(11)

Metode
razdvajanja
HROMATOGRAFIJA
Adsorpciona hromatografija u koloni
Podeona (particiona) hromatografija
Jonoizmenjiva~ka hromatografija

ELEKTROFOREZA
Elektroforetsko razdvajanje sme{e
Fe(II)– i Fe(III)– jona
 HROMATOGRAFIJA
(gr~ki chroma – boja i graphein – pisati)

Hromatografija je postupak koji omogu}ava razdvajanje, izolovanje, Teorijski princip

identifikaciju i odre|ivanje sastojaka sme{e na osnovu procesa koji
se de{avaju na granici dve faze koje se ne me{aju. Jedna faza je sta-
cionarna i mo`e biti porozno ili granulisano ~vrsto telo, te~nost,
tanak sloj te~nosti adsorbovan na ~vrstom telu i jonoizmenjiva~.
Druga faza je mobilna i mo`e biti gas ili te~nost.
Hromatografski proces sastoji se u tome {to se rastvor sme{e u
mobilnoj fazi propu{ta kroz stacionarnu fazu, pri ~emu dolazi do
raspodele komponenata sme{e izme|u mobilne i stacionarne faze.
Ovaj prelazak komponente iz jedne u drugu fazu de{ava}e se sve dok
odnos koncentracija komponente u stacionarnoj (cs) i mobilnoj fazi
(cm) ne dostigne konstantnu vrednost, koja se naziva koeficijent
raspodele a izra`en je Nernstovim (Nernst) zakonom raspodele:
cs
K= (1)
cm
Koeficijent raspodele zavisi od osobina faza, afiniteta komponente
prema fazama i temperature.
Razdvajanje supstancija uzrokovano je fizi~kohemijskim proces-
ima kao {to su adsorpcija, razli~ita raspodela (rastvorljivost) sastoja-
ka sme{e izme|u dve te~ne faze i jonska izmena. Prema ovim pro-
cesima hromatografija se deli na:
o adsorpcionu,
o podeonu (particionu) i
o jonoizmenjiva~ku.

Podela hromatografskih metoda mo`e se izvr{iti i na druge na-

~ine koji zavise od postavljenih kriterijuma: agregatnog stanja mo-
bilne i stacionarne faze, na~ina pomeranja faza i tehnike izvo|enja
hromatografije.

Eksperimentalna fizi~ka hemija 239

Adsorpciona Zasniva se na procesima adsorpcije rastvorene supstancije na grani-
hromatografija ci faza ~vrsto/te~no. Kao stacionarna faza koriste se ~vrste supstanci-
u koloni je, koje predstavljaju dobar adsorbens za komponente analizirane
sme{e (slika 1). Naj~e{}e se koriste aluminijum-oksid, silikagel, mag-
nezijum-silikat, magnezijum-oksid, a re|e aktivni ugalj. Dobrim ad-
sorbensima smatraju se supstancije koje su porozne, {to zna~i da
imaju veliku aktivnu povr{inu. Mehanizam adsorpcije se zasniva na
fizi~kim i hemijskim vezama izme|u adsorbensa i adsorbata, {to je
detaljnije obja{njeno u poglavlju »Procesi na granici faza«.
Punjenje kolone vr{i se tako {to se adsorbens u granulama, koje
moraju biti pribli`no istog pre~nika, oslobodi od sopstvenog praha i
suspenduje u rastvara~u koji se kasnije koristi kao mobilna faza.
Suspenzija se polako sipa u kolonu koja je prethodno do jedne tre-
}ine napunjena istim rastvara~em. Slavina na koloni se delimi~no
otvori tako da rastvara~ isti~e u kapima. Time se adsorbens izdvaja
iz suspenzije i sle`e u koloni.
Prema na~inu razdvajanja komponenti iz sme{e razlikuju se
slede}e metode:
o frontalne analize
o istiskivanja
Slika 1. o eluiranja
Adsorpciona hromatografija u koloni

Metoda frontalne analize
Sastoji se u tome da se ispitivana sme{a kontinuirano propu{ta kroz
kolonu. Ako sme{a sadr`i komponente A, B i C sa redosledom koefi-
cijenata raspodele KA > KB > KC, iz kolone prvo izlazi ~ista kompo-
nenta C, jer se najslabije adsorbuje. Zatim izlazi sme{a komponena-
ta B i C i na kraju eluat koji sadr`i komponente A, B i C u istom
odnosu u kome su unete u kolonu. Ovom metodom mo`e se dobiti
samo deo ~iste komponente C, odnosno ona koja se prva izdvaja iz
kolone, pa ova metoda nema ve}i analiti~ki zna~aj.

Metoda istiskivanja
Izvodi se tako {to se mala koli~ina sme{e, koja sadr`i komponente A,
B i C, nanese na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu kontinuirano
propu{ta rastvor komponente D, koja se mnogo ja~e vezuje za ad-
sorbens od komponenata analizirane sme{e. Komponenta D po-
tiskuje komponente sme{e, koje obrazuju zone. Zbog stalnog dejstva
komponente D, komponente sme{e se ne mogu potpuno razdvojiti,
ve} se zone me|usobno dodiruju. Do izlaska iz kolone, sve tri zone
se kre}u istom brzinom, a po{to izme|u njih nema razmaka, metoda
se ne mo`e pouzdano koristiti za razdvajanje u analiti~ke svrhe.

240 Medenica / Male{ev

Ovo je prakti~no jedina metoda koja se koristi za razdvajanje u ana- Metoda eluiranja
liti~ke svrhe, jer se pomo}u nje komponente sme{e potpuno razdva-
jaju. Mala koli~ina analizirane sme{e, koja sadr`i komponente A, B i
C sa redosledom koeficijenata raspodele KA > KB > KC , nanese se na
vrh kolone. Zatim se kroz kolonu vr{i eluiranje, odnosno kontinui-
rano propu{tanje mobilne faze, tzv. eluenta. Ako su razlike u vred-
nostima koeficijenata raspodele dovoljno velike, posti`u se potpuna
razdvajanja, pri ~emu iz kolone prvo izlazi komponenta C, koja se
najslabije vezuje za adsorbens.
Pona{anje razdvojenih komponenata u hromatografskoj koloni
pri procesu eluiranja prikazano je slici 2.
Hromatografska traka komponente se izdvaja u gornjem delu
kolone (slika 2a). Traka je uzana, zbog ~ega je odgovaraju}a koncen-
tracija komponente najve}a. Pod koncentracijom se podrazumeva
koli~ina komponente po jedinici zapremine stacionarne faze. Sa od- Slika 2.
govaraju}eg hromatograma, odnosno krive eluiranja (slika 2b), vi- Hromatografska kolona pri procesu
eluiranja
di se da koncentracija komponente ima maksimalnu vrednost c1 u
sredini trake. U toku eluiranja mobilnom fazom, traka se pomera
nani`e i {iri (slika 2a) dobijaju}i oblik Gausove (Gauss) raspodele.
Istovremeno se smanjuje i koncentracija komponente, ~ija maksi-
malna koncentracija na krivoj eluiranja iznosi c2 (slika 2b). Kada su
radni uslovi dobro izabrani, hromatografske trake imaju simetri~an
oblik. Me|utim, ako je koncentracija komponente ve}a od opti-
malne, dobija se traka s razvu~enim frontom i o{trim krajem, kao
{to se vidi na slici 2c. Da bi se dobile o{trije trake, protok mobilne
faze mora biti sporiji, a ~estice adsorbensa manje.

Pre kvalitativne i kvantitativne analize razdvojenih komponena-

ta, njihove zone se moraju odvojiti jedna od druge rezanjem delova
kolone, koju prethodno treba pa`ljivo izvu}i iz cevi. Komponente se
ekstrahuju iz adsorbensa pogodnim rastvara~em, a potom analizira-
ju fizi~kohemijskim ili hemijskim metodama. Me|utim, razdvajanje
komponenata naj~e{}e se vr{i tako {to se eluiranje nastavi do izlaska
rastvora iz kolone, tzv. eluata. Pomo}u frakcionog kolektora kom-
ponente se sakupljaju u niz frakcija istih zapremina, a potom anali-
ziraju.

Eksperimentalna fizi~ka hemija 241

Podeona (particiona)
hromatografija
Podeona hromatografija
u koloni
Podeona hromatografija
na hartiji i na tankom sloju
242
Zasniva se na raspodeli (razli~itoj rastvorljivosti) supstancija izme-
|u dve te~ne faze koje se me|usobno ne me{aju. Jedna te~nost je sta-
cionarna faza vezana za ~vrst nosa~, a druga je mobilna faza. Pored
procesa koji se zasniva na razli~itoj rastvorljivosti, de{ava se delimi~-
no i proces adsorpcije na ~vrstom nosa~u. Deli se na:
o podeonu hromatografiju u koloni i
o podeonu hromatografiju na hartiji i na tankom sloju.
Koeficijent raspodele u podeonoj hromatografiji naziva se pode-
oni koeficijent α. Karakteristi~an je za sistem u kome postoji kon-
centraciona ravnote`a nekog jedinjenja izme|u dva odre|ena rast-
vara~a, pri konstantnim vrednostima pritiska i temperature.
Kolona se priprema na sli~an na~in kao kod adsorpcione hroma-
tografije, s tim {to je vezana stacionarna faza naj~e{}e voda, a mobil-
na su organski rastvara~i koji se ne me{aju sa vodom.
Za kvalitativnu i kvantitativnu analizu sme{e, kao i u adsorpcio-
noj hromatografiji, uglavnom se koristi metoda eluiranja. Na pri-
mer, sme{a aminokiselina mo`e se analizirati u koloni sa silikagelom
koji je nosa~ stacionarne faze – vode, a mobilnu fazu ~ini neki or-
ganski rastvara~.
Naziva se i hromatografija u »otvorenoj koloni«. Razdvajanje kom-
ponenata vr{i se na hartiji ili plo~ici preko koje je nanet tanak sloj
~vrstog adsorbensa. Protok mobilne faze kroz hartiju ili tanak sloj
ostvaruje se kapilarnim prodiranjem kroz poroznu sredinu. Brzine
kretanja tzv. zona ili mrlja, od kojih svaka predstavlja jednu izdvo-
jenu komponentu, veoma su va`ne za hromatografski proces, jer od
njih zavisi razdvajanje komponenata. Brzina mobilne faze zavisi, pre
svega, od veli~ine pora u hartiji, odnosno pre~nika ~estica ~vrstog
adsorbensa.
Pri horizontalnom protoku rastvara~a (mobilne faze), tj. kada na
molekule rastvara~a deluju samo kapilarne sile, a ne i sila gravitacije,
front rastvara~a pre}i }e rastojanje z:
z = (k . t)1/2 (2)
gde je:
k – konstanta koja zavisi od prirode sistema (povr{inski napon i vis
koznost) i temperature
t – vreme za koje rastvara~ pre|e put z.
Medenica / Male{ev
 Kod uzlazne ili silazne tehnike razdvajanja, gravitaciona sila sma-
njuje, odnosno pove}ava brzinu kretanja rastvara~a, pa tako uti~e i
na pre|eni put fronta z. Da bi se dobilo dobro razdvajanje, potrebno
je uskladiti vrstu tehnike, vrstu hartije ili tankog sloja, sastav mo-
bilne faze, du`inu trake od hartije, du`inu plo~ice sa tankim slojem i
drugo.
Va`na veli~ina u podeonoj hromatografiji je Rf vrednost (reten-
cioni faktor ili faktor zadr`avanja), koja je karakteristi~na za svaku
komponentu u definisanom hromatografskom sistemu i slu`i za
identifikaciju komponente u analiziranoj sme{i. Defini{e se kao od-
nos pre|enog puta komponente (a) i pre|enog puta rastvara~a (b):

a Slika 3.
Rf = (3) Odre|ivanje Rf vrednosti
b
S – start
R – front rastvara~a
Merenje puteva vr{i se od sredi{ta zone nanetog uzorka (anal-
a, b, c – pre|eni putevi komponenata
izirane sme{e), koje se zove startna linija, do sredi{ta zone kompo- A, B i C
nente, odnosno do fronta rastvara~a, kao {to je prikazano na slici 3. d – pre|eni put rastvara~a
Najve}u Rf vrednost ima}e komponenta koja se najbolje rastvara
u organskom rastvara~u (mobilnoj fazi), jer se br`e kre}e od kom-
ponente koja se bolje rastvara u stacionarnoj fazi. Smatra se da su
komponente dobro razdvojene ako je ∆Rf > 0,05.

Izvodi se u staklenoj posudi, odnosno kadi sa poklopcem koji se do- A. Podeona hromatografija
bro zatvara. Time se atmosfera posude odr`ava zasi}enom parama na hartiji
rastvara~a, ~ime se spre~ava njegovo isparavanje sa hartije. [irina
zone izdvojene komponente zavisi od {irine po~etne zone uzorka i
koncentracije uzorka. Pomo}u kalibrisane kapilare ili mikropipete
nanese se rastvor uzorka na nekoliko centimetara od kraja trake od
hartije, koja se nalazi u horizontalnom polo`aju. Uzorak se nanosi u
obliku zone, koja ne treba da ima pre~nik ve}i od 5 mm, ili u obliku
{to tanje crte. Ako je koncentracija uzorka velika, uzorak se pre na-
no{enja razbla`i, a ako je mala, uzorak se nanosi vi{e puta na isto
mesto, s tim {to se pre svakog nano{enja, prethodno naneta zona
mora osu{iti na vazduhu ili u struji ne suvi{e toplog vazduha.
Hartija sa nanetom zonom uzorka mo`e se postaviti u sud tako
da rastvara~ kroz hartiju prolazi horizontalno, nadole ili nagore.
Prema tome, razlikuju se:
o horizontalna (kru`na),
o silazna i
o uzlazna tehnika.

Eksperimentalna fizi~ka hemija 243

 Horizontalna ili kru`na tehnika izvodi se tako {to se hartija kru`nog
oblika stavi u komoru zasi}enu parama mobilne faze i uzorak nane-
se u centar kru`ne hartije. Pre toga se od ivice ka centru kruga ise~e
uzana traka i savije normalno na ravan hartije. Kraj trake se uroni u
rastvara~, koji kroz traku dospeva do centra hartije i radijalno se {iri.
Na taj na~in formiraju se odvojene zone komponenti sme{e u obliku
koncentri~nih krugova (slika 4).

Slika 4.
Kru`na tehnika

Slika 5.
Silazna tehnika (shematski prikaz)
Silazna tehnika izvodi se tako {to se kraj trake na koji je naneta sme{a
pri~vrsti staklenim {tapi}em za dno rezervoara sa rastvara~em, koji
se nalazi na vrhu posude (slika 5). Protok rastvara~a kroz hartiju
ostvaruje se pomo}u kapilarnog pritiska, dok front rastvara~a ne
pre|e zid rezervoara. Dalje se rastvara~ kre}e i pod uticajem sile
gravitacije, pomeraju}i zonu uzorka, koji je nanet izvan rezervoara,
nani`e. Ova tehnika se koristi za razdvajanje komponenata koje
imaju male ili vrlo bliske Rf vrednosti. Rastojanje koje prelazi front
rastvara~a reguli{e se du`inom hartije i visinom posude.

Uzlazna tehnika se najvi{e koristi, a izbegava se samo kad su Rf vred-

Slika 6.
Uzlazna tehnika (shematski prikaz)
nosti komponenata suvi{e bliske. Ovde se rastvara~ sipa na dno su-
da, a hartija postavi tako da donji deo hartije bude, u du`ini od 0,5
do 1 cm, potopljen u rastvara~ (slika 6). Mesto nano{enja uzorka
mora biti dovoljno udaljeno (nekoliko cm) od donjeg kraja i mora
biti iznad nivoa rastvara~a, u kome bi se ina~e uzorak rastvorio.
Po{to rastvara~ kod ove tehnike prodire kroz hartiju pod dejstvom
kapilarnih sila, zbog suprotnog dejstva gravitacije dolazi do zaus-
tavljanja protoka rastvara~a na odre|enoj visini.

244 Medenica / Male{ev

Dvodimenzionalna tehnika je poseban vid tehnike i koristi se kod
supstancija sa bliskim Rf vrednostima. Kad se zavr{i razdvajanje si-
laznom tehnikom, traka se osu{i, okrene za 90° i protok rastvara~a,
naj~e{}e nekog drugog, usmeri normalno na pravac kretanja prvog
rastvara~a (slika 7). Na taj na~in razdvajaju se komponente koje se
nisu prvobitno razdvojile. Da bi dvodimenzionalno razdvajanje us-
pelo, potrebno je da prethodni rastvara~ potpuno ispari ili da bude
hemijski inertan u odnosu na drugi rastvara~.

Razvijanje hromatograma podrazumeva proces razdvajanja kom- Slika 7.

ponenata na hromatografskoj hartiji. Proces je zavr{en kad front Dvodimenzionalna tehnika
rastvara~a do|e do unapred odre|ene du`ine ili kad pro|e prethod-
no izmereno vreme razdvajanja komponenata. Olovkom se zabele`i
front rastvara~a, a zatim se hartija osu{i na vazduhu ili u struji toplog
vazduha, koja se propu{ta paralelno sa pravcem prostiranja trake.

Odre|ivanje polo`aja zona podrazumeva primenu hemijskih ili fi-

zi~kih procesa da bi se zone hromatograma u~inile vidljivim. Fluo-
rescentne supstancije otkrivaju se pomo}u UV lampe, a polo`aj zona
radioaktivnih supstancija odre|uje se ure|ajem za merenje radio-
aktivnosti. U drugim slu~ajevima se, za detekciju zona, naj~e{}e ko-
risti hemijska metoda koja se sastoji u tome da se osu{ena traka prska
odgovaraju}im rastvorom koji hemijski reaguje sa zonama, daju}i
obojena jedinjenja.

Eksperimentalna fizi~ka hemija 245

 Kvalitativna analiza komponenata izvodi se odre|ivanjem Rf vred-
nosti i njihovim pore|enjem sa tabli~nim. Ovaj na~in nije dovoljno
pouzdan, jer Rf vrednost zavisi od vi{e faktora, kao {to su priroda
komponenti, sastav mobilne faze, temperatura, vrsta hartije i dr. Za-
to se pri publikovanju Rf vrednosti moraju definisati i uslovi pod
kojima su one odre|ene. Pouzdaniji na~in identifikacije sastoji se u
tome da se ise~e deo hartije sa zonom nepoznate supstancije i izvr{i
ekstrakcija zone pogodnim rastvara~em. Dobijeni rastvor mo`e se
ispitati hemijskim, fizi~kohemijskim metodama ili hromatografski,
pore|enjem sa hromatogramima referentnih supstancija.

Kvantitativna analiza komponenata mo`e se izvr{iti na dva na~ina:

direktnim odre|ivanjem koli~ine supstancije u zoni ili ekstrakcijom
supstancije iz zone pogodnim rastvara~em. Supstancije se odre|uju
u izdvojenim zonama direktno na hartiji (in situ) spektrofotometri-
jskim metodama, uglavnom na osnovu reflektovane svetlosti. Drugi
na~in se odnosi na hemijsko i fizi~kohemijsko odre|ivanje koli~ine
supstancije u rastvoru dobijenog ekstrakta.

B. Podeona hromatografija Izvodi se istim tehnikama kao i hromatografija na hartiji: horizon-

na tankom sloju talnom, silaznom i uzlaznom. Aparatura za razvijanje hromatograf-
skih plo~a prikazana je na slici 8.

Slika 8.
Komore za razvijanje hromatografskih
plo~a (shematski prikaz)
(a – silazna; b – uzlazna; c – horizon-
talna tehnika)
Da bi se dobila ravnomerna zasi}enost parom u svim delovima
komore, unutra{nji zidovi se obla`u filtar-hartijom natopljenom
rastvara~em, koji slu`i kao mobilna faza.

246 Medenica / Male{ev

 Izbor adsorbensa zavisi od prirode supstancija koje se razdvaja-
ju. Silikagel se koristi u analizi aminokiselina, alkaloida, {e}era, mas-
nih kiselina, lipida, neorganskih katjona i anjona. Aluminijum-oksid
se koristi kod razdvajanja aminokiselina, alkaloida, fenola, steroida,
boja u `ivotnim namirnicama. Celulozni prah se koristi kod amino-
kiselina, alkaloida, nukleotida, boja u `ivotnim namirnicama, a
magnezijum-oksid kod ugljovodonika. Pored ovih, koriste se i ko-
mercijalne plo~e sa tankim slojem koje sadr`e specifi~ne aditive.
Priprema tankog sloja. Sloj adsorbensa na plo~i, koja je naj~e{}e
od stakla, mora biti odre|ene i ujedna~ene debljine. Samo u tom slu-
~aju dobijaju se reproduktivne Rf vrednosti za kvalitativnu analizu.
Nano{enje tankog sloja adsorbensa vr{i se pomo}u specijalnog
ure|aja po [talu (Stahl). U nedostatku ovog ure|aja, tanak sloj se
mo`e naneti i ru~no. Posle nano{enja sloja, plo~ica se su{i oko 10
minuta na vazduhu, a zatim oko 30 minuta u su{nici na temperaturi
od 100°C. Ako se za pripremu suspenzije ne koristi voda ve} organ-
ski rastvara~, plo~e se su{e na temperaturi manjoj od 100°C.

Nano{enje uzorka izvodi se na taj na~in {to se mala koli~ina ana-

lizirane sme{e nanese na 1,5–2 cm od kraja plo~e, tako da obrazuje
vla`nu zonu pre~nika 2–5 mm. Rastvor se nanosi mikropipetom ili
kalibrisanom kapilarom. Vrh pipete se primakne povr{ini sloja, tako
da formirana kap dodirne sloj i pre|e na njega, bez kontakta pipete
sa tankim slojem. U slu~aju o{te}enja sloja pipetom do{lo bi do
poreme}aja protoka rastvara~a, {to bi izazvalo deformisanje zona i
onemogu}ilo pravilno razdvajanje supstancija bliskih Rf vrednosti.
Pre razvijanja hromatograma, naneta zona uzorka mora biti suva.

Razvijanje hromatograma na tankom sloju sli~no je opisanom

postupku razvijanja na hartiji, a izvodi se u komorama koje su pri-
kazane na slici 7. Da bi se pove}ala efikasnost razdvajanja supstanci-
ja, plo~a se mo`e razvijati:
a) vi{e puta u istom pravcu sa istim rastvara~em;
b) sa dva rastvara~a u istom ili u dva pravca (dvodimenzionalna
hromatografska tehnika);
c) uz stalnu promenu rastvara~a.
Ovaj poslednji postupak primenjuje se za razdvajanje jedinjenja
koja se znatno razlikuju po svojim osobinama.
Odre|ivanje polo`aja zona vr{i se istim metodama kao kod hro-
matografije na hartiji.

Eksperimentalna fizi~ka hemija 247

 Kvalitativna analiza razdvojenih komponenti, odnosno identi-
fikacija, mo`e se izvr{iti odre|ivanjem Rf vrednosti, ali je ova meto-
da jo{ manje pouzdana od one kod hromatografije na hartiji. Uzrok
le`i u dodatnim faktorima koji uti~u na kretanje zona, kao {to su
priroda, aktivnost i debljina sloja adsorbensa, kao i zasi}enost at-
mosfere komore parama rastvara~a. Ako se supstancija ne mo`e sa
sigurno{}u identifikovati pomo}u Rf vrednosti ili bojenim reakcija-
ma, sloj adsorbensa sa zonom supstancije pa`ljivo se skine sa plo~e,
zona se ekstrahuje pogodnim rastvara~em i odre|uje nekom od
fizi~kohemijskih metoda.
Kvantitativna analiza se mo`e vr{iti direktno na plo~i spektrofo-
tometrijskim metodama, uglavnom na osnovu merenja intenziteta
reflektovane svetlosti, pod uslovom da su zone obojene, da fluoresci-
raju ili reaguju sa pogodnim reagensom, daju}i obojeno jedinjenje.
Ako se zona skida zajedno sa slojem adsorbensa, onda se analiza vr{i
nekom klasi~nom kvantitativnom metodom.

Hromatografija na hartiji i na tankom sloju ima veliku primenu

u istra`iva~kim i rutinskim odre|ivanjima. Sa razvojem hromato-
grafije na tankom sloju, kao i gasne, odnosno te~ne hromatografije,
smanjena je primena hromatografije na hartiji. Tankoslojna hro-
matografija na{la je {iroku primenu u farmaciji. U ispitivanju i kon-
troli lekova primenjuje se kako u analizi polaznih sirovina, tako i
me|uproizvoda i finalnih proizvoda. Tako|e se koristi i u pra}enju
stabilnosti lekova, zatim za odvajanje i odre|ivanje aktivnih princi-
pa lekova i njihovih degradacionih proizvoda. Ova metoda se mo`e
primeniti i na lek i na biolo{ki materijal. U biohemijskim i farmako-
lo{kim ispitivanjima primenjuje se za odre|ivanje metabolita lekova
u telesnim te~nostima. U analizi `ivotnih namirnica koristi se za
odre|ivanje npr. ostataka pesticida, za odvajanje i identifikaciju
aminokiselina ili za odre|ivanje boja koje se koriste kao aditivi. U
toksikolo{kim analizama koristi se za odre|ivanje npr. insekticida u
razli~itim materijalima.
Ovde su pomenuti samo neki karakteristi~ni primeri primene
tankoslojne hromatografije u farmaciji.

248 Medenica / Male{ev

Zasniva se na razlikama u afinitetu jonskih vrsta u rastvoru prema Jonoizmenjiva~ka
izmeni sa jonima aktivnih grupa koje poseduju neki adsorbensi. hromatografija
Takvi adsorbensi mogu biti neorganskog i organskog porekla, sin-
teti~ki i prirodni. Prema tome da li u aktivnim grupama sadr`e mo-
bilne katjone ili anjone, dele se na katjonske i anjonske izmenji-
va~e. Primena jonskih izmenjiva~a u analiti~ke svrhe je razli~ita:
razdvajanje elemenata sli~nog hemijskog pona{anja (npr. lantanida i
aktinida), odvajanje jonskih od nejonskih vrsta, razdvajanje jona,
razdvajanje katjona od anjona, koncentrisanje jona metala iz vrlo
razbla`enih rastvora i odre|ivanje koncentracije.
U praksi se, uglavnom, koriste visokopolimerne smole koje sa-
dr`e aktivne kiselinske ili bazne grupe, ~iji se joni izmenjuju sa joni-
ma iz rastvora. Katjonski izmenjiva~i sadr`e kiselinske grupe, kao
{to su –SO3H i –COOH, a anjonski izmenjiva~i sadr`e bazne grupe,
kao {to su –OH ili amino grupe –NH2, –NHR i –NR2. Mehanizam
izmene katjona izme|u katjonskog izmenjiva~a i analiziranog rast-
vora, npr. NaCl, zasniva se na ravnote`noj reakciji:

R–SO3H + NaCl  R–SO3Na + HCl

a mehanizam izmene anjona izme|u anjonskog izmenjiva~a i rast-

vora NaCl:

R–OH + NaCl  R–Cl + NaOH

Jonoizmenjiva~ka hromatografija se naj~e{}e izvodi u koloni, ko-

ja se mo`e puniti raznim vrstama organskih katjonskih i anjonskih
izmenjiva~kih smola (slika 9). Suspenzija izmenjiva~a u vodi sipa se
u kolonu koja je delimi~no napunjena vodom, pri ~emu treba paziti
da u kolonu ne u|e vazduh. Na kraju se ispusti vi{ak vode, ali tako
da iznad smole uvek mora postojati sloj te~nosti, bez obzira da li je
kolona u pripremi ili je u toku jonska izmena.
Slika 9.
Pri prvom kori{}enju izmenjiva~i nisu dovoljno ~isti za anali- Kolona sa smolom
ti~ke svrhe, pa ih je potrebno pre~istiti. Katjonski izmenjiva~i se vi{e
puta naizmeni~no ispiraju sa: 2 mol L–1 HCl, destilovanom vodom,
2 mol L–1 NaCl i ponovo destilovanom vodom. Ako je potreban iz-
menjiva~ u H–obliku, poslednje ispiranje se vr{i kiselinom, a kad se
`eli Na–oblik, poslednji se propu{ta NaCl. Na kraju se izmenjiva~
ispira destilovanom vodom do negativne reakcije na odgovaraju}i
jon (H+ ili Na+). Anjonski izmenjiva~i se naizmeni~no ispiraju sa:
2 mol L–1 NaCl, destilovanom vodom, 2 mol L–1 NaOH i ponovo

Eksperimentalna fizi~ka hemija 249

 destilovanom vodom. Ako je izmenjiva~ potreban u OH–obliku, po-
slednje ispiranje vr{i se sa NaOH, a kad se `eli u obliku soli, npr. hlo-
ridne, poslednji se propu{ta NaCl. Na kraju se izmenjiva~ ispira des-
tilovanom vodom do negativne reakcije na OH– ili Cl– jon.
Jonskom izmenjiva~u se, pre upotrebe, mora odrediti kapacitet,
koji se defini{e kao koli~ina jednovalentnog jona u milimolovima
koju mo`e da razmeni jedan gram suvog izmenjiva~a. Kapacitet ve-
}ine katjonskih i anjonskih izmenjiva~a koji se danas koriste iznosi
oko 4 mmol g–1 H+ jona, odnosno 4 mmol g–1 OH– jona. Poznavan-
je kapaciteta je neophodno u kvantitativnoj jonoizmenjiva~koj hro-
matografiji, jer se mora voditi ra~una o odnosu izme|u broja molo-
va propu{tenog analiziranog jona i broja grama smole u koloni. Ako
je ovaj odnos ve}i od kapaciteta smole, jedan deo analiziranih jona
ne}e biti izmenjen i pre}i }e u eluat. Po{to se koncentracija ispitiva-
nih jona odre|uje posredno, preko koncentracije jona koji su iz
smole putem izmene dospeli u eluat, rezultat za koncentraciju ispiti-
vanih jona, u ovom slu~aju, bi}e smanjen.
Kapacitet (npr. katjonske) smole odre|uje se na slede}i na~in:
odmeri se 0,5 g katjonske smole i prenese u erlenmajer od 250 mL.
Doda se 50 mL vode i 3 g natrijum-hlorida, ~ija koli~ina prevazilazi
kapacitet odmerene smole. Time je postignuto da svi aktivni joni u
smoli u~estvuju u izmeni. Sme{a se mu}ka nekoliko minuta da se
kvantitativno izvr{i izmena jona, doda 2–3 kapi fenolftaleina i titru-
je sa 0,1 mol L–1 rastvorom NaOH.
Kapacitet C jonskog izmenjiva~a izra~unava se iz izraza:
V.c
C= (4)
m
gde je:
V – zapremina utro{enog titranta
c – molarna koncentracija titranta
m – odmerena masa smole.

Kvalitativna analiza jonskih vrsta u sme{i bi}e uspe{na ako se

eluent izabere tako da razlika izme|u koeficijenata raspodele jona
koji se razdvajaju bude dovoljno velika. I kod kvalitativne i kvantita-
tivne analize mora se voditi ra~una da uzorak ne sme biti jako kiseo
kada se analizira u katjonskom izmenjiva~u niti jako bazan kad se
tretira anjonskim izmenjiva~em. Jake kiseline i jake baze sadr`e ve-
liku koncentraciju H+ i OH– jona, koji smanjuju kapacitet smole, a
time i mogu}nost izmene jona.

250 Medenica / Male{ev

 Razdvajanje jona u koloni vr{i se na osnovu afiniteta odre|enih
jona prema smoli. Afinitet zavisi od vi{e faktora. U vodenim rastvo-
rima afinitet prema smoli raste sa pove}anjem naelektrisanja jona.
Ako razli~ite jonske vrste imaju jednaka naelektrisanja, ve}i afinitet
prema smoli ima jon manjeg radijusa.
Kvalitativna analiza se naj~e{}e vr{i metodom eluiranja. Ako se
na vrh kolone sa anjonskom smolom sipa odre|ena zapremina anali-
zirane sme{e kiselina, a zatim vr{i eluiranje vodom, u gornjem delu
kolone do}i }e do izmene anjona smole sa anjonom ja~e kiseline,
prema kojoj smola ima najve}i afinitet. Zatim }e se izmeniti slabija
kiselina, pa ostale. Na ovaj na~in posti`e se razdvajanje kiselina u an-
jonskim i baza u katjonskim izmenjiva~ima, ~ija razlika u pK vred-
nostima mo`e biti manja od 0,05 jedinica.

Kvantitativna analiza se vr{i tako {to se odre|ena zapremina

analiziranog rastvora sipa na vrh kolone, a zatim vr{i sporo eluiranje
vodom da bi se izvr{ila kvantitativna izmena jona. Ako se u katjon-
skom izmenjiva~u odre|uje koncentracija rastvora NaCl, u eluatu }e
se, prema prikazanoj reakciji izmene katjona, na}i ekvivalentna koli-
~ina HCl. Eluiranje vodom vr{i se do neutralne reakcije, {to se pro-
verava lakmus-trakom. Eluat sa HCl, sakupljen u erlenmajeru, titruje
se rastvorom NaOH poznate koncentracije uz metiloran` kao indi-
katorom. Iz utro{ene zapremine NaOH i poznate zapremine anali-
ziranog NaCl, izra~unava se koncentracija NaCl, prema izrazu:

MNaOH .VNaOH
MNaCl = (5)
VNaCl
gde je:
M – koncentracija u mol L–1
V – zapremina rastvora.

U slu~aju da se rastvor NaCl propu{ta kroz anjonski izmenjiva~,

u eluatu }e biti NaOH, a kao titrant koristi}e se rastvor HCl poznate
koncentracije.
Upotrebljene smole mogu se regenerisati i vi{e stotina puta, a da
ne do|e do smanjenja kapaciteta. Regenerisanje katjonskih smola
vr{i se sa 2 mol L–1 hloridnom kiselinom, a anjonskih sa 2 mol L–1
natrijum-hidroksidom, da bi se aktivne grupe ponovo zasitile aktiv-
nim jonima. Eluiranje pomo}u kiseline, odnosno baze izvodi se vi{e
puta, a zatim se ispira destilovanom vodom do neutralne reakcije.

Eksperimentalna fizi~ka hemija 251

 Jedna od najva`nijih primena smola za izmenu jona je pre~i{}a-
vanje vode tzv. »hladnim postupkom« bez destilacije. Tako se dobija
dejonizovana voda koja je ~esto boljeg kvaliteta nego ona dobijena
klasi~nom destilacijom. Postupak se sastoji u propu{tanju vode prvo
kroz jak katjonski, zatim kroz jak anjonski izmenjiva~ i na kraju kroz
kolonu sa sme{om anjonskog i katjonskog izmenjiva~a. Jonski iz-
menjiva~i se veoma uspe{no koriste i za pre~i{}avanje radioaktivnih
voda.
Pomo}u katjonskih izmenjiva~a razdvajaju se aminokiseline,
masne kiseline, kiseline od baza, koje su rastvorne u vodi. Anjonski
izmenjiva~i se koriste za razdvajanje alkaloida, hlorofenola, hemo-
globina, aldehida, ketona, organskih kiselina male molarne mase i
drugo.

252 Medenica / Male{ev

 URADITE SAMOSTALNO ...

Zadatak eksperimenta Adsorpciona

hromatografija
n Kvalitativna analiza katjona u sme{i. u koloni

Pribor i hemikalije
l Staklene cev~ice
l Aluminijum-oksid
l Stakleni levak

l Analizirana sme{a katjona

Postupak
U dve staklene cev~ice, prethodno zatvorene na jednom kraju va-
tom, preko staklenog levka sipati aluminijum-oksid do oko 1 cm od
otvora cevi.
Pipetom ukapati po desetak kapi analiziranog rastvora u obe
cev~ice, tako da se uo~avaju dva sloja adsorbovane dvokomponent-
ne analizirane sme{e. Uporediti boje slojeva sa datim uzorcima na
hromatogramu, i na osnovu toga pretpostaviti prisustvo odre|enih
katjona u sme{i. Zatim u jednu cev ukapati rastvor natrijum-hidro-
ksida, a u drugu kalijum-heksacijanoferata. Pore|enjem boja slojeva
nastalih reakcijom katjona i dodatih reagenasa, sa datim uzorcima
na hromatogramu, dokazati prisutne katjone i napisati reakcije
identifikacije.

Eksperimentalna fizi~ka hemija 253

 URADITE SAMOSTALNO...

Podeona Zadatak eksperimenta

hromatografija na
tankom sloju n Podeonom hromatografijom razdvojiti komponente iz
analizirane sme{e i izra~unati njihove Rf vrednosti.
Grafi~ki prikazati dobijeni hromatogram.

Pribor i hemikalije
l Komora za hromatografiju (slika 8)
l Plo~ica sa tankim slojem od silikagela
l Sme{a organskih rastvara~a (mobilna faza)

l Analizirana sme{a za razdvajanje

Priprema
Komoru za hromatografiju pripremiti kao {to je prikazano na slici 8.
Zidove komore oblo`iti filtar-hartijom natopljenom mobilnom fa-
zom, da bi atmosfera komore bila ravnomerno zasi}ena parama
rastvara~a. U komoru zatim sipati rastvara~ (mobilna faza) tako da
pokrije dno i poklopiti komoru.

Postupak
Na jedan kraj plo~ice sa tankim slojem od silikagela naneti jednu
kap sme{e i centar dobijene mrlje ozna~iti kao start. Plo~icu postavi-
ti u komoru tako da se mrlja nalazi nekoliko milimetara iznad nivoa
rastvara~a. Kada rastvara~ do|e skoro do kraja plo~ice, izvaditi plo-
~icu iz komore i obele`iti front rastvara~a. Na osu{enoj plo~ici obe-
le`iti centre mrlja koje su se razdvojile i izra~unati njihove Rf vred-
nosti.
Grafi~ki prikazati dobijeni hromatogram na tankom sloju.

254 Medenica / Male{ev

 URADITE SAMOSTALNO ...

Zadatak eksperimenta Jonoizmenjiva~ka

hromatografija
n Regenerisati smolu.
n Odrediti kapacitet smole.
n Odrediti koncentraciju rastvora natrijum-hlorida.

Aparatura i hemikalije
l Kolona sa katjonskom smolom Dowex-50 (slika 9)
l Hloridna kiselina

l Natrijum-hlorid

l Natrijum-hidroksid

l Destilovana voda

l Metiloran`

Priprema
a) Punjenje kolone
Kolonu sa smolom pripremiti kao {to je prikazano na slici 9. Dno
kolone zatvoriti sinterovanom plo~icom ili staklenom vunom, a za-
tim napuniti kolonu smolom. Kolona se priprema tako {to se vode-
na suspenzija smole uliva u kolonu, pri ~emu treba voditi ra~una da
u koloni ne ostanu mehuri}i vazduha. Smolu treba prethodno os-
taviti neko vreme da bubri u vodi. Vrh kolone u~vrstiti sa malo stak-
lene vune. Iznad smole uvek mora postojati sloj te~nosti.
b) Regenerisanje smole
Kroz kolonu sa katjonskim izmenjiva~em propustiti rastvor hlorid-
ne kiseline, a zatim ispirati destilovanom vodom do neutralne reak-
cije, koja se proverava lakmus-trakom.

Eksperimentalna fizi~ka hemija 255

 Postupak
a) Odre|ivanje kapaciteta smole
Kapacitet smole odre|uje se na slede}i na~in: odmeriti 0,5 g kat-
jonske smole Dowex-50 u H+ obliku i preneti u erlenmajer od 250
mL. Dodati 50 mL vode, 3 g natrijum-hlorida, a zatim sme{u mu}-
kati nekoliko minuta. Dodati 2–3 kapi fenolftaleina i titrovati sa 0,1
mol L–1 rastvorom natrijum-hidroksida.
Kapacitet jonskog izmenjiva~a (C) izra~unava se iz izraza (4).
b) Odre|ivanje koncentracije rastvora natrijum-hlorida
Odre|enu zapreminu analiziranog rastvora natrijum-hlorida (o ko-
joj se mora voditi ra~una zbog kapaciteta smole) propustiti kroz
jonsku smolu, a zatim ispirati destilovanom vodom do neutralne re-
akcije. Eluat, sakupljen u erlenmajeru, titrovati rastvorom natrijum-
hidroksida poznate koncentracije uz indikator metiloran`. Iz utro-
{ene zapremine titranta izra~unati koncentraciju hloridne kiseline u
eluatu, odnosno koncentraciju analiziranog natrijum-hlorida.

256 Medenica / Male{ev

Tabela 1. REZULTATI
Odre|ivanje kapaciteta smole (C) i koncentracije (c)
rastvora natrijum-hlorida

C smole (mmol g–1) V NaCl (mL) c NaOH (mol L–1) V NaOH (mL) c NaCl (mol L–1)

Eksperimentalna fizi~ka hemija 257