ANALYSIS OF INFLAMMATORY CELLS AND MEDIATORS IN SKIN WOUND BIOPSIES TO

DETERMINE WOUND AGE IN LIVING SUBJECTS IN FORENSIC MEDICINE

Analisis sel inflamasi dan mediator dalam biopsi luka kulit

menentukan usia luka pada subjek hidup dalam kedokteran forensic

ABSTRACT
Objective: In forensic medicine it is important to determine the age of skin wounds in living subjects. The
aim of this study was to assess whether analysis of inflammatory cells and inflammatory mediators in
skin biopsies of wounds from living subjects could improve wound age determination.
Methods: Biopsies (n = 101), representing the superficial border area of a skin wound, were taken from
skin injuries of known wound age (range: 4.5 hours to 25 days) of living subjects. All biopsies were
analyzed for 3 inflammatory cell markers (MPO, CD45 and CD68) and 4 inflammatory mediators (MIP-
1, IL-8, CML and vitronectin). For quantification, biopsies were subdivided in 4 different timeframes:
0.2–2 days, 2–4 days,
4–10 days and 10–25 days old wounds. Subsequently, a probability scoring system was developed.
Results: MPO, CD45, MIP-1, IL-8 (inflammatory cell markers) and N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine
(CML) positivity were maximal in wounds of 0.2–2 days old and then decreased in time. Remarkably,
CD45, CD68 and CML showed a minor but non-significant increase again in 10–25 days old wounds.
MPO
and CD68 positivity was significantly lower in 4–25 days old wounds compared to 0.2–4 days old
wounds. MPO positivity was also significantly lower in 10–25 days old wounds compared to 0.2–10 days
old wounds. For CD45, MIP-1, IL-8 and CML no significant differences between the age groups were
found. In case of vitronectin positivity in the extravasate or when the number of MIP-1 or IL-8-positive
cells was more than 10 cells/mm2 the probability that a wound was more than 10 days old was 0%. A
probability scoring system of all analyzed markers can be used to calculate individual wound age
probabilities in biopsies of skin wounds of living subjects.
Conclusions: We have developed a probability scoring system of inflammatory cells and mediators that
can be used to determine wound age in skin biopsies of living subjects.

ABSTRAK
Tujuan: Dalam kedokteran forensik, penting untuk menentukan usia luka kulit pada subjek yang hidup.
Itu
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai apakah analisis sel inflamasi dan mediator inflamasi
dalambiopsi kulit luka dari subjek yang hidup dapat meningkatkan penentuan usia luka.
Metode: Biopsi (n = 101), yang mewakili area perbatasan permukaan kulit, diambil dari kulit
cedera usia luka yang diketahui (kisaran: 4,5 jam hingga 25 hari) dari subjek yang hidup. Semua biopsi
dianalisis selama 3 penanda sel inflamasi (MPO, CD45 dan CD68) dan 4 mediator inflamasi (MIP-1, IL-
8, CML dan vitronektin). Untuk kuantifikasi, biopsi dibagi menjadi 4 kerangka waktu yang berbeda: 0,2-
2 hari, 2-4 hari, Luka lama 4–10 hari dan 10–25 hari. Selanjutnya, sistem penilaian probabilitas
dikembangkan.
Hasil: MPO, CD45, MIP-1, IL-8 (penanda sel inflamasi) dan N (epsilon) - (karboksimetil) lisin (CML)
positif pada luka maksimal 0,2-2 hari dan kemudian menurun dalam waktu. Sungguh, CD45, CD68 dan
CML menunjukkan peningkatan kecil tetapi tidak signifikan lagi pada luka lama 10-25 hari. MPO dan
kepositifan CD68 secara signifikan lebih rendah pada luka berusia 4-25 hari dibandingkan dengan usia
0,2–4 hari luka. Positifitas MPO juga secara signifikan lebih rendah pada luka lama 10-25 hari
dibandingkan dengan 0,2-10 hari luka lama. Untuk CD45, MIP-1, IL-8 dan CML tidak ada perbedaan
yang signifikan antara kelompok umur ditemukan. Dalam kasus positif vitronektin dalam ekstravasat atau
ketika jumlah MIP-1 atau IL-8-positif sel lebih dari 10 sel / mm2 probabilitas bahwa luka lebih dari 10
hari adalah 0%. SEBUAH sistem penilaian probabilitas semua penanda yang dianalisis dapat digunakan
untuk menghitung usia luka individu probabilitas dalam biopsi luka kulit pada subyek yang hidup.
Kesimpulan: Kami telah mengembangkan sistem penilaian probabilitas sel inflamasi dan mediator itu
dapat digunakan untuk menentukan usia luka pada biopsi kulit subyek hidup.

Introduction
In forensic medicine it is essential to determine wound age. Inthe Netherlands, when victims of physical
abuse report a crime,they are referred to a forensic physician for an assessment of the injury, including
wound age estimation. It is however known that the macroscopical description of a wound to determine
wound age is inadequate [1–4]. Hence there is need for a more adequate method to determine wound age
in living subjects. In forensic autopsies, immunohistochemical analysis is used to determine wound age
more precisely in skin excisions containing epidermis, dermis and (part of) the subcutis, and the wound
itself [1,5]. Since it is not ethical to excise skin wounds in living subjects, we wondered whether
superficial skin biopsies, representing the border area of skin injuries, could also be used for (immuno)
histochemical analysis to determine wound age. In this study different inflammatory markers were
analyzed, that were mostly studied in previous autopsy studies. Although, this is the first study on living
subjects not going anesthesia, in other studies skin samples were taken from living patients undergoing
surgical interventions [6–8].

pengantar
Dalam kedokteran forensik sangat penting untuk menentukan usia luka. Di Belanda, ketika korban
penganiayaan fisik melaporkan suatu kejahatan, mereka dirujuk ke dokter forensik untuk penilaian
cedera, termasuk estimasi usia luka. Namun diketahui bahwa deskripsi makroskopis luka untuk
menentukan usia luka tidak memadai [1-4]. Makanya perlu ada yang lebih memadai metode untuk
menentukan usia luka pada subjek hidup. Dalam forensic otopsi, analisis imunohistokimia digunakan
untuk menentukan usia luka lebih tepatnya pada eksisi kulit yang mengandung epidermis, dermis dan
(bagian dari) subkutis, dan luka itu sendiri [1,5]. Sejak itu tidak etis untuk memotong luka kulit pada
subjek yang hidup, kami bertanya-tanya apakah biopsi kulit superfisial, mewakili daerah perbatasan
cedera kulit, juga dapat digunakan untuk analisis histokimia (immuno) untuk menentukan usia luka.
Dalam penelitian ini inflamasi berbeda marka dianalisis, yang sebagian besar dipelajari di sebelumnya
studi otopsi. Meskipun, ini adalah studi pertama tentang subyek yang hidup tidak terjadi anestesi, dalam
penelitian lain sampel kulit diambil dari pasien yang hidup menjalani intervensi bedah [6-8].

The first inflammatory cells that invade the site of injury are neutrophilic granulocytes. They can be
detected extravascular in human skin wounds as soon as 20–30 min after infliction [9,10]. Lymphocytes,
which are attracted to the wound by chemokines, can be found as soon as 5–6 h post wound infliction
[11]. Also macrophages can be detected as early as 5–6 h after wounding, although they have been
described to peak at 1–2 days in wounds, as studied in both human skin and animal models [12–14].
Kondo et al. showed that neutrophils also express the chemokines MIP-1 and IL-8, important mediators
of the immune response, as early as 4–12 h after wounding in autopsy skin wounds. With increasing
wound age macrophages and fibroblasts were positive for MIP-1 and IL-8 as well [15–17]. The
inflammatory mediator vitronectin has an inhibiting role in the complement pathway and is upregulated in
human fibroblasts on day 3 and day 6 after wound infliction [18,19]. Finally, an important
proinflammatory mediator of activated endothelium is N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine (CML), an
advanced glycation endproduct [20]. Its role in wound age determination however is unknown.

Sel-sel inflamasi pertama yang menyerang lokasi cedera adalah granulosit neutrofilik. Mereka dapat
dideteksi ekstravaskular pada luka kulit manusia segera setelah 20-30 menit setelah kejadian [9,10].
Limfosit, yang tertarik ke luka oleh kemokin, dapat ditemukan segera setelah 5-6 jam pasca luka luka
[11]. Juga makrofag dapat dideteksi sedini 5-6 jam setelah terluka, meskipun mereka telah digambarkan
memuncak pada 1-2 hari dalam luka, sebagaimana dipelajari dalam model kulit dan hewan manusia [12-
14]. Kondo et al. menunjukkan bahwa neutrofil juga mengekspresikan kemokin MIP-1 dan IL-8, mediator
penting respon imun, sedini mungkin 4–12 jam setelah luka pada luka kulit otopsi. Dengan meningkatnya
makrofag usia luka dan fibroblas positif untuk MIP-1 dan IL-8 juga [15-17]. Mediator inflamasi
vitronektin memiliki peran penghambat dalam jalur komplemen dan diregulasi dalam fibroblast manusia
pada hari ke 3 dan hari ke 6 setelah luka penderitaan [18,19]. Akhirnya, mediator proinflamasi yang
penting endotelium yang diaktifkan adalah N (epsilon) - (karboksimetil) lisin (CML), suatu produk akhir
glikasi maju [20]. Perannya dalam luka Namun penentuan usia tidak diketahui.

We have now quantified these inflammatory cells and mediators in skin biopsies of living subjects, to
analyze whether they can be helpful to determine wound age in living subjects.

Kami sekarang telah menghitung sel-sel inflamasi ini dan mediator dalam biopsi kulit subyek hidup,
untuk menganalisis apakah mereka dapat membantu menentukan usia luka dalam hidup mata pelajaran.

Materials and methods

We have collected 101 human skin biopsies from patients being referred to a forensic physician of the
Public Health Service in Amsterdam from May 2008 until November 2009. Patients with skin injuries of
known age were asked permission to obtain a wound biopsy. The mean age of the population was 37
years (range: 17–80 years), consisting of 52 males (51%) and 49 females (49%). Mean wound age, as
reported by the victim, was 5.4 days (range: 4.5 hours to 25 days). 3 cases were excluded, as there was
not enough material. The distribution of wound age in the other 98 cases was as follows: 0.2–2 days (n =
27), 2–4 days (n = 28), 4–10 days (n = 28) and 10–25 days (n = 15). The wounds were identified
macroscopically. The different types of injuries were bruises (69%), abrasions (19%), bites (3%), stabs
(2%), scratches (2%), unknown (3%) and firework (1%). Permission for this study was given by the
Medical Ethical Commission (METC) of the VUmc.

material dan metode

Kami telah mengumpulkan 101 biopsi kulit manusia dari pasien dirujuk ke dokter forensik dari Layanan
Kesehatan Masyarakat di Jakarta Amsterdam dari Mei 2008 hingga November 2009. Pasien dengan
cedera kulit pada usia yang diketahui diminta izin untuk mendapatkan biopsi luka. Usia rata-rata populasi
adalah 37 tahun (kisaran: 17–80 tahun), terdiri dari 52 pria (51%) dan 49 wanita (49%). Usia luka rata-
rata, seperti yang dilaporkan oleh korban, adalah 5,4 hari (kisaran: 4,5 jam hingga 25 hari). 3 kasus
dikeluarkan, karena ada tidak cukup material. Distribusi usia luka yang lain 98 kasus adalah sebagai
berikut: 0,2–2 hari (n = 27), 2-4 hari (n = 28), 4–10 hari (n = 28) dan 10–25 hari (n = 15). Luka itu
diidentifikasi secara makroskopis. Berbagai jenis cedera terjadi memar (69%), lecet (19%), gigitan (3%),
tusukan (2%), goresan (2%), tidak diketahui (3%) dan kembang api (1%). Izin untuk penelitian ini
diberikan oleh Komisi Etika Medis (METC) dari VUmc.

Histochemistry and immunohistochemistry

Skin biopsies were fixed in 4% formaldehyde solution and embedded in paraffin. For histochemical
analysis, 4 mm-thick Histokimia dan imunohistokimia tissue sections were stained with
hematoxylin/eosin (H&E) according to standard methods. For immunohistochemical analysis tissues were
deparaffinized and rehydrated and incubated in methanol/H2O2 (0.3%) for 30 min to block endogenous
peroxidases. Antigen retrieval was performed by either boiling slides for 10 min in a citrate pH 6.0 buffer
(MPO, CD68 and vitronectin), or Tris-EDTA pH 9.0 (IL-8) solution or by incubation with pepsine/HCl
(0.1%) (MIP-1, CML) for 30 min at 37 8C.

Histokimia dan imunohistokimia

Biopsi kulit diperbaiki dalam larutan formaldehid 4% dan tertanam dalam parafin. Untuk analisis
histokimia, tebal 4 mm bagian jaringan diwarnai dengan hematoxylin / eosin (H&E) sesuai dengan
metode standar. Untuk analisis imunohistokimia jaringan dideparafininasi dan direhidrasi dan diinkubasi
dalam methanol / H2O2 (0,3%) selama 30 menit untuk memblokir peroksidase endogen. Pengambilan
antigen dilakukan oleh salah satu slide didih untuk 10 menit dalam buffer sitrat pH 6,0 (MPO, CD68 dan
vitronektin), atau Larutan Tris-EDTA pH 9.0 (IL-8) atau dengan inkubasi dengan pepsine / HCl (0,1%)
(MIP-1, CML) selama 30 menit pada 37 8C.

Gambar 1. Gambar-gambar imunohistokimia dari 7 penanda berbeda. (A) Luka kulit berumur 2 hari
dengan sel MPO-positif (panah). (B) Luka kulit berusia 1 hari dengan CD45-positif sel (panah). (c) Luka
kulit berusia 3 hari dengan sel CD68-positif (panah). (D) Luka kulit berumur 1 hari dengan sel MIP
positif (panah). (e) Luka kulit berumur 4,5 hari dengan IL-Sel 8-positif (panah). (f) Luka kulit berumur 2
hari dengan ekspresi epidermis IL-8 sedang (panah). (g) Luka kulit berumur 2,5 hari dengan pembuluh
darah positif-CML. Panah menunjukkan pembuluh darah dengan skor intensitas 3. (h) Ekspresi
Vitronectin dari ekstravasat dalam luka kulit 1,6 hari (panah). Pembesaran asli: (aâ € “e, g) 400;(f, h) 200.
J. 8 Fronczek et al. / Forensic Science International 247 (2015) 7â € “13

Sections were incubated with either rabbit anti-human myeloperoxidase (1:700, Dako, Glostrup,
Denmark), mouse anti-human CD45 (1:50, Dako, Glostrup, Denmark), mouse anti-human CD68 (1:400,
Dako, Glostrup, Denmark), rabbit anti-human MIP-1 (1:50, Genetex, Atlanta, USA), rabbit anti-human
IL-8 (1:100, Novus Biologicals, Littleton, USA), rabbit anti-human CML (1:500, CLB, Amsterdam, The
Netherlands) or mouse anti-human Vitronectin (1:2000, Abcam, Cambridge, UK) antibody for 1 h at
room temperature (RT). Next sections were incubated with anti-mouse/ rabbit Envision (Dako, Glostrup,
Denmark) for 30 min at RT. Staining was visualized using 3,30-diaminobenzidine (0.1 mg/ml, 0.02%
H2O2).

Bagian diinkubasi dengan myeloperoxidase anti-manusia kelinci (1: 700, Dako, Glostrup, Denmark),
tikus anti-manusia CD45 (1:50, Dako, Glostrup, Denmark), CD68 anti-manusia tikus (1: 400, Dako,
Glostrup, Denmark), kelinci anti-manusia MIP-1 (1:50, Genetex, Atlanta, AS), kelinci anti-manusia IL-8
(1: 100, Novus Biologicals, Littleton, USA), kelinci CML anti-manusia (1: 500, CLB, Amsterdam,
Belanda) atau tikus anti-manusia Vitronectin (1: 2000, Abcam, Cambridge, UK) antibodi selama 1 jam di
kamar suhu (RT). Bagian selanjutnya diinkubasi dengan anti-mouse / rabbit Envision (Dako, Glostrup,
Denmark) selama 30 menit di RT. Pewarnaan divisualisasikan menggunakan 3,30-diaminobenzidine (0,1
mg / ml, 0,02% H2O2).
Sections were then counterstained with hematoxylin, dehydrated and covered. As a control, the same
staining procedure was used, but then the primary monoclonal or polyclonal antibody was replaced by
phosphate buffered saline. These tissue slides were negative (not shown).

Bagian kemudian counterstained dengan hematoxylin, dehidrasi dan tertutup. Sebagai kontrol, prosedur
pewarnaan yang sama adalah digunakan, tetapi kemudian antibodi monoklonal atau poliklonal primer
digantikan oleh saline buffer fosfat. Slide jaringan ini negatif (tidak diperlihatkan).

2.2. (Immuno)histochemical analysis

Slides were evaluated by light microscopy. The biopsies reflected the superficial border zone area of a
wound, containing the epidermis and dermis. In total 8 variables were scored as
follows:
Inflammatory cells:
- MPO (neutrophilic granulocytes), CD45 (lymphocytes), CD68
(macrophages): number of extravascular cells/mm2.
Inflammatory mediators:
- MIP-1: number of MIP-1-positive extravascular neutrophils
and macrophages/mm2
- IL-8: number of IL-8-positive extravascular neutrophils and
macrophages/mm2

- IL-8: intensity of the expression of the epidermis:

*Score 0: no staining
*Score 1: minor staining
*Score 2: moderate staining
*Score 3: strong staining.

- CML: each positive blood vessel was given an intensity score of:
*Score 1: minor staining
*Score 2: moderate staining
*Score 3: strong staining

2.2. (Immuno) analisis histokimia

Slide dievaluasi dengan mikroskop cahaya. Biopsi mencerminkan area zona perbatasan yang dangkal dari
luka, yang mengandung epidermis dan dermis. Total 8 variabel diberi skor sebagai berikut:

Sel-sel inflamasi:
- MPO (granulosit neutrofilik), CD45 (limfosit), CD68
(Makrofag): jumlah sel ekstravaskular / mm2.
Mediator inflamasi:
- MIP-1: jumlah neutrofil ekstravaskular MIP-1-positif
dan makrofag / mm2
- IL-8: jumlah neutrofil ekstravaskular IL-8-positif dan
makrofag / mm2

- IL-8: intensitas ekspresi epidermis:

* Skor 0: tidak ada noda
* Skor 1: pewarnaan minor
* Skor 2: pewarnaan sedang
 * Skor 3: pewarnaan kuat.

- CML: setiap pembuluh darah positif diberi skor intensitas:

* Skor 1: pewarnaan minor
* Skor 2: pewarnaan sedang
* Skor 3: pewarnaan kuat

Each score was multiplied with the number of positive blood vessels with that particular intensity score,
divided by the total surface area, resulting in a final immunohistochemical intensity score of CML/mm2
[21].
- Vitronectin expression in extravasate of erythrocytes and/or inflammatory cells: yes/no.
The total surface of each sample was measured using
QPRODIT [22].

Setiap skor dikalikan dengan jumlah positif pembuluh darah dengan skor intensitas tertentu, dibagi
dengan total luas permukaan, menghasilkan imunohistokimia akhir skor intensitas CML / mm2 [21].
- Ekspresi vitronektin dalam ekstravasat eritrosit dan / atau sel-sel inflamasi: ya / tidak.
Total permukaan setiap sampel diukur menggunakan
QPRODIT [22].

2.3. Statistical analysis

Statistical analysis was performed with SPSS (Windows version 20, IBM corp., Armonk, NY).
Differences in the variables between different wound age groups were tested with the chi-square test
(dichotomous or categorical variables) or the Kruskal–Wallis and the Mann–Whitney test (non-normal
continuous variables). P-values <0.05 were considered significant. Post hoc analysis to compare two
different wound age groups were corrected for multiple testing via the Bonferroni correction, in which
case p-values <0.017 were considered significant.

2.3. Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan dengan SPSS (versi Windows 20, IBM corp., Armonk, NY). Perbedaan dalam
variabel antara kelompok usia luka yang berbeda diuji dengan uji chi-square (variabel dikotomis atau
kategori) atau Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney (variabel kontinu non-normal). Nilai P <0,05
dianggap signifikan. Analisis post hoc untuk bandingkan dua kelompok umur luka yang berbeda untuk
dikoreksi beberapa pengujian melalui koreksi Bonferroni, dalam hal ini nilai p <0,017 dianggap
signifikan.

2.4. Probability scores

For quantification wound age was divided into four groups: 0.2–2 days old, 2–4 days old, 4–10 days old
and 10–25 days old. To compute the probability scores, the MPO, CD45, CD68, MIP-1, IL-8

2.4. Skor probabilitas

Untuk kuantifikasi usia luka dibagi menjadi empat kelompok: 0,2–2 hari, 2–4 hari, 4–10 hari, dan 10–25
hari. Untuk hitung skor probabilitas, MPO, CD45, CD68, MIP-1, IL-8
Gambar. 2. Analisis sel inflamasi / mm2. Jumlah (a) MPO, (b) CD45, dan (c) sel CD68-positif dalam
kelompok yang berbeda. Luka berumur 0,2–2 dan 2–4 hari gabungan secara signifikan berbeda (p = 0,004
untuk MPO dan p = 0,002 untuk CD68) dibandingkan dengan luka pada usia 4–10 dan 10–25 hari. Untuk
MPO juga ada luka kombinasi 0,2–2, 2–4 dan 4–10 hari berbeda secara signifikan (p = 0,016)
dibandingkan dengan luka lama 10-25 hari.