Hasil Uji Gula
dan Acid Form Isolat C dan Acid Form Isolat D

Gambar 3.24 Hasil Uji Gula

dan Acid Form Isolat E
Uji biokimiawi gula dan uji nutrisional digunakan untuk mengetahui apakah
bakteri memfermentasi masing-masing gula diatas membentuk asam. Uji gula
digunakan enam jenis medium gula yaitu glukosa, fruktosa, galaktosa, laktosa,
arabinosa dan sukrosa. Uji gula pada isolat A menunjukan hasil positif pada uji gula
glukosa, fruktosa, laktosa dan sukrosa karena terjadinya perubahan warna pada
medium. Isolat B, C dan E menunjukan hasil positif semua pada semua uji gula,
sedangkan untuk isolat D menunjukan hasil negatif pada uji gula galaktosa dan
arabinosa karena tidak adanya perubahan warna pada medium. Sedangkan untuk uji
nutrisional hasil isolat yang positif hanya ditunjukkan oleh isolat A pada medium
glukosa, isolat D pada medium laktosa dan isolat E pada medium glukosa yang
menunjukan adanya perubahan warna dan adanya gelembung pada tabung Durham.

Gambar 3.25 Hasil Uji Fisiologi Gambar 3.26 Hasil Uji Fisiologi
Suhu Ruang Suhu 4℃

Gambar 3.27 Hasil Uji Fisiologi Gambar 3.28 Hasil Uji Fisiologi
Suhu 50℃ Suhu 60℃

Isolat A, B, C, D dan E didapatkan hasil bahwa interpretasi positif terjadi pada

semua isolat dengan suhu 4o dan suhu ruang (SR). Sedangkan untuk semua isolat
pada suhu 50o dan 60o didapatkan hasil negatif. Hal ini dapat diketahui dengan
melihat tingkat kekeruhan pada medium masing-masing suhu. Tingkat kekeruhan
paling tinggi ada pada suhu ruang. Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat
menentukan kehidupan suatu mikroorganisme. Mikroorganisme memilki toleransi
masing masing terhadap suhu. Efek dari suhu yang ekstrim pada mikroba adalah
terdenaturasinya enzim, sedangkan suhu yang rendah menyebabkan enzim menjadi
inaktif. Namun, pada kondisi suhu yang optimum, mikroorganisme akan memilki
produktifitas yang optimal. Menurut Fardiaz (1989), suhu optimum untuk
pertumbuhan mikroba dikelompokan ke tiga golongan mikroorganisme, yaitu:
a) Psirofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh pada suhu antara 0-20o C.
Contohnya adalah Bacillus polymixa, Pseudomonas, Micrococcus.
b) Mesofilik, yaitu mikroorganisme yang dapat tumbuh pada suhu antara 25-45o
C. Contohnya adalah Bacillus subtillis, Azotobacter, Clostridium butyricum.
 c) Termofilik, yaitu mikroorganisme yang dapat tumbuh pada suhu antara
50-100o C. Contohnya adalah Bacillus coagulans, Sulfolabus, bakteri
pereduksi sulfur.

Gambar 3.29 Hasil Uji Fisiologi Gambar 3.30 Hasil Uji Fisiologi
pH 3 pH 7

Gambar 3.31 Hasil Uji Fisiologi

pH 11
Isolat A, B, C, D, dan E didapatkan hasil yaitu positif terjadi pada pH 7 dan 11.
Sedangkan untuk Ph 3 semua isolat tidak terjadi perubahan warna menjadi keruh
sehingga dihasilkan negatif. Nilai pH berpengaruh terhadap sel dengan
mempengaruhi metabolisme. Mikroba pada umumnya tumbuh baik pada pH netral
(7), atau berkisar pada pH 5-8. Pengelompokan mikroorganisme berdasarkan pH
optimumnya menurut Dwidjoseputro (2005), dikelompokan menjadi tiga, yaitu:
a) Asidofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh pada kisaran pH 2-5. Contohya
adalah Thiobacillus.
b) Neutrofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh pada kisaran pH 5,5-8.
Contohnya adalah Escherechia coli.
c) Alkalofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh pada kisaran pH 8,5-12.
Contohnya adalah Actinomycetes.
Gambar 3.32 Hasil Uji Fisiologi Gambar 2.33 Hasil Uji Fisiologi
TO 1% TO 2%

Gambar 2.34 Hasil Uji Fisiologi

TO 3%
Terdapat tiga keadaan yang memengaruhi lingkungan mikroorganisme,
yaitu:
a. Isotonik
Suatu keadaan dimana konsentrasi osmotik dalam sel sama dengan konsentrasi
zat terlarut pada lingkungan sel. Dalam hal ini, tidak ada pembengkakan atau
penyusutan sel karena tidak ada gradien konsentrasi air yang melewati membran sel.
Tekanan osmotik yang isotonis dengan konsentrasi sel bakteri adalah 0,85%
(Sperelakis, 2011).
b. Hipertonis
Hipertonis mengacu kepada konsentrasi yang lebih besar. Keadaan hipertonis
adalah keadaan dimana konsentrasi zat terlarut di luar sel lebih tinggi dari pada
didalam sel. Oleh karena itu, cairan yang berada di dalam sel akan mengalir keluar
menuju ke konsentrasi yang lebih tinggi. Hal ini menyebabkan plasmolisis, yaitu
keadaan dimana sel kehilangan cairannya dan mengkerut kemudian sel akan mati
(Burrows et al., 2004).
c. Hipotonis
 Hipotonis mengacu pada tekanan yang lebih rendah. Keadaan hipotonis adalah
apabila konsentrasi zat terlarut dilingkungan sekitar sel lebih rendah dari pada di
dalam sel. Dalam upaya menyamakan konsentrasi, maka air akan masuk ke dalam sel
menyebabkan sel mengalami pembengkakan dan akhirnya pecah. Keadaan semacam
ini disebut dengan plasmoptisis (Burrows et al., 2004). Uji tekanan osmotik dapat
diketahui bahwa tekanan osmotik pada semua isolat A, B, C, D dan E menunjukan
hasil positif pada tekanan osmotik 1%, 2%, dan 3%, kecuali pada isolat A dengan
tekanan osmotik 3%.

Gambar 3.35 Hasil Uji Oksidatif Gambar 3.36 Hasil Uji Oksidatif
Fermentatif Isolat A Fermentatif Isolat B

Gambar 3.37 Hasil Uji Oksidatif-Fermentatif Isolat C, D dan E

Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama
respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom
oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif
anaerob dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen sebagai
akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat menjadi energi.
Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi
yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni. Reagen yang biasa
digunakan adalah tetramethyl – D – phenylenediamine dihidrocloride. Reagen ini
mendonorkan elektron pada enzim untuk dioksidasi membentuk kompleks warna
biru marun. Reaksi yang terjadi adalah 4H+ + O2 2H2O (Cappucino &
Sherman, 1992). Uji Oksidatif-Fermentatif menunjukkan hasil positif pada semua uji
kecuali isolat A. Hasil diperoleh bahwa isolat A bersifat fermentatif saja sedangkan
untuk isolat B, C, D dan E menunjukan hasil bahwa isolat tersebut positif bersifat
oksidatif dan fermentatif. Hal ini dapat dilihat dari adanya perubahan warna dan
terangkatnya medium keatas akibat adanya gas di dasar tabung reaksi.
Isolasi adalah suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme dari lingkungannya
sehingga mendapatkan kultur murni. Menurut Dwidjoseputro (1998), teknik isolasi
mikroorganisme ada beberapa tahap, yaitu :
1. Pengambilan Sampel
Pengolahan terhadap sampel biasanya dilakukan bergantung pada jenis
sampelnya. Teknik yang dilakukan harus menggunakan eksistensi sehingga didapat
sampel mikroorganisme dari sampel yang didapat atau diambil.
2. Preparasi Sampel
Preparasi merupakan tahapan yang sangat penting karena preparasi merupakan
proses untuk menyiapkan alat dan bahan atau sampel untuk dianalisis sesuai dengan
prinsip mikrobiologi. Pengolahan terhadap sampel biasanya dilakukan dengan
mengambil mikroba dari substratnya. Preparasi yang dilakukan tergantung jenis dan
bentuk sampelnya.
3. Pengenceran Bertingkat
Pengenceran bertingkat bertujuan untuk mengurangi jumlah mikroba yang
tersuspensi dalam cairan dengan cara memindahkan sampel dari satu cairan ke cairan
lain. Cairan yang digunakan merupakan cairan yang steril. Penentuan besarnya atau
banyaknya tingkat pengenceran tergantung pada perkiraan jumlah mikroba dalam
sampel.
4. Penanaman
Teknik penanaman adalah suatu teknik pengambilan atau penumbuhan mikroba
yang telah dilakukan pengenceran bertingkat bertujuan untuk menumbuhkan
mikroba yang telah didapat di medium kultur.
5. Pemurnian
Pemurnian adalah suatu cara memisahkan satu mikroba dari campurannya,
sehingga diperoleh kultur murni yang hasilnya dapat diuji.
6. Pembuatan Stok
 Pembuatan stok bertujuan apabila isolat bakteri pertama yang digunakan habis,
masih ada isolat bakteri lain yang memilki karakteristik bakteri yang sama.
Tanah dihuni oleh bermacam-macam mikroorganisme, mikroorganisme tanah
seperti bakteri dan jamur sangat mempengaruhi kesuburan tanah, oleh karena itu
mikroorganisme merupakan salah satu aspek penting yang berperan dalam
pembentukan suatu ekosistem. Mikroorganisme tanah juga bertanggungjawab atas
pelapukan bahan organik dan pendauran unsur hara, dengan demikian
mikroorganisme mempunyai pengaruh terhadap sifat kimia dan fisik tanah (Anas,
1989). Jumlah bakteri yang ada di dalam tanah dipengaruhi oleh berbagai kondisi
yang mempengaruhi pertumbuhannya, seperti temperatur, kelembapan, aerasi dan
sumber energi. Tetapi secara umum populasi yang terbesar terdapat di horison
permukaan. Mikroorganisme tanah lebih banyak ditemukan pada permukaan tanah
karena bahan organik lebih tersedia. Oleh karena itu mikroorganisme lebih banyak
berada pada lapisan tanah yang paling atas (Alexander, 1977).
Jumlah dan tipe bakteria yang terdapat pada bagian tanah tertentu dapat sangat
dipengaruhi oleh lokasi geografi seperti temperatur tanah, tipe tanah, pH tanah,
kandungan bahan organik, kultivasi, aerasi dan kelembapan. Bakteri tanah dapat
berupa rod, basil, kokus (spherical), spirilla (spiral). Dari semua itu, Bacillus
memiliki kelimpahan lebih banyak dari pada yang lain. Mereka adalah salah satu
kelompok terbesar dari populasi bakteri tanah dan sangat tersebar luas (Abdulkadir &
Waliyu, 2012). Bakteri endofit dan bakteri yang berhubungan dengan tumbuhan
telah ditinjau baru-baru ini. Besar jumlah endofitik non-rhizobial dan rhizobial
Bakteri diisolasi dari legum yang berbeda secara khusus jaringan akar dan nodul dan
termasuk: Agrobacterium, Bacillus, Curtobacterium, Enterobacter, Erwinia,
Herbaspirillum, Mycobacterium, Paenibacillus, Pseudomonas, Phyllobacterium,
Ochrobactrum, Sphingomonas, Rhizobium, Ensifer, Mesorhizobium, Burkholderia,
Phyllobacterium, dan Devosia (Saini, 2013).
Bakteri adalah mikroorganisme yang paling dominan di dalam tanah bila
dibandingkan dengan mikroorganisme lain seperti fungi dan protozoa, bakteri dapat
hidup pada seluruh lapisan tanah dan pada kondisi tanah yang berbeda (Widawati et
al., 2005). Bakteri pada mulanya dianggap sebagai golongan mikroorganisme yang
sangat penting dalam berbagai proses yang mempengaruhi fertilitas tanah. Anggapan
ini dihubungkan dengan peristiwa atau kejadian dan berkembangbiaknya, sehingga
mikroba-mikroba atau kuman-kuman tersebut dipercaya berperan penuh. Bilamana
anggapan itu dihargai maka golongan-golongan mikroorganisme lainnya yang
beragam itu harus mendapatkan perhatian atau dihargai pula peranan pentingnya
dalam proses-proses tanah. Bakteri yang hidup dalam tanah memegang peranan
penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan
dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium
menjadi nitrat. Termasuk ke dalam golongan ini yang berbentuk batang (bacil) yang
mampu membentuk spora dan yang tidak membentuk spora, spora pada bakteri
bukan alat untuk berkembang biak melainkan alat untuk mempertahankan diri dari
lingkungan yang tidak menyenangkan. Selain bakteri bacil, terdapat pula bakteri
coccus, vibrios, dan spirilla. Bakteri Costvidium pastorianum adalah bakteri yang
dapat memfiksasi/mengikat Nitrogen dalam keadaan anaerob. Bakteri Azotobacter
chrococcum yaitu bakteri yang dapat mengikat Nitrogen dalam keadaan aerob.
Bakteri Nitrobakter yaitu bakteri yang dapat mengubah amonium menjadi nitrat.
Bakteri Radicicolas yaitu bakteri yang dapat bersimbiosa dengan Leguminosa.
Bakteri-bakteri sangat beragam dalam ukuran, bentuk dan keperluan-keperluan
oksigen (aerob dan anaerob), penggunaan energi (autotrof dan heterotrof), hubungan
pada tanaman dan binatang (saprofit dan parasit) (Mul Muyani Sutedjo,1996).
 IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat ditarik berdasarkan hasil dan pembahasan yaitu untuk
melakukan karakterisasi terdapat 3 uji yaitu uji morfologi, uji biokimiawi, dan uji
fisiologi. Uji Morfologi meliputi makromorfologi dan mikromorfologi. Uji Fisiologi
meliputi uji pH, uji temperature/suhu, dan uji salinitas.

B. Saran

Sebaiknya dalam praktikum lebih berhati hati lagi agar dapat mengurangi
kontaminasi sehingga didapatkan hasil maksimal dan sebaiknya saat pengumpulan
data di lakukan serentak saat selesai pengamatan agar tidak terjadi kesulitan saat
pengumpulan data.
.
 DAFTAR REFERENSI

Abdulkadir, M and Waliyu, S., 2012. Screening And Isolation Of The Soil Bacteria
For Ability To Produce Antibiotics. Beverly Scientific Organisation. 2(3):
76-82.

Alexander, M., 1977. Introduction to Soil Microbiolgy. New York: Academic Press.
Anas, I., 1989. Biologi Tanah dalam Praktek. Bogor: Pusat Antar Universitas
Bioteknologi.
Burrows, W., Moulder, J. M., and Lewert, R. M., 2004. Textbook of Microbiology.
Philadhelpia: W. B Saunders Company.
Capuccino, J.G. dan Sherman, N., 1992. Microbiology: A Laboratory Manual.
California: Adison Wesley Publishing Company.
Cassia, J. D. P., Rodrigo, S. R. L., Heloiza, F. A. D. P., Daniela, A. D. M., Eleni, G.,
& Roberto D. S., 2015. Production and Characterization of β-glucosidase
Obtained by the Solid-State Cultivation of the Thermophilic Fungus
Thermomucor indicae-seudaticae N31. Appl Biochem Biotechnol 175:723–732.
Dwidjoseputro, D., 1998. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Dwidjoseputro, D., 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Fardiaz S., 1989. Analisis Mikrobiologi Pangan. Bogor: Lembaga Sumberdaya
Informasi. Institut Pertanian Bogor.
Firliani, W., Anthoni A., & Fuji, A. F., 2015. Karakterisasi Bakteri Termofilik
Penghasil Enzim Protease Netral. Jurnal Biologi Universitas Andalas. 4 (1):
9-14.
Hadioetomo, R.S., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia
Pustaka Utama.
Hairdiana, E. U., Sabaniah, I. G., Arsyik, I., & Laode, R., 2016. Karakteristik Dan
Isolasi Bakteri Penghasil Antibiotik Dari Tanah Bekas Pembuangan Sampah.
Prosiding Seminar Nasional Kefarmasian, 4 116-111
Pelczar. M.J., dan Chan, E. S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.
Pelczar. M.J., dan Chan, E. S. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.
Rehm, H. J., 1987. Biotechnology: Enzyme Technology. Weinham: VCH Verlags
Gessel Schaff.
Saini, R., Singh, S. D., Giri, R., & Vishal, K., 2013. Isolation, characterization, and
evaluation of bacterial root and nodule endophytes from chickpea cultivated in
Northern India. J. Basic Microbiol. 53, 1–8.
Sperelakis, N., 2011. Cell Physiology Source Book: Essential of Membrane
Biophysic. New Castle: Academic Press.
Widawati, S.Suliasih, H.J.D. Latupapua, Sugiharto, A., 2005. Biodiversity of Soil
Microbes from from Rhizosphere at Wamena Biological Garden (WBi6),
Jayawijaya, Papua. Jurnal Biodiversitas. 6 (1): 6-11
Wilbraham, A. C dan Michael, S. M., 1992. Kimia Organik dan Hayati. Bandung:
ITB.
Yanti, N. D. Y., Bodhi, D. & Rudy, A. N., 2016. Karakterisasi Dan Identifikasi
Bakteri Dari Tamba Daging Babi (Sus sp.) Hasil Fermentasi Spontan.
Bioprospek 11 (2) 53-60.