18.4.

2017

PRETOČNA CITOMETRIJA
HEMATOLOŠKI ANALIZATORJI
MIKROSKOPSKE ANALIZE
Elizabeta Božnar Alič

Pretočna citometrija

1
 18.4.2017

Pretočna citometrija

tok tekočine – celice – merjenje

Vzorec Nosilna tekočina

Nosilec vzorca

Področje
hidrodinamičnega
fokusiranja

Žarek laserske
svetlobe

Hidrodinamično fokusiranje - vzorec s počasnejšim tokom prehaja v hitrejši

tok nosilne tekočine. Laminarni tok in površinska napetost omogočita posamično
prehajanje celic skozi mesto, kjer pride do interakcije z laserskim žarkom.

Odboj (razprševanje laserske svetlobe)

 Prednje sipanje (forward scatter, FSC) nastane zaradi stika žarka s celično
membrano in je sorazmeren velikosti celic; zazna ga FALS (FSC) detektor, ki
je v ravnini poti laserskega žarka,
 Stransko sipanje (side scatter, SSC) nastane zaradi prehoda fotonov skozi
citoplazmo, pri tem pride do interakcije z organeli (notranja celična
zgradba) in do odboja svetlobe pravokotno od smeri laserskega žarka;
zazna ga RALS (SSC) detektor, ki je pravokotno od poti laserskega žarka

2
 18.4.2017

Ločevanje populacij celic

 Ločevanje celic na podlagi morfoloških značilnosti (velikost, notranja celična

zgradba)
Granuliranost

Velikost

Ločevanje populacij celic

 Ločevanje celic na podlagi funkcionalnih značilnosti

 Specifična karakterizacija celic je omogočena na podlagi specifičnih molekul
(Cluster of Differentiation - CD) na površini ali v notranjosti celic, katerih prisotnost
ugotavljamo s specifičnimi protitelesi, ki so konjugirana s fluorokromi, ti po vzbujanju
oddajo fluorescenčno svetlobo določene valovne dolžine
 Fluorescenčni detektorji merijo fluorescenčno emitirano svetlobo

3
 18.4.2017

Hematološki analizatorji

Hematološki analizatorji-zgodovina

 Pomembna prelomnica na področju

hematologije je bil izum elektronske
naprave za štetje mikroskopsko
majhnih delcev (leta 1953)
 Izum je patentiral ameriški
elektroinženir Wallace H. Coulter
 Korporacija Coulter je lata 1954
dala na tržišče prvi komercialni
hematološki aparat Coulter Counter
Model A
 Analizator je deloval po t.i.
Coultrovem načelu, ki omogoča
štetje in merjenje velikosti
mikroskopsko majhnih delcev
suspendiranih v tekočini

4
 18.4.2017

Hematološki analizatorji

 Hematološke analizatorje uporabljamo za:

o Štetje krvnih celic
o Merjenje lastnosti krvnih celic
o Diferenciacijo celic
 Razlike so v naboru parametrov, ki jih lahko določamo (3/5/6 parametrska
DKS, IG, RTC, NRBC, BODY FLUID,…): od 8 do 60
 Razlike v zmogljivosti (št. analiz/uro)
 Zaznavanje strdkov, ustreznosti volumna vzorca,...
 Razlike v volumnu vzorca za analizo (pediatrični vzorci!)
 Razlike v principu določanja parametrov
o Coulter
o Siemens (Advia)
o Sysmex

Vzorec za analizo

 Venska ali kapilarna kri

z EDTA antikoagulantom
 Pogoste predanalitske
napake: koaguliran
vzorec (makro, mikro
strdki), razredčen
vzorec, nepravilno
razmerje med vzorcem
in antikoagulantom,…

5
 18.4.2017

Hematološki analizatorji

 Za določanje koncentracije in merjenje velikosti celic se

uporabljata 2 osnovna principa:
o električna impendanca
o odboj laserske svetlobe
 Diferenciacija celic
o impendanca
o odboj laserske svetlobe
o absorbanca
 Aparati so nezanesljivi pri prepoznavanju odstopanj (nezrele
ali atipične celice, morfološke spremembe) – opozorila!

Osnovni hematološki parametri

 Eritrocitna krvna slika  Levkocitna krvna slika

o Št. koncentracija eritrocitov
o Konc. hemoglobina
o Hematokrit
o Eritrocitni indeksi:
o MCV (mean cell volume)-
povprečni volumen eritrocitov
o MCH (mean cell haemoglobin)-
povprečna količina Hb v
eritrocitih
o MCHC (mean cell haemoglobin
concentration)-povprečna konc.
Hb v L krvi
o RDW (red cell distribution width)-
koeficient variacije V eritrocitov
o Št. koncentracija retikulocitov
o Št. koncentracija levkocitov
o Delež posameznih vrst levkocitov:
o Nevtrofilci
o Eozinofilci
o Bazofilci
o Limfociti
o Monociti
 Trombocitna krvna slika
o Št. koncentracija trombocitov
o MPV (mean platelet volume)-
povprečni volumen trombocitov

6
 18.4.2017

Osnovni hematološki parametri

 Volumen stisnjenih eritrocitov:

Hamatokrit (1/1) = MCV x št. ERCI
1000

 Povprečni volumen eritrocitov:

MCV (fL) = aparat ga direktno izmeri

 Povprečna koncentracija hemoglobina v eritrocitu

MCH (pg) = Hb (g/L)
št. ERCI

 Povprečna količina hemoglobina v L krvi:

MCHC (g/L) = Hb (g/L)
Ht

Hemogram, DKS

 CBC = complete blood count

 Ena izmed najpogostejših preiskav v klinično biokemičnih laboratorijih

7
 18.4.2017

Hematološki analizatorji COULTER

 Coulterjev princip omogoča štetje in

določanje velikosti celic z zaznavanjem in
merjenjem sprememb v električnem
uporu, ko celice v prevodni tekočini
prehajajo skozi majhno odprtino v števni
kapilari (vakuum).
 Vsaka celica suspendirana v prevodni
tekočini deluje kot izolator. Pri prehodu
skozi odprtino v kapilari se poveča upor
med elektrodama, ki sta nameščeni na
obeh straneh odprtine. To povzroči
nastanek merljivega električnega
impulza.
 Število impulzom je enko številu delcev
(celic), velikost električnega impulza pa je
enaka volumnu celic.

Coulter - štetje celic

 Merilna komora za štetje

levkocitov (hemoglobin):
 Razredčitev vzorca in
liza eritrocitov
 Levkociti: nad 35 fL

 Merilna komora za štetje

eritrocitov in trombocitov:
 Razredčitev vzorca z
izotonično raztopino
 Eritrociti: nad 36 fL
 Trombociti: 2 do 20 fL

Histogrami porazdelitve celic glede na volumen

8
 18.4.2017

Coulter- določanje koncentracije hemoglobina

 Hemoliza eritrocitov
 Meritev lahko poteka v levkocitni komori ali pa v ločeni
hemoglobinski komori
 Fero ioni Hb oksidirajo v feri obliko in nastane
hemiglobim
 Hemiglobin reagira s K-ciantom in nastane
hemiglobincianid (referenčna metoda - ICSH)
 Spektrofotometrično določanje, absorbanco merimo pri
525 nm
 Novejši analizatorji uporabljajo brez cianidne metode

Coulter - AcV DKS

AcV tehnologija:
 Levkociti so citokemično obdelani, pri tem
se ohrani njihova prvotna velikost,
medtem ko se različno obarvajo glede na
vrsto levkocita
 1. kanal:
Liza vseh levkocitov, razen bazofilcev, ki
ostanejo intaktni in se določijo v tem kanalu.
 2. kanal:
Absorbanca: razlike v absorbanci glede na
razlike v citokemičnem barvanju (klorazol
črno), to pa je odvisno od notranje
zgradbe celic (najmočnejša vezava na
granule eozinofilcev, nato nevtrofilcev in
najmanj na granule monocitov, limfociti
ostanejo ne obarvani)
Volumen: Coulterjev princip-impendanca

9
 18.4.2017

Coulter - VCS DKS

VCS tehnologija:

 V-Volumen: impendančno merjenje

z nizko frekvenco
elektromagnetnega toka
 C-Konduktivnost: merjenje
elektromagnetne prevodnosti
(notranja struktura celic, razmerje
J/C, gostota jedra in
granuliranost)
 S-Odboj laserske svetlobe (10-
70°): struktura in oblika celice,
granuliranost, lobuliranost jedra,
površinske značilnosti celice

Coulter - DKS 3D razsevni graf

3D prikaz razporeditve populacij levkocitov

Monociti Nevtrofilni
V granulociti
o
l
Eozinofilnii
u
granulociti
Limfociti m
e
n
Bazofilni
granulociti

Odboj laserske svetlobe

10
 18.4.2017

Coulter-DKS VCSn tehnologija

 Volumen
 Prevodnost
 AL2 (axial light loss)- meritev
svetlobe, ki se absorbira, ko gre
celica skozi pretočno celico)
 3 meritve razpršene svetlobe pod
različnimi koti:
- LALS (5°)
- LMALS (9-19°)
- UMALS (20-43°)
 Boljša ločitev posameznih populacij
celic
 Visoka občutljivost in specifičnost pri
klasifikaciji celic

Coulter-DKS VCSn tehnologija

 Boljše prepoznavanje nezrelih/atipičnih celic

11
 18.4.2017

Coulter- retikulociti

 Obarvanje RNA z
novim metilenskim
modrilom
(precipitacija)
 Ločitev RTC od
eritrocitov z VCSn
analizo

Hematološki analizatorji ADVIA

 120 vzorcev na uro

(hemogram+DKS)
 Omogoča selektivno izbiro analiz
 Avtomatsko vzorčenje iz zaprtih
epruvet preko podajalca vzorcev
ali iz posameznih odprtih ali
zaprtih epruvet
 Volumen vzorca 155 µL
 5 različnih merilnih komor

Parametri: hemogram, DKS, celični Hb (CH), retikulociti (# in%), CHr; 

eritroblasti, analiza telesnih tekočin, …

12
 18.4.2017

Advia - določanje eritrocitov

 Eritrocitno-trombocitna komora
 Reagent RBC/PLT vsebuje Na dodecilsulfat (SDS) in
glutaraldehid
 Citokemična reakcija poteče v dveh korakih:
- Pretvorba v izovolumetrično sferično obliko
- Fiksacija E in T

Slike vir: SIEMENS

Advia - RBC metoda

Meritev poteka v pretočni celici, meri se odboj laserske svetlobe pod dvema kotoma.

Odboj pod kotom 2o - 3o → Volumen (MCV)

Odboj pod kotom 2o ‐ 3o → Volumen (MCV)

Odboj pod kotom 5o - 15o → Koncentracija-

Odboj pod kotom 5o ‐ 15o → Koncentracija‐
vsebnost hemoglobina (CH)
vsebnost hemoglobina (CH‐ cellular haemoglobin)
Slike vir: SIEMENS

13
 18.4.2017

Advia - RBC metoda

VSEBNOST HEMOGLOBINA

MAKROCITI
MAKROCITI
120fl

VELIKOST
60fl

MIKROCTI
MIKROCITI
Hgb.conc. 28g/dl 41g/dl

HIPOKROMNI HIPERKROMNI

HIPO HIPER-KROMNI

Graf vir: SIEMENS

Advia - MCV histogram

MCV

MCV

RDW
MCV

MCV‐povprečje volumna eritrocitov v histogramu
RDW‐ koeficient variacije populacije eritrocitov glede na volumen 
(merilo anizocitoze)
Graf vir: SIEMENS

14
 18.4.2017

Advia - količina hemoglobina v eritrocitu-CH

 Izračunan parameter
(MCH=Hb/št.ERI)
 Direktno izmerjen
hemoglobin v vsakem
posameznem eritrocitu
(CH)
 Rezultat neodvisen od
celičnega volumna
 Meritev odboja laserske
svetlobe pod velikim
kotom

Graf vir: SIEMENS

Advia - MCHC/CHCM

 IZRAČUNAN: MCHC = Hb__

Eri x MCV

 IZMERJEN: CHCM (cellular haemoglobin concentration

mean)
 MCHC je previsok, kadar je lažno povečana
koncentracije Hb (lipemija, levkocitoza) CHCM CE >19
 Izračun prave koncentracije hemoglobina (formula)

15
 18.4.2017

Advia- trombociti
K trombocitom se štejejo vse celice med 0 in 30 fL, v območju med 30 in 60 fL so
veliki trombociti in fragmentirani eritrociti, nad 60 fL so eritrociti.

 1 Trombociti
 2 Veliki trombociti
 3 Eritrociti
 4 Fragmentirani eritrociti
 5 Debris

Odboj laserske svetlobe (50‐150 )‐ refraktilni
indeks
Graf vir: SIEMENS

Advia - hemoglobin

 Meritev poteka v hemoglobinski komori

 V prvi stopnji reakcije poteče liza eritrocitov (surfaktant
v alkalni raztopini)
 Železo oksidira iz fero v feri obliko in nato reagira s
cianidnimi ioni v cianmet hemoglobin.
 Pri reagentu brez cianida kot končni produkt nastane
monohidroksi feri porfirin.
 Absorbanca nastalih obarvanih produktov se meri
spektrofotometrično pri valovni dolžini 546 nm in je
sorazmerna koncentraciji hemoglobina.

16
 18.4.2017

Advia - koncentracija levkocitov in DKS

 Perox kanal (aktivnost mieloperoksidaze)

 Bazo kanal (gostota jedra, lobuliranost jedra)

Aktivnost mieloperoksidaze

Mieloperoksidaza je lizosomalni encim in je prisotna predvsem v:

‐ azurofilnih granulah nevtrofilnih granulocitov in monocitov
‐ specifičnih granulah eozinofilnih granulocitov
VRSTA CELICE AKTIVNOST MIELOPEROKSIDAZE
Mieloblasti -, včasih ½+ (posebno manjši mieloblasti)
Promielociti 3+
Mielociti 3+
Metamielociti 3+
Paličasti nevtrofilci 2-3+
Segmentirani nevtrofilci 2+
Eozonofilci 4+
Bazofilci ½-1+ (se ne obarvajo)
Limfociti -
Prolimfociti -
Limfociti -
Atipični /reaktivni limfociti -
Monoblasti -
Promonociti ½-1+
Monociti 1+
Plasma celice -
Eritroblasti

Slike vir: SIEMENS

17
 18.4.2017

Advia - perox metoda

celična peroksidaza
H2O2 + 4-kloro-1-naftol temen precipitat

Slika vir: SIEMENS

Advia - perox kanal

Y os: velikost celic (odboj laserske svetlobe)
X os: aktivnost peroksidaze 
(absorbanca svetlobe)

1 ŠUM
5 7 2 NRBC
3 SKUPKI TROMBOCITOV
6 4 LIMFOCITI & BAZOFILCI
5 LUC
6 MONOCITI +
velikost celic

4 8
7 NEVTROFILCI ++
2 3 8 EOZINOFILCI +++
1
aktivnost mieloperoksidaze
Podatki iz perox kanala: absolutno št. levkocitov; nevtrofilci, eozonofilci, limfociti, 
monociti in LUC (absolutna konc. in %); povprečna aktivnost mieloperoksidaze (MPXi).
Graf vir: SIEMENS

18
 18.4.2017

Advia - bazo kanal

Ftalna kislina in surfaktant lizirata eritrocite in trombocite in odstranita citoplazmo 
vsem levkocitom, razen bazofilcem.
Y os: VELIKOST CELIC
X os: GOSTOTA JEDER (struktura
kromatina, lobuliranost jedra)

1 BLASTI
4
2 MONONUKLEARNE CELICE (LY, MO,
IG, BLASTI)
3 POLIMORFONUKLEARNE CELIC
velikost celic

(NEVT, EO)
4 BAZOFILCI
2
3
Podatki iz bazo kanala: absolutno št. levko. in 
1
LI (indeks lobularnosti).

struktura kromatina, lobuliranost jedra
Graf vir: SIEMENS

Advia - retikulociti

 Barvanje celične RNA z barvilom Oksazinom 750

 Celice, ki imajo več RNA, vežejo več barvila in absorbirajo več svetlobe
(razsevni graf-razporeditev glede na zrelost)
 Aparat izmeri relativno in absolutno število retikulocitov
 Dodatni parametri: MCVr, CHCMr, RDWr, HDWr, CHr

19
 18.4.2017

Advia - retikulociti

Odboj pod kotom 5o ‐ 15o →
vsebnost hemoglobina ‐ CHr

Laser
Zero Angle

Odboj pod kotom 2o ‐ 3o →
velikost (volumen) celice

Advia - retikulociti
Velikost celic (dboj laserske svetlobe)

A zreli eritrociti
B nizka absorbcija
(zreli retikulociti)
C srednja absorbcija
(srednje zreli retikulociti)
D visoka absorbcija
(nezreli retikulociti)
Zrelost celic (absorbcija)

Graf vir: SIEMENS

20
 18.4.2017

Eritroblasti

 Nezreli eritrociti z jedri

 Pri manj izpopolnjenih analizatorjih (starejši tipi ali manj
zmogljivi) jih analizator vključi v celokupno število
levkocitov (lažno povečano število levkocitov), opozorilo
NRBC
 Pregled pod mikroskopom, štetje eritroblastov na
100/levkocitov
 Korekcija števila levkocitov (formula)
 Sodobnejši hematološki analizatorji štejejo eritroblaste
ločeno in podajo nekorigirano in korigirano število
levkocitov

Advia - eritroblasti

 Nezreli eritrociti z jedri

 Del rutinske analiza hemograma in DKS, dodatni
regenti niso potrebni
 Rezultat za NRBC: kadar je NRBC > kot 0,2 x 109/L
oz. vsaj 2% NRBC na 3,0 x 109/L levkocitov
 Avtomatska korekcija števila levkocitov in DKS
 Določanje števila eritroblastov poteka na podlagi 4
različnih štetij (histo count, gaussian count, residual
count, barox count)
 Štetje ni direktno

21
 18.4.2017

Advia - eritroblasti
Opozorilo: NRBC
Analizator zazna eritroblaste le, če je naročena tudi DKS.

Grafa vir: SIEMENS

Advia – analiza CSF

CSF Scatter CSF Scatter ABS

 Potrebna je ročna Monociti

predpriprava vzorca Limfociti

Nevtrofilci Eozinofilci

 Vzorcu se dodata Eritrociti

specifično barvila
 Kratka stabilnost
reagenta

22
 18.4.2017

Hematološki analizatorji Sysmex

 100 vzorcev na uro

(hemogram+DKS)
 Avtomatsko vzorčenje iz zaprtih
epruvet preko podajalca vzorcev
ali iz posameznih odprtih ali
zaprtih epruvet
 Volumen vzorca 88 µL
 Parametri: hemogram, 6 par. -
DKS, IG (# in %), retikulociti (# in
%), RET-Hb, eritroblasti (# in
/100 Lkc.), analiza telesnih
tekočin (TC-BF, WBC-BF, MN%,
PMN%, MN#, PMN#) …

Sysmex- pretočna citometrija

 Polprevodniški laser, oddaja

laserski žarek s 633 nm

 Analiza treh odbojev laserske

svetlobe:
o FSC (forward scatter light)=
velikost celice
o SSC (side scatter ligt)=
notranja celična zgradba
o SFL (side fluorescent light)=
vrsta in količina nukleinskih
kislin in celičnih organelov

23
 18.4.2017

Sysmex - RBC-PLT kanal

 Metoda
hidrodinamičnega
fokusiranja
 Celice potujejo skupaj z
raztopino za redčenje
skozi odprtino
 Pri vsakem prehodu
skozi odprtino nastane
impulz (število, velikost)-
impendanca

Sysmex - SLS metoda določanja hemoglobina

 Na lauril sulfat (SLS) povzroči

lizo eritrocitov
 Hidrofobne skupine SLS se
vežejo na globin, pri tem
pride do spremembe v
tridimenzionalni strukturi
molekule Hb (denaturacija)
 Fe v hemu prehaja iz Fe2+ v
Fe3+
 Hidrofilne skupine SLS se
vežejo na Fe3+, pri tem
nastane stabilna oblika Hb-
SLS
 Absorbanco merimo pri 555
nm

24
 18.4.2017

Sysmex- 4 diff kanal

 Liza eritrocitov
 Perforacija membran
levkocitov
 V celice vstopi
fluorescenčno barvilo in
specifično obarva
nukleinske celice
 Informacija o vsebnosti
DNA in RNA, v
citoplazmi in jedru

Sysmex- 4 diff kanal

 Po meritvi v 4-diff kanalu

dobimo informacijo v obliki
razsevnega grafa kjer je na:
- x osi prikazan SSC
(notranja celična zgradba)
- y osi prikazan SFS
(vsebnost nukleinskih kislin)
 Razporeditev celic v 4 skupine:
- monociti
- limfociti
- nevtrofilci+ bazofilci
- eozinofilci

25
 18.4.2017

Sysmex- WBC/BASO kanal

 Po meritvi v WBC/BASO
kanalu dobimo informacijo
v obliki razsevnega grafa
kjer je na:
- x osi prikazan SSC
(notranja celična zgradba)
- y osi prikazan FSC
(velikost celic)

 Ločita se 2 populaciji:
- bazofilci
-ostali levkociti

Sysmex- NRBC- WNR kanal

 Določanje koncentracije LKC in
diferencialno štetje NRBC in bazofilcev
 Hemoliza eritrocitov (surfaktant)
 WNR fluorocel prehaja skozi celično
membrano in obarva nukleinske kisline
in celične organele levkocitov in NRBC
 V razsevnem grafu je na x osi
prikazan SFS (vrsta in količina
nukleinskih kislin in celičnih organelov)
in na y osi FSC (velikost celic)
 Levkociti bolj fluorescirajo kot NRBC in
to razlika v fluorescenci se uporablja
za ločitev NRBC od levkocitov

26
 18.4.2017

Sysmex - retikulocitni kanal

 Celice se obarvajo s
fluorescenčnimi barvili
 Glede na razliko v vsebnosti
nukleinskih kislin dajo
različno intenziteto
fluorescenčnega signala SFL
(x os), kar omogoča ločitev
populacij levkocitov,
eritrocitov in retikulocitov
 Na y osi je meritev FSC, ki
nam poda velikost celic

Sysmex- PLT-F metoda

 Reakcija poteka v dveh

stopnjah
 Najprej pride do
perforacije membran
trombocitov, ki ji sledi
specifična označitev
trombocitov s
fluorescentnim barvilom
 Izmerjena fluorescenca je
direktno sorazmerna
zrelosti trombocitov
 IPF - frakcija nezrelih
trombocitov

27
 18.4.2017

Sysmex- body fluid

Opozorila hematoloških analizatorjev

 NRBC = sum na prisotnost eritroblastov

 FRAGMENTS = fragmentirani eritrociti
 PLT-CLM = sum na prisotnost skupkov trombocitov
 ATYP = sum na prisotnost atipičnih/reaktivnih limfocitov
 IG = sum na prisotnost nezrelih granulocitov (metamielociti, mielociti,
promielociti)
 LS = sum na pomik v levo (paličasti nevtrofilni granulociti)
 BLASTS = sum na prisotnost blastov

Nezanesljivost rezultatov-
Mikroskopski pregled/diferencijacija

28
 18.4.2017

RBC histogrami

NORMALEN
HISTOGRAM

AGLUTINACIJA ERITROCITOV MAKROCITI, POVEČAN RDW

ERITROCITNI FRAGMENTI, DIMORFNA ERITROCITNI FRAGMENTI, DIMORFNA

POPULACIJA, POVEČAN RDW POPULACIJA, POVEČAN RDW

WBC histogrami

NORMALEN
HISTOGRAM

POMIK V LEVO

NEZRELI GRANULOCITI LIMFOCITOZA REAKTIVNI/ATIPIČNI LIMFOCITI

CELIČNE INTERFERENCE EOZINOFILIJA BLASTI

29
 18.4.2017

Trombocitni histogrami

NORMALEN HISTOGRAM MAJHNI TROMBOCITI

GIGANTSKI TROMBOCITI PREKRIVANJE ERITROCITI/TROMBOCITI

Mikroskopske analize

30
 18.4.2017

Mikroskop

 Mikroskop: iz grških
besed μικρός, mikrós -
»majhno« in
σκοπεῖν, skopeîn -
»gledati« ali »videti«
 Naprava za opazovanje
objektov, ki so
premajhni, da bi jih
lahko videli s prostim
očesom

Robert Hook

 l. 1665
 Micrographia-zbirka
mikroskopskih raziskav
 Opazoval celice plute
 Celice-majhne škatlice

31
 18.4.2017

Celica

 Celica (latinsko cellula-sobica) je osnovna gradbena in funkcionalna

enota vseh živih organizmov. Celice so najmanjši deli organizmov, ki
jih obravnavamo kot žive, zato jim pogosto pravimo tudi gradbeni
elementi življenja.
 Celice so v povprečju velike 10-20 µm, s prostim očesom jih ne
moremo videti. S svetlobnim mikroskopom vidimo celico kot vrečasto
tvorbo, ki je obdana s celično membrano, izpolnjena s citoplazmo in
ima celično jedro.

Vrste mikroskopov

• Klasični svetlobni mikroskop (hematologija,

citologija, mikrobiologija)

• Fazno-kontrastni mikroskop (pregled

urinskega sedimenta, citologija)

• Fluorescenčni mikroskop (FISH; diagnostika

avtoimunskih bolezni)

• Mikroskopiranje v temnem polju

(mikrobiologija)

• Polarizacijski mikroskop (kristali)

32
 18.4.2017

Fazno kontrastni mikroskop

 Namenjen je opazovanju
neobarvanih, nativnih celic,
ki niso kontrastne
 Ker celica sestoji iz 70%
vode, so celični organeli in
strukture prozorni in slabo
absorbirajo svetlobo
 Razliko v fazi svetlobnega
valovanja spremeni v razliko v
amplitudi svetlobnega
valovanja, ki ga človeško oko
zazna kot razliko v jakosti
svetlobe

Fluorescenčni mikroskop

 Izkorišča dejstvo, da nekatere molekule

flurescirajo: sprejmejo svetlobo krajše
valovne dolžine (modro) in nato
oddajo svetlobo daljše valovne dolžine
(rdeča ali zelena)
 Absorbirana svetloba =vzbujevalna
svetloba
 Emitirana svetloba =fluorescenčna
svetloba
 Molekule, ki flourescirajo=
fluorecsenčna barvila ali fluorokromi
 Fluorescenčna barvila so lahko vezana
na protitelesa ali določeno zaporedje
DNA in na ta način se lahko določa
široka paleta tarčnih molekul v vzorcu

33
 18.4.2017

Nativni mikroskopski preparati

 Nativni
- Pregled urinskega sedimenta
- Pregled blata na parazite
 Nativno obarvani
- Določanje koncentracije levkocitov v
telesnih tekočinah (fenolni fuksin,
Türckova raztopina)
- Pregled blata na prebavljenost
(Lugolova raztopina, sudan III)
- Pregled blata na parazite (Lugolova
raztopina)
- Barvanje gliv z indijskim črnilom

Obarvani mikroskopski preparati

 Barvanje po Pappenheimu
 Barvanje po Pappanicolau
 Barvanje po Gramu
 Barvanje po
Ziehel-Neelsenu

34
 18.4.2017

Mikroskopske analize

 Hematologija
 Citologija, histologija
 Analitika telesnih tekočin
 Diagnostika avtoimunskih bolezni
 Urinske analize
 Analize blata
 Analize semenske tekočine

Mikroskopska DKS

 Mikroskopska diferenciacija levkocitov v skladu s

Priporočenimi postopki za mikroskopski pregled
krvnega razmaza (SZKK, Ljubljana 2012)
 Mikroskopski pregled morfologije vseh treh celičnih
vrst
 Skupki trombocitov/levkocitov/eritrocitov,
ekstracelularni organizmi, rulo formacije, fibrinske
niti, krioprecipitati

35
 18.4.2017

Mikroskopska DKS

• Verifikacija rezultatov hematološkega analizatorja

• Identifikacija nenormalnih/nezrelih/atipičnih celic

• Identifikacija morfoloških nepravilnosti, ki jih

hematološki analizatorji običajno ne zaznajo, ne
identificirajo in ne izdajo opozoril

Barvanje po Pappenheimu

 Barvila May-Grünwald-Giemsa  Eozin: bazične komponente

 May-Grünwald (raztopina obarva oranžno rdeče
eozina in metilenskega modrila v  Metilensko modrilo: kisle
metanolu): obarva specifična komponente obarva modro
zrna granulocitov, ne obarva  Azur:bazične komponente
azurofilnih zrnc, slabo obarva obarva rdeče in vijolično
jadro in citoplazmo
 Giemsa (eozin in azur): celično
jedro obarva rdeče vijolično,
citoplazma pa je odvisna od
vrste celic in se obarva bolj ali
manj modro ali rožnato,
azurofilna zrnca se obarvajo
purpurno rdeče

36
 18.4.2017

Mikroskopska DKS

Eritrociti Levkociti Trombociti

• Eliptociti • Auerjeve paličice • Satelizem

• Ehinociti • Vakuolizacija • Hipogranulacija
• Akantociti • Toksične
• Tarčasti eritrociti granulacije
• Stomatociti • Dohlejeva telesca
• Drepanociti • Hipogranulacija
• Dakriociti • Hipergranulacija
• H.-J. telesca • Hiposegmentacija
• BPE • Hipersegmentacija
• Paraziti • Mikroorganizmi
• Rolo formacije

Mikroskopska DKS

37
 18.4.2017

Telesne tekočine‐ koncentracija celic

 Komora za mikroskopsko štetje 
celic v likvorju‐ Fuchs‐
Rosenthalova komora (površina 
1,6 mm2, globina 0,2 mm, 
volumen 3,2 µL)
 Vitalno obarvanje levkocitov s 
fenolnim fuksinom (razmerje 
10:1)
 Svetlobni ali faznokontrastni
mikroskop
 Štetje na manjši površini (1/16)
 Redčenje vzorca (1:10 do 1:200)
 Skupine celic!
 Delno koagulirani vzorci!

Telesne tekočine- citološki sediment

 Citološki sediment - koncentracija

celic s citocentrifugo
 Princip tehnike citocentrifugiranja
temelji na tem, da so celice gostejše,
od tekočine v kateri so suspendirane
in zaradi sile uporabljene v procesu
centrifugiranja pridobijo tudi večji
pospešek, kar jim omogoča gibanje
skozi kiveto, preko odprtine do
stekelca, kjer se kopičenje v enem
sloju.
 Barvanje po Pappenheimu
 Celice: nevtrofilci, bazofilci,
eozinofilci, limfociti, monociti,
eritrofagi, siderofagi, lipofagi,
mezotelijske celice, maligne celice,
kristali,...

38
 18.4.2017

Citološki sediment PTV/Lc

Likvor: Eritrofagi (12- 18 ur po Likvor: Siderofagi (1-2 dni po možganski

možganski krvavitvi) krvavitvi)

Citološki sediment PTV/Lc

Plevralni PTV: Maligne celice Kolenski PTV: Romboidni kristali intra in

ekstracelularno

39
 18.4.2017

Barvanje po Gramu

 Hans Christian Gram (1884)

 Diferencialno barvanje
 Razlikovanje bakterij na dve
veliki skupini (G+/G-)
 G+: temno modro-vijolične
 G-: rdeče
 Razlika v kemični in fizikalni
zgradbi bakterijske celične
stene
 G+ bakterije imajo večjo
vsebnost peptidoglikana in
manjšo vsebnost lipidov

Barvanje po Gramu

Presejalna preiskava za hitro orientacijsko identifikacijo bakterij.

Po Gramu negativne paličaste bakterije Po Gramu pozitivni koki v parih

40
 18.4.2017

Urinski sediment

 Mikroskopski pregled urinskega sedimenta je kvalitativna analiza

formiranih in s centrifugiranjem koncentriranih sestavin urina:
o eritrociti
o levkociti
o cilindri
o bakterije
o glive
o paraziti
o epitelne celice
o soli v kristalni ali amorfni obliki
o sluz (mukopolisaharidi)
o maščobe

Urinski sediment- diagnostični pomen

Dismorfni eritrociti, akantociti Tubularni epitelni cilinder

(glomerularna krvavitev) (nefrotski sindrom, akutna
tubularna nekroza,…)

41
 18.4.2017

Urinski sediment- diagnostični pomen

Celica ledvičnega tubularnega epitela Kristal cistina

(akutna tubularna nekroza, nefrotski (cistinurija - prirojena metabolna motnja)
sindrom, akutna okužba)

Blato-prebavljenost

Dokazovanje prisotnosti mišičnih vlaken, škroba in maščob.

42
 18.4.2017

Blato-paraziti

Različne razvojne oblike parazitov: ciste, jajčeca ličinke

Vrednotenje rezultatov

 Številčno/vidno polje
 Semikvantitativno (malo, številne, zelo številne/ posamezni, maloštevilni,
številni/ nekaj, večina)
 Diferenciacija 100 ali več celic
 Opis morfoloških sprememb (zapis komentarja)
 Opis/navedba dodatnih morfoloških značilnosti (eritrofagi, siderofagi,
kristali, reaktivne spremembe, atipičnost, mitoze, maligne spremembe)
 Pozitivno/negativno
 Vrsta parazita, razvojna oblika
 G+/G-, oblika (koki, paličaste, nitaste, skupine, verižice)

Poenotenje
Priporočila

43
 18.4.2017

Kakovost mikroskopskih analiz

Kakovost in ustreznost
mikroskopskih preparatov

Zanesljivost
Sposobnost in Znanje in
rezultatov! izkušnje
spretnost
osebja osebja

Standardizacija postopkov
(priprava, vrednotenje,
rezultati analize)

44