Flow cytometry

Nguyên lý và ứng dụng

Bs. Lê Xuân Hải

 Flow cytometry là gì?

 Flow dòng dịch lỏng

 Cyto tế bào

 metry đo lường
 Flow cytometry là gì?
■ Đo lường đồng thời nhiều đặc tính của
một tế bào đơn lẻ.
■ Thực hiện trên từng tế bào với tốc độ
500 - 4000 tế bào/giây
 FC cho biết thông tin gì?

■ Kích thước (Forward Scatter—FSC)

■ Đặc tính hạt hoặc tính phức tạp nội
bào (Side Scatter—SSC)
■ Mật độ huỳnh quang
(FL1, FL2, FL3, FL4, và FL5)
 Khả năng của FSC và SSC
Bộ phát hiện ánh sáng
bên
α Tính phức tạp nội bào

Nguồn
Bộ phát hiện ánh
sáng
sáng thẳng
α Bề mặt tế bào

Forward Scatter—tia nhiễu xạ

■ Liên quan đến màng tế bào
■ Được phát hiện dọc theo trục tia tới theo hướng thẳng
Side Scatter—tia phản xạ và tia khúc xạ
■ Liên quan đến đặc tính hạt và độ phức tạp nội bào
■ Được phát hiện ở góc 90° so với tia laser
Máu toàn phần đã ly giải HC

1000
800
Neutrophils
Side Scatter

600
400

Monocytes
200

Lymphocytes
0

0 200 400 600 800 1000

Forward Scatter
Ánh sáng huỳnh quang là gì?
HO O
lambda = 488 nm lambda ≅ 530
C nm

Năng lượng CO2H Năng lượng ánh

tia đến sáng huỳnh
Phân tử huỳnh quang được giải
quang Kháng phóng
thể

■ Chất màu huỳnh quang hấp thu năng

lượng từ tia laser
■ Chất huỳnh quang giải phóng năng
lượng nhờ:
◆ Nhiệt năng và động năng
◆ Giải phóng photons bước sóng dài hơn
Phổ hấp thụ và giải phóng năng lượng
của một chất màu huỳnh quang
FITC
1000

800

600

400

200

0
400 450 500 550 600 650 700
Bước sóng (nm)
 Một hệ thống máy FC cần
kết hợp 3 phần chính
Hệ thống dịch lỏng
■ Định hướng và tập trung tế bào để phân
tích
Hệ thống quang học
■ Tạo ra và thu nhận các tín hiệu quang học

Hệ thống điện tử
■ Để chuyển đổi các tín hiệu quang thành tín
hiệu điện tử và số hóa các tín hiệu này để
phân tích trên máy tính
Nhuộm trực tiếp 2 màu

Phân
tích
Ủ Rửa
Phân tích 2 màu

10 4
10 3
CD19 PE
10 2
10 1
10
0

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD3 FITC
Nhuộm trực tiếp 3 màu

Phân
tích
Ủ Rửa
 Phân tích 3 màu
10 4

10 4

10 4
10 3

10 3

10 3
CD4 FITC

CD8 PE
CD8 PE
10 2

10 2

10 2
10 1

10 1

10 1
10

10

10
0

0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD3 APC CD4 FITC CD3 APC

 DNA Histogram
250
G0/G1

200

150
Counts

100

50
S G2/M

0
0 200 400 600 800 1000

FL2-Area
 FC trong chẩn đoán lâm sàng

■ Đếm tế bào miễn dịch trong HIV (tỷ lệ CD4/CD8)

■ Phân tích các dưới nhóm bạch cầu
■ Phân loại miễn dịch Leukemia và lymphoma
■ Phân tích Cell cycle (chu trình tế bào) và ploidy
(tính chất bội thể) của khối u
■ Đếm hồng cầu lưới
■ Đọ chéo (ghép tạng)
■ Đếm tế bào gốc tạo máu
■ Phát hiện bạch cầu tồn dư (kiểm tra chất lượng
khối tiểu cầu và khối bạch cầu)
FC trong chẩn đoán lâm sàng (tiếp)

■ Xét nghiệm TdT

■ Chẩn đoán Đái huyết sắc tố kịch phát
ban đêm (PNH)
■ Phát hiện các kháng thể kháng tiểu cầu
■ Đánh giá chỉ số DNA
Flow cytometery 1979
Ca bệnh 1

■ Cháu gái 2 tuổi biểu hiện xanh xao và thận to 2

bên, suy thận, tăng LDH và uric acid, giảm Hb.
■ Chọc tủy: thâm nhiễm nhiều tế bào chưa trưởng
thành, 100% blasts. Các tế bào blast có kích
thước từ trung bình đến lớn, tỷ lệ N/C cao, bào
tương bắt màu kiềm và có nhiều hốc. Ức chế
sinh tủy và sinh hồng cầu nặng. Không thấy mẫu
tiểu cầu
Nhìn vào 2 hình này cần chú ý có một quần thể tế bào phân định rõ rệt với ddwwcj
tính CD45 nhạt và SSC có tín hiệu cao hơn một chút so với quần thể lympho bình
thường (R1). Tăng tín hiệu SSC thường do sự có mặt hoặc các hạt hoặc các hốc
trong bào tương tế bào. Vị trí quần thể blasts (R2) trên đồ thị CD45 vs SSC roi vào
vị trí thường gặp Myeloblasts; nhưng khi nhìn vào vị trí của quần thể này trên đồ thị
FSC vs SC thì thấy rằng các tê bào này có khuynh hướng to hơn lympho một chút
(màu đỏ) và nhỏ hơn monocytes . Vì vậy không kết luận ngay khi thấy 2 kiểu hình
ảnh này mặc dù chúng phù hợp với blast dòng tủy.
Xem lại vùng blasts (R2) hoàn toàn âm tính với CD3/CD4/CD8; trong khi các tế bào lympho
bình thường (R1) có hình ảnh bình thường với các kháng thể này. Có thể thấy một số tế
bào dương tính chỉ với CD4 (mũi tên). Các tế bào này là các Monocyte bình thường do
vùng blast chồng phủ với các mnocytes bình thường; và các monocyte có mang CD4.
Nhìn vào hình ảnh bất thường khi nhuộm CD10/CD19/CD20. Trước hết có thể thấy
lympho bình thường (R1) âm tính với CD10 và dươn tính với CD19/CD20; và đây là hình
ảnh bình thường của lympho B, đòng thời hình ảnh này được dùng làm nội chứng cho
hoạt tính CD10. Trái lại có thể thấy quần thể Blasts (R2) không chỉ dương tính với
CD10/CD19 mà còn dương tính với CD20. Điều này quan trọng vì ở tế bào B bình
thường khi tế bào phát triển bắt đầu xuất hiện CD20 trên bề mặt thì chúng sẽ bắt đầu mất
CD10. Bất cứ khi nào thấy có sự xuất hiện không phù hợp về thời gian các CD màng tế
bào thì thường nghĩ đến quần thể ác tính như với ca bệnh này.
Quần thể blast (R2) có thêm dấu hiệu nữa để nghĩ đến giai đoạn tế bào trưởng thành hơn
đó là mấu CD34. Một dấu hiệu khác nghĩ đến tế bào ung thư là sự xuất hiện HLA-DR mạnh
hơn so với quần thể lympho bình thường (R1).
Một lần nữa nhấn mạnh rằng dấu hiệu cho thấy quần thể tế bào là ác tính khi xuất hiện quá
mức hoặc mất các kháng nguyên trên bề mặt tế bào.
Trong hình này hãy nhìn vào một kết hợp kháng nguyên rất quan trọng là Kappa/Lambda/CD19.
Nếu nhìn kỹ chúng ta có thể thấy hai quần thể rõ rệt có kiểu bắt màu khác nhau với bộ kháng thể
nhuộm. Quần thể thứ nhất là lympho bình thường (mũi tên) có kiểu bắt màu đặc trưng cho lympho
B bình thường đó là đa dòng trong xuất hiện kappa/lambda. Kiểu hình đa dòng này cho thấy
khoảng một nửa lympho B có kappa và nửa còn lại có lambda (mũi tên). Quần thể blasts (R2) trái
lại chỉ phát triển đơn dòng chuỗi nhẹ kappa light chain; có nghĩa là tất cả tế bào blasts biểu hiện 1
loại chuỗi nhẹ (kappa) trong khi mất hoàn toàn chuỗi nhẹ lambda.
Antigen profile: Dương tính với CD10,
CD19, CD20, CD22, CD9 và Kappa, HLA-DR
và CD45.
FISH: dùng probe IGH/MYC t(8;14) dương
tính 92% tổng số tế bào.

■ Chẩn đoán: Burkitt Lymphoma

Ca bệnh 2

■ Nữ, 16 tuổi được chẩn đoán leukemia mới. Máu

ngoại vi có tăng WBC, 53% promyelocytes.
Mẫu được gửi cho for flow cytometry để chẩn
đoán M3
Đồ thị CD45/SSC trông khác với hình ảnh đặc trưng của tủy và máu. CÓ thể thấy 2 quần thể
tế bào, một quần thể là lympho bình thường (đỏ) và quần thể còn lại là bất thường (xanh). Mới
trông quần thể bất thường thấy giống như neutrophils, nhưng nếu nhìn kỹ hơn sẽ thấy không
phải vậy. Thông thường BCĐN nhân máu ngoại vi trải từ kênh 600 trên SSC và phát tán cao
hơn (nhìn mũi tên). Trong trường hợp cụ thể này sự phân bố của tế bào bất thường bắt đầu từ
vùng cửa sổ blast và liên tục di chuyển cao hơn chồng vào vùng BCĐN. Vậy chắc chắn quần
thể này không phải BCĐN nhưng là các tế bào lớn có tính chất hạt rất phức tạp.
Hình ảnh này cho thấy có hình ảnh bắt màu bình thường với CD3/CD4/CD8 của các
lympho bình thường (đỏ). Bây giờ hãy chú ý đên kiểu bắt màu của quần thể tế bào bất
thường (xanh) với các kháng thể đơn dòng này. Có thể thấy các tế bào blast có tăng mức
độ tự huỳnh quang (xem phần mở ngoặc). Sự tăng mức tựu huỳnh quang này là một đặc
điểm của APL do trong các hạt có nhiều thành phần protein. Hết sức lưu ý khi đặt
ngưỡng với các dấu ấn để tránh kết quả sai.
Ở đây chúng ta nhìn vào một đặc điểm khác của APL. Các tế bào blasts dương tính
đồng nhất với CD33, không đồng nhất với CD13, âm tính với CD34, HLA-DR và CD7.
Thiếu hụt HLA-DR và CD34 biệt rõ rệt APL với các thể AML khác.
Chúng ta lại xem một số dấu ấn khác và thấy rằng quần thể blasts dương tính rõ rệt với CD9, CD64 và dương tính
nhẹ 1 phần với CD15 và âm tính với CD117, CD11b và CD2.
Antigen profile: Dương tính với CD45, CD33,
CD13, CD9 và cMPO. Âm tính với HLA-DR, CD117
và CD34.

■ Chẩn đoáns: Acute Myeloid Leukemia, FAB(M3)

Ca bệnh 3

■ Cháu gái 7 tuổi, có tiền sử u trung thất.

■ Máu ngoại vi: tăng bạch cầu, 26% Blasts.
Xem hình ảnh trường hợp này có thể nói có một quần thể bất thường (màu
xanh) bắt CD45 mạnh hơn quần thể lympho bình thường và có SSC cao.
Trong mẫu tủy, hầu như không có lympho bình thường.
Hình ảnh này mang rất nhiều thông tin và có thể giúp đưa ra chẩn đoán. Nhìn kiểu
biểu hiện CD3/CD4/CD8 ta có thể thấy phần lớn quần thể khoanh vùng đồng
dương tính với CD4/CD8 và âm tính với CD3 màng. Kiểu biểu hiện này rất ít gặp
trong tủy xương và cho phép nghĩ quần thể blast là những tế bào thuộc dòng T
chưa trưởng thành. Trong số các tế bào bất thường có thể nhận ra các hình ảnh
biểu hiện của lympho bình thường (mũi tên đỏ).
Xem hình này có thể biết thêm về các tế bào này. Chúng ta thấy quần thể này âm
tính với CD10, CD19, CD34, CD33, CD13 và dương tính với CD7. “CD7” khẳng
định dòng tế bào T của quần thể bất thường.
Quần thể bất thường dương tính với CD2 và CD11b và âm tính với HLA-DR.
Thường với hầu hết trường hợp tế bào T có xu hướng âm tính với HLA-DR.
Dương tính với CD11b cũng là một đặc điểm của tế bào ác tính loại này.
Lần nữa, các tế bào bất thường tiếp tục được khẳng định dòng lympho T; chúng
dương tính với CD56, CD5, dương tính một phần với CD1a và âm tính với CD117 và
CD64. Thông thường sự xuất hiện CD64 trong leukemia nghĩ đến tiên lượng xấu.
Dương tính với TdT và CD3 bào tương khẳng định dòng và tuổi của quần thể blasts.
Antigen profile: Dương tính với CD4, CD8, CD7,
CD2, CD5, CD56, dương tính một phần với CD1a,
cCD3 và âm tính với HLA-DR.

PCR: geneTCR gamma rearrangement dương tính

■ Chẩn đoán: Leukemia cấp dòng T