Not cnesa aries ISSN 0216 - 1540 JURNAL ILMIAH SAINS & TEKNOLOGI tease OM ANON eS SKRINING TRANSFORMAS! GENETIK TANAMAN TEBU (Saccharum spp. hybrids) Da Ner ios iE ras O Una ‘Mariana Wabjodi, Lucfia Lukman Alsudric, Roch Chrisnasari ISOLASI BAKTERI DARI TANAH GUNUNG KAPUR DAN PENGUJIAN AKTIVITAS. Pai auat i eeu mie nen OCgi ist rae ool Pech eeu Ae OSL t UPAYA PEMBENTUKAN TUNAS ADVENTIF DARI DAUN PHALERIA MACROCAREA (SCHEFF) BOERL. cea EVALUASI AWAL BUDIDAVA KAKAR PUTIH (Lates calcarifes) PAWNS Sai SIGUE KES baw cael ‘Ruth Chrisnasari, Wandy Yuwono, Monika Selvira Puspitasari, Tjandra Panejajani OPTIMASI PEMODELAN KONSENTRASI GLUKOAMILASE DAN AMONIUM. SULFAT PADA PRODUKSI BIOETANOL DARI ONGGOK DENGAN METODE SEPARATE HYDROLYSIS FERMENTATION (SHE) DAN SIMULTANEOUS too nie ule miata) Theresia Desy Askitosari PRODUKSI NEMATODA PATOGEN ages SKALA LABORATORIUM HASIL i FOES) NU MeN ca eee “Mangihot Tua Goeltom, Tie Kok, Dian Kumakisari INDUKSI KULTUR KALUS DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAUN. P\Nero ta a oy vih het conn ea) OAR Um et Fea Ne enti ia) asad bye assess Pee asta METODE SPEKTROSKOP! LIV.VISIBLE cS COR men Me R eee Hr!: JURNAL ILMIAH SAINS & TEKNOLOGI ISSN 02161540 ‘Terbit dua kali setahun pecta balan Juni dan Desember, Berisitulisan yang berssal dari has peneliiany, kkajian atau karyailmiah di bidang Sains dan Teknologi Ketua Penyunting Kena Lembaga Penelian dan Pergabdlian Kepads Masyarakat Penyunting Pebaksana Benny Lianto Nani Partai StafPelalsana Tang Hamid, Had Krsbiyanto, Sukono Penesbit Lembaga Peneliian dan Pergabdian Kepada Masyarakat ‘Universitas Surabaya Alamat Penerbit/Redalsi Gedung Perpustakaan Lt1V, Universitas Surabaya Jalan Raya Kalirurgkut, Surabaya, 60293 Telp. (031) 2981360, 2981365 Fax. (031) 2981373 Website: hp//Ippmubuyaacid Enmail:lppm@ubayaacid Jornal Ilmiah Sains dan Telenologi pemah terbit dengan nama Unitas (pertama kali terbitahun 1992) oleh Lembaga Penelitian Universitas Surabaya Ibid haar eonggung jab Percetakan,JURNAL ILMIAH SAINS & TEKNOLOGI ISSN 02161540 ‘Volume 7 Nomor 2, Juni 2014 Halaman -71 Popy Hactatie Hardjo, Win Darmanto, Bambang Sugihasto SKRINING TRANSFORMASI GENETIK TANAMAN TEBU (Svccharum spp. hybrids) DENGAN PERANTARA Agrobacterium rumeficiens ub 16) Mariana Wabjudi, Lutfia Lukman Algadrie, Ruth Chrisnasari ISOLAS! BAKTERI DARI TANAH GUNUNG KAPUR DAN PENGUJIAN AKTIVITAS. ANTIBAKTERI ISOLAT TERHADAP BAKTERI Escherichia coli DAN Staphylococeus aureus ek 217) Wina Dian Savieei UPAYA PEMBENTUKAN TUNAS ADVENTIF DARI DAUN PHALERIA MACROCARPA (SCHEFF) BOERL Gul 1830), Ernest Suryadiaia EVALUASI AWAL BUDIDAYA KAKAP PUTIH (Lates calearin) PADA SISTEM RESIRKULASI (RAS) SKALA KECIL (hal 3135) 7 Ruth Chrisnasari, Wandy Yuwono, Monika Selvita Puspicasari, Tjanclra Pansjajani OPTIMASI PEMODELAN KONSENTRASI GLUKOAMILASE DAN AMONIUM SULFAT PADA PRODUKSI BIOETANOL DARI ONGGOK DENGAN METODE SEPARATE HYDROLYSIS: FERMENTATION (SH}) DAN SIMULTANEOUS SACCHARIFICA TION FERMENTATION (SSP) (ba 3645) Theresia Desy Askirosari PRODUKSI NEMATODA PATOGEN SERANGGA SKALA LABORATORIUM HASIL ISOLASI SAMPEL TANAH TRAWAS, MOJOKERTO al4650) Mangihot Tua Goeltom, Tjie Kok, Dian Kumalasari INDUKSI KULTUR KALUS DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EXSTRAK DAUN ANGGREK MERPATI (Dendrobium crumenacum Swartz) (bab 5263) Maria Goretti M. Purwanto PERBANDINGAN ANALISA KADAR PROTEIN TERLARUT DENGAN BERBAGAI METODE SPEKTROSKOPI UV-VISIBLE (ab 6471) Sains & Teknologi VoLTNo2 Juni 2014 Hal-71 ISSN 02161540PERBANDINGAN ANALISA KADAR PROTEIN TERLARUT DENGAN BERBAGAI METODE SPEKTROSKOPI UV-VISIBLE Maria Goretti M. Purwanto Fakultas Teknobiologi, Universitas Surabaya Email: maria_gmp@staff.ubaya.ac.id Abstract ‘One need to choose the right method to determine concentration of total dissolved protein in any particular condition ot application, Here we report the analysis and comparison between several methods used in determination of dissolved protein, ic. 280 nm direct absorbance method, Biuret Assay, Lowry Assay, Bradford Assay and ako BCA Asay. The efft of contaminants present in the sample, such as ammonium sulphate and soxlium dodecisulphare, tothe protein. determination was aso studied. Each particular method showed it own characteristics regarding sensitivity and suscepabiliy to the presence of certain contaminant. For general application, Bradford Assay might obviously be the frst choice of method, duc o the procedures simplicity. $0 far, Bradford Asay has been also proven to be a fas, sensitive, selective and stable method in the presence of ammonium sulphate and SDS in che sample. ‘The best finearity was also found in the Brdaford Assay. Keywords: dissolved protein concentration, UV-Visible spectroscopy. PENDAHULUAN Lowry, metode Bradford dan metode BCA dalam menentukan kadar protein erlatur Seringkali kita para ilmuwan dan, * lalam sampe Selain itu dipelajari ra Ting gered blag Brsktsig CC een een eesti tae nee pene dihadapkan pada pilihanatas berbagai metode ketika ingin melakukan pengukuran kadar protein terlarut, Metode spektroskopi sejauh dipakai dan dirasa_ paling memadai serta praktis. Dalam —literatur kita sering pengaruh adanya amonium sulfac dan surfaktan sebagai _pengotor terhadap hasil pembacaan, Proteins secara umum memiliki serapan merupakan metode yang umum, maksimal pada 214nm karena adanya ikatan peptida. Namun daerah ini banyak terganggu ‘oleh adanya wap air dari udara sehingga pada menemukan beberapa pernyataan _terkait i Le en ee eset eee -iLctaca- seinen prakteknya sulit dilakukan, Asam amino ‘Tyrosine (Tyc/Y), Tryptophan (Tep/W), and Phenylalanine (Phe/F) memiliki absorbansi pada sekitar 280 nm karena adanya cincin aromatic dalam —strukturnya. Warburg: metode dalam menentukan kadar protein terlarut dalam sampel tertentu, Namun data data nyata yang mencerminkan kinerja masingamasing metode yang tersedia tidaklah mudah ditemukan, Tulisan ini bercujuan see Method enue eee berikut untuk menghicung kadar protein, uneuk menyumbangkan datadata yang bisa Sele ene eee dijadikan pijakan bagi pihakpihak yang membutuhkan, sehingga mereka dapat khususnya dengan mempertimbangkan Kesalahan yang mungkin timbul kerena serapan asam nukleat yang secara maksimal memutuskan metode mana yang akan dipilil aaa ee een terjadi pada 260 nm. pada keadaan tertentu, Metode yang akan dibandingkan adalah metode pembacaan fet, metode absorbansi Iangsung, metode BiPersamaan Groves 1,55Azz9 ~ 0.76Ax0 [protein] (mg/mL)~ Secara kolorimetri , protein dapat diretapkan kadamnya dengan metode biuret. Prinsipnya. adalah bahwa — ikatan—peptida membencuk kompleks dapat senyawa herwarna tungu dengan penambahan garam kupri dalam, suasana basa (Carprette, 2005), biuret terdiri dari campuran protein dengan hidroksida (berupa larutan) dan tembaga sulfat. Wana violet adalah hasil dari reaksi ini, Reaksi ini positif untuk 2 atau lebih, Pereaksi sodium ikatan peptida (Harrow, 1954). Spektrum absorbansisuatu larutan protein berfariasi tergantung pada pH dan sesuai dengan susunan residuasam amino (Montgomery, 1993). Kerugian dari metode ini adalah hasil pembacaan tidak murni menunjukkan kadar protein saja kadar senyawa yang mengandung benzena, gugus fenol, gugus sulthidrin, ikut terbaca kadarnya, Selain itu, waktupelaksanaan yang lama saja, melainkan bisa sering kali dirasa kurang efisien (Lehninger, 1982), Copper on reduced a me lection released Gambar 1. Reaksi pada Metode Biuret Metode Lowry merupakan pengembangen dari_metode Biuret. Reaksiyang_terlibat adalah —kompleks — Cu(i}protein akan. terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(ll) akan teredukst menjadi Cu(l), lon Cu" kemudian akan mereduksi reagen Folin-Cigcalteu, kompleks phosphomolibylatphosphotungstat (phosphomolybdotungstate), hetero-polymolybdenum blue akibar reaksi ooksicasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna menghasilkan step 1) oF ‘Step 2) biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada -kandungan —residu tryptophan dan tyrosinenya, Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret schingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas dereksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL, Namun metode Lowry lebih, banyak incerferensinya —akibat—_kesensitifannya (Sudarmanto 2008) on Ww + Folin Cioeaiteu Gambar 2. Reaksi pada Metode Lowry 65Selain menggunakan metodemetode i atas, pengukuran kadar protein juga dapat dilakukan dengan metode Bradford. Metode Bradford merupakan metode pengukuran onsentrasi protein. total, yang melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue faslsandArovaic Mt ‘ie Chas owe =505 00 (CBB). CBB akan berikatan dengan protein pada sampel Tarutan dalam suasana_asam. Dengan demikian, absorbansinya protein dapar diukur menggunakan spektrofotometri pada panjang —gelombang 465-595 nm. (Caprette, 2005), OQ coomsrse 6250 4650 Prter-ye Camaee (Gambar 3. Reaksi pada Metode Bradford Alternatif berikutnya adalah metode BCA assay yang mengandalkan dua tahapan reaksi. Pertama, ikatan peptide pada protein akan mereduksi ion Cu dari CuSO, menjadi Cu’ (eemperature dependend. Jumlah Cu” reredulsi akan proporsional rerhadap jumlah STEP, protein yang ada dalam sampel. Selanjurnya, dua molekul bicinchoninic acid akan membentuk chelate dengan masing-masing ion Cu’, membentuk kompleks berwarna tungu yang menyerap secara maksimal pada 562 nm. Protein + Cu2> OT cure STEP, Cut+2868—~ oe Or Gambar 4. Reaksi pada Metode BCAMETODE PENELITIAN Alat dan Bahan Alac yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer UV-Visible, kuvet kuarsa, plastik, rak tabung reaksi, tabung reaksi, pompa bulp, vorteks, piper mikro, tip, magnetic stirer , gelas piala, lnbu takar, gelas ukur, dan Bahan yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) dan bahan-bahan kimia yang dibeli dari Metck atau Fluka, kertassaring. Preparasi Sampel Larutan protein dibuat_menggunakan BSA pada beberapa konsentrasi, sbb: 600\/ml, 300) g/ml, 150) g/ml BSA 751 g/ml 37,5ky/ml. Jugadisiapkanlaratan BSA 600'g/ml + Amonium sulfate (IM) dan Larutan BSA + detergen (SDS 0,5%) serta Larutan Tyrosin (1O(e/mD. Preparari Reagen Reagen Biuret Sebanyak 0,45g Sodium Potassium Tarcrat, 0,15 # CuSO,5HLO, 0,25g Potassium lodide dan 0,4g NaOH dilarutkan dengan aquadest Jalu digenapkan sampai 50 ml Reagen Lowry Lowry -A disiapkan dengan mencampurkan reagen Folin ciocalteau dengan aquadest (1:1) Reagen Lowry B disiapkan dengan mencampurkan 50 ml larutan (2 % NasCOy* 0,1. N NaOH) + 1 ml farutan (1% CuSO, +1 % Sodium Pottasium Tartrat) dalam air. Reagen Bradford Sebanyak 10 mg comasic brilliant blue G-250 dlilarutkan dalam 5 ml etanol 95%, Setelah, itu 10 ml asam fosfae 85% ditambahkan, Terakhir larutan diencerkan dengan aquadest sampai 100 ml. dan 1 Reagen BCA Reagen BCAA: 0,5g¢ sodium bichinconinat (BCA), 1g NaxCOs, 0,082 sodium artrat, 0,20g NaOH dan 0,48¢ NaHCO,, Adjust ke pH 11,25 dengan 10 M NaOH, add sampai 50 ml dengan aquadest, Reagen BCA: 0,04 CuSO,5H,O dalam 1,0 ml H;O. Reagen BCA (working solution): campur 50 ml reagen BCAA dengan I ml reagen BCA. Prosedur Analisa Merode yang digunakan terbagi menjadi 2 agian, yaitu metode pembacaan langsung dan metode kolorimetri (metode Biuret, metode Lowry, metode Bradford dan metode BCA). Metode Absorbansi Langsung Larutan sampel diukur absorbansinya secara langsung pada 280 nm (panjang gelombang maksimal dari protein) dan 260 nm (faktor Koreksi untuk serapan dari asam nukleat) Prosedur Metode Biuret ‘Tambahkan 1,8 ml reagen biuret ke dalam 200 pl sampel dalam tabung reaksi, kocoke hingga homogen (vortex). Biarkan pada suhu Kamar selama 20 menit, Lakukan pembacaan pada panjang gelombang 550 nm. Prosedur Metode Lowry Masukkan 250 il laruran protein ke dalam ‘tabung reaksi, tambahkan 2 ml reagen Lowry B, dan biarkan selama 10 menit, Kemudian tambahkan 250 pl reagen lowry A, kocok dan biarkan 20 menit, Bacalah OD pada panjang gelombang 600 nm, Prosedur Metode Bradford Masukkan 50 1 1 larutan protein ke dalam tabung reaksi tambahkan 2,5. ml reagen bradford kocok hingga homogen dan diamkan selama 10 menit. Bacalah OD pada panjang gelombang 595 nm,Prosedur Merode BCA Tambahkan 1 ml reagen BCA kedalam 20 tl larutan protein dalam tabung reaksi, inkubasi selama 30 menit pada 60°C. Selanjurnya biarkan pada suhu kamar (larutan dapat stabil selama 1 jam). Lakukan pembacaan pada panjang gelombang 562 nm, HASIL DAN PEMBAHASAN Perbandingan Sensitivitas Dari data serapan/absorbansi yang terbaca untuk sampel yang sama, terbukti bahwa_ angka serapan yang diperoleh dari metode Bradford dan BCA adalah yang. tertingsi, diikuti oleh metode absorbansi_langsung. Sementara itu, metode Biuret elas nampak paling tidak sensitif Karena menghasilkan bacaan yang paling rendah. Metade Lowry senditi ternyata dalam kondi percobaan ini ike dibandingkan dengan metode absorbansi Tangsung. Tabel 1 menunjukkan datasdaca absorbansi kurang — sensitif secara Keseluruhan terkait sensitivitas, Nilai absorbansi yang tertera dalam table diambil dari sampel dengan konsentrasi BSA dalam volume akhir campuran assay yang. setara ‘Tabel 1. Data Absorbansi dari Berbagai Metode tethadap Sampel BSA. Metode “Absorbansi Langsung_ Biuret Lowry Bradford BCA “Absorbansi 0340 + 0.0006 0.029 + 0.0006 0.216 + 0.0289 0.638 + 0.0698 0.641 + 0.0940 Efek Senyawa Lain Dalam Larutan Data menunjukkan bahwa garam ammonium sulfat menjadi pengganggu yang paling dominan dalam pengukuran kadar protein pada penclitian ini. Pada konsentrasi ammonium sulfir IM, pengaruh terhadap peningkatan bacaanabsorbansi_nampak sangat dominan pada metode Biuret dan Lowry, kemudian efék penurunan nila absorbansi yang lebih ringan teramati_ pada metode BCA, Behwa efek yang teramati pada metody Lowry pengamatan sama besarnya metode dengan pada Biuret, 68 menunjukkan bahwa kemungkinan besar seaksi_—pembentukan kompleks ion Cur Proteinlah yang utamanya terpengaruh oleh keberadaan amonium sulfat. Sementara itt, keberadaan surfakran, dalam hal ini diwakili oleh SDS 05% b/w, terlihar tidak menimbulkan efek —peningkatan atau penurunan nilai absorbansi secara signifikan pada metode Lowry, Bardford dan BCA. Secara kescluruhan, metode Bradford terbukti paling “stabil” dibandingkan dengan metode- metode lain terkait keberadaan pengotor berupa ammonium sulfat dan SDS.‘Tabel 2. Data Perbandingan Absorbansi dari Berbagai Metode terhadap Sampel BSA dengan Keberadaan Zat Pengikut Merode Absorbansi BSA BSA+Amonium Sulfat _ BSA+SDS Absorbansi Langsung 0.340 + 0.0006" 0.330 + 0.0021" 0.370 + 0.0036" Biuret 0.023 +0,0029 0.248 + 0.0673" 0.019 + 0.0021" Lowry 0.729 + 0.1183 2.322 + 0.0648" 0.669 + 0.0217" Bradford 0.638 + 0.0698" 0.627 + 0.0637" 0.545 + 0.0510" BCA 0.641 + 0.0940" 0.469 + 0.0255" 0.729 + 0.0624" Spesifitas Deteksi Terhadap Ikatan Peptida vs ‘Asam Amino Pada penelitian ini juga digali informasi, apakah metodemetode pengukuran protein yang digumakan mampu membedakon antara asam amino sebagai monomer (diwakili oleh yang setara) dengan protein/polipeptida yang merupakan bentuk polimer dari asam amino. Pada semua metode hasil pembacaan absorbansi dari sighifikan protein. Tyrosin dengan konsentrasi sampel asm amino berbeda dengan sampel Namun demikian, nampak bahwa hanya absorbansi dari metode Biuret dan Bradford yang mampu spesifik protein dan mengabaikan” Keberadaan_monomer asim secara nengenali amino. Pada metode pembacaan langsuing, bukan hal yang anch jika nilai absorbansi yang terbaca lebih besar pada sampel_ mo aratharuf yang melambangkan hasil grouping data dengan ANOVA asam amino, Karena memang secaraumum telah dikenal efek hipokromisitas pada biopolymer, i mana serapan biopolymer ‘menjadi Iebib rendah daripada monomernya Selanjuenya bahwa ‘mamput “mengabaikan” keberadaan_ monomer asam pada konsentrasi yang setara menarik juga untuk dicermati, sementars —metode —Biuret amino, ternyata pada metode Lowry teramati hal yang sangat berbeda, bahkan nilai bacaan absorbansi menjadi signifikan lebih besar pada sampel asam amino daripada sampel protein. Hal ini kemungkinan mengindikasikan bahwa monomer asam amino aromatis seperti tyrosin — sangat berperan dalam = menunjang —_reaksi pembentukan kompleks hetero polymolybdenum blue, ‘Tabel 3. Data Perbandingan Absorbansi dari Berbagai Metode tethadap Sampel BSA vs Tyrosin Metode Absorbansi Tyrosin BSA AbsorbansiLangsung 1.710 0.0121 0.340 + 0.0006" Biuret 0.001 + 0.0006" 0.023 + 0.0029" Lowry 1.856 + 0.0880" 0.729 + 0.1183" Bradford, 0.000 + 0.0000 0.638 + 0.0698" BCA 0.851 +0.1102" 0.641 + 0.0940"Linearitas Pada Tabel 4 terendah teramati pada metode Biuret dan terlihat bahwa Tinearitas linearitas verbaik teramati pada metode: Biuret. Belum jelas alasan untuk perbedaan yang terjadi terkait linearitas dati masing- kadar protein, namun kemungkinan hal ini terkair masing metode dalam mengukur nilai_konstanta kesetimbangan reaksi-reaksi yang terjadi pada masing- masing metode yang berbedlarbeda. ‘Tabel 4. Data Lincarttas dari Berbagai Metode terhadap Sampel BSA Metode Absorbansi Langsung Biuret Lowry Bradford, BCA R 0.839 444 0.780 0977 0.937 KESIMPULAN DAN SARAN Untuk keperluan umum, nampak bahwa metode Bradford lebih, disukai karena selain relatif mudah dan cepat pengerjaannya, juga dalam pene terbukti sensitif,selektif dam juga cukup stabil tethadap keberadaanpengotorberupa amonium sulfat dan SDS, serta menunjukkan nilai linearitas yang relative terbaik. Potensi ng akan Penerapan yang juga penting dicatat adalah bahwa metode Bradford (atau mungkin juga Biuret), —berpeluang untuk — digunakan 10 merekam kinetika reaksi hidrolisis protein menjadi monomer: monomernya. UCAPAN TERIMAKASIH Ucapan terimakasih kepada para selurub, peserta MK Spektroskopi Biomolekul dan para asisten yang membantu mahasiswa dalam pengumpulan data selama lima tahun terakhir, juga kepada Fakultas Teknobiologi Universitas Surabaya atas dukungan dan akses terhadap peralatan yang diperlukan.DAFTAR PUSTAKA, Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microorganisms quantities of protein in utilizing the principle of protein - dye binding. Anal. Biochem 72:248- 254, Brenner, AJ. and Harris, E.D. 1995. A quantitative test for copper using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 226, 80-84, Brown, RE., et al. 1989. Protein measurement using bicinchoninic acid: elimination of interfering substances. Anal. Biochem, 180, 136-139, Carperte, 2005. An Introduction to Practical Biochemistry, 100-101, Me Graw HillBook Company, Great Britany. Lehninger. 1982, Dasardasar Biokimia, 137-157, Erlangga, Jakarta, Montgomery, R. 1993, Bickimia Berorientasi pada KasusKlinis, 77, 90, Binarupa Aksara, Jakarta, Pande, S.V. and Murthy, S.R. 1994. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents and lipids. Anal. Biochem. 220, 414-426. Protein Assay Technical Handbook. 2005. Pierce Biotechnology, Inc. Sudarmanto Arie. 2008, Penetapan kadar protein metode lowry. hurp://ariebs. Staffuym.ac.id/ [10 Oktober 2013]