Vežba 2.

Analitika proteina

Analitička gel filtracija

Gel filtracija (gel hromatografija, molekulsko prosejavanje, gel permeaciona hromatografija)

može biti preparativna metoda koja se koristi za razdvajanje proteina na osnovu molekulske
mase, rasoljavanje i izmenu pufera, kao i analitička metoda za određivanje nepoznate molekulske
mase proteina.

Gel se sastoji iz trodimenzionalne molekulske mreže u obliku kuglica. Pore unutar mreže
takvih su dimenzija da manji molekuli iz smeše koju smo naneli na kolonu mogu, dok veći ne
mogu u njih da uđu (Slika 1).

Slika 1. Dvodimenzionalni prikaz materijala za gel filtraciju.

Slika 2. Princip razdvajanja molekula različite veličine gel-filtracijom.

Veličine koje karakterišu gel-filtraciju su elucione zapremine: V o, Vt i Ve (Slika 3). Vo (void

volume ili dead volume) je početna ili "mrtva" zapremina prostora između kuglica matriksa i

1
odgovara elucionoj zapremini supstance velike molekuske mase, koja bez zadržavanja prolazi
kroz kolonu. Vt (total volume) je ukupna zapremina kolone i odgovara elucionoj zapremini
supstance male molekulske mase, koja se najviše zadržava u porama gela. Ve je eluciona
zapremina datog molekula (proteina), koja ima vrednost u rasponu između Vo i Vt (Slika 3). Za
određivanje Vo i Vt standardno se koriste obojeni molekuli veće odnosno manje mase od
proteina.

Slika 3. Shematski prikaz Vt i Vo.

Ponašanje datog molekula pri gel-filtraciji karakteriše se elucionom zapreminom V e, odnosno

preciznije podeonom konstantom Kav:

Slika 4. Kalibracione prave za određivanje molekulske mase proteina na Sephadex-kolonama

2
 Na elucionu zapreminu proteina utiče veličina i oblik molekula. Molekuli proteina koji se
dovoljno razlikuju po veličini, a istog su oblika, imaće različite elucione zapremine, pri čemu će
redosled eluiranja biti obrnuto srazmeran njihovim molekulskim masama. Elucioni profil
prikazuje se u vidu hromatograma koji predstavlja zavisnost koncentracije eluirane supstance od
elucione zapremine (Slika 5). Na hromatogramu se uočavaju pikovi razdvojenih proteina pri
čemu Ve svakog od njih odgovara zapremini koja protekne proz kolonu od nanošenja uzorka do
elucije maksimuma koncentracije datog proteina. Najmanje elucione zapremine imaju veliki
molekuli koji se ne zadržavaju u porama već prolaze između kuglica matriksa. Proteini manjih
masa se zadržavaju u porama, prelaze duži put i imaju veće elucione zapremine. Eluciona
zapremina proteina se određuje detekcijom proteinskog pika (npr. kolorimetrijskom metodom) u
sakupljenim frakcijama male zapremine.

Slika 5. Gel filtracioni hromatogram smeše pet proteina čije se molekulske mase međusobno
razlikuju za faktor 2.

Poznavajući elucione zapremine (Ve, odn. Kav) proteina poznatih molekulskih masa može se
odrediti nepoznata molekulska masa proteina na osnovu odredjivanja njegove elucione
zapremine.

Različiti materijali se koriste kao matriksi za gel filtraciju. Jedan od starijih i često korišćenih
je Sephadex koji nastaje umrežavanjem dekstrana. Primenjuju se i materijali koji se dobijaju
polimerizacijom akrilamida i bisakrilamida u različitim odnosima.

3
Elektroforeze

Elektroforeza predstavlja kretanje naelektrisanih čestica u električnom polju. Postoje brojne

elektroforetske tehnike sa različitim namenama, među kojima u biohemijskoj praksi najveću
primenu imaju gel elektroforeze – agarozna (u kliničkoj biohemiji) i mnogo češće
poliakrilamidna gel elektroforeza (PAGE). Elektroforeza je analitička metoda, mada postoji
mogućnost da se koristi kao preparativna za izolovanje proteina i mnogo češće nukleinskih
kiselina, isecanjem trake iz gela. Primene elektroforeze su brojne: utvrđivanje homogenosti
proteina prilikom praćenja procesa prečišćavanja (od smeše proteina u ekstraktu biološkog
materijala do jedne trake potpuno prečišćenog proteina), za karakterisanje proteins određivanjem
molekulske mase (SDS PAGE) i pI vrednosti (izoelektrično fokusiranje).

Izoelektrično fokusiranje je tehnika koja se koristi za razdvajanje proteina prema pI i za

određivanje pI vrednosti proteina. Proteini se razdvajaju u gradijentu pH koji se postiže pomoću
rastvora amfolita – sintetičkih polimera koji sadrže kisele i bazne grupe različitih pKa vrednosti.
U električnom polju proteini iz smeše dr kreću prema jednoj od elektroda dok ne dostignu oblast
u kojoj je pH jednaka njihovoj pI vrednosti. Na ovaj način proteini se razdvajaju prema pI
vrednostima.

Poliakrilamidna gel elektroforeza (PAGE)

Elektroforeza proteina se radi u gelu, koji se formira polimerizacijom akrilamida i N,N-

metilen-(bis)akrilamida:

4
 Stepen umreženja gela zavisi od količine dodatog N,N-metilen-(bis)akrilamida. Standardno se
koriste gelovi sa 7 - 12% umreženja, osim prilikom analize proteina izuzetno velikih molekulskih
masa ili analize peptida. Za analizu je dovoljno 5 - 25 g proteina. Šema aparature za
elektroforezu data je na Slici 6.

Ova elektroforeza se obično radi u puferu alkalnog pH, jer je pri tim uslovima većina proteina
negativno naelektrisana, te se kreću od katode ka anodi. Po završetku elektroforeze, gelovi se
izvade, razdvojeni proteini "fiksiraju", taloženjem organskim kiselinama, a potom boje. Višak
boje se ispere, a trake razdvojenih proteina se uočavaju na osnovu boje koja se na njima
adsorbovala (Slika 6).

Slika 6. Skica aparature za elektroforezu i primer elektroforegrama (SDS-PAGE)

Standardna PAGE je nativna metoda u kojoj na kretanje proteina u električnom polju utiče i
naelektrisanje i molekulska masa (razdvajaju se na osnovu odnosa m/q). Rezolutivnost ove
metode je mala pa je u velikoj meri zamenjena SDS PAGE elektroforezom.

SDS PAGE

U SDS PAGE metodi proteini se denaturišu u prisustvu anjonskog detergenta natrijum

dodecil sulfata (SDS) na visokoj temperaturi. Ovako denaturisani proteini su rastvorni i
uniformno negativno naelektrisani (Slika 7). SDS gradi slabe interakcije sa aminokiselinskim
ostacima tako da se u proseku na svaka dva aminokiselinska ostatka nalazi jedan molekul SDS.

5
Kao posledica ovakve stehiometrije i negativnog naelektrisanja SDS, proteini su potpuno
raspleteni i odnos q/m kod svih proteina je isti. Na razdvajanje proteina u ovim uslovima ne utiče
ni naelektrisanje ni oblik molekula već samo molekulska masa. Za određivanje molekulske mase
konstruišu se kalibracione na osnovu mobilnosti proteina poznatih molekulskih masa (Slika 8).

Slika 7. Denaturacija proteina u prisustvu SDS-a

Slika 8. Dijagram pokretljivosti proteina u SDS elektroforezi u zavisnosti od njihove

molekulske mase.

SDS PAGE se standardno radi u diskontinualnom sistemu što znači da se koriste dva gela od
kojih prvi služi za koncentrovanje uzoraka („stacking“ – gornji gel), a drugi za njihovo
razdvajanje prema molekulskoj masi („running“ – donji gel). Glavne razlike između ovih gelova
su procenat umreženja i u pH vrednost. U gelu za koncentrovanje formiraju se bunarići u koje se
nalivaju uzorci. Pre nanošenja, uzorci se pripremaju mešanjem sa pufesom za uzorke koji sadrži
reagense za denaturaciju (SDS i β-merkaptoetanol) koja se ostvaruje uz zagrevanje na
temperaturi ključanja vode. U puferu za uzorke nalazi se i mali obojeni molekul – brom fenol
plavo koji služi za praćenje toka elektroforeze koja se prekida kada se boja približi ivici gela. Po
završetku, proteinske trake se vizuelizuju nekim od bojenih reagenasa. Za bojenje ukupnih
proteina najčešće se koriste CBB (Comassie Brilliant Blue) ili postupak bojenja srebrom.
Proteini se mogu i selektivno bojiti – primer je Šifovo bojenje glikoproteina.

6
Eksperimentalni deo

1. Gel-filtracija: Određivanje molekulske mase ovalbumina

Materijal:

- 50 mM Na fosfatni pufer pH 7
- rastvor plavog dekstrana (10 mg/mL)
- rastvor kalijumdihromata (10 mg/mL)
- preparat ovalbumina

Na vrh kolone koja je napakovana matriksom Sephadex G-100 pažljivo nanesite rastvor
plavog dekstrana sa ovalbuminom (tako da ne uzburkate matriks na vrhu). Protok kolone treba
da bude podešen na oko 2-3 mL na 10 min. Odmah po nanošenju, počnite sa sakupljanjem pufera
na izlazu iz kolone. Kada uzorak uđe u matriks, pažljivo dodajte pufer na vrh kolone (matriks
nikada ne sme ostati suv). Kada sakupite oko 2 mL eluata, nanesite na vrh kolone i
kalijumdihromat (zapišite tačnu zapreminu koja je izašla iz kolone do trenutka nanošenja
kalijumdihromata). Sakupljajte eluat u početku u menzuri. Kada počne da silazi plavi dekstran iz
kolone, sakupljanje eluata nastavite u frakcijama od po 0,5 mL u ependorf tubama (sve do
potpunog eluiranja kalijumdihromata). Na osnovu intenziteta boje odredite frakcije u kojima se
nalaze elucioni maksimumi plavog dekstrana i dihromata. Elucioni maksimum ovalbumina
odredićete Bredfordovom metodom (koja se koristi i za određivanje koncentracije proteina).

Iz dobijenih zapremina (V0, Vt i Ve) izračunajte Kav vrednost za ovalbumin i na osnovu

kalibracione prave za Sephadex G-100 koja je data u praktikumu, odredite molekulsku masu
ovalbumina.

7
 2. Brаdford-ova metoda za određivanje koncentracije proteina

Bredfordov reagens:

CBB G-250 250 mg

95% etanol 50 mL
96% fosforna kiselina 100 mL
Destilovana voda do 200 mL

Postupak:

U bunare mikrotitar pločice otpipetirati po 20 μL svake frakcije dobijene sa gel-filtracije

(osim onih u kojima je plavi dekstran i kalijumdihromat), kao i 20 μL vode (slepa proba). U
svaku dodati po 200 μL Bredfordovog reagensa. Nakon 5 min izmeriti apsorbancu na 620 nm.
Na osnovu intenziteta dobijenih apsorbanci odredite u kojoj je frakciji elucioni maksimum
ovalbumina.

3. SDS poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS PAGE)

Materijal:

- aparatura za elektroforezu
- monomerni rastvor (30% akrilamid, 2,7% bisakrilamid) Pažnja: toksičan!
- pufer gel za razdvajanje (1,5 M Tris pH 8,8)
- pufer gela za koncentrovanje (0,5 M Tris pH 6,8)
- inicijator polimerizacije (10% amonijum persulfat)
- TEMED
- n-butanol zasićen vodom
- 10% SDS
- pufer za elektroforezu (0,025 M Tris, 0,192 M glicin, 0,1% SDS, pH 8,3)
- pufer za uzorke (0,0625 M Tris pH 6,8, 2% SDS, 20% glicerol, 10% β-merkaptoetanol, 0,03%
bromfenol plavo)
- rastvor za fiksiranje gelova (40% metanol, 10% sirćetna kiselina)

8
- rastvor za bojenje (0,125% Coomassie Briliant Blue R-250, 50% metanol, 10% sirćetna
kiselina)
- rastvor za obezbojavanje (7% sirćetna kiselina)

Postupak pripreme gelova za SDS PAGE:

U čašicu od 25 mL odmeriti sledeće zapremina rastvora za gel za razdvajanje:

finalna koncentracija
akrilamida u gelu 12%
Rastvor:
Monomerni 4.00
rastvor (mL)
Pufer (mL) 2.50
Voda (mL) 3.33
TEMED (µL) 5
SDS (mL) 0.10
APS (mL) 0.05
* Ukupna zapremina je 10 mL i ona je dovoljna za dva gela

U čašicu od 10 mL odmeriti sledeće zapremina rastvora za gel za koncentrovanje:

finalna koncentracija
akrilamida u gelu 4%
Rastvor
Monomerni 0.67
rastvor (mL)
Pufer (mL) 1.25
voda (mL) 3.00
TEMED (μL) 2.5
SDS (μL) 50
APS (μL) 25
* Ukupna zapremina je 5 mL i ona je dovoljna za dva gela

Rastvor gela za razdvajanje se dobro promeša i nalije između dve staklene ploče sistema za
elektroforezu koje su odvojene odgovarajućim spejserima. Gel za razdvajanje se nadsloji
rastvorom n-butanola zasićenog vodom. Reakcija polimerizacije traje 20-30 min. Nakon
završene polimerizacije, ispere se n-butanol sa površine gela i nalije se gel za koncentrovanje. U
ovaj gel se odmah ubaci češalj kojim se prave bunari za nanošenje uzoraka. Nakon što
ispolimerizuje i gornji gel, češalj se vadi i bunari ispiraju vodom. Gel se postavlja u sistem za

9
elektroforezu i u bunare se mikrošpricem nanose uzorci proteina koji su prethodno pripremljeni
za elektroforezu.

Priprema uzoraka za elektroforezu:

Odgovarajuća razblaženja ovalbumina i ovoglobulina pomešati sa puferom za uzorke.

Inkubirati 10 min na 95 °C (isto inkubirati i markere za elektroforezu). Markeri za elektroforezu
su smeša proteina poznatih molekulskih masa koja nam služi za određivanje mase proteina u
našim uzorcima.

Nakon nanošenja uzoraka u bunare gela, sistem se priključi na izvor struje. Podesi se voltaža
na 80 V. Kada uzorci uđu u gel za razdvajanje, voltaža se može povećati. Elektroforeza je
završena kada front boje (bromfenol plavo) dođe do kraja gela. Tada se struja isključuje i gelovi
prebacuju u plastične posude. Sledi bojenje gelova u cilju vizuelizacije proteina.

Bojenje gelova uobičajenim postupkom - detekcija svih proteina:

Uobičajeni postupak bojenja SDS gelova podrazumeva korišćenje boje Coomassie Briliant
Blue R-250 (skraćeno CBB). Postupak je prikazan u tabeli:

Faza Rastvor Vreme (min)

Ispiranje Destilovana voda 1
Fiksiranje Rastvor za fiksiranje 10
Bojenje Rastvor boje 25
Obezbojavanje Rastvor za fiksiranje 15
Obezbojavanje Rastvor za Do obezbojenja
obezbojavanje

10