Določanje elementov v sledovih

v bioloških vzorcih
Biomedicinska analitika

asist. mag. Alenka France – Štiglic, spec. med. biokem.

 Definicije
• elementi v sledovih (ang. trace elements) so
anorganske snovi, ki so v organizmu v
koncentracijah, nižjih od 100 μg/g telesne mase
• “ultra-trace” elementi: pod 10 ng/g
• elementi v sledovih:
• esencialni (nujno potrebni),
• tisti, ki so verjetno esencialni in
• neesencialni oziroma potencialno toksični.
• najpogosteje jih določamo z metodami atomske
spektroskopije

2
 Definicije
• atomska spektrometrija je določanje
elementov glede na njihov elektromagnetni ali
masni spekter
• ločimo lahko glede na:
– vir atomizacije (plamen, elektrotermična)
– način detekcije (optična ali masna spektrometrija)

3
 Zgodovina optične spektroskopije
• 1666 Newton: sončni spekter
• 1760 Beer-Lambertov zakon
• 1802: W. H. Wollaston: temni pasovi med svetlobnimi
• 1859 Kirchoff in von Brunsen: temne črte v spektru posledica
absoprcije atomov in barve plamena zaradi prisotnih elementov
• 1928 Lunegardh: AES v kmetijstvu (acetilen – zrak)
• 1955 Welsh: prvi atomski absorpcijski spektrometer (votla katoda,
atomizacija s plamenom)
• 1961 L´vov: elektrotermična atomizacija (grafitna kiveta)
• po 1960 Greenfield (UK), Fassel (ZDA): ICP – AES
• 1963: Perkin-Elmer Corporation: prvi model rutinskega atomskega
absorberja
4
 Zgodovina masne spektrometrije
• 1898: Wein: odklon nabitih delcev v magnetnem
polju
• 1907-1913: Thomson: odklon ionov skozi
kombinirano elektrostatično in magnetno polje
• 1913: Soddy: odkritje izotopov
• 1969: Fassel: razvije metodo ICP
• 1974: prvi komercialni ICP
• v osemdesetih letih: prvi članki z ICP-MS
• 1983: prvi komercialni ICP-MS

5
 Analitične tehnike
• atomske spektrometrične:
– atomska absorpcijska spektrometrija
– atomska emisijska spektrometrija
– atomska fluorescenčna spektrometrija
• masna spektrometrija
• ostale metode (rentgenske metode,
aktivacijske analize, speciacije)

6
 Analitične tehnike

atomske atomske
optične spektrometrije masne spektrometrije

atomska atomska atomska

emisijska fluorescenčna absorpcijska
spektrometrija spektrometrija spektrometrija
ICP-MS ostale

plamenska
emisijska ICP-OES
fotometrija plamenska tehnika elektrotermična
ostale AAS hladnih AAS
par
7
ATOMSKE SPEKTROMETRIČNE
ANALITIČNE TEHNIKE

8
 Atomska spektrometrija
• emisija ali absorpcija elektromagnetnega
valovanja

Absorpcijska atomska Emisijska atomska

spektrometrija (FAAS, ETAAS) spektrometrija

9
Instrumenti za optično spektrometrijo
absorpcijska spektrometrija
vir svetlobe:
vzorec monokromator detektor signal
votla katoda

emisijska spektrometrija
vzorec v
plamenu, monokromator detektor signal
plazmi

fluorescenčna spektrometrija

vzorec monokromator detektor signal

vir: žarnica,
laser
10
 Atomske spektrometrične analitične
tehnike
• atomska emisijska spektrometrija
• atomska absorpcijska spektrometrija
• atomska fluorescenčna spektrometrija

11
Atomske spektrometrične analitične tehnike
PLAMENSKA EMISIJSKA SPEKTROMETRIJA (FES)

12
 Opis tehnike

vzbujeni atomi leče

monokromator

vir vzbujanja
detektor
plamen

www.scimedia.com

13
 Plamenska emisijska spektrometrija
• potek analize:
– razprševanje
– uvedba aerosola v plamen
– sušenje aerosola
– disociacija molekul
– atomizacija
– vzbujevanje atomov (toplotna kolizija)
– padanje elektronov v nižje ali osnovno stanje → oddajajo
značilno valovanje → usmerimo skozi monokromator, ki
prepusti samo specifično valovno dolžino → fotodetektor
→ fotopomnoževalka → signal

14
 Plamenska emisijska spektrometrija
• plamen:
– zrak (oksidant) – acetilen (gorivo)
– temperatura do 2000°C
• uporabnost
– kvalitativne določitve
– kvantitativne določitve (Na, K, Li, Ca…)
• občutljivost narašča s številom atomov v
vzbujenem stanju

15
 Plamenska emisijska spektrometrija
• interference:
– nastajajo molekule in ioni, ki:
• absorbirajo in emitirajo svetlobo (dodatne spektralne
črte)
• zmanjšujejo učinkovitost nastajanja prostih atomov
• modifikatorji:
– za atome z nizkim ionizacijskim potencialom
– elemente, ki se lažje ionizirajo, v prebitku (100x)
– K, Cs, Sr

16
Atomske spektrometrične analitične tehnike
PLAMENSKA IN ELEKTROTERMIČNA ATOMSKA
ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA

17
 Opis tehnike
leče detektor

monokromator

votla atomiziran
katoda vzorec

signal pomnoževalka

plamen ali grafitna kiveta

(1000 – 2000°C)

Beer-Lambertov zakon

www.scimedia.com

občutljivost je direktno proporcionalna številu atomov v osnovnem stanju 18

 Plamenska atomska absorpcijska
spektrometrija (FAAS)

• potek analize:
– razprševanje
– uvedba aerosola pomešanega z oksidantnim in gorilnim plinom
v plamen
– sušenje aerosola
– disociacija molekul
– atomizacija (temperatura! – sestava in razmerje oksidantnega in
gorilnega plina)
– presvetlitev oblaka atomov s svetlobo značilne valovne dolžine
→ usmerimo skozi monokromator, ki prepusti samo specifično
valovno dolžino → fotodetektor → fotopomnoževalka → signal

19
 Plamenska atomska absorpcijska
spektrometrija (FAAS)
• prednosti:
– enostavna in hitra
– poceni oprema
– manj interferenc kot ETAAS in AES
– manjša temperaturna odvisnost kot AES in večja
občutljivost in natančnost
• slabosti:
– velik volumen vzorca
– višje meje detekcije

20
 Elektrotermična atomska absorpcijska
spektrometrija (ETAAS)
• grafitna kiveta

• inerten plin
• potek analize

2000-3000 vnos vzorca in sušenje (1)

sežig (2)
350-1200 atomizacija in analiza (3)

110 čiščenje kivete (4)

ohladitev (5) 21
Elektrotermična atomska absorpcijska
spektrometrija (ETAAS)

22
 Elektrotermična atomska absorpcijska
spektrometrija (ETAAS)
• prednosti:
– majhni volumni,
– večja občutljivost (meje detekcije do 100x nižja kot pri FAAS)
– manjša poraba plinov kot FAAS
– “In situ” priprava vzorca
– direktna analiza trdnih vzorcev
– nizka cena delovanja
– avtomatizacija
• slabosti:
– interference matriksa
– čas analize
– zahtevno optimiranje določitve
– enoelementnost
– majhna množina vzorca- nehomogenost

23
 Interference AAS
• vpliv izvora (plamen, grafitna cevka)

24
 Interference pri AAS
• spektralne
– snovi, ki oddajajo svetlobo valovne dolžine, ki sovpada z analitom
(razlika v val. dolžini manj kot 0,01 nm ) ali absorbirajo in sipajo
– korekcija: višanje T atomizacije, uporaba devterijeve žarnice,
Zeemanova korekcija ozadja

25
 Interference pri AAS
• fizikalne
– neodvisne od tipa analita; viskoznost, površinska napetost, gostota,
vpliv topila na temperaturo izvora in na hitrost desolvacije
– korekcija: standardi v podobnem matriksu kot je vzorec
• kemične:
– nastanek nizko hlapnih spojini (kompleksi analita z anioni, tvorba
oksidov… ),
– disociacijske (HCl vpliva na disociacijo KCl ali NaCl),
– ionizacijske,
– nastanek hlapnih spojin
– korekcija:
• zvišanje temperature atomizacije (sprememba razmerja oksid – gorivo)
• dodatek snovi za sproščanje ali kompleksiranje
• uporaba standardov z enakim matriksom kot je vzorec (metoda
standardne adicije)
• dodatki snovi, ki se lažje ionizirajo – supresorji (K, Cs)
• znižanje temperature atomizacije

26
Atomske spektrometrične analitične tehnike
ATOMSKA ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA S
HLADNIMI PARAMI

27
 AAS s hladnimi parami
• določamo živo srebro
• ione Hg reduciramo s SnCl2, da dobimo Hg0
(dobro hlapno pri sobni temperaturi):
Hg2++ Sn2+ Hg0+ Sn4+
• z inertnim plinom pare živega srebra
prenesemo v absorpcijsko celico, kjer z
atomsko absorpcijo merimo živosrebrove
atome

28
Atomske spektrometrične analitične tehnike
ATOMSKA FLUORESCENČNA SPEKTROMETRIJA

29
Opis tehnike

30
INDUKTIVNO SKLOPLJENA PLAZMA Z
MASNO DETEKCIJO

31
 Induktivno sklopljena plazma

Emisijska Absorpcijska Induktivno sklopljena

atomska atomska plazma (ICP-MS)
spektrometrija spektrometrija
(FAAS, ETAAS)

32
 Ionizacijski potencial

Večji kot je IP, manjša je občutljivost.

33
 ICP-MS

kolizijsko/ sekvenčni
razpršilec in plazma
razpršilna reakcijska masni
stožci ionske
komora bakla celica filter
leče
detektor

34
35
 ~ 8000 K

analit v obliki
pozitivno nabitih
Teslova tuljava ionov M+
(visokofrekvenčno
magnetno polje) razkroj delcev
sušenje aerosola in disociacija
36
ionske leče

37
 razmerje masa/naboj
sekvenčni masni filter

kvadrupolne palice
tok
ionov hiperbolično električno polje

38
elektronska pomnoževalka

39
 Interference
• fizikalne / povezane z matriksom:
– viskoznost, soli, topilo…
– zmanjšana občutljivost signala, vpliv na točnost in
natančnost rezultatov, pogosto čiščenje
• spektralne:
– prekrivanje pika z merjenim analitom
– netočni rezultati, pozitivna napaka (lažno višji
rezultati)

40
 Spektralne interference
• izobarne (204Pb, 204Hg)
• poliatomski ioni (40Ar16O = 56Fe)
• dvojno nabite snovi (136Ba2+ se prekriva z 68Zn+)

41
Isotope Principal Interfering Species (mixed matrix)
45 13 16
Sc C O2, 12C16O2H, 44CaH, 32S 12CH, 32S13C, 33S12C
47 31
Ti P16O, 46CaH, 35Cl12C, 32S14NH, 33S14N
49 31
Ti P18O, 48CaH, 35Cl14N, 37Cl12C, 32S16OH, 33S16O
50 34 16
Ti S O, 32S18O, 35Cl14NH, 37Cl12CH
51 35
V Cl16O, 37Cl14N, 34S16OH
52 36
Cr Ar16O, 40Ar12C, 35Cl16OH, 37Cl14NH, 34S18O
53 36
Cr Ar16OH, 40Ar13C, 37Cl16O, 35Cl18O, 40Ar12CH
54 40
Fe Ar14N, 40Ca14N, 23Na31P
55 37
Mn Cl18O, 23Na32S, 23Na31PH
56 40
Fe Ar16O, 40Ca16O
57 40
Fe Ar16OH, 40Ca16OH
58 40
Ni Ar18O, 40Ca18O, 23Na35Cl
59 40
Co Ar18OH, 43Ca16O, 23Na35ClH
60 44
Ni Ca16O, 23Na37Cl
61 44
Ni Ca16OH, 38Ar23Na, 23Na37ClH
63 40
Cu Ar23Na, 12C16O35Cl, 12C14N37Cl, 31P32S, 31P 16O2
64 32
Zn S16O2, 32
S2, 36
Ar12C16O, 38Ar12C14N, 48
Ca16O
65 32
Cu S16O2H, 32
S2H, 14
N16O35Cl, 48
Ca16OH
66 34
Zn S16O2, 32
S34S, 33
S 2, 48
Ca18O
67 32
Zn S34SH, 33
S 2H, 48
Ca18OH, 14
N16O37Cl, 16O235Cl
68 32
Zn S18O2, 34
S2
69 32 18 34 16
Ga S O2H, S2H, O237Cl
70 34
Zn S18O2, 35
Cl2
71 34 18 35 40
Ga S O2H, Cl2H, Ar31P
72 40
Ge Ar32S, 35
Cl37Cl, 40
Ar16O2
73 40
Ge Ar32SH, 40Ar33S, 35
Cl37ClH, 40
Ar16O2H
74 40
Ge Ar34S, 37
Cl2
75 40 34 40
As Ar SH, Ar 35Cl, 40
Ca 35Cl, 37
Cl2H
77 40 37 40 37
Se Ar Cl, Ca Cl
78 40
Se Ar 38Ar
80 40
Se Ar2, 40Ca2, 40Ar40Ca, 32
S2 16O, 32
S16O3 42
 Spektralne interference
• izobarne (204Pb, 204Hg)
• poliatomski ioni (40Ar16O = 56Fe)
• dvojno nabite snovi (136Ba2+ se prekriva z 68Zn+)

Kaj storimo?
• merimo tisti izotop, ki nima spektralnih interferenc
• okside in dvojno nabite snovi zelo zmanjšamo s pravimi
nastavitvami plazme
• uporaba korekcijskih enačb
• kolizijska celica (brez plina, helij, reakcijski plin)

43
Izbira izotopa
Izotopi

Izobari

45
analit in As
interference
(plazma, Ar He
matriks) Cl As
kolizija As

Ar

Cl

kolizijska celica

46
 Slabosti
• omejena toleranca za količino raztopljene
suhe snovi – večje redčenje
• precej težavno optimiziranje metod za biološki
material
• veliko čiščenja in menjavanja cevk
• veliko spiranja zaradi možne kontaminacije,
višje koncentracije kisline
• večja poraba argona
47
 Prednosti
• hitra analiza
• določimo več elementov hkrati
(semikvantitativni in kvantitativni način)
• določanje izotopov
• večja občutljivost
• večje dinamično območje

48
PRIMERJAVA TEHNIK

49
 Izbira ustrezne tehnike
• občutljivost in meja določljivosti
• analitična natančnost
• koncentracijsko območje
• cena instrumenta
• potrebna izurjenost za delo
• analitične interference in kontrola nad njimi
• težave s kontaminacijo

50
 Primerjava tehnik
Več-elementna
analiza

Eno-elementna
analiza

51
 Primerjava atomskih spektrometričnih
analitičnih tehnik
tehnika območje prednosti slabosti

FAAS ppb to ppm (μg/L do mg/L) poceni enoelementna analiza

enostaven za uporabo veliki volumni
malo interferenc

ETAAS ppt (ng/L) občutljiva enoelementna analiza

nekaj interferenc počasna
najzahtevnejša za izvedbo
ICP-AES ppb to ppm (μg/L do mg/L) hitra kompleksne interference
večelementna relativno slaba občutljivost
visoka TDS toleranca
tehnologija hladnih ppt (ng/L) občutljiva, enoelementna analiza
par enostavna počasna
malo interferenc
AFS ppb-ppm (μg/L do mg/L) široko linearno dinamično območje spektralne in kemične interference
visoka selektivnost
enostavna
poceni
ICP-MS ppt to ppm (ng/L do mg/L) hitra, občutljiva omejena toleranca za količino
večelementna raztopljene suhe snovi (TDS)
široko linearno dinamično območje
nadzor nad interferencami
izotopska informacija
52
STANDARDIZACIJA, KALIBRACIJA,
KONTROLA KAKOVOSTI

53
 Osnovni pojmi
• meja detekcije oz. določljivosti (LOD - limit of detection) je
najmanjša količina substance, ki jo lahko ločimo od odsotnosti
substance (vrednost slepe) znotraj intervala zaupanja
• meja kvantifikacije (LOQ - limit of quantification) je najnižja
koncentracija, ki jo lahko zanesljivo določimo ob določenih
ciljih za odklon (bias) in nenatančnost (imprecision)
• meja linearnosti (LOL -limit of linearity) in linearno
(dinamično) območje
• občutljivost
• specifičnost
• pravilnost (točnost, natančnost)

54
 Karakteristična koncentracija pri ETAAS
• s karakteristično maso (včasih občutljivost) izražamo
občutljivost pri ETAAS
– to je masa analita v pg, ki ustreza signalu 0,0044
absorbance (integrirana površina vrha)

m0 = V(μL) x konc (μg/L) x 0,0044/Aint

– signal, ki ustreza masi analita, ki jo uporabimo za določitev

m0, mora biti v linearnem delu umeritvene krivulje

55
 Kalibracija
• merjena količina (signal) se more definirano in
sistematično spreminjati s koncentracijo
analita
• odnos lahko definiramo s kalibracijo z uporabo
definiranih standardov (kupljeni ali
pripravljeni)
• nikoli ne ekstrapoliramo: koncentracija
analita v vzorcu mora biti v območju
standardov

56
 Kalibracija pri AAS
• več kalibracijskih točk
• za razredčene raztopine
v teoriji velja Beer-
Lambertov zakon
• v praksi pride do
odklona od linearnosti

Linearno območje

57
 Metoda standardnega dodatka
• intenziteta signala pogosto
odvisna od matriksa
• dodatek standardne raztopine za
premagovanje interferenc
matriksa
• dodajanje standardnih raztopin
različnih koncentracij v vzorec z
neznano koncentracijo analita
• ohranjanje razmerja med
vzorcem (matriksom) in končnim
volumnom testirane raztopine
(nenatančnost – napake!)
• kalibracijska premica mora biti
linearna
• časovno zamudno

58
 Kalibracija ICP-MS

razmerje a12/is12

razmerje a11/is11

razmerje a0/is0 koncentracija 59

 Kontrola kakovosti
• notranja kontrola:
– komercialni kontrolni material
– za vsak matriks posebej
– lahko kontrolni materiali različnih nivojev
– ob vsaki seriji (na začetku in koncu ter na vsakih
10-20 vzorcev)
• zunanja kontrola:
– dvakrat na leto

60
 Predanalitika pri elementih v sledovih
• izbira ustreznega biološkega materiala:
– razporeditev v organizmu
– dostopnost biološkega materiala
– časovno obdobje v katerem želimo nadzorovati
koncentracijo elementa
– predanalitski vplivi na elemente v sledovih
• zelo občutljivi na zunanjo kontaminacijo
– protokoli za preprečitev
– viri kontaminacije: guma, les, papir, kovinske površine,
prah, koža in lasje
– pribor mora biti posebej kemično čist
– osebje: možne poti kontaminacije
61
 Predanalitika pri elementih v sledovih
• kri (kri, serum, plazma, eritrociti):
– najpogosteje venska
– kemično čiste epruvete označene za elemente v sledovih (angl.
trace elements)
– antikoagulant: EDTA ali heparin
• urin:
– enkratni urin: standardni plastični lončki s plastičnim pokrovčkom
– zbirni urin zbiramo v posebne plastične posode, ki ne oddajajo
elementov v sledovih
– zbiramo izven okolja, za katerega sumimo, da je vir izpostavljenosti
• ostali biološki materiali (lasje, nohti , tkiva (npr. jetrih, kosteh),
znoj, humano mleko, slina, blato…) → razklop vzorca, če je
potrebno

62
Predanalitika pri elementih v sledovih

• shranjevanje biološkega materiala:

– do transporta ga hranimo v hladilniku
– na -20 ˚C za analizo elementov v sledovih
uporabljamo čiste polietilenske epruvete
(stabilen več let)

63
 Kdaj določamo elemente v sledovih?
• redne analize pri otrocih in odraslih na
parenteralni prehrani (cink, baker, selen,
mangan)
• pri pacientih z obsežnimi opeklinami, obolenji
črevesja s slabo absorpcijo, sum na premajhen
vnos, pri kritično bolnih
• sum na zastrupitev
• pri različnih drugih obolenjih (Wilsonova bolezen
(Cu), avtizem, nevrološke motnje…)

64
 Elementi v sledovih
• esencialni (nujno potrebni)
• tisti, ki so verjetno esencialni
• neesencialni oziroma potencialno toksični

65
Esencialni elementi

66
 Definicije esencialnega elementa
• potreben za življenje in njegovo pomanjkanje vodi v smrt
• pomanjkanje povzroči:
– nenormalen razvoj ali funkcijo (vodi do resnih motenj v
delovanju organizma ali celo smrti) in hkrati
– dodajanje fizioloških količin samo tega elementa prepreči
neželene učinke
• pri fiziološko pomembnih funkcijah (rast, razvoj in
razmnoževanje)
• učinka esencialnega elementa ne moremo popolnoma
nadomestiti z drugim elementom
• ojačevalci: del ali aktivator metabolično aktivne molekule
(encima, vitamina…)

67
Biološka funkcija in koncentracija

68
 Uravnavanje koncentracije
• absorpcija
– načeloma se absorpcija manjša z višanjem koncentracije v črevesju in tkivih
– aktivni transport s specifičnimi vezalci in povratna inhibicija (Zn, Fe, Cu)
• shranjevanje
– proteini (metalotionin, feritin)
• izločanje
– blato (kaže na homeostatske regulacijske mehanizme kot npr. absorpcija in
sekrecija v GIT)
– urin – relativno malo se izloča (pomembna pot za I, F, Se, Cr)
– druge poti (lasje, nohti, znoj, luščenje kože) – zelo malo (izjema Zn, Se, Fe pri
obilnem potenju precej)
• vplivajo tudi:
– starost, spol, izraženost specifičnih proteinov, vloga genetskih faktorjev,
interakcije elementov

69
 Interakcije
• presežek enega elementa v sledovih lahko
vpliva na metabolno uporabo drugega
elementa, ki je v normalni ali manjši
koncentraciji
• učinek toksičnega elementa lahko zmanjšamo
z “zaščitnim” elementom

70
 Interakcije
• Zn – Cu (kompeticija)
• Zn – Cd, Pb (antagonizem)
• Zn – Ca/P (antagonizem)
• Zn – Mg (korelirata)
• Zn – Fe, Co, Cr, Mn, Ni, Hg (antagonizem)
• Cu – Fe (sinergistično)
• Cu – Pb (antagonistično)
• Cu – Hg (antagonistično)
• Cu – Ag (antagonistično)
• Cu – Cd (antagonistično)
• Cu – Mo (antagonizem)
• Cu – Ca (antagonizem)
• Cu – Fe (antagonizem)
• Se – Hg (antagonizem – varovalna vloga)
• Se – Pb (antagonizem)
• Se – Cd (antagonizem)
• Se – Ag (antagonizem)
• Se – S (nadomeščanje S v aminokislinah – nohti)
• Hg-Te (antagonizem)
• Hg-Cd (antagonizem)

71
 Enote
• ppm = mg/L
• ppb = μg/L
• ppt = ng/L
• ppq = pg/L

72
73