GS. TS.

NGUYỄN THỊ HIỂN (C hủ biên)

PGS. TS. LÊ GIA HY - PGS. TS. QUẢN LẺ HÀ - TS. TỬ VIỆT PHÚ

CONG NGHẸ
SẢN XUÂT
ENZYM.PROTEINWnjNG'DU

NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM

 GS.TS. NGUYỄN THỊ HIỀN (Chủ biên)
PGS.TS. LÊ GIA HY - PGS.TS. QUÀN LÊ HÀ - TS. TỪ VIỆT PHÚ

CONG NGHẸm SÁN XUẨT

ENZYM,* PROTEIN VÀ ÚNG DỤNG
m

NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM

 LỜI MỞ ĐẦU

Trong thời đại hiện nay, vấn để cung cấp các kiến thức cơ bản nhất để hiểu
biết về công nghệ enzym từ nguổn gốc khác nhau; sản xuất và ứhg dụng protein từ
vi sinh vật và giá trị ứng dụng của nó đối với con người ngày càng đòi hỏi cao hơn,
đáp ứng được sự phát triển của đời sống kinh tế, xã hội của đất nước. Từ những
kiến thức cơ bản đó, sinh viên và những nhà sản xuất tìm mọi biện pháp nâng cao
giá trị của sản phẩm chế biến bằng cống nghệ vi sinh vật, thõng qua hệ enzym của
nó tạo ra.
Cuốn sách Công nghệ sản xuất enzym, protein và ứhg dụng ra đời nhằm
cung cấp những kiến thức cơ bản đó. Cuốn sách gồm 2 phẩn chính: Phần thứ nhất
đề cập đến công nghệ sản xuất và ứíig dụng của enzym và Phần thứ hai để cập
đến công nghệ sản xuất và úng dụng protein từ vi sinh vật.
Công nghệ sẩn xuất enzym, protein và úng dụng sẽ cung câp được những
kiến thức cần thiết và bổ ích cho nhiếu độc giả khác nhau khi nghiên cứu hay sản
xuất liên quan đến hai lĩnh vực enzym và protein.
Nhân dịp này, cho phép chúng tôi cẳm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học
Phương Đông Hà Nội, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm - Đại học Bách
khoa Hà Nội đã động viên và khích lệ tập thể tác giả chúng tỏi hoàn thành giáo
trình này. Chúng tôi cảm ơn Công ty c ổ phần Sách Đại học - Dạy nghể, Nhà xuất
bản Giáo dục Việt Nam đã giúp đỡ để cuốn sách đến với bạn đọc.
Măc dù tập thể tác giả đã cổ gắng tập hợp tư liệu, kinh nghiệm trong và ngoài
nước và qua kinh nghiệm giảng dạy trong những nam qua để chọn lọc và thể hiện
những kiến thức cần thiết nhất cho học tập của sinh viên, nhưng chắc chắn chưa
hoàn toàn đầy đủ và còn những thiếu sót nhất định. Chúng tôi mong có những
đóng góp quý báu của các đổng nghiệp, các bạn sinh viên và đông đảo bạn đọc để
cuốn sách ngày càng hoàn chỉnh hơn trong những lẩn xuất bản sau.
Mọi ỷ kiến đóng góp xin gửi về Công ty c ổ phần Sách Đại học - Dạy nghề,
Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 25 Hàn Thuyên, Hà Nội.
Xin trân trọng cảm ơn.

Thay m ặt tập th ể tác giả

GS.TS. NGUYỄN THỊ HIEN

3
 Phần thứ nhất

ENZYM VÀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYM

Chương 1

NHỮNG KHÁI NIỆM c ơ BẢN VỂ ENZYM

1.1. GIỚI THIỆU VỂ ENZYM

Enzym là chất xúc tác sinh học, do tế bào sông sản xuất ra, có tác dụng
tăng tôc độ và hiệu suất phản ứng hoá sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ
nguyên khả năng xúc tác. Như vậy, enzym có hai đặc trưng cơ bản:
—Enzym là protein có hoạt tính xúc tác:
Ngưòi ta đã khám phá ra rằng, các enzym đã xúc tác cho hầu hết
các phản ứng hoá học xảy ra trong cơ thê sống, đảm bảo cho các quá
trình chuyển hoá các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp
nhàng, cân đối, theo những chiều hưâng xác định. Như vậy, enzym đã
dảm bảo cho sự trao đổi Ihưòng xuyên giữa cơ thể sông và môi trưòng
bôn ngoài, nghĩa là dẳm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.
- Enzym có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn:
Hiệu suất xúc tác của enzym có thể gấp hàng trăm, hàng nghìn,
hàng triộu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Ví đụ: trong phản
ứng thuỷ phân saccaroza, nếu dùng enzym saccaraza làm chất xúc tác
thì tốc dộ phản ứng tăng nhanh gấp 2.10'2 lần so vối khi dùng axit làm
chất xúc tác.
Điểu quan trọng nữa là enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác
trong diều kiện nhẹ nhàng, ỏ áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ
thể, pH môi trường gần pH sinh lý. Hơn nữa enzym lại có khả năng lựa
chọn cao đôì vởi kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như với các chất mà
nó tác động.
Ví dụ: a-am ylaza chỉ có khả năng xúc tác việc phân cắt các mối liên
kết a - 1,4 — glucozit ỏ bất kỳ chỗ nào trong phân tử tinh bột, còn
glucoamylaza lại có thể phân cắt các mối liên kết c c - l , 4 v à a - l , 6 t ừ
dầu không khử của phân tử tinh bột.
Do nhũng đặc điểm trên, việc nghiên cứu và ứng đụng enzym có ý
nghĩa to lớn về m ặt lý thuyết cũng như về m ặt thực tế áp đụng.

5
 1.2. PHÁT TRIỂN NGHIÊN c ứ u VÀ ỨNG DỤNG ENZYM TRONG CÁC
NGÀNH KiNH TẾ QUỐC DÂN
1.2.1. Phát triển nghiên cứu enzym
Từ trước th ế kỷ XVII, khi loài người hoàn toàn chưa biết gì về
enzym, người ta đã biết sử đụng rộng rãi các quy trình enzym trong hoạt
động thực tế như làm bánh mỳ, bia, rượu,... Việc ứng dụng enzym trong
giai đoạn này hoàn toàn có tính chết kinh nghiệm thuần tuý và sử dụng
enzym thông qua hoạt động sống của tế bào vi sinh vật.
Từ th ế kỷ XVII đến th ế kỷ XIX, ngưòi ta đã đề ra được khái niệm vể
sự lên men. Vanhelmont, ngưồi Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được
hiện tượng tạo thành chất khí khác vối không khí trong quá trình lên
men. Silvius (1659) lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản, tấ t cả các quá
trình sông đểu là nhũng quá trình hoá học. Đến nửa cuôì th ế kỷ XVIII
bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn giản, như thí
nghiệm của R eaunur (ngưồi Pháp) và Spallanzani (người Italia) vể khả
năng tiêu hoá th ịt của dạ dày. Năm 1787, Pabroni cho rằng, bản chất
của quá trình lên men và sự phân giải một châ't này bởi một chất khác
gọi là “ferment”.
Đầu th ế kỷ XIX, ngưòi ta bắt đầu tách được các chất gây ra hiện
tượng lên men, mở đầu công trình của Kiecgov (ngưòi Nga) đã chứng
minh rằng, nưóc chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hoá
tinh bột thành đường, gọi là diastase (xuất phát từ chữ Hy Lạp -
diastasic, có nghĩa là phân giải). Năm 1851, Leuchs đã phát hiện hoạt
động phân giải tinh bột của nước bọt.
Trong thời kỳ này cũng xảy ra cuộc đấu tranh giữa hai quan niệm
về bản chất tác dụng xúc tác của enzym. Quan niệm thứ nhất mà đại
diện là Pasteur cho rằng, tác dụng xúc tác của enzym có liên hệ tới hoạt
động sống của tế bào, nghiền nát tế bào nấm men sẽ không chuyển hoá
được đường th àn h rượu. Quan niệm thứ hai, đại diện là Liebig và Bertlo
lại xem enzym như những chất xúc tác khác, hoạt động xúc tác của nó
không liên hệ vổi hoạt động sống. Trong điểu kiện thí nghiệm thời bấy
giờ, các thí nghiệm lên men vô bào dều không thành công, vì vậy
Pasteur đã thắng trong cuộc đấu tranh này và đi đến phân chia enzym
thành hai loại enzym có tổ chức và enzym không có tổ chức. Năm 1878,
Kiihn gọi enzym có tổ chức là “ferment” và enzym không có tổ chức là
“enzym” (theo tiếng Hy Lạp, enzym có nghĩa là trong nấm men). Sự

•%.
phân biệt giữa “enzym” và “ferment” đã bị bác bỏ sau khi Buchner ngưòi
Đức đã làm thí nghiệm thành công quá trình lên men bằng dịch chiết vô
bào từ nấm men.
Trong nửa cuôi thế kỷ XIX, người ta đã biết dùng phương pháp hấp
phụ lựa chọn để tinh chế enzym (Danilevxki, 1862), xác định tính đặc
hiệu của enzym (Fischer, 1894), xác định ảnh hưỏng của pH đến hoạt
động của enzym (Sornsen, 1909). Cuối thế kỷ XIX, đầu thế kỷ XX đã có
nhiều công trình nghiên cứu về động học của enzym.
Từ năm 1922 bắt đầu có nhiêu công trình nghiên cứu tách enzym ỏ
dạng tinh khiết và nghiên cứu bản chất hoá học của chúng. Năm 1926,
lần đầu tiên Sumner tách được enzym ở dạng tinh thể (ureaza). Công
trình này mở đầu một giai đoạn mới trong lịch eử nghiên cứu enzym.
Sau đó nhiều ngưòi khác đã kết tinh được nhiều enzym khác nhau. Đến
năm 1930, người ta mới xác định dứt khoát bản chất hoá học của enzym
là protein.
Từ sau Chiến tranh Thế giói thứ II, Enzym học là một trong những
ngành phát triển nhất của sinh hoá học. Người ta đã xác định được toàn
bộ hộ thông enzym đảm bảo cho các quá trình trao đổi chất của cơ thể
sông như quá trình đường phân (Embden Meyerhoff, 1933), chu kỳ axit
axetic (Krebs Knop và Martius, 1937), các enzym tham gia quá trình
oxy hoá axit béo,...
Trong 20 năm gần đây, người ta đã đạt được nhiều thành tựu đáng
kể trong nghiên cứu cấu trúc phân tử enzym và giải thích cơ chế phân tử
quá trình sinh tổng hợp enzym trong tê bào.
Năm 1960, Movr và Stein đã xốc định được cấu trúc bậc một của phân
tử enzym là ribonucleaza. Nghiên cứu này đã mở đường cho những hiểu
biết về đặc tính cấu trúc phân tử enzym và cơ chế tác dụng của enzym.
Trong những năm gần đây, nhò dùng phương pháp phân tích
Rơnghen ngựòi ta đã nghiên cứu được cấu hình không gian của phân tử
onzym. Ngoài việc nghiên cứu câu trúc, những công trình quan trọng
trong thời gian này là đã phát hiện được các enzym tham gia quá trình
sinh tổng hợp protein và các axit nucleic trong cơ thể sống. Các công
trình trên đã làm sáng tỏ cơ chế phân tử của quá trình sinh tổng hợp
protein và axit nucleic trong tê bào.
Năm 1961, Jacop và Monod đã để ra cơ chế giả thuyết vể sự điều
hoà hoạt động enzym trong tế bào. Từ năm 1960 đến nay người ta cũng
đã chú ý nghiên cứu tính đa dạng của các enzym (izoenzym).
7

A
 Một th àn h tựu lớn dã đạt dược trong 20 năm gần đây là đã tổng hợp
được enzym. Năm 1968, hai nhóm nhà hoá học người Mỹ, đứng đầu là
Hirsm an và Merifield đã dùng các phương pháp khác nhau tổng hợp
được ribonucleaza có hoạt tính xúc tác giông ribonucleaza tự nhiên. Vói
đà phát triển hiện nay của Enzym học, chắc chắn trong tương lai không
xa chúng ta có thể tổng hợp được nhiều chất xúc tác mới theo kiểu xúc
tác enzym để sử dụng trong thực tế. Điểu này sẽ có ý nghĩa kinh tế hdn
đổi với các enzym khó tách từ nguyên liệu tự nhiên.
1.2.2. ứng dụng enzym trong các ngành kinh tế quốc dân
Cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lý thuyết vể
enzym, các nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tê ngày càng được
mở rộng và đạt hiệu quả cao. Để sử dụng enzym trong thực tế có thể tiến
hành theo hai cách chủ yếu sau đây: (1) điều hoà định hướng tác dụng
của enzym trong các nguyên liệu chứa nó và (2) tách enzym ra khỏi
nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng trong các quá trinh sản xuất.
Sử dụng enzym theo hướng thứ nhất trong nhiều trưòng hợp có thể
đơn giản hơn. Ví dụ: có thể dùng yếu tô' nhiệt độ để điều chỉnh hoạt độ
một sô" enzym có trong cá, chè, thuốc lá,... để làm tăng rõ rệt hương vị,
màu sắc của sản phẩm. Tuy nhiên, cách sử dụng này hạn chế khả năng
ứng dụng của enzym vì chỉ có thể dùng enzym đối với quy trình chế biến
chính nguyên liệu của nó.
Sử dụng enzym theo cách thứ hai thường có hiệu quả hơn, vì chế
phẩm enzym nhận được có thể sử dụng rộng rãi tùy theo yêu cầu. Hơn
thế nữa còn có thể dễ dàng điều khiển hoạt động của enzym theo ý muốn
và cho phép đề ra quy trình sản xuất. Vì vậy, trong mấy chục năm gần
đây đã hình th ành và phát triển mạnh kỹ th u ật sản xuất chế phẩm
enzym. Hiện nay, trên thế giới hàng năm sản xuất hơn 100.000 tấn chế
phẩm enzym, trong đó N hật Bản là nước có truyền thống lâu đồi nhất
trong lĩnh vực này. Hiện nay ở Nhật Bản có 20 hãng sản xuất chế phẩm
enzym vói sản lượng hàng năm 15.000 tấn, trị giá 10 triệu USD. Sau
N hật Bản là một số nước khác như Mỹ, Anh, Pháp, Đan Mạch, Thụy
Điển. Hãng Novo của Đan Mạch cũng là một trong những hãng sản xuất
chế phẩm enzym nổi tiếng thế giới. Trong 10 năm gần đây, các nước
Đông Au, Trung Quốc, An Độ cũng bắt đầu phát triển m ạnh công nghiệp
sản xuất các chê phẩm enzym. Tuy nhiên, sô' lượng và chất lượng enzym
còn ở mức độ thấp.

8
 Các chế phẩm enzym đã được sử đụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
khác nhau như:
a) Trong hoá p h â n tích để định tính và định lượng một sô' chất. Khi
sử dụng enzym để định lượng các chất, có thể tiến hành theo hai cách:
- Dùng enzym có tác dụng phân giải riêng chất ấy, sau đó dùng một
trong rác phương pháp phân tích thông thường để định lượng các chất
sau phản ứng. Từ đó suy ra lượng chất cần phân tích. Ví dụ như dùng
ureaza dể định lượng ure, sau khi cho enzym tác dụng với ure ta xác
định được amoniac được tạo thành, từ đó suy ra lượng ure có trong
nguyên liệu cồn nghiên cứu,
- Nếu chất cần phân tích có tác dụng kìm hãm, hoặc kích thích đặc
hiệu một enzym nào đấy, ta có thể định lượng bằng cách xác định mức
độ ảnh hưởng của chúng đến hoạt độ enzym đổi chiếu với bảng, hoặc đồ
thị chuẩn đổ suy ra lượng chất cồn phân tích. Ví dụ: dùng phosphataza
dể định lượng ion fluo vì fluo có tác dụng kìm hăm enzym này. Phương
pháp này có dộ nhạy khá cao, có thể xác định được lượng fluo rất bé,
khoảng 0,02mg/ml.
b) Trong y học có thể sỏ dụng enzym để chữa bệnh, để sản xuất
các sinh tó và các chất kháng sinh. Ví dụ:
- Có thể dùng enzym để tăng thêm lượng enzym cho cơ thể, chừa
các bộnh thiếu enzym bẩm sinh, hoặc làm các nội quan nhân tạo, có thể
dùng enzym đổ chữa bệnh về tiêu hoá kém hoặc để loại bỏ các phần mô
bị hỏng, bị Lhối ở các ổ viêm, các vết thương hoặc hoà tan các cục máu
dông làm tắc nghẽn mạch máu. Ngoài ra, cũng có thế dùng enzym đổ
phân giải thuốc khi cơ thể bị dị ứng mạnh với các thuôc này. Ví dụ: đùng
penixilinaza khi cơ thổ bị dị ứng mạnh với penixilin,...
- Chữa bệnh do siêu vi trùng gây nên bằng các loại enzym phân giải
axit nucleic (nucleaza).
- Dùng kẹo cao su có chứa hai loại enzym (lactat dehydrogcnaza và
inveclaza) để chông bệnh hà răng. Hai loại enzym này có khá năng làm
phân giải hoà tan lớp keo bền ở chân răng do liên cầu khuẩn sinh ra.
- Dùng enzym chẩn đoán nhanh chóng một số bệnh như dùng
glucooxydaza và peroxydaza cùng với các phụ liệu khác tạo giấy chỉ thị
cực nhanh để kiểm tra bệnh tiểu đưòng, giấy này được làm bằng
xenluloza đặc biệt, được tẩm dung dịch hai enzym trên và chất tiếp
nhận sinh màu octotoluidin, hoặc octodiami/in. Khi nhúng giấy chỉ thị
này vào nưóc tiểu, nêu nước tiểu có chứa glucoza thì sau 1 - 2 phút nhấc

9
giấy ra khỏi dung dịch nước tiểu, giấy sẽ chuyển từ trắng sang xanh
hoặc sang màu khốc. Cơ chế chuyển màu như sau:
Glucoza + 0 2 Glucooxydaza ) Ạy-it. gluconic + H20 2
HvO,, + Chất tiếp nhận sinh màu —Peroxydaza—> tiếp nhân sinh màu
(Khõng màu) ịCó màu}

c) Trong công nghiệp

- Trong công nghiệp xà phòng dùng để làm châ't tẩy rửa dầu mâ
công nghiệp.
- Sử dụng enzym amylaza để khử hồ trên vải trong công nghiệp dệt.
- Sử dụng proteaza của Aspergillus oryzae 33 để khử lông trâu, bò
trong công nghiệp thuộc da, cho hiệu suất cao hơn phương pháp vôi sulfua.
- ứ n g dụng xenlulaza thuỷ phân bào mòn màng xenluloza để trích
ly các chất keo trong rong biển.
- Trong công nghiệp giấy, sử dụng enzym để sản xuất bột giấy và giấy.
d) Trong thực p h ẩ m
- Sử dụng a - amylaza trong chế phẩm tạo men bia, men bánh mỳ.
Nếu đưa vào bột nhào 0,002 - 0,003% chế phẩm amylaza thì chất lượng
bánh mỷ tăng cao: bánh xốp hơn, ngọt hơn, màu sắc đẹp hơn.
- Sử đụng amylaza để sản xuất glucoza từ tinh bột, thay cho
phương phốp dùng axit HC1 (hiệu suất 96 - 97%).
- Sử dụng proteaza:
+ Làm mềm thịt (proteaza từ đứa, đu đủ, nội tạng động vật).
+ Công nghiệp cá, thuỷ phân thịt cá, sản xuất nước mắm, sản xuất
bột cá.
Trong công nghệ chế biến thịt, nếu thịt bị dai phải sử dụng onzym
có hoạt tính proteaza, elastaza và keratinaza. Hiện nay có loại
keratinaza từ Actinomyces fradiae có tác dụng lảm mềm th ịt tốt ngang
với chất làm mềm tandrin.
Trong chế biến đồ hộp cá rán: trước khi rán ngưòi ta ưóp cá với
enzym làm mềm thịt sau đó mối rán. Kết quả thịt cá thơm ngon hdn,
màu sắc đẹp hấp dẫn hơn và chất lưdng đồ hộp cao hơn.
+ Chê biên nưóc mắm ngắn ngày, bổ sung chế phẩm proteaza từ vi
sinh vật, thực vật,... đã rú t ngắn thòi gian chế biến.
+ Dùng proteaza thuỷ phân màng tế bào gan cá đẹ trích ly dầu cá.
+ Dùng proteaza để tinh chế Guanin.

10
 - Dùng pectinaza để tâng hiệu suất ép nước quả và làm trong dịch
quả, chống hiện tượng tủa trắng khi bảo quản. Điểu đó được giải thích
như sau:
Trong khối quả nghiền chứa nhiểu pectin, khi có m ặt pectin và
dường làm cho khối quả nghiền keo hoá cao, khi ép, dịch quả khó thoát
ra, khi khôi quả nghiền được trộn với pectinaza sẽ thuỷ phân pectin và
làm giảm độ nhớt, dịch thoát ra dỗ dàng hơn.
Cơ chế:
Pectin -----Pectmaza---- > metylic + axit pectic

Cấu tạo của pectin (poly a - galacturonic) có nhóm metoxi (H3CO-

CH = 0).
Axit pectic không có khả năng keo hoá. Sau đó người ta dùng phản ứng:
Axít pectic + Ca --------------- » Pectat canxi (kết tủa)
Và cuối cùng pectin được loại ra khỏi dung dịch nước quả, nhờ vậy
mà dịch quả bảo quản lâu không bị keo vẩn đục.
- Sử dụng xenlulaza làm mềm xenluloza để tăng hiệu suất tiêu hoá
cho trâu, bò, cá trắm ,...
- Sử dụng glucooxydaza làm túi thu oxy trong bảo quản phomat, bột
trứng, sữa khô. Túi khử oxy được chuẩn bị như sau:
Cho một ít glucoza với chế phẩm glucooxydaza vói catalaza và dung
dịch đệm cần thiết vào trong túi PE hoặc túi vật liệu khác. Đặc điểm của
túi chỉ cho axy đi qua mà không cho nước đi qua. Sau đó dặt túi vào
trong hòm hay thùng kín có sản phẩm cần bảo quản.
Cơ chế:

Glucoza f f l ĩ s l ỹ 3 ĩ ĩ i r >A*it eluconte + H A

H2° 2 Cataĩãia '_> + 1/2° 2

Trong sản xuất bột trứng, nếu bột trứng còn chứa một lượng glucoza
thì sau một thời gian bảo quản ngắn bột trứng bị sẫm màu và có mùi
khó chịu. Trong albumin trớng chứa 3% glucoza, trong lòng đỏ trứng
chứa 0,5% glucoza. Do vậy, trong sản xuất bột trứng người ta sử dụng
glucooxydaza để oxy hoá trước glucoza để tránh các quá trình có hại
trên, tăng thời gian bảo quản.
- Dùng enzym để chế biến các sản phẩm nông nghiệp như chè,

11
thuốc lá,... để làm tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Có
thề đùng enzym để bảo quản đồ hộp và các nguyên liệu khác. Ví dụ:
dùng glucooxydaza, catalaza và một ít glucoza vào một hệ thông kín với
một lưựng oxy có hạn thì sau một thời gian nhất định chúng ta sẽ loại
hết oxy trong hệ thông theo phản ứng chung sau đây:
2C(ỉH , A + 0 2----->2CgH 120 7
Như vậy, sẽ tránh được việc xảy ra oxy hoá ìàm ảnh hưởng đến
hương vị và chất lượng của sản phẩm.
e) Trong nông nghiệp
Có thổ dùng ensym để sản xuất thức ăn cho động vật nhằm tăng giá
trị dinh dưõng của thức ãn thô, tăng hệ số sử dụng thức ãn. Các enzym
dược sử dụng với mục đích này thường là các enzym thuỷ phân như
amylaza, protoinaza, đặc biệt là xenlulaza, hemixenlulaza. Chúng thuỷ
phân các chất phân tử lớn thành dạng dễ hấp thụ hơn nên thường làm
tăng hiệu quả sử dụng thức ăn lên khoảng 10%, tăng khối lượng đàn gia
súc trung bình 10 —15%. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng khi
chuẩn bị thức ăn chỏ các loài động vật còn non như bê con, lợn con,... vì
hệ thông tiêu hoá của chúng còn chưa th ật thích hợp với việc ăn loại
thức ăn thô. sử dụng enzym để chuẩn bị thức ăn cho gia súc có thể tiến
hành theo 2 cách:
- Thêm trực tiếp enzym vào thức ăn trước khi dùng.
- Dùng enzym để xử lý sơ bộ thức ăn.
Cách thứ nhất đơn giản hơn nhưng cách thứ hai có lợi hơn, vì khi xử
ỉý ngoài cơ thể ta có thể dễ dàng tạo điều kiện thích hợp về pH, nhiệt độ,
enzym hoạt động m ạnh hơn, do đó hiệu suất phân giải thức ăn lớn hơn
so với cách thứ nhất.
Đổ sử dụng enzym trong chăn nuôi tốt nhất là dùng các chế phẩm
enzym từ vi sinh vật và chưa tinh chế, vì thành phần enzym, đặc biệt là
các enzym thuỷ phân trong các chế phẩm này thường phong phú hơn
nhiều so với chế phẩm enzym từ động vật. Do vậy khi thêm chế phẩm
enzym vi sinh vật vào thức ăn của động vật trưởng thành, khoẻ mạnh
vẫn có ảnh hưởng rõ rệt. Trong khi đố, nếu thêm chế phẩm enzym động
vật lại không có hiệu quả gì.
Ngoài việc sử dụng enzym để chuẩn bị thức ăn cho gia súc, trong
nông nghiệp có thể dùng enzym để xử lý hạt trước khi gieo mầm nhằm
rú t ngắn thòi gian nảy mầm và tăng sản lượng thu hoạch.

12
 Bảng 1.1 dưới đây trình bày tóm tắt khả năng ứng dụng enzym
trong các ngành công nghiệp.

Bảng 1.1. ứng dụng của enzym trong công nghiệp

C ông nghiộp S ự ứng dụng Enzym Nguón gốc

Bánh nướng Làm biến đổi bột nhào Proteaza Nấm mốc
bánh mỳ.
Amylaza Malt nghiến
Tẩy trẳng màu tự nhiên
Lipoxydaza Nấm men bánh mỳ
của bột.
Bột đậu nành

Bia và đổ uống Nấu mail. Protea 2a Malt

có cổn
Giảm hàm lUdng dextrin. Amylaza Nấm, vi khuẩn
Amyloglucooxydaza Papain
Nấm mốc

Kẹo Làm mếm kẹo Invectaza Nấm men

Mứt kẹo Chống “san ” đường Amylaza Vi khuẩn

Ngũ cốc Xử lý sơ bộ ngũ cốc Amytaza Malt, nấm

Cà phê Khử chất nhày từ Pectinaza Nấm mốc

những quả mọng.
Amylaza
Làm loãng độ đặc.
Pectindaza

Sản xuất bơ Làm đỏng sữa trong Rennet Nấm dạ dày bồ

sữa sản xuất phomat.
Proteaza Papain
Thuỷ phân protein. Glucooxydaza Nấm mốc
Khử oxy từ bột trứng. Vi khuẩn
Catalaza

Alcol Hoá lòng Amylaza Vi khuẩn

Đưởng hoá Amyloglucooxydaza Malt, nấm mốc

Công nghệ cá Thuỳ phân thịt cá Proteaza Vi khuẩn

Quả và nuốc Ép, lọc và cô đặc nước Pectinaza Nấm mốc

quả quả. Naringinaza
Loại vị đắng của quà
nho.

Giặt lã và làm Ngâm và tẩy trắng. Alkaline proteaza Vi khuẩn.

khô sạch Khử chấm đen. Proteaza Nấm mốc, vi khuẩn,
Lipaza tuyến tuỵ.

Amylaza

13
Công nghệ da Làm mềm da Proteaza Tuyến tuỵ, vi khuẩn,
nấm mốc

Đóng gói thịt Làm mềm thịt Proteaza Papain

Bromelain
Nấm mốc

Dầu Thu hồi thịt vụn. Proteaza Vi khuẩn

Khoan giếng dầu. Hemixenlulaza Nấm mốc
Xenlulaza

Giấy Làm biến đổi bột giấy để Amylaza Vi khuẩn

tạo điểu kiện tạo màng
và kích thước giấy.

Dược phẩm Tăng cưởng tiêu hoá. Proteaza, Lipaza, Tuỵ tạng, nấm mốc,
Amylaza, động vật.
Tăng cưông tác dụng
của thuốc tiêm. Hyaluromidaza, Nấm mốc, vi khuẩn,
tuyến tuy., bromelain.
Giấy chỉ thị Kiểm tra Glucooxydaza,
nước tiểu. Peoxydaza, VI khuẩn.
Chống viêm. streptokinaza, Trypxin. Tuyến tuỵ.

Phim ảnh Thu hổi bạc trong sản Amylaza Nấm mốc
xuất phim.

Tinh bột Chế tạo xiro ngô khác Amylaza Nấm mốc
nhau.
AmylogJucodaza Nấm mốc
Sản xuất dextroza, fructaza.
Glucoizomeraza Vi khuẩn

Dệt Khử hổ trên vải Amylaza Vi khuẩn

Nước quả Làm tăng sản lượng Pectinaza Nấm mốc

nước quà trong ép lọc

1.3. Phản loại và các cách gọi tên protein

Trong thực tế cũng có một sô' enzym được gọi theo một 30 tên gọi
khác nhau và ngược lại, hai enzym khác nhau lại có thể được gọi cùng
một tên. Do có những trường hợp không nhất quán như trên, càng ngày
sô' lượng enzym mới được phát hiện càng nhiều và để thống nhất tên gọi
enzym, người ta đã xây dựng hệ thông phân loại enzym quốc tế. Trong
hệ Lhống phân loại này tất cả enzym được phân chia thành 6 lốp lớn,
mỗi lốp íớn có những lớp phụ được phân biệt khác nhau theo kiểu phản
ứng mà chúng xúc tác (bảng 1.2).

14
 Bảng 1.2. Phân loại các nhóm erưym và tinh chất sinh hoá của chúng
Lớp Các loại enzym Tinh chất sinh hoá
1 Oxydoreductaza Tác đống lên nhiều nhóm hoá học nhằm thèm vào hay bớt đi
(oxy hoá khử) nguyên tử hydro. A~ + B <-> A + B".
2 Transferaza Chuyển hoá các nhóm chức năng giữa các phân tử cho và
(chuyển hoá) nhận. Kinaza là enzym transferaza đặc hiệu điều hoà quá trình
trao đổi chất bằng cách chuyển phosphat từ ATP đến các
phân tử khác: A-B + c <-►A + B-C.
3 Hydrolaza Gắn thèm phân tử nước váo một liên kết, thuỳ phân nó.
(thuỳ phán) A-B + HjO <-> A-H + B-OH.
4 Lyaza Gắn phân tử nước, amon hoặc dioxit cacbon vào đỏi liên kết
(phân ly) hoặc loại bỏ các nguyên tố này để sàn sinh đỏi liên kết:
AX-BY <-> A-B + X-Y
5 Izomeraza Thực hiện nhiều loại đóng phân hoá; Dạng L sang dạng D, các
(đổng phân) phản ứng biến đồi (sự thay đổi vị trí các nhóm hoá học) vả các
thay đổi khác: AX-BY <-> AY-BX.
6 Ligaza Xúc tác các phản ứng trong đó 2 nhóm hoá học đuạc liỗn kết
(kết nối) (nối lại) có sử dụng năng lượng từ ATP; tạo liẻn kết: C-C, C-S,
C -0 và C-N.

Rất nhiều enzym được đặt tên bằng cách thêm đuôi -aza vào tên gọi
cơ chất hoặc tên gọi mô tả quá trình xúc tấc của nó, vĩ dụ: ureaza là
enzym thuỷ giải ure. Một sô' enzym khác như pepsin, trypxin,... lại
không gọi theo tên cơ chất, mà vẫn gọi theo tên truyền thống.
Tại Hội nghị lần thứ năm của Hiộp hội các nhà sinh hoá quốc tế
(I.U.B) đã thòng nhất cách gọi tên Iheo nguyên tắc sau: Tên mỗi enzym
gồm hai phần; Phần thứ nhất chỉ tên cơ c h ấ t (nếu có nhiều cơ chất thì
Lên các cơ chất cách nhau bằng dấu: ), phần thứ hai chỉ tên kiểu phản
ứng mà onzym xúc tác cộng thêm phần tiếp vị ngữ aza. Hai phần trên
cách nhau bằng một dấu nôi ngang.
Theo nguyên tắc này, mỗi enzym có một số’ duy nhất. Hộ thông
I.U.B. cũng định rõ tên nguyên bản cho mỗi enzym. Tên enzym bao gồm
tên cơ chất, tên sản phẩm và nhóm chức năng của enzym. Vì quá nhiều
enzym, như alcohol dehydrogenaza, được hiểu theo nghĩa rộng trong
cộng đồng các nhà khoa học bởi các tên thông thường của chúng, sự thay
đổi theo danh pháp I.U.B. rấ t chậm. Chính vì vậy, sử dụng tên phần lớn
các enzym vẫn được gọi theo Lên thông thường của chúng.
Mỗi enzym trong hệ thống được phân loại và đặt tên theo mã 4 chữ
sô'biểu thị phản ứng xúc tác. Ví dụ: enzym xúc tác phản ứng:
ATP + D-Glucoza -* ADP + D-Glucozo-6-phosphat

15
 Enzym này còn có tên gọi là glucoza phosphotransferaza, biếu thị
phản ứng chuyển nhóm phosphat từ ATP tới glucoza có mã sô phân loại
E .c num ber (enzym classification number) là 2.7.1.1. Trong đó, mã số 2
biểu thị tên lớp enzym là transferaza, mã số 7 biểu thị lóp phụ
phosphotransferaza, mã số 1 biểu thị nhóm -OH, là nhóm nhận gổc
phosphat và mã sô 1 cuối cùng biểu thị D-glucoza, là chất nhận gốc
phosphat. Thường tên hệ thống dài và khó gọi, nên các tên gọi truyền
thống vần được sử dụng phổ biến, ví dụ: enzym xúc tác phản ứng trên có
tên gọi ngắn gọn và dễ nhớ là hexokinaza.
Enzym cũng còn được phân loại dựa trên thành phần cấu tạo. Các
cnzym chỉ có phần protein được hiểu là enzym đơn thuần, ngược lại, với
t'.nzym phức hợp bao gồm phần protein cộng với một phân tử hữu cơ
tương đốì nhỏ. Enzym phức hđp được hiểu là holoenzym. Trong thuật
ngũ này, thành phần protein được hiểu là apoenzym, trong khi đó phần
còn lại không phải protein được hiểu là coenzym hoặc nhóm tiền chất,
mà nhóm này trong phức hợp enzym, các phân tử hữu cđ nhỏ liên kết với
apoenzym bằng liên kết đồng hoá trị; còn khi liên kết giữa apoenzym và
các thành phần không phải là protein không phải là liên kết đồng hoá
trị thì các phân tử hữu cơ nhỏ này được gọi là coenzym.
Các thành phần không phẳi là protein của một enzym có thể đơn giản
như ion kim loại, hoặc phức tạp như một phân tử hũu cơ nhỏ không phải là
protein. Các enzym đòi hỏi có ion kim loại trong thành phần của nó dược
hiểu là enzym kim loại (mctallo - enzym) nếu chúng liên kết và giữ lại các
nguyên tố kim loại ái lực cao. Còn đôi với các enzym có ái lực thấp hơn đôi
với ion kim loại, nhưng vẫn đòi hỏi phải có ion kim loại mới hoạt động thì
được gọi là enzym được hoạt hoá kim loại (metal - activated enzymes). Chi
tiết xem Website (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/).

CÂU HÒI ÔN TẬP CHƯƠNG 1

1. Vì sao enzym là chất xúc tác sinh học?
2. Hãy trình bày hai đặc trưng cơ bản của enzym.
3* Y nghĩa của việc ứng dụng enzym trong các ngành kinh tê quốc dân.
4. Các nhóm enzym và tính chất sinh hoá của chúng.
5. Hãy trình bày cách gọi tên enzym.
6. Hãy trình bày cấu tạo của enzym.
 Chương 2

SẢN XUẤT ENZYM TỪTHựC VẬT

2.1. SẢN XUẤT ENZYM TỪ HẠT NẢY MẨM (MALT)

2.1.1. Tóm tắt quy trình tạo malt
Từ trước đến nay nhiều loại enzym từ hạt nảy mầm đă được ứng
dụng rộng rãi như quá trình sản xuất mạch nha (từ thóc, ngô nảy mầm)
sản xuất bia (từ hạt đại mạch nảy mầm), các hỗn hợp bột enzym
amylaza, proteaza, lipaza từ ngô, đậu, đại mạch và một số h ạ t ngũ cốc
khác nảy mầm được dùng vào phối chế các loại bột dinh dưỡng giàu men
tiêu hoá cho trẻ em, ngưòi kém tiêu hoá và ngưòi già.
Hạt dược nảy mầm và sây khô mà vẫn giữ được các hoạt lực của enzym
do quá trình nảy mầm tạo ra hay giải phóng ra gọi là malt. Sau đây là quy
trình chung sản xuất các loại malt và được dùng rộng rãi các loại enzym
tạo ra nhiều nhất là malt đại mạch. Vì vậy chúng ta có thể thấy đây là
khâu chủ ycu cần chú ý nhất khi sản xuất enzym từ các loại hạt nảy mầm
đã và đang được áp dụng ở nước ta và các nước trên thế giới.

Hỉnh 2.1. Cây vả hạt dại mạch

2.1.2. Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại và bảo quản nguyên lỉệu
hạt đại mạch
a) Thu nhận, x ử lý, làm sạch nguyên liệu
Nhằm loại tạp chất (rđm rác, đất cát,...), xác định, phân loại chất
lượng, sô'lượng đại mạch để bảo đảm đúng chất lượng m alt sau này.
Phương pháp: Dùng các thiết bị vận chuyển (xe chở, gầu tải,...) đưa
đại mạch lên các thiết bị làm sạch, phân loại,... (chủ yếu là loại sàng
rung, sàng chuồi, quạt gió,...).

17
 b) P h ân loại và bào quản
Nhằm phân loại đại mạch theo đúng chất lượng đại mạch yêu cầu
kỹ th u ật của dây chuyền sản xuất.
Phương pháp: - Bằng cảm quan (màu sắc, độ chắc, độ chín...)-
—Phân loại theo kích cỡ, độ ẩm,...
1) Phân loại theo chiểu rộng của hạt bằng sàng (chiểu dài hạt < (ị) lỗ
sàng < chiều rộng hạt).
2) Phân loại theo chiều dài của hạt bằng sàng (chiều dài lỗ sàng >
chiểu dài hạt, chiểu rộng lỗ sàng < chiểu rộng hạt).
3) Phân loại theo chiều dài trong thùng phân loại.
4) Phân loại theo khôi lượng (loại hạt lép, xanh, nhẹ) bằng quạt.
5) Phân loại theo độ ẩm (hàm lượng nước): w > 15,5%: ẩm phải sấy
lại, w - 13 - 14% là vừa,...
c) Sấy đ ạ i m ạch đ ể bảo quản
Khi tiếp nhận, hàm lượng nưóc (W) đại mạch > 17%, bắt buộc phải sấy:
- Giảm hàm lượng nước xuông còn khoảng 13% - 14%.
- Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật.
- Duy trì tình trạng ngủ sinh lý của hạt (là tình trạng tự hạn chế sự
nảy mầm của hạt sau khi đã chín và thu hoạch.
- Tiêu diệt các côn trùng, vỉ sinh vật đã nhiễm.
Đại mạch sau khi làm sạch, phân loại và được chứa riêng từng loại
trong các thùng chứa khác để bảo quản hay đưa đi chế tạo malt.
d) Cảc quá trìn h xảy ra khi bảo quản
- Quá trình hô hấp của hạt:
Đây là một quá trình sinh ìý bình thưòng của h ạ t khi bảo quản, đó
là sự trao đổi năng lượng cho sự sông của hạt.
H ạt hô hấp hiêu khí; Tiếp nhận 0 2 của không khí, thải C 02, H20 và
nhiệt lượng.
H ạt hô hấp yếm khí: Khi không có 0 2, h ạt tự sử dụng chất dinh
dưỡng của mình (các đường trong nội nhũ), thải ra C 02, alcol (C2H5OH)
và nhiệt.
Quá trình hô hấp là nguyên nhân cơ bản dẩn đến sự toả nhiệt, vón
cục và hư hỏng của hạt (nếu không được kiểm tra và xử lý thường kỳ).

18
 - Quá trình hút ẩm:
Bản chất của hạt (đại mạch) là khô và háo nước. H ạt hút ẩm của
môi trường làm tăng hàm lượng nước, thúc đẩy các quá trình sinh hoá
trong hạt tiến triển (hô hấp, thuỷ phân,...) dễ dẫn đến làm giảm chất
lượng hay hư hỏng hạt khi bảo quản.
Trong bất cứ một trường hợp nào, khi hàm lượng nước (hạt) bảo
quản trên 13% thì đều phải được sấy khô (t° = 40 - 45°C) đến 13 - 14%,
cho bảo quản tiếp hay đưa đi chế tạo malt.
- Các chế độ cần thiết khi bảo quản:
+ Thông gió, đảo hạt khi cần thiết.
+ Kiềm tra nhiệt độ, độ ẩm của hạt và kho thường kỳ.
2.1.3. Quá trình chế tạo malt
Malt là một sản phẩm không tồn tại trong giới tự nhiên, nó là một
sản phẩm nhân tạo: cho hạt nảy mầm và sự nảy mầm được dừng lại
bằng sấy.
M ục đích: Mục đích chính của quá trình tạo m alt là tạo ra, giải
phóng, hay tăng hoạt lực của các enzym chả yếu để ứng dụng nó vào quá
trinh thuỷ phân các hợp chất cao phân tử như tinh bột, protein,... để ứng
dụng vào các quá trình tạo ra các sản phẩm tiếp theo cho lên men
đường, hay sản phẩm dễ tiêu hoá để tạo ra các sản phẩm cuổì cùng khác
nhau tuỳ theo mục đích sủ dụng malt khác nhau, Nếu từ hạt đại mạch
thì biến hạt đại mạch thành sản phẩm giầu các enzym xúc tác sinh học,
có hương vị thích hợp, màu sắc mong muốn cho loại bia hay rượu sẽ sản
xuấ"t sau này.
Malt tạo ra từ các loại hạt khác nhau có tên hạt kèm theo như: Malt
đại mạch, m alt thóc tẻ, malt thóc nếp, malt ngô, m alt đậu xanh, đậu
đen,...
Quá trình chế tạo malt bao gồm các bước: ngâm hạt, nảy mầm, sấy
m alt tươi, tách mầm và bảo quản malt khô.
a) Quá trìn h ngâm hạt
M ục đ ích : Để hạt tự hút đủ nước trương nỏ và đủ độ ẩm cần thiết
cho sự chuẩn bị nảy mầm, nảy mầm và nuôi sống mầm.
1) Các b iến đổi cơ bản của hạt khi ngâm
- Vổi độ ẩm trung bình 13% - 14%, hạt chỉ đủ nước để duy trì các tế
bào sống.

19
 - Khi ngâm, nước ngấm vào hạt (thẩm thấu), làm thể tích hạt tăng
(trung bình 1,45 lần), đưa các enzym vê trạng thái hoạt dộng và hoạt
động mạnh dần, nó thuỷ phân các chất dự trữ cao phân tử trong hạt
(tinh bột, protein, pentoza....) không hoà tan thành các sản phẩm phân
tử thấp hoà tan (các đường, amino axit,...).
- Lượng nước ngấm vào khi ngâm (được gọi là “nước tự do”, trung
bình từ 29 - 34%) hoà tan các chất hoà tan trong hạt (đã sẵn có và các
sản phẩm do enzym thuỷ phân) dể nuôi mầm sống và phát triển.
- Lượng nước có sẵn trong hạt và lượng nước ngấm vào khi ngâm
(nước tự do) biểu thị độ ẩm của hạt sau khi ngâm được gọi là “mức dộ
ngâm”. Mức dộ ngâm malt vàng là 42 - 44%, còn malt đen là 44 - 45%.
- Tốc độ ngấm nước tống nhanh ở thòi gian dầu của quá trình ngâm
và sau dó giảm dần và cuối quá trình tăng không đáng kể: Tốc độ ngấm
nước phụ thuộc vào nhiệt độ nước ngâm, mức độ thông khí của thiết bị
ngâm, kích thước của hạt ngâm.
- Tổn hao chất khô của hạt (do hạt hô hấp, do tan vào nước ngâm,...).
Ngâm đạí mạch

ìL p rTrửr đai
r n tri Làmsach
r ~ 1[_p n Trữ
rn n
• lì--II
mạch sạch
UUUUL

Đại mạch ngâm nước

Khi tái - / Khl thải h2o

sử dụng

□
Không
Ngâm này mầm
khi mới
Khl vào *_ Ngăn dưới
1LLKW
Khống khi nóng

Hinh 2.2. Quá trình sản xuất enzym tứ hạt nảy mầm (tạo malt)

20
 Vò tráu Ax" 9'bborillic

Vó ngoầl

Aleuron

Vày nhỏ
Nội nhũ chưa biển đổi

NỘI nhũ đâ biến đổ.

A B

Hinh 2.3. Sơ đố biểu diễn trạng thái hạt đại mạch khi nảy mẩm
A. Hạt đại mạch nảy mầm; B. Sơ đồ cấu tạo hạt đại mạch này mầm

0 6 24 27 45 50 58 74 73 giờ 24 27 46 50 64 74 76
a-amylaza p-amylaza

Hinh 2.4. Đổ thị chỉ sự tăng hoạt lực (H) của ct-amylaza và p-am ylaza
của hạt đại m ạch phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian ngâm.
I - Nhiệt độ nước ngâm 15°c, II- Nhiệt độ nuớc ngâm 21°c (Theo Narziss và Frendrich 1990)

T h ứ tự ngày ngâm J 2 3

T h ứ tự giò ngâm 6 12 18 24 G 12 18 24 6 12 18
ị! ỉ1 ị1 ị1 ị1 ị1
T hòi gian ngâm

Hơi nước

Thổi khí 1. T ố c độ hút

----------------------------------------------- V?---
tí iĩ í í tt tt tt tt tt tt tt tt ít
nước của hạt
Đ ồ thị ngâm ngước 40
2. S ự biến đổi
30
20
✓ * đ ộ ẩm của hạt

V trong quá trinh

10
ngảm

Hình 2.5. Biểu đố ngâm malt

21
 2) Các p h ư ơ n g p h á p ngâm
—Ngâm trong nước.
—Ngâm trong nưốc và không khí gián đoạn, liên tục.
—Ngâm bằng phương pháp tưới phun nưốc, tưới phun không khí.
3) T h iế t bị ngâm : (Ngâm trong nước và không khí gián đoạn)
Thùng ngâm hình trụ, đáy hình chóp nón làm bằng thép, bêtông.
Đại mạch và nước cùng đi vào thùng ngâm. Hạt nhanh chóng ngấm
nước đủ (cho các quá trình sinh hoá xảy ra) cho quá trình nảy mầm bắt
dầu xảy ra (25 - 30%).

Hình 2.7. Mặt cắt của một thùng ngâm hạt

hình trụ đáy côn

1. Ống trục có chân vịt đẩy;
2. Camera thóc lép; 3. Nước
sạch; 4. Nước bẩn và 5. Đại
mạch đã rửa sạch.
1. Đưòng ống dẫn khi nén vào; 2. Trục nâng
lên/ xuống kiểu Geyser; 3. Đường ống đục lỗ
cố định, 4. Tay quay kiểu Geyser; 5. ống chảy
tràn; 6. Van xả đáy; 7. Đường ống dẫn nước
sạch và 8. Đường ống thu hổi nước sạch.

b) Rửa h ạ t và hoá chất thường dùng sát trùng hạt trước kh i ngâm
Trước khi ngâm hạt để loại bỏ bốt đất, cát, bụi hay vi sinh vật bám
vào bề mặt hạt cho quá trình ngâm hạt đạt chất lượng cao hơn. Người ta
có thể dùng các hoá chất như sau và thiết bị rửa hạt như hình 2.6.
- CaOCl2, Ca(OCl)2, HCHO (focmalin) 40%: 700g/lcm3 HoO.
- HọSO ị, KM n04: 10 - 15g/lcm3 H20.
- Ca(OH),: 2 - 3 lít/100kg hạt.
- CaOCỊ,: sát trùng mạnh, kích thích sự nảy mầm nên hay dùng,
thường sử dụng 40g CaOCl2 33% cho 100kg hạt.

22
 Nưốc vôi [Ca(OH)J chỉ dùng sát trùng khi rửa lần 2, không dược cho
vào cuối giai đoạn ngâm hạt.
c) N gâm h ạ t
Thiết bị ngâm hạt được minh hoạ hình 2.7. Sau 48 giờ, hàm lượng
nước (W) đạt 42 - 46% là lượng nưốc đủ cho sự nảy mầm và nuôi sống
mầm sau này (thời gian ngâm phụ thuộc vào nhiệt độ nước). Khí nén
thường xuyên được đưa vào (qua ống sục khí 4) để thông khí cấp oxy cho
hạt và thải C 0 2 ra khỏi khối hạt ngâm). Quá trình ngâm kết thúc khi rễ
con bắt đầu nhú ra khỏi vỏ hạt (48 —72 giờ).
ớ đây đo ngâm, hạt trương nở và dần hút đủ nước, thể tích hạt tăng
trung bình 1,45 lần. Nước ngấm vào hạt bằng cách thẩm thấu và tốc độ
ngấm nước tăng nhanh thòi kỳ đầu (khoảng 24 giờ) sau đó chững lại và
giảm dần,... khoảng 48 giờ sau đạt 42 - 47%.
Thực sự quá trình nảy mầm bắt đầu từ khi hàm lượng nước của hạt
đạt 25 - 30%.

Hình 2.8. Sơ đố biểu thị khả năng tạo enzym của hạt đại m ạch khi nảy mầm
ỏ các vùng khác nhau
(Số chỉenzym: 1. Endo - [ỉ -gluconaza; 2. a - amylaza; 3. Proteinaza;
4. Phosphataza vả 5. [3-amylaza).

Sự hoạt động của các enzym:

- Hạt khô (độ ẩm dưối 13%) các enzym hầu như “nghỉ” (không hoạt dộng).
- Khi ngâm (dộ ẩm tăng lên 25 - 30%) các enzym được “đánh thức”
Lrở lại trạng thái hoạt động, được giải phóng tự do và tại nhiệt độ, dộ ẩm
thích hợp nó hoạt động mạnh nhất: Kết quả là các chất dự trữ cao phân
tử không hoà tan (tinh bột, protein,...) bị thuỷ phân thành các chất hoà
Lan. Nước hoà tan các chất hoà tan đưa đi nuôi sống mầm.

23
 - Không những chỉ hoạt động mạnh mà do kết quả của các quá
trình hoá lý, sinh hoá, lý học,... xảy ra liên tiếp, lượng các enzym tăng
lên đáng kể (cả sô" lượng, chất lượng) đó cũng là mục dích biên đại mạch
thành malt.
Đáng lưu ý nhất là các enzym xúc Lác quá trình hô hấp (sự hô hấp
của hạt gắn liền với sự sử dụng oxy: lkg đại mạch cần 63mg oxy và thải
86mg CQ2) quá trình thuỷ phân pentoza, tinh bột, protein,...
Sau dây là các đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt lực enzym khi
ngâm hạt:

(A) (B)

(C)

Hình 2.9. Sự tăng hoạt lực của enzym proteaza trong hạt đại mạch phụ thuộc vào
nhiệt độ và thời gian ngâm (theo Narziss, Friedrich, 1980)
(A) Proteaza; (B) Dipeptidaza; (C) Leucinaminopeptidaza.
H. Hoạt lực enzym (tính theo đơn vị hoạt lực)

2.1.4. Q uá trin h nảy mầm

a) Kỹ th u ậ t cơ bản của quá trìn h nảy m ầ m

Quá trình này là giai đoạn dầu tiên đố tạo điều kiện thuận lợi cho
hạt nảy mầm. Trong thời gian nảv mầm, các quá trình sinh lý, sinh hoá
và hoá lý xảy ra rất mạnh, nhò dó m à'hạt đại mạch chuyển dần sang

24
hạt malt. Ỏ giai đoạn dầu của thời kỷ nảy mầm, trong hạt tiến triển các
quá trình sinh lý, sinh hoá cũng tương tự như trong tự nhiên hạt nảy
mầm Lrong lòng đất. Với điểu kiện độ ẩm, nhiệt độ và oxy đầy đủ, thích
hợp, phôi sẽ phát triển rất mạnh. Phôi là cơ quan dầu tiên của cây non
sau này. Các rễ khi phát triển sẽ di ra khỏi các lớp vỏ và tiếp tục phát
Iriển bên ngoài, mầm sẽ phát triển ỏ bên trong vỏ. Lượng thức ăn cần
thiết cần cung cấp cho phôi phát triển sẽ dược lấy từ nội nhủ, ở dó cỉưỏi
tác dụng của các hệ thông enzym hoạt dộng, các chất dự trữ ở dạng cao
phân tử sẽ trở về dạng những chất hoà tan.
Những chất hoà tan này dược vận chuyển đến phôi đố nuôi phôi,
dồng thời một phần l)ị oxy hoá và tạo them năng lượng cần thiết cho hạt,
một phần khác được sử dụng vào những quá trình tạo thành những tế
bào mới.
Quá trình xâm nhập và hoạt dộng của các hệ IhôYig enzym trong nội
nhũ nhằm phá vỡ các chất dự trữ có cấu tạo phức tạp thành những chất
hoà tan không bị dừng lại, nếu trong mộl thòi gian nhất định ta hạn chê*
hay thậm chí tạm ngừng hẳn sự cung cấp oxy. Do đó ta có thổ hạn chế
sự hô hấp, làm yêu sự phát triển của rỗ và không cho mầm phút triển
quá lớn. nghta là ta giảm bỏt sự tổn thất chất khô của hạt. Trong Ihời
gian này, các enzym vẫn tiếp tục hoạt động (trừ enzym oxy hoá) nhằm
phục vụ mục đích của con người - tạo thành malt. Đây chính là chỗ khác
biệt giữa nảy mầm nhân tạo và náy mầm tự nhiên.
Khi nảy mầm, trong hạt dại mạch sẽ xảy ra những quá trình chủ
vếu sau đây:
1) S in h lý: Sự phát Iriển của mầm đồng thòi vối sự hô hấp và sự
tống hợp một sô chất mới.
2) S in h hoá: Thuỷ phân các chất dự trữ trong nội nhũ.
3) Hoá học: Tác dụng tương hỗ giữa các chất tạo thành sau khi
thuỷ phân, hình thành các chất thơm, vị ngọt.
4) Lý học: Việc vận chuyển các chất dự trữ hoà tan từ nội nhũ di
nuôi mầm và ngược lại.
Đây chính là quá trình chủ yếu xảy ra khi hạt nảy mầm, nhò những
quá trình này mà hạt dại mạch chuyển dần thành hạt malt.
b) S ự h ìn h th à n h và h oat động của các hệ enzyrn ưà dồng
thời n h ữ n g q u á tr ìn h sin h hoá xảy ra trong thời g ia n n ả y m ầm
Ta biết rằng, ở các hạt đại mạch dã dạt độ chín kỹ thuật thì các

25
enzym thường nằm ở dạng liên kết (không hoạt động), chúng bị hấp thụ
trong những tế bào của hạt. Trong quá trình nảy mầm, chúng được giải
phóng khỏi dạng liên kết và trở về dạng tự do (hoạt động mạnh), đồng
thời ỏ vùng phôi hình thành những enzym hoạt động mới - đặc trưng cho
quá trình nảy mầm của hạt đại mạch. Ta thấy có các enzym sau đây:
1) Enzym oxy hoá
Sự xâm nhập và hoạt động của các enzym oxy hoá là bước đầu
chuẩn bị cho cốc quá trình sinh hoá sau này của sự nảy mầm. Trong các
nhóm enzym xúc tác cho quá trình oxy hoá - khử, khi hạt hô hấp có
những enzym như oxydaza, peroxydaza và catalaza. Khi hạt hô hấp, nhò
oxy không khí và tác dụng của oxydaza sẽ tạo thành nước và C 02;
peroxydaza sẽ tạo thành với C 02 một phức chất, phức này sẽ hoạt động
mạnh và có khả năng chiếm hydro lớn; catalaza sẽ giúp cho quá trình
phá vỡ C 02, từ đó sẽ giải phóng ra 0 2. Hoạt tính của các enzym oxy hoá
lăng lên khá mạnh trong quá trình nảy mầm. Ví dụ: theo sự nghiên cứu
của các nhà bác học cho ta thấy rằng, nếu so sánh hoạt tính của catalaza
của hạt đại mạch ngâm và hạt malt tươi thì lượng 0 2 thải ra tăng 4 lần
(từ 97ml táng lên 382ml). Hoạt tính của peroxydaza tãng lên có chậm
hơn một chút. Hoạt tính của oxydaza tăng lên khá mạnh. Do hoạt tính
của các enzym oxy hoá tăng lên như vậy, nên quá trình hô hâp của hạt
cũng m ạnh hơn - cường độ của sự hô hâp sẽ phụ thuộc vào nhiệt độ và
lượng 0 2. Trong một giối hạn nhất định (10 - 30°C), nhiệt dộ tăng thì
cưòng độ hô hấp tăng, đồng thòi hoạt tính của các enzym oxy hoá và một
số enzyin khác cũng tăng, dẫn đến sự tổn thất một lượng chất khô.
Lượng 0 2 nhiều quá cũng dẫn đến kết quả tương tự. Ngược lại, C 02 thải
ra khi hạt hô hấp sẽ kìm hãm quá trình hô hấp: ở giai đoạn đầu của sự
nảy mầm, C 0 2 sẽ tác dụng lên cả những enzym thuỷ phân các chất dự
trữ trong hạt; ỏ giai đoạn hai, chúng trực tiếp tác dụng lên các enzym
ấy, Ihậm chí chúng đình chỉ tác dụng của các enzym thuỷ phân, khi đó
chi còn có sự hô hâ'p. Nhờ vậy, lượng chất khô Lổn thâ't sẽ giảm bót, mà
không ảnh hưởng gì đến châ't lượng malt.
Quá trình hô hấp của hạt kèm theo sự thải nhiệt - do sự oxy hoá
hoàn toàn các đưòng mà thải ra một lượng nhiệt khá lớn (673kcaỉ/g phân
tử dường). Trong hạt đại mạch ngâm có khoảng 2 - 3% đường tính theo
chất khô. Trong quá trình nảy mầm do sự thuỷ phân các chất dự trữ mà
híợng đường còn tăng thêm khoảng 20%. Khoảng một nửa (9 - 10%)
lượng đường bị hao tổn do hô hấp, 3 - 4% hao tổn cho sự phát triển của

26
rỗ và lượng còn lại đi vào thành phần của malt, Qua đó ta nhận thấy
rằng, quá trình hô hấp đã tiêu thụ một lượng đường khá lớn, ngoài việc
oxy hoá các đưòng, ta thấy còn tạo một sô axit hữu cơ như axit oxalic
hay axit xitric.
Trong malt, ngoài 2 axit hừu cơ trên, còn có các axit malic, lactic,
sucxìnic, formic, axetic, propionic và một sô' axit khác. Một sô' đã có sẵn
trong đại mạch, nhưng phần lớn là hình thành trong khi nảy mầm. Nếu
lượng 0 2 không cung cấp đủ, đặc biệt ỏ giai đoạn đầu của quá trình nảy
mầm, thì sự hô hấp sẽ bị đình trệ, khi đó sẽ xảy ra hiện tượng hô hấp yếm
khí, kết quả sinh ra rượu etylic và co*. Với một hàm lượng ethanol nhất
định, các tế bào sông sẽ bị ức chế và đình chỉ sự phát triển của mầm.
Hiện tượng hô hấp yếm khí thực chất là quá trình lên men rượu, cho
phép ta kết luận rằng, trong hạt đã hình thành tập hợp enzym zymaza.
Những sản phẩm sinh ra do oxy hoá đưòng (các axit hữu cd) sẽ tác
dụng tương hỗ với sản phẩm của sự lên men rượu (e ty lie) và sinh ra các
este. Chính vì vậy trong malt tươi thường có mùi thơm đặc trưng.
Tỷ sô" tương hỗ giữa cường độ của các dạng hô hấp được thể hiện
bằng hệ số hô hấp CCyOz. ở điều kiện hô hấp bình thường thì C0.y02 = 1.
Nhưng ở những giai đoạn khác nhau của quá trình nảy mầm, do kết quả
của sự oxy hoá không hoàn toàn và sự hô hấp yếm khí nên hệ sô' này sẽ
thay đổi. Oxy hoá không hoàn toàn các chất đường cũng như oxy hoá
nhũng chất ít oxy hơn đường như protein sẽ dẫn đến chỗ hạ thấp hệ số
hô hấp. Khi hô hấp yếm khí và đặc biệt trong trường hợp khi hô hấp, hạt
dùng nhiểu chất có khả năng oxy hoá mạnh như các axit hữu cơ, khi đó
hệ sô" hô hấp sẽ cao hơn 1. Sự khác nhau giữa nảy mầm và ngâm h ạt là ở
chỗ hệ số hô hấp khi ngâm thưòng lân hơn 1. Khi nảy mầm, hệ số hô hấp
thường di chuyển trong giới hạn 0,74 - 1, Điểm này nói lên rằng, khi
nảy mầm do oxy hoá không hoàn toàn các đưòng và các chất ít oxy hơn
sẽ có hiện tượng không sử dụng, hoặc sử dụng ít oxy không khí hdn. Sự
hình thành nhiều axit hữu cơ đã chứng minh điều đó.
2) Enzym sitaza
Như ta đã biết, sitaza là một tập hợp enzym, gồm sitoplastaza và
sitaza, những enzym này sỗ phân cắt hemixenluloza và các chất ỏ dạng
sáp, keo, cho ra những sản phẩm có gốc C5 và C(j và một số sản phẩm
khác. Trong quá trình nảy mầm, hoạt tính của sitara tăng khá nhanh.
Sự phân cắt hemixenluloza nhờ sitaza khi nảy mầm đại mạch là một

27
quá trình khá quan trọng trong sản xuất ĩĩialt. Nhờ có tác dụng của sitaza
mà màng ngăn cách giữa nội nhũ và vỏ trấu bị phá vỡ, sau đó cấc enzym
khác mới có điểu kiộn để xâm nhập vào nội nhũ và dễ dàng hoạt động.
3) Enzym am ylaza
Tập hợp enzym amylaza gồm có: a - amylaza, (3 - amylaza, amylo -
phosphataza, chúng tập trung chủ yếu ở nội nhũ và phần dưồi của nội
nhũ. Ngoài ra, còn một ít nằm trong màng ngăn giữa nội nhũ và vỏ trấu.
Hoạt tính của a - amylaza bắt đầu tăng mạnh ỏ giai đoạn đầu của
nảy mầm, đặc biột mạnh sau ngày thứ 3 - 4 , thòi gian để có được cực đại
và hoạt tính của a - amylaza phụ thuộc vào nhiệt độ, ví dụ: õ 12 - 14°c
sau 1 1 - 1 2 ngày, ở 18 —20°c sau 6 - 7 ngày, ở 25 - 28°c sau 4 - 5 ngày.
Trong quá trình nảy mầm, hoạt tính của a - amylaza tự do tăng lên
A - 8 lẩn.
Thành phần thứ hai trong tập hợp enzym amylaza là p - amylaza,
chúng thường có trong hạt đại mạch chín ở dạng liên kết cũng như ở
đạng tự đo. Trong quá trình nảy mầm, hoạt tính của p —amylaza tự do
tăng ìôn 3 - 4 lồn.
Trong hạt đại mạch chín không có chứa amylophosphataza tự do,
enzym này hình thành sau ngày thứ hai của quá trình nảy mầm, sau
8 ngày thì đạt đến cực đại - so vối ban đầu, số lần tăng có thể lên đến
1 5 - 2 0 lần.
Sự tảng hoạt tính của các thành phần của tập hợp amylaza khi nảy
mầm được thể hiện bằng sự tăng hoạt tính chung của amylaza, ta ký
hiệu là DC (lực diasta), DC được xác định bằng lượng maltoza tạo thành,
thưòng được thể hiện bàng đơn vị của Windish - Kolbach (°WK) hay đơn
vị của Lintner (°L). Liên hệ giữa hai đơn vị này như sau:
0l _ UWK + 16
L ---------------
3,5
Tác dụng của amylaza đến các quá trình sinh hoá khi nảy mầm và
dặc biệt trong quá trình đường hoá sau này có một ý nghía hết sức quan
trọng trong sản xuất bia, rượu,...
Mục đích của quá trình nảy mầm là tích tụ được nhiều amylaza
hoạt động, để đến khi đường hoắ chúng có thể chuyển tinh bột thành
những sản phẩm trung gian hoà tan hoặc các đường đơn giản.
Amylaza hoạt động bắt đầu gây sự thay đổi thành phần của đại
mạch ngay từ khi nảy mầm, một phần của tinh bột bị phân cắt thành

28
dextrin và đường. Tỷ lệ khối lượng giũa hai chất này phụ thuộc chủ yếu
vào nhiệt độ. Dù rằng ở giai đoạn CUỐI của nảy mầm, nhiệt độ thấp hơn
nhiều so với nhiệt độ tối thích của amylaza, song vẫn gần vối nhiệt độ
tối thích của p - amylaza, do đó thưòng lượng dường thu được sẽ nhiều
hớn. Khi nhiệt dộ tăng thì lượng dextrin tạo thành cũng sẽ tăng, mặt
khác, thường pH của hạt là 6,0 tương đốí gần với pH tối thích của
p - amylaza (pH = 5,0) hơn là của a - amylaza (pH = 4,36).
Cùng với sự thuỷ phân tinh bột và tạo thành maltoza, maltotrioza,
maltotetraoza,... và sau đó nhò maltaza tạo thành glucoza, khi nảy mổm
chúng còn tạo thành một lượng đáng kể saccaroza và một ít đường fructoza.
Trong khi nảy mầm, khôi lượng tinh bột giảm khoảng từ 4,0 - 5,0%.
Theo sô' liệu của Bungakov, tinh bột trong đại mạch có 62,7%, sau
khi nảy mầm giảm xuốíng còn 57,3% tính theo chất khô. Lượng chất khô
hao tổn này chủ yếu do hô hấp và tạo rễ.
Hàm lượng của các chất đưòng hoà tan trong malt thường lớn gấp
3,5 lần so với trong dại mạch. Thường dại mạch có từ 2,3 - 2,5% đưòng,
trong malt tươi có khoảng 8,5 - 9,0%. Đường chủ yếu trong malt là
saccaroza (4,0 - 4,5%), glucoza (2,0 - 2,5%), maltoza (1,5 - 2,0%) và
fructoza (1,0 —1,5%). Ngoài ra còn chứa một ít đường hoà tan bậc thẩp
(fructazan và glucozan). Đường rafinoza không tìm thấy.
4) Enzym proteaza
Hoạt tính của proleaza trong hạt đại mạch không đáng kể. Song
trong quá trình nảy mầm, hoạt tính đã tăng lên khá nhanh. Sự gia tăng
hoạt tính proteaza phụ thuộc vào đặc tính của giông đại mạch và điều
kiện nảy mầm. Theo J. Declerck, khi nảy mầm, hoạt tính của proteaza
tảng 4 lần. Theo sự nghiên cúu của Waldschmit - Leitz và một số tác giả
khác cho thấy ràng, trong đại mạch khô không có proteaza hoạt động,
khi ngâm có tăng lên đáng kể và khi nảy mầm hoạt tính dã tăng lên
8 lần; cũng theo các tác giả trên thì peptidaza bắt đầu hoạt động ở giữa
quá trình nảy mầm.
Hoạt tính của proteaza tăng nhanh hơn của amylaza, Hoạt tính này
thường đạt đến cực đại sau ngày thứ năm của quá trình nảy mầm.
Dưới tác dụng của proteaza, protein sõ thuỷ phân đến những sản
phẩm trung gian hay các sản phẩm cuổì cùng như amino axit. Đầu tiên,
chúng phá vỡ các chất protein dự trữ trong các tế bào của nội nhũ nằm
gần màng ngăn cách, sau đó phá vd đến protein của tế bào nội nhũ ngay
giữa trung tâm. Protein của màng ngăn cách không bị biến đổi trong quá

29
trình nảy mầm cũng như trong các quá trình chế biến vể sau, chúng sẽ
cùng với protein không bị phá vỡ của trung tâm nội nhũ đi theo bã malt.
Sự thuỷ phân protein bát đầu bằng tác dụng của proteinaza và đầu
tiên sẽ tạo thành albumo —pepton, sau đó là polypeptit, đipeptit và dưới
Lác dụng của peptidaza, chúng sẽ trở về dạng amino axit. Tuy nhiên,
không phải lúc nào trong quá trình nảy mầm, sự thuỷ phân protein
cũng xảy ra hoàn toàn, mà phụ thuộc vào điểu kiện nảy mầm có thể cho
ta nhiều sản phẩm trung gian hay sản phẩm cuối cùng.
Trong quá trình nảy mầm ta không tạo được điều kiện tôi thích cho
hoạt dộng của proteinaza và peptidaza. Nhiệt độ rất xa với nhiệt độ tối
thích, song nó cũng tương đối gần với nhiệt độ tối thích của peptidaza (dưới
50°C) hơn là của proteinaza (60°C). pH của hạt cũng khác xa với pH tối
thích của hai enzym trên, pH tôì thích của proteinaza là 4,5 —5,0 và của
poptidaza là 7,6 - 8,0, Vì rằng nhiệt độ nảy mầm tương đối thấp và thòi
gian tương dối dài nên sự thuỷ phân protein khì nẫy mầm tương đổi sâu xa
- dẫn đến chỗ tạo thành một lượng khá nhiều polypeptit và amino axit.
Kết quả thuỷ phân protein làm tăng lượng các chất chứa N hoà tan
trong nước kổ cả albumo, pepton, polypeptit và amino axit. Một phồn
các chất chứa N hoà tan dễ bị kết tủa khi đun sôi dịch đưdng, một phần
khác vẫn tồn tại ở dạng hoà tan. Như vậy, nửa thời gian đầu của quá
trình nảy mầm là sản phẩm thuỷ phân protein tăng lên liên tục, sau đó
lượng sản phẩm này dừng lại hay giảm đi một ít, điều này có thể giải
thích vì hoạt tính của proteaza đã yếu dần và một phần sản phẩm đã
hao tốn cho sự phát triển của rễ.
Một chỉ sô' quan trọng đặc trưng cho quá trình thuỷ phân protein
khi nảy mầm và nói chung cho mức độ thuỷ phân của m alt là lượng nitơ
íormol. Chỉ sô' này nói lên khối lương sản phẩm đã tạo thành như amino
axit, peptit bậc thấp,... tức là tất cả những chất chứa N, trong đó có
nhóm -COOH tự do.
Lượng ni tơ formol ban đầu trong malt vàng thường từ 125 - 225mg%
tính theo chất khô, nitơ formol do enzym thuỷ phân từ 75 — 175mg%.
Nitơ formol chung từ 200 - 400mg%. Trong malt đen, hàm lượng nitơ
íbrmol ban đầu và ni tơ formol do enzym thưòng cao hơn từ 30 - 40mg%
và nitơ formol chung cao hdn khoảng 60 - 80mg%. Một yếu tô" cố ảnh
hưởng lớn đến các quá trình thuỷ phân protein là nhiệt độ trong khổì
hạt nẩy mầm. Nhiệt độ càng tăng thì quá trình thuỷ phân càng mạnh
và sản phẩm trung gian tạo thành càng nhiều. Nhiệt độ thích hợp nhất

30
cho sự thuỷ phân protein khi nảy mầm là 13 - 16°c, ở nhiệt độ này, sự
thuỷ phân xảy ra sâu xa hơn và ta thu được một tỷ lệ tối thích giữa sản
phẩm trung gian và sản phẩm cuối cùng.
Cường độ thông gió cùng ảnh hương trực tiếp đến sự thuỷ phân
protein, nêu thông gió càng mạnh ở giai đoạn đầu của nảy mầm thì sẽ
Lạo điều kiện tích tụ càng nhiều proteaza hoạt động và sự thuỷ phân xảy
ra hoàn toàn hơn.
Một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân protein khi
nảy mầm là glutatíon, chất này bao gồm glycosol, xistein và axit glutamic:
o
\\
HOOC — CH— CH2— CH2— C— N— CH— C— N — CH.J—CH3
I II I I
nh2 o h c h 2— s h
Nhóm -SH trong glutation tham gia vào các quá trình oxy hoố - khử
và làm tăng khả năng hoạt động của một sô'enzym, đặc biệt là proteaza.
Để đánh giá mức dộ thuỷ phân protein nói riêng hay độ thuỷ phân
của malt nói chung, người ta thường theo dõi một sô" chỉ số’ như nitơ hoà
tan, nitơ của amino axit, nitơ kết tủa cũng như hàm lưdng nitd của
hordein, hoặc những thành phần khác so vứí hàm lượng nitd nói chung.
Sự thuỷ phân protein được coi là bĩnh thường nếu:
- ít nhất có 33% lượng nitơ nói chung ỏ dạng hoà tan.
- Lượng nitơ của amino axit từ 9 - 20% lượng nitơ chung.
- Lượng nitơ của hordein khi hàm lượng proLein từ 9 - 13% sõ chiếm từ
24 - 30% nitơ chung, nếu protein có từ 9 - 10% thì sẽ có 24 - 25% nitơ chung.
- Lượng nitơ kết tủa ở trong giỏi hạn 6 - 9% lượng nitơ chung.
Theo Kolbach (Chỉ số Kolbach), nếu tỷ sô'giữa lượng nitơ hoà tan và
lượng nitơ chung trên 42% thì malt có độ thuỷ phân rấ t tốt, từ 36 - 42%
là tốt, từ 32 - 36% là trung bình và dưối 32% là thuỷ phân kém.
Quá trình nảy mầm kéo theo sự tổn thất protein (do nuôi rễ), trung
bình lượng tổn thất chiếm từ 11 - 12% hàm lượng protein của đại mạch.
5) Enzym esteraza
Trong các enzym xúc tác cho quá trình este hoá khi nảy mầm ta
thấy chủ yếu là tập hợp enzym phosphataza (fitaza, sacarophosphataza,
glyxerophosphataza, nucleotidaza và amylophosphataza). Hoạt tính của
phosphataza (trừ enzym cuối cùng, enzym này nằm trong tập hdp
enzym amylaza) sẽ làm tăng khả năng nảy mầm từ 8 - 11 lần.
31
 Fitaza se phá môi liên kết este của fitin và giải phóng ra axit
inozitphosphoric và axit phosphoric tự do.
OH
C H ọ - O - P == o CFLOH
X OH
n t-Ĩ ỊX H ^ y C H ,— Ọ o h +6Hso HOH* c h 2o h
n L - H .O - k ^ - C H s - n t I/ ' -HOH2C- c h :o h ™
p = 0
CH, nt OH CHoOH
Axit inozitphosphoric Inozit
Sacarophosphataza, glyxerophosphataza' và nucleotitdaza sẽ phá
các môì liên kết este của các chất hữu cơ chứa phosphat tương ứng và
giải phóng ra axit phosphoric tự do. Amylophosphataza sẽ cắt axit
phosphoric của phân tử amylopectin, pH tốì thích cho hoạt động của
phosphalaza tưdng đối gần với pH của đại mạch và của m alt khí nảy
mám. Nhiột độ Lối thích chung cũng gần với nhiệt độ của m alt hơn so vói
các cnzym khác. Nói chung, khi nảy mầm, điểu kiện tương đối thích hợp
cho hoạt dộng của phosphataza.
Do kết qua của các quá trình biến đổi enzym mà lượng các chất hoà
Lan (ta gọi là chất chiết) đã tăng lên đáng kể. Bình thường hàm lượng
các chất hoà tan trong đại mạch có từ 6,5 - 8% tính theo chất khô, khi
náy mầm tăng lên đến 26%, nhưng vì một lượng đã mất đi trong hô hấp
và cho rễ phát triển (10 —20%) do vậy lượng chất hoà tan còn lại trong
malt thường là 14 - 15%.

250 100
Đơn vị y ,
200 7s
go Đơn vị

V'Á
hoạt lực
' B ct-amylaza
dextrinazai50 60
100 40
50 / 20
0
1 2 3 4 5 6 t {Ngày nảy mầm)

Hình 2.10. ĐỔ th ị chỉ sự tăng của enzym dextrinaza tương úmg quan hệ với hoạt lực
của enzym amylaza của hạt dại mạch trong quả trình nảy mẩm
A. «-am yla 2a; B. dextrinaza tương ứng.

Sự tạo thành và giải phóng hệ thông enzym xảy ra cùng với sự sinh
trương của phôi, nhưng sau khi tạo thành, enzym có thể tiếp tục tác

32
dụng của chúng trong những điểu kiện không thuận lợi cho sự phát
triển của phôi. Đa 80 enzym vẫn giữ được hoạt tính của nó ngay cả điểu
kiện phải ngừng thỏ. Điều quan trọng là tốc dụng của enzym không bị
đình trệ trong môi trường yếm khí. Ngược lại, ỏ điểu kiện này phôi sẽ bị
chêt. Người ta ứng dụng điều này để giảm tiêu hao chất khô khi nảy
mầm. Đầu tiên ta cung cấp đủ không khí vào lớp hạt nảy mầm để tạo ra
lượng enzym cần thiết, sang ngày thứ tư và thứ năm ta ngừng cung cấp
không khí và giữ COz trong lớp hạt nảy mầm. Bằng cách này những
biến đổi sinh hoá đạt được sâu xa hơn, đồng thòi tiêu hao chất khô ít hơn
vì rằng hô hấp của phôi bị hạn chế rấ t nhiều trong môi trường C 02.

Malt sim màu (----- )

Malt sáng màu (........... )
400
300
200 Tích tụ enzym cflastaza
100

H. 3
'2
1
0
10 Hj: Độ axit tốngsđ
5 (ml NaOH 1N/100g)

Hình 2.11. Sự táng hoạt lực enzym diastaza, protaaza và phosphataza

trong quá trinh tạo malt

c) N hiệt độ và thời gian nảy mẩm

Nhiệt độ đóng một vai trò đặc biệt quan trọng ảnh hưỏng trực tiếp
đến những biến đổi của enzym trong thời gian nảy mầm. Khi nảy mầm,
nhiệt độ tăng lên đo sự thải nhiệt của quá trình hô hấp. Do sự gia tăng
nhiệt độ mà trong một giới hạn nhất định nó làm tăng quá trình hô hấp
và nhũng biến đổi của enzym, kết quả là tạo điều kiện cho phôi phát
triển mạnh, mầm và rễ chóng nảy mầm, đồng thời lượng chất khô trong
hạt cũng giảm xuống nhanh hơn. Mặt khác, do cường độ hoạt động của
enzym tăng lên mạnh quá làm cho nội nhũ bị thuỷ phân quá mức cần
thiết, điều này gây ảnh hưởng đến hiệu suất chất hoà tan và chất lượng
malt. Vì vậy ta không nên cho nhiệt độ quá cao trong thòi gian nảy
mầm. Ở nhiệt độ thấp hđn, từ 10 —15°c, thì các chất protein thuỷ phân
sâu hơn và nói chung, trong quá trình nảy mầm, protein bị thuỷ phân
sâu và toàn diện hơn trong thời gian đường hoá. Nhiệt độ thấp thích hdp
với sự tạo thành của các enzym hoạt động phân huỷ những hợp chất hữu

33
cơ phosphat. Ví dụ: fitaza ở nhiệt độ thấp hoạt động mạnh gấp 2 lần ở
nhiệt độ cao. Các quá trình sinh hoá và những quá trình khác trong thời
gian nảy mầm tiến triển tốt ở nhiệt độ thấp từ 14 - 16°c. Muôn vậy
trong thời gian nảy mầm phải thường xuyên đảo trộn các lớp hạt và cho
không khí lạnh và ẩm sục vào. Khi độ ấm của hạt xuống dưới 40% thì
các quá trình biến đổi rất yếu. Khi sản xuất malt đen, nhiệt độ nảy mầm
cho phốp cao hơn 17 - 18°c. Đặc Lrưng của malt đen là màu hạt như bị
cháy, vị ngọt và có mùi thơm. Những dặc điểm này có dược là do quá
trình sấy tạo dược nhiều melanoit cần phải có nhiều dường và amino
axit do sự phân huỷ protein tạo nôn, nhất là ở nhiệt độ cao. Nhiệt độ cực
đại đối với sản xuất malt vàng là 18°c và đối với malt đen là 25°c.

Hình 2.12. Sự phát triển của mẩm và rễ trong quá trinh nảy mầm đại mạch
(a) Ngày nảy mẩm 1; (b) Ngày nảy mầm 4; (c) Ngày nảy mầm 7;
(d) Đại mạch ở cuối quá trình nảy mầm.

Thòi gian nay mầm phụ Ihuộc vào nhiệt độ và những đặc trưng của
dại mạch. Bình thường náy mầm kệo dài từ 7 - 8 ngày.
Đối vối sản xuất malt vàng, hạt nảy mầm xong nếu chiều dài rễ của
75% hạt đạt được kích thước bằng 1,5 lần chiều dài hạt; đối với malt đcn
chiều dài rễ phải bằng 2 lần chiều dài hạt. Chiều dài mầm của hạt malt
vàng phái từ 2/3 —3/4 chiều dài hạt; 3/4 — 1 chiều dài hạt đối vối hạt
malt đen.
Trong thời gian nảy mầm, chất khô của hạt bị hao tổn khoảng 10 - 20%.
Trong dó khoảng 6 - 7% do sự hô hấp gây nên và 4 —5% do sự tạo thành rễ.
Cứ 100kg hạt khô (với độ ẩm 14%) thu được 152kg hạt dà ngâm và
sau khi nảy mầm thu được 142kg malt tươi. Một hectolít (hl) hạt khô
thu dược l,45hl hạt ngâm và 2,2hl malt tươi.

34
 d) D ùng chê phârn enzym kích th ích lấy từ n ấ m G ibberella d ể
làm tă n g tốc dộ nảy m ầm
Trong những năm gần đây, ngành sản xuất bia phát triển, do đó
lượng malt sản xuất không kịp để cung cấp, vì vậy người ta có xu hướng
sử đụng những chất kích thích để gây kích thích với hạt, giúp cho hạt
nảy mầm nhanh hơn, rút ngắn được thời gian nảy mầm.
Gibberelin là những chất kích
thích tô' lấy từ nấm Gibberella
fujikuroi. Đầu tiên, một số tác giả
Nhật Bản cách đây khoảng một thế
kỷ có tìm ra một loài nấm gây bệnh
dôi với lúa, làm cho thân lúa phát
triển không đều. Sau đó một số tác
giả khác nghiên cứu và họ thấy rằng, Gibberelin
loại nấm này có tác dụng kích thích
sự nảy mầm của hạt, làm tăng tốc độ nảy hoa và kết hạt,... Chất kích
thích tố đó có tên là gibberelin.
Những chất kích thích tô" quan Irọng nhất là gibberelin A|
(C19H2<Otì), gibberelin A., (C,9H2(iO,,), gibberelin A3 (CiflHjjoOu), gibberelin
A , (CiàH2(i0 5). Trong số những chất trên, hoạt dộng sinh hoá mạnh nhất
là A3 còn gọi là axit gibberelic, axit này kết tinh dưói dạng không màu ở
nhiệt độ 233 - 235°c.
Những kết quả nghiên cứu cho đến hiện nay chứng minh rằng: Dùng
chất kích thích tố axit gibberelic sẽ làm tăng độ hoạt động của các enzym
amylaza và proLeaza lên rất mạnh so với diều kiện nảy mầm bình thường,
làm tăng tốc độ phân huỷ tinh bột và protein, mầm phát triển nhanh hơn,
thời gian đường hoá và hiệu suất chất hoà tan đạt được trong chu kỳ ngắn
hơn. Tất cả những điều này cho phcp rút ngắn thòi gian nảy mầm xuống
khoảng 2 ngày, song nhược điểm của phương pháp này là trong một vài
trường hợp nó gây khó khăn cho quá trình lọc dịch dưòng.
Người ta cũng rút ra một kết luận rằng, axit gibberelic nên cho vào
hạt ngâm ngày cuối cùng, khi hạt bắt dầu trương nở, hoặc ngày đầu tiên
của giai đoạn nảy mầm. Bình thường để sản xuất malt có chất lượng
cao, người ta hay dùng axit gibberelic kết hợp vói bromat kali, glucoza
hay 2,3 bcnzocazol làm kích thích tô' trong giai đoạn nảy mầm. Nảy
mầm có dùng kích thích tố thì các chất dự trữ bị thuỷ phân mạnh hơn
và tạo nên những chất hoà tan trong một thòi gian ngắn. Bình thường

35
thời gian nảy mầm chỉ 5 ngày. Malt gibberelin sau khi sấy và bảo quản
có chất lượng kỹ th u ật cao hơn malt mâu. Chúng đường hoá nhanh hơn,
hiệu su ất chất hoà tan cao hơn và dịch đưòng trong hơn, thòi gian lọc và
dịch đường đạt đúng tiêu chuẩn.
e)Các phương p h á p nảy mẩm
Có hai phương pháp nảy mầm chủ yếu: thông gió và không thông gió.
ỉ) N ảy m ầm không thông gió
Đây là phương pháp cổ điển hiện còn được ứng dụng nhiều trong
những nhà máy bia hiện đại. Cấu tạo và chế độ làm việc của bộ phận
nảy mầm không thông gió như sau: Bộ phận nảy mầm khồng thông gió
thường nằm một nỏa trên m ặt đất hay toàn bộ nằm trên m ặt đất. Tường
dày, cửa sổ nhỏ và sàn nhẵn hơi nghiêng về các mương đẫn nưâc thoát,
phải bảo đảm nhiệt độ từ 10 - 12°c, độ ẩm không khí w = 90%. Vì
những yêu cầu trên mà nhà nảy mầm kiểu này, nếu một nỏa nằm dưới
m ặt đất thì tốt hơn, nếu nằm trên m ặt đất toàn bộ thì phải dùng lạnh
nhân tạo. Điều này gây cho malt bị kh5 nhanh. H ạt sau khi ngâm được
đổ thành từng đông trên sàn, có thể để 5 - 6 giờ hoặc trải ngay cũng
được, lúc đầu chiều dày m alt khoảng 40cm, chiểu dày này giảm dần cho
đến 10 - 12cm trong giai đoạn cuôì. Trong thời kỳ nảy mầm phải bảo
đảm lượng oxy, nhiệt độ và độ ẩm tối thích cho malt phát triển bằng
cách thưòng xuyên đảo trộn lóp malt, thông gió để giải phóng H2C 03 và
cung cấp oxy cho m alt hô hấp, quá trình nảy mầm có thể chia ra làm ba
thời kỳ như sau:
- Thòi kỳ thứ nhất: gồm 2 ngày đầu, trong 2 ngày này, quá trình nảy
mầm từ từ, nhiệt độ táng dần đến 13 - 14°c, mỗi ngày đảo trộn 2 - 3 lần.
- Thòi kỳ thứ hai: gồm 3 ngày giữa, các quá trình tăng mạnh, nhiệt độ
có thể tăng vọt, nhiệt độ cho phép cao nhất đốì với malt vàng từ 16 - 17°c,
đối vói m alt đen từ 19 - 20°c. Mỗi ngày cần đảo trộn 3 - 4 lần.
- Thời kỳ thứ ba: gồm 2 ngày cuối, cường độ các quá trình giảm dần,
nhiệt độ tiếp tục tăng, rễ bắt đầu kém phát triển, mỗi ngày cần đảo trộn
2 - 3 lần.
Cuối thòi gian nảy mầm, rễ hạt dài và có nhiều nhánh con. Rễ dài
khoảng 1,5 lần chiều dài hạt, còn mẩm dài bằng 3/4 hạt. Mầm dài quá
sẽ dẫn đến tổn hao chất khô do quá trình hô hấp; ngược lại, nếu mầm
quá n g ắn chứng tỏ điềư kiện nhiệt độ và độ ẩm cũng như thòi gian nảy
mầm không đảm bảo đúng kỹ thuật. Malt nảy mầm trong những điều
kiện như vậy sẽ có độ hoà tan kém, làm tổn hao chất khô trong quá
trình nấu và đường hoá sau này.

36
 2) Nảy mầm thông gió
Về nguyên tắc, nảy mầm thông gió được tiến hành bằng cách thổi
những luồng không khí đã đi qua bộ phận điều hoà vào lớp hạt.
Không khí bên ngoài thưòng có nhiệt độ cao hơn và độ ẩm thấp hơn
so với không khí cần thiết, đồng thòi không khí này có lẫn nhiều bụi bẩn
và vi trùng, không khí này sau khi đi qua bộ phận điều hoà được hạ
nhiệt độ, làm sạch bụi và vi sinh vật và được bão hoà hơi nước có nhiệt
độ 2 - 3°c thấp hơn nhiệt độ malt, độ ẩm từ 98 —100%. Không khí đả
được bão hoà nhò hệ thống mương kín dẫn đến chỗ nảy mầm. Hệ thông
này phải có chiều dài bé nhất, tránh những chỗ cong và quanh co, mặt
trong mương phải nhằn. Nếu mương dài quá sẽ dẫn đến chỗ hơi nước
trong mương bị ngưng tụ và giữ lại trong mương, vì vậy trong một số
trường hợp người ta làm thêm những hệ thông phun nước phụ trong các
mương dẫn không khí. Không khí từ những hệ thống mương được thổi
qua lốp malt dày từ phía dưới ỉên. Không khí được thổi qua lớp malt
tuần hoàn hay liên tục.
3) Nảy mầm thông gió trong ngán
Phòng nảy mầm gồm 1 dãy hay 2 dãy ngăn hình chữ nhật cách
nhau bởi những tưòng gạch hoặc bêtông, có buồng điểu hoà không khí
và hệ thống mương ngầm dẫn không khí lạnh vào các ngăn (hình 2.13).

Hlnh 2.13. Sơ dồ nảy mầm bằng phưdng pháp bán liên tục

1. Ngân nảy mầm; 2. Măt bằng trống; 3. Măt bằng lấp đầy; 4. Khoang thông khí; 5. Máy đảo
malt kiểu guồng (cũ); 6. Phần đại mạch đang đưọc chuyển ngăn; 7. Thiết bị ngâm hạt; 8. Vít
tài để chuyển malt tươi đi; 9. Qưạt gió và 10. óng thông khí.

Mỗi ngăn có chiều dài từ 10 - lõm, rộng 3 - 4m và cao 1,8 - 2,Om. Tỷ

số giữa chiều dài và chiều rộng từng ngăn thường là 5 : 1. Trung bình mỗi
ngăn có thể chứa 1 0 - 1 2 tấn hạt khô. Đáy ngăn nảy mầm phải làm hơi
nghiêng, cách đáy khoảng 60cm đặt một lưới sắt đày khoảng 2 —3mm, lỗ
lưới có kích thước 1,5 X 20mm. Tổng số’ diện tích lồ lưới khoảng 15 —20%

37
diện tích toàn bộ. Thông thưòng, một phân xưởng nảy mầm có 8 ngăn, cứ
4 ngăn một bên. Buồng điều hoà không khí có thể làm chung cho tất cả
các ngãn hay có thể làm riêng cho từng ngăn. Thứ tự làm việc như sau:
H ạt ngâm xong, đổ chảy tự do vào các ngăn, chiều dày của lớp malt
lúc ban đầu khoảng 60cm, về cuối, chiều dày này có thể tăng lên 80 - 100cm.
Hạt ngâm được đưa vào từng ngăn có mang theo một lượng nước, lượng
nưóc này sẽ chảy qua lưới và theo ống dẫn ra ngoài. Malt được đảo trộn
nhờ máy đậo gồm những trục xoắn ôc, tốc độ chuyển động của máy là
0,4 - 0,6m/phút. Sau khi san bằng các lớp hạt ngâm, tiến hành thổi
không khí khô vào các lớp hạt để chúng làm khô sơ bộ khôi hạt, nhiệt độ
của không khí khô khoảng 14°c, sau 18 - 20 giò chấm dứt sự thổi không
khí khô, Tiếp tục tiến hành thổi không khí lạnh và ẩm qua các lớp malt,
liên tục đảo trộn qua các lớp malt. Luồng không khí lúc đầu phải thổi
mạnh, có nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ malt 2 —3°c, thổi trong 5 - 6 giò.
Trong thòi kỳ thứ hai của quá trinh nảy mầm cần thổi mạnh hơn, và
dến giai đoạn thứ ba thì cưòng độ thổi giảm dần, chu kỳ này kéo dài từ
1 0 - 1 2 giờ. Sau khi nảy mầm kết thúc, malt được tập trung lại và vận
chuyển đến lò sấy. Cáẹ ngăn được rửa sạch và tiếp tục làm việc (theo
bảng 2.1).
Bảng 2,1. Chế độ tàm việc của phòng nảy mẩm
Chiều dày N h iậtđ ộ cực đại (°c>
Số ngây Sô' lần đảo
lớp m alt T rong phòng Trong lớp Ghi chú
nảy mầm trong ngày
(cm) nảy mẩm I malt
Đối vời malt vànợ
Ngày thứ 1 3 0 -3 5 12 1 2 -1 4 2
Ngày thứ 2 1 5 -2 0 12 1 4 -1 7 2 -3 Bắt đẩu phát triển,
Ngày thứ 3 1 5 -2 0 12 1 5 -1 8 3 -4 cẩn chú ý các
điều kiện t°, w,
Ngày thứ 4 1 2 -1 5 12 1 7 -1 8 3 -4
Oj, đưa về lò sấy.
Ngày thứ 5 1 0 -1 2 12 1 5 -1 6 3
Ngày thứ 6 10 12 15 2
Đối vòi malt ơen
Ngày thứ 1 2 5 -4 0 12 1 3 -1 6 2
Ngày thứ 2 2 0 -2 5 12 1 7 -1 8 2 -3
Ngày thứ 3 1 5 -2 0 12 1 8 -1 9 4
Ngày thứ 4 1 0 -1 5 12 1 9 -2 0 4
Ngày thứ 5 1 0 -1 5 12 2 0 -2 2 2 -3
Ngày thứ 6 10-15 12 16-18 2
Ngày thứ 7 1 0 -1 5 12 16-17 2

38
 4) Nảy mầm thông gió thừng quay
Có hai loại thùng quay: Thùng quay kín và thùng quay hở. Thông
dụng hơn cả là thùng quay kín. Cấu tạo của thùng quay kín như sơ dồ
hình 2.13. '

b) c)
Hỉnh 2.13. Hệ thông ươm mầm thòng gió tang quay
a) Mãt cắt dọc, b và c) Mạt cắt ngang
1. Khỏng khí đà xử lý; 2. Đường cắt ống trung tâm; 3. Đường ống xung quanh;
4. Van điều chình khí lưu; 5, Khỏng khf bẩn.

zactzazga

----- ị— -4^— 4- ị .
WlTT7TJinM!ITwW?a«

Hình 2.14. Sơ đồ mặt cắt một ngăn của phân xưỏng nảy m ẩm
1. Quạt nén không khi; 2. Hoa sen phun nước; 3. Không khí sau khi sử dụng; 4. Lớp malt;
5. Nhiệt kế và ẩm kế; 6. Thiết bị đảo trộn và vận chuyển malt; 7. Cừâ thoát cho không khí đả sử
dụng và một phần khống khí đã sử dụng cho hỗn hợp với khống khí ỏ bồn ngoài để tái sử dụng.
Thùng quay kín có dạng hình trụ, dài từ 4 ~ 6m, đưòng kính từ
2,3 - 3,Om. Thể tích thùng phải đảm bảo đủ để nảy mầm từ 10 - 12 tấn
hạt khô. Thùng quay được là nhờ hệ thông truyền chuyển động đặt trên
giá đỡ. Chế độ làm việc như sau:
Hạt ngâm được đưa vào thùng qua các cửa 4, hạt được phân bô' đều
trên lưối thép. Không khí lạnh và ẩm đi vào cửa 5 chiếm khoảng không
gian giữa thùng và lưới thép, không khí chui qua các lóp m alt và sau khi
qua lốp malt ra ông trung tầm 6 và được thải ra ngoài qua cửa 7. Thòi
gian nảy mầm trong thùng quay thường kéo dài từ 7 - 10 ngày. Thùng
quay tuần hoàn, trung bình cứ hai vòng quay cho mỗi lần 5 - 6 giờ. Lúc

39
đầu và lúc cuối có thể quay chậm hơn, thời gian giữa quay nhanh hơn và
thường xuyên hdn. Sau khi nảy mầm xong, cho thùng quay vào vị trí
ngược lại vái lúc cho m alt vào, như vậy các cửa sẽ nằm phía dưói, có thể
tháo ra được dễ dàng.
Đối với thùng quay hỏ thường làm bằng những tấm lưới thép dày, có
lỗ hẹp và dài, thùng có dạng hình trụ. Thùng có hai đáy, đáy sau đóng
kín, đáy trước có lỗ rộng nối thông với một ống lưới; chính giữa có ống
lưới trung tâm, qua đó ta có thể cho thêm vào một lượng nước phụ (nếu
cần thiết) trong quá trình nảy mầm. Loại này rấ t ít sử dụng vì đắt tiển.
5) Nảy m ầm bằng phương pháp bán liên tục
Trong kỷ thuật ngâm hạt, nảy mầm và sấy m alt những năm gần
đây có những tiến bộ rế t lớn, Nhiều nhà máy bia trên th ế giới đã được
trang bị bàng những thiết bị mới và hiện đại về ngâm, nảy mầm thông
gió, tất cả các quá trình làm việc đều được cơ giói hoá và một phần, hay
thậm chí toàn bộ quá trình đã được tự động hoá
Oztertag, kỹ sư người Đức đã tìm ra một phương pháp nảy mầm mới,
gọi là phương pháp “những khôi dịch chuyển”.
Nảy mầm bằng phương pháp này được tiến hành trong những ngăn
có chiểu đài từ 50 - 60m, rộng từ 3 - 4m. Thông thường trong phân
xưởng nảy mầm có hai ngăn. Đáy mỗi ngăn làm bằng những tấm thép
dày, khoảng cách từ lưới thép xuống đất khoảng 60cm, khoảng không
gian này được ngăn cách ra từng ô, trung bình khoảng từ 16 - 18 ô,
không khí lạnh và ẩm được đưa từ phòng lạnh nhồ hệ thông mương dẫn
đi vào các ô, qua lưới thép và xâm nhập vào lớp malt. Malt được đảo trộn
nhờ máy đảo, máy đảo gồm những thùng con, máy chuyển động trên hai
đường sắt đặt trên hai thành ngăn. Máy đảo chuyển động vổi tốc độ
0,2 - 0,3m/phút. Khi máy chuyển động, các thùng con sẽ xúc malt lên và
đổ xuống, như vậy là khối m alt vừa được đảo trộn và vừa được chuyển
động dần về phía trước. Mỗi ngày máy đảo làm việc hai lần, như vậy là
một lần đi mâ't 12 giò và một lần về m ất 12 giờ. Khi nảy mầm xong, nhò
máy đảo, m alt được đưa ra ngoài và vận chuyển đến lò sấy. Trung bình
thòi gian nảy mầm kéo dài từ 7,5 - 8 ngày, nghĩa là trong thòi gian này,
trong hai ngăn sẽ có từ 15 - 16 đông malt. Phương pháp bán liên tục
này có nhiều ưu điểm hơn các phượng pháp khác, 10 -15% m alt nảy
mầm đều và có chất lượng tốt.
6) N ảy m ầm bằng phương pháp liên tục
Phương pháp nảy mầm liên tục đang được thí nghiệm nhiều ndi trên
40
thế giới, vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi. Một trong những thí nghiệm
đó là hệ thông nảy mầm liên tục của Viện Hàn lâm Nông nghiệp Nga.
2.1.5. Đánh gỉá chất lượng malt tươi và so sánh ưu, nhược điểm của
các phưdng pháp nảy mầm
Chất lượng malt tươi được đánh giá qua cảm quan, phân tích độ
hoạt động của enzym và thành phần hoá học của chúng. M alt tươi có
chất lượng tốt khi thể hiện mùi dưa chuột. Khi bị mổc hay có sự hoạt
động của vi sinh vật thì malt có mùi chua, ôi khó chịu. H ạt malt phải
mềm, khi ta bóp thì hạt tinh bột còn d dạng như những h ạt cám. Ngược
lại, khi hạt malt còn cứng hay bị nhão thì coi như phẩm chât xấu. Yếu tô"
quan trọng để đánh giá chất lượng malt là chiểu dài và độ lớn của rễ và
mầm. Sô hạt nảy mầm phải đạt từ 85% trâ lên đối với malt vàng, chiều
dài của mầm phải từ 1/2 - 3/4 chiều dài hạt; còn m alt đen mồm dài hơn
nhưng không quá chiểu dài hạt. Độ hoạt động của amylaza đốĩ vói malt
vàng bình thường từ 300 - 400 đơn vị WK; đôi với malt đen từ 400 - 500WK,
hoặc đđn vị so sánh như phần phẳn tích DC ở thí nghiệm.
Vê' thành phần hoá học, chỉ sô" chính xác nhất để đánh giá sự phân
huỷ của dịch từ lượng sản phẩm protein thu được (các chất có N hoà
tan). Nếu sự phân giải protein chưa đồy đủ thì chất lượng malt kém, khi
ấy lượng các chất chứa N hoà tan không đủ để cho nấm men tiêu thụ,
kết quả là bia sẽ kém khả năng tạo bọt. Sự tồn tại của protein ở dạng
không hoà tan hay những phân tử trung gian chính là nguyên nhân của
sự đục ở dạng keo của bia. Ngược lại, protein bị thuỷ phân quá sâu cũng
không cần thiết. Malt được sản xuất bằng những phương pháp khác
nhau đểu có những đặc điểm bên ngoài hay những thành phần hoá học
khác nhau. Malt được sản xuất trong thùng quay thường có mầm ngắn
nhưng rễ đài và bé; malt nảy mầm trong ngăn thì ngược lại. Qua thí
nghiệm người ta chứng minh rằng, malt được nảy mầm trong điều kiện
có C 0 2 nhiều (không quá 20%) ở thòi kỳ thứ hai cùa giai đoạn nảy mầm
thì kết quả rấ t tốt.
2.1.6. Sấy m alt tươi
a) Mục đich và những quá trình biến đổi của m alt trong khỉ 8ấy
Vì malt tươi có hàm lượng nước cao, do đó không thể để lâu được.
Mục đích của sấy m alt là nhằm tách lượng nước thừa có trong m alt tươi,
khi đó m alt tươi mới có thể vận chuyển đi xa và bảo quản được lâu. Khi
sấy malt tươi chẳng những tách được lượng nưốc thừa khỏi malt, mà
41
ngay trong bản thân malt vẫn tiếp tục tiến triển những quá trình sinh
hoá, chẳng hạn sự tạo thành chất thdm, vị ngọt đặc biệt hay chất màu,...
Ngoài ra, sấy còn mục đích nhằm đạt được những loại m aỉt có chất
lượng khác nhau theo yêu cầu của kỹ thuậL
Quá trình quan trọng nhất xảy ra trong khi sấy là sự tạo thành chất
melanoit, Chất này hình Ihành do tác dụng tương hỗ giũa những chất có
nhóm cacbonyl (-CO) và những chất có nhóm amin (-NH2) như đường,
amino axit,...
Trong malt tươi chứa một lượng khá lán các loại đuòng, amino axit
và một sô' chất khác tham gia vào việc tạo thành melanoit. ở giai đoạn
đầu của quá trình sấy, vì hàm lượng nưóc còn cao và do nhiệt độ tăng, ở
điều kiện này thích hợp cho sự hoạt động của một số enzym, vì vậy
cường độ hoạt động của một soenzym vẫn tiếp tục tăng, do đó tạo thêm
những chất do sự thuỷ phân tinh bột và protein. Khi nhiệt độ tăng lcn
nữa thì các chất này tác dụng tương hỗ với nhau và tạo thành melanoit.
Chế độ sấy đôi vói malt vàng và malt đen có khác nhau. Malt vàng có
dặc trưn^ là màu hạt hơi vàng nhạt, vị ngọt và mùi thơm nhẹ. Đối vối
malt vàng, hàm lượng nước hạ từ 42 - 44% xuống 8 - 10% khi nhiệt độ
tăng từ 45 —50°c, sau đó độ ẩm hạ xuống 3,3 - 3,5% và nhiệt độ tăng lên
uực dại là 75 - 80°c. Do sự tách nước nhanh khi sây malt vàng nên không
tạo diều kiện thuận lợi cho sự hoạt động các enzym thuỷ phân, vì nguyên
Iihân này mà lượng sản phẩm tạo thành do sự thuỷ phân tinh bột và
protein ít, hay nói khác đi chính là lượng melanoit không đáng kể.
Malt đen được biểu hiện màu đen rõ ràng hơn, vị ngọt và mùi thdm
mạnh hơn. Từ loại m alt đen này ngưòi ta sẳn xuất ra bia đen, đặc trưng
của bia đen là màu tổì, sánh, thơm, bọt nhiều và bền. Khi sấy malt đen,
điều kiện hoạt động của enzym thuỷ phân rấ t thuận lợi, do nhiệt độ
Lăng lên nên đạt được những nhiệt độ tôi thích của những enzym khác
nhau, dồng thòi lượng nưổc trong malt cũng giảm xuống từ từ. Nhiệt độ
Láng lên đến 38 - 40°c và độ ẩm còn lại khoảng 20%, sau đó nhiệt độ lại
tăng dần lên 60 - 65°c, 70 —75°c và cho đến khi đạt được 100 - 105°c.
Có loại nâng lên 170, 200, 220°c, khi đó hàm lượng nước cũng hạ dần
xuống đến 8 - 10% và CUÔ1 cùng còn lại 1,5 - 2,5%. Vì khi sấy malt đen
có điều kiện để cho các enzym thuỷ phân hoạt động tốt hơn, do vậy
lượng melanoit tạo thành nhiều hơn malt vàng. Song m ặt khác, khi sấy
ở nhiệt độ cao như vậy, một phần lổn các enzym kém chịu nhiệt đều bị
phá fruỷ, do đó thường trong malt đen hoạt lực của enzym có phần yếu
hơn so vối malt vàng.

42
 Quá trình sấy malt có thể chia ra làm 3 giai đoạn như sau:
1) G iai đ o ạn sin h lý: ở giai đoạn này nhiệt độ tăng dần đến 45°c,
mầm và rễ vần tiêp tục phát triển. Hàm lượng nước hạ xuống còn
khoảng 30%. Vì điểu kiện độ ẩm và nhiệt độ thích hợp nên những quá
trình sinh lý hoạt động mạnh.
2) G iai đ o ạn lên m en: Nhiệt độ tăng lên từ 45 - 70°c, các quá
trình sinh lý (hô hấp, sự lớn lên của rễ và mầm,...) bắt đầu dừng lại,
nhưng những quá trình thuỷ phân và những biến đổi khác trong nội
nhũ vẫn diễn ra, vì nhiệt độ tối thích của đa sô' enzym nằm trong
khoảng 45 - 60°c, Điều này thể hiện rõ rệt đối với malt đen, ở giai đoạn
này hàm lượng nước của malt đen từ 20 - 30%. Đối với m alt vàng, hàm
lượng nước hạ xuống còn 10%.
3) G iai đ o ạ n h o á học: Nhiệt độ tăng từ 70 - 105°c. Ở nhiệt độ
trên 75°c, các quá trình enzym bị đình trộ, một sô" enzym bị phá huỷ
hoặc mất hoạt tính, phần còn lại bị hấp thụ bởi những châ't keo của hạt
và chuyển sang trạng thái nầm yèn, ví dụ: ỏ nhiệt độ lớn hơn 40°c,
enzym peptidaza ngừng hoạt động; ỏ 60“C, s'taza và phyta/a mất hoạt
tính, ở giai đoạn này, amylaza giảm hẳn hoạt tính. Riêng đối với
proteinaza, khả năng chịu nhiệt rất lớn, độ hoạt động của nó giảm rấ t ít
khi sấy malt vàng.
ở giai đoạn này, đồng thời với sự ngừng trệ các quá trình lên men,
thì những quá trình khác bắt dầu tiến triển như sự tạo thành mùi, vị,
chất màu. Đặc biệt ở giai đoạn này, sự tạo thành melanoit nhiểu nhất.
Melanoit là những chất mà thành phẫn và cấu tạo của nó hiện nay
ngưòi ta vẫn chưa xác định được. Ngưòi ta chỉ biết đây chỉ là một hợp
chất được tạo thành, do tác dụng tương hỗ giữa những chất có nhóm
cacbonyl và nhóm amìn. Theo Hodge, quá trình tạo thành melanoit
trong khi sấy malt tiến triển theo 3 giai đoạn.
- Giai đoạn đầu: Đặc trưng của giai đoạn này là sự cô đặc các chất
đưòng và amino axit. sả n phẩm cuối cùng của giai đoạn này là những
tinh thổ không màu.
- Giai đoạn giữa: Đặc trưng của giai đoạn này là sự m ất Hz và bẻ
gẫy phân tử đưòng. Amino axit cũng bị phá vỡ, kết quả là tạo thành
nhũng chất không màu hoặc có màu vàng nhạt. Ở điểu kiện sấy malt,
giai đoạn này do sự tổn tại của các amin mà tạo nên các chất khử, tiêu
biểu là hydroxyl—aldehytbutyric

43
 H — c = c — c = 0
I I I
OH OH H
Hydroxyl - aldehytbutyric
Đây là những chất hữu cơ có khả năng khủ rấ t mạnh, Trong những
chất khử này có một số hợp chất thơm dưới dạng hydroquinon, khi bị
khử H2 chúng trở về dạng quinon.
Những chất khử được tạo thành trong những quá trình sấy và
những quá trình về sau (đường hoá, đun sôi,...) đóng vai trò rấ t quan
trọng trong quá trình oxy hoá khử của kỹ thuật sản xưâ't bia. Ngoài sự
tham gia trực tiếp của chúng trong quá trình tạo thành mùi, vị, bọt của
bia, chúng còn là những chất bảo vệ quan trọng nhằm chống lại sự oxy
hoá những thành phần còn lại, hoặc chống lại sự kết tủa các chất keo,
làm cho bia bị đục.
- Giai đoạn cuối: Đặc trưng của giai đoạn này là sự tạo thành các
chất có màu tối sẫm. Tôc độ của những phản ứng tạo thành melanoit
không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào thành phần
những chất tham gia vào tác dụng tương hỗ. Thành phần của melanoit
gần như sau:
c = 54 - 60%; 0 2 = 31,3 - 35,1%; H2 = 4 ,9 - 5,2%; N = 3,ỗ - 5,3%.
Chúng có chứa các nhóm -OH, -CO, -COOH. Khối lượng phân tử
khoảng 1.480. Ý nghĩa của các chất melanoit trong ngành bia rấ t quan
trọng. Chúng gây cho bia có màu và mùi thdm đặc biệt, chúng có khả
năng hoạt động bề mặt rất mạnh, vì vậy chúng là nhũng chất tạo bọt tốt,
chúng còn đóng vai trò bảo vệ các chất keo, ngăn cản không cho sự kết
tủa của nhừng chất keo không bền vững; ngoài ra chúng còn có khả nàng
khử mạnh, làm tăng tính chất bền vững của bia, chống ỉại hiện tượng bia
bị đục do oxy hoá. Vì rằng lượng melanoit có trong bia đen nhiều hơn nên
những tính chất này được thể hiện rõ ràng hơn trong bia vàng.
Trong khi sấy, ngoài sự tạo thành melanoit, trong m alt còn tiến
triển sự biến đổi khác như: Hàm lượng đường kliử trong m alt vàng bị
giảm khoảng 0,2%, đối với m alt đen giảm khoảng 0,6%; ngược lại hàm
lượng saccaroza tăng lên; hàm lượng axit ban đầu tăng lên, nhưng hàm
lượng axit nói chung trong quá trình sấy giữ nguyên hoặc giảm đi một
ít; hàm lượng chất béo giảm xuống, những axit béo được tạo thành gây
ảnh hưởng xấu đến sự tạo bọt của bia. Thài gian của từng giai đoạn trên

44
vói m alt đen và m alt vàng có khác nhau. Đối vối m alt vàng, giai đoạn
sinh lý thưòng kéo dài 13 giò; giai đoạn lên men 7 giò và giai đoạn hoá
học từ 3 - 4 giờ.
b) Tiên hành sấ y m alt
1) Lò sấy hoạt động tuẩn hoàn
Lò sấy nằm ngang 2 tầng: đây là một lò sấy kiểu cổ điển, thưòng là
nhà cao 4 tầng với chiều cao 20 - 25m, hình vuông hay hình chữ nhật, ở
dưới tầng hầm hay tầng cuối cùng đặt bếp đun châ't lỏng hoặc chất rắn,
tầng tiếp theo là phòng hơi nóng, trong phòng có đặt hệ thông ông đẫn
hơi nóng, trên nữa là tầng trộn không khí và trên cùng là 2 tầng chúa
malt, ông thoát hơi ẩm. Trong phòng trộn không khí, người ta cho hơi
nóng và không khí bên ngoài vào trộn lẫn để điểu hoà nhiệt độ, những
bộ phận chủ yếu của lò sấy xem trên hình 2.16.
Sàn phơi malt làm bằng những tấm lưới thép dày, tổng diện tích của
lỗ lưối chiếm 30 - 35% diện tích toàn bộ. Diện tích mỗi sàn thường là
25 - 72m2 nhưng thông thường là 36m2.
- Tiến hành sấy malt vàng:
Malt tươi cho vào và trải đểu trên sàn, chiều đài lớp m alt thường từ
14 - 22cm. Nhiệt độ tăng lên từ từ và nưởc được tách ra lúc đầu yếu, sau
mạnh dần. Sấy khoảng 6 giò, nhiệt độ đạt đến 30 - 35°c và độ ẩm còn
20%. Trong 6 giò sau, nhiệt độ tâng lên 50°c, độ ẩm hạ xuống còn 8 - 10%.
Điều kiện quan trọng để thu được malt vàng tốt là nhiệt độ không được
lên trên 40°c khi độ ẩm chưa hạ xuống 12 —14%. Malt được đảo trộn
nhò máy đầo trộn, trong thòi gian đầu, cữ 3 - 4 giò đảo một lần, về sau
đảo nhiều hơn. Sau 12 giò, malt ở sàn trên đưa xuống sàn dưới, vì Bàn
trên lại tiếp tục nhận một lớp malt mới.
- Tiến hành sấy malt đen:
M alt đen sấy lâu và phức tạp hơn 80 với m alt vàng. Malt tươi được
đổ và trải đều trên sàn trên, chiều dày lớp malt từ 22 - 30cm. Giai đoạn
đầu kéo dài khoảng 14 già, nhiệt độ tăng lên từ từ đến 40°c và malt
được đảo trộn 2 giò một lần, hàm lượng ẩm của m alt hạ xuống còn 20%;
3 - 5 giờ tiếp theo, nhiệt độ tăng lên đến 60 - 65°c, sô" lần đảo trộn tăng
lên. Sau khoảng 24 giò thì sây xong ở sàn trên, ở sàn dưới, m alt bắt đầu
sấy ở nhiệt độ 50°c và độ ẩm 20%. Quá trình sấy ỏ sàn này chia thành
2 thòi kỳ: Thòi kỳ thứ nhất kéo dài từ 9 —10 giờ và nhiệt độ luôn luôn
giữ ỏ 50 - 55°c và độ ẩm hạ từ từ xuống 8 - 10%. Lúc đầu m alt được đảo

45
trộn liên tục và sau đó cứ 2 giờ một lần. Trong thời kỳ thứ hai, nhiệt độ
tăng lên, trong 4 - 5 giờ đầu của thời kỳ này nhiệt độ tăng lên đến 75°c.
1'Iàm lượng ẩm tụ t xuông 5%, trong 3 - 4 giò tiếp theo, nhiệt độ tăng lên
đến 1 0 0 - 105°c.
Cuối cùng có thể nâng lên nhiệt độ 170, 200 —22 0 °c và giữ ở nhiệt
độ này cho tới khi sấy xong. Hàm lượng ẩm cuô"i cùng còn lại khoảng
1 ,5 - 2,0%.
Vì m alt đen sản xuất lâu hơn và khó khăn hơn, hao tổn chất khô
nhiều hơn do đó m alt đen và bia đen đắt hơn. Để khắc phục nhược điểm
này, một số" nưóc sản xuất bia đen từ malt vàng và pha lẫn một số malt
dặc biệt có màu (m alt cà phê, malt caramen,...).
2) Lò sấy 1 tần g hoặc 2 tầng

Hinh 2.15. Lò sấy 2 tầng Hinh 2.16. Lò sấy 1 tẩng

1. Nắp; 2. Quạt gió; 3. Tầng 2; 4. Máy đào 1. Hệ thống cấp nhiệt; 2. Quạt
mail; 5. Tầng 1; 6. Camera điều chỉnh khi gió; 3. Khí đốt; 4, Lớp malt tươi và
nóng và 7. Hệ thống cấp nhiệt. 5. Khí thải.

Đây là một loại lò sấy tương đối mối. Loại lồ sấy này có công suất lớn,
dựa trên nguyên tắc thổi những luồng không khí nóng qua lớp malt có độ
dày 8 - lOom mà không cần đảo trộn. Người ta còn gọi là phương pháp
sấy thông gió. Đổ sử dụng triệt đế không khí nóng, người ta thường làm 2
lù sấy một tầng đi dôi với nhau, mỗi một lò đểu có phòng nóng riêng, hay
L‘ó thổ chung. Hai sàn của 2 lò đều được trải đều malt, đầu tiên hưi nóng
đi qua sàn có malt đang sấy ở giai đoạn cuối, sau đó hơi nóng đi qua sàn
malt tươi. Sau khi dưa malt sấy xong đi ndi khác, ta lại trải một lớp malt

46
tươi mới thay thế ở sàn được hơi nóng đi qua đầu tiên, và lúc này chiểu
của hơi nóng di ngược lại và cứ như vậy ta tiếp tục sấy.
Công suất trung bình của kiểu lò sấy này là 250 - 300kg malt khô/m2.giờ.
3) Lò sấy hoạt động liên tục
Lò sấy liên tục là một nhà thẳng đứng cao khoảng 15m. Malt tươi
clưực đưa vào bể chứa và phòng sấy sư bộ, ở đây malt được thổi một
luồng không khí nóng đi qua để sấy sơ bộ. Nhò van điều chỉnh, malt liên
tiếp di xuống các phòng sấy.
2.1.7. Tách mẩm, rễ và bảo quản malt khô
a) Tách mầm, rễ và bảo quản
Mầm và rễ cần tách khỏi malt, vì
chúng có tính chất hút nước mạnh, đổng
thòi chúng có vị đắng khó chịu. Nếu
không tách rễ ra khỏi malt thì trong quá
trình bảo quản chúng sẽ hút nước và phá
vỡ sự cân bằng ẩm trong hạt, lạo diều
kiộn thuận lợi cho sự phát trien vi sinh
vật và những quá trình không thuận lợi
đến châ"t lượng của malt. Bia sản xuất từ
malt chưa tách mầm thường có vị đắng
khó chịu. Tách mầm và rễ thưòng tiến Hlnh 2.17. Máy tách mẩm, rỗ malt
hành ngay sau khi sấy, nếu để lâu rễ sẽ 1. Quạt giả; 2. Tang quay và các
hút nước, khiến cho rễ bị dai khó tách mái chèo; 3. Vít lời.
khỏi malt (hình 2.17).
Muốn tách mầm và rỗ, ngưòi ta dùng máy cắt. Máy cắt là một lưới
hình trụ quay chậm và đặt hơi nghiêng trong một thùng gỗ kín. Lỗ lưới
dài 25mm và rộng l,5mm, bên trong thùng hình trụ có một trục quay
nhanh, gắn liền với trục có những cánh quạt, khi thùng quay thì trục có
cánh quạt cũng quay, nhưng hai tốc dộ khác nhau, do đó sẽ gây ra một
lực ma sát giữa malt và các cánh quạt, nhờ lực ma sát này mà rc bị cắt
đứt và đi theo lỗ lưới ra ngoài. Malt sau khi tách mầm, nhò dộ nghiêng
của thùng quay, malt Lừ từ đi ra ngoài. Công suất của máy tách mầm và
rễ thường là 1.000 - 2.000kg/giờ. Malt sau khi tách mầm và rỗ di qua
các cân tự động và đưa đi bảo quản.
Hạt m alt và đặc biệt là vỏ malt sau khi sấy xong thường rấ t khô và
giòn. Khi nghiền, chúng thường bị vỡ mU, gây khó khản cho quá trình

47
lọc. Trong một vài trường hợp, những loại m alt như vậy khó đường hoá,
dịch đường lên men chậm và tính keo của bia kém bền vững. Trong quá
trình bảo quản, hàm ẩm của malt thưòng tăng từ 5 - 6%, đồng thòi
trong m alt tiến triển những quá trình hoá lý và sinh hoá. Do kết quả
khử H2 mà các chất keo nở ra và cấu tạo của h ạt trỏ nên dẻo hơn, thể
tích h ạ t tăng lên. Khi hàm ẩm tăng lên với mức độ bình thường cho
phép bảo quản m alt thì các quá trình của enzym tiến tôi cực tiểu. Ta
nhận thấy sự hoạt động của amylaza và độ axit chuẩn tăng lên yếu,
đồng thời lượng các chất có N hoà tan cũng tăng lên, nhưng không đáng
kể. Hàm ẩm cực đại cho phép trong khi bảo quản malt là 6%. Thòi gian
bảo quản ít n h ất là 3 - 4 tuần và nhiều nhất là 2 năm, Tốt nhất malt
nên bảo quản trong những kho chứa gồm nhiều thùng bằng sắt tầy, và
trong mỗi thùng nên bảo quản những loại malt cùng chất lượng.
ở nước ta hiện nay, vì phải mua malt của nước ngoài nên thưòng
bảo quản rấ t lâu, hơn nữa diều kiện kho tàng rấ t thiếu thổn nên độ ẩm
của m alt khi đem dùng thưòng từ 8 - 9%. Kết quả là châ't lượng malt bị
giảm sút và dẫn đến hao hụt lượng chất hoà tan.
Malt trong quá trình bảo quản cũng như vận chuyển thường bị bụi
bám bẩn, do đó trước khi đưa vào sản xuất, m alt cần phải làm sạch bụi
và những tạp chất bám vào malt hay những rễ malt còn sót lại, trong
quá trình làm sạch ta tách được khoảng 0,5 - 1,2% bụi và những tạp
chất khác.
1

Hình 2.18. Máy đánh bóng malt

1. Phễu đổ malt; 2. Tang quay cò lượn sóng; 3. Chổi quay; 4. Quạt gió; 5. Malt ra,

b) Đ á n h g iá c h ấ t lương m a lt kh ô
1) Tỷ lệ th u h ồ i m alt k h ô
Cứ 100 lít hạt đại mạch khô, độ ẩm 15%, sau khi nảy mầm và sấy ta
thu được 90 lít malt khô, độ ẩm 2% và thu được 100 lít malt sau khi bảo
quản với độ ẩm 4%.

48
 Hay cứ 100kg hạt đại mạch khô, độ ẩm 15% thu được trung bình
75kg malt vừa mới sấy có độ ẩm 2% hoặc 78kg m alt thành phẩm (sau
khi bảo quản), sỏ dĩ khối lượng giảm là vì tổn th ất chất khô trong quá
trình ngâm, nảy mầm, đồng thòi sự giảm hàm lượng nước trong hạt.
Hao tổn thực tế dựa vào khôi lượng và số % chất khô của hạt và
malt để tính.
2) Nhận xét cảm quan
- Màu: malt vàng: vàng tươi; malt đen: màu tổì sẫm, vỏ phải óng
ánh. Kích thước, hình dáng tương tự như hạt đại mạch khô.
- VỊ và mùi: Phải đặc trưng cho từng loại malt, không có mùi, vị lạ.
Nếu có mùi chua hay mốc chứng tỏ malt bị ẩm.
Malt vàng vị ngọt dịu (nhẹ), malt đen vị cà phê, thdm ngọt mạnh.
- Độ sạch: không lẫn tạp chất, hạt không bị vỡ và không có hạt bị
bệnh (hạt vỡ tôi đa 0,5%; hạt bị bệnh tối đa 1% và hạt không nảy mầm
tcíi đa 5%).
3) Chỉ số cơ học
- Dung trọng: Malt loại rất nhẹ: 480 - 500g/]ít, loại nhẹ: 500 - 530g/lít.
Malt loại trung bình: 530 - 560g/lít, loại nặng: > 560g/lít.
- Khối lượng khô tuyệt đối:
Trung bình là: 28 - 38g/1.000 hạt (theo khối lượng).
25 - 37g/1.000 hạt (theo chất khô tuyệt đối).
4) Thành phần hoá hoc
- Độ ẩm (W): Malt vừa sấy xong w< 4,5%; trong bảo quản, tốì đa
cho phép w = 7%.
- Thòi gian đường hoá: Malt vàng: 10 - 20 phút/70°c.
Malt đen: 20 - 30 phúƯ70°C.
- Chất hoà tan: Trung bình: 65 - 82% chất khô.
Loại được xếp chất lượng cao: >78% (malt vàng), £75% (malt đen).
- Cưòng độ màu: màu dịch đưòng (trong phòng thí nghiệm) phải
đúng bằng màu của dung dịch iot trong nước: 0,1N.
- Thực tế sản xuất: Lấy màu chuẩn cho m alt vàng là màu của
0,3 - 0,16mg ioưl lít H20.
Lấy màu chuẩn cho malt đen là màu của 0,7 - l,3mg iot/1 lít H20.
■—Hồm lượng malt: malt vàng: 65 - 70% chất hoà tan.
Malt đen: 59 —65% chất hoà tan.

49
 - Tỷ lệ đường maltoza/các đưàng khác:
1 1 ; malt đ„e n :-------—
m alt vàng: --------- 1 1—;
0,4 0,5 0,6 0,7
- Độ axit: pH dịch đường (thí nghiệm) = 5,5 - 6,5.
- Các thành phần chính của malt khô (% chất khô):
Tinh bột = 58,0; pentoza hoà tan = 1,0; hexoza và pentoza không tan = 9,0;
xenluloza = 6,0; saccaroza = 5,0; đưòng khử = 4,0; protein (quy ra đạm
tổng sô' N X 6,25) =10; protein hoà tan = 3,0; châ't béo = 2,5; tro = 2,5.
2.1.8. Kỹ thuật sản xuất các loại malt đặc biệt
Đố làm tăng chất lượng của bia vể màu, mùi vị hoặc để làm dễ dàng
quá trình đường hoá trong khi chế biến dịch đường ngưòi ta thưòng
dùng những loại malt đặc biệt cho lẫn với malt thưòng theo tỷ lệ 5 - 10%
khôi lượng của malt thường.
a) Malt caramen
Được sử dụng nhiều đôì vối sản xuất bia đen, làm cho bia có vị
caramen, mùi thdm, màu cánh gián và khả nâng tạo bọt tốt, Malt
caramen được chế biến từ m alt tươi hay malt khô nhờ quá trình đường
hoá phụ và sấy ở nhiệt độ cao hơn, thường từ 110 - 170°c. Để chế biến
malt caramen ngưòi ta thưòng dùng malt tưdi có độ phân giải tot. Malt
tươi được tưới nưốc với liều lượng 10 - 15 lít/100kg, trộn đều và đổ
khoảng 12 giờ, ò điều kiện như vậy, quá trình enzym tiếp tực hoạt động
và tiếp tục thuỷ phân những thành phần có cấu tạo phức tạp của malt,
sau đó m alt được sấy ở những lò sấy đặc biệt, nhiệt độ có thể nâng lên
đến 170°c, thòi gian sấy thường từ 2 - 3 giờ. Đối với m alt khô dùng đổ
chế biến m alt car amen đòi hỏi phải có độ phân giải thật tốt. Từ 100kg
malt khô thu được trung bình 90 — 95kg malt caramen. Dung trọng
thường từ 400 - 450g/ì, hàm ẩm từ 5 - 6%, chất khô hoà tan 40 - 60% và
dưòng khử 30 - 50%. Malt caramen phải có mùi vị caramen đặc trưng.
b) M alt cà p h ê
Malt cà phê chế biến từ malt vàng tươi hay khô, được sấy ỏ nhiệt độ
220 —250°c, Để thu được kết quả tôt hơn, cần tạo được điều kiện cho
malt đường hoá sơ bộ. Ta tiến hành như sau: Malt ngâm trong nước ở
nhiệt độ 70°c trong 12 giờ. Làm như vậy sẽ tạo điều kiện cho sự tạo
thành chất màu nhiều hơn. Nếu dùng malt tươi thì không cần ngâm sơ
bộ. Sau đó tiến hành sấy ở những lò sấy tương tự dùng cho malt

50
caramen. Thời gian sấy kéo dài từ 2 - 2,5 giờ. Điểu quan trọng để thu
được malt cà phê có chất lượng là phải hạ nhiệt độ nhanh sau khi 8ấy.
Hạt malt cà phê có chất lượng cao phải có màu giống hạt cà phê rang và
mùi thơm của cà phê rang. Từ 100kg malt khô thu được 85 - 90kg malt
cà phê, dung trọng thường từ 400 - 450g/l. Hàm ẩm sau khi sấy: 2 - 3%
và sau khi bảo quản là 5 - 6%. Chất hoà tan chung là 60 - 65%.
c) M alt m elanoit
Malt melanoit còn gọi là malt melan, chứa một lượng lớn melanoit.
Malt melanoit được chế biến từ đại mạch có hàm lượng protein cao. Giai
đoạn cuối của quá trình nảy mầm nhiệt độ tăng cao (20°C) và để như
vậy trong một ngày đêm, sau đó malt tươi được dồn đống, để 1 - 2 ngày
và nhiệt độ tăng lên đến 50 - 52°c. Để ỏ nhiệt độ này trong 1 6 - 2 4 giò.
Sau đó tiến hành sấy như sấy malt đen.
2.1.9. Tận dụng mẩm malt bla
Mầm m alt bia là phế liệu được thu nhận từ khâu xử lý malt trên
máy tách mầm. Mầm malt bia có thành phẩn dinh dưông rấ t cao nên
chúng được sỏ dụng như một thành phần của thực phẩm gia súc. Thành
phần hoá học của mầm malt như bảng 2,2.
Bảng 2.2. Thành phẩn hoá học của mẩm malt

T hành phần (%) Malt màu đậm Malt màu nhạt Malt nghlển 80 bộ

Nước 7,03 8,80 10,07

Protein 30,88 30,06 34,18
Lipit 1,63 1,95 2,23
Chất hoà tan khỗng
chứa nilơ 43,87 44,53 35,18
Xenluloza 9,64 8,64 11,42
Tro 6,95 6,02 7,05

Lượng mầm m alt thường chiếm khoảng 3 - 5% khôi lượng malt thu
được, hoặc khoảng trên 90kg trên 1.000 decalít bia sản xuất ra.
Mầm m alt có tính hút nưâc cao và tăng thể tích rấ t lớn. Do đó cần
phải bảo quản ở nơi khô ráo. Một đặc điểm nữa là mầm m alt rấ t dễ bị
nấm mốc phát triển, do đó rấ t dễ bị nhiễm độc. Hiện nay mầm m alt được
sử dụng vào các lĩnh vực sau: làm thực phẩm gia súc; sản xuất axit
lactic; làm nguồn cung cấp nitơ để sản xuất nấm men từ rỉ đường; sản

51
xuất các chế phẩm enzym và các chất hoạt hoá quá trình lên men. Phần
rễ và bụi tách ra được cyclon thu lại đưa làm phân bón.
Phần nước thải thải ra được xử lý bằng phương pháp sinh học được
đề cập chung vào chương cuối cùng của cuốn sách này.

2.2. SẢN XUẤT ENZYM THựC VẬT KHÁC

Thu nhận proteaza từ thực vật cũng chiếm một tỷ lệ quan trọng
trong công nghệ enzym. Một số enzym thực vật được ứng dụng nhiểu
trong y học, thực phẩm và công nghiệp. Trong sô" đó phải kể đến bromelain
có trong dứa, papaìn trong đu đủ và ureaza trong các cây họ đậu,...
2.2.1.Thu nhận ureaza từ đậu rựa (Canavaỉin ensiformfs)
Ureaza có vai trò xúc tác thuỷ phân ure thành NH3 và C 0 2:
CO(NH2)z » 2NH3+ C 02
Ureaza
Ureaza có nhiểu trong một số loại họ đậu Canavalia ở châu Phi, còn
ở Việt Nam có loại Canaưaỉỉa ensiformis. ở các loại nguyên liệu này,
hàm lượng ureaza lên tới 20% khôi lượng khô. Do vậy, một sô"cây họ đậu
kể trên là nguồn nguyên liệu quan trọng để thu nhận ureaza.
- Ureaza có thể chiết xuất theo các công đoạn trình bày trên hình 2.19.

Hình 2.19. So đồ các công đoạn chiết xuất ureaza

+ Chiết xuất: nghiền kỹ bột đậu trong dung dịch HCIO 4%, có thêm
ETA nông độ 5. lO^M và L— xystein Õ.IO^M. Sau đó ly tâm bỏ bă tủa
xuống đáy dụng cụ ly tâm.
+ Xử lý nhiệt: Nâng nhanh nhiệt độ dịch chiết lên 60°c, giữ ở nhiệt
độ này 10 phút, sau đó làm lạnh đên 4 —8°c, giữ nhiệt độ này trong
vòng 30 phút, đem ly tâm bỏ cặn tủa xuốhg đáy dụng cụ ly tâm.

52
 + Siêu lọc: Dịch ly tâm được xử lý qua màn siêu lọc để loại bỏ peptit
và polypeptit có khôi lượng phân tử nhỏ (< 500).
+ Tỏa axeton: Sau khi chạy qua màn siêu lọc, dịch enzym được xử lý
bằng axeton lạnh và tỷ lộ so với dung dịch là 1: 1. Sau đó ly tâm lấy
phần cặn lắng xuống đáy dụng cụ ly tâm. Phần kết tủa đem hoà tan
trong tris-buffer 0,1M, pH = 7 chứa EDTA và L - xystein (5.10-3).
+ sác ký trao đổi ion: Dịch enzym được chạy sác ký trao đổi ion
trong cột chứa DEAE - xenluloza với gradien nồng độ NaCl từ 0 - IM.
Phân đoạn chứa enzym dược đông khô với sự hiện diện của saccaroza
làm on định với tỷ lệ 2,5mg cho lm g enzym.
Chê phẩm thu được có hoạt tính tăng 25 lần so vói ban đầu và hiệu
quả thu hồi 43%. Bảng 2.3 thể hiện hoạt tính enzym thu hồi bằng các
phương pháp khốc nhau.
- Ureaza được sử dụng trong y tế để xác định hàm lượng ure trong
máu, một chỉ tiêu sinh lý quan trọng của cơ thể.
- Trong chế biến cá đuối, cá nhám có thể sử dụng ureaza để thuỷ
phân ure, góp phần khử mùi khai cho thịt của loại cá này.
Bảng 2.3. Một số thông số trong quá trinh thu nhận ureaza tử đậu rựa

Các Thổ tích Hoạt tính Protein Hoạt tính đặc hiộu Thu hổi
giai đoạn (ml) (ui/mg) (mg) (Ul/mg protein) (%)

Chiết xuất 780 47.480 5.460 8,7 100

Xử lý nhiệt 780 35.670 3.640 9.8 75

Siêu lọc 316 34.310 - - 72

T ủa axeton 155 29.540 1.670 17,7 62,2

Sắc ký 100 20.760 95 2,3 43,7

2.2.2. Thu nhận bromelain từ dứa

Bromelein có nhiều trong phần phế liệu khi xử lý trái dứa như vỏ,
lõi, chồi, đầu lõi, trong đó nhiểu nhất là ỏ phần lõi đầu dứa.
a) Đăc điểm chếphẩm bromelain
Bromelain thuộc nhóm proteaza xystein, trung tầm hoạt động của
nó có chứa nhóm -SH , do vậy các chất có chứa nhóm -SH đều là chết
hoạt hoá cho bromelain. Bảng 2.4 và 2.5 giối thiệu một sô" chất hoạt hoá
và ức chế bromelain.

53
 Bảng 2.4. Ảnh hưỏng của các chất hoạt hoá lên phế phẩm bromelain
Tôn chất hoạt hoá Nóng độ (M) Hoạt tính của bromelain (%)
L-xystein 1.10'* 100
Dithiothreitol 1.10'2 95,5
KCN 1.10-* 96
Thioglycolic axit 1.10'2 99

Bảng 2.5. Một số chất ức chế hoạt động của bromelain

Tftn chất ức chế Nóng độ (M) Hoại tính bromelain {%}
Không có chất ức chế - 100
N-chloromercurlbenzoat 4.10-* 16
HgCI2 1,44.10“* 0
lotoaxetat 2.10*2 0

Chế phẩm bromelain có hoạt tín h cực đại trong khoảng nhiệt độ
50 - 60°c, pH tối thích của chế phẩm khi sử dụng cơ chất cazein là
8,0-8,5, còn đối với azocazein thì dao động từ 6,0 - 9,0.
Khả năng thuỷ phân của bromelain với các loại protein là khác
nhau. Sự thuỷ phân tốt nhất là cazein và azocazein, cồn albumin của
máu bò thì kém hơn nhiều.

Hình 2.20. Khả năng-thuỷ phân của bromelain đối vóỉ các protein khác nhau

Trên cùng một cơ chất là azocazein, khả năng thuỷ phân của bromelain
kém hơn proteinaza nhận được từ Streptomyces grỉseus và cao hơn
chymotrypxin.
Hoạt tính của bromelain phụ thuộc nhiều vào trạng thái và điều
kiện bảo quản nguyên liệu. Nguyên liệu tươi mặc dù được giữ ở 4°c
nhưng hoạt tính thuỷ phân giầm đi gần 50%, còn nguyên liệu được sấy
khô ở 40°c thì có thể bảo quản lâu dài hơn.
54
 Bảng 2.6. Hoạt tính của bromelain theo đỉểu kiện bảo quản
Hoạt tinh dặc hlộu (UI/ mg protein)
Điểu kiện bảo quản
Dịch chiết Đõng khố
Nguyên liệu tươi 1.600 1.150
Bảo quán 4°c (5 ngày) 830 630
Sấy khô ở 40° 1.880 1.360

b) Thu nhận và tinh sạch enzym bromelain

1) N guyên tắc chung để thu nhận brom elain
Việc thu nhận và tinh sạch bromelain có thể thực hiện theo các công
doạn trên sơ đồ sau:
Chồi dứa ----- > Làm giập ----- >■ Lọc ----- > Ly tâm ------> Kết tủa
----- vLy tâ m ----- > Lọc ----- > Chế phẩm kỹ thuật ----- ►sắc k ý ----- »
Đông k h ô ------> Sản phẩm tinh.
- Chiết lọc bằng nưóc, ly tâm bỏ bã dung dịch.
- Kết tủa bằng (NH4)2SO, lạnh hoặc axeton lạnh thể tích 1:1.
- Dùng sắc ký trao dổi ion để thu chê phẩm.
2) Thu nhận bromelain bằng phương pháp nhanh sử dụng
CMC (cacboxyl m etyl xenluloza)
Phương pháp ép lọc rồi kết tủa vối (NH4)2S 0 4 hoặc axeton đòi hỏi
thòi gian lâu và việc lọc gặp nhiểu khó khăn do dịch chiết có nhiểu bụi
nhỏ, dung dịch có độ nhớt cao làm cho màng lọc bị ngăn chặn. Đồng thời
thực hiện theo phương pháp này số lượng dịch lớn, điều kiện bảo quản
gập nhiều khó khăn. Do vậy việc triển khai chưa được thuận lợi.
Hiện nay một số tác giả đã đưa ra phưđng pháp nhanh tách bromelain
bằng CMC. Phương pháp này thu được bromelain ở dạng bột trắng có
hoạt tính cao, thời gian nhanh, đơn giản hơn so với các phương pháp
khác. Phương pháp nầy có thể thực hiện ở điều kiện nước ta.
Có thể thực hiện việc chế tạo CMC từ vải màn, bông, vải gạc loại tốt.
- Tách chiết bromelain từ dịch chiết dứa bằng CMC:
CMC vải màn được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphat 0,05M,
pH = 6,1, sau dó cho vào dịch chồi dứa, thỉnh thoảng khuấy trộn. Sau 2
giờ lấy ra, vắt kiệt, vẩy sạch bẩn bám vào CMC vải màn, rửa protein
bằng đệm phosphat 0,05M, pH = 6,5. Sau đó tiến hành phản ứng hấp
phụ lần 1, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphat 0.05M,

55
pH = 7,1, 0,5 NaCl, khuấy trộn 3 - 4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kìột được
dung dịch đậm đặc chứa bromelain.
Tiếp tục phản hấp phụ lần thứ 2 như lần 1. Sau đó gộp các dung
dịch chiết lại, tủa bằng axeton hay cồn lạnh để tách lây enzym.
Với phưdng pháp này hiệu suất thu đạt 0,1% so với chồi dứa tươi, và
có hoạt tính 24UI/mg chế phẩm enzym, cao hơn gần 2 lần, thời gian
nhanh hơn và tiến hành thuận lợi.
• 1 N bOH __1'___ 1 1 __
ai CICHftCOOH /riA ín
Vải màn -—»Alcalixenlulaza— — *—-------->CMC
(Cacboxylmetyl xenluloza)
c) Một số ứng dụng của chế phẩm bromelain
1) T h u ỷ p h â n gan bò
Gan bò được xử ỉý bằng chế phẩm bromelain trong thài gian 10 giờ ở
nhiệt độ 55uc , sau đó xử lý nhiệt 100°c trong vòng 3 - 4 phút. Dịch thuỷ
phân tách dược đem lọc và đông khô. Hàm lượng amino axit của chế
phẩm thu được, với chế phẩm Biovit của Hungary được trình bày trên
bảng 2.7.
Bảng 2.7. Thành phẩn amỉno axit của chế phẩm thuỷ phàn gan bò
bằng Bromelain

Am ino axit Hàm lượng (nM/ml)

•
Bỉovit Chỗ' phẩm thuỷ phân
Lys 16,2 5,8
His - 1,4
Arg - 2,1
Asp 3,2 7,9
Ser 3.4 5,5
Glu 3,6 9,6
Ala 6,7 8,3
Val 3,8 7,6
Mat 0,3 0,7
lso 3,7 5,5
Leu 5,5 11,6
Tyr 2,1 1,7
Phe 2,7 4,6

56
 2) Sử dụng brom elain trong quá trình làm đông sữa
Renin là loại enzym được sử dụng làm đông tụ sữa truyền thõng,
enzvm renin được thu nhận từ ngăn thứ tư của dạ dày bê. Tuy nhiên,
cùng với sự gia tăng của công nghiệp chế biến sữa, lượng ronin được sản
xuất chưa tỉáp ứng được nhu cầu thực tô”. Trong 10 năm gần dây, xu
hướng sử dụng enzym proteaza thực vật trong chế biến sửa đang được
phát triổn, trong đó enzym ficin từ các loại cây cọ Ficus và bromelain
chồi dứa dang được quan tâm sử dụng vào mục đích này.

Bảng 2.8. Ảnh hưởng của một số enzym proteaza thực vật
lẽn quá trinh dõng kết sữa bò
Lượng enzym Thởi gian dông kết
Enzym Hộ s ố K*
(mg) (giày)
Ficin (calbiochem) 0,26 . 30 7,8
Papain (calbíochem) 0,25 45 11,25
Bromelain (calbiochem) 0,26 55 14,30

Bromelain (Việt Nam) 0,20 60 12,24

* Hệ số K cảng nhò, hoạt tính kết đông sữa càng lớn.

3) Sử dụng brom elain dể thu nhận các chất ức ch ế proteaza

Trong tế bào cơ quan động, thực vật tồn tại các chất ức chế enzym,
trong đó có chất ức chế proteaza. Các chất ức chế trong tế bào thường có
bản chất protein như enzym. Hiện nay, trong công nghiệp và y tế
thường sử dụng rộng rãi các chất ức chế này. Chế phẩm protcaza được
sử dụng để thu nhận các chất ức chế proteaza có chứa nhóm -SH theo
cách tiến hành như sau:
Bromelain được thu nhận và tinh sạch theo các phương pháp mô tả
ơ trên, sau đó nó được cố định trong gel sepharoza. Dịch nghiổn từ lõi và
đầu dứa sau khi lọc ly tâm được cho chạy qua cột chứa Bromelain cô"
định, trước tiên trong phosphat buffer pH = 4,6; sau đó pH = 7,6 - 7,8,
sau đó xảy ra quá trình liên kết giữa bromelain và chất ức chế của
chúng có m ặt trong dịch nghiền nói trên. Sau đó thu hồi chất ức chế
bằng dung dịch NaOH 0,01N có chứa NaCl 0,1M pH = 11,5 - 12. Bằng
phương pháp này chất ức chế thu được ở dạng tinh sạch hoạt tính cao.
Chất ức chế này có tác động mạnh lên các enzym như ficin, trypxin,
bromelain.

57
 Ngoài các ứng dụng trên đây, bromelain còn được ửng dụng trong quá
Lrình làm thịt mềm, thuỷ phân sản xuất nước mắm, sản xuất bột cá,...
2.2.3. Thu nhận papain từ nhựa đu đủ (Carỉca papayal)
Papain là một loại proteaza được thu nhận từ nhựa đu đủ, một loại
nguyên liệu có nhiều ở các nước nhiệt đới cũng như ở nước ta. Papain
được ứng dụng trong y học, công nghiệp thực phẩm như làm bia và nước
ngọt, làm mềm thịt,...
Papain có khối lượng phân tử (M = 20.700), có nhiệt độ hoạt động tối
thích là 80°c, pH tối thích là 5,0 - 5,5. Papain bị ức chế và m ất hoạt tính
bởi H20 2; Iotaxetat; lot vồ ferixianua. Papain được hoạt hoá bởi -CN;
xystein; HyS và glutation. Hiện nay có các chế phẩm papain thô và
papain thươ ng phẩm đang được sản xuất rộng răi.
Phương pháp thu papaỉn thô:
a) Thu nhận
Dùng khăn mồm lau sạch vỏ ngoài và lấy dao vạch những đưòng cắt
không quá sâu, cách nhau 2 “ 3cm. Nhựa (latex) chảy ra'v à được hứng
vào cốc, sau đó đem làm khô theo các phương pháp khác nhau ta được
chế phẩm papain thô. Ảnh hưởng của phương pháp làm khô đến hoạt
Lính của papain thô rất rõ rệt.
Bảng 2.9. Hoạt tính của papain theo thời gian bảo quản
và phương pháp làm khô

Hoạt tinh enzym - đơn vị papain (*)

C hất lưỡng
th eo bảo quản Phơi Sấy có quạt gió Sấy chân không Dung môi sấy
(1 - 2 nắng) (1 6 - 2 0 giờ) ( 7 - 9 già) ( 4 - 5 giờ)

Ngay sau khi sản

500 675 775 800
xuất

Sau 3 tháng 200 500 620 750

Hinh thức cảm Vón cục, Vón cục, Vảy mồng, vằy mỏng, óng
quan vàng nâu. vàng nhạt. trắng ngà. ánh, trắng ngà.

(*) Đơn vị papain là số gam fibrin tưdi bị thuỷ phân hoàn toàn thành pepton bởi 1g chế
phẩm papain.

58
 Hoạt tính của papain sau khi sản xuất là cao hơn khi đã để 3 tháng.
Trong các phương phốp làm khô thì phương pháp phơi nắng cho hoạt
tính thấp nhất, màu sắc và trạng thối xấu, sấy chân không trong
dung môi là cho chê phẩm có hoạt tính cao nhất. Enzym cần được bảo
quản ở 6 - 10°c.
b) Papain thương phẩm
Ngâm papain trong thể tích nưóc cất nhất định trong vài giò hoặc
hoà tan nhựa (latex) tươi trong nước cất, có thể bẩ sung một ít glyxerin
cho tạo th àn h dịch, lọc lấy dịch qua vài lớp vải màn. Dùng axeton lạnh
với tỷ lệ 2 : 1 so với thể tích dịch lọc, sau đó ly tâm lạnh và thu lấy kết
tủa. Sấy kết tủa ở nhiệt độ 45 - 50°c hay sấy chân không, hoặc phơi
khô. Sau đó nghiền thành bột ta có chế phẩm enzym thương phẩm.
Thông thường trong papain thương phẩm chỉ chứa 5 - 8% papain,
còn lại là chymopapain và peptidaza, Hoạt tính thuỷ giải protein của
papain thương mại (Merk) vồ của Viột Nam được trình bày trên bảng
2.10. Papain của Việt Nam có hoạt tính cao hơn 3 lần so với papain
thương phẩm (Merk). Các chế phẩm trên đều có thành phần tương tự
nhau. Khi chạy điện di trên gel polyacrylam it trong hệ (3 - alanin,
pH = 4,3, chúng đều chứa 5 tiểu phần trong đó 1 tiểu phần là papain, 3
tiểu phần là chymopapain và 1 tiểu phần là peptidaza A.
Bảng 2.10. Hoạt tinh của các chế phẩm papain

Hoạt tính proteaza Hoạt tinh amylaza

Chè' phẩm
(UI/ mg protein) (UI/ mg protein)

Thương mại (Merk) 19,9 1,5

Đông khô 53,5 3,1

Tươi (Việt Nam) 42,2 1,9

Tách bằng phương pháp sắc ký ion trên Cm - Sephadex c - 50 ở

pH = 7,5 và gradient nồng độ natri axetat từ 0 - 5M cho thấy, trong
latex tươi tồn tại 2 loại peptidaza A và B, tuy nhiên trong quá trình
sấy hoặc đông khô sản phẩm peptidaza B bị m ất đi trên 80% hoạt tính.
Thành phần protein và hoạt tính thuỷ giải của enzym trong các chế
phẩm papain được trình bày trên bảng 2.11.

59
 Bảng 2.11. Hoạt tính của các enzym trong các chấ phẩm papaỉrt
Chỗ' phẩm Thành phẩn protein (%) Hoạt tính thuỷ gìài {%)
Chê' phẩm thương mạl (Merk)
Papain 4,7 3,7
Chymopapain 66,2 40,5
Peptidaza B 15,2 32,9
Peplidaza A 13,5 16,7
Chồ' phẩm đông khô Việt Nam
Papain 7,6 1,4
Chymopapain 65,9 33,0
Peptidaza B 6,9 39,7
Peptidaza A 9,6 13,2
C hế phẩm tươi Việt Nam
9,6 3,7
Papain
45,1 40,2
Chymopapain
39,7 43,0
Peptidaza B
5,5 10,3
Peptidaza A

Tất cả cốc loại chế phẩm papain thương phẩm đều chứa các thành
phần err/ym có hoạt tính proteaza, trong đó papain chiếm từ 4,7 - 9,6%,
nhóm chymopapain từ 45,1 - 65,9%, peptidaza B từ 6,9 - 39,7% và
peptidaza A từ 5,5 —9,6%.
Papain được ứng dụng trong quá trình làm đông sữa, thuỷ phân
protein trong sản xuất bột cá thực phẩm, trong sản xuất nưốc mắm và
công nghệ làm mềm thịt.

2.3. CÁC ENZYM THƯƠNG MẠI CÓ NGUỒN G ố c THỰC VẬT, ĐỘNG

VẬT VÀ HƯỚNG THAY THẾ CHÚNG BẰNG ENZYM VI SINH VẬT
2.3.1. Amylaza của ngũ cốc
Các amylaza ngũ cốc đã được sử dụng rộng rãi trong hệ thông
enzym thương mại. Amylaza thu được từ malt lúa mỳ đã được áp dụng
nhiều trong th ế kỷ để sản xuất các đồ uốhg từ malt. Trong quá trình áp
dụng này, cả 2 enzym endoamylaza (a - amylaza) và exoamylaza (P - amylaza)
đều được sử dụng cho quá trình hoá lỏng và đưòng hoá tinh bột của ngũ
cốc trong công nghệ nấu dịch lên men. Nhò có quá trình hoá lỏng và
đường hoá mà tinh bột đã chuyển thành đường lên men (maltoza) và
tiếp tục được tạo thành alcol bởi tác nhân vi sinh vật nấm men. Quá

60
trình hoá lỏng tinh bột có thể được thay thế bằng amylaza của vi BÌnh
vật Bacillus subtilỉs.
Amylaza hoá lỏng tinh bột thu được từ Aspergillus (Flavus oryzae)
kém phù hợp bởi vì tính ổn định nhiệt của nó thấp hơn. Quá trình đường
hoá của tinh bột có thể hoàn toàn nhờ enzym amyloglucooxydaza thu
được từ một trong hai loại là Aspergillus niger hoặc Rhizopus oryzae.
Amyloglucooxydaza nấm mốc thuỷ phân tinh bột cho ra nhiều glucoza
hơn maltoza nhưng khả năng nghịch đảo đường lên men lớn hơn với việc
sử dụng a - amylaza từ malt, bỏi lẽ sự tạo thành các đường nghịch đảo
ít. Sản lượng alcol sẽ tăng lên do sự bổ sung nấm mổc vào môi trường,
hơn thế nữa amyloglucooxydaza ít bị ảnh hưởng hđn amylaza của malt,
do sự có mặt của vi khuẩn có độ pH thấp hơn giai đoạn lên men. Trong
sản xuất đồ uông có rượu, sự thay thế hoàn toàn m alt chưa được chỉ rõ
bởi vì m alt còn tham gia tạo mùi cho bia mà các loại vi sinh vật thay thế
không có được. Malt còn đang chiếm giữ vị trí quan trọng trong sản xuất
bia vì nó mang lại mùí vị tốt cho bia, Một ứng dụng thương mại của
amyloglucooxydaza nấm mốc trong sản xuất bia dextrin thấp đã được
nghiên cứu bởi Gablinger, 1968, và đã, đang được mở rộng sản xuất bia
năng lượng thấp.
Amylaza ngũ cốc cũng được sử dụng vào công nghệ nưống bánh như
ìà việc bổ sung bột có hoạt tính a - amylaza, làm cho có nhiều COz trong
bột lên men, kết quả làm bánh xôp hơn. Từ nửa đầu thế kỷ XX, a - amylaza
raalt ỏ trạng thái bột malt hay bột lúa mỳ đã được bổ sung với lượng
0,25 - 0,5% vào bột nhào để góp phần tạo ra đường lên men trong đó.
Cũng trong công nghệ bánh mỳ, a - amylaza của nấm mốc Aspergillus
flavusoryzae được bổ sung để làm tăng tốc độ lên men của giai đoạn bột
nhào và làm tăng các hoạt tính của bột nhào như là làm cho màu sắc
đẹp, bánh mỳ mểm mại. Sự bổ sung nấm mốc thường lợi hơn malt vì
nấm mốc được nuôi cấy tạo ra enzym có hoạt tính cao, chế phẩm không
chứa proteaza hoặc đã được định trưốc mức độ proteaza.
Sự bể sung chế phẩm nấm mốc cũng có mức độ nhiễm vi khuẩn nhỏ
hơn. Sự kiểm tra mức độ trong chế phẩm bổ sung rấ t quan trọng trong
sản xuất bánh nướng. Sô' lượng đó chính xác proteaza nấm mốc được sử
dụng trong sản xuất bánh mỳ thương mại để giảm thấp hơn thòi gian
chuẩn bị bột nhào. Nhũng dạng viên chứa diastaza và proteaza làm
tăng phạm vi lựa chọn bột nguyên liệu cho bánh mỳ. Một số quá trình

61
thương mại khác như khử hồ trên vải, sản xuất hồ tinh bột và tinh bột
nở lạnh đã được áp dụng enzym của vi khuẩn. Các ứng dụng chung này
dều được sử dụng amylaza thu được từ Bacillus subtilis, bởi vì enzym ổn
định ỏ nhiệt độ cao, phù hợp công nghệ nhiệt độ cao. sử dụng amylaza vi
khuẩn rẻ hơn amylaza của nấm mốc.
2.3.2. Các proteaza thực vật
Có 3 loại proteaza thực vật như bromelain, papain và ficin. Papain
thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn bromelain
thu từ quả, dọt, chồi dúa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzym này được
sử dụng đổ chống hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling
proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của proteaza thực
vật này lủ trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục đích tiêu hoá.
Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus caricà). Enzym được sử dụng
Ihuỷ phân protein tự nhiên.
Các proLeaza từ Aspergillus flavusoryzae và Bacillus subtiỉìs đã và
dang dược sử dụng thay thế cho các enzym proteaza thực vật này trong các
ứng dụng, nhưng riêng papain, các ứng dụng tiếp tục được nghiên cứu.
2.3.3. Lipoxydaza
Lipoxydaza thu dược từ bột dậu tương, nỗ được sử dụng rộng rãi để
khử màu của các chất màu tự nhiên trong bột màu. Mặc đù hoạt tính
lipoxydaza còn được tìm tháy trong nuôi cây vi khuẩn nhưng nó không
có khả nãng thay thế lipoxydaza của đậu tướng.

2.4. CÁC ENZYM THƯƠNG MẠI CÓ NGUỒN G ốc ĐỘNG VẬT VÀ HƯỚNG

THAY THẾ CHÚNG BẰNG ENZYM VI SINH VẬT
2.4.1. Chè' phẩm enzym tuyến tuy. (pancretic)
Các proteaza và tinh thể từ tuỵ tạng (pancreas) đã có một lịch sử lâu
dài trong thương mại. Có nhiều ứng dụng dịch tuỵ thô vào công nghiệp
nhưng trong y học đòi hỏi trypxin phải được tinh chế mới được sử dụng.
Trypxin tuyến tuỵ hoạt động thích hợp ồ pH = 7 —9. Công nghệ ứng dụng
enzyrn này đầu tiên là làm mềm và lột da để khử các vết sứt trên da sau
khi xử lý và làm mềm mại, thông khí cho sản phẩm da động vật.
Hiện nay có thể dùng proteaza thu được từ Aspergillus flavusoryzae
và Bacillus subtỉlis để thay thê cho enzym tuyến tuỵ.
Chế phẩm dịch tuỵ cũng được sử dụng để sản xuất sản phẩm thuỷ
62
phân protein và môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Các proteaza của nấm
môc và vi khuẩn ỏ dạng đơn lẻ hay tổ hợp cũng có thể sử dụng để sản
xuất ra các sản phẩm thuỷ phân protein tưdng tự như việc sử dụng tuỵ.
Sụ ]ựa chọn enzym nào đó sẽ phụ thuộc vào giá cả và yêu cầu dặc tính
của sản phẩm.
Chế phẩm dịch tuỵ đã và đang được áp dụng rộng rãi cho mục đích
tiêu hoá vì chế phẩm chứa enzym proteaza, amylaza và lipaza. Các
enzym này rấ t cần thiết cho các bệnh nhân có tuyến tuỵ bị rối loạn hoặc
bị cắt bỏ tuyến tuỵ.
Những hoạt tính chế phẩm dịch tuỵ có thể được nhân lên gấp đôi bởi
phương pháp thay th ế bằng enzym vi sinh vật thu được từ Bacillus
subtilis, Aspergillus flavusoryzae và Aspergillus niger. Xcnlulaza thu
dược từ Aspergillus nỉger cũng được trộn vào chế phẩm vi sinh vật Ilày.
Chê pham tuyến tuỵ vãn còn có sự phân biệt lớn trên thị trường, nhưng
đôi với chế phẩm tổ hợp các enzym của vi sinh vật lại được áp dụng khá
dầy đủ và thuận tiện.
Chê phẩm tuyến tuỵ cũng dùng sản xuất phần lớn các chế phẩm
enzym tẩy các vết bẩn, cho nên nó được dùng trong công nghệ làm khô
sạch các vật liệu, nó có thể tẩy được các vết màu khó hoà lan. Ngày nay,
người ta dùng enzym amylaza, proteaza và lipaza của vi sinh vật thay
thế cho chế phẩm tuyến tuỵ trong lĩnh vực này. Chế phẩm hỗn hợp
enzym vi sinh vật có ưu thế chịu được nhiệt độ cao và pH thay đổi trong
chu kỳ giặt tẩy, còn các enzym trong chế phẩm tuyến tuỵ không bền ở
nhiột độ cao và pH thay đổi đó.
2.4.2. Pepsin
Pepsin thu được từ dịch dạ dày của lợn, enzym này được sử dụng
trong quá trình hạn chế đục bia lạnh và mục đích tiêu hoá. Proteaza vi
sinh vật và papain có thể thay thế pepsin trong làm đục bia lạnh.
Pepsin hoạt động thích hợp ỏ pH = 1,3 - 2,2.
2.4.3. Renin
Renin được sử dụng nhiều trong sản xuất phomat. Enzym này được
tìm thấy trong ngăn thứ tư của dạ dày bê. Renin làm biến đổi cazein
thành paracazein - dây là chất kết tủa để hình thành vón đông sữa
trong điều kiện có canxi trong môi trưòng. Nhiều chế phẩm renin
thương mại bị nhiễm pepsin cho nên khả năng làm đông sữa kém.
Nhiều loại proteaza vi sinh vật có khả năng làm đông tụ sữa, nhưng chì
63
gần đáy mới có một sô" được nghiên cứu sản xuất. Chẳng hạn proteaza có
đặc tính renin được sản xuất từ các loại vi sinh vật như Endothia
parasitica và Murco purillus.

CÂU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG 2

1. Mục đích quá trình tạo hạt nảy mầm hay tạo malt để làm gì?
2. Hãy nêu các công đoạn chính trong quá trình sản xuất malt và quá
trình rửa hạt bằng dịch hoá chất hay gặp dể làm gì trước lúc ngâm hạt?
3. Hãy nêu cốc điều kiện kỹ thuật cần thiết cho quá trình ngâm và nảy
mầm của hạt và các phương pháp hay gặp nhất.
4. Hãy nêu các enzym chủ yếu hình thành và tăng lên trong quá trình
tạo m alt từ hạt đại mạch và tác dụng của nó làm gì?
5. Mục đích quá trình sấy khô malt để làm gì và hãy nêu điều kiện kỹ
Ihuật và các quá trình xảy ra lúc sấy malt tươi ra sao?
6. Đánh giá châ't lượng m alt khô thu được dựa vào các chỉ sô" chủ yếu
nào và nó thể hiện được chất lượng malt ra sao?
7. Muốn tạo ra-các loại malt có màu khác nhau ta cần chú ý khâu nào
quan trọng nhất trong quá trình tạo malt và ứng dụng các loại malt
này vào những mục đích gì mà bạn biết?
8. Hãy nêu nguyên tắc và phương pháp thu nhận enzym ureaza từ đậu
rựa và ứng dụng của nó.
9. Hãy nêu nguyên tắc và phương pháp thu nhận enzym bromelain từ
nhựa đu đủ và ứng dụng của nó.
10. Hãy nêu nguyên tắc và phương pháp thu nhận enzym papain từ
nhựa đu đủ và ứng đụng của nó.
11. Hãy nêu nguyên tắc và phương pháp thu nhận enzym bromelain từ
các phần của quả dứa và ứng dụng của nó.
12. Hãy nêu một sô' enzym thu nhận từ vi sinh vật đã thay th ế enzym
từ thực vật và hiệu quả của nó ra sao?
13. Hãy nêu một số enzym thu nhận từ vi sinh vật đã thay th ế enzym
từ động vật và hiệu quả của nó ra sao?

64
 C h ư ơn g 3

CÔNG NGHỆ SẢN XUÂT ENZYM TỪ VI SINH VẬT

3.1. NGUỒN ENZYM

3.1.1. Vỉ sinh vật - nguồn enzym vô tận

Enzym là chất xúc tác chịu trách nhiệm các quá trình trao đổi chất
của tế bào. Các tế bào từ các nguồn khác nhau đã, đang và sẽ tiếp tục là
các nguồn enzym cơ bản. Các enzym có thể được sản xuất từ các cd thể
sống, cũng có thể chiết từ các tế bào hoặc thu nhận chúng từ dịch tiết ra
của tế bào.
Vào nhũng năm 1960, mô thực vật và các cơ quan của cơ thể động
vật đã là nguồn enzym quan trọng nhất cho công nghệ sinh học enzym,
khoảng 70% enzym được chiết xuất từ mô hoặc dịch chiết thực vật và
các cơ quan động vật. Nhưng 20 nãm sau đó, vị thế bị thay đổi và phần
lớn các enzym công nghiệp được sản xuất có nguồn gôc vi sinh vật. Ngày
nay, enzym vi sinh vật chiếm trên 90% thị trưòng enzym, vì vi sinh vật
có hệ thống trao đổi chất mạnh mẽ, linh hoạt và dễ dàng nhân lên ở cấp
độ lốn bằng lên men chìm và lên men trên môi trường xốp, chúng dễ
dàng thao tác cả về m ặt môi trường cũng như biến đổi di truyền, hơn
nữa nhu cầu dinh dưõng của chúng đơn giản và không phụ thuộc vào sự
thay đổi thời tiết theo mùa. Các thuộc tính này liên quan đến công nghệ
sản xuất enzym. Tuy nhiên, hầu hết các enzym được sản xuất hiện nay
bằng vi sinh vật ưa ấm. Để tìm kiếm các enzym hoạt động tốt dưới điều
kiện khắc nghiệt, phải thúc đẩy việc nghiên cứu enzym từ các cơ thể ưa
điều kiện khắc nghiệt dựa trên giả thuyết các cơ thể có thể phát triển
trong môi trưòng khắc nghiệt có bộ máy enzym thích nghi và hoạt động
dưới điểu kiện như vậy. Enzym bền vững với nhiệt độ cao hay nhiêt độ
thấp ngày nay được sàng tuyển và thử nghiệm như là enzym công
nghiệp tiềm năng. Mặc dù các cơ thể ưa điều kiện khắc nghiệt như vậy
khó có thể phát triển trong điều kiện phòng thí nghiệm, gen của chúng
có thể được chọn dòng vào cơ thể ưa ấm thích hợp như miêu tả việc chọn
dòng gen enzym ưa nhiệt từ cổ khuẩn và vi khuẩn và gen enzym ưa
lạnh vào cơ thể ưa ấm. Trong thực tế, sự tiến bộ của đi truyền phân tủ
và kỹ thuật di truyền trong vài chục năm gần đây có khả năng chọn
dòng và biểu hiện hầu như bất kỳ gen nào vào cơ thể vi sinh vật thích
hợp, do vậy enzym từ các vi sinh vật khác cũng như các cơ thể bậc cao

65
hơn có thể được sản xuất trong cơ thể vi sinh vật chủ như vi khuẩn, nâ'm
mon và nấm mốc. Điểu này có ý nghĩa lớn nhằm góp phần làm tăng số
lượng enzym có thể sản xuâ't nhờ lên men vi sinh vật và cũng làm tăng
hiệu quả lên men và chất lượng sản phẩm enzym. Năm 1994, đă ước
tính có khoảng 50% enzym công nghiệp (dựa trên khối lượng) được sản
xuất từ cơ thể cải biến di truyền. Tỷ lệ này tăng nhanh trong mười năm
qua do sự tiến bộ của công nghệ ADN tái tổ hợp và công nghệ protein và
sản xuất các enzym đặc biệt cho công nghiệp dược và hoá học tinh vi.
Phát triển nguồn để sản xuất enzym đã tăng nhanh trong những
năm gần đây. Một ví dụ minh hoạ là trường hợp chymosin, nó là một
axit aspartic —proteaza rấ t đặc hiệu, thuỷ phân liên kết PheVQ5- M et106
của enzym cazein gây ra sự vón cục của cazein với sự có mặt của ion
canxi hình thành sữa đông (curđ). Không phải không có loại enzym khác
có tính đặc hiệu để làm sữa vón cục, tuy nhiên chymosin (chymotrypsin)
là phương án lựa chọn tốt nhất để sản xuất phomat, do hiệu suất đông
sữa cao và phát triển mùi đặc trưng trong phomat chín. Nguồn
chymosin truyền thông chiết xuất từ dịch bên trong dạ đày thứ tư của
bê non đang bú-và là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất bê. Sự thiếu
hụt rennet dẫn đến việc phát triển công nghệ sinh học nhằm tìm kiếm
các chất thay th ế rennin trong lĩnh vực sản xuất enzym. Do vậy, người
ta đã sử dụng pepsin để thay thế từng phần chymosin bất chấp chất
lượng phomat không đạt vẫn sản xuất. Vào đầu những năm 1960, ngưòi
ta quan tâm đến chymosin trong các nguồn vi sinh vật và đã thành công
thu nhận enzym proteaza từ nấm Mucor miehei và Mucor pusiỉlus. Loại
rennin vi sinh vật được giói thiệu trên thị trưòng vào nhũng năm 1960
và hiện nay vàn còn được xem là một phần có ý nghĩa thị trường
chymosin. Tuy nhiên, nó vẫn chưa được thị trưòng chấp nhận như
chymosin bê non bỏi VI hiệu suất đông thếp và hương vị khi làm chín
vẫn không dễ chịu. Hơn nữa, rennet vi sinh vật bền nhiệt hơn và phải
làm bất hoạt ở nhiệt độ cao không giống như rennet từ bê non. Với kỹ
thuật di truyền, đã chuyển gen chymosin vào Escherichia coli, tuy
nhiên, enzym được sản sinh trong thể vùi không hoà tan (insoluble
inclusion bodies), khó thu nhận. Cơ thể chủ tốt hơn đổ biểu hiện
chymosin là các vi sinh vật nhân th ật như nấm mốc và nấm men, chính
vì thế’ nấm sợi như Trỉchoderma và Neurospora đã được công bố như là
cđ thể chủ, nhưng Aspergillus đă được khẳng định là các cơ thể chủ tốt
nhất để sản xuất chymosin, vì enzym này có thể được tiết vào số' lượng
các dạng có hoạt tính cao hơn bằng cách sử dụng các vùng kiểm soát
66
kích thích bài tiết một sô enzym ngoại bào liên quan dến cDNA của
prochymosin (tiền chymosin) và enzym từ Aspergillus oryzae đã bán
trôn thị trường trên 10 năm nay. Chymosin cũng đã được tổng hợp
thành công ở cơ thế chủ là nấm men. Đầu tiên, Saccharomỵces cereưisiae
là cơ thế được chọn và chymosin gen cADN của bê non được chọn dòng
và biểu hiện, prochymosin được tổng hợp d mức 5% protein tổng của tế
bào nấm men. Tuy nhiên, hoạt tính enzym kém, do vậy Kluyueromyces
lactis, một loại nấm men có khả năng tổng hợp và tiết đầy prochymosin
hoạt động và sớm được xem xét để lựa chọn tốt nhất, bởi VI khả năng
kích thích bài tiết tuyệt vòi và có khả năng lên men ở cấp độ lón, tình
trạng dạng thực phẩm và khả năng của cả vectơ biểu hiện bổ sung và hệ
thông. Chymosin tái tổ hợp từ K. lactis đã bán trên thị trường trên 20
năm cho đến nay, có khả năng sử dụng rộng rãi trong sản xuất phomat.
Những ví dụ ở trên minh hoạ sự tiến triển của lĩnh vực sản xuất
cnzym mà chymosin chỉ là một trường hợp, còn nhiều trưòng hợp khác
tồn tại cũng rấ t có ý nghĩa như sản xuất proteaza kiềm sử dụng trong
bột giặt mà nó được tạo nên từ việc sử dụng rộng rãi các công cụ công
nghệ di truyền và protein để tạo nên proteaza đặc hiệu và có tác động
hữu hiệu dưới điều kiện khắc nghiệt của nghề giặt là. Cải biến hợp lý
cấu trúc và chức năng của enzym bằng kỹ thuật hiện đại như các
phương pháp tiến hoá có định hướng và đột biến điểm có định hướng,
kết hợp sàng tuyển đề’ tìm ra hoạt tính mới và hoàn thiện trong sự đa
dạng của tự nhiên sẽ tác động lên công nghệ sinh học enzym trong
những năm tối.
3.1.2. Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh enzym cao từ tự nhiên
Vi sinh vật sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị
nhanh đổ duy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. Vi
sinh vật có hệ enzym đa dạng và phong phú. Tuy nhiên, không phải tất
cả các vi sinh vật có khả năng sinh enzym như nhau, ngay cả những
chủng cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzym.
Vì vậy khi tuyển chọn vi sinh vật để tìm kiếm, lựa chọn và phân lập
chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzym mong muốn là cần
thiết. Ví dụ: muôn lựa chọn các chủng vi sinh vật sinh enzym chịu nhiệt
nên lựa chọn từ suôi nước nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các vi sinh
vật sinh enzym chịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit
cao- lựa chọn chủng sinh amylaza thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa
chọn chủng sinh enzym chịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ hguồn nước
67
biển. Ngưòi ta phân lập những chủng vi sinh vật có khả năng sinh
pectinaza thưòng từ những quả bị mốc; lựa chọn chủng sinh xenlulaza
thường tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bị phân huỷ.
Nấm mổc (hay còn gọi là nấm sợi) đã trỏ thành nguồn vi sinh vật
chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym. Hiện nay, có trên 80 loại
enzym khác nhau được sản xuất ở mức độ công nghiệp từ nấm mốc,
trong đó 10 loại được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. Bảng 3.1 cho
thấy, những enzym thuỷ phân chủ yếu được sản xuất bằng hai chi vi
sinh vật Aspergillus và Bacillus.
Bảng 3.1. Các vi sinh vật sinh enzym được sử dụng
trong sẳn xuất công nghiệp
Các enzym Các enzym
Vi sinh vật Vỉ sính vật
chinh chính
Aspergillus oryzae Amylaza và Bacillus mesentericựs Proteinaza
KC proteaza
Aspergillus oryzae Amylaza và Bacillus bubtilis Amytaza +
1476 proteaza Proteinaza
Aspergillus awamori Glucoamylaza Bacillus diastBticus Amylaza chịu
nhiệt
Aspergillus awamori Pectinaza Trichoderma viside Xenlulaza
Aspergillus terricola Proteinaza Trichoderma lignorum Xenlulaza
Aspergillus flaw s Proteinaza Aspergillus terreus Xenlulaza
Trichothecium Xylanaza Aspergillus niger Xylanaza
roseum
A. oryzae 4 -9 -7 5 a-am ylaza Streptomyces fradiae Proteinaza +
Estraza
Aspergillus awam oii Proteinaza axit Dtreptomyces griseus Proteinaza +
Estraza
Aspergillus Candidas Preteinaza + Fabospora flagilis p-galactozidaza
Renin

* Như vậy, trong tự nhiên, nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh các
loại enzym khác nhau. Để tuyển chọn các loại vi sinh vật có khẫ năng sử
dụng trong sản xuất dòi hỏi các bước ngliiên cứu công phu và m ất nhiều
công sức. Tuy hiện nay có nhiều chủng vi sinh vật đã đưa vào sản xuất,
nhưng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn các
chủng mối nhằm phục vụ cao nhất cho con người. Ví dụ: hiện nay người
ta vẫn tiếp tục sàng tuyển các chủng sinh enzym phân huỷ ligno -
xenluloza cao sử đụng trong sản xuất cồn nguyên liệu; tuyển chọn các

68
chủng có khả năng sinh enzym kiểm chế tế bào ung thư và sự nhân lên
của virus,...
3.1.3. Vấn để sảng tuyển các loại enzym mới
Để đáp ứng yêu cầu sản xuất chế phẩm enzym, các công ty phải có
phòng thí nghiệm nghiên cứu cơ bản để sàng tuyển nhanh các giống vi
sinh vật có hoạt tính enzym với giá thành hạ. Các mẫu đất, nước lấy từ
tự nhiên hay từ các khu vực bãi thải, phế thải có chứa các nguyên liệu
giông như cơ chất trong phản ứng enzym được sử dụng làm nguồn để
tuyển chọn giông, ví dụ: để sàng tuyển chủng vi sinh vật sinh proteaza
kiềm sử dụng trong thuộc da thì các mẫu thí nghiệm được lấy từ bãi phế
thải hay đất gần khu vực thuộc da; hay để sàng tuyển các chủng ưa
nhiệt có khả năng sinh enzym chịu nhiệt thì các mẫu thí nghiệm được
lấy từ suôi nước có giàu chất hữu cơ; các chủng ưa mặn từ nước biển.
Giai đoạn đầu của quá trình sàng tuyển các enzym công nghiệp là ý
tưởng tuyển chọn, nghĩa ]à xác định sự cần thiết ưu thế thương mại đối
với các loại enzym mối, đánh giá mức độ thị trường và quyết định có tính
chất ước lượng sô' lượng người sử dụng có nhiều không để đầu tư công
sức nghiên cứu. Thông thường, tất cả các yếu tố trên cổn phải được dự
tính kể cả yếu tố rủi ro. Việc thường xuyên đánh giá tài chính trong quá
trình phát triển để đưa ra kết luận liệu có sử dụng có hiệu quả enzym
không, chính vì vậy, một số chế phẩm enzym thương mại được chào bán
trên thị trưồng cho thây, các chế phẩm như vậy là nguồn enzym rẻ tiển,
có tiồm năng đáng được đầu tư nghiên cứu.
Nếu bưốc tìm kiếm đầu tiên này không thành công thì cần thiết
phải sàng tuyển cốc vi sinh vật mới có định hướng từ nguồn có mặt các
chất mà ở đó vi sinh vật muốn tồn tại đòi hỏi sinh ra các enzym để chông
lại. Do vậy, các cơ thể ưa nhiệt được tìm kiếm ò SUÔI nước nóng, ưa thẩm
thấu ỏ nhà máy đưòng, các cơ thể có khả năng chuyển hoá gỗ ở xưởng
cưa, bãi gỗ,... Việc xác định nguồn enzym vi sinh vật không có nghĩa kết
thúc việc tuyển chọn mà cần phải xác định các tính chất của enzym như
nhiệt độ cho năng suất tôi ưu, pH tối ưu và độ ổn định của enzym, hằng
sô" động học (Km, VmM), có hay không sự ức chế của cơ chất hay sản phẩm
và khả năng chống lại các cấu phần của các chất khác đưa vào cùng sản
phẩm và cơ chất. Sau đó, đánh giá enzym bằng công nghệ protein và
khắc phục các yếu điểm của enzym để xác định năng suất của chủng
giông sản xuất, cách tách chiết enzym, sử dụng ỏ dạng tự do hay cố định
và nếu cần thiết, phải tinh sạch enzym, Nếu vi sinh vật không được cơ

69
quan có thẩm quyển chấp nhận theo quan điểm điểu chỉnh về an toàn
sinh học thì có hai lựa chọn: hoặc loại bỏ hẳn vi sinh vật đó và tiếp tục
công việc sàng tuyển các vi sinh vật khác, hoặc chọn dòng gen của
enzym từ vi sinh vật này vào các vi sinh vật đã cho phép sỏ dụng trong
B ẩn xuất enzym và bước tiếp theo là tạo chủng tái tổ hợp để làm tăng
hiệu suất quá trình lên men. Tuy nhiên, chọn đòng không phải là công
việc làm thường xuyên và lúc nào cũng thành công, do vậy vẫn còn có
cách tuyệt vời để lựa chọn, đó là lựa chọn của các loài nguyên bản đã
phát hiện ra bằng cách sàng tuyển từ tự nhiên.
Hiện nay, trong công nghiệp người ta quen sử dụng enzym cô" định
(xem Chương 4) và nhận thây rõ ưu điểm của chúng, nên trong thực tế
sử dụng, các enzym mới ở dạng cô' định sẽ sớm được xác định trong quá
trình tuyển chọn như: nếu enzym nội bào, thì xem xét rấ t cẩn thận việc
sử dụng nó không cần tách chiết và tinh chế, và các chủng được lựa chọn
đảm trách sử dụng theo cách này.
Nếu một vi sinh vật sinh enzym mong muốn đã được tuyển chọn ỏ
cấp độ phòng thí nghiệm dựa trên các tiêu chuẩn về năng suất, hoạt
tính và độ ổn định của enzym thì chủng này cần thử nghiệm sản xuất ỏ
mức độ pilot để hiệu chỉnh các sai sót trong phòng thí nghiêm. Nếu sản
xuất thử nghiệm ở cấp độ pilot thành công thì phải tiến hành thử
nghiệm ở cấp độ cao hơn để ngưòi tiêu dùng sử dụng đánh giá, các mẫu
enzym ở cấp độ sản xuất thử phải được nghiên cứu an toàn và độc tố học
để đảm bảo cho giông của quá trình sản xuất thử nghiệm cung cấp sẽ là
giông ơảa quá trình sản xuất đầy đủ.
Việc sàng tuyển các enzym mới tốn kém, do vậy cần được bảo vệ
chông lại sự sao chép từ những người cạnh tranh. Việc thường làm là
đăng ký bằng sáng chế enzym, hoặc phưđng pháp sản xuất, hoặc giải
pháp hữu ích của quy trình sử dụng trong đó. Việc đăng ký phát minh
sáng chê càng sớm càng tốt như là minh chứng tạo ra phát minh có tính
chất sáng chế.

3.2. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN SẢN XUẤT ENZYM
3.2.1. Nguyên tắc chung

Ngày nay, enzym được sản xuất để ứng dụng vào thực tế cấp độ
khác nhau từ quy trình sấn xuất lớn mà ỏ đó enzym được xem như hàng
hoá đên ứng dụng ở câp độ nhỏ để nghiên cứu đặc tính và sử dụng các
enzym tinh khiết mà ở đó enzym được xem xét các tính chất riêng. Từ đó
70
xác dịnh mức độ sán xuất và loại hình ứng dụng enzym đó. Đặc trưng
của các enzym được ứng dụng trong y học và sản phẩm chăm sóc sức
khỏe thường đòi hỏi mức dộ tinh khiết cao, với khôi lượng khá nhỏ; trong
khi các enzym sử dụng trong sản xuất thực phẩm, thức ăn bổ sung và
nhiên liệu ỏ mức độ công nghiệp lớn thì thường sản xuất chế phẩm thô,
với khối lượng lổn. Do việc sủ dụng enzym cố định tăng cho các quá
trình sản xuất ở cấp độ lớn đã làm tăng nhu cầu các chế phẩm enzym
tinh khiết hơn.
Quá trình lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật phụ thuộc vào
nguồn và nơi khu trú của enzym (nội bào hay ngoại bào), tuy nhiên sơ đồ
sản xuất enzym chung được trình bày trên hình 3.1.

Hình 3.1. Sơ đó dây chuyển công nghệ sản xuất enzym bằng phương pháp l&n men
(đường liền quá trình sản xuất enzym ngoại bào,
đường nổt đứt là quá trình sản xuất erizym nội bào, mô hay dịch tế bào)

Quá trình sản xuất có thể phân chia theo bôn giai đoạn như sau:
a) T ổng hợp enzym : Được thực hiện ở giai đoạn nhân giông (pha
tăng tốc) của tế bào sản xuất.
b) Thu nhận enzyrn: Được thực hiện quá trình tách chiết enzym từ
hệ thống tế bào sản xuất và liên quan đến phân tách pha rắn/lỏng, chiết
xuất tế bào và/hoặc cô đặc enzym.
c) T in h sạch e m y m : Được tiến hành hàng loạt các thao tác để khi
thu nhận enzym đã được loại bỏ các chất không mong muốn.
d) Tạo c h ế p h ẩ m enzym: Bao gồm các công đoạn khác nhau dựa
vào viêc tạo ra sản phẩm enzym cuối như cố’định enzym, lập công thức,
nghiên cứu độ bển và tiêu chuẩn hoá sản phẩm.

71
3.2.2. Thiết kế các quá trỉnh lên men công nghiệp
Các quá trình lên men đòi hỏi các yêu cầu sau:
a) Giông thuần của một cơ thể đã chọn cả về chất lượng cũng như
trạng thái sinh lý;
b) Phải vô trùng, cần quan tâm đến môi trường cho sính trưỏng của
vi sinh vật;
c) Thiết bị nhân giông: Thiết bị trung gian để phát triển giống đáp
ứng cho nồi lên men chính;
d) Thiết bị lên men: Cấp độ phòng thí nghiệm và cấp độ sản xuất lớn;
e) Thiết bị để lếy môi trường nuôi cấy ỏ trạng thái ổn định; phân
tách tế bào (sinh khối); thu nhận dịch nuôi đă loại bỏ tế bào; tinh sạch
sản phẩm và xử lý chất thải, nước thải đầu ra,
Thiết bị lên men hay thiết bị phản ứng sinh học được chế tạo với
cánh khuấy và có cấp khí oxy trong quá trình hiếu khí, cánh khuây luôn
giữ cho nồng độ môi trường đồng nhất và hệ thông điều chỉnh nhiệt độ,
kiểm tra pH và phương thức kiểm soát tương ứng.
Trong các mục tiếp theo đây, giáo trình trình bày quy trình sản
xuất và tạo chế phẩm enzym bằng phương pháp lên men vi sinh vật.

3.3. QUY TRÌNH CÒNG NGHỆ LÊN MEN SINH TổNG HỢP ENZYM
3.3.1. Hệ thống nuôi cây vi sinh vật
Trong sản xuất enzym có nhiều phương pháp lên men sản xuất phụ
thuộc vào tính chất của vi sinh vật và mục đích sử dụng như phương
pháp lên men bể mặt, lên men trên mối trường xốp và lên men chìm
(chiểu sâu). Tuy nhiên, trong công nghiệp sản xuất hiện nay người ta
quan tâm đên phương pháp lên men chim, vì nó có thể phát triển ở cấp
độ lón và dễ tự động hoá quá trình sản xuất. Vì vậy, có ba hệ thống nuôi
cấy (hay quá trình lên men) chính như sau:
a) jVwổ/ cấy hay quả trình lên men theo m ẻ (batch processing)
Kết thúc pha ổn định, thu nhận sinh khôi (tế bào, cơ thể) hoặc các
hợp chất mà nó tích lũy trong môi trường nuôi cấy (rượu, amino axit) và
bắt đầu mẻ lên men mói. Ưu điểm của quá trình này thu hồi sản phẩm
đạt mức tốĩ ưu. Nhược điểm là lãng phí môi trường không sử dụng hết,
phải ngắt quãng thòi gian giữa các mẻ.

72
 b) Nuôi cấy liên tục (continuous processing)
Môi trường được bổ sung liên tục vào nồi lên men và lấy ra dịch đã
lên men đê thu nhận sản phẩm theo từng giai đoạn đã định trước.
Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trưòng tĩnh, hàm lượng chất dinh
dưỡng cạn kiệt dần, sản phẩm trao đổi chết tăng lên làm cho pha log chỉ
kéo dài trong một thời gian ngắn, làm thay dổi tốc độ sinh trưởng riêng,
hình thái và các đặc điểm sinh lý —sinh hoá của vi sinh vật, gây khó
khăn cho quá trình công nghệ và sản xuất công nghiệp.
Để tránh sự “già” của giống, giữ giống luôn ỏ cùng một trạng thái ở
pha log, người ta dùng các môi trường đổi mới liên tục bằng cách liên tục
dưa môi trưòng dinh dưõng vào và đồng thài loại bỏ một lượng dịch
huyền phù vi sinh vật ra. Đây là nguyên tắc cơ bản cho quá trình nuôi
liên tục trong hệ thống các nồi lên men kiểu Chemostat và Turbidostat.
Như vậy, ta có thể điều chỉnh quá trình này ở Chemostat (đo mật độ
huyền phù) hay ở Turbidostat (đo độ đục nhò tế bào quang điộn). Khi
làm cho dòng môi trường chảy vào chậm, thì số lượng tê' bào trong bình
tăng lên và vì thê dẫn đến làm giảm tôc dộ sinh trưởng của vi sinh vật,
giảm cho dến ]úc đúng bằng tốc độ dòng môi trường vào bình (đúng hơn
là hệ số pha loãng); ngược lại, khi tăng tốc độ môi trưòng cho vào, sô'
lượng tế bào giảm đi, vì vậy tốc độ sinh trưởng của chúng tăng lén một
cách tương ứng.
Ưu điểm của nuôi cấy liên tục là làm cho tốc độ sinh trưỏng riêng
của vi sinh vật cao, thu dược lượng sinh khôi cao, nghiên cứu cụ thể
được sự thay đổi cơ chất, sản xuất được các chất trao đổi với hoạt tính
mong muôn, tiết kiệm do không có thời gian chết và tối ưu dễ dàng điểu
kiện nuôi cấy, bằng cách thêm chất dự trữ hay thay đổi các thông số'
hoạt dộng.
Nhược điểm khó tránh khỏi là sản xuất các chất trao đổi thứ cấp
không luôn luôn được ổn dinh; dễ bị tạp nhiễm, tập hợp ngẫu nhiên vật
thể lạ trên bề m ặt tế bào, dẫn đến quá trình không đồng bộ và sau thời
gian dài có thể dẫn đến biến mất tính trạng của giống nguyên thuỷ.
c) Nuôi cấy theo mẻ có b ổ sung (f e d b a tc h processing)
Trong hệ thống lên men theo mẻ có bổ sung, môi trường mới được bổ
sung liên tục và theo giai đoạn vào bình nuôi nhưng không loại bỏ dịch
nuôi cấy khỏi bình cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Nồi lên men
được thiết kế với dung tích tăng hơn dung tích lên men ban đầu. Lên

73
men theo mẻ có bổ sung chỉ thành công ở một sô" quá trình và sản phẩm
dược kiểm soát hợp lý.
Nuôi cấy theo mẻ có bổ sung có các ưu điểm: Giữ các điều kiện
trong quá trình nuôi cấy có cấp khí vào nổi lên men; loại bỏ sự kiểm
chế của các thành phần môi trường như việc sử dụng quá nhanh nguồn
cacbon, nitơ và phosphat; loại trừ được ảnh hưởng độc tính của các
thành phần môi trường và cung cấp có giới hạn các chất dinh dưỡng
cho các chủng dinh dưỡng thụ động. Tuy nhiên, lên men theo mẻ có bổ
sung thường phù hợp cho sản xuất các sản phẩm bậc hai của quá trình
trao đổi chất.
3.3.2. Tiêu chuẩn của giống đưa vào sản xuất
Một chủng vi sinh vật được coi ià chủng giống tốt sử dụng trong sản
xuất nếu hội tụ được rihiểu các đặc tính ưu việt, trước hết phải có năng
suất cao, đồng thời phãi có thêm những đặc điểm sau: (1) Có khả năng
sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như các phụ phẩm, các nguyên
liộu thô,... để sinh sản và sính tổng hợp enzym chính nhanh; (2) Tạo ít
nhất sản phẩm phụ trong qưố trình lên men sản xuất; (3) ít mẫn cảm
với các vi sinh vật tạp nhiỗm và thể thực khuẩn; (4) Tách chiết sinh khối
hay sản phẩm khỏi dịch lên men dễ dàng. (5) An toàn về m ặt sinh học
khi sử dụng; ( 6) ít tác hại đến môi trường,..,
Viộc lựa chọn chủng giống vi sinh vật cho một quy trình công nghệ
là hết sức quan trọng. Ngưòi ta thường lựa chọn chủng có hoạt tính cao
bằng cách hoàn thiện genotype nhò các phương pháp chọn lọc tự nhiên,
lai tạo, gây đột biến bằng các tác nhân vật lý như tia ƯV, tia X, tia
Gamma, hoặc bang các chất gây đột biến như etylenimin, axit nitric,
nilrosoguanidin,... Hiện nay, nhờ hiểu biết các con đưồng trao đổi chất,
bằng phương pháp gây đột biến tạo được nhiều biến đổi về gen và chọn
lọc định hưổng như bổ sung chất chọn lọc vào môi trưòng trong quá
trình tuyển chọn sẽ nâng cao được hoạt tính sinh tổng hợp của chúng,
không những thế, sử dụng chọn lọc bằng phương pháp đột biến đã chọn
lọc những ưu điểm của chủng sản thuận lợi cho quá trình sản xuất, Do
vậy, trong vàì thập niên gần đây, người ta đã sử dụng các phương pháp
của kỹ thuật di truyền hiện đại để tạo chủng giông có tính chất mong
muốn một cách chủ động. Rõ ràng, việc hoàn thiện genotype của chủng
giống là không cổ điểm dừng và phải làm thường xuyên. Chính vì vậy,
các chủng giống được dùng trong sản xuất có đặc tính ngày càng hoàn
74
hảo hơn, năng suất ngày càng cao, giá thành sản phẩm ngày càng hạ,
dáp ứng ngày càng tô't hơn các yêu cầu của con ngưòi.
Trong quá trình sản xuâ't, vì giông được lưu giữ trong các diều kiộn
báo quản khác nhau, nên trước khi đưa giống vào sản xuất, chúng thường
được hoạt hoá và thường xuyên kiểm tra chất lượng. Hơn nữa các chủng
có hoạt tính cao được chọn lọc nhân tạo, thường có thiên hướng thoái hoá
(lại giống) do đặc tính chung của vi sinh vật là sinh sản nhanh và phân ly
liên tục. Do vậy, những cơ sỏ sản xuố't bằng phương pháp lên men thường
phải thành lập phòng kỹ thuật làm nhiệm vụ sau đây: Kiểm tra độ thuần
khiết của giống trong lên men, kiểm tra khả năng hồi biến của giông,
hoạt hoá giống sau một thời gian sủ dụng, thường xuyên chọn chủng có
hoạt tính cao bằng phưdng pháp chọn lọc tự nhiên và bảo quản giống
bằng các phương pháp thích hợp để phục vụ cho sản xuất. Để hoạt hoá
giống, ngưòi ta thường sử dụng môi trường có thành phần giàu các chất
kích thích sinh trưởng như cao nấm men, nước chiết cà chua, hổn hdp các
vitamin, axit béo hay cơ chất trong sản xuất enzym,
3.3.3. Dinh dưdng và môi trường nuôi cấy vi sinh vật
a) Thành p h ầ n dinh dường ở t ế bào vỉ sinh vật
Chất dinh dưỡng VI sinh vật là nguyên liệu cung cấp cho các quá
trinh sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào và các quá trình
trao đổi nãng lượng ở vi sinh vật, chất dinh dưỡng phải là những hợp
chất có tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.
Để nghiên cứu môi trưồng dinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật,
người ta phải nghiên cứu thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật, nó
quyết định nhu cầu dinh dưâng của chúng. Thành phần dinh dưỡng của
tế bào vi sinh vật được xây dựng từ các nguyên tố đa lượng (C, H, o , N),
các nguyên tố khoáng đa lượng và khoáng vi lượng. Hàm lượng các
nguyên tô' ỏ vi sinh vật khác nhau và ỏ các giai doạn phát triển khác
nhau của vi sinh vật là khác nhau. Tuy nhiên, chúng bao gồm 2 loại
chính: nước và các chất hữu cơ.
b) Quá trìn h dinh dường ỏ t ế bào vi sinh vật
Trao đổi chất (metabolism) của tế bào hay của cơ thể là tất cả các
phản ứng hoá học diễn ra trong tế bào hoặc cơ thê gồm hai quá trình: Dị
hoá (catabolism) là các phản ứng phân giải và đồng hoá (anabolism) là
các phản ứng tổng hợp các chất khác nhau để xây dựng và kiến tạo tế

75
bào hoặc tiêu tôn năng lượng. Hai quá trình đồng hoá và dị hoá tương
tác với nhau và diễn ra đồng thời. Các quá trình oxy hoá - phân huỷ
kèm theo sự giải phóng năng lượng cần thiết cho hoạt động sống được
gọi là quá trình trao đổi năng lượng.
Phần lớn các vi sinh vật thuộc loại dị dưỡng hoá năng (sử dụng hợp
chất hoá học làm nguồn năng lượng thông qua truyền trực tiếp bằng
điện tử —electron), còn nhóm tự dưỡng hoá năng là sử dựng hợp chất vô
cơ và nhóm vi sinh vật dinh dưõng quang năng là nhóm đĩnh dưỡng
quang năng vô cơ và dinh dưõng quang năng hữu cơ.
c) Nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật
Các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng có ý nghĩa rất lớn trong
quá trình nuôi cấy và nghiên cửu các chủng vi sinh vật. Hiểu được các
nguy ôn tố, hàm lượng cấu thành tế bào, nguồn gốc của các chất dinh
dưỡng cũng như chức năng của chúng đối với tế bào vi sinh vật là rất
cần thiết trong nghiên cứu tối ưu hoá môi trưòng nuôi cấy và lên men
sản xuất các sản phẩm trong công nghiệp.
Một sô’ loài có thể sử dụng một sô' hợp chất đơn giản làm nguồn dinh
dưõng cho tấ t cả các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng và nguyên tố vết
và từ đó chúng được tổng hợp tất cả các phân tử hợp chất cần thiết cho
sinh trưởng. Những vi sinh vật khác không có khả năng trao đổi chất
rộng và sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào các phân tử hữu cơ có
sẵn mà chúng không có khả năng tổng hợp. Do vậy, chúng phải thu
nhận các hợp chất này từ môi trường.
Tuỳ thuộc vào nhu cầu các chất là nhân tố sinh trưỏng, vi sinh vật
thường được chia làm hai nhóm: Tự dưởng (prototrophes) là những vi
sinh vật không nhất thiết cần các nhân tố sinh trưởng và khuyết dưỡng
(còn có tên dị dưõng - auxotrophes) là những vi sinh vật đòi hỏi các chất
hữu cơ nhất định cần cho sự sinh trưởng của chúng.
Các vi sinh vật nguyên dưỡng có thể nuôi cấy được trên môi trường
tối thiểu, loại môi trường này chỉ chứa các nguyên tố dinh dưõng chủ
yếu. Ví dụ: môi trưòng tối thiểu có thành phần như sau (g/1): Glucoza -
10,5; KaH P 0 4 - 1; KH2PO< - 3,5; NH4C1 - 0,5; M gSO^H^O - 0,05;
Fe2S 0 4.7H20 — 0,005; NaC1.2H20 - 0,05; MnCl2.4HoO và nưóc cất -
1.000ml.
Các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng thích hợp để xây dựng tế
bào vi sinh vật được tóm tắ t trên bảng 3.2.

76
 Bảng 3.2. Các chát sinh dưõng đa lượng, vi lượng, nguõn gốc
và chức năng đối với tế bào vi sinh vật
% khối
Nguyên
lượng Nguỗn gốc Chức năng
tố
Khô (*)
Thức ăn đa ÌUỢng
Cacbon 50 Hợp chất hữu cơ Xây dựng thành phần vật chất ca bản cùa
hoặc C 0 2 tế bào.
Oxy 20 H20 , hợp chất hửu Xây dựng nên vật chất vả nước trong tế
cỡ, C 0 2 và 0 2 bào, 0} là chát nhận điện tử trong hố hấp
hiếu khí.
Nitơ 14 NHj, N 03, hợp chất Xảy dựng nên amino axit, nucleotit cùa
hữu cơ, N2 axit nucleic và coenzym.
Hydro 8 H20 , hợp chát hữu Xảy dụng nên các hợp chất hữu cơ;
cờ, Tham gia vào quá trình sinh năng lượng
như các proton.
Phospho 3 Phosphat vô cơ Xảy dựng nốn axit nucleic, nucleotit,
(P 0 4) phospholípit, LPS, axit teichoic.
Thức àn vi lượng
LƯU 1 S 0 4, HjS, s°, hợp Xây dựrig nên xystein, methionin, glutathlon
huỳnh chất hữu cơ chứa và nhiều coenzym.
IƯU huỳnh
Kali 1 Muối kali Xây dựng nên các cation vô cơ của tế
bào và là cofactor cho các enzym.
Magiê 0,5 Muối magiê Dạng cation vô cơ của tế bào, cofador
cho nhiáu phản Lfrig enzym.
Canxi 0,5 Muối canxi Cation vô cơ là cofactor cho nhiéu enzym
vả lả cấu phẩn của nội bào tử.
Sắt 0,2 Muối sắt Cẩu phẩn của cytochrom và các protein
khác và cũng là cofactor cho một số phản
ứng enzym.

* % khối lượng khô tế bào E. coli tiêu biểu trong pha log.
d) Cách tín h thành p h ẩ n mói trường nuôi cấy vi sìn h vật
Ngày nay, người ta kiểm tra tỷ lệ cacbon: nitơ: phospho: kali có
trong môi trường nuôi cấy ví sinh vật tương đương với tỷ lệ này trong
sinh khôi vi sinh vật để cân đôì các thành phần dinh dưdng hợp lý. Tỷ lệ
các chất này trong sinh khối vi sinh vật như sau: C: N: P: K - 50: 10: 4: 1.
Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện hiếu khí, một nửa
nguồn cacbon đồng hoá vào sinh khối còn một nửa qua hô hấp thành

77
C 0 2. Do vậy trong môi trường lên men hiếu khí, tỷ lệ các chất là C: N: P:
K = 100: 10: 4: 1. Tuy nhiên, trong điểu kiện lên men kỵ khí, ví dụ: xử lý
rác thải kỵ khí (chôn lấp rác), thì khoảng 90% nguồn cacbon phân huỷ
được dùng vào trao đổi năng lượng. Do vậy, tỷ lệ các nguồn tốt nhất là C:
N: P: K = 500: 10: 4: 1 đủ để cung cấp chất khoáng cần thiết.
Tuy nhiên, để tính chính xác nguồn cacbon bổ sung vào môi trường
lên men phù hợp, Aiba (1965) tính theo cách sau: Nếu ta muôn sản xuất
dược 40g/J tế bào khô của vi khuẩn hiếu khí chứa nguyên tố cacbon bằng
50% khối lượng của nó và có thể biến đổi được 50% cacbon có trong cơ
chất th ì cơ chất đó phải chứa: [(40 X 50)/100] X (100/50) = 40g (cacbon).
Còn nêu lượng cacbon đó được cung cấp dưới dạng glucoza thì trong công
thức của mỗi môi trường cần có: 40 X (180/72) = lOOg (glucoza).
Phcp tính tương tự cho phép ta xác định được khối lượng hợp chất
nitơ cần phải đưa vào công thức môi trưồng. Tuy nhiên, sử dụng dạng
nào của nguồn cacbon và nitơ là tối ưuf hoàn toàn phụ thuộc vào bản
thân vi sinh vật và chỉ có thể xác định chính xác bằng thực nghiệm. Như
vạy, nguồn cacbon vồ nâng lượng được đưa vào ỏ phạm vi 10 —100g/l. Ổ
nhiều chủng vi sinh vật, nồng độ cần thiết để duy trì tốc độ cực đại là râ't
nhỏ, dối với đường thì chỉ khoảng 1 - 10mg/l. Với amino axit và vitamin
thì tố bào chí cần nồng độ 1 —100|ag/l.
Một thành phần cần thiết cho sinh trưởng của vi sinh vật hiếu khí
là oxy. Johnson (1959) đã đưa ra công thức cho phép tính lượng oxy cần
thiết cho sinh trưỏng của một vi sinh vật hiếu khí, phát triển trong cơ
chất gồm những hydratcacbon như sau:
m M 02 /phút = (3333 : y) - (40,8 X G)
Trong đó, y là khôi lượng tế bào vi khuẩn khô tạo thành từ lOOg glucoza;
G là tốc độ phát triển tính bằng g/phút.
Nhu cầu oxy thay đổi ở các vi sinh vật khác nhau, như tảo, nâ'm hay
một số vi khuẩn là vi sinh vật hiếu khí hoàn toàn, nhất thiết đòi hỏi
lượng oxy hoà tan cao; ngược lại, nấm men hay vi khuẩn hiếu khí tuỳ
tiện, có thể phát trion ỏ điểu kiện có hay không có oxy.
e) Tối ưu hoá thành p h ầ n môi trường
Thành phần môi trường nuôi cây vi sinh vật được xác định bằng
t-hực nghiệm, với mục đích lựa chọn môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy
thu nhận được lượng sản phẩm tối đa. Đây là công việc vất vảf lâu dài
đòi hỏi người nghiên cứu phải có kiến thức sâu về sinh lý vi sinh vật.

78
Thành phần môi trưòng và điều kiện tối ưu dược xác định bằng hai cúch:
chọn lọc thực nghiệm lâu dài qua ríhiểu giai đoạn và sử dụng phương
pháp toán học mô hình hoá thực nghiệm.
Cách thứ nhất là phổ biến từ trước tới nay trong công tác nghiên
cứu vi sinh vật. Người ta xác định tính chất thành phần môi trường dựa
trên dặc điểm sinh lý của vi sinh vật, còn nồng độ được xác định bằng
hàng loạt các thí nghiệm, trong dó cấu tử của môi trường dược thay đổi
trong khoảng giới hạn, còn cấu tử khác giữ nguyên. Cách này đáng tin
cậy, nhưng m ất nhiều thời gian.
Cách thứ hai là sử dụng phương pháp toán học kế hoạch hoá thực
nghiệm cho phép xác định nhanh các chế độ và thành phần tối ưu của
môi trưòng dinh dưỡng. Tối ưu hoá gồm hai giai đoạn: ở giai đoạn đầu
cần xác lập bằng hàng loạt thí nghiệm nhằm xác định ý nghĩa của các
yếu tố nghiên cứu, xác định hướng và mức độ biên đổi của mỗi yếu tô"
trong Ihí nghiệm của quá trình tốì ưu hoá. Sau đó thực hiộn kế hoạch
hoá dựa theo các yếu tố 2", là việc thể hiện tất cả các tổ hợp có thể có
giữa n các yếu tô" nghiên cứu. Mỗi yếu tô" đểu được kiểm tra đồng thời và
không phụ thuộc vào nhau à 2 mức độ: cận trẽn (+) và dưới (-) khi tối ưu
hoá thành phần môi trưòng. Trung tâm của thực nghiệm là mức độ
trung bình hay là mức cd bản (0), tức là số trung bình cộng giữa mức
trên và mức dưói của mỗi yếu tô'. Giai đoạn thứ hai là bản thân quá
trình tối ưu hoá môi trường theo phương pháp lên dốc (phương pháp Box
- Wilson) với nhiệm vụ là tìm một tương quan tối ưu cho các yếu tô' quan
trọng n h ấ t (có ý nghĩa nhâ't) trên cơ sở cô' dịnh các yêu tổ' còn lại.
Ị) Nguyên liêu trong sản xuất enzym từ vi sinh vát
- Các nguyên liệu tinh bột: Các loại bột ngũ cốc và bột sắn. Ngoài
thành phần tinh bột là chủ yếu còn chứa một lượng nhỏ các hợp chất
protein, các chấl xơ và các chất khoáng.
- Các nguồn nguyên liệu thuỷ phân tinh bột: Đó chính là glucoza
dược thuỷ phân bằng axit hoặc bằng enzym amylaza.
- Các loại rỉ đưòng (mật rỉ): địch nhận được từ sau khí kết tinh
glucoza ở các xí nghiệp thuỷ phân bột bằng axit để sản xuất glucoza
hoặc từ nhà máy đưòng sản xuất đường saccaroza thưùng có: ltỉ củ cải
dường và rỉ đưòng mía.
- Các nguồn nguyên liệu giàu nitđ hừu cơ: bột đậu tưdng; nước chiết
ngô và cao ngô; nước chiêt nấm men và cao nám men.

79
 - Các nguồn chất sinh trưởng: nước chiết cám, dịch ép khoai tây, các
dịch ép giá đậu, dịch ép cà chua, bắp cải,...
- Chất béo nguồn dinh dưỡng cacbon và phá bọt: các loại dầu thực vật.
- Nước trong công nghệ vi sinh vật phải đạt tiêu chuẩn nước sinh hoạt.
3.3.4. Động học của quá trình lên men vi sinh vật
Sinh trưởng và phát triển là thuộc tính của sinh vật. Sinh trưởng là
sự tăng lên kích thước và khôi lượng của tế bào, còn phát triển (hoặc
sinh sản) là sự tăng số lượng tế bào. ở vi sinh vật, sự tăng số lượng tế
bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự tăng sinh khôi. Ví
dụ: khi chất dinh dưỡng của môi trường đã cạn, vi khuẩn tuy còn phân
chia 1 - 2 ỉần, nhưng cho 2 - 4 tế bào nhỏ hơn bình thưòng. Điểu đáng
chú ý là khi nói đến sinh trưỏng và phát triển của vi sinh vật là để cập
đến BÌnh trưởng và phát triển của một sô" lượng lón tế bào cùng một loại.
Việc nghiên cứu sinh trưảng, phát triển ở một cá thể vi khuẩn là rất
khó, không thể thực hiện được. Tuy nhiên, cần phân biệt các thông số và
hằng số khác nhau khi xác định sô" lượng hoặc khôi lượng vi khuẩn
(bảng 3.3). Đôi vối sô”lượng, thòi gian từ 1 tế bào tăng lên 2 tế bào, gọi là
thời gian th ế hệ, giá trị nghịch đảo thời gian thì gọi là hàng sô" tốc độ
phân chia, tương ứng với khốỉ lượng là thòi gian tăng đôi khối lượng và
hằng sô" tốc dộ sinh trưỏng.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, thường chúng ta theo dõi ảnh
hưởng của các yếu tô' môi trường lên sinh trưởng và phát triển của vi
khuẩn nhờ các phương pháp nuôi cấy thích hợp. Tuỷ theo sự thay đổi hệ
thống vi khuẩn —môi trưòng mà ta phân biệt hai phương pháp cơ bản
nuôi cấy vi khuẩn: nuôi cấy gián đoạn và nuôi cấy liên tục.
Bảng 3.3. Các thông số và hằng sấ dùng khi xác định số lượng
hoặc khối lượng vi khuẩn
T hông sô' Số lượng Khối lưdng
Với đơn vị thể tích Nồng độ vi khuẩn (số tè' Mật độ vi khuẩn {sinh khối
bào/ml). khô/ml).
Số lần tăng đôi sau đơn vị Hằng số tốc độ phân chia, Hằng sô' tốc độ sinh trưởng, n
thời gian V (giờ- ’). (gicr1).
Thời gian cho sự tâng đôi Thòi gian thế hệ g (giờ). Thời gian tăng đôi, tđ (già).

Xác định sô" lượng tế bào vi sinh vật bằng các phương pháp khác
nhau: đêm trực tiêp bằng buồng đêm hồng cầu qua kính hiển vi, so sánh
dộ đục dịch nuôi cấy, đếm trực tiếp trên đĩa thạch,...

tìO
 Xác định khối lượng bằng các phương pháp trực tiếp cân sinh khôi
tê bào sau khi dă sấy khô đến khối lượng không đổi hoặc gián tiếp thông
qua đo độ đục.
3.3.5. Ảnh hưởng của cảc yếu tố môi trường và điểu kiện nuôỉ cấy lên
sinh tổng hợp enzym của vỉ sinh vật
a) N hiệt độ
Nhiệt độ môi trưòng vói vi sinh vật có môi quan hệ m ật thiết, vì
nhiệt độ không chỉ đơn thuần ảnh hưởng đến cưòng độ phát triển của
từng loại vi sinh vật mà chính khả năng sinh trưởng của chúng ở nhiệt
dộ đó. Mỗi loại vi sinh vật đều có nhiệt độ phát triển tôì thiểu, tối thích
và tối đa mà chúng có thể chịu được khác nhau.
Dựa vào khả năng của vi sinh vật phát triển trong khoảng nhiệt độ
tối ưu khác nhau, người ta phân chia vi sinh vật thành các nhóm sau: Ví
sinh vật ưa lạnh có nhiệt độ sinh trưỏng tổì ưu dưới 20°C; ưa ấm - tối ưu
từ 25 đến 45UC; ưa nhiệt - tôi ưu từ 45 đến 70°c và cực ưa nhiệt - tôi ưu
trên 70 c.
Sự phân định các nhóm vi sinh vật theo nhiệt độ trên không phải là
tuyệt đôi mà thưòng giới hạn giữa các nhóm có phần xen cài lên nhau.
Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật là vi sinh vật ưa ếm. Nấm sỢi và
nấm men là những vi sinh vật ưa mát, nghĩa là thường từ 20 đến 30°c,
tốì ưu ở 25 - 26°c, n hư ng cũng có một số' loài sống được ở 45°c, cũng có
loài sống được ở l°c ,
Trong quá trình phân lập và nuôi cấy vi sinh vật cùng cần chú ý đến
nguồn vị trí lấy mẫu mà nuôi cấy thích hợp. Điều đó cũng có nghĩa là
tuỷ thuộc vào mục đích sử dụng mà người ta phân lập các chủng vi sinh
vật ỏ những nơi có điểu kiện sống tương ứng.
Trong quá trình lên men sản xuất trong nồi lên men thưòng người
ta giữ ở nhiệt độ phù hợp cho từng chủng vi sinh vật và không thay đổi
trong suốt quá trình lên men. Tuy nhiên, quá trình lên men thưòng làm
tăng nhiệt độ bình, do vậy phải có hệ thông làm lạnh để giữ ở nhiệt độ
phù hợp.
b) Đ ộ ẩ m (nuôi cấy trên môi trưồng xốp)
Thành phần nưóc chiếm từ 70 - 90% khôi lượng cơ thể vi sinh vật,
tất cả các quá trình phân huỷ thức ăn và các phản ứng chuyển hoá các
chất trong tế bào đều diễn ra với sự có m ặt của nước. Thiếu nước, vi sinh
vật không phát triển được và lúc này vi sinh vật chĩ tồn tại ở dạng nghỉ
hoặc bào tử.

81
 Nuôi vi sinh vật trên môi trường xốp cần quan tâm đến lượng nước
phù hợp (độ ẩm thường 60 - 70%). Tuy nhiên, trong quá trình lên men,
lượng nước bốc hơi dẫn đến tình trạng thiếu nưốc cho nên phải bổ sung
thêm nước sao cho vi sinh vật phát triển bình thường.
c) Oxy (thông khí)
Phụ thuộc vào khả năng sử dụng oxy, ngưòi ta chia vì sinh vật
thành 3 nhóm chính: vi sinh vật hiếu khí, phát triển ở hiệu th ế oxy hoá
cao (nhu cầu oxy cao); vi sinh vật yếm khí, phát triển ỏ hiệu th ế oxy hoá
thấp (không cần oxy) và vi sinh vật yếm khí tuỷ tiện, phát triển ở cả
hiệu th ế oxy hoá cao và hiệu thế oxy hoá thấp.
Trong tế bào vi sinh vật hiếu khí có đầy đủ hệ thông men hô hấp,
trong quá trình oxy hoá dùng phân tử oxy làm chất nhận hydro (H+), còn
trong quá trình oxy hoá được thực hiện nhò sự tham gia của các enzym
dehydrolaza, chúng dùng các chất hữu cd có liên kết không bão hoà làm
chất nhận H+.
Trong lên men chìm, lượng oxy cồn thiết phải là lượng oxy hoà tan
vào môi trường nuôi, do đó trong các bình lên men người ta thường bô" trí
cánh khuấy và máng chắn sóng để tăng cưòng sự hoà tan của oxy.
Thông thường lượng khí cấp cho vào nồi lên men là 1 lít/ 1 phút/ 1 lít
môi trường lên men, Tuy nhiên, lượng oxy hoà tan phụ thuộc chính vào
cấu tạo và tốc độ của cánh khuấy,
d) p H m ôi trư ờng
pH môi trưòng nuôi cấy vi sinh vật rấ t quan trọng, vì mỗi loại vi
sinh vật có khả năng sinh trưỏng, phát triển ồ pH môi trường khác
nhau. Người ta chia vi sinh vật thành các nhóm theo khả năng phát
triển ở các pH môi trường như sau: pH từ 2 - 4 là nhóm axit mạnh; 4 - 5 :
nhóm axit; 5 —6: nhóm axit yếu; 6 —7: nhóm trung tính; 7 - 8 : nhóm
kiểm nhẹ; 8 - 9 : nhóm kiềm và trên 9: nhóm kiểm mạnh.
Đa số các vi sinh vật sinh trưởng, phát triển bình thưòng trong
phạm vi pH trung tính, có loại chịu được pH thấp như Thiobacillus
ferrooxydans, có thể sinh trưởng ỏ pH 1 —2, nấm môc chịu được pH 4 - 5 .
Ngược lại, nhiều loài có thể sinh trưỏng ở môi trường kiềm, pH 10.
Sự thay đổi pH là do hàm lượng ion H+ trong môi trường tạo nên.
Hàm lượng H+ trong môi trưòng ảnh hưởng đến sự hoạt động của các
enzym trong tế bào ảnh hưỏng đến quá trình trao đổi châ't của chúng.
Dựa vào khả năng chịu pH khác nhau của vi sinh vật, ngưòi ta thay đổi

82
pH tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, hoặc ức chế khả năng phát
triển của chúng.
Trong quá trình lên men sinh tổng hợp, pH môi trường thường giảm
nhẹ vào thời gian đầu do sự phân huỷ các chất, như các protein thành
các amino axit mang tính axit, sau đó pH thưòng tăng dần do quá trình
trao đổi chất tạo ra các chất mang tính kiểm như các amoni,... Tuy
nhiên, quá trình này còn phụ thuộc vào từng chủng vi sinh vật và sản
phẩm tạo thành.
e) Á p s u ấ t
Phần lốn vi khuẩn không chịu ảnh hưỏng của sự thay đổi áp suất, vì
chúng được bảo vệ nhò thành tế bào cứng. Nếu thành tế bào này bị phá
huỷ, thì chất nguyên sính bị giải phóng ra bên ngoài do áp suất bên
trong tế bào thưòng cao hơn bên ngoài. Tuỳ theo sự mẫn cảm của chúng
đối với áp suất thẩm thấu mà ngưòi ta chia thành các nhóm:
- Vi khuẩn không ưa mặn phát triển trong môi trưòng có nồng độ
muôi dưới 0,2M như vi khuẩn Enterobacteria, Pseudomonas.
- Vi khuẩn ưa mặn cần nồng độ muối 0,2% đối với các loài ưa mặn
trung bình (P. mariana)', 5,2% đối với những loài ưa rấ t mặn như
Halococcus morrhueae, Halobacterium salinarium.
- Vi sinh vật chịu mặn như Staphylococcus, một sô" nấm men và
nấm mốc, một sô Lactobacillus.
Để tránh nhiễm trùng, thông thường trong nồi lên men người ta
thường giữ ở áp suất dư (khoảng 0,3 đến 0,5atm). Nếu áp auất trong nồi
lên men cao, sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật.
3.3.6. Những điểm cần lưu ý trong quá trình lẽn men sinh tổng hợp enzym
Hiện nay, enzym vi sinh vật được sản xuất bằng lên men dưới điểu
kiện có kiểm soát liên quan đến hầu hết các lựa chọn tổng hợp enzym.
Enzym vi sinh vật được sản xuất chính bằng lên men chìm dưới điều
kiện môi trương được kiểm soát chặt chẽ. Tuy nhiên, lên men trên môi
trưồng xốp (solid -State fermentation - SSF) cũng vẫn có tiềm năng tốt
để sản xuất enzym, đặc biệt là các enzym từ các cơ thể sợi thích hợp cho
sinh trưỏng trên bề mặt. Một số' enzym, cụ thể là các enzym liên quan
đến phân giải lignoxenluloza, hiện nay vẫn được sản xuất bằng cách lên
men trên môi trường xốp. Các enzym thuỷ phân khác như amylaza,
proteaza và phytaza vẫn đang được sản xuất bằng phương pháp lên men
trên môi trường xốp. Lên men trên môi trưòng xốp so vói lên men chìm

83
về nhu cầu năng lượng, năng suất về khối lượng và th u hồi sản phẩm,
nó sẽ được lựa chọn khi giá thành sản xuất phải giảm như trường hợp
làm giàu vi sinh vật trên phế thải nông nghiệp hoặc sản xuất lớn enzym
không đắt tiền. Trong phần lớn các trưòng hợp lên men sinh tổng hdp
enzym, lên men chìm là công nghệ được lựa chọn để sản xuất enzym vi
sinh vật.
Lên men chìm có thể được hướng dẫn trong các cách thức thực hành
khác nhau.
a) P h ư ơ n g p h á p lên m en tru yên thống là lên men theo mẻ, trong
đó các nồi phản ứng sinh học với môi trường, cấy giống và ủ dưới điều
kiện được điều chỉnh đến điểm mà ở đó sản phẩm (enzym) được tổng hợp
đến (hoặc gần) mức cực đại; sau đó tế bào được thu lại để thu nhận
enzym nếu là enzym ngoại bào.
b) L ên m en theo m ẻ có b ổ su n g là một loại lên men theo mẻ, sau
một thòi gian nuôi cây nào đó, nồi phản ứng được bổ sung môi trưòng
dinh dưỡng theo một tốc độ có kiểm soát cho đến thể tích cuối cùng theo
định mức và sau đó thu hồi sản phẩm như trên. Phương thức nuôi cây
nhừ vậy trong thực tế râ't được quan tâm trong sản xuất enzym, bởi vì
nó cho phép kiểm soát được sự đáp ứng trao đểi chất của tế bào và vận
hành khá đơn giản.
c) P h ư ơ n g p h á p n u ô i cẩy ỉiên tục, trong đó môi trường được bổ
sung liên tục vào nồi phản ứng và môi trường đã lên men liên tục được
lấy ra với cùng tốc độ. Tuy hiệu suất lên men cao hơn, nhưng khó thực
hiện ỏ mức độ công nghiệp, dễ bị nhiễm khuẩn, quá trình nuôi kéo dài
ảnh hưỏng đến chất lượng chủng giông sản xuất.
Một số điểm cần lưu ý liên quan đến quá trình lên men sản xuất
enzym hiện nay là:
— Xác định enzym của vi sinh vật nằm trong nội bào, trong khoang
chu chất hay tiết vào môi trưòng trong quá trình lên men để khẳng định
cách thức thu hồi trong quá trình sản xuất, v ề nguyên tắc, hầu hết
enzym ỏ vi sinh vật là enzym nội bào, nhưng cũng nhiều enzym ngoại
bào, nhưng cũng có loại enzym ỏ cd thể này là nội bào, nhưng ỏ cơ thể
khác lại là ngoại bào. Ví dụ: invertaza chủ yếu là nội bào ở
Saccharomyces, trong khi đó ỏ Candida và Streptomyces lại tiết vào môi
trưòng; p - galactosidaza là enzym ngoại bào ở nấm mốc, nhưng lại là nội
bào ở nấm men. Enzym nội bào có thể chuyển thành enzym ngoại bào nhò
kỹ thuật di truyển và công nghệ protein.

84
 - Hoạt tính đặc hiệu (đơn vị hoạt tính cho đơn vi sinh khôi vi sinh
vật) là thông sô liên quan đên sản xuất enzym bằng lên men, trong đó có
cả nâng cao hiệu suất bằng kỹ thuật di truyền và kỹ nghệ môi trường.
Đột biên và chọn lọc thông thưòng, kỹ thuật di truyền, đột biến điểm có
định hướng và tiên hoá có định hướng là công cụ di truyền hữu hiệu để
thu nhận chủng sản có hiệu suất cao; trong một sô' trường hợp, một
phần protein được tổng hợp nhờ có thể phù hợp với enzym, Hiệu suất
đặc hiệu không chỉ làm giảm chi phí lên men mà còn giảm chi phí quá
trình thu hồi. Sự tăng đáng kể của hoạt tính đặc hiệu của enzym có thể
nhận được bằng cách lựa chọn môi trưòng phù hợp thông qua việc thiết
kế môi trường nuôi và tối ưu các thông sô’ thao tác liên quan như nhiệt
độ, pH, kỹ thuật, trộn khí và tỷ lệ khí cấp.
- Khả năng bền vững và sự an toàn di truyền của chủng sản xuất cũng
cần được xem xét, đặc biệt trong trường hợp các protein của enzym tái tổ
hợp, do tính không ổn định cấu trúc và phân ly của việc chọn dòng vectd.
Phụ thuộc vào việc sử dụng enzym mà chủng sản xuất cần phải xem xét an
toàn sinh học. Ví dụ: enzym được sử dụng trong oông nghiệp thực phẩm ò
Mỹ phải được Cơ quan Quản lý thực phẩm và thuốc (FDA) chứng nhận an
toàn theo GRAS (Generally ricognized aa safe) theo Danh mục các enzym
và chủng sản xuất trên website http://www.cfsan.fda.gov/~dms/opa-
enzy.html. Để nhận được chứng chỉ an toàn cho một cd thể phải mất tiền
và mất thòi gian, do vậy cách tốt hơn là lựa chọn các gen cấu trúc của
enzym vào cơ thể chủ của GRAS.

3.4. QUÁ TRÌNH THU NHẬN ENZYM TỪ VI SINH VẬT

Một khi enzym được lên men sinh tổng hợp từ một chủng sản xuất
được tiến hành quá trình thu nhận gồm các bước tuỳ thuộc vào enzym
nội bào hay ngoại bào (hình 3.2). Đó là phân tách tế bào (nếu ỉà enzym
ngoại bào thu nhận phần dịch lỏng loại bỏ sinh khối, nếu nội bào thì thu
sinh khối, loại bỏ phần dịch lỏng), nếu là enzym nội báo thi phải tiến
hành phá vỡ tế bào thu nhận enzym, tiếp theo cô đặc và tinh chế enzym
và sau cùng chuyển sang lập công thức và hoàn thiện chế phẩm.
3.4.1. Phân tách pha rắn - pha nước
Thực hiện quá trinh thu nhận đầu tiên là tách tế bào khỏi môi
trưòng lên men thường bằng cách ly tâm hay lọc. Phương pháp lọc
thường thích hợp cho các cơ thể đa bào dạng sợi như nấm hay xạ khuẩn,

85
r
nhưng sử dụng lại phin lọc có giá đỡ bởi bản chất lọc nén để hình thành
bánh sinh khối tế bào. Ngưòi ta thường sử dụng phương pháp lọc đĩa, lọc
ép khung bản. s ỏ dụng phương pháp ly tâm thích hợp hơn cho các cơ thể
đơn bào như vi khuẩn và nấm men, nhưng đòi hỏi phải kết bông trước
khi lọc, bởi vì kích thước tế bào riêng rẽ nhỏ. Máy ly tâm dạng ông, dạng
đĩa thường được sử dụng nhiểu nhất (hình 3.2) hay lọc tang trông (hình
3.3). Quá trình hoạt động này, dường như áp dụng rộng rãi trong các
quá trinh sinh học, còn hạn chế do tế bào vi sinh vật nhỏ, chịu ép và độ
đậm đặc tương tự như môi trưòng đã sử dụng. Vì thế, đã thay đổi quy
trình hoạt động này, chú ý đến vi lọc cắt —đòng (cross —flow): dòng liên
quan đến màng mà nó giảm sự hình thành bánh và màng bị cản trỏ, giá
thành thực hiện thấp hơn và cản trồ màng. Người ta đã phát triển và cải
tiến màng vi lọc và xác nhận, các màng lọc này rấ t hữu ích để thu hồi
enzym (Guisán JM, 2006).

Hỉnh 3.2. C ác dạng m áy ly tâm cô n g nghiệp thu nhận enzym

(a) Ly tâm đĩa dạng ống; (b) Ly tâm xoắn liên tục, thiết bj nằm ngang, chất rắn bám trên bề
mặt các rãnh xoẳn và chất lồng thoát ra ngoài, bã thải lấy ra ở đẩu của rãnh cuối cùng;
(c) Ly tâm xếp giá đĩa thành nhiều ngăn liên tục cố các đĩa xếp song song tạo bề mạt rộng
với khoảng cách chất lắng nhò, bã thải đi qua van.
Nếu enzym dược bài tiết ra ngoài, cấy tế bào vào dịch nuôi cấy thì
quá trìn h thu hồi được thực hiện từ pha lỏng; còn nếu enzym nằm trong
tế bào, quá trìn h thu hồi b ắt dầu từ pha rắn (xem hình 3.1). Tuy nhiên,
nếu enzym được bài tiết ra ngoài tế bào thì thuận lợi cho quá trình thu
nhận, chính vì vậy người ta cô' gắng tạo được chủng tái tổ hợp bằng công
nghệ gen để các enzym nội bào tiết ra ngoài môi trường.

86
 Phun dung dịch lên men

Hình 3.3. Lọc tang trống quay

Dịch nuôi cấy thấm qua vải lọc khi tang trống quay, tạo trên bể mặt lớp sinh khối
và toại ra ngoài bằng luỡi dao.

3.4.2. Cô đặc enzym ngoại bào

Trong sản xuất enzym, nồng độ enzym được sản sinh vào môi
trường với nồng độ thấp, trong điểu kiện nuôi cấy tốt, rấ t hãn hữu vượt
quá vài gam trong một lít môi trường lên men, hòn nữa dịch nuôi cấy
thường không sạch, ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lọc qua màng siêu
lọc. Vì nồng độ enzym thấp, cho nên, bình enzym ít nhất cũng phải được
cô đặc trước khi chuyển sang các bưỏc tinh chế hay tạo sản phẩm. Trong
thực tế, có nhiều cách tiến hành cô đặc enzym phù hợp để phân đoạn
enzym tinh sạch, ỏ đây chỉ để cập đến cô đặc enzym, còn phần tinh chế
được xem xét trong mục 3.5 của chương này.
Cách tiến hành cô đặc phổ biến nhâ't là cô chân không, công nghệ
này ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, do
enzym là protein dễ bị phân huỷ, do vậy quá trình bay hơi cần phải
kiểm soát dưới điểu kiện chân không khá cao tránh làm biến tính enzym
bằng cách làm lạnh sâu và đưa các chất dễ kết tinh vào. Việc loại bỏ
nước bằng đông khô không kinh tế, vì bên cạnh sự có mặt của muôi hoà
tan sẽ sản sinh tổ hợp các chất ở nhiệt độ thấp và dễ tạo bọt làm biến
tính enzym. Để giảm sự hình thành bọt, người ta thổi không khí hoặc
khí trơ vào dung dịch enzym và protein sẽ tích tụ ỏ giữa pha khí - lỏng
theo định luật của Gibbs như sau:
d ơ /đ c = ( R X T /c ) X r (3 .1 )

Trong đó, ơ - là sức căng bể mặt, c - nồng độ chất tan, R - hằng số

luật khí chung, T - nhiệt độ tuyệt đối và F - protein dư tại bề mặt giữa.
Kỹ thuật này rấ t có tiềm năng để phân đoạn enzym, nhưng không được
đánh giá cao có thể do hiệu suất thu hồi thấp do sự bất hoạt ở ranh giới
pha khí và pha lỏng.
87
 a) b)

• • • • , «
• •• •_ •••_ ••
. • • < .* .» >

ị H H ịị H ị H H U H H
Hlnh 3.4. Nguyên lý (a) lọc trực tiếp iên phin lọc và (b) lọc cắt dòng. Lọc trực tiếp thỉ
phin lọc bị bám ch ặt sinh khối cản trỏ quá trình lọc, nó đư ạc loại bỏ khi lọc cắt dòng.
Phương pháp cô đặc enzym phổ biến nhất là lọc qua màng siêu lọc do
sự chênh lệch áp suất giữa trong và ngoài màng (Hình 3.4). Khôi lượng
phân tử của hầu hết các loại enzym cơ bản trong khoảrìg từ 1.000 đến
100.000. Màng siêu lọc được chế tạo từ các vật liệu khác nhau, trong đó
polyacrilonitril, polysulphon, polyamit và polyvinyliden fluorit rất bển
vững cả về cơ học và hoá học. Màng siêu lọc được đặc trưng cắt đoạn khối
lượng phân tử cả ở dạng đẳng trương và không đẳng trương, tuy nhiên
cần chú ý đến tốc độ dòng và điều chỉnh quá trình hoạt dộng, các phân
đoạn của nồng độ chất tan (protein) màng cũng được sử dụng để đặc
trưng enzym. Thiết bị siêu lọc có nhiều khổ và kích thước khác nhau,
thông thường độ dày của màng lọc khoảng lmm với áp suất hút chần
không trong khoảng từ 100 đến 500KPa và công suất trong khoảng từ 10
đến 200 lít/m 2/giò. Cô đặc bằng phương pháp siêu lọc không ảnh hưởng
đến hoạt tính của enzym, tuy nhiên do hiện tượng tích tụ protein trên
màng cũng ảnh hưởng đến dòng chảy qua màng. Với nồng độ và dòng
protein cao, màng lọc trở nên bão hoà, tốc độ khuếch tán của protein
chậm đến mức tác động xấu đến hoạt động của màng do áp suất cao. Để
giảm thiểu sự phân cực nồng độ, cách tốt nhất giảm độ dày của màng
bằng cách cho dịch chảy thành dòng và giảm nồng độ enzym hoặc chọn
màng lọc loại bỏ các chất tan có phân tử lượng thấp hơn phân tử lượng
của enzym trưốc khi lọc cô đặc enzym. Hiện nay, phương pháp siêu lọc
được xem như là cách lựa chọn tốt nhất để cô đặc enzym tinh khiết, ảnh
hưởng không đáng kể đến hoạt tính của enzym, tuy nhiên cũng cần cải
biến vật liệu lọc và kỹ thuật enzym nhằm cung cấp cách lựa chọn rất hài
hoà đê chọn màng và thiết bị hợp lý cho mỗi loại enzym cụ thể.
3.4.3. Chiết xuất enzym nội bào
Chiết xuất enzym sẽ được xác định bởi loại tế bào và ndi enzym khu
trú trong cấu trúc của tế bào. Enzym từ tế bào và mô động vật tách chiết
dễ dàng bỏi vì chúng không có thành tế bào, cho nên bằng sốc thẩm thấu

88
và các phương pháp nhẹ nhàng khác cũng hoàn toàn có hiệu quả, còn
enzym từ tê bào hoặc mô thực vật đòi hỏi điểu kiện khắt khe hơn bởi vì
thành tê bào là xenluloza dày, chúng có cấu trúc cứng nhưng có thể phá
vỡ băng cách chặt nhỏ. Tê bào vi sinh vật, đặc biệt vi khuẩn và nâm
men, phá vỡ rấ t khó khăn bởi bản chất đàn hồi của vỏ tế bào của chúng.
Một sô" enzym nằm trong khoang chu chất, có thể tách chiết dễ dàng
bằng sốc thẩm thấu, khi enzym đã thoát ra ngoài có thể thu nhận bằng
như quá trình tinh sạch enzym. Còn các trường hợp cực đoan khác, một
sô' enzym nằm trong màng hoặc cấu trúc khác của tế bào thì không chỉ
phá v3 tế bào mà còn sử dụng cốc enzym phân giải thành tế bào, bằng
cách tẩy rửa hoặc bằng dung môi, chúng cũng có thể ảnh hưởng đến
enzym. Mặc dù, phần lớn enzym nội bào nằm trong tế bào chất, thu hổi
chúng bằng cách phá vỡ vỏ tế bào hoặc các biện pháp thẩm thấu khác,
đây không phải là nhiệm vụ dễ dàng. Các phương pháp thu hồi enzym
nội bào có thể phân chia thành các quá trình phố vỡ tế bào bằng lực cơ
học và gây hỏng màng tế bào. Tuy hiện nay đã xuất hiện một số’phương
pháp luận mới như chiết xuất enzym chịu nhiệt bằng nhiệt phân, còn lại
hầu hết phương pháp liên quan đến chiết xuất enzym nội bào bằng cách
phố hỏng vỏ tế bào (bảng 3.4), tuy nhiên không phải tất cả phương pháp
này có thể thực hiện được ở cấp độ lớn hoặc vì lý do kinh tế, hoặc vì lý do
công nghệ.
Bảng 3.4. Các phương pháp chiết xuất enzym nộì bào
Phương pháp Nguyên lý Cấp độ ứng dụng
Phả võ tế bào
Áp suất Ép làm biến dạng Trung bình
Sự đồng nhất hoá Làm biến dạng tạo lỗ hổng Khả thi cao
Nghiền Ép làm biến dạng Khả thi cao
Siêu âm Tạo lỗ hổng Trung binh
Giảm áp suất Làm vỡ bằng giảm áp Trung bình
Rã đông Làm biến dạng Không được
Phân tán trong nước Gây sốc thầm thấu Không được
Nhiệt phàrt phá vỡ thành tế bào Trung bình
Thẩm (hấu tế bào
Xử lý kiểm Tiêu hoá thành tế bảo Không được
Xử lý dung môi Tiêu hoá màng tế bào Trung bình
Phân giải bằng enzym Tiêu hoá thành tế bào Khả thi
Tự phân Tiêu hoá thành tế bào Khả thi

89
 Chỉ các phương pháp với ưu thế
ứng dụng thu hồi enzym cấp độ lón
mới được xem xét ngắn gọn ô đây, còn
những xem xét có tính toàn diện về
chủ đề này có thể tìm thấy trong các
tài liệu khác.
Phương pháp phá vỡ cơ học
thường được nghiên cứu và lựa chọn
nhiều nhất do ý nghĩa kinh tế của quá Hình 3.5. Mặt cắt n g an g van của máy
trình > chúng dược lựa chọn để thực đổng hoá cao áp Manton - Gaulin với
dòng vật liệu qua van.
hiện ở cấp độ lớn, điều kiện thực hiện
đơn giản và có th ể tối ưu hoá được;
nhưng điểm không thuận lợi, cơ bản là đòi hỏi điều kiện lực phá mạnh
làm enzym dễ bị biến tính trong quá trình thực hiện.
Trong số các cách phá võ cơ học thì sử dụng máy đồng nhất hoá
(hình 3.5) và nghiền bí là dễ dàng và thuận tiện hơn cả. Máy đồng nhất
áp suất cao được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, nhưng
thực tế, các thiết bị tương tự như sử dụng đồng hoá sữa có thể sử dụng
để phã võ tế bào vói tấ t cả các loại kích thước khác nhau (xem
www.directindustrv.com). Chúng được sử dụng rộng rãi để chiết xuất
enzym và protein tái tổ hợp, đặc biệt tốt đối với tế bào vi khuẩn cũng như
tế bào nấm men, nhưng không thể ứng dụng cho cơ thể nấm sợi bậc cao.
Hoạt động của máy đồng hoá cao áp được thực hiện bằng cách cưỡng bức
hỗn dịch tế bào dưới áp suất cao thông qua khe cửa rất hẹp trong van làm
tê bào vi sinh vật va mạnh lên vòng điều chĩnh khe, phá v3 thành tế bào.
Nghiền bi cũng là một phương pháp quan trọng khác để phá vô tế bào vi
sinh vật, nhất là tế bào nấm men và cũng có hiệu quả đôi vói vi khuẩn và
nâm sỢi. Dịch tê bào dạng nhão được trộn với các hạt thuỷ tinh, gốm hay
kim loại kích thước nhỏ và nghiền, thành tế bào bị mài mòn và võ ra do
kêt hợp áp suât và lực co giãn lổn. Trong thực tế, có nhiểu loại thiết bị
được thiết kê đặc biệt để phá v3 tế bào vói kích thước và kiểu dạng khác
nhau được bán trên thị trưòng (xem www.glenmills.com1).
Ngược lại các phương pháp cơ học, không cần phá võ tế bào trong
mọi trường hợp mà đơn giản chỉ cần các chất thấm qua vỏ tế bào dựa
vào thành phần hoá học của vỏ tế bào có thể xử lý bằng dung dịch kiềm
hay dung môi hữu cơ, nhưng bằng cách này thường có hại, đắt tiền và
không đặc hiệu, do đó sử dụng bị hạn chế.

90
 Bảng 3.5. Các cấu phần của vỏ tê' bào vi sinh vật
Vi sinh vật Cấu trúc t ế bào Thành phẩn
Vi khuẩn Gram âm Thành tế bào Peptitoglycan
Màng ngoài Upopolysaccarit, Protein
Màng nguyên sinh chất Phospholipit, Protein
Vi khuẩn Gram dương Thành tế bào Peptitoglycan
Màng nguyên sinh chất Phospholipit, Protein
Nấm men Thành tế bảo Mannanoprotein, a-glucan
Màng tế bào Phospholipit, Protein
Nấm mốc Thành tế bào Xenluloza, Kitin, cc-glucan, Protein
Màng tế bào Pliospholipit, Protein

Tiêu hoá vỏ tế bào bằng enzym là công nghệ có nhiều hứa hẹn hơn,
đặc biệt các enzym nội bào đắt và không bền, ví dụ lysozym thường được
sử dụng để phá vỡ peptítoglycan thành tế bào vi khuẩn, (3- glucanaza để
phân huỷ thành tế bào nấm men và helicaza từ Helix pomatia (ốc sên)
để phân huỷ thành tế bào nấm men và nấm mốc, tế bào bị vỡ và các chất
trong tế bào tiết vào môi trường dịch. Thành phần hoá học của vỏ tê bào
vi sinh vật được chỉ ra trên bảng 3.5 cho thấy, có thể sử dụng để lựa
chọn enzym thích hợp.
Các chế phẩm enzym phân giải trước đây đắt, không đặc hiệu và
thưòng không có sẵn sô' lượng lốn, nhưng enzym phân giải vi sinh vật
đặc hiệu hơn đã dược phát triển có thể sản xuất rẻ hơn ở cấp độ lớn hơn
như enzym p - glueanaza từ Cytophaga và Oerskovia đã được khẳng
dịnh rấ t có hiệu quả trong phân giải thành tế bào nấm men. Chiết xuất
chọn lọc protein và enzym tái tổ hợp được thực hiện như enzym với
thành công lớn lao; trong nhiểu trường hợp, không nhiều hơn 20%
protein nội bào được giải thoát và tiết kiệm đáng kể các yêu cầu tinh
sạch sau này. Động học quá trình phân giải vỏ tế bào của enzym đã được
mô hình hoá, tốì ưu hoá và được tổng quan gần đây.
Tự phần là phương pháp chiết xuất enzym rấ t có hiệu quả đối với
nấm men và Bacillus dưới điều kiện không bình thường (như khô, nồng
độ dung môi hữu cơ hoặc chất điện ly cao), các enzym thuỷ phân (như
proteaza, nucleaza và glucanaza) tiêu huỷ chính thành tê bào cua chúng
làm cho thành phẩn nội bào dễ dàng chiết xuất được bằng sốc thẩm
thấu. Tự phân đã được sỏ đụng từ lâu để chiết xuất protein từ tế bào, là
91
cơ sở để sản xuất công nghiệp một số loại dịch chiết nấm men và sử
dụng có hiệu quả chiết xuất các loại enzym của nấm men như invertaza,
nằm trong khoang chu chất và tế bào chất, được chiết xuất có hiệu quả
từ tế bào nấm men bánh mỳ tự phân giải bằng cách làm khô. ở hàm
lượng ẩm tối hạn, quá trình tự phân sẽ diễn ra, hiệu suất tách chiết
protein và thu hồi enzym phụ thuộc vào thời gian mà tế bào duy trì ở độ
ẩm tới hạn đó. Quá trình này đã được thực hiện ở cấp độ pilot và tách
thô được sử dụng như là nguyên liệu thô để sản xuất chất xúc tác sinh
học ứng dụng trong chuyển hoá liên tục nước đưòng.
Trong quá trình phá vỡ tế bào vi sinh vật, nhiều yếu tố tác động làm
biến tính enzym được tóm tắt trên bảng 3.6.
Bảng 3.6. Những rủi ro có thể làm hỏng enzym trong quá trình phá vd tế bào

Nhiệt Tất cả các phuưrtg pháp cơ học cần nguồn nồng lượng khá lớn, sinh
nhiệt. Việc làm lạnh là cẩn thỉết cho hầu hết enzym. Sự có mặt của cơ
chất, các chất đổng phân của cơ chất hay polyol cũng có thể giúp ổn
định enzym.

Chà xát Lực chà xát cần thiết để phá vỡ tể bào cũng có thể lãm hỏng enzym,
đặc biệt vòi sự có mặt của các ion kim loại nặng và giỗi hạn khỏng khí.

Proteaza Phá vâ tế bào chắc chắn giải thoát enzym nhưng nó có thể làm mất
hoạt Ưn(i enzym. Tác động như vậy có thể đuợc giảm thiểu bằng cách
làm lạnh nhanh cỏ thể. Cách này cũng có thể được cải tiến bằng cách
cho thêm cơ chất thay thế (như các loại protein rẻ tiền), hoặc các chất
ức chế trong môi trường tách chiết.

pH Cần thiết phâi có dung dịch đệm. Sự có mặt của cơ chất, các chất đổng
phân của cơ chất hay polyol cũng có thể giúp ổn định enzym.

Hoá chất Một sô' enzym có thể thay đổi hình dạng trong sự có mạt của chất tầy
rửa hay dung môi. Polyphenolic thải ra từ nhà máy cũng là chất ức chế
enzym. Vấn để này cũng thấy khí sử đụng cảc chất hấp phụ như poly -
vìnylpyrolidon và axit ascorbic làm giảm hoạt động oxy hoá polyphenol.

Oxy hoá Các tác nhãn khử (như axit ascorbic, mercaptoetanol và dithiothreitol)
có thể cẩn thiết.

Tạo bọt Giao điện giữa pha khí - lỏng có mặt của bọi cũng làm hỏng hình dạng
enzym.

Độc tinh của lon kim loại nặng (như sắt, đổng và nikei) có thể thoát ra từ máy đồng
kim loại nặng hoá. Enzym có thể được che chở từ sự tương tác thuận nghịch bằng
cách sử đụng các tác nhân chelat, như EDTA.

92
3.4.4. Loại bỏ mảnh vụn của tế bào
Sau khi tách chiết, trong dịch enzym còn lẫn các tế bào chưa bị phá
vỡ hoặc các m ảnh vụn của tế bào, vì vậy cần loại bỏ chúng trước khi tinh
sạch. Phương pháp tách chiết hai pha rắn - lỏng thường được thực hiện
bằng cách ly tâm hay lọc, tuy nhiên phải nâng cao kích thước của mảnh
vụn của tế bào vì chúng quá nhỏ. Do đó, phương pháp vi lọc là cách lựa
chọn tốt hơn cả.
Tách chiết hai pha lỏng là phương thức có triển vọng nhất để loại bỏ
xác tế bào, mặc dù ưu thê của phương pháp này dùng để phân đoạn
protein (sẽ được xem xét lại ở mục sau). Hệ thống tách hai pha lỏng -
lỏng bao gồm hoặc hai chất polyme, hoặc là một polyme và một muổì.
Việc tách pha là do hiện tượng kỵ nhau của các polyme hình thành hai
pha nhằm loại trừ lẫn nhau. Tuy nhiên, về bản chất các pha đều là chất
lỏng, do vậy, về nguyên tắc không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzym
như trong hệ thông hai pha nước - dung môi thông thường. Hơn nữa, sử
dụng các loại polyme không ảnh hưởng nhiều đến môi trường cũng như
lựa chọn thiết bị để tách chiết hai pha lỏng - lỏng, nó thường được sử
dụng trong công nghiệp hoá học và hoá dược. Hầu hêt các hệ thông tách
hai pha lỏng - lỏng thường được sử dụng các chất polyme polyethylen -
glycol (PEG) - dextran và PEG - muo'i, trong hai loại trên ỏ cấp độ tách
chiết lớn, người ta dùng PEG - muối nhiều hơn, vì dextran tạo độ nhớt
cao không thuận lợi cho quá trình tách chiết. Hàng loạt hệ thông hai
pha khác đã được thử nghiệm nhằm giảm giá thành và lựa chọn polyme
có lợi cho môi trường nhiều hơn, nhưng hệ thống PEG - muối vẫn được
sử dụng nhiều nhât.

Hình 3.6. Biểu đổ pha của hệ thống polyethylen glycol 4000 - dextran T500

Hệ thống hai pha có thể trình bày bằng một biểu đồ pha, như trình
bày trên hình 3.6 cho hệ thống PEG (MW 4000) - dextran (T500) mà â
đó trạng thái cân bằng được biểu thị bàng đưòng cong.

93
 Tất cả các hỗn hợp tương ửng với các điểm lên trên đưòng cong cân
bằng (M) tách rời thành hai pha mà thành phần cấu tạo của nó được xác
định bằng các điểm T và B đến pha đỉnh và pha đáy tương ứng. Tỷ lệ
pha đỉnh và pha đáy được xác định bởi giá trị các vệt BM và MT liên
quan trên đường thẳng tương ứng:

i = = (3.2)
VB MT
Trong đó, VT là thể tích pha đỉnh, VBlà thể tích pha đáy. Protein và
mảnh vỡ của tế bào được phân bố giữa hai pha theo hệ số phân tán của
chúng. Đối với một protein đặc hiệu, hệ sô" phân tách được xác định là:

K =^ (3.3)
CB
Trong đó, Kp là hệ số phân tách đối với protein, CT —nồng độ protein
trong pha đỉnh và cn - nồng độ protein trong pha đáy. Khi sử dụng để
loại bỏ mảnh vỡ của tế bào, protein lúc nào cũng vậy tập trung vào pha
đỉnh (PEG trong trường hợp PEG/dextran và PEG/muôì), trong khi đó
các mảnh vỡ tập trung vào pha đáy, Do vậy, hiệu suất thu hồi protein là:
V c 1
Yt =. ~ —- (3.4)
VT.CT +V B.CB 1 + v , J _
V K,
Hiệu suất (Yt) hiển nhiên sẽ tăng vói Kp, nhưng cũng với tỷ lệ thể
tích đỉnh và đáy. Kp phụ thuộc vào nhiều yếu tố liên quan đến cả hệ
thống hai pha (nghĩa là khối lượng phân tử của các polyme, nồng độ các
polyme và muôi, pH, nhiệt độ, nồng độ các mảnh tế bào), và đến protein
đích (nghĩa là các gốc amino axit không ưa nước, số lượng các gốc cacboxyl
và amin nhánh bên).
Phần lốn các trang bị dùng phân tách lỏng —lỏng cấp độ lớn để tách
chiết hai pha hoặc nhiều pha thu nhận enzym hiệu suất cao đã được bán
trên thị trường như: Các loại cột kiểu Kủhni, máy ly tâm ép Podbielniak
và ly tâm đĩa hay ly tâm ống đã được sử dạng.

3.5. TINH SẠCH ENZYM VI SINH VẬT

3.5.1. Cơ sỏ lý thuyết
Dịch chiết thô hay dịch nuôi cấy chứa enzym sau khi đã loại bỏ tế
bào và mảnh vụn tế bào được chuyển sang tinh sạch enzym theo nhiều

94
bước (hình 3.2) nhằm loại bỏ tất cả những chất ô nhiễm ảnh hưởng
không tốt đến mục đích sử dụng. Tinh sạch cũng có thể phục vụ cho mục
đích làm tàng hoạt tính đặc hiệu của chất xúc tác sinh học trong trường
hợp cô định enzym. Tuy nhiên, quá trình thực hiện khác nhau cơ bản
giũa enzym nội bào và enzym ngoại bào, Trong enzym nội bào, địch chiết
enzym là hỗn hợp protein, axit nucleic và các cấu phần khác của tế bào;
trong khi ở enzym ngoại bào, dịch cô đặc enzym chỉ chứa một số’ protein
ngoại bào và các chất hoà tan có khối lượng phân tử thấp, vì màng tế
bào làm hàng rào ngăn cản hầu hết thành phần của tê', bào thoát ra
ngoài, giúp cho việc tinh sạch enzym có hiệu quả hơn. Trong thực tế,
nhiều enzym thuỷ phân được bán trên thị trưòng là các chế phẩm enzym
khá thô, không qua bước tinh chế nào, còn trong trưòng hợp enzym nội
bào, dịch chiết không chỉ nhiễm các protein khác, mà còn nhiễm axit
nucleic, do vậy, theo thông lệ phải thực hiện bước loại bỏ axit nucleic
trước. Có nhiều cách được lựa chọn để loại bỏ axit nucleic như xử lý bằng
enzym nucleaza và kết tủa bằng các tác nhân khác nhau. Amon sulphat
là chất loại bỏ hiệu quả axit nucleic, nhưng cũng kết tủa protein tốt, do
vậy cần có các chất kết tủa đặc hiệu hơn như các vật liệu có điện tích
dương để tạo thành phức với các gôc phosphat mang điện tích âm của
axit nucleic như polyethyleneimin, chất tẩy rửa cation cetyltrimethyl
amoni bromid, streptomycin sulphat và protamin sulphat. Tất cả các
quá trình này đắt và có ảnh hưởng nhất định lên enzym, do vây chùng
dược sử dụng tinh sạch ở cấp độ lớn chỉ trong trường hợp không cho
phép nhiỗm bẩn lên sản phẩm enzym, Việc xử lý bằng enzym nucleaza
tuyến tuỵ của bò được xem là phương pháp loại bỏ axit nucleic có hiệu
quả về giá thành nhất (Chaplin M., 2004).
Chất hoà tan có khối lượng phân tử thấp, cụ thể là các ion, có thể
gây rắc rối cho bước tinh sạch ban đầu và trong trường hợp này, chúng
phải được loại bỏ trước, hoặc bằng cách lọc kép, hoặc bằng sắc ký loại trừ
kích thước. Không phải thưòng xuyên, như vậy loại bỏ ion (loại trừ
muối) được sử dụng tiếp như bước hoàn thiện cuôì cùng.
Tinh sạch enzym cđ bản dựa trên việc loại bỏ protein nhiễm bẩn
bằng cách phân đoạn dựa trốn khôi lượng phân tử của enzym thông qua
phương pháp lọc gel, đây là bưốc trung gian giữa tinh chế và thu hồi
enzym. Mỗi bước tinh sạch làm tăng độ tinh sạch (thưòng được biểu thị
trong thuật ngữ hoạt tính đặc hiệu: đdn vị hoạt tính trên đơn vị khôi
lượng protein) nhiing chãc chăn một sô enzym hoạt tính bi m ât dân đên

95
hiệu suất thu hồi thấp hơn 100%. Các yếu tô' tinh sạch enzym và hiệu
suất cho một quá trình hoạt động đã cho (i) và tổng thể giá trị cho các
quá trình hoạt động liên tiếp nhau N là như sau:
(PF)1- a , / ( a i _1) (3.5)
Trong đó ai là hoạt tính enzym cho đơn vị khối lượng protein.
PF = ^ = q (PF) (3.6)
aD 1=1
Trong đó, aN là hoạt tính enzym cho một lần xác định, a0 - hoạt
tính enzym cho đòn vị khối lượng protein ban dầu.
Y, = E ,/(E 1^ ) (3.7)
Hiệu suất thu hồi (Y) phụ thuộc vào hoạt tính enzym mỗi lần thu
hồi (E,)’
E N
Y = Ì ^ Ì ị Y (3.8)
Ed W
Để khắc phục giữa tính sạch và thu hồi, do làm tàng độ tinh sạch
đòi hỏi phải thực hiện Bố lần thực hiện cao hơn, mỗi lần là một lần có
hiệu suất thu hồi riêng. Mặc dù, nếu hiệu suất thu hồi của một lần thực
hiện cao (nghĩa là 80%), nếu quá trình tinh chế đòi hỏi hàng loạt (nghĩa
là 5) các bước thực hiện liên tục thì hiệu suất thu hồi CUỐI cùng sẽ thấp
(chi 33%). Nếu yếu tố tinh sạch trung bình là 2,5 cho một lần thực hiện,
thì sau 5 lần thực hiện hiệu suất thu hồi sẽ là 98. Điều này có thể được
đánh giá đúng như trên hình 3.7.

N
Hình 3.7. Yếu t ế tinh sạch (PF) và hiệu su ất thu hổi (V)
lả phương trình của sô' bưổc tinh sạch (N)

Đối với enzym công nghiệp sản xuất ở cấp độ lớn thì chỉ tiêu tinh
sạch đạt được mục đích thích hợp cho mục đích sử đụng đã được định
trước. Điều này là do tinh sạch ở cấp độ lớn là nặng nề và đắt và thưòng

96
không thể bù đắp để đầu tư cho việc sản xuất protein tinh khiết. Trong
mỗi trường hợp, nhiệm vụ chủ yếu là hiệu suất thu hồi enzym quan tâm
nhiều hơn độ tinh sạch của enzym. Tuỳ thuộc hoàn cảnh cho mỗi trường
hợp đặc biệt thì độ tinh sạch của enzym không cần quan tâm đến hiệu
suất thu hồi. Tuy nhiên, trong sản xuất lớn vẫn cần quan tâm đến độ
tinh sạch, đặc biệt trong trưòng hợp enzym cố định, độ tinh sạch có thể
có ý nghĩa kinh tế lớn của quá trình và cũng vì thế gần đây có tiến bộ
trong lĩnh vực tinh sạch protein ỏ cấp độ lớn, như enzym ứng dụng trong
công nghiệp hoá dược. Ngoài hiệu suất thu hồi, năng suất và tốc độ liên
quan đến các đặc tính cũng cần xem xét khi lựa chọn cách thức tinh
sạch enzym.
Về nguyên tắc, bất kỳ phương pháp nào dự định để phân đoạn
enzym có thể được sử dụng tinh sạch enzym, nhưng các phương pháp
được áp dụng phải tuân thủ cho việc nâng cấp với giá thành hợp lý, chỉ
những phương phốp đó mới được xem xét ở đây. v ề tinh sạch enzym xem
website: Protein purification handbook.
Phương thức tiến hành dựa trên tinh chất vật lý (như kích thước
phân tủ, độ hoà tan, sự phân bố điện tích bề mặt) cần được chọn xem xét
đầy đủ mà trong đó sự khác nhau rõ rệt tồn tại giữa enzym đích và các
protein nhiễm bẩn. Mỗi phương thớc hoạt động cần phải dựa trên một
tính chất khác biệt, trước hết cần phải giảm thể tích quá trình càng
nhiều càng tốt, ví dụ: đốì với quá trình thực hiện đắt thì việc tinh chế
dược thực hiện sau cùng, những chất nhiễm bẩn gây hại như proteaza
cần được loại bỏ sớm. Tất cả các thao tốc phát triển ỏ mức độ phòng thí
nghiệm cần phải phân tích thận trọng để nâng cấp độ sản xuất với số
lượng các thao tác càng ít càng tốt và nếu sử dụng các chất bổ sung, cần
giảm tối thiểu để tránh cho các bưóc tinh sạch tiếp theo.
Người ta đã tổng kết quá trình tinh sạch enzym ỏ cấp độ phòng thí
nghiệm thưòng khó ứng dụng trong sản xuất cấp độ lớn, vì sô' lượng
enzym lớn, thao tác phức tạp và hiệu suất thu hồi rấ t thấp (thường dưối
10%), cho nên chỉ các protein tái tổ hợp giá thành cao, sử dụng để chữa
bệnh hay trong công nghiệp hoá dược và sản xuất ở cấp độ nhỏ thì mới
cần độ tinh sạch cao.
3.5.2. Các phướng pháp tinh sạch enzym
Một sô' phưdng pháp phân đoạn protein liên quan đến tinh sạch
enzym phổ biến nhất ứng đụng ở cấp độ lớn được xem xét dưới đây. Cốc

97
phương pháp này có thể phân tách dựa trên sự kết tinh phân đòạn cũng
như thời gian lưu trong dịch thể chứa các vật liệu rắn.
a) Kết tủa
1) Chất hình thành dựa trên sự giảm độ hoà tan là kết quả
của việc bổ su n g một số muối (gây tủa bằng m uôi), dung môi
hữu cơ hoặc polyme
Các phương pháp này thưòng được sử dụng như là bưóc tinh sạch
dầu tiên bỏi các phương pháp này đơn giản, độ chọn lọc không cao và dễ
thay đổi. Khả nãng hoà tan của protein thay đổi vổi cưòng độ của các ion
của muối trong dung dịch, ở nồng độ muôi thấp, khả năng hoà tan của
protein tăng với nồng độ muôi tăng, nhưng khi nồng độ muôi tăng cao
hơn thì khả năng hoà tan của protein bắt đầu giảm và protein kết tủa
khỏi dung dịch (gây tủa khỏi dung dịch). Kết tủa nhờ muổì thưòng được
thực hiện dể phân đoạn protein dựa trên sự giảm độ hoà tan của protein
ở nồng độ muối hoà tan cao. Nhìn chung, các cation đdn trị và anion đa
trị có hiệu quả hơn, chúng chông lại sự hỗn loạn và làm tăng tính kỵ
nước, đẩy mạnh sự tích tụ của protein. Kết tủa protein ở nồng độ muối
cao đã được giải thích bằng sự solvat hoá ion, nó làm giảm hiệu lực của
nước để hoà tan protein. Theo khả năng tan của protein (S) thì khả năng
kết tủa của protein ở nồng độ muôi được mô tả bằng phương trình của
Cohn như sau:
logs = Ps- Ks. ịi (3.9)
Trong đó, Ps là hệ số hoà tan của protein; Kg - hằng số muối thoát
ra ngoài (salting - out) và p. - cường độ ion, ở đó:
l/2 E n v Z ;2 (3.10)
Trong đó, tĩii là nồng độ phân tử gam ion và Z; - hoá trị của ion.
Như vậy, Ps biểu thị log của tính tan của protein ở cường độ ion
bằng không và tác động mạnh của nhiệt độ và pH. Ks là độ dốc (slope)
của đường cong tính hoà tan và phụ thuộc vào bản chất của protein và
muối, nhưng không phụ thuộc vào pH và nhiệt độ. Độ lân của Ks xác
dịnh cường độ ion mà ở đó protein kết tủa, giá trị Ks cao tiến dần đến
khả năng kêt tủa, vì vậy protein sẽ kết tủa trong một khoảng hẹp của
cường độ ion. ps xác định độ lớn của cường độ ion mà ở đó protein bắt
đầu kết tủa, giá trị Ps càng thấp, càng tiến gần đến sự kết tủa. Theo
illanes A (1974), phương trình của Cohn không bao gồm bất kỳ nồng độ
protein nào lệ thuộc vào thuật ngữ này và trong thực tế, đưòng cong kết

98
 tủa không thay đổi với nồng độ protein, đơn giản giá trị này xác định
cường độ ion là giá trị ngưỡng để kết tủa. Với từng loại muối, Kg có thể
thay đổi theo kích thước của phân tử, giá trị Ks càng lớn thì protein bất
đôĩ xứng càng lớn. Amon sulpha t không chỉ là loại muôi tốt nhất theo
tập hợp của Hoffmeister mà thường được chọn vì nó không ảnh hưỏng
xấu đến enzym (trên thực tế ngưòi ta sử dụng muôi này để bảo quản
enzym) và cường độ ion cho phép hoà tan đủ để kết tủa hầu như mọi
protein. Tủa bằng muốĩ diễn ra nhanh, sự cân bằng đạt được chỉ trong
vài phút, nhưng kích thưóc hạt nhỏ (từ 0,5 đến 5um) gẫy trồ ngại cho
việc thu hồi vì đòi hỏi lực ly tâm phải cao thì mới phân tách tốt được.
Như bất kỳ phương pháp kết tủa nào, phương pháp muối hoố có độ chọn
lọc không cao và các yếu tố tinh sạch dưới 10 nhận được, thậm chí dưới
điều kiện đã tối ưu, nhưng nó hoàn toàn hữu dụng như một bước cô đặc
sớm, vì protein đã tủa lại có thể hoà tan lại vào lượng nưâc nhỏ.
2) Kết tủa bằng phức hợp nước và dung m ôi hữu cơ
Phương pháp này thưòng được sử dụng trong giai đoạn đầu tinh sạch
enzym. Một số’trở ngại là quá trình thực hiện phải thực hiện ở nhiệt độ
thấp (gần hoặc dưới Ơ’C) bồi vì dung môi là chất làm biến tính protein ỏ
nhiệt độ phòng và phải có quạt hút phòng cháy nổ. Ethanol và axeton là
dung môi thường được sử dụng nhiều nhất, khoảng kết tủa của axeton là
hẹp hơn, nhưng nó rất có hại, do vậy cần phải sử dụng ở nhiệt độ rất thấp.
Ngược lại, kết tủa bằng dung môi hữu cơ có ưu điểm hơn phương pháp kết
tủa bằng muối, vì nó có độ chọn lọc hơn do tính chất hoá lý của protein,
hơn nữa, nó sản sinh ít chất kết tủa vô định hình, dễ dàng thu nhận bằng
phương pháp ly tâm thông thưòng. Kết tủa được xúc tiến bằng tương tác
Coulomic của protein - protein ỏ cường độ ion thấp mà nó khuếch đại
bằng cách giảm hằng số điện môi được xúc tiến bởi dung môi trộn lẫn với
nước. Một sự tương quan theo kinh nghiệm tương tự như phương trình
kết tủa bằng muôi của Cohn, được nhận thấy hữu ích cho đánh giá sự kết
tủa protein bằng dung môi hữu cơ hoà với nước:
logS = ỉogS0—Ks • e'2 (3.11)
Trong đó, So là khả năng tan của protein ỏ hằng số' chất diện mồi
không gi ối hạn, K’s - hằng sô' kết tủa dung môi hữu cd và e - hằng sô'
chất điện môi.
Sự lý giải ỏ trên đã đật vân đề từ khi tiến hành với cồn ỏ nhiệt độ
thấp, giảm hằng sô' điện môi là không có ý nghĩa đặc biệt đối với nước;
trường hợp đó đã được chứng minh rằng lực tương tác van der Waal dẫn

99
đến sự tích tụ protein. Khả năng hoà tan của protein liên quan tốt đến
tính có cực của dung môi và các thông số hoà tan dự báo trước khả năng
kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ. Kết tủa bằng muối và dung môi
được kết hợp trong hệ thông phân chia ba pha mà ò đó enzym bị kết tủa
tập trung vào giao diện pha nưóc —dung môi nhận được độ tinh sạch cao
ỏ hiệu suất thu hồi cố thể chấp nhận được.
3) Các polym e không có ỉon hoà tan cũng được sử dụng làm
chất kết tủa trong tỉnh sạch enzym
Sự tương tác protein - protein được xúc tiến bằng các polyme đã giải
thích bằng thuật ngữ ưu thế loại nước của Asakura và Osawa, nhờ đó sự
chiết xuất dung môi giữa các phân tử protein gây ra lực tương tác làm
tích tụ protein và tách pha. Ngược lại, vối dung môi hữu cơ, các polyme
giống như polyethylen - glycol không gây hại cấu trúc và có thể được sử
dụng ỏ nhiệt độ phòng không ảnh hưỏng có hại lên cấu trúc của enzym.
Sử dụng polyme dễ làm tăng tính nhót, gây khó khăn loại bỏ polyme sau
khi kết tủa. Khả năng tan của protein phụ thuộc vào nồng độ polyme và
được mô hình hoá theo phương trình tương tự như phương trình bổ sung
muối của Cohn như sau:
logS = logS'o - K"s • Cp (3.12)
Trong đó, S 0 là khả năng tan của protein ỏ nồng độ chất kết tủa
bằng không, K s - hằng sô'kết tủa polyme và C p - nồng độ polyme.
Một số kỹ thuật kết tủa protein khác, giống như sự bất hoạt khác
nhau do nhiệt độ và pH, hãn hữu được sử dụng cho các trưòng hợp này
mà ỏ đó độ bền khác thưòng cho phép enzym giữ lại được cấu trúc thực
của nó trong khi các protein nhiễm bẩn bị kết tủa nhờ xuất hiện sự
không thuận nghịch.
Độ chọn lọc của hầu hết các phương pháp phân đoạn bằng kết tủa
cho là hạn chế chính của nó, cho nên người ta bổ sung các mấu (ligand)
đặc hiệu vào các polyme có thể là công cụ hữu hiệu để tinh sạch (kết
tinh ái lực) và các polyme “thông minh” (nghĩa là với chúng độ hoà tan
thay đổi đột ngột với sự thay đổi nhỏ trong môi trưởng), đang sử dụng
ngày càng tăng để tinh sạch enzym, vì nó cho phép tính đến các thao tác
chọn lọc cao ngay từ lúc khỏi đầu quá trình tinh sạch.
b) S ắ c ký
1) Sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là một hệ thống tinh sạch enzym rấ t m ạnh để tách phân
đoạn protein, gồm việc chuyển trạng thái phức hợp các chất hoà tan

100
(trong trường hợp này là protein) được hoà tan vào pha nhu động qua
pha ổn định (thường là các chất nển rắn) vói nó, các chất tan tương tác ở
cường độ thay đổi cho nên sinh ra sự chậm trễ khác nhau cho phép phân
tách chúng nhò đầu ra thích hợp. sắc ký là một hệ thống phân tích rất
có hiệu quả và đã được sử dụng rộng khắp ở cấp độ phòng thí nghiệm để
tình chế enzym. Hầu hết cấu hình thông thưồng là sắc ký cột, trong đó
pha ổn định được xếp vào trong cột đi qua đó là pha nhu động chứa
protein và sau đó trên đầu ra được bơm nhu động. Nâng cấp các phương
pháp sắc ký để sản xuất enzym là cồng kềnh, phức tạp, vì hệ thống này
phải mạnh, vì số’lượng dưa vào quá trình cao và giá cả hợp lý mà nó là
nhiệm vụ không dễ dàng một chút nào. sắc ký lỏng để phân đoạn
protein đã được sử dụng rộng rãi trong thực tế.
Nhiều kiểu sắc ký đã có để phân đoạn enzym, trong đó, theo nguyên
tắc phân tách thì các loại sắc ký phổ biến nhất là: sắc ký loại bỏ kích
thưốc, sắc ký trao đổi ion, sắc ký kỵ nưốc và sắc ký ái lực.
* Sắc k ý loaỉ bỏ kích thước (cũng không
đúng với thuật ngữ lọc gel hay thẩm thấu gel),
phân tách protein theo kích thước phân tử của Hạtsephadex
chúng (hình 3.8 và 3.9). Phân tử nhỏ hơn đi vào
cấu trúc lỗ mao quản của hạt và chậm trễ nhất,
trong khi đó phân tử lôn hơn không bị pha ổn
định ngăn cản và đi ra khỏi cột sớm hơn. Sự dung
giải cao (nó được sử dụng để xốc định khôi lượng
phân tử) nhưng số lượng vật liệu đưa vào thấp và
do vậy thường được sỏ dụng ỏ giai đoạn sau. hay
bước hoàn thiện enzym cuốỉ cùng. Hàng loạt các Ị
chất nền đã có trong đó dextran liên kết chéo, _
polyacrylamiđ, polymethacrylat, polyvinyl alcohol,
agarose gel, nhưng sephadex là nổi trội hơn cả. ị
Cần chú ý các thông sô' sau: tỷ lệ chiều cao 80 với
đường kính cột (thông thường chiều cao bằng căn Hình 3 8 Loc J
bậc hai đưòng kính), khả năng đóng cặn gây cản ,
" , ' 7 ^ V 1 ___ Phân tử nhỏ lọt vào tro n g
trở độ phân tán, các loại chất mang xếp vào trong - sVphadex và bị giữ lại;
côt,... Những thông tin đây đủ vê thực hiện quy phântử lớn khônglọt vào
trình, các loại chất mang và các loại cột để sắc ký đượctrong hạtsephadex
loai bỏ kích* thưổc đã có trong s ổ tay tinh sạch và di chuyển xuốns giữa
các hat.
enzym của Anonymous, 1999.

101
 >
83WB
O
oooặ>Ộ
T pOO o ọ 000
ÕO oooộộ
0ọộ
OỘỘ
g Ọ poo
o600
ọọọ
oooooo
o ooo o oooo
00 000
o 0 000
o ộ ọpo
oơtoọ o o 000
O
o Õ000
oỌỌÕO
„50 ỵpỘ ỘO
ỘÓ
oÒộộ ộpo
9 ooO
OỌỌ
oOỘO
ỘÕ
Õ
Õ Sc
OÒ
ọ 0 ọoọ
O o o ọ 00
00 ỘOO 8 00 000
ọoo
ộ ộ oọộ
<
VoO ÕoÒoọọ
OÓ
ÕO
Õ ọoooO
o

OO
OỎ
Õ O Q O

O OOCCC
OO 00 000
ŨGOOO
^ ỊD o a a CJC CTOŨCE □CEDOCJC

\l \ \
Hinh 3.9. Dùng cột sephadex để tách biệt hai protein có kích thưđc khác nhau
1, C á c h ạ t s e p h a d e x h y d ra t hoá; 2. M à n g ngăn có lỗ.
A - ĐỔ h ỗ n h ợ p p ro te in v à o cột; B - C á c p ro te in b ắ t đầu th ấ m xu ố n g c ộ t; C - C á c p ro te in bắt
đầư tách biệt: p h â n tử n h ỏ v à o tro n g hạ i, còn p h â n tử lớ n d l c h u y ể n x u ố n g ; D - H ai protein
tách riê n g và có th ể thu và o c á c ố n g kh á c nh au .

* s ẩ c k ý tra o đổi ion đã được sử dụng rộng răi để tinh sạch enzyra
có ý nghĩa thương mại. Bản chất lưỡng tính của enzym có thể là cation
hoặc anion phụ thuộc vào pH của +
dung dịch và sự phân tách dựa vào
sự tương tác ion thuận nghịch giữa
các gốc amino axit tích điện trong
phân tử protein và chất mang sắc ký pH
(thông thưòng là nhựa trao đổi ion)
trái dấu. Khi các protein đi qua cột,
chúng liên kết khác nhau theo sự
phân bố điện tích trên bề mặt ô pH Hỉnh 3.10. Nguyên tắc trao đổi ion
hoạt động khác nhau. Khi trên điểm
Ở trên điểm đẳng điện (IP), protein liên
đang điện, các protein biểu thị điện kết với chất trao đổi anion (AE) và được
tích mạng âm và liên kết vối chất thôi ra bằng cách giảm pH và ỏ dưới,
trao đổi anìon, còn dưới điểm đẳng chúng liên kết với chất trao dổi cation và
được thôi ra bằng cách tăng pH.
điện chúng biểu thị điện tích mạng
dương và liên kết vối chất trao đổi cation. Các protein được giữ lại được thôi
ra bằng cách chuẩn độ, giảm pH đến điểm đẳng điện trong trường hợp thứ
nhất và tăng pH đến điểm đẳng điện trong trường hợp thứ hai. Trong cả
hai trường hợp, việc thôi enzym có thể được thực hiện bằng cách thay đổi
giá trị pH qua điểm đẳng điện (xem hình 3.1Q).

102
 Bảng 3.7. Các hộ thống sắc kỹ trao đổi ion thường được sử dụng
Chất trao đổi iort
Chất m ang Nhà cung cấp
Anion Cation
Xenluloza DEAE; TEAE; QAE. CM; p Amersham - Pharmacia;
Bio - Rad; Whatman
Dextran DEAE; TEAE; QAE. CM; P; SP Amersham - Pharmacia
Agaroza DEAE; PEI. CM Amersham - Pharmacia;
Bio - Rađ;
Chất đồng trùng hợp DEAE CM; SP PaJt Ind. Biologique Franọaise
acrylic
Polyme dựa trên DEAE CM; SP TosoHaas
Toyopearl và TSK - GEL

Ghi chú: DEAE: diethylaminoethyl; TEAE: triethylaminoethyl; QAE: quatemaryamino - ethyl;

PEI: polyethylene!mìn; CM: cacboxymethyl; P: phospho; SP: sulfopropyl.

Phân đoạn protein được thực hiện trong bước tách rửa, mà ở đó pH
hoặc gradien muôi được áp dụng; gradien có thể thực hiện theo bậc hay
liên tục. sắc ký trao đổi ion thưòng thiết kế để giữ lại enzym đích,
nhưng nó cũng được thiết kế để giữ lại tạp chất. Hầu hết các chất mang
và các nhóm trao đổi ion thông thường để sắc ký trao đổi ion được trình
bày trên bảng 3.7, tuy nhiên năng lực trao đổi của chất mang là nhân tố
quyết định đến hiệu suất của cột và có thể cao đến 5meq/g, sắc ký trao
đổi ion cho phép vật liệu đưa vào cao hơn sắc ký loại bỏ kích thước và có
thể thực hiện sớm trong quá trình tinh chế miễn là cường độ ion của chế
phẩm enzym thô thấp bằng phương pháp khử muối trưổc đó. sắc ký trao
đổi ion là cách tinh sạch enzym rất mạnh và thậm chí protein có cùng
điểm dẳng điện có thể phân tách thuận tiện, bởi vì sự tương tác với chất
mang được xác định bằng sự phân bô" diện tích bề mặt của protein khá
hơn điện tích của mạng lưới. Thông tin đầy đủ về các quy trình thực
hiện, các loại chất mang và cột để sắc ký trao đổi ion đã có trong các
sách hướng đẫn (Simpson RJ, 2004).
2) Sắc ký kỵ nước
Để làm tống độ tinh sạch enzym, phương pháp này dựa trên sự
tương tác các vùng kỵ nước của protein vói thể gel kỵ nước, tuy nhiên,
phân tách protein theo nguyên tắc chung không rõ ràng. Hầu hết các
chất mang là các gel bao gói vối các nhóm aryl hay alkyl (cũng có thể là
các nhóm butyl, octyl hay phenyl) kỵ nưóc. Để phân đoạn có hiệu suất
cao cần cường độ ion phải cao, vì nó làm tăng khả năng tương tác kỵ

103
nước trong các phân tử protein, cho nên, quá trình hoạt động này lý
tưởng hơn bằng cách bão hoà muối trước và tách enzym khỏi chất mang
bằng cách thay đổi pH, hoặc biến tính hằng số chất điện môi của chất
tách rửa (eluent), nhưng phương pháp này thưòng kết hợp với các quy
trình sắc ký khác thì mới mang lại hiệu quả cao.
3) Sắc ký ái lực
Đây có lẽ là kỹ thuật tinh sạch có uy tín nhất vể khái niệm khuếch
tán, vì nó dựa trên các tính chất ứng đụng hơn là tính chết hoá lý của
protein, dựa trên tính đặc hiệu của chất xúc tác và tính chất kháng
nguyên của enzym cũng như bất kỳ một protein nào khác. Trong nhiều
trường hợp, quá trình thực hiện đơn giản, nhưng có thể thu được enzym
tinh sạch như mong muốn và hiệu suất thu hồi cao. Tuy nhiên, giá
thành sản xuất cao, do đó nó chỉ thích hợp để sản xuất enzym ỏ cấp độ
thấp, nhưng có giá trị cao.
Chất mang cho sắc ký ái lực gồm chất cơ chất liên kết với một
nhánh (legand) trong khoảng không tương tác đặc hiệu với protein, chất
mang là polyme không tương tác với protein, nhưng tạo các nhánh cho
phép liên kết với protein, các hydrocacbon béo thường được tận dụng
chiểu dài chuỗi từ 5 đến 7 nguyên tử cacbon, nhưng không dài quá trở
nên dễ gẫy hoặc làm cho tương tác không đặc hiệu. Các chất đặc hiệu vói
enzym cũng có thể là bất kỳ phân tử nào mà tương tác đặc hiệu với cấu
trúc của enzym như cơ chất, coenzym hay cofactor và các analog tương
ứng. Mức độ đặc hiệu có thể thay đổi theo tínỉi đặc hiệu của cơ chất, chất
ức chế và các analog tương ứng cho một enzym cụ thể, trong khi đó các
coenzym, cofactor và analog tương ứng của chúng đặc hiệu cho một
nhóm enzym (như NAD+ cho dehydrogenaza; ATP cho kinaza) hơn là
cho một enzym cụ thể. Việc lựa chọn chất liên kết phù hợp là bước quan
trọng, quyết định cho quá trình thực hiện thành công, vì các chất phải
liên kết với enzym đủ mạnh, cho phép sự trễ có hiệu quả trong cột sắc
ký, nhưng không quá mạnh để ngăn cản sự thôi ra của enzym; các giá
trị hằng sô' phân ly được gợi ý là nằm trong khoảng ÌÍT* và ÌO^M, Chất
nền sắc ký ái lực đặc biệt đối với protein tái tổ hợp gắn đuôi His (His -
tagged recombinant protein) cũng đã được phát triển và ứng dụng thành
công cho tinh sạch một bưóc các enzym liên quan đến công nghiệp,
nhiều enzym có ở cơ thể nhân thật là glycoprotein và trong trường hợp
này, đã sử dụng sắc ký ái lực lectin ỏ đó nhánh liên kết đặc hiệu đối với
cacbohydrat (như concavalin A). sắc ký ái lực miễn dịch cũng được sử

104
dụng đê tinh sạch enzym mặc dù ở cấp độ khá nhỏ, chủ yếu để nghiên
cứu và tinh sạch các enzym dùng trong điều trị bệnh.
c) Các phương pháp phân đoạn protein khác
Sử dụng các phương pháp đã có để tinh sạch enzym khi đòi hỏi mức
độ tinh sạch cao. Hầu hêt các kỹ thuật này đều hướng đến điều chế các
mẫu protein có độ tinh sạch cao để nghiên cứu đặc trưng enzym và giá
thành tinh sạch enzym rấ t cao, cho nên, việc ứng dụng nó chỉ giói hạn
đôi với các protein và peptit đặc biệt đổ sử dụng trong điều trị, chẩn
đoán và nghiên cứu điểu trị bệnh, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là hệ
thống dung giải cao phần lớn được sử dụng cho mục đích phân tích và
cũng đã được sử dụng tinh chế các protein và enzym tái tổ hợp. HPLC
đảo pha, ở đó protein phát triển khác nhau do tương tác kỵ nước vối chất
mang và sau đó được thôi ra bằng cách tăng nồng độ dung môi hữu cd
trong pha lưu động phù hợp cho phân đoạn enzym. Và một phương pháp
phân đoạn enzym khác là điện di —một kỹ thuật tinh chế enzym để
phục vụ cho mục đích phân tích và đặc trưng enzym.

3.6. LẬP CÕNG THỨC VÀ HOÀN THIÊN CHẾ PHẨM ENZYM

Trước đây, enzym được tinh sạch đến mức độ cần, chế phẩm phải
được lập công thức theo mục đích sử dụng. Việc lập công thức chế phẩm
enzym cũng giông như là một nghệ thuật và được các nhà sản xuất giữ
bí mật chi tiết, hoặc không tiết lộ đối với khách hàng. Mặc dù không
quan tâm nhiều đến giai đoạn sản xuất này trong các tài liệu tham khảo
đã công bố, nhưng lập công thức là một bước quyết định trong sản xuất
enzym đặc biệt trong enzym công nghiệp, vì bước sản xuất quyết định
tính cạnh tranh của nhà sản xuất. Tuy nhiên, lập công thức đưa ra
không chi’ cho enzym hàng hoá lớn mà còn cho enzym đặc biệt cần phải
tuân theo những quy định nghiêm ngặt, các quy định này được xác định
đến quy mô lón nhò khách hàng sử dụng enzym. Ví dụ: enzym sử dụng
trong bột giặt, dệt, thuộc da, sản xuất giấy được quy định như bất kỳ
hoá chất khác sủ dụng trong quá trình sản xuất; enzym được sử dụng
trong lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm theo quy định của các cơ quan
tương ứng (Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc, (FAD) ở Mỹ và các cơ
quan tương ứng ở các nước khác). Do vậy, quy định này bao trùm cả thế
giới và thậm chí giữa các cộng đồng của các nước. Tuy enzym, theo họ,
về bản chất không độc và không nguy hại, nhưng chúng có thể gây dị
ứng và các chủng vi sinh vật sản xuất cũng phải được đán nhãn an toàn

105
và phải được chấp thuận là chủng được phép đưa vào sản xuất. Rủi ro dị
ứng enzym trong công nghiệp bột giặt ngày nay cần được đánh giá cẩn
thận, do tranh cãi mà cuôl những năm 1960, công nghiệp bột giặt đã bị
đe đoạ và xóa bỏ việc sử dụng enzym trong bột giặt vài năm ở Mỹ. Vân
dề dị ứng cũng đã tìm thầy đối với trường hợp amylaza sử dụng trong
làm bánh. Chủ đề môi quan tâm chính hiện nay là sản xuất enzym từ
các cơ thể biến đổi gen chưa được nhất trí, trong khi một số nước ngăn
cản và quy định nghiêm ngặt sản xuất enzym như vậy thì một số nước
khác lại có nhu cầu và đòi hỏi thực hành sản xuất tốt (GMP). Khía cạnh
sức khỏe và an toàn liên quan đến sản xuất và sử dụng enzym đã được
tổng quan toàn điện và quy định an toàn đối vái enzym thực phẩm đã
được công bố gán đây. Hưóng dẫn cơ bản về các khía cạnh cần điều
chỉnh và an toàn về sản xuất enzym đã được Chaplin MF & Bucke c,
1990, đưa ra rất tiến bộ.
Chìa khoá để giữ hoạt tính enzym là giữ hình dạng cấu trúc liên kết
cộng hoá trị của enzym mà không bị cuộn lại, không bị giãn ra và không
bị thay đổi. Có ba cách tiếp cận, đó là: sử dụng chất bổ sung, sử dụng có
điểu chỉnh sự thay đổi liên kết đồng hoá trị và cồ' định enzym (được thảo
luận kỹ ở chương 4).
Lập công thức enzym bao gồm các bước thực hiện hoàn thiện cuối
cùng, độ bển và tiêu chuẩn hoá chế phẩm enzym (hình 3.2). Bước hoàn
thiện cuôì cùng nhằm hạn chế cốc chất nhiễm bẩn chưa loại bỏ trưác đó.
Đôi với trưòng hợp sản xuầt nhỏ các enzym đặc biệt để ứng dụng trong y
học, bước hoàn thiện bao gồm một sô" bước có tính cha’t chìa khoá để loại
bỏ các chất nhiễm bẩn vết như pyrogen, nội độc tô' axit nucleic và virus.
Đối với trường hdp enzym công nghiệp lớn, bước hoàn thiện cuối cùng
thường được xem xót loại bỏ muối và điều chỉnh pH nếu enzym được sản
xuất ỏ dạng lỏng và làm khô nếu sản xuất là chế phẩm rắn, việc lựa
chọn giữa dạng rắn lỏng không có nghĩa tầm thường. Chế phẩm rắn có
ưu thế dễ mang vác, vận chuyển và đời sống của nó tương đôi cao, tuy
nhiên, vân đề hình thành bụi trong phân xưỏng sản xuất là một vấn đề
nghiêm trọng, do vậy nhiễm bẩn cần thiết giảm rủi ro dị ứng đối với
công nhân làm việc. Chê phẩm lỏng có một sô”ưu điểm: không gây nhiễm
bẩn, không cần làm khô và liều dùng dễ dàng hơn. Mỗi công ty sản xuất
có triêt lý riêng trong vân đê này, nhưng nhìn chung, sử dụng cuổì cùng
enzym vản là do khách hàng. Enzym mà nó là một phần của sản phẩm
rắn (như enzym bột giặt) thường được săn xuất ở dạng rắn; được sản

106
xuất ở dạng lỏng để ứng dụng cho cốc sản phẩm lỏng (như enzym đường
hoá và isome hoá để sản xuất xiro fructoza cao), tuy nhiên chế phẩm
enzym dạng lỏng cũng cần cô đặc thì tốt hơn. Làm khô chân không hay
sấy phun là phương thức được sử dụng nhiều nhất để sản xuất chế phẩm
enzym rắn có hoạt tính cao, trong khi đông khô là một phương pháp đắt
hơn chỉ sử dụng cho các enzym đặc biệt dễ biến tính. Với việc tăng cường
sử dụng enzym trong môi trưòng khô, đòi hỏi enzym được đông khô tác
động như chắt xúc tác không hoà tan trong môi trường như vậy tâng lên.
Trong một số trưòng hỢp, cần thao tác đặc biệt, như trường hợp proteaza
bột giặt, cần gói bột enzym thành hạt để tránh hình thành bụi trong quá
trình sản xuất và bảo vệ người sử dụng tiếp xúc trực tiếp enzym, còn chế
phẩm enzym dạng lỏng có thể đóng chai, hoặc cô đặc enzym trước khi loại
muối bằng lọc thẩm thấu hoặc sắc ký loại bỏ kích thước.
Enzym được bán trong điều kiện có hoạt tính đặc hiệu mà người sản
xuất cần khẳng định giá trị tối thiểu nào đó cho khách hàng, thông
thường hoạt tính đặc hiệu trên nhãn thấp hơn giá trị thực nhận được ở
thòi điểm sử dụng bỏí lãi suất tiếp theo, độ bền là mốỉ quan tâm chính
khi sản xuất enzym, vì sản phẩm enzym phải chịu được điều kiện bảo
quản và vận chuyển không bị mất hoạt tính, sản phẩm enzym lỏng có
thể mất 10 - 20% hoạt tính trong thời gian 4 - 6 tháng ở nhiệt độ phòng,
vì thế ngưồi ta khuyên cần bảo quản trong lạnh sẽ tàng tuổi thọ của nó
được một năm hoặc lâu hơn. Hàng loạt các chất bổ sung và chiến lược
được sử dụng dể cải tiến độ ổn định để bảo quản enzym. Cũng cần chú ý
đến phòng trán h nhiễm vi sinh vật và bảo vệ cấu trúc của enzym.
Nhiễm vi sinh vật là vấn đề trong sản phẩm enzym dạng lỏng, vì
proteaza dại có thể phân huỷ enzym vổi quy mô đáng kể. Loại bỏ hoàn
toàn và bổ sung châ't bảo quản được chấp nhận (chất diệt khuẩn) vào
chê' phẩm enzym và ngăn ngừa làm hỏng, tuy nhiên, chia khoá của độ
bển khi bảo quản enzym là sự thích ứng hình dạng của enzym ngăn
ngừa sự tích tụ, sự giãn Ĩ1Ở hoặc bất kỳ sự thay đổi có hại trong cấu trúc
không gian ba chiều tự nhiên của enzym.
Người ta sử dụng nhiều cách để ổn định enzym như protein bền hdn
trong dung dịch cô đặc và độ ion cao, vì cô đặc không chỉ là cách loại bỏ
các vật liệu trd mà còn trợ giúp trong bảo quản mà một sô' muôi trung
tính cũng tác động như là chất ổn định bằng cách xúc tiến tương tác kỵ
nưâc trong phân tử enzym, trong khi đó có thể tác động hỗn loạn làm mất
ổn định cấu trúc enzym, do đó muối là cách lựa chọn sáng suốt (bảng 3.8).

107
 Bảng 3.8. Ảnh hưỏng của các ion lên độ ổn định của enzym

<----------------- 7------- Tác động làm tăng sự hỗn loạn

Cation: AI3*, Ca2\ Mg2*, Li*, Na*, K \ NH/, (CH3)4N+
Anion: SCN", I', CIO,-, B r, C|-, s o / - , HPO^2-, xitrate^
Độ ổn định được tăng lên -------------------------------- >

Các nhóm cùng gốc được lựa chọn chất bảo quản là các loại muôi như:
anion đa trị (như xitrat hay phosphat) hoặc cation đơn trị (như amoni
hoặc ion kim loại kiềm) là thích hợp. Một sô" cation là một phần, của vị trí
hoạt động có thể tác động như chất ổn định, ví đụ: Mg2+ hoặc Co2+ trong
trường hợp enzym glucoza isomeraza và Ca2+ trong trường hợp ertzym a -
amylaza; các polyol khôi lượng phân tử thấp, như glyxerol và sorbitol và
các loại đường cũng có thể tác động như chất ổn đình bằng cách giảm hoạt
tính của nước và bảo vệ protein không bị giãn ra. Một số polyme ưa nước
như polyvinyl alcohol, polyvinylpyrolidon và hydroxypropylxenluloza
cũng là chất ổn định enzym bằng cách làm chất thay thế tương tác enzym
- enzym và enzym - nưóc do làm giảm khả năng làm biến tính tương tác
enzym-polyme, các polyme tổng hợp cũng là chất ổn định enzym tốt và
thường dùng trong lập công thức enzym, chúng cũng tác động bằng cách
làm ổn định tác động kỵ nước trong các phân tử enzym. Các hợp chất
hình thành chất có độ nhớt như trehaloza hoặc glyxerol cũng có thể đưa
vào áp dụng bảo vệ enzym bằng cách bao bọc cấu trúc của protein, ngoài
ra glyxerol cũng có thể sử dụng bảo vệ enzym chống lại sự biến tính dẫn
đến sự hình thành băng kết tinh ồ nhiệt độ dưới 0°c. Cơ chất và chất ức
chế được sử dụng để bảo quản enzym đặc hiệu bằng cách bảo vệ các vị trí
hoạt động; thực tế đây là thực hành thông thường mà nó đòi hỏi thẩm tích
chế phẩm enzym trưỏc khi sử dụng. Các enzym có gốc amino axit bị oxy
hoá được ỏ vị trí hoạt động cần được bảo vệ đặc biệt để tránh làm bất hoạt
enzym, ví dụ: xystein proteaza như papain và các enzym liên quan công
nghiệp khác như p - galactozidaza nấm men; các hợp chất thiol, nếu được
phép, có thể sử dụng như là tác nhân bảo vệ hoặc phòng ngừa đặc biệt,
làm giảm mức độ oxy hoà tan trong sản phẩm enzym và một số tác nhân
ổn định cấu trúc cũng được sử dụng để chống lại sự nhiễm khuẩn. Độ bền
có thể nhận được bằng cách cố định, nhưng "ưu thế của nó thuộc vể lĩnh
vực ổn định, đặc biệt tính kinh tê của sản phẩm enzym cố định và nhũng
công bố gần đây của Springer cho ta cách nhìn đầy đủ và cập nhật về cố
định enzym (Guisán JM, 2006).
Bước cuối cùng trong sản xuất enzym là tiêu chuẩn hoá, nhà sản xuất

108
phải khẳng định sản phẩm enzym có chất lượng không thay đổi đôi với
ngiiời tiêu dùng nó, nhưng enzym được sản xuất từ hệ thống sinh học, do
đó sự thay đổi trong các mẻ sản xuất chắc chắn sẽ xảy ra và cũng có thể
thay đổi từ mẻ này sang mẻ khác. Enzym vi sinh vật được sản xuất bằng
lên men dưới điều kiện có kiểm soát chặt chẽ hơn thì thay đổi ít hơn,
nhưng sự khác nhau trong nguyên liệu thô để làm môi trưòng cũng có thể
thay đổi đáng kể. Đê xác lập tính hợp thức của các quá trình sản xuât thử
(pilot) p-galactozidaza từ K. marxianus, người ta nhận thấy sự thay đổi
10% hoạt tính theo thể tích trong 80 mẻ sản xuất. Để giải quyết vấn dề
này, enzym được pha loãng với sự thay đổi lượng chất bổ sung (tá dược) để
hấp phụ theo mỗi mẻ. Chất bổ sung này có thể là nguyên liệu trơ hoặc
một số cơ chất được sử dụng để bảo quản enzym hoặc nâng cao hoạt tính.
Chế phẩm enzym phải có tờ rơi giới thiệu sản phẩm và giấy chứng nhận
phân tích chất lượng sản phẩm. Hoạt tính đặc hiệu được biểu thị bằng số
đơn vị hoạt tính (đơn vị quôc tễ) cho đơn vị khôi lượng hoặc đơn vị thể tích
của sản phẩm enzym. Nhà sản xuất enzym thưòng có cách xác định hoạt
tính riêng mà nó có thể không thích hợp để sử dụng theo dự định, hoặc
đôi khi không rõ ràng cho sản xuất, Cách xác định hoạt tính enzym chính
xác nhất phải được xác định từ người sử dụng và những thông tin đầy đủ
về phương pháp xác định hoạt tính enzym cần phải được người sản xuất
cung cấp để kiểm tra chất lượng enzym. Độ bền bảo quản sản phẩm cũng
liên quan đến người sỏ dụng phải được ghi rõ ràng từ nhà sản xuất, ví dụ:
phải ghi rõ thòi gian mất hoạt tính ở điều kiện bảo quản nào, các thông
tin về tính chất vật lý của sản phẩm enzym như diện mạo bên ngoài, khả
năng hoà tan, hàm lượng nước (độ ẩm), yếu tổ nổi trội (nếu là chế phẩm
rắn) thưòng phải được cung cấp. Tuy nhiên, thông tin về thành phần và
chất bổ sung của sản phẩm enzym không được cung cấp thường xuyên
mặc dù có liên quan đến người sử dụng và thực tế trong hầu hết các điều
chế enzym công nghiệp khôi lư ợ n g sản phẩm lớn được trình bày bằng các
protein khác, như chất ổn định, chất bảo quản, ĨĨ1 U Ố Ỉ và các chất làm
loãng trơ để tiêu chuẩn hoá.
Bất kỳ sản phẩm enzym nào tung ra thị trưàng cũng cần phải ghi
đầy đủ các yêu cầu về chất lượng và tính hợp thức, nhà sản xuâ't phải
đăng ký sản phẩm với cơ quan có trách nhiệm cho phép sử dụng. Các
tiêu chuẩn hiện hành phải được chấp thuận không chỉ sản phẩm mà cả
quá trình sản xuất như sản xuất phải thực hiện theo tiêu chuẩn thực
hành sản xuất tốt (GMP) và hầu hết các công ty sản xuẵt enzym có giấy
chứng nhận ISO tương ứng. Các công ty hàng đầu trong sản xuất enzym
phải có tất cả các quá trình sản xuất được chứng nhận theo tiêu chuẩn
ISO 9001: 2000.
109
3.7. MỘT SỐ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN SẢN XUẤT EN2YM
CÔNG NGHIỆP
Hiện nay, công nghiệp sản xuất enzym trên thế giới thường áp dụng
hai phương pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm.
3.7.1. Phương pháp nuôi cấy bể mặt
Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, vi sinh vật được phát triển
trên bề m ặt môi trường rắn hoặc lỏng. Các môi trường rắn trước khi
nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm. Nguyên liệu thường dùng làm môi
trường là cám gạo, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đưòng,
khoai tây, lõi ngô,... hoặc hỗn hợp các nguyên liệu này.
Nguyên liệu làm môi trường hay dùng là cám, nhất là cám mỳ có
tương dối đầy đủ chất dinh dưỡng và khi làm ẩm sẽ tạo ra môi trường
rấ t thích hợp cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiều enzym. Để đảm bảo
đầy đủ chất dinh dưỡng trong môi trường, người ta bổ sung thêm các
nguồn nitơ, phospho, kali hoặc các chất kích thích sinh trưởng như mầm
mạ, nưốc khoai tây, cao ngô,.., Độ ẩm môi trường nuôi cấy thích hợp
nhất là 58 - 60%, nếu quá ướt môi trưòng sẽ bết lại, dễ bị nhiễm khuẩn,
nếu khô quá dưối 40% nấm khó phát triển, dễ sinh bào tử và sản sinh ít
enzym. Trong quá trình nuôi, môi trưồng dễ bị khô do hơi nưóc dễ thoát
ra, cho nên cần giữ độ ẩm không khí phòng nuôi khoảng 90 - 100%. Sau
khi chuẩn bị xong, môi trưòng được hấp thanh trùng ở 1 đến l,5atm
bằng hơi nóng trong 45 - 60 phút. Môi trường được đưa vào các khay
nuôi với độ dày của môi trường khoảng 2,5 đến 3cm, sau đó cấy giông
vào khay với tỷ lệ giống cấy khoảng 0,2 - 2%. Nhiệt độ phòng nuôi thích
hợp từ 25 - 30°c tuỳ từng loại giống vi sinh vật. Có những loại vi sinh
vật ưa nhiệt thì nhiệt độ nuôi cần phải cao hơn.
Thòi gian nuôi nấm mốc sinh enzym thường kéo dài 36 - 60 giờ.
Nhiều loại Aspergillus tạo enzym cao nhất lúc bắt dầu sinh bào tử, còn
một sô' nấm mổc tích tụ enzym cao nhất vào lúc sinh nhiều bào tử. Quá
trình nuôi cây nâm môc sinh enzym bằng phương pháp lên men bê mặt
trên môi Lrưòng xốp được chia làm 3 thời kỷ:
1) K hoảng 10 - 14 giờ đầu: Bào tử trương nở, bắt đầu nảy mầm.
Thời kỳ này không hình thành enzym, không đòi hỏì nhiều không khí,
cho nên chỉ cần làm thoáng khoảng 2 - 3 thổ tích không khí/thể tích
phòng nuôi/giờ.
2) Thừi kỳ giữ a kéo dài khoảng 14 - 18 giờ: Mốc phát triển
nhanh, hô hấp mạnh. Sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường, lúc đầu
là lúp lông tơ màu tráng —xám, sau đó càng rõ, làm môi trưòng kết bánh
110
lại. Môi trường có thể lật lên, bẻ nhỏ ra để sợi nấm mọc nhanh hơn. Thời
kỷ này chất dinh dưỡng tiêu hao mạnh, hô hấp mạnh và sinh nhiều nhiệt
làm môi trường nóng lên, có thể lên tói 37 - 40°c. Thòi kỳ này phải thông
khí mạnh, tới 60 thể tích khí/thể tích phòng nuôi/giờ, vừa để cung cấp oxy,
thải C02, vừa làm giảm nhiệt độ phòng nuôi. Nhiệt độ phòng nuôi ở giai
doạn này cần giữ ở 28 —29°c và độ ẩm trong phòng khoảng 100%.
3) Thời k ỳ th ứ b a kéo dài từ 10 - 20 giờ: Trao đổi chất yếu dần,
lượng nhiệt tạo ra giảm và tiếp tục sinh enzym. Thông khí không quá
20 - 25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi/giờ và giữ ở nhiệt độ
phòng nuôi ở 30°c. Tuỳ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng giông môc
mà thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại thời điểm mà hàm lượng enzym
tạo thành toi đa. Hiện nay, quá trình sản xuất enzym bằng phương
pháp lên men bề mặt đã được cơ khí hoá ở mức độ sản xuất công nghiệp.
Sơ đồ quá trình công nghệ sản xuất enzym bằng phương pháp bề mặt
trên môi trường xốp (bán rắn) được trình bày trên hình 3.11.

Hình 3.11. Sd đồ công nghệ sản xuất các ch ế phẩm enzym thô trên môi trường xốp
1. Thùng nhận nguyên liệu; 2. Định lượng; 3. Cyclon; 4. Nổi thanh trùng nước; 5. Nồi thanh
trùng nguyên liệu; 6. Thiết bị nhàn giống; 7. Nạp nguyên liệu; 8. Bộ phận tự ổộng phân chia
nguyên liệu’ 9. Thiết bị chuẩn bị dung địch muối khoáng; 10. Thiết bị phối trộn; 11. Nối thanh
trùng mòi trường; 12. Phin lọc không khí sạch; 13. Thiết bị tán nhỏ; 14. Lọc thô; 15. Lọc vi
khuẩn; 16. Calorife; 17. Máy tạo ẩm không khí; 18. Thùng chứa môi trường nhãn giống nấm;
19. Cơ cấu vận chuyển; 20. Thiết bị sấy và nghiền; 21. Lọc; 22. Bơm chân khòng; 23. Thùng
chứa môi trường đã nuôi cấy; 24. Thùng chứa chất bổ sung; 25. Máy nghiền trộn; 26. Thùng
chứa chế phẩm; 27. Mảy đóng gói tự động.

111
 Những năm gần đây, phương pháp nuôi mốc bể m ặt được cải tiến:
Nuôi trong thùng quay, nuôi trong lớp dày môi trưòng có thôi khí, nuôi
trong buồng nuôi được cơ khí hoá có những rãnh thẳng đứng. Tuy
nhiên, phưdng pháp nuôi trên khay vẫn tiện lợi và đơn giản, được áp
dụng phổ biến.
Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô xuống độ ẩm dưói 12%,
nghiền nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hay giấy chống ẩm. Sản
phẩm này có thể dùng trực tiếp để làm tương, làm nước chấm, đường
hoá trong công nghiệp rượu bia hoặc làm nguyên liệu để tách chiết
enzym tinh khiết.
3.7.2. Phương pháp nuôi cấy chìm
Nuôi cấy vi sinh vật sinh enzym theo phương pháp nuôi cấy chìm ỏ
quy mô cồng nghiệp được thực hiện trong các nồi lên men có khuấy và
thổi khí liên tục tương tự như quá trình lên men sản xuất amino axit
hay các chất kháng sinh. Không thể có môi trường nuôi cấy chung cho
tất cả các chủng vi sinh vật, vì vậy phải lựa chọn môi trường, tỷ lệ cáo
chất dinh dưõng cho thích hợp với từng chủng, đặc biệt phải chú ý đến
các chất cảm ứng cần thiết để cho vi sinh vật sản sinh ra enzym d mức
độ tối đa.
Về nguyên lý, quy trình sản xuất enzym bằng phương pháp lên men
chìm giống như quá trình sản xuâ't các chế phẩm sinh học khác. Quá
trình lên men trải qua các khâu: Chuẩn bị môi trường, hoạt hoá giống,
nhân giông trên máy lắc, nhân giống trong nổi lên men và lên men trên
nồi lên men cấp độ lớn. Lượng nhân giống thường là 5 - 10% so với thể
tích môi trường nuôi, thòi gian lên men kéo dài từ 2 - 4 ngày tuỳ từng
loại vi sinh vật. Đa số eác loại enzym thuỷ phân do nấm mổc và xạ
khuẩn tạo thành được tách vào môi trường, phần còn lại trong hệ sỢi
nấm sau 3 ngày nuôi cấy khoảng 10 - 15%. Sơ đồ quá trình công nghệ
nuôi cây vi sinh vật theo phương pháp lên men chìm trong sản xuất
enzym được trình bày trên hình 3.12 và 3,13.
Về nguyên tắc, quá trình sản xuất enzym bằng phương pháp nuôi
cây chìm nâm môc được trình bày â trên được áp dụng cho các quy trình
sản xuất enzym từ các vi sinh vật khác như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm
men,... Tuy nhiên, tuỳ từng loại vi sinh vật, từng chủng sản xuất mà
thời gian lên men, điều kiện nuôi cấy khác nhau, nhất là các chủng tái
tô hợp thì quy trình có thay đổi, phù hợp vối từng loại vi sinh vật, từng
chủng giống sản xuất cụ thể.

112
 Mình 3.12. Sơ dồ sả n xuất các ch ế phẩm onzym trong môi trưòng dinh dưỡng lỏng
bằng phương pháp lên men chìm
1. Thùng trộn môi trường dinh dưỡng; 2. Nổi thanh trùng; 3. Thùng chứa; 4. Vanxả; 5. Thiết bị
trao đổi nhiệt; 6. Bơm ly tâm; 7. Thùng dịch lèn men; 8. Thùng lên men; 9.Máy nén khí;
10. Phin lọc khí chung; 11. Phin lọc khí riẽng; 12. Thùng chứa dịch lên men (chế phẩm
enzym thô dạng lỏng).

Thùng ^
giỏng
Ly tâm
"i I
Õ Kỗt tủa
i_L
Nối
lẻn men
O iO
Máy trao
co 3
1
t

o
I firriTn ■" lạnh 1
I
Tách chất
I ị
1

Thùng đựng (4°C)

Hình 3.13. Sơ đồ sản xuất enzym ngoại bào

3.8. TỔNG QUÁT CHUNG CÁC CÔNG ĐOẠN THU NHẬN ENZYM
Enzym cố thể điều chế từ nhiều nguồn, nhưng nhận được nhiều
nhất nhờ lên men vi sinh vật. Hơn nữa, nhò kỹ th u ật đi truyền người ta
113
đã tạo chủng tái tổ hợp siêu tổng hợp enzym, đáp ứng yêu cầu sản xuất
công nghiệp hiện nay.
Việc sử dụng enzym công nghiệp phụ thuộc vào hiệu lực, giá thành
v à sự an toàn của chúng. Enzym được tách bằng phương pháp phá vỡ tê
b à o thường tỷ lệ thuận vói lượng enzym đã có và phương pháp ly tâm
thông thường được sử dụng để thu nhận enzym dạng rắn, ngược lại
phương pháp lọc thích hợp để thu hồi enzym dạng lỏng, nhưng hệ thống
hai pha lỏng thường thích hợp trong quá trình thu hồi enzym hơn.
Sơ đồ tổng quát thu nhận enzym được trình bày trên hình 2.14.

Nguồn eraym Lọc Cô dặc Kẽt tủa Làm khô

Axeton. aicol,
Mô động vặt Ị ĩ r ọ lọc (NH,) j S 0 4
Mô thực vật
«1 Lọc ép
*----- 1 Dịch rì

Vi sinh vật Cỏ đặc

chân không
Nuôi cấy chim
Nước
Nuôi cấy bề mặl
Chiết Làm lạnh

Trống quay

Thẩm
Thành phần tro I Trợ thấu
Ị lọc ngược
Trộn
Muối và
Chất bảo chấl trơ
Làm khô I
Thiết bị lọc chất quản N ị ...........
không cao tốc
Sản phẩm
khô thô
Sản phẩm Sản phẩm II Sàn phẩm II sản phẩm khô
lỏng loãng lỏng cở đặc đặc biệt II chất lượng cao

Hình 3.14. Sđ đồ tổng quát thu nhận enzym từ các nguổn khác nhau

Chế phẩm enzym công nghiệp bao gồm số lượng tôì thiểu các giai
đoạn tinh sạch tương thích với việc sỏ dụng chúng. Nếu tinh sạch kéo dài
thì quá trình rấ t đắt và phải lựa chất mang phù hợp để ngân ngừa sự bất
hoạt của enzym. Trong thực tế, ngoài những enzym phục vụ công tác
chữa bệnh, trong sản xuất hoá tinh vi, tạo biosensor (cảm biến sinh học),
sản xuất mỹ phẩm,... người ta vẫn thưòng dùng enzym không cần độ tinh
sạch cao, gọi là enzym kỹ thuật. Tuy vậy, enzym được phép bán ra thị
trường cần thiêt phải ổn định và an toàn khi vận chuyển và sử dụng.

114
 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG 3

1. Enzym có thể điều chế từ nhiều nguồn, nhưng nhận được nhiều
nhất nhờ lên men vi sinh vật, vì sao?
2. Hãy nêu sự cần thiêt phải tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả
năng sinh enzym cao từ tự nhiên.
3. Hãy nói rõ sự cần thiết phải sàng tuyển các loại enzym mới từ vi
sinh vật trong tự nhiên.
4. Hãy trình bày nguyên tắc chung và sự cần thiết thiết kế quy trình
công nghệ lên men sản xuất enzym công nghiệp.
5. Hãy nêu các hệ thống nuôi cấy vi sinh vật và tiêu chuẩn giống đưa
vào lên men sản xuất enzym từ vi sình vật.
6. Động học của quá trình lên men sản xuất enzym thường phụ thuộc
vào các thông sô”nào?
7. Hãy nêu các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến
khả náng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật.
8. Hãy nêu các bước tách chiết enzym ngoại bào và nội bào từ vi sinh vật.
9. Giải thích vấn đề: Đổ chiết rút enzym khỏi môi trường rắn, người ta
sử dụng nước, các dung môi trung tính, các dung môi có cực hay
dung dịch muối khoáng cho kết quả tốt nhất và dễ được dùng rộng
rãi trong sản xuất.
10. Hãy nêu nguyên tắc và các phương pháp tinh sạch enzym từ vi sinh vật.
11. Vì sao lại cần lập công thức và hoàn thiện chế phẩm enzym?
12. Các ion kim loại, các phân tử hữu cơ được gọi lả coenzym có ảnh
hưởng lớn đến hoạt tính của enzym, vì sao?
13. Hãy nêu các điều kiện kỹ thuật cần thiết cho quá trình lên men sản
xuất enzym bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt.
14. Hãy nêu các điều kiện kỹ thuật cồn thiết cho quá trình lên men sản
xuất enzym bằng phương pháp nuôi cấy chìm.
15. Hãy nêu tổng quát các công đoạn thu nhận enzym.

115
 C h ư ơn g 4

CÓ ĐỊNH ENZYM VÀ ÚNG DỤNG ENZYM CÔ ĐỊNH

4.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỂ c ố ĐỊNH ENZYM

4.1.1. Enzym cô' định
Enzym cố định là enzym có sự chuyển động trong một không gian bị
giới hạn, nô cho phép tái sử dụng hoặc sử dụng tiếp tránh gây bẩn cho
sản phẩm. Quá trình cổ định (immobilisation) enzym được hoàn tất bằng
cách cố’định enzym lên bề mặt, hoặc bên trong một số vật liệu khác.
Thuật ngữ “cố định” ở đây không có nghĩa là enzym không có khả
nãng di chuyển tự do bên trong pha riêng biệt của nó. Nhiều vật liệu
không hoà tan, cũng oó thể hiểu đó là cơ chất (không lẫn với các chất
phản ứng enzym), có thể sử dụng để cố định enzym bằng cách lầm cho
chúng không bị hoà tan. Đó là các chất tạo hạt polyme hoặc vô cơ trơ.
Trong một số trường hợp, không nhất thiết phải gắn chặt enzym vào
polyme, mà có thể giữ nó ỏ bên trong polyme, lúc này polyme tạo thành
thể lưói bao xung quanh enzym. Thể lưới đó có mắt nhỏ tới mức không
cho phép phân tử enzym chui ra khỏi mạng, nhưng đồng thòi nó lại đủ lốn
để cơ chất và sản phẩm tạo ra có khỗì lượng phân tử thấp qua lại dễ dàng
Việc nghiên cứu enzym không tan (enzym cố định) bắt đầu phát
triển từ 1950. Để thu nhận được enzym cô" định có thể dùng các phương
pháp khác nhau như phương pháp hấp phụ, liên kết hoá trị để gắn các
enzym vào các chất không tan trong nước. Các chất đùng để gắn enzym
gọi là chất mang, các chất mang thưòng dùng là xenluloza, tinh bột,
sephadex, agaroza, alginate canxi,... và các dẫn xuất của chúng, hoặc có
thể là gel polyacrylamit, bột thuỷ tinh, nilon,... chế phẩm có thể là dạng
bột, dạng phiến và dạng màng. Trong những năm gần đây, enzym cố
định được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Đến 1995, người ta đã
thu được hơn 100 các chế phẩm enzym cố định.
Trong thực tế sản xuất công nghiệp bằng enzym, người ta thực hiện
quá trình chuyển hoá không chỉ bằng enzym tách chiết tinh khiết, mà còn
sử dụng enzỵm thô (còn gọi là enzym kỹ thuật), thậm chí còn sử dụng vi
sinh vật sản sinh enzym ngoại bào làm chất xúc tác sinh học để thực hiện
quá trình chuyển hoá trong sản xuất. Chính vì vậy, trong sản xuất, người
ta không chỉ cố định enzym, mà còn cố định tế bào vi sinh vật để thực

116
hiện các quá trình chuyển hoá sinh học. Do vậy, khái niệm enzym còn
dược hiểu là chất xúc tác sinh học và không giói hạn ở enzym cô" định, mà
bao gồm cả tế bào cô định thực hiện các quá trình chuyển hoá sinh học.
Trong công nghiệp, người ta đã sủ dụng nhiều chế phẩm enzym cố
định trong các quá trình sản xuất. Một số quá trình sản xuất công
nghiệp với các enzym cố định tiêu biểu được trình bày trên bảng 4.1.
Bảng 4.1. Một số enzym công nghiệp quan trọng
đã được sử dụng trong dạng cố định
Enzym Nguồn vi sinh vật Sản phâVn/vai trò
Aminoaxylaza Aspergillus oryzae Axit L - amin
Amy1og 1ucoz id aza Aspergillus niger Sản xuất glucoza từ tinh bột
Rhizopus niveus
Glucoza izomeraza Actinomyces missouriensis, Nước ngô giàu fructoza
Bacillus coagulans
Hyrfamoinaza Flavobacterium Axit D - và L- amin
ammoniagenes
Irwertaza Saccharomyces cerevisiae, Khử đường (glucoza + fructoza)
Aspergillus niger
Lactaza Aspergillus oryzae Sữa và huyết thanh sữa không
Kluyveromyces fragili có lactoza
Lipaza Rhizopus arrhizus Chất thay thế bơ cho cacao
Naringinaza Penicillium decumbens Khử đắng nước quả chanh
Nitril hydrataza Rhodococcus rhodochrous Acrylamit
Penixilin acylaza Escherichia coli cẩ t chuỗi bên của penixilin
Bacillus subtilis
Melibiaza (raffirtaza) Aspergillus niger Loại bỏ raffinoza khỏi dịch
chiết củ cải đường
u-galactozidaza Saccharomyces cerevisiae
Thermolysin Bacillus thermoproteolyticus Aspartam (L- aspartyl - L -
phenyl - alanin methyl este) “
bột ngọt calo thấp

Sử dụng enzym cô' định trong công nghiệp đem lại những lợi ích sau:
(1) Tái sử dụng được nhiều ỉần, (2) Thích hợp cho quá trình sản xuất
liên tục, (3) Sản phẩm (cũng là sản phẩm của phản ứng enzym) đã loại
bỏ enzym, không cần thiết phải loại bỏ hay bất hoạt enzym, (4) cải
thiộn được độ bền của enzym và (5) Giảm dược chất thải đầu ra.
Người ta hy vọng trong những năm tới, enzym cố định có thể được
sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, thay thê cho các quá trình lên men
để sản xuất rượu, axit hữu cơ, amino axit,...

117
4.1.2. Kỹ thuật cố định enzym
Có 4 hướng cố định enzym được nghiên cứu sau đây:
a) Tao vi n a n g (m ỉcroencapsulation) (Chang và ctv, 1967—1968)
Các vỏ bán thấm xenluloza có kích thước 10 —12|im đường kính và
200Ả (bề dày) có thể được hình thành. Các h ạt nhỏ này được tạo từ các
màng hay nguyên liệu polyme khác. Các màng này có vai trò thẩm thấu
cho các cơ chất và sản phẩm của quá trình phản ứng enzym, nhưng các
phân tỏ enzym không thể đi ra ngoài do phân tỏ quá lớn. Quá trình
hoạt động của enzym diễn ra trong hạt bao màng bán thấm, vì vậy
phương pháp này cố giới hạn là các cơ chất có phân tủ lượng lớn như
protein, polysaccarit không thể cho phép đi vào trong capsul và lúc đó
enzym không thể thực hiện quá trình thuỷ phân.
b) L ỉê n k ế t enzym vói c h ấ t m a n g k h ô n g hoà ta n (Silman và
Katchalski, 1966)
Enzym được gắn vào xenluloza không hoà tan bằng các phương
pháp khác nhau như: cacboxylmetyl xenluloza không hoà tan, xenluloza
không hoà tan hoặc các h ạt thuỷ tinh silica xốp.
Enzym được gắn vào chất mang tại một sô' vị trí xa vổi trung tâm
hoạt động của enzym. Enzytn được cố định và hoạt động nhưng có thể bị
giảm tốc độ phản ứng, bởi vì đặc tính của các enzym liên kết không còn
giống các enzym đó ở trạng thái tự do. Các trung tâm anion và cation tự
nhiên của chất mang sẽ làm thay đổi pH của phản ứng khi enzym bị gắn
lên chất mang sẽ tạo lên một lực của quá trình phản ứng. Điều đó xuất
hiện nếu cơ chất là những phân tử lân như protein, sản phẩm thuỷ phân
protein có thể khác các sản phẩm thuỷ phân từ liên kết enzym có kích
thước lốn hòn các sản phẩm thuỷ phân tử enzym hoà tan. Giá trị hằng
số Kmvà Vmcó thể bị thay đổi.
c) Cô' định enzym trong p h a nước của hê thống 2 p h a (Reese
và Mandels, 1958)
Một enzym được hoà tan trong một pha nước và được giữ lại trên cột
của chất rắn chịu nước như xenluloza. Cơ chất trong pha dung môi
khuếch tán vào trong pha nước đó xảy ra phản ứng với enzym. Các sản
phẩm khuêch tán ngược lại pha di động và đi ra ngoài cột. Sử dụng
invectaza hệ thống giữ được hoàn toàn trong vài tuần lễ. Hệ thông này
giông với phương pháp microencapsule, mà pha dung môi có vai trò như
một màng bán thấm.

118
 d) S ự cầm g iữ enzym bằng m à n g siêu lọc
Theo các phương pháp trưốc, enzym dược cố định trong các giọt, các
nang (capsules) nhỏ hay chất mang không hoạt dộng. Nguyên lý của
phương pháp là enzym tự do trong dung dịch, màng lọc có vai trò tách
sản phẩm từ enzym và cơ chất. Cơ chất tiếp tục được đưa vào hệ thống,
còn sản phẩm được lấy ra qua màng lọc. Phương pháp này cho phép áp
dụng trong trường hợp cơ châ”t lớn, hoặc cơ chất không tan. Trong quá
trình đó, enzym và cơ chất được giữ lại cùng một bên của màng lọc. Kết
quả của phương pháp này còn phụ thuộc vào khả năng phù hdp của
màng lọc và giá cả của nó.
Một sô" kiểu cố định enzym trên chất mang được trình bày trên hình
4.1, được chú giải theo các kỹ thuật như sau:
1) H ấp p h ụ (adsorption), hình 4.1(1): Đây là phương pháp cổ điển
nhất được nghiên cứu bởi Nelson, 1965. Enzym invectaza được cố định
trên chất mang là than hoạt tính. Từ đó có nhiều nghiên cứu để cổ' định
enzym theo phương pháp hấp phụ này. Các chất mang có thể là: Polyme
hữu cơ; thuỷ tinh, muôi khoáng; oxyt kim loại và các vật liệu khác như:
Wollastimit, colloidasilicagen,...
2) L iên k ế t th ể vù i polym e hay bẩy enzym (Entrapment - hình
4.1(2): Enzym được cầm giữ trong gel polyme sinh tổng hợp hoặc tự
nhiên, có thể sử dụng polycrylamit.
3) Tạo vi n ang (microencapsulaton), hình 4.1(3): Enzym được cô”định
trong nang trong (capsule) một màng của các polyme khác nhau. Các
nang có thể được tạo thành vói kích cỡ từ lum đến vài um. Quá trình
phản ứng giữa cơ chất và enzym xảy ra trong nang, enzym cố' định còn
cd chất đi vào nang, màng bán thấm chỉ cho phép các cd chất nhỏ đi qua,
đồng thời sản phẩm sẽ đi từ trong ra ngoài nang.
4) T rao dổi ion (ion - exchange), hình 4.1(4): Enzym được gán với
chất mang bằng liên kết ion. Đây là phương pháp đơn giản nhưng có
hiệu quả thưòng được ứng dụng trong thương mại.
5) L iên k ế t chéo (cross - linking), hình 4.1(5): Enzym được polyme
hoá bằng các liên kết ngang cùng với các tác nhân liên kết như: Bezidin
dithiocyanat, bifuntional alkylating và glutaraldehyt.
6) H ấp p h ụ và liên k ế t chéo, hình 4.1(6): Enzym được hấp thụ
trên chất mang, sau đó nhờ tác nhân gắn tạo liên kết chéo.
7) Đ ồng polym e hoá (copolym erization), các hình 4.1(7) và 4.1(8):
Enzym nối giữa các polyme nhò các tác nhân như mateic anhydrit và
ethylendiamin,
119
 Hấp phụ
Enzym
o

Chất mang (1)

Trao đổi ion (2)
Vi nang

O" o O ' ơ — Enzym

r y ?
(3) Chất mang (4)
Liên kết chéo Hấp phụ và liên kết chéo

Enzym

(6)

Enzym
Enzym

(7) (8)
Hình 4.1. Sơ đồ giới thiệu các phưdng pháp thưòng g ặp
đổ c ố định enzym trên chất m ang

Như vậy, các kỹ thuật chủ yếu để cô" định enzym: Hấp phụ, tạo liên
kết dồng hoá trị, bao gói enzym bằng cách bẫy và gói enzym bằng màng
thẩm thấu. Trong triển khai công nghệ cố định enzym bằng các kỹ thuật
trên, cần quan tâm một cách toàn diện đến đặc điểm của phương pháp,
về cơ sở ]ý thuyết cũng như khả năng ứng dụng và vận hành sản xuất,
dể lựa chọn phương pháp tối ưu cho từng enzym (bảng 4.2).
Bảng 4.2. So sánh khái quát các kỹ thuật cố định enzym khác nhau

Liên kết cộng Bao gói

Đặc tính Hấp phụ Bay
hoá tri m àng
Điều chế Đơn giản Khó khăn Khó khàn Đơn giản
Giá thành Thấp Cao Trung bình Cao
Lưc liên kết Hay thay đổi Manh Yếu Manh
Rò rỉ enzym Có Không Có Không
Khả nâng ứng đụng Rộng Chon loc Rộng Rất rộng
Vấn để ván hành Cao Thấp Cao Cao
Ảnh hưởng chất nền Có Có Có Không
Cản trở khuếch tán Không Không Có Có
Bảo vệ vi sinh vật Không Không Có Có

120
 Tuy nhiên, không phải bất cứ enzym nào cũng nên sử dụng ở dạng
cô định. Trên thực tế, công nghệ cô" định enzym chỉ được chọn lựa và ứng
dụng cho những enzym mà sản phẩm cô" định mang lại hiệu quả cao hơn
so với enzym tự do. Hiện nay, phát triển công nghệ sử dụng các enzym
cô dịnh đắl tiền, có giá trị sử dụng cao, xúc tác trên cơ chất có khôi lượng
phân tử nhỏ, dễ kiểm soát sự lây nhiễm và sản phẩm không chứa enzym
đang là xu hướng được tập trung nghiên cứu và triển khai.

4.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP c ố ĐỊNH ENZYM

Các phương pháp cô' định enzym có thổ dựa vào cốc kỹ thuật được
thực hiện: liên kết chất mang, liên kết chéo và bẫy enzym. Việc lựa chọn
phương pháp cố định phải dựa vào loại enzym, phản ứng enzym và thiết
bị phản ứng enzym; các tính chất của chất mang thích hợp đáp ứng các
yêu cầu sau: phải có các nhóm chức thích hợp để cô' định, bẽn cơ học, các
tính chất vật lý, hoá học và sinh học ổn định và không độc.
Trong cô" dịnh enzym, người ta sử dụng các phương pháp đe cố định
enzym (hình 4.2), trong giáo trình này, chúng tôi chỉ giới thiệu các
phương pháp dựa trên các kỹ thuật chính như sau:
Các phương pháp cố định emym
— I

Cho enzym Cho enzym

không hoá tan hoà tan

1 I
Q*y Màng siẽu lọc
Liên kết
(chất xúc tác biến tính) (chất xúc tác sính học tự do) ị

Hình 4.2. Các phương pháp c ố định enzym

4.2.1. Hãp phụ enzym lên chất mang

Phương pháp hấp phụ liên quan đến bể mặt tương tác thuận nghịch
giữa enzym/tế bào và vật liệu cố định. Các lực tương tác tham gia vào
121
quá trình hấp phụ chủ yếu là lực tĩnh điện như liên kêt van der Waals,
ỉicn kết ion và liên kết hydro. Các lực liên kết này rất yếu, nhưng với số
lượng lớn đủ để gắn kết chất mang và enzym. Ví dụ: các tế bào nấm men
có bể m ặt hoá học tích điện âm có thể sử dụng các vật liệu có bề m ặt tích
diện dương để cố định. Phương pháp hấp phụ được tiến hành bằng cách
trộn enzym hoặc tế bào vi sinh vặt với vật liộu cố định trong điều kiện
pH, lực ion thích hợp. Sau thòi gian ủ, thu vật liệu đã cố định enzym/tế
bào bằng cách rửa để loại bỏ các enzym hoặc tế bào không được gắn kết.
Ưu điểm của phương pháp này là: (1) ít hoặc không gây hại đến
enzym hoặc tế bào, có thể duy trì hoạt tính cao bỏi không gây biến đổi
hoá học phân tử enzym, (2) Đơn giản, rẻ và nhanh, cho phép cố định
enzym trong các điểu kiện ôn hoà, (3) Không làm biến đổi tính chất hoá
học của vật liệu và enzym hoặc tế bào và (4) Không chỉ cho phép tinh
sạch protein dễ dàng mà còn cho phép tái sử dụng các châ't mang.
Tuy nhiên có các nhược điểm sau: (1) Có thể gây rò rỉ enzym/tế bào
từ chất mang hoặc nhiễm vào sản phẩm, (2) Gắn kết không đặc hiệu, (3)
Gắn quá nhiều enzym trên chất mang và (4) Gây trỏ lực không gian bởi
chất mang.

E pệ
.'

Hình 4.3. Hấp phụ enzym lên chất mang

Theo Linqiu Cao, 2005, có thể phân loại phương pháp cố định enzym
bằng hấp phụ thành các loại sau:
- Hấp phụ vật ìý không đặc hiệu: Enzym hấp phụ bằng liên kết không
đặc hiệu như: lực van der Waals, liên kết hydro và tương tác ưa nước.
- Hấp phụ sinh học đặc hiệu: Thường sử dụng các phối tử cố định để
hấp phụ các enzym.
- Hấp phụ ái lực đôi với kim loại đã được cố' định trên chất mang (sử
dụng cho các enzym tái tổ hợp có gắn đuôi His - tag).
- Tương tác tĩnh điện (liên kết ion): Dựa trên tương tác giữa các
điện Lích ngược dấu giữa vật liệu và enzym.
- Tương tác kỵ nưốc: Dựa trên cơ sỏ tương tốc của các vùng kỵ nước
của enzym và chất mang.
Về cơ bản, bất cứ một chất mang nào (chất tổng hợp hoặc có nguồn
gốc tự nhiên, chất hữu cơ không hoà tan hoặc vô cơ) đều có thể sử dụng
122
cho hấp phụ các enzym bằng gắn kết không đặc hiệu (hấp phụ vật lý).
Tuy nhiên, các giá thể thường được sử dụng để cô' định enzym bằng hấp
phụ là: cacbohydrat như xenluloza, CM - xenluloza, DEAE - xenluloza;
các vật liệu không tích điện như các polyme, thuỷ tinh, sứ, oxyt kim loại;
nhựa trao đổi ion như amberlit, DEAE - sephadex và các polyme tổng
hợp như polyamit, polyacrylamit, polystyrol, nilon, polyvinyl.
Một số yếu tố ảnh hưởng đến ìượng enzym cố định được và độ bển
của liên kết cô" định như lượng enzym cô" định lên chất mang thường tỷ
lệ thuận với nồng độ của nó trong một giối hạn nhất định; pH thay đổi
đột ngột có thế làm giải hấp phụ enzym; sự có mặt của các ion muối tích
điện trái dấu vối chất mang có thể kéo tầeo sự kết tủa cục bộ của protein
trong dung dịch; nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm
tăng liên kết protein vói chất mang, nhưng cần hạn chế nhiệt độ cao để
tránh làm bất hoạt enzym và enzym có khối lượng phân tử càng nhỏ thì
khả nãng hấp phụ càng lớn, nhâ't là chất mang chứa nhiều nhóm háo
nước hấp phụ tốt và bền hơn.
4.2.2. CỐ định enzym bằng liên kết chéo
Các phân tử enzym có thể tập hợp lại với nhau bằng các liên kết chéo,
liên phân tử hoặc kết tủa dạng lớn bằng cách bổ sung các protein như
gelatin, bovine serum albumin (BSA) và một số chất như glutaraldehyt,
hoặc bằng phương pháp hoá học hoặc vật lý khác. Kết quả là tạo ra một
tập hợp enzym không tan có thể sử dụng trong một bình phản ứng liên
tục. Tuy nhiên, các tác nhân hoá học sử dụng thường gây độc nên được
áp dụng hạn chế với tế bào sống và với nhiểu enzym. Hơn nữa, do không
bền cơ học và không có độ ổn định cao, phương pháp liên kết chéo
thường ít được đùng để cô' định enzym, mà chỉ sử dụng để cải thiện các
phương pháp cô" định khác.
Ưu điểm của phương pháp này là: (1) Đơn giản và có thể thực hiện
nhanh chóng với giá thành thấp và thòi giun thương mại hoá ngắn; (2)
Có thể ốp dụng cho rất nhiều enzym, bao gồm các enzym thô và có thể cố
định dồng thời nhiều enzym trong cùng một hệ thông; (3) Dễ dàng phân
tách sau quá trình và có thể được thu hồi hoàn toàn nhờ các kỹ thuật
lọc, ìy tâm trong thời gian ngắn và (4) Có thể kết hợp tinh sạch và cố
định enzym trong cùng một bước. Tuy vậy, có nhược điểm: (1) Một số’tác
nhân sử dụng trong quá trình liên kết chéo gây độc cho enzym và tế bào,
ví dạ: glutaraldehyt tuy có giá rẻ và đa năng, song lại gây bất hoạt một
vài enzym; (2) Enzym cố’định bị hạn chế bởi quá trình chuyển khối; (3)
123
Giữ được hoạt tính thấp; (4) Tái sử dụng kém và (5) ố n định cơ học thấp
và khó điều khiển dạng kết tủa của các enzym đã liên kết chéo.
Trong phương pháp này, bổ sung các muối, dung môi hữu cơ, hoặc
các polyme phi ion vào các dung dịch của protein dẫn đến protein bị kết
tủa thành từng chùm (đám) nhỏ nhưng không gây ảnh hưởng tối cấu
trúc không gian của chúng, không gây biến tính protein. Chẳng hạn, bổ
sung muối và một số dung môi hữu cơ đổ tủa protein, các kết tủa rắn
này được tạo ra bởi các lực liên kết không có bản chất cộng hoá trị giữa
các phân tử, do đó dễ dàng bị phá vỡ và tái hoà tan lại khi được phân
tán vào môi trường nước.
Đường kính tạo thành đám của protein kết tụ phụ thuộc vào sức
căng bể mặt của nó và do đó phụ thuộc vào bồ mặt kỵ nước của protein.
Có thể quan sát dược dưới kính hiển vi điện tử các khối kết tụ tương đôì
giống nhau. Ví dụ: kích thưốc của khôi kết tụ tạo thành của lipaza từ
Candida antarctica (lipaza B, hình 4.4) có đường kính khoảng l|am với
độ sai lệch nhỏ, kích thước enzym là 5 X 5 X 5nm, phần enzym liên kết
chéo đơn chứa nhiều nhất 8 X 1 0 fi phân tử enzym. Các enzym liên kết
chéo có thế tạo dạng chùm lớn, do đó làm hạn chế sự chuyển khối (mass
- transport), đặc biệt trong kiểm tra nhanh u v . Kích thưốc chùm có thể
lên tới lOOịim và chúng ta có thể quan sát được bằng mắt thưồng.

Hinh 4.4. Hình dạng enzym c. antarctica lipaza cố định

(A) c. antarctica lipaza A/B CLEA, một hạt CLEA có thể chứa đến 8 triệu phàn tử enzym
(x3500); (B) Đám CLEA của c. antarctica lipaza A/B trong nước (x150).
Phương pháp tạo liên kết chéo bị ảnh hưỏng bởi các yếu tố liên quan
đến quá trình oxy hoá khử (coíầctoi' —dependent oxydoreductaza); một
số yếu tố tác dộng trực tiếp đến tính chất enzym (nhiệt độ, pH, nồng độ,
lốc dộ khuấy, chất kết tủa và tác nhân tạo liên kết chéo) và phụ thuộc
vào đặc tính của từng loại enzym. Kết quả khảo sát hoạt tính của dạng
cô' định bằng liên kết chéo của một sô' enzym như penixilin G acylaza,
124
lipaza, esteraza, trypxin, oxynitrilaza, nitrilaza, galactozidaza, alcohol
dehydrogenaza, format dehydrogenaza, glucoza oxydaza, galactoza oxydaza,
catalaza, lactaza, phytaza và pyruvat decacboxylaza cho thấy hoạt tính
của các enzym ở dạng cố dinh lốn hơn nhiều so vối các enzym tự nhiên.
4.2.3. Cô đ ịn h enzym bằng phương pháp bẫy

Bay enzym là quá trình mà trong đó các enzym được cố’ định trong
không gian ma trận được tạo thành bằng các phương pháp hoá học, hoặc
vật lý như tạo liên kết chéo hoặc sự đông tụ (hình 4.5). Điều này thường
được thực hiện bằng cách trộn lẫn enzym với một monome và một tác
nhân tạo liên kết chéo nhằm polyme hoá monome xung quanh phân tử
enzym. Nói chung, ma trận bẫy thường được tạo ra trong suốt quá trình
cô' định, vì vậy, tiền chất của ma trận gel và các điều kiện sử dụng tạo
cấu trúc cần thích hợp với các phân tử enzym.

Enzym

Dung dịch gel

Hình 4.5. Bầy enzym tạo chất xúc tác sinh học

Tuỳ thuộc vào các phương pháp sử dụng, các tiền chất sử dụng tạo
ma trận gel cũng khác nhau. Trong nhiều trường hợp bẫy bằng trùng
hợp polyme, bằng các monome chưa no và các monome phối hợp được sử
dụng như một chất tạo liên kết chéo và sự polyme hoá có thể khởi đầu
bằng chiêu bức xạ hoặc chiếu quang điện, hoặc được bắt đầu bằng
phương pháp hoá học. Trong dông tụ vật lý, enzym và polyme hoà tan
thường được tạo gel ầưổi điều kiện nhiệt độ thấp bằng việc sử dụng các
hạt polyvinylalcohol (PVA) làm tác nhân lạnh sâu, muôi (alginat - Ca2+)
hoặc bởi sự dịch pha trong dung môi.
Ngoài kỹ thuật bẫy enzym, người ta cũng có thể sử dụng một số ma
trận làm sẵn như sepharoza hoặc hạt sephadex để bẫy enzym. Ma trận
này có thể được chuẩn bị ở dạng hạt, màng, bản, đĩa và dạng sợi, các
chất này thường được sử dụng trong pha tĩnh của sắc ký, trong dó
cnzym sau khi được hút- vào bên trong của các hạt và sẽ tạo liên kêt chéo
hoá học vối glutaraldehyt.

125
 Một số yếu tố cần chú ý trong phương pháp bẫy như: kích thước lỗ,
kích thước hạt, bản chất của lỗ (mỏ hoặc đóng), hình thái học, hình dạng vằ
độ bền cơ học, tính ưa nước, khả năng giữ nước của chất mang sử dụng,
Phương pháp này có ưu điểm: (1) Có thể sử dụng để cô" định nhiều
enzym cùng một lúc; (2) Đơn giản và dễ làm, các enzym được bẫy trong
diều kiện ôn hoà và (3) Enzym cố định thường bền hơn, nhưng cũng có
các nhược điểm: ( 1 ) Hạn chế khuếch tán của enzym trong quá trình
phản ứng và (2) Enzym có thể rò rỉ dần dần từ ma trận gel vào môi
trường phản ứng.
Trong một vài thập kỷ gần đây, để giải quyết nhược điểm của các
phương pháp bẫy trước đây, người ta phát triển nhiều công nghệ bẫy
khác nhau như: sủ dụng bẫy cộng hoá trị, bẫy hai lần, bẫy sau khi cố
định enzym bằng phương pháp khác, bẫy và tạo liên kết chéo, bẫy phủ,
bẫy kết hợp với hấp phụ,... Hiện nay, kỹ thuật bẫy sử dụng để cố định có
xu hưống phát triển mạnh, không chi để cố định tế bào mà còn để phân
tách các enzym. Có các phương pháp bẫy như sau:
a) B ay bằng polym e hoá các m onom e
Phương pháp này dựa trên cơ sồ polyme hoá dung dịch chứa enzym,
các monome và co - monome. Các monome thường được sử dụng là acrylamìt,
axit acrylic với glyxidylacrylat, 2 - hydroxyethylmethylacrylat, N - vinylpyrolidon,
2 - hydroxylpropylamit, 2 - hydroxypropylacrylat, poly (ethylen glycol)
methylacrylat, butanediolacrylat và ethyleneglycoldiacrylat. Việc bổ
sung các chất hoạt động bề mặt hoặc polyme trơ như PEG (polyethylen
glycol) và PVA (polyvinylalcohol) có thể cải thiện hoạt tính do hạn chế
làm bất hoạt enzym hoặc cải thiện độ xốp của ma trận, vì vậy làm tăng
khả năng khuếch tán hoặc mở rộng các lỗ.
b) B ầy v ậ t lý
Phương pháp này dựa trên cơ sở bẫy enzym hoặc toàn bộ tế bào
trong các gel tạo thành bởi sự đông tụ vật lý của các polyme tự nhiên
(alginat, gelatin), các polyme tổng hợp và các gel hỗn hợp bán tổng hợp
bằng cách thay đổi pH, nhiệt độ và một số điều kiện khác. Các polyme
thường sử dụng trong phương pháp này là các polypeptit (albumin,
gelatin, collagen, cazein), polysaccarit (chitosan, agar hay agaroza, tinh
bột, K - carrageenan, xenluloza, pectin, galactomanan, xanthan) và các
dẫn xuất của chúng như ethylxenluloza, propyl alginat, các polyme tổng
hợp PVA, PEI, PAA và các chất đa điện phân tổng hđp khác.

126
 Hinh 4.6. Đòng tụ vật lý của polyme với enzym bẫy trên chất m ang

Trong quá trình bẫy vật lý, enzym và chất mang có thể tạo thành
các tương tác như: cầu hydro, các cầu muối và tương tác kỵ nước.
Các hợp chất có thể được tạo thành bởi các tương tác polyme -
polyme, poiyme - muối hoặc polyme - oxyt kìm loại vô cơ. Nói chung,
dưới ảnh hưỏng của pH, nhiệt độ, các muôi hoặc các dung môi, các
polyme hoà tan đó có thể bị đông kết để tạo thành một chất mang không
tan. Phương pháp này thống thường sử dụng hệ alginat - canxi clorit.
Dung dịch chứa enzym và alginat bị đông cứng khi được nhỏ giọt vào
dung dịch CaCL, làm cho enzym hay các tế bào có thể dễ dàng bị bọc
trong chất mang alginat. Đại diện của phương pháp này là bẫy enzym
hoặc toàn bộ tế bào chứa enzym trong gel alginat.
Trong phương pháp bẫy vật lý, ma trận gel thường hạn chế sự
khuếch tán enzym trong quá trình phản ứng. Để khắc phục nhược điểm
này, người ta có thể bổ sung một sô' chất để cải thiện độ rỗng của gel.
Trong một số' trường hợp khác, nguyên nhân của sự rò rỉ enzym là kết
quả của sự lựa chọn tiền chất gel không phù hợp.
4.2.4. CỐ định bằng phương pháp bao gói
Bao gói enzym là phương pháp trong đó các phân tử enzym được cố’
định trong một bao nang có kích thưốe biến đổi từ vài micromet cho đến
hàng trăm micromet. Thông thường, đo kích thước màng nhỏ hơn các
phân tử enzym, các phân tử enzym không thể đi qua được màng trong
khi các cơ chất có thể tự do đi qua. Do đó, sự khuếch tán bị hạn chế được
coi là vấn đề nghiêm trọng của phương pháp này so với các phương pháp
cố định enzym trên các chất mang xốp. Các màng siêu lọc hoặc các sợi
lõm được làm bằng polyethersulfon, xenluloza nitrat hoặc axetat, hoặc
nilon được sử dụng trong phương pháp này.

127
 A B
H ìn h 4.7. C ô đ ịn h e n z y m b ằ n g p h ư ơ n g p h á p v ậ t lý
A. Trong màng bán thấm; B. Trong vi nang.

Phương pháp này có ưu điểm là: (1) Cho phép tạo ra các hệ thống đa
enzym và các điều kiện sử dụng thường là ôn hoà và (2) Không có biến
dổi hoá học trong suốt quá trình bao gói, do đó công nghệ này hạn chế sự
bất hoạt enzym, nhưng cũng có các nhược điểm: ( 1 ) Các enzym nằm bên
trong vỏ bọc là enzym tự do, do vậy chúng không bền; (2) Dễ rò rỉ enzym
và sự khuếch tán ra môi Irường phản ứng bị hạn chế và (3) Khó có thể
Lái sinh chất mang.
Ngày nay, đã có nhiều cải tiến trong công nghệ bao gói, với mục đích
khắc phục các bất lợi của kỹ thuật bao gói ban đầu và đáp ứng các nhu
cầu ứng dụng khác nhau. Các phương pháp cải tiến bao gồm:
—Bao gói kết hợp tạo liên kết chéo trong đó enzym đầu tiên được
bao gói trong bao nang, sau dó liên kết chéo với tác nhân hai chức năng
để tạo các enzym không tan.
—Cô" định và bao gói trong đó enzym ban đầu được cố định bởi một
công nghệ khác như cộng hoá trị, hấp phụ, bẫy và liên kết chéo, sau đó
dược phủ một. lóp màng bên ngoài. Mục đích của phương pháp là tăng sự
ổn định của enzym.
— Kỹ th u ật bao gói sau khi gắn enzym trong đó enzym được tính
toán sắp xếp Irong vị trí lõm tạo sẵn của chất bao gói.

• Chất liên kết chéo '

«

| | V • • ì

.V V
Cơ
•***• ^ IEnzym
H in h 4.8. B a o g ó i c h o th ê m tá c n h â n liê n k ế t c h é o

Thường thì bao gói tăng cường chủ yếu được thiết lập để cải thiện
enzym được bao gói, ví dụ: (1) Giảm sự rò rỉ enzym từ các enzym hấp

128
phụ trên các vật liệu nhỏ, (2 ) cải thiện hoạt tính enzym cô định trong
vật liệu, (3) Tăng độ bền như độ bền cơ lý và độ bền trong các dung môi
hữu cơ, hoặc bền với quá trình thao tác, (4) cải thiện sự chọn lọc, (5)
Giảm cơ chât hoặc sự ức chê cơ chất và (6 ) Tăng kích thước.
4.2.5. Cô đ ịn h enzym bằng phương pháp cộ n g hoá trị

Vào năm 1953, Grubhofer và Schleith đã tạo được các chế phẩm
enzym cô định như cacboxypeptidaza, diastaza, pepsin và ribonucleaza
bằng cách tạo liên kêt cộng hoá trị giữa enzym với polyaminostyren đã
dược diazot hoá. Có thể nói, thành công này đã mở đầu cho việc sử dụng
enzym trong thực tế. Nguyên lý của phương pháp này được biểu diễn
trên sơ đồ hình 4.9.

H in h 4 .9 . C ô đ ịn h e n z y m lê n c h ấ t m a n g b ằ n g liê n k ế t c ộ n g h o á t r ị
(A) A m in o a xit hoạt độ ng ; (B ) C á c chấ t m ang đã được gắn n h ó m chứ c năng;
(C ) C h ấ t m an g; (D ) V ù n g đ ịn h vị (Linqiu C ao, 2005).

Phương pháp này có ưu điểm: (1 ) Dễ dàng tách enzym ra khỏi giá

thể là ưu điểm đặc biệt của phương pháp này; (2) Enzym thường được
gắn vào giá thể thông qua nhiều điểm và việc này tạo nên sự tăng tính
bền nhiệt, pH, độ ion hoá, và tính ổn định của chúng trong dung môi
hữu cơ làm nó khó biến tính hơn và các enzym được cô' định thường
cũng khó bị phân hủy và (3) Tính ổn định được tăng lôn và lượng
enzym rò rỉ ít nhất so với các phương pháp khác. Phương pháp này
cũng có các nhược điểm sau: (1) Giá thành đắt hơn do vật liệu cô' định
có giá cao; (2 ) Phương pháp cố định này phức tạp hơn so với các phương
pháp khác, giá thể thường phải được hoạt hoá trước khi cố định; (3)
Cấu trúc của enzym có thể bị thay đổi một phần trong quá trình gắn
với chất mang, làm giảm hoạt độ xúc tác và (4) Liên kết chặt giữa
onzym với chấl mang có thể làm giảm sự di chuyên tự do, do đó làm
giảm hoạt độ của enzym.
Để có dược các liên kết bền vững và duy trì hoạt tính cao, enzvm và
129
chất mang được lựa chọn phải được đặt trong các điều kiện mà vùng
chức năng riêng của chúng nằm trên bề mặt và chúng có thể tiến đến
gần nhau đề hình thành liên kết cộng hoá trị. Liên kết cộng hoá trị giữa
các enzym và chất mang chỉ được tạo thành hiệu quả khi thoả mãn hai
yêu cầu cơ bản. T hứ nhất, các nhóm chức năng của chất mang lựa chọn
và enzym cần phải phù hợp vối nhau, và môi trường sử dụng (thường là
nước hoặc dung môi hữu cơ) phải tạo điểu kiện cho phản ứng có thể xảy
ra và duy trì sự bển vững của enzym cô" định. Thứ hai, các nhóm chức
năng của chất mang và enzym cần có không gian tiếp xúc được với nhau
trong các điều kiện cố định trước gắn. Như chúng ta đã biết, các enzym
hoặc protein tạo thành từ 2 0 amino axit cơ bản, tất cả đều chứa các nhóm
tự do. Tuy nhiên, chỉ một nửa trong số này có thể sử dụng được cho cố
dịnh enzym trong phương pháp này, cụ thể là: (1) Các amino axit đầu
cuối là nhóm amin N-(NAA) và (e) nhóm - amin của lyzin (Lys); (2) Các
nhóm cacboxyl 7 và p của axit glutamic (Glu) và axit aspartic (Asp) và
các nhóm cacboxyl có đầu tận cùng là C-; (3) Nhóm guanidin của
arginin (Arg); (4) Nhóm sulphydryl (SH) của xystein (Cys); (5) Nhóm
imidazol của histidin (His); (6) Nửa thio — ete của methionin (Met);
(7) Nhóm indol của tryptophan (trp) và (8 ) Các nhóm hydroxyl phenolic
của tyrosin (Tyr).
Phương pháp gắn enzym vào chất mang bằng liên kết cộng hoá trị,
thông thường tiến hành qua hai giai đoạn chính: ( 1 ) xử lý, hoạt hoá chất
mang trước khi gắn enzym và (2 ) Gắn enzym vào chất mang đã được
hoạt hoá.
Một số phương pháp thường dùng để hoạt hoá chất mang như dùng
xianogen bromit, diazot hoá, azit axit, các chất ngưng tụ,...
a) Gắn k ế t cộng hoá tri trên vảt liệu polyhydroxyl
Các vật liệu cố dịnh polyhydroxyl như thuỷ tinh có lỗ, và đặc biệt là
các polysaccarit, gốm là những vật liệu phổ biến nhất trong số các vật
liệu dùng trong cố định enzym. Do các nhóm hydroxyl là các nhóm mang
nghèo nên chúng phải được hoạt hoá trước khi kết hợp với enzym, trong
phương pháp này thường sử dụng xianua bromit và một sô" tác nhân
khác như dẫn xuất s - triazin để hoạt hoá chất mang. Vật liệu sau hoạt
hoá có Ihê bắt cặp cộng hoá trị với một enzym thường là qua nhóm E - amin
của lyzin hoặc qua đầu amin. Cơ chế của quá trình tạo dẫn xuất các vật
liệu hydroxyl và cố định enzym (hình 4.10).

130
 Q r + CNBr ------* . ^ ^ ^ /C=NHt Enzym-N^
q,/C _= N— Enzym

Chất mang Xỉanua Chất mang Enzym cô* định

chứa nhóm hyơroxyl bromit được hoạt hoà

OH C I-Ịf\-C I / * ^ - 0 - | f NV CI + Enzym-NH2 ° “ i f ' S - N H _ Enzvm

+ Ns^N ---► Ns^N --- ► Nsíí-N
Chất mang S-triazin Chất mang Enzym cố định
chứa nhóm hydroxyl được hoạt hoá

Hinh 4.10. Cố định enzym trên các vật liệu chứa nhóm hydroxyl
đã được hoạt hoá với xianua bromit hoặc các dẫn su ất s - triazin

Các vật liệu sau khi được hoạt hoá vói cyanogen bromit có thể bảo
quản tới 1 năm trong tủ lạnh. Để tạo các liên kết cộng hoá trị, enzym và
chất mang đã hoạt hoá phải được tiếp xúc vói nhau trong một dung dịch
trong vài giờ, sau đó rửa lại để loại bỏ hết protein không tham gia liên kết.
Phương pháp này được nghiên cứu đặc biệt phổ biến trong phòng thí
nghiệm, với các ứng dụng có quy mô lốn hơn, tạo liên kết cộng hoá trị
thường ít được sử dụng do tác nhân hoạt hoá xianua bromit rất độc và
các vật liệu cacbohydrat như xenluloza, agaroza và dextran có tính ổn
dịnh hoá học kém, trong khi các polysaccarit tự nhiên khác dễ phân huỷ
bởi vi sinh vật.
b) Gắn k ế t đồng hoá tri lên các vát liêu chứa a x it cacboxylic
(d ù n g các hoá ch ấ t trù n g ngưng)
Trong phương pháp này, các chất chứa nhóm cacboxylic như các
copolyme của axit (meth)acrylic vối (meth)acrylic este, xenluloza thường
được sử dụng làm vật liệu cố định. Đế’ cô' định, trước hết các vật liệu kể
trên được hoạt hoá vói cacbodiimit, chất này được sử dụng làm yếu tô'
ngưng tụ để tạo thành các liên kết peptit giữa các nhóm cacboxyl hoặc
nhóm amino của chất mang. Trong môi trường axit nhẹ (pH 4,75 - 5,0),
cacbodiimit phản ứng vối các nhóm cacboxylic axit tạo ra dẫn xuất o -
acylisourea hoạt hoá cao. Cacbodiimit hoà tan trong nưốc được sử dụng
rộng rãi nhất là 1 - ethyl -3 - (3 - dimethylaminopropyl) - cacbodiimit
(EDC) và 1- cyclohexyl - 3- (2 -morpholino - ethyl) - cacbodiimit (CMC). Sơ
đồ phản ứng hoạt hoá một vật liệu có chứa axit cacboxylic và bắt cặp
enzym (4.11).
ọ ọ II II
C"NH-Enzym + ,C N
RHN NHR'

Chất mang chửa Carbodiimit hoà Chẩt mang Enzym cố định

nhóm axil cacboxyỉic tan trong nước được hoạt hoả
Hình 4.11. Hoạt hoá vật liệu chứa axit cacboxylic vối cacbodiim it
sau đó cố định enzym

131
 c) Gắn k ế t dồng hoá tri lên vật liệu chứa am in
Vật liệu chứa amin là loại phổ biến và hữu hiệu nhất trong cố' định
enzym nhờ tạo liên kết đồng hoá trị. Những vật liệu này có thê là vô cơ
hoặc hữu cơ được chức năng hoá bằng cách gắn thêm nhóm amin. Kỹ
thuật hay dùng nhất trong việc tạo ra các nhóm amin trên vật liệu vô cơ
là thông qua gắn kết aminosilan. Ví dụ: 3 - aminopropyltriethoxysilan
(3 - APTES) có thể được bắt cặp vào thuỷ tinh có lỗ tạo ra các nhóm
amin chìa ra ngoài
Thường vật liệu mang nhóm amin khác là các hạt phủ polyethyleneimin.
Polyethyleneimin là một dẫn xuất của polyamin thu được sau khi polyme
hoá ethyleneimin tạo ra các polyme có nhiều nhánh. Polyme này có thể
dược phủ lên nhiều loại vật liệu bao gồm: nhôm, cacbon, đất có tảo silic và
vật liệu polyvinyl clorit —silica composit.
/ '" % o o _ ? Enzym-HN2
HN2+ H — H -------- ► N—

Chát mang chứa Glutaraldehyt Chất mang Enzym cố định

nhỏm amin được hoạt hoả

Hình 4.12. Hoạt hoá vật liệu m ang nhóm amin với glutaraldehyt đ ể c ố định enzym

Sự bắt cặp của một enzym vói vật liệu chứa nhóm amin có thể được
tiến hành theo nhiều cách khác nhau. Cách phổ biến nhất là thông qua
việc sử dụng các tác nhân hai chức năng, ví dụ như diimidat este,
điisocyanat, glutaraldehyt và dialdehyt. Trong đó, glutaraldehyt thường
dược sử dụng rộng rãi như một trong sô" những tác nhân hai chức năng
do giá thành rẻ nhất và sẵn có. Việc gắn enzym được hoàn thành dễ
dàng nhờ trộn lẫn enzym với vật liệu cô" định đã hoạt hoá.
Các nhóm cacboxyl của enzym cũng hình thành các liên kết cộng
hoá trị trực tiếp với các vật liệu mang nhóm amin. Các enzym này trước
Liên phải được hoạt hoá vói một cacbodiimin hoặc một thuốc thử tương
Lự trước khi cố' định. Tuy nhiên, bước hoạt hoá này có thể làm bất hoạt
enzym, vì vậy phương pháp này ít khi được sử dụng.
d) L iên kết công hoá tri với các văt liêu polym e h o at hoá
Phương pháp này dựa trên cơ sở gắn kết enzym bằng liên kết cộng
hoá trị vối các vật liệu có chứa nhóm epoxy hoạt hoá. Hiện nay trên thị
trường có rất nhiều loại vật liệu chứa epoxy, đơn cử Rhm Pharma
Polyme (Piscataway, NJ), tên thương mại là Eupergit. Chất liệu này là
một polyme đồng trùng hợp liên kết chéo của methacrylamit và các
monome chứa oxyran. Chúng bao gồm các hạt hình cầu, đường kính
132
khoảng 200|am. Eupergit có hai loại, Eupergit c và Eupergit c 250 L,
khác nhau về hàm lượng oxyran và kích thước lỗ. Eupergit c có đưòng
kính lỗ trung bình là lOnm và hàm lượng oxyran là 600fimol/g, trong
khi Eupergit c 250 L có kích thước lỗ và hàm lượng oxyran là lOOnm và
300(imol/g. Eupergit c 250 L được dùng để cố định các enzym có khối
lượng phân tử lớn (> lOOkDa).
Cố’ định enzym vào Eupergit khá đơn giản. Dung dịch enzym được
cho tiếp xúc với hạt Eupergit ở trạng thái tĩnh hoặc khuấy trộn nhẹ
trong vòng 24 —96 giò (không dùng thanh khuấy từ đổ tránh làm vỡ các
hạt). Việc này có thể được thực hiện ở nhiệt độ phòng, hoặc ở 4°c trong
Irường hợp enzym kém bền. Có thể thực hiện việc gắn kết ở nhiều pH
khác nhau. Trong môi trường kiềm và trung tính, các nhóm amin trên
enzym đảm nhận chủ yếu việc gắn kết với vật liệu cố định. Trong môi
trường trung tính và axit, các nhóm sulfhydryl và cacboxyl tham gia vào
liên kết.
Cố định trên Eupergit không làm thay đổi đặc tính của enzym. Các
yếu tô" ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình cô" định là: kiểu phối trộn,
thời gian cố định, nhiệt độ, pH, và cả độ ion hoá (buffer 0,5 - IM hoặc
muối trung tính thường là tối ưu). Khi enzym được gắn vào vật liệu cố
định, liên kết ổn định trong một thòi gian dài và trong khoảng pH rộng
từ 1,0 - 12,0. Cũng do Eupergit trung tính về điện tích nên pH thay đổi
không ảnh hương tới sự trương nở của gel.
Sau khi enzym được gắn kết, chỉ khoảng 1 % nhóm epoxy thực sự
tham gia vào cố định enzym. Các nhóm còn lại sẽ phân giải từ từ thành
các diol hoặc chúng chuyển thành nhiều hợp chất có thể gây ảnh hưởng
tới môi trường xung quanh enzym cô' định, kết quả là enzym có thể trở
nên ưa nước, kỵ nước. Điều này làm ảnh hưởng tới độ bển hoặc hoạt tính
của enzym liên kết.
Bên cạnh Eupergit, các polyme khác có chứa epoxy cũng đã được
Ihăm dò để gắn cộng hoá trị các enzym. Các hạt polyacrolein là một chất
mang polyme hoạt hoá khác củng được sử dụng cho cố dịnh enzym cộng
hoá trị. Margel đã tổng hợp loại hạt này và bao gói chúng vào agarose
trước khi gắn kết vổi enzym. Do những vật liệu cố’ định này là
polyalclehyt, enzym được gắn kết Iheo cách tương tự như với các vật liệu
đã hoạt hoá vối glutaraldehyt. Nhiều oligome như poly(lyzin) và
poly(glyxin) được gắn vối các hạt polyacrolein để hoạt động như những
miếng đệm giữa các hạt và enzym. Trong cả hai trường hợp thì

133
poly(amino axit) được tiếp xúc với vật liệu cố định thông qua các nhóm
amin ở đầu của chúng, hoặc các nhóm e - amin trong trường hợp của
poly(lyzin). Liên kết enzym với polyacrolein không biên đổi được trình
bày trên hình 4.13.
° Enzym-HNj NaBH,,
C— H --------------- + - C H = N— Enzym -----------C H — NH— Enzym

Chất mang chứa Enzym cố định Enzym cô' định

nhóm polyacrolein (dạng oxy hoá) (dạng khử)

Hinh 4.13. c ố định enzym trên các polyacrolein không biến đổi
nhờ các nhóm amino tự do

4.2.6. Ả n h hư ỏng sự c ố đ ịn h lên hoạt tính của enzym

Khi gắn lên chất mang, enzym bị giới hạn trong một phạm vi môi
trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi do đó
làm biến dổi một sô" tính chất của enzym ban đầu (enzym hoà tan). Ví
dụ: có thồ làm thay đổi pH, nhiệt độ hoạt động cũng như các giá trị của
hằng số Michaelis và tính đặc hiệu của enzym. Tuy nhiên những thay
đổi này còn phụ thuộc nhiều vào bản chất hoá học của chất mang. Nói
chung enzym cố định thường bền hơn, nhưng hoạt động riêng thường
thấp hơn enzym hoà tan.
Hoạt tính của enzym cố định phụ thuộc vào bản chất và tính chất
hoá học của chất mang và sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các
phân tử khác. Như vậy, tuỳ thuộc vào bản chất của enzym và mục đích
sử dụng mà người ta lựa chọn phương pháp cố định, chất mang phù
hợp. Ví dụ: khi sử dụng các enzym có khối lượng phân tử lớn, cũng có
nghĩa là kích thước enzym lớn, thì không thể chọn các vật liệu cấu trúc
nano có kích thước mao quản nhỏ để cố định, ngược lại không thể cố
định enzym cho hoạt tính cao trong vật liệu có kích thưốc mao quản
nhỏ (như SBA —15, MCM - 41) sử dụng để thuỷ phân các cơ chất có
khôi lượng phân tử lớn (như xenluloza hay tinh bột). Như vậy, tốc dộ
khuêch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các
yêu tô: (1) Kích thước lỗ gel của chất mang; (2) Khối lượng phân tử của
cơ chất và (3) Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung
quanh enzym và dung dịch tự do. Những giới hạn này có ảnh hưởng
đên những đặc tính động học của quá trình khuếch tán nếu so sánh
chúng với với enzym "tự do".

134
4.3. ĐỘNG HỌC CỦA ENZYM c ố ĐỊNH

4.3.1. Đặc đ iểm độ n g học của enzym c ố định

Đặc điểm dộng học của enzym liên kết (còn được hiểu là enzym dị
thể) rất khác tính chất của enzym trong dung dịch tự do (enzym đồng
thể). Các tính chất của enzym có thể biến tính do cách lựa chọn phương
pháp cố định, và cùng một phương pháp cố định có thể có ảnh hưởng
khác biệt rõ rệt lên các enzym khác nhau. Thay đổi này có thể dẫn đến
sự thay dổi hình thể bên trong enzym đối với quá trình cô" định, hoặc sự
có mặt và bản chất của chất mang cô" định.
Cố định có thể ảnh hưởng lổn đến độ bền của enzym, nếu quá trình
cô" định ảnh hưởng đen trạng thái của enzym như làm bất hoạt enzym
trong điều kiện biến tính (nhiệt độ cao và pH cực đoan), sự liên kết
nhiều điểm giữa enzym và cơ chất, làm cho enzym có độ ổn định hơn.
Thứ nhất, do ngăn cản vật lý, sự thay đổi lớn hình dạng trong cấu
trúc của protein dẫn đến bất hoạt enzym. Nhiều quá trình cô' định cộng
hoá trị thành công bao gồm giai đoạn đầu đảo ngược tự do cho phép
hình thành, phá vổ và tái hình thành liên kết cộng hoá trị cho đến khi
tạo thành cấu trúc liên kết cộng hoá trị dỗ dàng làm ổn định enzym cố
định. Ổn định hơn khi ngăn cản các phân tử enzym từ sự tương tác
giữa chúng và có đủ khả năng chông lại sự tấn công của proteaza và vi
sinh vật. Ảnh hưởng này dẫn đến sự tổ hợp khó khuếch tán và ngụy
trang chống lại sự tấn công của enzym bằng cách thay đổi cấu trúc. Để
đạt độ ổn định cực đại của enzym, bề mặt của enzym và chất mang
hình thành sự tương tác cộng hoá trị và không cộng hoá trị. Thông
thường, yếu tố này phải cân bằng vối các yếu tô' khác như cơ chất
không bị cản trở bởi không gian khuếch tán đến vị trí hoạt động của
enzym cô định theo trình tự phản ứng.
Các hằng số động học (Km, Vmax) của enzym có thể bị thay đổi do quá
trình cô' định dẫn đến thay đổi cấu trúc bên trong và giới hạn đường đến
vị trí hoạt động của enzym. Do đó, tính đặc hiệu bên trong (k/Km) của
enzym có thể bị thay đổi nhiều so vối enzym hoà tan (tự do). Ví dụ:
trypxin ở trạng thái tự do thuỷ phân 15 liên kết peptit trong protein
pepsinogen, nhưng enzym cô' định chi thuỷ phân 10 liên kết. Giá trị của
các thông sô' động học này khi xác định bằng thực nghiệm có thể khác
giá trị thực do sự thay đổi các tính chất của dung dịch trong không gian
khi đó của enzym cô' định, hoặc ảnh hưởng của sự khuếch tán các phân

135
tử trong môi trường cục bộ (hình 4.19). Quan hệ giữa các thông sô này
được chỉ ra dưói đây: Các thông số bên trong của enzym hoà tan, các
thông sô" bên trong của enzym cố định và các thông sô" biểu hiện do sự
phân chia và khuếch tán của cơ chất và sản phẩm.
Môi trường lớn

Hỉnh 4.14. Sơ đố nơi giao nhau của hạt enzym c ố định (vi môi trường)
và môi trường lớn

Phân tích trên hình 4.14 cho thấy, điểm giao nhau giữa hạt enzym cô
định (A) —Vi môi trường và môi trường lớn (môi trường bên ngoài), trong
dó, vi môi trường bao gồm dung dịch bên trong là phần dung dịch bao
quanh bị tác động bởi các đặc tính bề mặt của enzym cố định. Sự phân
chia của cơ chất xảy ra giữa hai môi trường này, phân tử cơ chất (S) cần
phải khuếch tán qua lốp màng bao quanh (vận chuyển bên ngoài) để tiến
dến bề mặt xúc tác và chuyển hoá thành sản phẩm (P). về nguyên tắc, tất
cả enzym dược sử dụng, cơ chất cũng cần phải khuếch tán đến mao quản
trong bề mặt của hạt enzym cố định (vận chuyển bên trong). Trạng thái lỗ
(s) của hạt tỷ lệ với thể tích dung dịch có trong toàn bộ hạt, còn trạng thái
co (chỗ uốn khúc) (x) là tỷ lệ trung bình giữa chiều dài của con dường qua
lỗ, giữa bất kỳ điểm nào trong hạt đến khoảng cách tuyệt dối của chúng,
chỗ uốn khúc luôn luôn lớn hơn hoặc bằng một đơn vị, rõ ràng nó phụ
thuộc vào hình không gian của lỗ (mao quản). Sơ đồ biểu thị kích thưỏc
cho mục đích này rõ ràng. Thông thường kích Lhước của phân tử enzym
( 2 - 1 0 nm) nhỏ hơn từ 1 đến 2 0 lần so với đường kính lỗ, mà đưòng kính
lỗ nhỏ hơn từ 2 đến 40 lần đường kính của hạt (10 —2.000|.im); vi môi
trưòng bao gồm một lớp khuếch tán (dày ~ 1 0 |Am) và một lốp màng ngăn
(dày ~20nm). (B) —Nồng độ cơ chất trên bề mặt của hạt (đường kính R) là
[S|{] trong khi nồng độ bên trong ở bất kỳ đường kính nhỏ hơn (r) cũng có
giá trị nhỏ hơn được biểu thị bằng [S,.].

136
4.3.2. Ả nh hưỏng của sự dịch chuyển chất tan lên động học của enzym
cô định

Dung dịch bao quanh bể mặt của enzym cô" định bị tác động bởi cả
diện tích và độ kỵ nước của bổ mặt. Điện tích trên bề m ặt của hạt enzym
cô định do tính chất lưỡng tính của enzym, ở đó điện tích dương và âm
không cân bằng do tính chất của bề mặt hạt cô' định. Điện tích bề mặt dỗ
dàng sinh ra do sử dụng hạt trao dổi ion hay hạt tích điện để cô" định,
đẩy xa các phân tử điện tích cùng dấu và hút các tích điện trái dấu. Sự
chuyên dịch các phân tử tích điện (cơ chất, và sản phẩm) xảy ra giữa
dung dịch (môi trường lớn) và trong hạt enzym cố định (vi môi trường);
phân tử trái dấu trên bề mặt enzym cô định sẽ dịch chuyển vào vi môi
trường, trong khi các phân tử cùng dấu bị đẩy ra, đi vào môi trường lớn.
Độ dịch chuyển chất tan có thể xác định được bằng hệ sô' dịch chuyển
tĩnh điện (electrostatic partition coefficient, A), theo công thức:
A = [C0n+] / [C "1 = [A "1 / [A0"1 (4 . 1)
Ổ đó, [C0n+1 và [A0n~] biểu thị nồng độ mỗi loại cation và anion trong
môi trường lớn, [Cnt] và [An~] biểu thị nồng độ của chúng trong vi môi
trường và n số điện tích trên mỗi loại ion. A được nhận thấy thay dổi
trong khoảng từ 0,01 đến 100; A ở dầy lớn hơn dơn vị bề mặt enzym tích
điện dương và thấp hơn đớn vị bề mặt tích điện âm. Ẩnh hưởng của sự
dịch chuyển lên các phân tử tích điện dương và điện âm là bằng nhau
nhưng ngược chiều nhau, để chất mang tích diện dương, các cation được
tách khỏi vi môi trường, trong khi đó nồng dộ anion lớn hơn Irong thể
tích dó so với dung dịch bên ngoài. <p phụ Ihuộc vào mật độ điện tích trên
và bên trong hạt enzym cố’ định, nó bị ảnh hưởng lớn bởi cường độ ion
trong dung dịch, ở cưòng độ ion cao, nổi lên nồng độ phân tử chất tan
tích điện chông lại sự tích điện trôn hạt, giảm lực tĩnh điện và làm cho ọ
tiến gần tới dơn vị.
4.3.3. Ả n h hư ởng của khả năng khuếch tán của ch ấ t tan lên đ ộ n g học
của enzym cô định

Về nguyên tắc, enzym cô' dịnh xúc tác phản ứng, cơ chất phải
khuếch tán qua dung dịch đến vị trí hoạt động xúc tác và sản phẩm
khuếch tán vào dung dịch mà lực chuyển dịch qua màng nhờ gradient
nồng dộ, chất tan chuyển từ nồng độ cao sang nồng dộ thấp hdn. Cơ chất
hưóng đến bể mặt của hạt enzym qua một lớp dung dịch không chuyển

137
động mỏng bao quanh hạt và sau đó khuêch tán qua mao quản có thể
chạm vào enzym hoạt động. Sự chuyển động của chất tan có thể được mô
tả theo hai bước như sau:
Khuếch tán bên ngoài: ỗ đó trong nhiều trường hợp chuyển hoá cơ
chất thành sản phẩm xảy ra trên bể mặt, thì vận chuyển cơ chất đên bề
mặt và giải phóng sản phẩm ra khỏi bề mặt (quá trình diễn ra liên tục).
Khuếch tán bên trong: ở đó, bên trong mao quản của các hạt enzym
cố định diễn ra song song vỏi phản ứng xúc tác là vận chuyển cơ chất và
sản phẩm trong đó (quá trình diễn ra đồng thòi).
a) b)
L§L ÍẼL

ĩ
í
1 HP] ĨÌT

Hình 4.15. Sơ đố biểu thj gradient nồng độ cơ chất và sả n phẩm có th ể sinh ra

xung quanh hạt mao quản của enzym c ố định
(a) G ra d ie n t nồng độ g â y ra phản ứng và khu ếch tán bên trong hạt; (b) cũ n g n h ư (a) nhưng vâi
g ra d ie n t nồng độ bổ su n g làm c h o sự chuyển dịch cơ chất và sản p h ẩ m v à o trong vi m ôi
trường; (c) cũ n g n h ư (a) nhưng với gra dient nống độ bổ sung dãn đ ế n sự k hu ếch tán bên ngoài
đến bề m ặt hạt; (d) G ra d ie n t nồng độ làm ảnh hưởng phối hợp cả ch u yể n d ịc h và khu ếch tán,
lớ p ngăn cá ch ch u yể n dịch thường m ỏng hơn m ột nghìn lần so với ló p khưếch tán.

Gradient nồng độ là nguyên nhân gây ra sự khuếch tán và chuyển

dịch được mô tả trên hình 4,15. Tốc độ phản ứng đưdc xúc tác nhờ
cnzym cô" định (v) thường thấp hơn tôc độ của enzym tự do trong dung
dịch (vtlítiu). Chính vì vậy cần phải điều chỉnh cơ chất khuếch tán từ pha
môi trường lón dến bề mặt xúc tác.
Phụ thuộc vào khôi lượng và kích thước phân tử của cơ chãt và nhiệt
độ, độ nhớt và thành phần của pha lỏng, mà người ta có thể thay đổi với
độ khuếch tán và m ật độ cũng như độ nhót của chất lỏng. Do vậy, ngưòi
ta cũng thường sử dụng các hạt chất xúc tác nhỏ, bằng cách tăng cường
sự chuyển động hỗn loạn của dung dịch xung quanh enzym cố định
khoảng 10 lần.

138
 4.4. CÁC THIẾT BỊ PHẢN ỨNG (BÌNH PHẢN ỨNG) CHỨA ENZYM c ố ĐỊNH
Thiết bị phản ứng chứa enzym được sử dụng để tạo tiếp xúc giữa
enzym và cơ chất trong một khoảng thời gian đủ để tiến hành phản ứng
xúc tác, đồng thòi nó cũng cho phép tách sản phẩm nhận được ra khỏi
enzym một cách dễ dàng. Một sô* mô hình thiết bị phản ứng chứa enzym
cố định (hình 4.16).

V
Bình phản ứng Binh phản Cmg Bình phản ứng
V
Bình phản ứng
chứa lớp xúc chứa lớp xúc chứa tóp xúc màng xoần
tác cô” định tác phảng tác lọc

Bình phản ứng

Ụ
Binh phàn ứng Binh phản úng
máo dẵn chứa hạt hổi lưu

Hình 4.16. Một s ố mô hình điếu khiển thiết bị phản ứng chứa enzym c ố định

4.4.1. Thiết bị phản ứng hoạt động như thếnào

Thiết bị phản ứng hoạt động theo chu kỳ thực tế là những bể lớn
chứa enzym và cơ chất được trang bị máy khuấy. Thông thường trong
thiết bị phản ứng kiểu này ngưồi ta cho phản ứng tiến hành triệt để tới
cùng, sau đó tháo cạn thiết bị phản ứng và tách sản phẩm của phản
ứng ra khỏi enzym. Trong trưòng hợp enzym tan thì ngưồi ta thưòng
tách nó bằng cách làm biến tính enzym (ví dụ bằng cách xử lý nhiệt).
Phương cách sử dụng này tỏ ra có lợi về mặt kinh tế trong trưòng hợp
đùng enzym rẻ tiền. Để thiết bị phản ứng hoạt tính theo chu kỳ có khả
năng sử dụng enzym dắt tiền, trưổc tiên cần phải cố định nó và sau
quá trình phản ứng, enzym cố định sẽ được tách bằng ly tâm hay lọc.

iI 139
Song thực tế enzym cô" định có thể bị phá huỷ trong quá trình tách. Vì
vậy, thiết bị phản ứng hoạt tính theo chu kỳ thường được sử dụng với
enzym tan rẻ tiền hơn, ưu điểm chủ yếu của thiết bị phản ứng hoạt
dộng theo chu kỳ là giá thành thâ'p so với thiết bị phản ứng kiểu khốc.
4.4.2. Thiết bị phản ứng hoạt động kiểu dòng chảy
Nguyên tắc hoạt tính của thiết bị phản ứng dòng chảy là sự bổ sung
liôn tục cơ chất vào và lây sản phẩm của phản ứng ra khỏi thiết bị phản
ứng. Thiết bị phản ứng dòng chảy có một số’kiểu thiết kế nhưng chứng
dều có một đặc điểm chung được mô tả dưói đây.
Thiết bị phản ứng dòng chảy có khuấy trộn bao gồm bể chứa được
trang bị máy khuây có những lỗ riêng biệt để bổ sung cơ chất và lây hỗn
hợp phản ứng, hoặc lấy sản phẩm của phản ứng ra ngoài. Sự lựa chọn
dúng kích thước của bể chứa, hoạt tính của enzym và tốc độ bổ sung cơ
chất cho phổp ta đạt được mức độ chuyển hoá cơ chất thành sản phẩm
mong muôn. Ví dụ: cho dịch cơ chắt chảy chậm vào thiết bị phản ứng có
thể tích lớn (như vậy thời gian đuy trì hỗn hợp phản ứng trong thiết bị
phản ứng sẽ gia tăng), cộng với hoạt tính đáng kể của enzym sẽ cho
phép nhận được sản phẩm với năng suất cao.
Có một sô" phương pháp cho phép lưu giữ enzym cô" định ồ trong
thiết bị phản ứng như: tách enzym ra khỏi sản phẩm bằng cách lọc, đưa
vào giai đoạn tan bổ sung, cô" định enzym trên các hạt nhiễm từ và đưa
chúng vào từ trường để khuấy trộn những hạt này, cố định enzym trực
tiếp trên cánh khuây,...
Thiêt bị phản ứng dòng chảy có khuấy trộn có thể kết hợp với quá
trình siêu lọc, điều này cho phép sử dụng enzym cố định ở dạng tan
trong các thiết bị phản ứng. Kiểu thiết bị phản ứng này thích hợp vối cd
chất không hoà tan hay ở trạng thái keo.
Thiết bị phản ứng dòng chảy không khuấy trộn là: các hạt enzym
cô dinh có thế được nhồi chặt vào cột, trong trưòng hợp này chỉ việc cho
dịch cơ chat chảy qua cột và ỏ đầu ra người ta nhận được sản phẩm.
Thiết bị phản ứng lý tưởng chứa lớp enzym cố định là thiết bị phản
ứng cho phép cơ chất chảy qua toàn bộ diện tích m ặt cát ngang của cột
với tôc độ như nhau. Hệ thống này được biết đến với tên gọi là thiết bị
phản ứng tách đẩy lý tưởng. Trong thực tế, dịch cơ chất có thể được
đưa vào cột từ trên xuống cũng như từ dưới lên, còn bản thân cột thì ỏ

140
dạng cột cao hoặc ở dạng các lớp phảng dẹt. Đôi khi người ta cố định
enzym trên màng hoặc trên các tấm mỏng (ví dụ trên giấy lọc) và sắp
xêp chúng theo lớp ở trong cột. Mới đây xuất hiện thông báo về thiết bị
phản ứng kiểu mới chứa các lớp ccT định theo một nguyên tắc khác.
Trong thiêt bị phản ứng kiểu này, các tấm màng xốp có gắn enzym
được xoắn lại thành hình xoắn ốc và nhồi vào cột.
Ngoài ra, còn có phương ỐĨ1 khác vê thiết bị phản ứng chứa lớp cố
định - đó là thiêt bị phản ứng chứa những ống mao dẫn có vách thẩm
thấu đối vối cơ chất và sản phẩm nhưng lại không thẩm thấu đối với
enzym được nhồi trong cột. Trong trưòng hợp này, enzym nằm ở phía
trong của ống và tiếp xúc với dòng chảy của cơ chất bao phía ngoài.
Trong quá trìn h đó cơ chất thẩm thấu ngược qua vách của ông mao
dẫn đi vào dòng dung dịch. Trong một biến dạng của thiết bị phản
ứng kiểu này, cơ chát được bơm qua ông mao dẫn có vách xốp ngâm
trong đung dịch enzym. Kiểu thiết bị phản ứng với các lớp enzym ở
dạng huyền phù được coi là sự kết hdp: ngưòi ta nhồi không chặt cột
bằng các h ạt có gắn enzym cố định sao cho dịch cơ chất đi vào qua
đáy của cột và chảy qua cột với tốc độ đủ lớn và đủ để khuấy trộn đều
các hạt bên trong cột. Tầ't nhiên cốc hạt chứa enzym cố định phải có
m ật độ cao hơn so với môi trưòng phản ứng, tuy nhicn tốc độ dòng
chảy cũng không được quá lón để enzym không bị đẩy ra ngoài qua
phần trên của cột.
Phụ thuộc vào tính chất vật lý của thiết bị phản ứng chứa enzym cố
định và cơ chất của nó sẽ nảy sinh hai vấn đề. Thứ nhất là khả năng có
những phản ứng toả nhiệt cao dẫn tói việc làm nóng quá mức dòng dung
dịch lỏng. Thứ hai là cố khả năng xung quanh các hạt enzym hình
thành lớp dung dịch không được khuấy trộn, làm giảm hiệu suất của
thiết bị phản ứng. c ả hai vân để nêu trên dểu có thể khắc phục được
bằng cách gia tăng tốc độ dòng chảy qua thiết bị phản ứng. Nhưng khi
dó thời gian qua cột của hỗn hđp phản ứng lại bị giảm và như vậy làm
giảm mức độ biến đổi cơ chất.
Để khắc phục nhược điểm trên, bắt buộc hoặc phải sử dụng thiết bị
phản ứng có kích thước lớn, hoặc sử dạng một loạt các thiết bị phản ứng
nốì tiếp nhau. Tuy nhiên cách giải quyết này không có lợi về m ặt kinh tế
vì giá thành của bản thân thiết bị phản ứng, enzym và chất mang
polyme đều cao. Một phương án khác cho phép gia tãng thời gian tồn tại

141
hữu ích của hỗn hợp phản ứng trong cột với chi phí bổ sung không lớn
mà vẫn đảm bảo tốc độ dòng chảy của dung dịch lốn là phương pháp hồi
lưu một phần dung địch chứa sản phẩm qua thiết bị phản ứng.

4.5. SỬ DỤNG ENZYM c ố ĐỊNH TRONG CÔNG NGHIỆP VÀ Y HỌC

Ngày nay enzym cố định đã cho phép tạo ra một số công nghệ hoàn
toàn mới trong thực phẩm và dược phẩm.
Trong y học có thể sử dụng enzym cố định trong việc tạo ra các nội
quan giả hoặc sử dụng dưới dạng vi nang (microcapsul) để đưa enzym
vào cơ thể chữa bệnh thiếu enzym và không gây phản ứng miễn dịch. Có
thể dùng enzym không hoà tan để nghiên cứu cấu trúc phân tử protein,
để tạo ra các màng enzym không tan ngoài tế bào,... Đặc biệt, việc
nghiên cứu về màng enzym liên kết với thành phần cấu tạo của màng tế
bào, mô hình hoá được hệ thông enzym trong tế bào.
Để sử dụng trong công nghiệp, có thể cho enzym không tan vào bể
chứa hoặc các cột và cho nguyên liệu đi qua liên tục. Ví dụ: Nakhapetian
(1976) cho dung dịch tinh bột 35% liên tục đi qua cột có chứa
glucoamylaza không tan để đường hoá nó, Sau 22,6 ngày ở 45°c, hoạt độ
của enzym trong cột vẫn còn 50% hoạt độ ban đầu. Theo Beekorn (1972),
ở Mỹ, chỉ cần khoảng 500 cột glucoamylaza cho cả nước Mỹ. Một số’chế
phẩm enzym không tan khác cũng đã có thể dùng trong kỹ nghệ thực
phẩm như: Các enzym như catalaza để khử trùng sữa bằng H20 2,
xenlulaza để sản xuất glucoza, glucoza—isomeraza, glucooxydaza-catalaza
để sản xuất axit glucomic, pectinaza để làm trong nưóe quả,...
Ngoài các hướng trên, enzym cô" định còn được sử dụng vào các lĩnh
vực sau (bảng 4.6):
“ Sản xuất hỗn hợp glucoza - fructoza (42 - 55%) sử dụng glucoza -
isomeraza cô' định.
- Phân tách hỗn hợp D, L - amino axit sử dụng aminoaxylaza cố định.
- Sần xuất các loại D - amino axit nhờ sử dụng hydantoinaza cố định.
- Tổng hợp L - aspartic axit nhờ sử đụng tế bào cố định chứa
aspactaza.
- Tổng hợp íumaric axit nhờ sỏ dụng tế bào cố định chứa fumaraza.
- Sản xuất axit 6 - amino penixilinic nhờ sử dụng penixilin - amidaza
Lố dịnh.

142
 Bảng 4.6. Các quá trình cõng nghệ sử đụng enzym cố đinh
Tên hãng Loại enzym cố định
sử dụng GI AA A F PA L GA 1 c H
Anheuserr Bush +
Clinton Corn +
Car Mỹ +
Corning + 0 + 0 0
Denki Cagasu 0
Diamond Shamrock 0
Gist Brocades + 0 0 0
Gulf Oil 0
Hameen Peruna +
!C1 +
Novo +
Snam pgogetti + 0 Ũ + + 0 0 +
Sanmatsu +
Tanabe Seiyaku + + + +
Valio 0
Bộ Y tế Nga +

Ký hiệu: +: s ả n xuất công nghiệp; 0: sả n xuất thử nghiệm (pilot); GI: Glucoza -
isomeraza; L: Lactaza; AA: Aminoaxylaza; GA: Glucoamilaza; A: Aspartaza; I: Invertaza;
F: Fumaraza; C: Xenlulaza; PA: penixilin amidaza; H: Hydantoinaza.

4.5.1. Sử dụng Aminoaxylaza cố định để sản xuất L - amino axit

Các quá trình công nghiệp sản xuất L - amino axit bằng enzym
aminoaxylaza hoà tan được bắt đầu từ năm 1954. Tuy nhiên, không như
các quá trình theo mẻ với ervzym hoà tan, các quy trình này có nhược
điểm như giá nhân công cao, tách chiết sản phẩm khó khăn, hiệu suất
thấp, giá thành enzym cao và không tái sử đụng được enzym.
H _ H _
R' N COOH Aminoaxylaza R'v OH R '^ N. COQH H;N COOH
Y Ỵ * H,o — - - » Ỵ “ Y T - Y
OR o OR R
Axil axyl-DL-amìn NưâcAxit cacboxylic

A Kẽt lẳrig I

Hình 4.17. Sản xuất L - amino axit bằng xúc tác nhờ aminoaxylaza
Trong quá trình tống hdp hoá học thường thu nhận được hỗn hợp
axyl -DL - amino axit, hỗn hợp này được xử lý bằng aminoaxylaza cố
định (hình 4.17). Aminoaxylaza cố định chỉ thuỷ giải axyl - L - isome cho

143
phép nhận được dạng L —amino axit. Axyl —D —amino axit nhò đun
nóng và quá trình trên lại được lặp lại. Công nghệ sản xuất này lần đầu
tiên được hăng TANABE SEIZAKU Nhật Bản sử dụng vào năm 1969,
trong đó aminoaxylaza được cô định trên DEAE - sephadex thông qua
các liên kết ion với thòi gian bán huỷ là 65 ngày ỏ 50°c. Phương pháp cố’
định tương đôì đơn giản: 100 —1.700 lít dung dịch enzym lắc đều trong
10 giờ ở 35°c, pH = 7,0, sau đó lọc và rửa sạch, số’lượng hoạt tính enzym
sau khi gắn bằng việc được tái sinh với enzym mới: cứ như vậy có thể sử
dụng 8 năm mối phải thay chất mang mới (hình 4.17). Quy trình này
được xem là quy trình đầu tiên sử dụng enzym cố định trong sản xuất ở
cấp độ công nghiệp hoàn chỉnh với ưu điểm quan trọng nhất là phương
pháp đơn giản và dễ kiểm soát.

Hlnh 4.18. Sỡ đồ sản xuất L - amino axit của hãng TANABE SEIZAKU

Phản ứng trong thiết bị phản ứng sinh học xảy ra ồ pH 7,0 ở 50°c có
bể sung thêm Õ.IO^M Co, vận tốc dòng chảy từ trên xuống 2.000 líơgiờ,
dung tích của thiết bị phản ứng sính học là lm 3. Ví dụ: trong quá trình
thu nhận methionin nồng độ ban đầu của hỗn hợp axetyl - DH -
methionin là 0,2 mol. Sau khi chạy qua cột phản ứng thu được 200 lít
hỗn hợp, sau khi cho bay hơi và kết tinh thu được 27kg L - methionin
(91% thu hồi theo lý thuyết), dịch chứa axetyl —D - methionin được xử
lý, ở 60°c với axetic alhydrit (quá trình racemat hoá), sau đó chỉnh pH
tiến 1,8 để thu hồi Axetyl - LD -methionin.
Quá trình tương tự được hãng SNAM PROTETTI (Ý) ứng dụng dựa
trên cơ sở cố định enzym aminoaxylaza trong sợi triaxetat xenlul'oza, chế
phẩm này hoạt động liên tục 50 ngày chỉ mất 25 - 30% hoạt tính. Trong
quá trình săn xuất tryptophan, lkg enzym cổ định cho phép sản xuất
dược 400 kg L —tryptophan.

144
 Với quy trình công nghệ mói sử dụng aminoaxylaza cố định, hiện
nay hãng TANABE SEIZAKU sản xuât khoảng 700 - 1.000kg L - amino
axit/ngày với chi phí sản xuất chỉ bằng 60% so với quy trình cũ sử dụng
enzym tan.
4.5.2. Sản xuất axỉt L - aspartic bằng enzym aspartaza cố định
Enzym aspartaza xúc tác cho quá trình tạo liên kết đồng hoá trị
giữa NHa và fumaric axit. Từ năm 1973, hãng TANABE SEIZAKU đã sử
dụng tế bào cố định có chứa aspartaza trong polyacrylamit gel vói bán
chu kỳ hoạt động là 120 ngày ở 37°c. Phương pháp cố định như sau:
lữkg tế bào hoà trong 40 lít dung dịch sinh lý, thêm 7,5kg acrylamit,
0,4kg bis acrylamit, 5 lít 5% dimethylaminopronìtril và 5 lít 2,5% amon
persulphat, hỗn hợp để 40°c trong vòng 10 —12 phút, gel tạo thành được
cắt thành viên hình vuông kích thước 2 - 3mm.
Nguyên liệu ban đầu để sản xuất là fumarat amoni ở nồng độ
1 mol/lít. Phản ứng thực hiện ở pH 8,5, 37°c, vận tốc dòng chảy là
0,6 thể tích thiết bị phản ứng/giờ. Dịch sau khi qua cột được xử lý pH
xuôYig 2,8 bằng 60% H2S 0 4 ỏ 90°c, sau đó làm lạnh xuống 15ớc trong
vòng 2 giò. Tinh thể aspartic tạo thành trong quá trình đó được rửa lại
bằng nước. Vận tốc hình thành axit aspartic không phụ thuộc vào hình
dáng của thiết bị phản ứng, nhìn chung tương quan giữa đường kính cột
và chiều cao vào khoảng 4,27 X 14,49. Với cột dung tích lm 3, hãng
TANABE SEIZAKU sản xuâ't 1.700kg L - aspartic axit/ngày với chi phí
sản xuất dưới 60% so vởi công nghệ cũ.
4.5.3. Sản xuất axit L - malic bằng enzym fumaraza cố định
Malic axit được sử dụng để thay thế xitric axit trong công nghệ thực
phẩm và dược phẩm. Dưói tác dụng của fumaraza, axit fumaric được
chuyển hoá thành axit malic, phản ứng sẽ cân bằng khi chuyển hoá
khoảng 80% axit fumaric. Quy trình sản xuất axit malic trên cd sở thiết
bị phản ứng sinh học tế bào cô' định chứa fumaraza được thực hiện từ
nám 1974 ỏ hãng TANABE SEIZAKU. Tế bào được cố định trong gel
polyacrìlamit, để ức chế phản ứng phụ tạo axit sucxinic, tế bào cố định
được xử lý bằng 0,2% axit mật ồ 37°c, pH 7,5 trong vòng 20 già. Chế
phẩm thu nhận được có bán chu kỳ hoạt động là 55 ngày ở điều kiện
37°c. Cơ chất ban đầu được sử đụng là fum arat natri có nồng độ
lmol/Kt, pH 7,0 và nhiệt độ là 37°c, vận tốc dòng chảy là 0,2 thể
tícb/giờ. Hãng SNAM PROGETTI sử đụng trực tiếp fumaraza nhổt trọn
sợi Lriaxetat xenluloza, sau khi chạy qua cột malic được tách bằng
phương pháp kết tủa muôi Ca.

145
4.5.4. Sản xuất axit 6 - am inopenixilinic bằng penỉxỉlỉn amidaza
Một trong các ứng dụng chính của enzym cố’ định trong công nghiệp
dược là sản xuất axit 6 —aminopenixiliĩũc (6 - APA) bằng cách sử dụng
enzym penixilin axylaza (penixilin amidaza) để deaxyl hoá chuỗi bên
hoặc của penixilin G hay V. Trên 50% SQ iượng 6 - APA được sản xuất
hiện nay bằng cách cố định enzym. Một trong lý do chính cho thành
công này là nhận được sản phẩm tinh khiết hơn, do đố giảm thiểu được
giá thành tinh chế. Các công ty Squibb (Mỹ), Astra (Thụy Điển) và nhà
máy sinh học Riga (Liên Xô cũ) đã lặp đặt quá trình công nghiệp để sản
xuất 6 - APA vào những nãm 1970. Ngày nay, hầu hết eác công ty dược
lổn đang sử đụng công nghệ này. Nhiều hệ thống enzym cô' định đã đăng
ký độc quyền hoặc sản xuất công nghiệp penixilin axylaza bằng cách sử
dụng nhiều kỹ thuật hoặc sử dụng enzym tách chiết hoặc bằng tế bào.
Đây cũng là một trong các ứng dụng chính công nghệ enzym cô" định ở
An Độ. Bằng cách tương tự như vậy cũng đã được sử dụng để sản xuất
axit 7 — aminodeaxetoxyxephalosporanic, một chất trung gian để sản
xuât các xephalosporin bán tổng hợp.
6 - APA được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để sản xuất các
loại thuốc kháng sinh bán tổng hợp thuộc họ penixilin. Hãng SNAM
PROGETTI lần đầu tiên sử dụng enzym penixilin amidaza cô" định để
sản xuất 6 - APA vào năm 1979. Enzym penixilin amidaza cố' định xúc
tác quá trình thuỷ phân benzyl penìxilìn (penìxilin G) tạo thành 6 - APA
và axit phenylaxetic. Hiện nay, toàn bộ sô”lương 6 - APA trên thế giới
đều được sản xuất bằng phương pháp sử dụng penixilin amidaza cố định
(hình 4.19).
o
Nhu cẩu đé sản xuất 500 tấn 6APA
Để thuỷ phân penixllirt G cẩn:
Phưong pháp en^ym Phương pháp hoá học
1.000 tán penlxjlin
penlxịlin G 1.000 tấn penixỉlin G
Enzym cố định Dimethylchlorosalin arrion
45 tấn amon 300 tấn dimethylchloroaaíin
Amõn N. N- Dí methyl alanin, ~ 1 tấn enzym cố định 800 tấn N. N’-dimethylalanin,
■p* 30°c Phosphopenỉachlorid 10.000 m3
m3 nước 600 tấn phosphopentachlorid
Amon 160 tán amon
-40°c 4.200m2 dichloramethan
4200 m3 n-butanol
S CH; Để thu hổi 6-APA cán:
Axeton, amon bicacbonal Axlt hypochionlc, butylaxetat,
axeton

6-APA + Axit phenylaxetic

Hình 4.19. So sánh quy trinh sản xuất cũ (hoá học) và mái (enzym) đ ể thuỷ phân
penixilin G Ihành 6-APA.
 Ví dụ: phương pháp nhốt enzym của hãng SNAM PROGETTI: 10kg
dung dịch penixilin amidaza (pH 8,0) trộn với 5kg triaxetat xenluloza
trong 71,4g chloromethylen ở 4°c, lắc kỹ cho đến khi tạo gel và kéo sợi.
Mỗi kg thành phẩm được cố định trong các cột kích thước 43 X 14cm, 26
lít 6% penixilin G (dạng muối K) được cho chảy liên tục qua cột ở pH 8,2
cho đến khi đạt mức chuyển hoá thành 97% 6 - APA.
Công nghệ sản xuất 6 - APA của hãng TANABE SEIZAKU sử dụng
thiết bị phản ứng tế bào cô" định chứa penixilin amidaza trong gel
polyacrilamit như sau: dung dịch penixilin G nồng độ 0,05M ở pH 8,5
được cho chảy qua cột vối vận tốc 0,12 - 24 thể tích/ giò. Hiệu suất phản
ứng đạt 80%.
Sử dụng enzym cô" định không những mang lại hiệu quả kinh tế cao
do không phải sử dụng thiết bị đắt tiền, phản ứng chuyển hoá bằng
enzym ở nhiệt độ thường, không như phương pháp hoá học là ở nhiệt độ
thấp (-40°C) và không thải ra môi trường các hoá chất độc hại như
phương pháp hoá học.
4.5.5. Thuỷ giải lactoza bằng enzym lactaza cố định
Lactoza còn gọi là đường sữa cố độ ngọt và độ hoà tan kém, lactoza
được enzym lactaza thuỷ giải thành glucoza và galactoza. Sữa được xử lý
bằng enzym sẽ có chất lượng cao hơn, bởi vì một bộ phận dân số’ không
sử dụng được sữa đo hệ tiêu hoá không hấp thụ được lactoza. Quan
trọng hơn nữa là việc sử dụng lactaza để thuỷ giải lactoza trong huyết
thanh sữa (chứa 5% lactoza ở dạng dung dịch và gần 75% ở dạng khô)
không nhũng mang lại một nguồn nguyên liệu mới mà còn giải quyết
được vấn đề ô nhiễm môi trưòng ở các nhà máy sữa do hầu hết lượng
huyết thanh sữa không được sử dụng gây ra.
Để thuỷ giải lactoza trong sữa, hãng SNAM PROGETTI sử dụng bio
thiết bị phản ứng có đung tích 20 lít chứa 4kg enzym lactaza cố định
trong sợi axetat xenluloza, trưóc tiên sữa được khử trùng (142°s, 3 giây),
sau đố làm lạnh nhanh đến 4 - 7°c và cho chảy qua bio thiết bị phản
ứng với vận tốc 7 líưphút, sản phẩm có thể bảo quản ít nhất 3 - 4 tháng
ở 4°c. Hiện nay hàng ngày, hãng sản xuất khoảng 10 tấn sữa không có
lactoza.
Từ năm 1978, hãng CORNING GLASS cũng đã bắt đầu sử dụng
enzym lactaza cô' định bằng liên kết đồng hoá trị vối các hạt silicagel để
xử lý lactoza trong huyết thanh sữa với công suất 30 tấn/ngày.

147
 Bảng 4.17 cho biết một sô" chế phẩm lactaza cô” định thương mại,
được sản xuất chủ yếu từ lactaza nấm mốc và nấm men.
Bảng 4.17. Các chế phẩm lactaza cố định đã thương mại hoá
Hăng Nguõn enzym Quy trình c ố định

Gist Brocades Saccharomyces Enzym được bẫy vào trong sợi triaxetat
lactis xenluloza.
Snamprogetti Kluyveromyces Enzym được bẫy vào trong sợi triaxetat
lactis xenluloza.
Corning Glass Works Aspergillus niger Enzym liên kết đổng hoá trị với hạt silica.
Valio Laboratory A. niger Enzym bị hấp phụ/liên kết chéo với nhựa
phenol formaldehyt.
sturge A. niger Enzym liên kết cộng hoá trị với ferrit Mn -
Zn được silanal hoá.
Rorhn GmbH A. oryzae Enzym liên kết cộng hoá trị với hạt thuỷ tinh
plaxi mao quản lớn.
Sumitomo A. oryzae Enzym liên kết cộng hoá trị với nhựa trao
đổi ion dị hình mao quản lớn.
Amerace Corp. A . oryzae Enzym liên kết cộng hoá trị với bản PVC -
silica mao quản lớn.

CÂU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG 4

1. Hãy nêu những ưu điểm chính của phương pháp cố đính enzym hay
tế bào lên chất mang so phương pháp xúc tác enzym tự do.
2. Hãy nêu và giải thích nguyên tắc chính và minh họa của các phương
pháp cố định enzym thường dược sử dụng hiện nay.
3. Hãy nêu sd đồ các công đoạn chủ yếu để cô" định enzym lên chất
mang và ví dụ ứng dụng mà em quan tâm nhâ't.
4. Hãy nêu cụ thể phương pháp hấp phụ enzym lên chất mang, ưu,
nhược điểm chính và ứng dụng cụ thể của phương pháp này.
5. Hãy nêu cụ thể phương pháp liên kết chéo với chất mang, ưu, nhược
điểm chính và ứng đụng cụ thể của phương pháp này.
6. Hãy nêu cụ thể phương pháp bẫy enzym vói chất mang. Ưu, nhược
điểm chính và ứng dụng cụ thể của phương pháp này.

148
7. Hay nêu cụ thể phương pháp bao gói enzym với chất mang. Ưu,
nhược điểm chính và ứng dụng cụ thể của phương pháp này.
8. Hăy nêu cụ thổ phương pháp liên kết cộng hoá trị enzym với chất mang.
Ưu, nhược điểm chính và ứng dựng cụ thể của phương pháp này.
9. Hoạt hoá enzym cô" định lên chất mang chịu ảnh hưởng của những
yếu tố chủ yếu nào cần quan tâm nhất? Động học phản ứng enzym
chịu tác động ra sao?
10. Hãy minh họa một số loại thiết bị và nguyên tắc chính của nó được
dùng đế’ cố”định enzym hiện nay.
11. Hãy nêu một sô' ứng dụng chính của phương pháp cổ”định enzym
hay gặp nhất hiện nay để tạo ra những sản phẩm mong muôn và
lĩnh vực nào bạn quan tâm nhất? Vì sao?

149
 Chương 5
GIỚI THIỆU MỘT SỐ ENZYM CHỦ YÊU
VÀ ỨNG DỤNG

5.1. AMYLAZA
Amylaza là các enzym xúc tác thuỷ phân tinh bột và các polyoza
tương tự như dextrin, glycogen,... Các enzym chủ yếu trong nhóm này
là: a -am ylaza (a - 1,4 glucan - glucanhydrolaza); P-amylaza (a-1,4
glucan-malto-hydrolaza) và glucoamylaza (a - 1,4 glucan - glucohydrolaza).
Ngoài ra, nhiều vi sinh vật còn tạo các enzym transglucozilaza (a - 1,4 —
glycan: D - glucoza —1 - glucozil - transferaza 2.4.1,3) cùng với các amylaza.
Các enzym amylaza từ các nguồn khác nhau thì thường khác nhau
về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ
phân. Ngay cả các amylaza cùng loại do vi sinh vật tổng hợp nền cũng có
nhiều điểm khác biệt nhau về đặc tính, cơ chế tác dụng và điều kiện
hoạt động.
5.1.1. a - amylaza
a - amylaza xúc tác sự thuỷ phân liên kết a - 1,4 glucozit nội mạch
ở bất kỳ vị trí nào trong phân tử tinh bột (hình 5.1), Với cơ chất là
amyloza, a - amylaza cho sản phẩm thuỷ phân chủ yếu là maltoza (khoảng
87%) và một ít glucoza (13%). Với cơ chất là amylopectin, a - amylaza
chỉ thuỷ phân liên kết 1,4, không thuỷ phân liên kết 1,6. Sản phẩm tạo
thành là các dextrin phân tử thấp: maltoza, glucoza và izomaltoza,
không cho phản ứng màu với iot.
a - amylaza hầu như không tác dụng lên tinh bột nguyên thể và tác
dụng mạnh lên tinh bột đã hồ hoá. Quá trình thuỷ phân xảy ra qua
nhiều giai đoạn. Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hoá), chỉ một số liên
kết trong phân tử cơ chất bị thuỷ phân, tạo thành một lượng dextrin, độ
nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh, sang giai đoạn hai (giai đoạn đưòng
hoá), các dextrin vừa được tạo thành bị thuỷ phân, tiếp tục tạo ra các
dextrin phân tử thấp hơn, maltoza, izomaltoza và glucoza.
Tuy nhiên, thông thường, trong một thòi gian ngắn (30 - 60 phút),
a - amylaza chỉ thuỷ phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử
thấp và một ít đưòng maltoza, khả năng dextrin hoá cao của a - amylaza

150
là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, ngưòi ta còn gọi loại amylaza này
là amylaza dextrin hay amylaza dịch hoá.
a - amylaza của nấm mốc có thể xúc tác sự thuỷ phân tinh bột ỏ
50 — 52°c, a - amylaza của nấm hoạt động tốt ở nhiệt độ 58 - 60°C;
a —amylaza của nhiều vi khuẩn có tính bển nhiệt cao, chúng có thể giữ được
hoạt tính ồ 70 —90DC. Tính bền nhiệt của a - amylaza là do sự có mặt của
canxi trong phân tử enzym, ở đây canxi giữ vai trò ổn định cấu trúc bậc
ba của phân tử enzym. a - amylaza thường thể hiện hoạt tính trong vùng
axit yếu: a - amylaza của nấm moc hoạt động mạnh ở pH 4,5 - 4,9; của vi
khuẩn ở pH 5,9 - 6,1. Nếu pH < 3, đa sô" a - amylaza bị vô hoạt hoàn
toàn, trừ a —amylaza của Aspergillus niger có thể chịu được pH 2,5 - 2,8.
Những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp a - amylaza có ý
nghĩa công nghiệp: Bacillus subtilís, B. licheniformis, Aspergillus oryzae.
o'oo oooo ooooooooooooooooooo ooooooood
'ooooooo ooooooooo ^ boooooooooooooooò
a) 6oc>Ỹoé> Òoooooooi ỦOOO^>OOOỒ io o o o ò
ử o o ử 5 3 ỎO^OỎ ử o ở àt OOỔ ÒOOOÒ Òo õ ỏ o o ỏ
<5~ò £"2> í ỉ ó õ ỳ S h ò o ổ ©S è o ỏ <fra<5"2><írà<boó
<5"2> < ĩ i o 5 1 <ST2» o í i f & £~&o éTễ> í i éT&o

Hlnh 5.1. Các giai đoạn thuỷ phân tinh bột bỗi a. - amylaza của nấm mốc

a) Sựthuỷ phàn amyloza; b) Giai đoạn đầu thuỷ phân amylopectin;

c) Giai đoạn cuối đường hoá amylopectin.

5.1.2. p - amylaza
p - amylaza xúc tác thuỷ phân liên kết a -1,4 glucozit của phân tủ
tinh bột và các polysaccarit tương tự (hình 5.2).
Đối với các chất amyloza, p - amylaza thuỷ phân các liên kết glucozit
bắt đầu từ đầu không khử của mạch, tách dần từng phần tử maltoza ra
khỏi cơ chất với hiệu suất là 100%.
151
 Đối với các cơ chất amylopectin, p - amylaza chỉ phân cắt các liên kết
1,4 và cũng tách dần ra khỏi mạch các phân tử maltoza bắt đầu từ đầu
không khử của mạch. Sự tấn công của enzym chỉ xảy ra ở phần thẳng của
mạch và bị dừng lại ở vị trí phân nhánh, sản phẩm thu được trong trường
hợp này là maltoza (chừng 54 - 58% và các dextrin phân tử lớn).
(3 - amylaza không tác dụng lên tinh bột nguyên thể, chỉ tác dạng
lên tinh bột đã hồ hoá. Khác với a - amylaza, p - amylaza vẫn giữ được
hoạt tính khi không có canxi.
p - amylaza kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao và bị vô hoạt
hoàn toàn ỏ 70°c, song trong dịch nâu, nhiệt độ tối thích lại là 60 - 65°c,
p -am ylaza khá bền trong môi trường axit, ngay ỏ pH 3 - 4 . Đa sô'
p - amylaza hoạt động mạnh hơn trong môi trường có pH 4,5 - 5.

Hình 5.2. Tác động của p - amylaza lên tinh bột

a) Sự tác động lên amyloza; b) Sự thuỳ phân các nhánh ngoài của amyíopectin
(phần bên trong đường chấm là (1—dextrin).

5.1.3. Glucoamylaza

Enzym này xúc tác thuỷ phân các liên kết a - 1,4 và cả 1,6 glucozit
của phân tử tinh bột và các polysaccarit khác tương tự.
Sự thuỷ phân các cđ chất dưói tác dụng của glucoamylaza tiến hành
tuần tự ỏ từng liên kết một, bắt đầu từ đầu không khử của mạch, tách
đẳn từng phân tủ của glucoza, glucoamylaza cũng có khả năng thuỷ
phân cả maltoza, izomaltoza và dextrin.
Đa số glucoamylaza đã biết đểu thuộc loại enzym "axit", thể hiện
hoạt lực tôi đa ở vùng pH 3,5 — 5. Nhiệt độ hoạt động tôi thích của
152
glucoamylaza là 50 —60°c. Hầu hết các glucoamylaza bị m ất hoạt tính
khi đun nóng trên 70°c. Những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng
hợp glucoamylaza có ý nghĩa công nghiệp: nấm môc: Aspergillus, Rhizopus,
Asp. awamori, Asp. niger, nấm men: Endomycopsis.
5.1.4. Transglucozilaza

ơ nhiều loại nấm mốc, transglucozilaza luôn luôn là "người bạn

đồng hành chí cốt" của glucoamylaza. Nó có cả hoạt tính trans - feraza
]ẫn hoạt tính thuỷ phân. Vì thế, sự có mặt của nó trong dung dịch
thưòng gây nên những nhầm lẫn về sự tồn tại của glucoamylaza.
Transglueozilaza thực hiện việc chuyển các gốc glucozil sang các mono-,
d i- và oligosaccarit, xúc tác sự tạo thành các liên kết a - 1,4 và a - 1,6
glucozit, Pzur (1961) đã tách được enzym này từ Asperhiỉỉus niger bằng
phương pháp sác ký hấp phụ trên DEDA - xenluloza và cho biết cd chế
tác dụng của nó. Transglucozilaza không những chỉ thuỷ phân maltoza
thành glucoza mà còn tổng hỢp izomaltoza, izotrioza và panoza, tức là
có khẩ nàng chuyển gốc glueoza và gắn nó vào phân tử maltoza hoặc
phân tử glucoza khác bằng liên kết a - 1,6 để tạo thành panoza hoặc
izomaltoza.
Rodzevit và Butova (1965) tìm thấy trong canh trường các nấm mốc
Aspergillus niger, A oryzae và A. awamori có glucoziltransferaza, đồng
thời cho biết rằng enzym này xúc tác sự tổng hdp các oligosaccarit vâi
các liên kết a - 1,4 và a - 1,6 glucozit từ maltoza. Các tác giả cho rằng,
trong các vi sinh vật trôn có hai hệ transglucozilaza. Một hệ tổng hợp
các sản phẩm có liên kết a - 1,4 glucozit kiểu maltoza và chuyển các gốc
glucoza từ maltoza tói vị trí c thử 4 của gốc glucoza cuối: n - maltoza -
(1,4 - a - glucoza)n + n - glucoza. Một hệ chuyển các số gốc glucoza tâi vị
trí c thứ 6 khi tổng hợp các sản phẩm kiểu izomaltoza: n - maltoza -
(1,6 - glucoza)n + n - glucoza.
IIỘ thứ nhất bền ỏ pH 8,5, còn hệ Lhứ hai thì vô hoạt hoàn toàn ở pH
này trong 2 giờ. ở pH 3,3, trong thòi gian 1 giờ, hoạt lực transglucozilaza
của cả hai hệ đều không thay đổi. Transglucozilaza của nấm mốc bị vô
hoạt hoàn toàn ở pH 1,9 - 2,0 sau 24 giờ.
Các chủng nấm mốc khác nhau thì khác biệt về hoạt lực
Lransglueozilaza (Buger, 1956). Các loài Rhizopus có ưu thế hơn các loài
Aspergillus là không tạo ra transglucozilaza.
Sự có m ặt của transglucozilaza trong các chế phẩm amylaza (dừng

153
trong công nghiệp mật tinh bột, đưòng glucoza, công nghiệp rượu,...) là
điều không mong muôn. Glucoamylaza xúc tiên sự thuỷ phân tinh bột,
còn transglucozilaza lại tổng hợp các izosaccarit từ các sản phẩm thuỷ
phân này, do đó làm giảm bớt mức độ thuỷ phân sâu sắc tinh bột và làm
cho dịch thuỷ phân có vị đắng.

5.2. PR0TEA2A
Proteaza là các enzym xúc tốc sự thuỷ phân liên kết peptit (CO - NH)
trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.

H2N - ch - co “ NH-CH-CO -C H - COOH

I I I
Rj Rg R3

+H20
--- — »H2N - CH - c o -N H —CH - co ... NH —CH —COOH
I I I
K] R2 R3

Nhiều proteaza cũng có khả náng thuỷ phân liên kết este và vận
chuyển amino axit (CO - OH).
Theo phân loại quốc tế, các enzym thuộc nhóm này chia thành
4 phân nhóm phụ:
a) A m in o p ep tid a za ; xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptit ỏ đầu
nitơ của mạch polypeptit.
b) C acboxypeptidaza: xúc tác thuỷ phân liên kết peptit ở đầu
cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzym trên đều là có exo
-peptidaza.
c) D ip ep tih ydrolaza: xúc tác sự thuỷ phân các liên kết dipeptit.
đ) P roteinaza: xúc tác sự thuỷ phâĩi các liên kết nội mạch.
So với proteaza động vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có
những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ proteaza vi sinh vật là một hệ
thông rấ t phức tạp bao gồm nhiều enzym rấ t giống nhau vể cấu trúc,
khôi lượng và hình dạng phân tử nên rấ t khó tách ra dưới dạng tinh
thể đồng nhất.
Cũng đo là phức hệ gồm nhiều enzym khác nhau nên proteaza vi
sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt
để và đa dạng.

154
 Người ta cũng phân loại các proteaza theo vùng pH hoạt động tối
thích proteaza axit, trung tính và kiềm tính. Tuy nhiên, sự phân loại
này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động
tối thích của mỗi enzym còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiểu
yếu tô" khốc nữa.
Nguồn thu proteaza vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ
khuẩn. Trong số các vi khuẩn, cốc loài có khả năng tổng hợp mạnh
proteaza là: Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermoproteoliticus và
một sô" thuộc giống Clostridium. Các vi khuẩn thường tổng hợp các
proteaza hoạt động thích hợp ỏ vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các
proteaza được sản xuất từ vi khuẩn được biết nhiểu hdn cả là: Subtilizin
A (mã số s .4.4.16), Subtilizin B và Subtilizin c.
Nhiều loại nấm mổc có khả năng tổng hợp một lượng lớn proteaza
được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng thuộc các loài:
Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium
chrysogenum,,,, Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả ba loại
proteaza: axit, kiềm và trung tính. Tỷ lệ cấu tử enzym có thể thay đổi
tuỳ theo thành phần môi trường nuồi. Ví dụ; A. oryzae nuôi trong điều
kiện bình thường sinh tổng hợp chủ yếu proteaza tính kiềm; còn trong
môi trưồng giảm gluxit thì chủ yếu tạo thành proteaza tính axit.
Các nấm mốc đen có khả năng tổng hợp chủ yếu các proteaza tính
axit, có khả năng thuỷ phân protein ở pH 2,5 - 3.
Một số nấm mốc khác như Aspergillus candidatus, Penicillỉum
cameberti, p. roqueforti,... cũng có khả năng tổng hợp các proteaza có
khả năng đông tụ sữa, được sử dụng trong sản xuất phomat.
Về phương diện tổng hợp proteaza, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn
vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta đã tìm được một sô' chủng có
khả năng tổng hợp proteaza cao như: Streptomyces griceus, s. fradiae,
s. rimosus,...
Các chế phẩm proteaza từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronaza
(Nhật Bản) được tách từ Streptomyces griseus, enzym này có tính đặc
hiệu rộng, có khả năng thuỷ phân tới 90% liên kết peptit của nhiều
protein tới amino axit. ở Liên Xô, người ta cũng tách được chế phẩm
tương tự từ Streptomyces griseus có tên là protelin.
Từ Streptomyces fradiae cũng đã tách được keratinaza, thuỷ phân
keratin, ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M - Xim dùng trong sản
xuất da. Proteaza từ Streptomyces fradiae cũng có hoạt tính elastaza cao,
do đó được dùng trong công nghiệp thịt.

155
 Cũng như amylaza, proteaza được sử dụng rộng rãi trong nhiều
ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược,
nông nghiệp,...
Trong công nghiệp thịt, proteaza được dùng để làm mềm thịt nhò sự
thuỷ phân một phần protein trong thịt, kết quả là làm cho thịt có một độ
mềm thích hợp và có vị tốt hơn.
Proteaza được dùng trong kỹ nghệ sản xuất thịt thường là proteaza
thực vật (papain, bromelin, ficin) và enzym vi sinh vật (từ nấm mốc, xạ
khuẩn). Các chế phẩm thường dùng là papain hoặc papain lẫn với
proteaza vi sinh vật.
Phương pháp làm mềm thịt nhờ tác dụng của proteaza cho phép
nâng cao chất lượng thịt đưa vào chế biến, làm tăng tỷ lệ thịt, có thể đưa
vào sản xuất và rú t ngắn thời gian chín của thịt nhiều lần.
Trong công nghiệp sữa, proteaza được dùng để sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Để làm đông tụ sữa có thể dùng
renin, pepsin hoặc một số proteaza vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ
sữa được tách từ nấm mốíc và vi khuẩn. Trong sô" các enzym này, renin
là enzym có giá trị đặc biệt, cho phép thu được sản phẩm có chất lượng
cao nhất, còn các proteaza vi sinh vật thì ngoài khả năng đông tụ sữa
còn có khả năng thuỷ phân sâu sắc cazein, gây ảnh hưởng xấu đến mùi
vị của phomat. Vì vậy, ngưòi ta thường chọn các chủng vi sinh vật cho
phép thu proteaza có tính châ't tương tự rennin, hoặc chỉ thay thế một
phần renin (chừng 25 - 50%) bằng proteaza vi sinh vật. Proteaza từ một
sô vi sinh vật như Aspergillus candidus, Penicillium roqueforti, Bacillus
mesentericus,... đã đưdc dùng trong thực tế sản xuất phomat.
Trong công nghiệp da, proteaza được sử dụng với mục đích tách lông
trên da và làm mềm da nhờ sự thuỷ phân một phẫn protein của da, chủ
yếu là một số liên kết của colagen là thành phần chính làm cho da bị
cứng. Kết quả của sự làm mềm là loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm
cho da có độ mổm dẻo nhất định, tính chất đó đưđc hoàn thiện hơn sau
khi thuộc da.
lYưốc đây đổ làm mềm đa, người ta đùng proteầza khu trú trong cơ
quan tiến hoá của dộng vật. Hiện nay, việc đưa cấc proteaza tách từ vi
khuẩn (Bacillus mesentericus, B. subtiỉis), nấm mốc (Aspergillns oyae,
A. flavus) và xạ khuẩn (Streptomyces fradiae, s. griseus, s. rỉmosus,...) vào
rông nghiệp da đã dem lại nhiều kôt quả và dần chiếm một vị trí quan trọng.
So với phương pháp cũ trước đầy, phương pháp xử lý da bằng
proleaza vi sinh vật có nhiều ưu điểm như:
156
 - Cho phép rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông tới một vài lần.
- Nâng cao hiệu suất lông được tách ra từ 20 - 25% do không bị tổn
thất trong quá trình xử lý hoá học tiếp theo, vì rằng các chât béo cũng
đồng thời được loại khỏi lông nhờ tác dụng của lipaza trong canh trưòng.
- Đem lại hiệu quả kinh tế cao vì có thể sử dụng trực tiếp nước chiết
canh trường không cần tinh chế, do đó giá thành hạ, kỹ thuật sản xuất
dơn giản.
Ngoài ra, proteaza còn được dùng rộng rãi trong rấ t nhiều ngành
khác như:
- Điều chế các dịch đạm thuỷ phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất
tăng vị trong thực phẩm và bổ sung cho thức ăn gia súc.
- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vacxin,
kháng sinh,...
- Sản xuất keo động vật, bột giặt tổng hợp để giặt các chất bẩn
protein, sản xuất mỹ phẩm,...
- Tách keo xerixin của tơ tằm, khử hồ có bản chất protein trên một
sô"hàng dệt,...

5.3. PECTINA2A
Pectinaza là nhóm enzym xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin
thành các hợp phần khác nhau. Các pentinaza được chia thành hai
nhóm chủ yếu:
a) P ectim etylesteraza (còn có tên pectinhydrolaza, mã số EC
3.1.1.11) là các enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết este trong phân tử
pectin hoặc axit pectinic (các axit polygalacturonic được este hoá nhà
rượu metylic ở mức thấp) khi toàn bộ các nhóm metoxyl đều bị tách ra
khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là metanol và các axit
polygalacturonic. Sự thuỷ phân chỉ xảy ra ở liên kết este liền kề vói
nhóm cacboxyl tự do.
Như vậy sô' liên kết este trong phân tử pectin và axit pectinic có thể
bị thuỷ phân hoàn toàn hoặc một phần.
b) Polygalacturonaza (còn có tên polygalacturonit - glucanohydrolaza,
mã sô' EC 3.2.1.1.5) là các enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết 1,4
glucozit trong phân tử pectin. Có nhiều polygalacturonaza có tính đặc
hiệu rất khác nhau:
- Polymetyl galacturonaza tác dụng chủ yếu lên các este metylic
của các axit polygalacturonic. Các enzym này được chia thành hai nhóm

157
nhỏ tuỳ theo vị trí liên kết glucozit bị cắt đứt dưới sự xúc tác của enzym
ở đầu hay giữa mạch như:

* 3 COOH
COOH COOCH 1 3 COOCH
COOCH i 3

Sơ đồ tác động của pectimetylesteraza lên hợp chất pectin

— Endo - glucozidaza + polymetylgalacturonaza I: xúc tác sự thuỷ
phân các liên kết glucozit nội mạch của các phân tủ axit polygalacturonic
được este hoá ỏ mức độ cao. Hoạt tính của enzym này bị giảm khi có mặt
enzym pectinesteraza trong môi trường.
COQH COOCH3ịCịOOCH3ịCOOCH3 COOH COOCH3ịCOOH COOCH3

Sơ đồ tác động của endo - glucozidaza + pectimetylesteraza I

lên hợp chất pectin
- Exo - glucozidaza + polymetylgalacturonaza III: xúc tác sự thuỷ
phân các liên kết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc axit glacturonic
ra khỏi phân tử pectin, bắt đầu từ đầu không khử. Enzym này có ái lực
với gốc axit galacturonic đã metoxyl hoá.
COOCH3 ịcị!OOCH3 ^QOCH3 COOCH3 COQCH3

Sơ đồ tác động của exo —glucozidaza + polymetylgalacturonaza III

lên hợp chất pectin
- Poly galacturonaza là các enzym tác dụng chủ yếu lên các axit
pectic (các axit polygalacturonic không bị este hoá) và axit pectinic (các
axit polygalacturonic bị este hoá ở mức độ thấp). Các enzym này cũng
được chia thành hai nhóm tuỳ từng vị trí liên kết glucozit bị cắt đứt:
+ Endo —glucozidaza + polygalacturonaza II xúc tác sự thuỷ phân
các liên kết glucozit ỏ giữa thành mạch của các phân tử axit pectic hoặc
axit pectinic, các enzym này tác dụng ỏ vị trí liên kết đầu nhổm cacboxyl
tự do. Sự thuỷ phân cơ chất dưới tác dụng của endo - glucozidaza -
polvgalacturonaza II xảy ra mạnh hơn khi nguyên liệu đã được xử lý
trước với pectinesteraza.
CQOH COQH (jOQCH3 CQOHị CQOH COOCH3 COOH

Sơ đồ tác động của endo - glucozidaza + polygalacturonaza II

lên axỉt pectinic

158
 COOHI COOH COOCH3 COOH COOH COOCH3 COOH
-I *1______ I______ I I_____ I I
Sơ đồ tác động của exo —glucozidaza + polygalacturonaza IV
lên axit pectinic
+ Exo —glucozidaza + polygalacturonaza IV xúc tác sự thuỷ phân
các liên kết glucozit ở đầu mạch của phân tử axit pectic hoặc axit
pectinic. Enzym này có ái lực với các liên kết glucozit đầu mạch gần với
nhóm cacboxyl tự do.
Các enzym thuỷ phân pectin có tính bền vói nhiệt và pH hoạt dộng
tối thích khác nhau. Các exo - polygalacturonaza của Aspergillus awamori
16 hoạt động mạnh ở pH 3,5: các endo —polymetygalacturonaza hoạt động
mạnh ở pH 4,2; còn pectinesteraza chỉ hoạt động mạnh ở pH 5. Nhiệt độ
hoạt động tối thích của các enzym này trong khoảng 45 - 52uc.

Ngoài các enzym chủ yếu kể trên, tham gia sự phân giải các hợp
chất pectin còn có: Protopectinaza xúc tác sự phân giải protopectin không
tan thành pectin hoà tan và transemilinaza xúc tác sự phân cắt các hdp
chất pectin bằng con đường khác con đường thuỷ phân tạo thành
galacturonit mạch ngắn hơn vối liên kết kép ỏ giữa nguyên tử cacbon 8ố
4 và số’5.
Tuy nhiên cho đến nay, ngưòi ta vẫn chưa biết được rõ ràng về cơ
chế tác dụng, tính chất và đặc biệt là về cấu trúc của các enzym này.
Thực vật thượng đẳng và vi sinh vật có khả năng tổng hợp pectinaza.
Các chế phẩm pectinaza thường được tách từ canh trưòng nuôi cấy
AzargiUus niger, A. awamori; một số chủng của Penicỉỉlium, Rhizipus
và một sô' vi khuẩn và nếm men cũng có khả năng sinh tổng hợp mạnh
pectinaza.
Trong công nghiệp, pectinaza được ứng dụng để phân giải pectin
nhằm nâng cao hiệu suất ép, lọc nưóc quả, chiết được liệu, làm trong
rượu vang và nưổc quả.
Ngoài amylaza, proteaza và pectinaza là những enzym được dùng
nhiều, các enzym khác cũng được ứng dụng phô bien trong sản xuất như
xenlulaza, saccaraza, glucooxydaza,...

159
5.4. XENLULAZA
Xenlulaza là một loại homopolyme của p —D - glucoza. Các gốc
p - D - glucoza được nôi với nhau qua liên kết p —D — 1,4 glucoza.
Mức độ polyme hoá của phân tử xenluloza thay đổi nhiều (từ vài trăm
đến 15.000, trung bình là 3.000).
Tuỳ theo từng loại thực vật mà các phân tử xenluloza có khôi lượng
phân tử khác nhau rất nhiều (từ 50.000 đến 2.500.000).

( 1) (2)

.0

5.3. câ'u tạo của p h in tửxenluloza

(1) Gốc p - glucoza binh thuởng; (2) Gốc p - glucoza â dạng cấu trúc không gian
binh thường; (3) Một đoạn phân tửxenluloza với 3 gốc p - glucoza.

Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen, người ta biết rằng
xenluloza có cấu tạo sđi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi
là các microfibrin có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những phần
dặc (phần kềt tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình).
Các sợi microfibrin có chiều rộng khoảng 100 —300Ả(1 Â = icr7mm)
và chiều dày khoảng 40 —100Ẳ (Colovalov, 1972). Chiểu dài của một
phân tử xenluloza tự nhiên thường lớn hơn hàng chục lần so với chiều
dài của một phần kết tinh (Cristalite).
Xenluloza là một trong những hợp chất tự nhiên khá bển vững. Nó
không tan trong nước mà có thổ bị trương lên do hấp thụ nưóc. Xenluloza
bị phân huỷ khi đun nóng với axit hoậc kiềm ở nhiệt độ 40 - 50°c nhò các
enzym phân huỷ xenlulaza.
Trong tế bào thực vật, xenluloza liên kết chặt chẽ vói hemixenluloza
(mộL loại hetepolyme chứa nhiều loại monosaccarit như galactoza,
160
manoza, glucoza, xitoza, arabinoza,...), vối pectin (hợp chất polyme của
axit D -galacturonic), với lignin (homopolyme của N - axetylglucozamin).
Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phân huỷ xenluloza mới tồn tại
trong trạng thái một polyme gần tinh khiết.
Xenlulaza là một hệ enzym phức tạp xúc tác sự thuỷ phân xenluloza
thành xenlobioza và cuối cùng thành glucoza. Sự phân giải xenluloza
dưối tác dụng của hệ enzym xenlulaza theo ba giai đoạn chủ yếu sau:
- Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân Cj,
xenluloza nguyên thể chuyển thành xenluloza hoà tan. Người ta cho
rằng, tác nhân Ci gây ra sự biến đổi xenluloza trong giai đoạn nảy
không phải là enzym mà là bao gồm một sô' tác nhân nào đó đặc trưng
của môi trường có vi sinh vật phát triển. Thực chất về vấn đề này cho
đến nay vẫn chưa được giải thích rõ,
- Trong giai đoạn thứ hai, xenluloza (đã biến đổi sau giai đoạn 1) bị
thuỷ phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzym thuỷ phân Cx tạo thành
đưồng xenlobioza. Enzym c„ còn gọi là enzym p -1,4 - glucanaza. Chữ X có
nghĩa đây là loại enzym có nhiều thành phần khác nhau. Ngưòi ta thưòng
chia thành hai loại: Exo - p -1,4 -glucanaza và Endo - p - 1,4 - glucanaza.
+ Exo - p - 1,4 - glucanaza xúc tác việc tách ra một cách liên tiếp các
dơn vị glucoza từ đầu không khử (non - reducing end) của chuỗi xenluloza.
+ Endo - p -1,4 glucanaza có khả năng phân cắt liên kết p - 1,4
glucozit ở bất kỳ chỗ nào bên trong chuỗi xenluloza phân tử.
Các tác giả Ogawa và Toyama (1967) cho rằng, còn có một enzyrrv-
khác có tác dụng trung gian giữa C] và c*, đó là enzym C2. Enzym này
tác dụng vào các xenlodextrin hoà tan. Enzym Cx sẽ tiếp tục thuỷ phân
các loại xenlodextrin này thành xenlobioza.
Để xác định hoạt tính enzym c,, người ta thường sử dụng các loại
xenluloza tự nhiên (nhất là sợi bông thấm nước), còn để xốc định'hoạt
tính enzym Cx ngưồi ta thường sử dụng CMC (cacboxylmetyl - xenluloza)
hay HEC (hydroxyetyl - xenluloza).
- ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzym xenlobioza
(p - glucozidaza), đường xenlobioza bị thuỷ phân thành glucoza.
Enzym p - glucozidaza là những enzym rất đặc hiệu, p - glucozidaza
thuỷ phân xenlobioza thành xenlohexoza (D - glucoza). Theo danh pháp
enzym quốc tế thì endo - [3-1,4 - glucanaza có mã sô': E.c.3.2.1.4; còn
p - glucozidaza có mã số: E.c.3.2.1.21. Enzym exo —p —1,4 glucanaza
đôi khi cũng được xếp vào loại E .c.3.2.1.21 nhưng đúng ra cần có một vị
trí khác (King Vessel, 1969).

161
 Enzym xenlulaza thưòng được tổng hợp mạnh mẽ ở các giống nấm
mốc như Aspergillus, Penicillium, Tricoderma,... nhiều vi khuẩn và xạ
khuẩn cũng có khả năng tổng hợp xenlulaza cao.
Trong khoảng vài chục năm gần đây, nhiều nước trên thế giới đã
chú ý nghiên cứu sản xuất các chế phẩm xenlulaza nhằm mục đích sử
dựng xenluloza là loại nguyên liệu rấ t dồi dào trong thiên nhiên với hiệu
quả kinh tế cao hơn, ngưòi ta cũng dùng xenlulaza để phân giải
xenluloza nhằm mục đích khai thác các hợp chất tự nhiên nằm trong
nguyên liệu thực vật.

5.5. SACCARAZA VÀ GLUCOOXYDAZA

5.5.1. Saccaraza
Thuộc nhóm enzym này có nhiều enzym khác nhau như: invertaza,
saccaraza, levansaccaraza,... Tác dụng chủ yếu của các enzym saccaraza
là xúc tác sự thuỷ phân các liên kết glucozit của cơ chất như saccaroza
và một sô" saccarit khác. Ngoài ra trong những điểu kiện nhất định, các
enzym a -glucopiranozidaza xúc tác thuỷ phân liên kết ở phía gốc
glucozil, còn p -fructoranozidaza xúc tác sự thuỷ phân liên kết ố phía
gốc fructozil.
CHyOH

H OH
ậ-fructofuranôza.dẩza
CL-glucopiranozilaza

Trong sô' các enzym saccaraza được biết thì p - fructofuranozidaza

(p - D - fructofuranozit - fructofuranozidaza, mã sô" EC 3.2.1.26) là enzym
có ý nghĩa trong sản xuất hơn cả.
Các chế phẩm saccaraza công nghiệp thường được sản xuất từ nấm
men (Saccharomyces cerevisiae, Sacharomyces carỉsbergensìs, Sacharomyces
pasteurianus,...) và một số nấm mốc như Aspergillus oryzae, A. niger,...
Saccaraza được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để
nghịch đảo hoá đường, tránh hiện tượng kết tinh đường gây hiện tượng
sạn đường khi sản xuất bánh kẹo, mứt, nưỏc quả, rượu ngọt và m ật ong
nhân tạo,... Sự tạo thành đường nghịch đảo có tính hút ẩm cao cũng có
tác dụng ổn định, tránh hiện tượng khô cứng đối với một số’ mặt hàng
bánh kẹo, mứt quả,...

162
 I

5.5.2. Glucooxydaza
Glucooxydaza (p - D —glucoza; 0 2- oxydoreductaza, mã sô" EC 1.1.3.4)
là enzym xúc tác sự oxy hoá glucoza thành axit gluconic theo sơ đồ phản
ứng sau:

H OH H OH
(3-D-glucoza (3-D—gluconplacton
COOH
CFfeOFI H — C --OH

h o \o h
I
y I
H -J - O H
HO — C— H
I
P-D-glucono-8-laeton ... ,
Axit gluconic
Glucooxydaza được tổng hỢp ở nhiều vi sinh vật, đặc biệt là các
giống nấm mốc Penicilium (P. notatum, p. chrysogenum, p. vỉtale,...) và
Aspergillus (A. niger) cỏ khả năng tổng hợp mạnh glucooxydaza.
Dựa trên cơ sở sự oxy hoá glucoza và loại oxy có m ặt trong môi *
trưòng, glucooxydaza được sử dụng trong thực tế vói nhiều mục đích
khác nhau như chông oxy hoá cho thực phẩm, chông sự biến chất (biến
đổi màu sắc, mùi vị) sản phẩm thực vệt do có m ặt glucoza và oxy, ngăn
cản sự sống và phát triển cùa vi sinh vật yếm khí làm hư hỏng thực
phẩm, chống hiện tượng han gỉ bao bì bằng kim loại do sự có m ặt oxy
trong sản phẩm. Ngoài ra, glucooxydaza còn được sỏ dụng để phân tích
glucoza và chẩn đoán bệnh bằng cách xác định glucoza trong các dịch
sinh học như máu và nước tiểu.

5.6. MỘT SỐ ENZYM CỦA HÃNG NOVO VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG
5.6.1. Endo - glucanaza (Cereflo) và ứng dụng
ạ) Giởỉ th iệ u c h u n g
Endo - glucanaza Novo gọi là cereflo, được sản xuất từ Bacillus subtỉỉỉs
bằng sự lên men chìm. Enzym này làm nhiệm vụ phân giải p - glucan
(các cầu rún 1,4 —p —glucozit) trong mạch nha và lúa mỳ tạo thành
oligosaccarit có 3 - 5 đơn vị glucoza.

163
 Cereflo ở dạng lỏng có tỷ trọng là l,2g/ml được đóng trong các thùng
thép 250kg và thùng thô ở 30kg.
Ngoài hoạt tính (3- glucanaza, Cereflo còn chứa hoạt tính p - amylaza
giông như chê phẩm amylaza từ Bacillus subtiỉis.
Hoạt tính được định nghĩa như sau: Một đơn vị p —glucanaza (BGU)
là một lượng enzym theo điểu kiện tiêu chuẩn phân giải p - glucan của
lúa mạch thành hydrat cacbon có cưòng độ giảm tương ứng với 1 micro
mol của glucoza trong một phút.
Điểu kiện tiêu chuẩn: Cơ chất là p - glưcan lúa mạch; nhiệt độ ỏ
30°C; pH = 7,5 và thời gian phản ứng là 30 phút.
Các thành phần enzym hoạt tính của Cereflo đểu dễ dàng hoà tan
trong nước ở tất cả các nồng độ trong cách dùng bình thưòng. Tình trạng
đục có thể xảy ra trong chế phẩm enzym sẽ không ảnh hưởng đến hoạt
tính hay các đặc tính xỏ lý của sản phẩm, Sản phẩm này không cháy
được và hoàn toàn hoà tan vối rniốc. Nên tránh trong trường hợp không
cần thiết phải tiếp xúc hay hít phải. Trường hợp ỉâ vô tình nuốt hay tiếp
xúc với da, m ắt thì phải rửa ngay với nhiều nưốc.
b) ứ n g d ụ n g
Cereílo được dùng như một chế phẩm glucanaza phụ khi nâu bia
hay những hỗn hợp của chuyển hoá tinh bột từ lúa mạch. Nó sẽ hạ thấp
độ nhớt của dịch thuỷ phân nhò sự thuỷ phân các p - glucan, và như thế
làm dễ dàng sự ỉọc hay lắng lọc.
5.6.2. a - amylaza (Termamyl - 120L) và ứng dụng
a) Giới th iêu chung
a - amylaza Novo gọi là termamyl. Termamyl là chế phẩm lỏng,
chịu được nhiệt độ cao và' được sản xuất từ vi sinh vật Bacillus
lichenifomis. Termamyl là một endo —amylaza, có tác dụng thuỷ phân
mối nối 1,4 —a glucozid của amyloza và amylopectin với cơ chất tinh bột
dưới tác dụng của termamyl sẽ nhanh chóng tạo thành dextrin và oligo
saccarit tan trong nước.
Termamyl có trong thực tế với sản phẩm là termamyl 120L.
Enzym termamyl dễ dàng tan trong nước ỏ mọi nồng độ trong điều
kiện thường dùng. Độ vẩn đục có thể xảy ra trong chế phẩm enzym nhưng
không ảnh hưởng tói hoạt tính chung hoặc tính năng của sản phẩm.
Sản phẩm này không cháy và hoàn toàn hoà tan trong nước, nên
tránh tiếp xúc da và hít phải phải rửa ngay nhiều lần vói nước.

164
 b) Xác d in h h oat tín h của enzym
Một đơn vị kilonovo a - amylaza là lượng enzym cần thiết để thuỷ
phân 5,26g tinh bột trong một giờ theo phương pháp tiêu chuẩn của
hãng Novo trong điều kiện: Cơ chất là tinh bột hoà tan; hàm lượng canxi
là 0,0043M; thòi gian phản ứng là 7 - 20 phút ở 37°c và pH = 5,6.
Hoạt độ enzym cũng có thể được biểu thị bằng tốc độ gia tăng ban
đầu của DE (đương lượng dextroza) với nồng độ enzym đã cho sẵn. Tốc
độ gia tăng trung bình đương lượng DE trên một đơn vị thời gian cho
trước cũng sẽ phụ thuộc vào độ ổn định của enzym.
Tốc độ ban đầu với hàm lượng termamyl 0,1% trên khôi lượng như sau:

Nhiệt độ 90°c 95°c 100°c 105®c

- Độ gia tăng trung binh đương lượng DE/giờ 5,2 5,5 5,9 6,2
- Độ gia tâng trung bình đương IƯỢng DE sau 1 già
đầu tièn {điều kiện tiêu chuẩn) 5,1 5,3 5,3 4,3

c) Ảnh hưởng của canxỉ, nhiệt độ đến độ Ổn định của term am yl

Trong bột nhão, tính ổn định của termamyl được thoả mãn với sự
hiện diện từ 5 - 70ppm ion Caa+. Trong bảng 5.1 cho thấy, sự ổn định
của termamyl trong bột nhão ở nồng độ 30% trong cùng một điều kiện
nhiột độ và pH ỏ các nồng độ ion Ca2* khác nhau (ppm). Các số liệu so
sánh có cùng trị giá đương lượng DE và trong phạm vi từ 0 - 12.
Bảng 5.1. Độ ổn định của termamyi
(thời gian (phút) cẩn thiết để mất 50% hoạt tính)

Nhiệt độ °c 93 98 103 107

lon Ca1* 70ppm

pH 6,5 1.500 400 100 40
pH 6,0 800 200 75 20
pH 5,5 300 75 25 10

lon Ca2* 20ppm

pH 6,5 450 125 40 10
pH 6,0 250 75 20 5
pH 5,5 100 25 5 2

lon Ca2* 5ppm

pH 6,5 150 40 10 4
pH 6,0 75 20 5 2

165
 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của termamyl được
trình bày trên hình 5.4 và hình 5.5.

Hình 5.4. Ảnh hưỏng của pH lên hoạt tính của termamyl tại các nhiệt độ khác nhau
(dưởng cong biểu diễn hoạt tính của a - amylaza, BAN để so sánh). Cd chất 0,5 tinh bột
(hoà tan trong nuớc), chất ổn định 30 - 60ppm canxi.

Hình 5.5. Ảnh hưổng của nhiệt độ lân hoạt tính của termamyl cơ ch ấ t 0,5% tinh bột
(hoà tan trong nước), chất ổn định 30 - 60ppm canxi, pH = 5,7.

d) ử n g d ụ n g
Termamyl được sử dụng trong những ngành công nghiệp: tinh bột,
cồn, bia, đường và dệt.
- Trong kỹ nghệ tinh bột, termamyl được dùng cho việc dịch hoá
liên tục tinh bột trong nồi hơi hoặc trong những thiết bị tương tự hoạt
động ở nhiệt độ từ 105 — 110°c và vì vậy lới dụng được tính ổn định
nhiệt độ cực cao của enzym.
- Trong kỹ nghệ nấu cồn, termamyl được dùng để phân tán tinh bột
khi nghiển và chưng cất. Và ở giai đoạn này, cũng lợi dụng được độ ổn
định nhiệt của enzym. Hơn nữa, rất có thể thực hiện việc chưng cất
không cần điều chỉnh pH và thêm Ca mặc dù các điều kiện có hơí khác
166
vổi điều kiện tối ưu. Điều này là do phạm vi pH tương đối lán và việc đòi
hỏi Ca của enzym tương đối thấp. Nó làm cho quy trình sản xuất được
đơn giản và mức độ rủi ro của cặn bẩn Ca được giảm thiểu trong cột
chưng cất.
- Trong kỹ nghệ nấu bia, termamyl được dùng để phụ giúp cho việc
dịch hoá được dễ dàng. Do độ ổn định nhiệt cao của enzym, quy trình
nấu có thể được đơn giản hoá. Nhò thế, việc gia tăng tỷ lệ các phụ gia
cũng có thể thực hiện được.
- Trong kỹ nghệ đưòng, termamyl được sử dụng để phá vỡ lượng
tinh bột hiện diện trong nước mía, 'Vi vậy, hàm lượng tinh bột trong
đường thô được giảm và việc lọc đường tại nhà máy tinh luyện được dễ
dàng hơn.
- Trong kỹ nghệ dệt, termamyl được sử dụng ồ nhiệt độ cao để rũ hồ
trưóc khi nhuộm.
5.6.3. a - amylaza (Fungamyl) và ứng dụng
a) Giới th iệ u c h u n g
a - amylaza của hãng Novo được gọi là Fungamyl thu nhận được từ
nấm mốc Aspergillus oryzae, có tên theo danh pháp là 1 - 4 a - D - glucan
glucanhydraza.
Enzym này thuỷ phân cầu nối 1-4 a - glucozit của amyloza và
amylo-pectin tạo thành lượng lớn đường maltoza.
Sản phẩm dạng lỏng (L) là một dung dịch có màu nâu với tỷ trọng
l,25g/ml. Ngoài ra còn ở dạng bột vô định hình và dạng cầu.
b) Các loại sả n p h ẩ m 1>Òđóng gói
- Dạng lỏng fungamyl 800L có 800FAƯ/g được đóng gói trong thùng
sắt 250kg và can nhựa 30kg.
- Dạng bột fugamyl 1.600S có 1.600FAU/g được đóng thùng 25kg.
- Sản phẩm hạt tròn fungamyl MG 35,000 được đóng thùng 40kg.
Hoạt tính của fungamyl được xác định: một đơn vị a - amylaza từ
nấm mốc (1FAU) là lượng enzym cần thiết để thuỷ phân 5,26g tinh bột
một giò theo phương pháp tiêu chuẩn của Novo. Để xác định hoạt tính
cần có các điều kiện sau đây: Cơ chất là tinh bột hoà tan; thời gian phản
ứng từ 7 —20 phút; pH = 4,7 và nhiệt độ 37°c.
c) ứ n g d ụ n g
Trong công nghiệp tinh bột: fungamyl được dùng trong sản xuất
đường malto cao cấp, chẳng hạn như sản phẩm 45 - 60% đường maltoza
167
hay là đường glucoza cao độ (DE 60-70: 35 - 43% glucoza, 30 - 37%
maltoza). Sản phẩm đường maltoza cao cấp có thể được chế tạo từ một
dung dịch đã dịch hoá vói enzym. sản phẩm đường glucoza cao độ có thể
chế tạo từ dung dịch tinh bột có DC 42 đã dịch hoá với enzym hay vâi
axit (sử dụng fungamyl và AMG).
Trong công nghiệp chế tạo bia, fungamyl được dùng trong giai đoạn
lên men để gia tăng hệ thống lên men của nước nha. Độ lên men có thể
gia tăng đến 2 —5%, a—1,6-lìmit dextrin còn ỉại trong bia.
Trong công nghiệp chế tạo cồn, fungamyl có thể sử dụng trong giai
đoạn dịch hoá tinh bột trong thiết bị vối nhiệt độ thấp (55 - 60°C).
Trong kỹ nghệ làm bánh (biscuits hay bánh mỳ), fugamyl được sử
dụng để hỗ trợ hàm lượng thấp của a-amylaza chứa trong bột tiểu mạch.
Sự tác dụng của fungamyl sẽ gia tăng cấu tạo và thể tích của bánh.
d) C hú ỷ k h i sử d ụ n g và bảo q u ả n
Bụi enzym có thể gây dị ứng khi bị hít phải. Nên phòng tránh trong
trường hợp phải tiếp xúc vổi enzym. Trong trưòng hợp lở nuốt phải
enzym hoặc enzym tiếp xúc vối da hoặc mắt, nên rửa ngay với nước.
Fungamyl bảo quản ô 5°c giữ được 3 tháng, để nơi khô ráo.
5.6.4. Amyloglucozidaza (AMG NOVO) và ứng dụng
a) Giới th iệ u c h u n g
AMG - amyloglucozidaza Novo là một chất exo-D -glucoziđaza-l,4a
(gluco-amylaza) được sản xuất từ một chủng loại vi sinh vật chọn lọc
tên là Aspergillus nỉger bằng sự lên men chìm. Tên theo hệ thống là
1,4 a - D - glucan glucohydrolaza. Enzym này thuỷ phân các cầu nối
a 1-4 và 1-6 trong tinh bột.
Trong thuỷ phân, các đơn vị glucoza bị tách ròi theo thứ tự từ đầu
không khử của phân tử cơ chất. Mức độ thuỷ phân tuỳ thuộc vào loại
mối nối cũng như chiều dài chuỗi các mối nối; 1-4 a dễ dàng bị thuỷ
phân hơn các mối nối 1-6 a, trong khi maltotrioza và đặc biệt maltoza bị
thuỷ phân ô mức độ thấp hơn là các phân tử lón của oligosaccarit.
T ất cả sản phẩm AMG đều không nhiễm hoạt tính transglucozidaza
bằng cách chuyển các phân tử của glucoza từ vị trí 1,4 a qua 1,6 a (có
thể tạo thành panoza và izomaltoza).
b) Cáe d a n g sả n p h ẩ m
Các sản phẩm lỏng (L) là nhũng chế phẩm màu nâu trong, có tỷ

168
trọng l,2g/ml. Vi hạt AMG 300MG là hạt màu trắng, không gây bụi, có
kích thước hạt trung bình khoảng 300^m.
Loại sản phẩm: AMG có sẵn với các cường độ tiêu chuẩn sau đây:
- Dạng lỏng: AMG 200L có 200AGU/ml; AMG 300L có 300 AGƯ/ml.
- Dạng vi hạt: AMG 400L có 400AGU/ml; AMG 300MG có 300AGU/ml.
Xác định hoạt tính: Một đơn vị của Novo amyloglucozidaza (AGU)
được định nghĩa là một lượng enzym thuỷ phân một fig cơ chat maltoza
ồ 25°c, pH 4,3 (dung dịch đệm axetat) trong 30 phút.
Tiêu chuẩn của bao bì đóng gói: AMG lỏng có sẵn trong thùng thép
210 lít và thùng thô sơ 25 lít. Vi hạt AMG có sẵn trong thùng fibro 40kg.
c) C hú ý k h i bảo q u ả n và sử d u n g
Khi AMG (dạng lỏng cũng như vi hạt) được bảo quản ỏ 25°c, hoạt
tính phổ biến được duy trì ít nhất trong 6 tháng; còn ở 5°c, duy trì ít
nhất một năm.
Sự trao đổi ion hay xử lý cacbon của dung dịch đương thường sẽ làm
mất hoạt tính của AMG. Hoạt tính có thể bị huỷ bằng cách đun dung
dịch cơ chất đến 80°c trong 5 phút, hoặc đến 75° trong khoảng 40 phút.
Sản phẩm này không cháy, hoàn toàn hoà tan trong nước và an toàn khi
sử dụng theo như chỉ dẫn. Bụi enzym có thể gây dị ứng khi bị hít phải.
Nên tránh trưồng hợp 15 nuốt phải enzym, hoặc tiếp xúc với da hoặc
17191» nên rửa ngay với nước.

Hình 5.6. Ầnh hưởng của pH dối vói
h oạt tính của AMG Novo
Cơ chất: 39% trên khối lượng maltoza;
0,1M đệm phosphat/xitrat; Nhiệt độ 55°C;
Thời gian phản ứng 39 phút.
Hỉnh 5.7. Ảnh hưỏng của pH đối với
độ ổn định của AMG Novo
Cơ chất: 35% trên khối lượng
glucoza xiro; Nhiệt độ: 60°C;
Thời gian phản ứng 48 giờ.

5.6.5. a - axetonlactat decacboxylaza (Maturêx L) và ứng dụng

a) Giới th iê u c h u n g
Maturêx là enzym a-axetolactat decacboxylaza (ALDC) tinh chế
được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis. sản phẩm M aturêx là một

169
dung dịch màu xám với tỷ trọng l,2g/ml. Khi bảo quản ở nhiệt độ 5°c,
Maturêx sẽ duy trì hoạt tính ít nhất 6 tháng.
Chế phẩm thương mại Maturêx L được đựng trong các can nhựa loại
lkg và 5kg. Hoạt tính của Maturốx L là 1.500ADU/g. Một đơn vị của a -
axetolactatdecacboxylaza Unit (ADU) là số lượng enzym cần thiết để có
thể sản xuất 1 micro mol axeton trong một phút dưói điều kiện tiêu
chuẩn của phản ứng decacboxyl hoá của a-axetolactat.
b) Ánh hưởng của nhiêt đô, pH đến hoat tính và sư Ổn đỉnh
của M a tu rê x L
Sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của enzym Maturêx
L được trình bày trên đồ thị hình 5.15 và 5.16. Sự ảnh hưởng của pH và
nhiệt độ đến sự ổn định của Maturêx L được trìn h bày trên biểu đồ hình
5.17 và 5.18.
Maturêx được sử dụng trong thòi kỳ lên men của bia nhằm ngăn
ngừa sự kết thành của diaxetyl bằng cách xúc tác phản ứng decacboxyl
hoá của a-axetolactat tạo axeton nhanh mà không qua quá trình
chuyển hoá giải phóng ra điaxetyl, rồi trong quá trình lên men phụ mới
thực hiện quá trình chuyển diaxetyl thành axeton. Vì thế thời kỳ lên
men phụ có thô được loại trừ hay giảm ngắn thdi gian nhiều.

Hinh 5.8. Ảnh hưỏng của nhiệt độ trên Hình 5.9. Ảnh hưỏng của pH trên
hoạt tính của Maturêx. hoạt tính của Maturêx.
Cơ chất: Nước lên men; pH 5,0 Co chất: Nuớc lên men; Nhiệt độ: 1ũ°c.
— — — — —
5- 100 100
E 80 80
o 60
.c 60
C
40 40
o 20 20
-C
& 0 5 10 15 20 25
HŨ.
°c 0 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 pH

Hình 5.10. Ảnh hưỏng của nhiệt độ Hinh 5.11. Ảnh hưỏng của pK
trên sự ổn định của Maturêx. trên sự Ổn định của Maturâx.
Cơ chất: Nước lên men; Thòi gian 2 ngày Cơ chất: Nước lên men; Thời gian 2 ngày

170
 c) ứ n g d u n g
Lượng sử dụng cần thiết của Maturêx là l-2kg trong 1.000 hecto lit
(hay 100.000 lít) nước lên men (có thể trộn trực tiếp vào nước lên men
lạnh tại lúc ban đầu của thòi kỳ lên men).
Lưu ý khi sử dụng Maturêx L: Maturêx L hoàn toàn hoà tan trong
nước và không bắt lửa. Khi sử dụng Maturêx L chú ý không để tiếp xúc
trực tiếp với da hay hít phải. Nếu dính Maturêx trên da phải rửa nhiều
lần trong nước.
5.6.6. Enzym proteaza (Neutraza) và ứng dụng
a) Giới thiêu chung
Neutraza Novo là enzym proteaza được sản xuất từ vi khuẩn Bacilỉius
subtilis.
Neutraza có hai loại sau đây:
- Dạng lỏng N eutraza 0,5L 0,5AU/g.
- Dạng vì hạt Neutraza 1,5MG l,5AU/g.
Neutraza 0,5L là chất lỏng màu nâu, có tỷ trọng l,25g/ml.
Neutraza 1.5MG là dạng hạt nhỏ, không gây bụi, kích thưác hạt
trung bình là 300]am. Neutraza 1,5MG có thể trộn dễ dàng với bột mý.
Neutraza 1,5MG là chế phẩm không cháy, hoà tan hoàn toàn trong
nước. Enzym này có thể làm ngứa da mắt, bụi enzym khi hít vào cơ thể
gây mẫn cảm,
Khi bảo quản ỏ 5°c, sản phẩm enzym duy trì hoạt tính ít nhất là 1 năm.
Khi bảo quản ỏ 25°c, duy trì hoạt tính là 3 tháng và hoạt tính giảm
mỗi tháng ít hơn 2%. Neutraza 0,5L nên dược bảo quản ở -10°c,
Neutraza 1,5MG cần phải được bảo quản nơi khô ráo và nhiệt độ ít dao
động để đảm bảo hoạt tính cho enzym.
Neutraza 0,5L được chứa trong các thùng thô sơ khoảng 30kg hay
thùng thép 250kg. Neutraza 1,5MG được chứa trong các thùng Fibzo 40kg.
Hoạt tính của enzym xác định theo đơn vị Anson (AU), dựa trên
phản ứng hemoglobin bị biến tính trong dung dịch đệm 0,02M Ca2+.
Neutraza chỉ chứa proteaza dạng trung tính của B. subtlỉis, trong khi
đó hầu hết các chế phẩm thương mại khác còn chứa cả proteaza kiềm.
Neutraza là một proteaza kim loại, chứa Zn trong cấu trúc của nó.
Enzym này được ổn định bởi Ca2+, bị ức chê bởi EDTA.
Neutraza hoạt động thích hợp ở nhiệt độ 45 - 54°c và pH = 5,5 - 7,5.

171
 b) ử n g d u n g
N eutraza dùng để thuỷ phân protein đến peptit, phân giải một phần
protein.
Trong công nghệ chế biến bia, neutraza dùng để hỗ trợ thêm với các
proteaza trong lúa mạch nha. Neutraza không bị ức chê bằng các chất
ức chẽ proteaza trong lúa mạch.
Trong công nghệ “bánh nưống” neutraza được dùng làm mềm vừa
phải gluten lúa mỹ khi cần, chẳng hạn trong sản xuất Biqui cũng vậy.
5.6.7. Enzym Novo cho sản xuất alcol và úmg dụng
a) Giới th iê u c h u n g
Quy trình sản xuất đồ uống có rượu từ những nguyên liệu thô chứa
tinh bột đã được áp dụng qua nhiều thế kỷ ở nhiều nước trên thế giới,
Sự chuyển hoá của nguyên liệu tinh bột õ dạng thô thành đưòng lên
men được tiến hành bởi sự có mặt của enzym hoạt tính amylolitic. Ở Tây
Âu, mạch nha từ lúa mạch là nguồn enzym truyền thông phục vụ cho
quá trình này. Trong khi đó ở Viễn Đông, amylaza thường được sản xuất
từ nấm mốc, phát triển trên môi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có
chứa tinh bột.
Ngày nay, các loại amylaza vi sinh vật đã được tinh chế có hoạt tính
cao đã được áp dụng ngày càng gia tăng. Các dẫn liệu cho rằng, việc sử
đụng amylaza vi sinh vật đã mang lại hiệu quả kinh tế lốn hơn các quá
trình lên men truyền thông khác.
Trong nhiều năm qua, Novo industry A/S từng là nguồn cung cấp
chủ yếu các loại enzym vi sinh vật cho sản xuất đồ uống có cồn tại nhiều
nước trên thế giới. Những kinh nghiêm tổng quát vể việc sử đụng
amylaza hoá lỏng tinh bột đã được tập hdp khá đầy đủ, đó là Termamyl
và Fungamyl. Sự kết hợp của quá trình dịch hoá và đường hoá bởi
amylaza và spiritamylaza Novo đã thay thế hoàn toàn hay một phần
cho m alt đại mạch, hay chế phẩm nấm mốc thô ở nhà máy rượu.
b) Các loại enzym thư ờ ng sử d ụ n g
Trong công nghệ sản xuất cồn, enzym xúc tác cho quá trình thuỷ
phân tinh bột thành đường lên men là khá quan trọng. Các enzym này
thuộc loại amylaza.
— Novo amylaza:
Novo amylaza, termamyl 60L, fungamyl 800L và spiritamylaza Novo
150L được sản xuất từ các vi sinh vật không gây bệnh trong điều kiện vệ

172
sính cao, sự lựa chọn, sàng ỉọc gắt gao. Các Novo amylaza này thường
được tinh chế, cô đặc và tiêu chuẩn hoá ở dạng lỏng để có hoạt động cao.
Các enzym này có thể lưu trữ 6 tháng mà không có những biến đổi nào
về hoạt tính trong điều kiện bảo quản không lớn hơn 25°c.
- Termamyl 60L:
Termamyl 60L là một enzym a - amylaza cô đặc ở dạng lỏng, hoạt
động ổn định ở nhiệt độ cao. Hoạt động của nó là thuỷ phân tinh bột
thành dextrin giống như a - amylaza của malt. Termamyl 60L có thể
hoạt động thuỷ phân tốt ỏ pH 5,0, nhiệt độ 90°€ và không yêu cầu sự có
mặt của muôi canxi cho sự ổn định của nó.
- Fungamyl 800L:
Fungamyl 800L là một a - amylaza cô đặc dạng lỏng. Nhiệt độ hoạt
động tối thích là 60 - 65°c. Fungamyl 800L hoạt động thuỷ phân tinh
bột thành dextrin giống như các a —amylaza khác, tuy nhiên có một
lượng lớn maltoza được tạo thành.
Fungamyl có thể thuỷ phân tinh bột ở pH 4,5 và không đòi hỏi điều
kiện có muối Ca cho sự ổn định của nó.
- Spiritamylaza Novo 150L:
Spiritamylaza Novo 150L. là một glucoamylaza lỏng cô đặc, được sử
dụng thuỷ phân tinh bột trong công nghệ lên men rượu. Enzym này
thuỷ phân tinh bột hoàn thành các đường lên men glucoza không có các
dextrin trong sản phẩm thuỷ phân.
Spiritamylaza Novo giữ được hoạt tính và ổn định bền vững ở pH
th ấp n h ư là pH = 3 tạ i 60°c.
Tính ổn đinh của spiritamylaza không phụ thuộc vào sự có m ặt của
ion canxi (Ca2+).
5.6.8. Enzym Novo cho quá trình biến đổi tinh bột và ứng dụng
a) Gỉởi th iê u c h u n g
Trong công nghệ sản xuất dồ uống, enzym được sử dụng để sản xuất
xiro, trong đó chứa các đưòng đặc biệt như dextroza, maltoza, fructoza...
Những Novo enzym và sử dụng chúng vào các công đoạn chủ yếu
của quá trình công nghệ như: quá trình dịch hoá tinh bột, đường hoá,
đồng phân hoá.
b) Quá trìn h dich hoá tỉnh bôt
Trong quá trình này, một trong các enzym như a - amylaza,
termamyl phá vỡ gel của tinh bột tạo thành các dextrin và số’lượng nhỏ

173
các cacbohydrat có phân tử lượng thấp, c ả amyloza và amylopectìn đều
bị cắt mạch, kết quả giảm nhanh độ nhớt của dung dịch.
c) Q uá tr ìn h th u ỷ p h ả n
Amyloglucozidaza AMG và Fungamyl hay Sansuper được sử dụng
thuỷ phân các dextroza tạo thành cacbohydrat đồng phân quang học.
Dung dịch này chứa glucoza và 60% maltoza.
d) Q uá tr ìn h đồng p h â n hoá
Xiro chứa hàm lượng cao fructoza là có chất lượng tuyệt vời và có vị
ngọt như đường mía, củ cải đường, đưòng nghịch đảo trong công nghệ
thực phẩm.
e) Các loai enzym thư ờ ng sử d u n g
Quá trình biến đổi xiro glucoza thành xiro có hàm lượng fructoza
cao cần có sự tác động của enzym. Quá trình này gọi là quá trình đồng
phân hoá nhờ hệ enzym gọi là sweetzyme, các enzym đó được giới thiệu
như sau:
- Termamyl 60L:
Enzym này được sản xuất trong quá trình nuôi cây Bacillus
lichenigemis. Enzym này hoạt động và ổn định trong dung dịch tinh bột
ỏ nhiệt độ 110°c, chịu được nhiệt độ cao nên cũng đưdc sử dụng trong
quá trình hoá lỏng tinh bột.
Termamyl 60L là một sản phẩm lỏng với hoạt động là 60 kilo Novo
Unit/g (KNƯ/g).
- Bacterial amylaza Novo hay Ban 120L:
Enzym này cũng được gọi là a - amylaza, được sản xuất từ quá
trinh nuôi cấy Bacillus subtilis. Ban được sử dụng trong quá trình hoá
lỏng tinh bột ỏ nhiệt độ > 90°c. Enzym này ở dạng lỏng (Ban 120L) với
hoạt động là 120 kilo Novo ƯniƯg (KNU/g),
- Amyloglucozidaza Novo (AMG 150L):
Amyloglucozidaza được sản xuất từ quá trình nuôi cấy Aspergillus
nỉger. AMG được sử dụng vào quá trình đường hoá các dextroza. Độ hoạt
động của nó được tính 150 Amyloglucozidaza Unit trên ml (AGƯ/ml).
- Fungamyl (fungamyl 800L):
Enzym này chính là fungamylaza, dược sản xuất bởi quá trinh nuôi
cấy Aspergillus oizae. Fungamyl có vai trò thuỷ phân tinh bột tạo thành
maltoza trong sản xuất xiro. Chế phẩm enzym ở dạng lỏng với hoạt động
800 đơn vị amylaza của nấm (fumgal amylaza unit) trên gam (FAU/g).

174
 - Sweetzyme:
Bao gồm 2 loại: Sweetzyme loại A và Sweetzyme loại s. Sweetzyme
là enzym đồng phân hoá glucoza, enzym này thu được từ quá trình nuôi
cấy Bacillus coagulan. Sweetzyme xúc tác làm biến đổi glucoza thành
fructoza. Hoạt tính của Sweetyme A là 600 GINU/g và Sweetyme s là
15D GINU/g.
Các điều kiện công nghệ đặc trưng cho Termamyl 60L:
Enzym termamy] 60 lít
Nồng độ đung dịch tinh bột (DS) 30 - 40%
pH 6,0 - 6,5
Nhiệt độ I50°c - 95°c
Thời gian phản ứng 5 phút
Liều lượng enzym sử dụng khoảng l,2kg/tấn tinh bột để dịch hoá
cho dung dịch tinh bột đã quy định trong từng công nghệ.
5.6.9. Một số enzym mới của hãng NOVO (Đan Mạch) và ứng dụng
a) T erm a m yl s c
Sử dụng a - amylaza để dịch hoá toàn bộ hạt. Sau đây là bài giới
thiệu của Lary w. Peckous, Novozymes tại Hội nghị về tinh bột tại
Detmold, Đức về Termamyl SC:
Novozymes đã thiết kế a-am ylaza mới đặc trưng cho dịch hoá toàn
bộ hạt trong sản xuất cồn và cồn nhiên liệu, sản xuất cồn nhiên liệu từ
lâu không còn được thoả mãn bỏi các enzym được thiết kế cho tinh bột
xử lý ướt, các enzym này đôi khi hoạt động kém hiệu quả trong điều
kiện đòi hỏi hơi khắt khe của môi trường bột nghiền khô.
- Các enzym cho tinh bột trong ngành công nghiệp cồn nhiên liệu:
Có nhiều ví dụ điển hình về các giải pháp enzym cho những thách
thức tìm thấy trong công nghiệp tinh bột xử lý ướt. Ngành công nghiệp
tinh bột có những hỗn hợp enzym mới để sản xuất glueoza, maltoza,
cyclodextrin hàm lượng đặc biệt cao. Có những enzym cắt mạch nhánh,
chuyển hoá, đồng phân hoá mới. Tuy vậy các ngành công nghiộp sản
xuất Whisky, Vodka, cồn và cồn nhiên liộu chưa nhận được sự quan tâm
thích dáng. Mặc dù thực tế ngành cồn nhièn liệu sử dụng gần 100.000
tấn hạt/ngày trên thế giới, công nghiệp sử dụng hạt nghiền khô đã phải
sử dụng những enzym được thiết kế cho công nghiệp nghiền ướt nhưng
không hiệu quả.

175
 Trong những năm gần đây, quy trình sử dụng bột nghiền khô đã
được tự động hoố và kiểm soát tốt. Sự cải thiện này trong các quy trình
ổn định làm nổi bật tầm quan trọng của việc định hoá bột ướt thưòng
phải kéo dài thòi gian làm việc trong những điều kiện khó khăn khi làm
việc trong các quy trình sử dụng toàn bộ hạt và gây nên chuyển hoá tinh
bột ngược lại.
Những vấn đề quan tâm của công nghiệp sử dụng tinh bột nghiền
khô đối với cc-amylaza dịch hoá bao gồm sự chuyển hoá các thành phần
khi nồng dộ ion Ca giảm và pH thấp.
Hơn nữa ngành công nghiệp này mong muốn giảm nhanh độ nhớt
dịch cháo, giảm tiêu hao năng lượng và sử dụng hiệu quả nguồn nhiệt
thứ cấp. Bảng 5.2 chỉ ra sự cần thiết và sự quan tâm của 2 ngành công
nghiệp này.
Bảng 5.2. Sự quan tâm khác nhau của 2 ngành công nghiệp sản xuất
Yèu cáu hoặc sự quan tâm Nghiến ưãt Nghrôn khỏ
Yêu cẩu canxi thấp Chi phí trao đổi íon thấp hơn. Giảm canxi oxalat “đà bia".
Chịu pH thấp Chi phí ừao đổi ion thấp hữn, Cho phép sử đụng nhiổu "dấm
giảm lưạng xút sử dụng. chín" ban, giảm sử dụng kiểm và
tạo muôi.
Đỏ nhớt cuối cùng Khỏng như tiẽu chuẩn. Ảnh hưảng tòi tfao đổi nhiệt và
hiệu suất lán men.
Giảm độ nhớt Thưòng thích họp ỏ DE 10. Nhanh hon thi tốt hơn.

Tổn tại hoạt tinh (dịch hoá Không mong muốn (tạo Mong muốn (cải thiện sự chuyển
nhanh) panoza). hoá tái hạn trong lân men).
Dạng liên kết đường trong địch Quan trọng đổi vói dịch Lièn quan không tòn.
hoá glucoza.
Sự thuỷ phản thành phần tinh Khống đặt ra. Có thể tâng đáng kể hiệu suất lẻn
bột khỏ chuyển hoả men.

- Termamyl sc cho công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu:

Termamyl s c là bưóc đi chủ yếu hướng tâi những nhu cầu của
ngành công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu nhiều tiểm năng, sử dụng
phương pháp công nghệ tương tự để thực hiện việc phát triển enzym
proLein công nghệ (công nghệ gen) Bacillus licheniformis. Termamyl s c
được các nhà khoa học nghiên cứu của Novozymes tại Đan Mạch đã tạo
ra a-am ylaza chuyên biệt cho ngành công nghiệp sử dụng tinh bột
nghiền khô. Termamyl s c là một enzym công nghệ enzym protein công
nghộ có nguồn gốc từ chủng Bacillus stearothermophilus và dạng thể

176
hiện là chủng B. licheniformis. Trong khi 2 loại enzym này được sản
xuất thông qua kỹ thuật tương tự, nhưng hiệu quả hoàn toàn khác
nhau, Sau đây là những điểm chỉ ra quan hệ của Termamyl s c với các
thông số quan trọng trong việc chuyển hoá hạt thành cồn.
+ Canxi: Chúng ta biết rõ rằng nhũng a-am ylaza bền nhiệt thông
thường yêu cầu một số’kim loại để ổn định, điển hình là ion canxi giúp
giữ các vùng protein của enzym có cấu trúc không gian thích hợp để
chúng có thể hoạt động như một chất xúc tác sinh học. Lượng canxi
20 - 50ppm là yêu cầu cần thiết để ổn định ct-amylaza của loại enzym
nguyên thuỷ thông thưòng từ Bacillus stearotkermophilus hoặc Bacillus
licheniformis trong dịch tinh khiết. Thài gian dịch hoá nhanh hơn
Termamyl-120L
+ pH thấp hơn: Điều chỉnh pH ít hơn, có nghĩa là chi phí hoá chất
cho thao tác này thấp hơn và ít thời gian để điều chỉnh hơn. Nhiều
nghiên cứu chỉ ra rằng, những thay đổi pH trong khoảng 5,7 - 5,0 có
ảnh hưởng không đáng kể tới hiệu quả của a-am ylaza mới này.
+ Canxi oxalat: Sự tạo thành canxi oxalat trong bia là vấn đề rất
nghiêm trong do thời gian yêu cầu để làm sạch những vẩy cáu cặn bám
chặt trên đường ông công nghệ và ông trao đổi nhiệt. Cặn canxi oxalat
cũng làm suy giảm hiệu quả của thiết bị trao đôi nhiệt, tăng chi phí
năng lượng. Có 2 cách làm giảm canxi oxalat kết tủa trong sản xuất.
Một là giảm canxi trong hệ thống. Hai là giảm pH để canxi oxalat không
tạo thành. Công nghệ Bacillus stearothermophilus giúp thực hiện cả
2 hướng, chúng cho phép hạn chế việc bổ sung canxi nhờ yêu cầu canxí
thấp, thêm nữa nó có thể thực hiện ở pH thấp (ở khoảng 5,0), thấp hơn
hầu hết các quy trinh dịch hoá hiện nay. Khả năng chịu pH thấp hơn
cho phép ngưòi sử dụng hạn chế điều chỉnh pH, hoặc tăng thêm dấm đã
cãt cồn vào dịch cháo. Nhũng sự thay đổi này rấ t tổt cho sự tiết kiệm
trong sản xuất bằng hạt nghiền khô.
+ Giảm độ nhớt: Những quy trình sử dụng toàn bộ hạt cần một loại
enzym làm giảm nhanh độ nhớt của dịch cháo. Độ nhớt thấp hơn cải
thiện hiệu quả truyền nhiệt trong thiết bị trao đổi nhiệt và nó cho phép
thiết lập quy trình có nồng độ chất khô của dịch cao hơn. Chỉ vài năm
trưởc đây, quy trình cho bột nghiền khô thường thực hiện ỏ dưới 30%
chất khô, 35% chất khô là bình thường, ngày nay vài quy trình chạy ở
38% chất khô. ct-amylaza công nghệ từ vi khuẩn Bacillus licheniformis

177
và Bacillus stearothermophilus tạo ra làm giảm độ nhớt nhanh hơn các
loại enzym khác.
Những lợi ích khác rú t ra từ việc giảm độ nhớt cho một số quy
trìn h bao gồm: (1) Hiệu quả trao đổi nhiệt được cải thiện; (2) Truyền
nhiệt tốt hơn trong thiết bị lên men và (3) Thoát C 02 khỏi dịch lên men
nhanh hơn.
+ Giảm lượng sử dụng: Sự khác biệt về năng lượng kích hoạt phản
ứng trong a~amylaza của Bacillus stearothermophiỉus cũng cho phép
giảm đáng kể hàm lượng sử dụng, hàm lượng sử dụng giảm tạo cho công
nghệ sử dụng bột nghiền khô với việc giảm chi phí vận tải, bảo quản....
trong khi không phải chỉ là lợi ích kỹ thuật, nó được đánh giá cao bởi
ngành công nghiệp cồn nhiên liệu thực chất ở chi phí. Người ta sử dụng
0,3kg termamyl s c (a—amylaza của Bacillus stearothermophiỉus) cho 1
tấn tinh bột (pH 5,25), còn 0,54kg (a~amylaza của Bacillus licheniformis)
cho 1 tấn tinh bột (pH 5,55).
Termamyl s c đã nhanh chóng trở thành câu chuyện thành công của
cả Novozymes và các khách hàng sử dụng vào các nhà máy bia, rượu,
mỳ chính,... để dịch hoá tinh bột thay cho termamyl—120L. Không có
sản phẩm nào khác luôn cho phép nhà sản xuất cồn vừa tăng sản lượng,
vừa giảm tiêu thụ năng lượng,
b) D extrozym GA (glucoam ylaza)
D e x t r o z y m G A k h á c A M G E ò c h ỗ t ỷ lệ a - a m y l a z a : G l u c o a m y l a z a
tăng 0,12 thành 0,30. Hàm lượng a-am ylaza nấm bền axit cao hdn trong
Dextrozym GA cho phép sử đụng hàm lượng enzym thấp hơn 10 - 20%.
Đồng thòi hiệu suất glucoza thu hồi tăng nhẹ so vối AMG E,
Mục đích của công việc được báo cáo ỏ đây là để 80 sánh hiệu quả
của Dextrozym GA vổì các glucoamylaza trước đây (AMG E & AMG
300L) và Optidex L từ GCI. Điều kiện tiêu chuẩn là 61°c, 31% DS (dịch
tinh bột ban đầu) và pH 4,3. Hàm lượng glucoamylaza được thay đổi
phù hợp với enzym sử dụng.
Thực hiện: Chất nền cho đưòng hoá được chuẩn bị là tinh bột ngô
dược dịch hoá tới DE 10, nong độ 30% chất khô. Thử nghiệm đường hoá
được thực hiện một cách đồng dạng trong bình thí nghiệm đậy kín thể
tích 500ml có khuấy từ, sử dụng rôbôt đường hoá Gilsson (ABF-SP-5058).
Các pH được điều chĩnh lúc bắt đầu đưòng hoá, với pH điện cực cô" định
tại nhiệt độ đưòng hoá.

178
 Enzym được pha loãng trong thiết bị sản xuất bởi “Milli —Q water”
và dung dịch được sử dụng ngay. Theo điều kiện tiêu chuẩn như sau:
Nồng độ chất nền 31,1% (đầu) 33,6% (cuối)
Nhiệt độ 61 c
pH 4,3
Hàm lượng 0,24 AMG/g DS (Optidex L & AMG 300 L)
0,2 AMG/g DS (AMG E)
0,16 AG/g DS (Dextrozym GA)
Rôbôt được lập trình để lấy mẫu sau 18, 24, 30, 36, 48, 72, 84 và 96 giờ
kể từ khi đưòng hoá,
Vô hoạt enzym, pha loãng, lọc vô trùng được thực hiện như một phần
của quy trình.
Không tinh chế trước khi phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp (ABF
SM 5121 02).
Dextrozym GA tốt hơn cốc glucoamylaza khác, mặc dù giảm đáng
kể hàm lượng enzym (theo AG/g DS). Điểu đáng quan tâm là hoạt tính
chuyển hoá ngược của Optidex L (xác định bằng sự giảm glucoza trong
địch đưòng) lớn hơn cả AMG 300 L. Điều này là do dấu vết của hoạt tính
transglucozidaza trong enzym này. Trong bản giâi thiệu sản phẩm của
optidex L chỉ ghi hầu như không có hoạt tính transglucozidaza”.
Dextrozym GA thực sự là “glucoamylaza tốt nhất th ế giới”.
c) L iquozym su pra
Liquozym supra là hỗn hợp dạng lỏng của các enzym amylaza rất
bền nhiệt (EC.3.2.11) dược sử dụng để dịch hoá tinh bột.
a - amylaza là protein công nghệ từ vi khuẩn Bacillus, được sỏ dụng
bằng chủng biên đổi gen của Bacillus licheniformis.
Liquozym supra cung cấp khả năng đặc biệt cho các quy trình làm
việc ở pH và nồng độ canxi thấp và có xu hưống tạo thành panoza thấp.
Điều này cho phép có dao động và khả năng mềm dẻo hơn trong quy
trình sản xuất.
Đặc tính: Liquozym supra là chất lỏng màu nâu có tỷ trọng khoảng
l,23g/ml.
Hoạt tính: Liquozym supra có hoạt tính công bố là 90 KNƯ(T)/g và
45 KNU(S)/g
Khía cạnh an toàn thực phẩm: sản phẩm tuân thủ những điều kiện
của FAO/WTO JECFA và FCC đã chỉ ra về độ tinh khiết và an toàn.
ứ ng dụng: Liquozym supra được phát triển cho dịch hoá tinh bột

179
liên tục bằng Je t cooker hoặc thiết bị tương tự ở nhiệt độ 105 - 110°c
(221 —230°F) sử dụng đặc tính bền nhiệt đặc biệt của enzym. Liquozym
supra có thể hoạt động ở khoảng pH 5,1-5,6 với thời gian hoạt động
60 - 180 phút. Điều kiện ứng dụng được giới thiệu ở hàm lượng
0,25 - 0,65kg/tấn tinh bột ở pH 5,3 và nồng độ Ca2+5 - 20ppm phụ thuộc
vào dịch tinh bột. Chi tiết về các ứng dụng của Liquozyme supra sẽ được
cung cấp trong bản riêng biệt.
Bảo quản: Đề nghị bảo quản ỏ 0 - 25°c trong thùng nguyên bao gói
và tránh ánh sáng Mặt tròi. Tuy nhiên, enzym sẽ m ất dần hoạt lực theo
thòi gian. Bảo quản kéo dài hoặc điều kiện khắc nghiệt, bao gồm nhiệt
độ cao có thể cần sủ dụng hàm lượng cao hơn.
Giá của Liquozym supra còn tăng lO.QOOđ/kg, trong khi đó hoạt lực
dịch hoá tăng 25% so với Termamyl 120 LS. Như vậy, nếu sử dụng
enzym mới sẽ giảm được chi phí sản xuâ't.
d) X en lu S E B -T L
Giới thiệu: XenluSEB-TL là enzym cacbohydraza ở dạng lỏng được sản
xuất bằng cách điểu khiển quá trình lên men chủng chọn lọc không biến
đổi gen của Trichoderma. Enzym này đạt tiêu chuẩn thực phẩm, được
chứng nhận là thành phần hữu cơ dùng cho thực phẩm. XenluSEB-TL
chứa một hỗn hdp enzym làm yếu đi các tế bào thành ngoài các hạt,
enzym xúc tác cho sự phân cắt xenluloza/hemixenluloza/beta—glucanoza,
thường được tìm thấy trong các tế bào thành ngoài của thực vật. Enzym
xúc tiến quá trình dịch hoá, giảm độ nhớt, gia tăng sự tách ỉỏng/rắn và
sự chiết các thành phần của tế bào thực vật như là sự chiết protein, tinh
bột, đưòng, dầu, chất tạo vị, màu, càfê, trà, những chất có nguồn gốc
thực vật. Về cơ bản, XenluSEB-TL không ảnh hưởng tối hoạt tính của
proteaza và amylaza.
Tiện ích:
- Gia tăng hiệu suất trích ly thực vật lỏng hoặc rắn khoảng 5 - 20%.
- Quá trình trích ly nước ỏ điều kiện nhiệt độ và pH ôn hoà.
- Gia tăng sự tinh khiết của quá trình trích ly.
- Giúp quá trình phần tách và cô đặc chất rắn nhanh và dễ hơn.
- Quá trình làm trong và lọc rấ t thuận tiện.
- Gia tăng hiệu suất và lợi nhuận sản xuất.
Công dụng: XenluSEB—TL sử dụng cho quá trình trích ly, dịch hoá
trong ngành công nghiệp thực phẩm, cồn, tinh bột, bia. Trong ngành

180
công nghiệp thực phẩm, XenluSEB-TL sử dụng để nâng cao hiệu quả
quá trình chế biến và trích ly của gluten lúa mỳ và ngô, protein đậu
nành, bột ngũ cốc, dầu quả và hạt, hương và màu, càfê, trà và các chất
thực vật khác. Trong công nghiệp nước giải khát có cồn và bia,
XenluSEB-TL sử dụng để cắt các polysaccarit ở tế bào thành ngoài của
hạt ngũ côc để tăng độ đường, có khả năng lên men và giảm độ nhớt dịch
cháo. Thông thường được thêm vào trong quá trình dịch hoá.
Đặc điểm: Trạng thái là dung dịch màu nâu, mùi vị đặc trưng của
sản phẩm lên men và tan hoàn toàn trong nước. Nhiệt độ sử dụng trong
khoảng 39 - 60°c, pH 4,5 - 6. N hiệt độ vô hoạt b ắ t đ ầ u từ 65°c, pH vô
hoạt < 3 và > 7.
Liều lượng: Liều lượng sử dụng phụ thuộc: (1) Kích thước của nguyên
liệu thực vật sau khi nghiền; (2) Nhiệt độ và pH xử lý enzym; (3) Kiểu
thiết bị trích ly và cô đặc được sử dụng; (4) Nồng độ cơ chất (thông thưòng
12 - 25%); (5) Thời gian xử lý (thông thường là 1 - 48 giò); (6) Liều lương
đề nghị cho quá trình trích ly: 0,2 - 25kg/tấn chất nền; (7) Liều lượng để
nghị cho quá trình lọc: 0,2 - lkg/tấn malt hoặc hạt ngũ cốc và (8) Tăng thời
gian xử lý thì giảm được liều lượng enzym sử dụng.
Chất lượng kỹ thuật: XenluSEB-TL đạt tiêu chuẩn ISO 9002. Các
dặc tính kỹ th u ật tuân các tiêu chuẩn dành cho enzym thực phẩm của
FAO/WHO JECFA, FCC và JOAM
Bao bỉ: XenluSEB-TL được đóng trong thùng 22kg, 250kg, 1.200kg.
Bảo quản: XenìuSEB-TL phải được bảo quản ỏ nơi khô ráo và lạnh.
Bảo quản trong container kín với nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng 10°c,
nhằm giũ được hoạt tính trong thời gian dài bảo quản. Bảo quản trong
điều kiện này thì sau một năm hoạt tính mất không cao hơn 5 - 10%.
Bảo quản không đúng điều kiện như trên (> 10°C) thì sẽ giảm hoạt tính
của enzym và liều lượng sử dụng sẽ phải cao hơn.
5.6.10. Ý nghĩa của việc sử dụng enzym trong công nghiệp
a) Công ng hiệp củ a m ứ t kẹo (Confectionery)
Áp dụng enzym để chế biến xiro maltoza cao và xiro đưòng nghịch
đảo cao. Các loại enzym này được sử dụng: Bổ sung vào bánh kẹo làm
cho bánh kẹo ngọt, chông lại hiện tượng kết tinh lại đưòng hay gọi là
hiện tượng “sạn đường”. Đồng thòi các loại xiro này có tác dụng giữ nước
cho sản phẩm.

181
 b) Cổng nghê đổ uống (Soft drink)
- Sử dụng enzym để sản xuất xiro fructoza cao.
- Sử dụng xiro vào các mục đích: Tạo vị ngọt và tạo nhũ tương và sự
ổn định hồ hoá tinh bột
c) Công n ghệ đồ hộp (Canning)
- Sử dụng enzym để sản xuất xiro: Xiro đường nghịch đảo cao; xiro
đưòng nghịch đảo thấp và xiro fructoza cao.
- Nhằm mục đích: Cân bằng, điều hoà vị ngọt cho đồ hộp.
d.) Công nghệ thự c p h ẩ m nư ởng (Bake)
- Sử dụng enzym sản xuất xiro đường nghịch đảo cao hoặc đưàng
tổng số.
- Mục đích: Giữ ẩm cho sản phẩm khi gia nhiệt và sản phẩm mềm,
màu đẹp, mùi thơm.
e) Công n ghệ m ứ t hoa quả
- Sử dụng enzym sản xuất xiro fructoza cao và đưòng nghịch đảo cao.
- Mục đích: Bảo quản mứt quả, chống khô và tạo sự mềm mại và sự
keo hoá của mứt.
f) B ia rượu tổng hợp
- Sử dụng enzym để tạo xiro đưòng nghịch đảo cao.
- Mục đích: Tạo nên khả năng lên men cao và sự có m ặt của đường
nghịch đảo làm cho bia rượu dư vị dịu hơn.
g) Công nghệ kem lạnh
Mục đích: Bảo vệ đặc tính của kem khi làm lạnh, chống hiện tượng
kết tinh đường và cân bằng, điều hoà vị ngọt của kem.
h) Trong che độ cho người ăn kiêng
- Sử dụng enzym để sản xuất các dextroza và maltodextrin.
- Mục đích: Giảm năng lượng và điều chỉnh hàm lượng cacbohydrat
trong thực phẩm cho người ăn kiêng.

CÂU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG 5

1. Hãy nêu các loại và tác dụng chủ yếu của enzym amylaza lên cơ
châ't tinh bột và các sản phẩm chuyển hoá của nó.
2. Hãy nêu các loại và tác dụng chủ yếu của enzym proteaza lên cơ
chất protein và các sản phẩm chuyển hoá của nó.
182
3. Hay nêu các loại và tác dụng chủ yếu của enzym pectinaza lên cơ
chất pectin và các sản phẩm chuyển hoá của nó.
4. Hãy nêu các loại và tác đụng chủ yếu của enzym xenlulaza lên cơ
chất chính và các sản phẩm chuyển hoá của nó.
5. Hãy nêu các loại và tác dụng chủ yếu của enzym saccaraza và
glucoamylaza lên cơ chất chính và các sản phẩm chuyển hoá của nó.
6. Hãy nêu tính chất, điều kiện tác dụng chủ yếu của enzym endo-
glucanaza (Cereflo) lên cơ chất chính và ứng dụng của nó.
7. Hãy nêu tính chất, điều kiện tác dụng chủ yếu của enzym
Termamyl —120L và Termamyl s c lên cơ chất chính và ứng dụng
của nó.
8. Hãy nêu tính chất, điều kiện tác dụng chủ yếu của enzym a - amylaza
(fungamyl) và AMG (amyloglucooxydaza) lên cơ chất chính và ứng
dụng của nó.
9. Hãy nêu tính chất, điểu kiện tác dụng chủ yếu của enzym Maturêx
- L (a - axetolactatdecacboxylaza) và neutraza lên cơ chất chính và
ứng dụng của nó.
10. Hãy nêu lên một số loại enzym mới sản xuất từ vi sinh vật của
Hãng NOVO và ứng dụng chủ yếu của nó cho các ngành công
nghiệp nào hiện nay (Dextrozym GA; Liquozym Supra và
XenluSEB-T)?
11. Hãy nêu lên một sô' ứng dụng quan trọng của enzym trong các
ngành công nghiệp Việt Nam và thê giới hiện nay.
12. Quá trình sử dụng enzym trong các ngành công nghiệp cần phải chú
ý an toàn và bảo vệ môi trưòng ra sao?

183
 C hương 6

ỨNG DỤNG ENZYM

TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHAM

6.1. TÌNH HÌNH ỨNG DỤNG ENZYM TRONG CÔNG NGHIỆP TRÊN THẾ
GIỚI VÀ ở VIỆT NAM
Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hoá của enzym,
loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuầ't và ứng dụng enzym trong
công nghiệp. Số’ lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và sô" lượng
enzym được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều. Các
enzym quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp được trình
bày trong bảng 6.1.
Bảng 6.1. Mức độ ứng dụng của một sô' enzym quan trọng hiện nay
trên thê' giới
TT Loạỉ enzym Tỷ lệ ứng dụng (%)
1 Proteaza 59
Trypxin 3
Rennet 10
Proteaza axit 3
Proteaza trung tính 12
Proteaza kiếm yếu 6
Proteaza kiềm mạnh dùng trong chất tẩy rửa 25
2 C acbohydraza 28
Pectinaza 3
Izomeraza 6
Xenlulaza 1
a - amyla2a 13
p - amylaza 13
3 Lipaza 3
4 C ác enzym khác sử dụng trong y học và trong phân tích 10

Các en 2ym thuộc nhóm proteaza hiện đang được ứng dụng nhiều
nhất. Trong đó, enzym proteaza kiềm được ứng dụng trong chất tẩy rửa
với sô lượng lớn nhất so với các loại enzym khác. Trong sô" enzym được
sản xuất và ứng đụng trên thế giới thì các nước Châu Âu sản xuất và
bán ra thị trường thế giới sô lượng nhiều nhất (bảng 6.2).
184
 Bảng 6.2. Thị trường enzym ỏ Châu Ẩu

TT Loại enzym Doanh thu (triệu USD)

1 Cacbohydraza 83,2
2 Proteaza 187,2
3 Lipaza 31,6
4 pectinaza 41,6
5 Những loại enzym đặc biệt 20,8
6 Các loại enzym khác 41,6
Nguồn: Frost và Sullivan, 1992
Riêng trong công nghệ thực phẩm, lượng enzym được tiêu thụ nhiều
nhất. Số lượng enzym được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm chủ
yếu ở các nước Châu Mỹ, Châu Âu.
Bảng 6.3. ThỊ trường enzym trong công nghệ thực phẩm,
thức ăn gia súc trên thế giới

L ĩn h vực c ô n g n g h iệ p v à D o a n h th u L ĩn h v ự c c ô n g n g h iệ p v à Doanh thu

enzym (tr, USD) enzym (tr. USD)
Chuyển hoá tin h b ộ t 140 Cồn 32
A m y lo g lu c o o x y d a z a 55 a - amylaza
a - amylaza 40 A m y lo g lu c o o x y d a z a
G lu c o z a iz o m e ra z a 20 pullulanaza
X e n lu la z a , h e m ix e n lu la z a 50 p - g lu ca n a za
E n zym n ấ m sợi 3 X e n lu la za - h e m ix e n lu la z a
Pullulanaza 1 Công nghiệp bánh kẹo 15
p - a m y la z a 1 A m y la z a nấm sợi 10-12
a - a m yla za 1-2
Công nghiệp SŨS 110 Pr o te a z a 1-2
Rennet động vật 75 Xenlulaza - hemixenlulaza 1-2
Rennet vi sinh vậl 20
Lipaza - esteraza 8 Thụt phẩm hỗn hợp 15
L yso zym 6 Inve rta za 8
L ipa za 2
Rượu, bia, nước g iả i khát 46 B rom e lin 3 -4
P e c lin a z a 10 Glucoza oxydaza 1 -2
P ap ain 8
(1 - glucanaza 4 Thức ăn gia súc 8
Xenluiaza - hemixenlulaza 3 -4 p - g lu ca n a za 3 -4
a- a m y la z a 2 -3 Xenlula2a - hemixenlulaza 2-3
Amylo glucooxyda2a 1-2 a - amylaza <1
Glucoza oxydaza 0,5 Glucoza oxydaza <0,5
proteaza vi khuẩn < 0,5
N guỗn:A. Wiseman, 1998

185
 ở Việt Nam, công nghệ enzym chưa phát triển. Các nghiên cứu có
dề cập đôn hầu hết các loại enzym của động vật, thực vật và vi sinh vật,
nhưng chưa có enzym nào được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Việt
Nam vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzym từ nước ngoài. Trong
đó nhiêu nhất vẫn là các loại enzym của hãng NOVO, Đan Mạch. Điều
đó cho thấy, việc hiểu biết, nghiên cứu, phát triển sản xuất enzym tại
Việt Nam là rấ t cần thiết.

6.2. MỘT SỐ ENZYM QUAN TRỌNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP
THỰC PHẨM
6.2.1. Amylaza
Amylaza là enzym tinh bột, đóng vai trò râ't quan trọng trong công
nghiệp thực phẩm. Cơ chế tổng quát của amylaza, như sau:
a-am ylaza
Dextrin + oligosaccarit
Tinh bột
Dextrin
Pullulanaza

P-amylaza
Maltoza
Dextrin
Glucoza
Amyloglucozidaza
Enzym amylaza chia ra làm hai nhóm:
1) E n d o am y laza (a - amylaza, EC.3.2.1.1). Nhóm này lại chia ra
làm hai nhóm nhỏ:
- a -1,4 - glucano hydrolaza
- a - 1,6 - glucano hydrolaza. Nhóm nhỏ này bao gồm: izoamylaza
(EC.3.2.1.68) hay pullulanaza (EC.3.2.1.41).
2) E xoam ylaza. Nhóm này gồm có:
- p - amylaza (EC.3.2.1,2).
- Amy lo glucooxydaza (glucoamylaza) (EC 3.2.1.3).
a) a - a m y la za (EC 3.2.1.1)
a - amylaza có nhiều trong malt. Tuy nhiên trong công nghiệp,
người ta thưòng sản xuất a —amylaza từ nuôi cấy vi sinh vật hay từ
tuyên tuỵ (pancreas). Mỗi một loại a — amylaza có tính chất enzym
riêng. Điều đó phụ thuộc vào nguồn khai thác a —amylaza.
- a - amylaza vi khuẩn:
Trên thị trường enzym thế giói có bán hai dạng sản phẩm: sản
186
 phẩm a —amylaza dạng lỏng và a —amylaza dạng bột. Enzym a —amylaza
dạng bột có hoạt tính 20.000 —30.000SKB/g, pH hoạt động mạnh ở giá
trị 5. Enzym a - amylaza dạng lỏng có hoạt tính 3.000 - 12.000 SKB/g.
Đặc biệt, a — amylaza dạng bột được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus
amyỉolique - faciens có hoạt tính rất cao, vào khoảng 500.000SKB/g.
Dựa vào khả nãng chịu nhiệt, a - amylaza của vi khuẩn chia ra làm
h ai loại:
+ Loại a —amylaza vi khuẩn chuẩn (standard —a - amylaza), loại này
được sản xuất từ Bacillus subtiỉis, nhiệt độ hoạt động tổì ưu là 70 —85°c.
+ Loại a —amylaza vi khuẩn chịu nhiệt (head stable a —amylaza)
thường được sản xuất từ Baccillus licheniformis, có nhiệt độ hoạt động
tối ưu là 90 —105°c.
Khả năng chịu nhiệt của a - amylaza phụ thuộc vào pH, hàm lượng
muối canxi, nồng độ cơ chất. Ví dụ: ở pH 7,0, enzym hoạt dộng mạnh ở
nhiệt độ 103 - 105°c trong 7 —11 phút; ở pH 3,5 - 4,5, enzym hoạt động
mạnh ở 80 - 90°c trong 5 —30 phút.
a - amylaza của vi khuẩn bền trong ion canxi. Một scí được hoạt hoá
■ bởi NaCl. Các ion kím loại nặng như đồng, sắt thường ức chế hoạt động
của enzym. Khi thuỷ phân tinh bột, a - amylaza thường tạo ra các sản
phẩm có tỷ lệ như sau:
G](glucoza) 5%, Gs (maltopentaoza) 16%,
G2(maltoza) 7%, G6 (maltohexaoza) 22%,
Ga (maltotrioza) 13%, G7 (dextrin cao phân tử) 33%,
G4 (maltotetraoza) 4%.
Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng DE (dextrose
equyvalent) để biểu thị khổ năng phân cắt tinh bột. Người ta thường sử
dụng a - amylaza của vi khuẩn để thu nhận maltodextrin có DE là 20, còn
khi cần thu nhận maltodextrin 40, người ta sử dụng enzym của nấm sợi.
- a - amylaza của nấm sợi:
Người ta thường thu nhận a - amyiaza của nấm sợi từ Aspergillus
niger và Aspergillus oryzae. a - amylaza của nấm sợi thường kém bển
nhiệt hơn a - amylaza của vi khuẩn và rế t dễ bị biến tính trước khi tinh
bột được gelatin hoá. Khi cho enzym amylaza của nấm sợi thuỷ phân
tinh bột sẽ tạo ra các sản phẩm có tỷ lệ như sau: Gj: 8%; Ga: 32%; G4:
18%; G5: 9%; GB: 4% và dextrin phân tử cao 17%.
Các chế phẩm a — amylaza của nấm sợi được bán trên thị trường
hiện nay có hoạt tính từ 500 - 100.000SKB.
b) f i - a m yla za (EC 3.2.1.2)
Enzym này cố trong hạt đậu, khoai tây,... Enzym này tham gia

187
phân giải chuỗi amylaza, còn đối với amylopectin, enzym này tham gia
phân cắt glucoza thứ hai, thứ ba từ điểm liên kết a - 1,6 glucozit. Nhiệt
độ hoạt động tối ưu của p - amylaza là 55°c, pH 5 - 5,5. p - amylaza
trong malt thuỷ phân tinh bột tạo ra maltoza. Maltoza là sản phẩm chủ
yếu của hoạt động p —amylaza.
c) P a n crea tic am yla za
Enzym này có nhóm —SH, vì thê enzym này rấ t dễ bị biến tính bởi
ion kim loại nặng. Khi có mặt của ion clorit, hoạt tính m ạnh nhất của
chúng ở pH 7.
Bảng 6.4. Một số tính chất của a - amylaza từ các nguổn khác nhau
TT Loại enzym Nguổn enzym Khoảng pH K hoảng nhiệt độ
tối ưu tối ưu (“C)
1 Pancreatic enzym Tuyến tuỵ động vật 5 ,5 - 8 ,5 40-50
(6.0 -7 ,0 ) Mất hoạt tính ở 75°c
2 a - amylaza VI khuẩn 8. sublitis 4,5 - 9 ,0 7 0 -8 5
8. amyloìiqueỉaàeins (6,5 - 7,5) Mất hoạt tính ở 95°c
3 a - amylaza của vi B. licheniformis 5 ,8 - 8 ,0 90 - 105
khuẩn Ưa nhiệt (7,0) Mất hoạt ưnh ở 120°c
4 a - amylaza của nấm A. niger 4,0 - 7,0 5 5 -6 0
sợi A. oryzae ( 5 0 - 6 ,0 ) Mất hoạt tính ở 80°
5 a - amylaza cùa malt Malt đại mạch, tiểu 3,5 - 7 ,5 60-70
mạch (4,5-7,0) Mất hoat tính ở 85°c

d) Iso a m yla za và p u llu la n a z a

- Izoamylaza (EC,3.2.1.68) là enzym thu nhận từ nấm men và nấm sợi.
- Pullulanaza (EC.3.2.1.41) là enzym thu nhận từ vi khuẩn Aerobacter
aerogenes hay từ Kĩebsieỉỉa.
Dưới tác động của izoamylaza hay pullulanaza, sản phẩm tạo thành
sẽ là glucoza. Trong quá trình thuỷ phân, người ta thường sử dụng
enzym này vối amyloglueooxydaza. Hoạt tính tối ưu của chúng ỏ pH 6
và nhiệt độ 60°c. Khi thuỷ phân cùng amyloglucooxydaza, hoạt tính tối
ưu của chúng ở pH 4 —5 và nhiệt độ 45°c.
e) G lucoam ylaza (EC.3.2.1.3)
Enzym này còn có tên là amyloglucooxydaza. Enzym thuộc nhóm
exo - a - 1,4 D - glucan glucohydrolaza. Theo lý thuyết, enzym này thuỷ
phân tinh bột để tạo ra glucoza có hiệu suất đến 100%.
Phần lớn những sản phẩm thương mại của glucoamylaza ở dạng
dung dịch đã được ổn định vối NaCl hay glyxerol. Những sản phẩm
188
thương mại giucoamylaza cỏ hoạt tính 200 - 600ƯI/g. Hoạt tính riêng
vào khoảng 4.000 Ul/g protein.
Bảng 6.5. Một sấ tính chất của glucoamylaza
STT Nguổn enzym Khoảng pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu (°C)
1 Aspergillus niger 3 ,0 -6 ,0 5 5 -6 0
Tối ưu ở 4 ,5 - 5,0 Mất hoạt tính ở 90°c

1
2 Aspergillus awamori 5 5 - 65

o
Tối ưu ở 3,0 - 5 ,0 Mất hoạt tính ở 85°c
3 Rhizopus niveus 3,0 - 6 ,0 5 5 - 60
Tối ưu ở 3,0 - 5,5 Mất hoat tính ở 70 - 80°c

Hiện nay người ta sản xuất nhiều enzym glucoamylaza dạng cố định.
Phương pháp cố định thông dụng nhất đối vói enzym này là phương pháp
tạo cầu nối đồng hoá trị. sử dụng enzym glucoamylaza không tan thường
thực hiện phương pháp liên tục ở nhiệt độ 55°c, pH 4,5.
Bảng 6.6. Một sô' tính chất của glucoamylaza hoà tan và không hoà tan
được sử dụng nhiều trong thuỷ phân tinh bột
TT Tính chất Glucoamylaza Glucoamylaza
hoà tan không hoà tan
1 Nồng đô cơ chất 35% 35%
2 pH 4,5 4,5
3 DE 1 0 - 15 3 0 -4 0
4 Thể tích thùng phản ửlng 60.000 lít 500 lít
5 Thời gian phản ứng 48 - 72 giờ 0,5 giờ

f) G lucoza izom eraza (EC.5.3.1.5)

Đường glucoza có độ ngọt khoăng 65% độ ngọt của đường saccaroza.
Đường fructoza có độ ngọt khoảng 120 - 180% độ ngọt của aaccaroza, do
đó việc izome hoá glucoza thành fructoza có ý nghĩa rấ t lớn.
Những nghiên cứu về enzym izomeraza xuất hiện không lâu:
- Năm 1957, khái niệm glucoizomeraza mới thấy xuất hiện trong
một sô" tài liệu.
- Năm 1960, Marshall lần đầu tiên đưa ra phương pháp sản xuất
fructoza bằng glucoizomeraza từ glucoza và đây cũng là patnet đầu tiên
được công bô".
- Năm 1965, Takasaki và những cộng tác viên đã công bố công trình
nghiên cứu sản xuất glucoizomeraza không tan tại Nhật Bản.
- Năm 1967, tại Mỹ, công ty Clinton Corn Processing đã sản xuất
theo quy mô công nghiệp xiro fructoza bằng công nghệ enzym cố' định
của Takasaki.
189
 - Nám 1970, phương pháp sản xuất fructoza theo phương pháp liên
tục cũng được thực hiện tại Công ty Clinton Corn Processing.
- Năm 1975, xuất hiện những bể phản ứng cố định có dung tích rất
lớn dùng để sản xuất xiro fructoza.
- Năm 1978, xuất hiện phương pháp tinh sạch xiro fructoza.
- Năm 1984, hai hãng Coca Cola và Pepsi cola đã sử dụng xiro
fructoza vào các sản phẩm của mình.
- Năm 1989, xuất hiện nhiều báo cáo vể sử dụng các tác nhân gây
đột biến, thu nhận giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
glucoizomeraza cao.
- Từ năm 1990 đến nay, toàn bộ công nghệ sản xuất glucoizomeraza
đã được sản xuất bằng enzym glucoizomeraza không tan.
Hiện nay, trên th ế giới có rất nhiều sản phẩm enzym không hoà tan
dùng trong sản xuất glucoza - fructoza. Các sản phẩm thương mại đó
được trình bày trong bảng 6.7.
Bảng 6.7. sản phẩm thương mại glucoizomeraza không hoà tan
(theo Pedersen, 1991)

Giá tri
Nơi Tén Nguổn Phương pháp
hoạt tính ỏ
sản xuất thưdng mại enzym c ố định
60 °c/gỉờ
CPC (enzym G - zyme G.994 s. oìivocbro - mogenes Trao đổi anion resin 6
Bio - Systems)
Genencor Int Spezyme s. rubiginnosus Hấp thụ trẻn DEAE 3.9
(600 IGIU/g) xenluloza với
polystyren và TíOj

Godo Shusei AGI - s - 600 S. griseofuseus Chitosan 3,1

IBis Maxazyme Actìnoplanes Tạo màng bọc 1.2
(1.100 MGiu/g) missouriensis gelatin
NAGAZA Sweetaza s. phaechro - Trao đổi anion, tạo 1,4
mogenes hạt
NOVO Sweetzym s. murinus Cố định trên 2,1
Nordísec A/S (300 lglú/g) glutaraldehyt
Solway Optisweet 11 s. rubiginosus Cố định trên 6,8
glutaraldehyt
s Otway Takasweet Flavobacterium CỐ định trên 2,0
(200 MlGic/g) Arbouscens potyamin
UOP Ketomax 100 s. olivochro - Cố định trên 5,2
mogenes ceramic

190
6.2.2. Xenlulaza
Xenlulaza là một phức hợp gồm nhiều enzym. Các loại enzym trong
phủc hợp này sẽ phân huỷ lần lượt xenluloza thành sản phẩm cuối cùng
là glucoza.
Theo Wood và Mc Crae (1979), quá trình thuỷ phân xenluloza được
thực hiện bỏi ba nhóm enzym sau: exoxenlulaza hay exobiohydrolaza
(EC.3.2.1.91), endoxenlulaza hay endoglucanaza (EC.3.2.1.91) và
p - glucooxydaza hay xenlobiaza (EC.3.2.1.21).
a) E xo xen lu la za còn gọi là 1,4 p - glucan xenlobiohydrolaza.
Enzym này thủy phân xenlobioza từ đầu không khử của chuỗi glucan và
xenlodextrin. Exoxenlulaza được sản xuất từ Trichoderma và
Aspergillus.
b) E ndoglucanaza còn gọi là 1,4 (3-D-glucan—4-glucano-hydrolaza.
Enzym này được sản xuất từ nhiều vi sinh vật khác nhau như:
Aspergillus, Trichoderma, Penicilỉium và rất nhiều vi khuẩn khác nhau.
Khối lượng phân tử vào khoảng 12.000 - 50.000.
c) Xenlobiaza còn gọi là p-glucooxydaza hay (3-D glucozit glucohydrolaza.
Enzym này tham gia phân huỷ xenlobioza và xenlodextrin đến
xenlohexoza và cuổì cùng thành glucoza. Enzym này được sản xuất từ
Trichoderma, đặc biệt là từ Aspergillus niger. Khối lượng phân tử của
chúng vào khoảng 35.000 (đôì với Trichoderma) và 218.000 (đổì với
Aspergillus oryzae).
Các loại xenlulaza thu nhận từ nấm sợi Trichoderma spp hoạt động
mạnh ở pH 3 - 7, nhiệt độ tối Ưu là 40°c, Các loại enzym thu nhận từ
nấm sợi Aspergillus spp. hoạt động mạnh ỏ pH 4 - 6, còn xenluloza thu
nhận từ Penicillỉum hoạt động mạnh ở pH 5 - 8 .
Các loại xenlulaza của vi khuẩn hoạt động ở pH rất rộng (pH 5 - 10).
6.2.3. Hemixenlulaza
Enzym hemixenlulaza là một phức hợp gồm nhiều enzym và được
thu nhận từ thực vật, nấm sợi Aspergillus, Trichoderma, nấm men và
vi khuẩn.
a) D extranciza (EC.3.2.1.11)
Enzym này thu nhận từ Peniciỉỉỉum. Chúng phân huỷ liên kết 1,6 D
- glucozit của dextran. Chúng hoạt động mạnh ở pH 5 - 5,5 và ỏ nhiệt
độ 40 - 55°c.

191
 b) I n u lin a z a (EC.3.2.1.7)
Enzym này được thu nhận từ Aspergillus nấm men. Chúng hoạt
động mạnh ở pH 3,0 - 6,0 và ở nhiệt độ 35 - 50°c. Chúng chuyển hoá
inulin thành fruetoza với hiệu suất 99% trong 24 giờ.
c) f ỉ - g lu c a n a za từ n ấ m sợi
Enzym này thu nhận từ Aspergillus niger và Penicilỉium emesonỉi.
Các chê phẩm thương mại của enzym này có chứa cả a —amylaza.
p —glucanaza của Asp. oryzae hoạt động mạnh ở pH từ 4 —6 và nhiệt
độ 60°c. p —glucanaza của Penicillium emesomi hoạt động mạnh ở 70°c.
d) p - g lu c a n a za từ vi k h u ẩ n
Enzym được thu nhận từ Bacillus subtilỉs, có chứa một ít enzym
a - amylaza và proteaza. Chúng hoạt động mạnh ỏ pH 6 - 7 ,5 , dễ dàng
mất hoạt tính ở nhiệt độ > 60°c. Tuy nhiên, người ta hiện cũng đã tìm
được những p - glucanaza của vi khuẩn rất bền nhiệt, có thể giũ được
hoạt tính ở 80°c.
e) X yla n a za và p e n to sa n a za
Người ta đã sản xuất xylanaza và pentosanaza theo quy mô công
nghiệp từ Aspergillus spp. và Trichoderma. Các enzym này hoạt động
mạnh ở pH 3,5 —6,0 ỏ 50 —55°c. Các enzym này còn được phối trộn với
pectinaza dùng trong sản xuất nước quả.
6.2.4. Pectinaza
Người ta chia pectinaza ra làm ba nhóm: Pectin methylesteraza,
pectin depolymeraza và exoenzym.
a) P ectin m eth ylestera za (EC.3.1.1.11)
Enzym này tham gia thuỷ phân pectin tạo thành axit pectic và
methanol. Enzym này có một cái tên khác là pectiesteraza (PE). Đây là
enzym rấ t đặc hiệu, hiệu suất phân giải pectin có thể đạt 98%.
Người ta thường thu nhận pectiesteraza từ nấm sợi. Các pectiesteraza
của nấm sợi hoạt động mạnh ở pH 3 - 5, còn pectiesteraza của vi
khuẩn lại hoạt động m ạnh ỏ pH 7 - 8 . Chúng bị m ất hoạt tính khi đun
nóng 85°c.
b) P ectin depolym eraza
Enzym này có trong thực vật. Trong công nghiệp ngưòi ta sản xuất
enzym này từ nấm sỢi và từ vi khuẩn. Tuỳ thuộc vào cơ chế phân giải và

192
cơ chất mà chúng táo động, enzym pectin depolymeraza được chia làm
bốn loại sau: (1) Endo - pectin transeliminaza (EC.4.2.2.3), PTE; (2) Endo
- pectin axit transliminaza (EC.4.2.2.1), PATE; (3) Endo - polygalacturonaza
(EC.3.2.1.15), PG và (4) E ndo- polymethyl galacturonaza, PMG.
Đặc tính của một sô" pectin depolymeraza được trình bày trong
bảng 6.8.

Bảng 6.8. Giá trị pH tối ưu của một số pectin depolymeraza

TT Nguổn ch o enzym Loại enzym pH tối ưu

1 Aspergillus níger Endo - PMG 5,2
2 Aspergillus niger Endo - PMG 5,5
3 Flavobactenum pectinovomm Endo - PMG 7 ,4 - 8 ,2
4 Aspergillus niger Endo - PG 4 ,7 - 4 ,8
5 Aspergillus species Endo - PG 3 ,7 -4 ,2
6 Coniothyrum diploiella E n d o -P G 4,4
7 Aspergillus sojae Endo - PTE 5,5
8 Bacterium polymyxa E nđo-P T E 8 ,9 -9 ,1

6.2.5. Proteinaza
Proteinaza là enzym proteaza thuỷ phân các peptit bên trong
protein. Proteinaza được chia ra một sô’ loại dựa trên những đặc điểm
riêng của chúng cũng như cấu tạo trung tâm hoạt động của enzym.
- Một sô" proteinaza chứa lưu huỳnh (nhóm SH) ở trung tâm hoạt
động, chúng bao gồm: Papain, bromelin, íĩciĩi, một số enzym từ vi sinh vật.
- Metallo proteinaza cần ion kim loại như kẽm, magiê, hay cobalt.
Các loại proteinaza trung tính của vi khuẩn thuộc nhóm này, chúng bị
ức chế bởi EDTÀ.
- Protein có chứa histidin trong trung tâm hoạt động. Chúng bao
gồm proteinaza vi khuẩn, trypxin, chymotrypxin. Chúng bị ức chế trong
môi trưòng kiềm.
Proteinaza axit: Nhóm này gồm pepsin, trong trung tâm hoạt động
có chứa asparagyl hay glutamyl.
a) P a n crea tic p ro te in a za
Trong công nghiệp sản xuất enzym, người ta thường sản xuất chế
phẩm hỗn hợp giữa trypxin và chymotrypxin. Chế phẩm thương mại này
được sản xuất từ tuyến tuỵ. Trong chế phẩm thương mại này còn chửa
cả peptidaza khác, enzym amylaza, lipaza. Chế phẩm hỗn hợp này hoạt
193
động mạnh ở pH 8,5 - 9,0, nhiệt độ từ 30 - 40°c. Tuy nhiên, người ta
cũng có thể sử dụng pH là 7,5 và nhiệt độ 45 —50° c để thực hiện các
phản ứng.
Chế phẩm hỗn hợp bền vững trong dung dịch ỏ pH 3 —5. Nếu đưa
nhiệt độ lên 90°c ở pH 6 - 8 , chế phẩm enzym hỗn hợp sẽ bị m ất hoạt
tính. Khi cho 1 - 2g CaClg chế phẩm enzym hỗn hợp và hàm lượng cơ
chất cao sẽ làm ổn định enzym
Trong sản xuất công nghiệp, ngưòi ta thường sử dụng cơ chất là
cazein hay chromogen như là cơ chất để xác định hoạt tính của chế
phẩm enzym.
b) P epsin (EC.3.4.4.1). Pepsin thưòng được sử dụng chung với renet
trong sản xuất phomai và làm thuốc tiêu hoá. Hỗn hợp này hoạt động
mạnh ỏ pH 2 —4 và nhiệt độ 50°c,
c) R en et (rennin) ( EC.3.4.4.3). Rennin thường được sản xuất từ bao
tử cừu. Đây là enzym có hoạt tính đặc biệt rất cao. Ngưòi ta thường phối
trộn với pepsin theo tỷ lệ 1: 1 để sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa.
d) P a p a in (EC.3.4.22.2) Ngưòi ta thu nhận chế phẩm papain bằng
cách sấy khô mủ cây đu đủ Carica papaya. Trong mủ quả đu đủ có chứa
papain, chymopapain và một lượng nhỏ protein khác.
Trên thế giới có chế phẩm thương mại papain dạng bột và chế phẩm
thương mại dạng lỏng. Chế phẩm thương mại dạng lỏng thưòng được
làm Ổn định hoá bằng glyxerol. c ả hai dạng chế phẩm thương mại trên
được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh, trong sản xuất bia, và trong
công nghiệp chế biến thịt.
Ngoài ra, papain còn được sử dụng trong y học để làm lành các vêt
thương ngoài da.
Papain thô cỏ hoạt độ khoảng 400 - 600UI/g. Papain tinh khiết có
hoạt độ khoảng 100.000mUI/g. Papain hoạt động ồ khoảng pH rất rộng
(pH 4,5-10), pH tối ưu cho hoạt động của papain là 7 - 8, nhiệt độ tối ưu
cho phán ứng là 55 —60°c. Papain rấ t dỗ bị mất hoạt tính ỏ pH 3,0 khi
có mặt của oxy. Dung dịch papain ổn dịnh khi cho xystein hay sulfit.
e) B ro m elỉn (EC.3.4.22.5). Bromelin được sản xuất từ vỏ và chồi
của quả dứa. Chế phẩm thương mại bromelin thường có hoạt độ vào
khoảng 5.000 - 10.000UI/g (cơ chất là hemoglobin), Tuy nhiên, chế
phẩm bromelin thường không ổn định bằng papain.

194
 0 F icin (EC.3.4.22.3). Ficin có nhiều trong nhựa cây sung. Đặc tính
enzym của ficin gần giông papain. Ficin được ứng dụng nhiểu trong công
nghệ chế biến sữa.
g) P ro tein a za của ui sin h văt. Ngưòi ta thường sản xuất
proteinaza từ vi khuẩn và nấm sợi:
- proteinaza từ vi khuẩn:
Có hai loại proteinaza từ vi khuẩn được bán trên thị trưòng enzym
thế giới. Hai loại này khác nhau rấ t nhiều về khoảng pH hoạt động, mức
độ hoạt động và cấu trúc trung tâm hoạt động.
+ proteinaza kiềm (EC.3.4.21.14):
Chế phẩm này có tên thương mại là Subtilisin. Chế phẩm enzym
này có khoảng pH hoạt động 7 - 1 1 , trong trung tâm hoạt động của
chúng có serin. Chế phẩm enzym này dạng bột và dạng hạt có hoạt tính
1 - 6 đơn vị Anson/gram. Chế phẩm enzym này dạng kết tinh có hoạt
tính 25 - 30 đơn vị Anson/gram. Chế phẩm subtilisin còn được gọi là
enzym tẩy rửa vì được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa.
+ Proteinaza trung tính (EC.3,4.24.4):
Proteinaza trung tính là metallo - enzym, chúng có pH hoạt động
6 - 9 . Chế phẩm enzym này được sản xuất từ Bacillus subtỉlis,
B. thermoproteolyticus và Streptomyces griseus.
Chế phẩm enzym thưdng mại thường là dạng bột, có hoạt tính 0,5 - 2
đơn vị Anson/gam. Ngoài ra, chế phẩm thưdng mại của enzym này cũng
có dạng dung dịch lỏng. Chế phẩm proteinaza trung tính được ớng dụng
trong công nghiệp da, bia và công nghiệp sản xuất protein thuỷ phân.
Bảng 6.9. Tính chất của proteinaza kiềm và trung tính

TT Tính chất Proteinaza kiếm Proteinaza trung tinh

1 Khoảng pH hoạt động 7 ,0 -1 1 ,0 6,0 - 9,0

2 pH Ổn định tối ưu 7 ,5 -9 ,5 6 ,0 - 8 ,0
3 Chất kim hãm DIFP, PMSF EDTA
Chất kim hâm khoai tây + đậu nành Natri dodecylsulphat
4 Cơ chất đặc hiệu Este khác nhau, amit, peptit Một số peptit, este

Gtìi chủ: DIFP: Diisopropyl fluorophosphat; PMSF: Phenylmethan sulfonyl fluorit;

EDTA: Ethylen diaminetetra axetic axit
- Proteinaza từ nấm sdi:
Proteinaza nấm sợi thuộc proteinaza axit, kiềm và cả trung tính.

195
Enzym proteinaza thu nhận từ Aspergillus thường thuộc proteinaza axit
và trung tính. Các proteinaza axit và trung tính được ứng dụng để sản
xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Các proteinaza kiềm được ứng dụng
trong công nghiệp thuộc da.
Bảng 6.10. Tính chất proteinaza của nấm sợi
Khoảng hoạt động pH Chất
TT Vi sinh vật
Hemoglobin Cazain tôi ưu ức chê'
1 Aspergillus saitoi 3 ,0 - 4 ,5 2 ,5 - 3 ,0 2 ,0 - 5 ,0 NBS
2 Aspergillus oryzae 3 ,0 -4 ,0 2 5 - 3 ,0 5,0
(proteinaza axit)
3 Aspergillus oryzae 5,5 - 7 ,5 6 ,5 -1 0 ,0 7.0 EDTA
(proteinaza trung tính)
4 Aspergillus oryzae 6,0 - 9,5 3,0 7,0 - 8 ,0 DIFP
(proteinaza kiềm)
5 Paecilomyces varioti 3,5 - 5,5 2 ,9 - 3 ,3 3,0 - 5 ,0
6 Phizopus chinensis 5,0 5,6 3,8 - 6,5
7 Mucor pusillus 3 ,5 - 4 ,5 3,0 - 6 ,0

6.2.6. Lipaza (EC.3.1.1.3)

Lipaza là enzym cacboxylesteraza tham gia thuỷ phân gluxerit. Tuỳ
thuộc nguồn thu nhận và tính chất, người ta chia enzym này ra nhũng
loại sau:
a) P a n crea tic lip a za
Enzym này thu nhận từ tuyến tuỵ của heo. Chế phẩm enzym có chứa
cả esteraza, proteaza, amylaza và các zymogen. Enzym này tham gia phân
huỷ triglyxerit tự nhiên, dầu, chất béo, axit béo đơn giản và aryl este.
Các sản phẩm lipaza thương mại thường trộn ion canxi. Các ion canxi
ảnh hưỏng rất tốt đến hoạt tính enzym và tính bền vững của enzym.
Bảng 6.11. Tính chất lipaza từ nhiều nguõn khác nhau
TT Nguồn lipaza Khoảng pH hoạt Nhiệt độ hoạt pH ẩn định
động và pH tối ưu đọng (flC) hoat tinh
1 Pancreaza (heo non) 6 ,5 -9 ,5 (7 ,5 8,5) 4 0 -4 5 5 ,5 - 7 ,5
2 Phizopus sp 6 ,0 - 7 ,5 (7,0) 3 5 -4 0 4 ,0 - 8 ,0
3 Mucor favanicus 5 ,5 - 8 ,0 (7,0) 4 0 -4 5 4 ,5 - 6 ,5
4 Aspergillus niger 3,0 - 4,0; 7,5 - 9,0 4 0 -5 0 5 ,0 - 7 .0
5 Pseudomonas sp 4,0 -5 ,0 ; 7 ,0 - 8 .5 50-60 4,5 - 10,0
6 Candida cylindracea 5,0 - 7,5 4 0 -4 5 4 ,5 - 8 ,5
Ghi chú: pH: 3,0 - 7,0 đối với axit béo chuỗi ngắn; pH: 7,5 - 9,0 đối với dầu và chất
béo; pH: 4,0 - 5,0 ìà pH đối vối cả hai Í2oenzym.

196
 Ion canxi tác động đến hoạt tính và sự ổn định của lipaza phụ thuộc
vào NaCl có trong chế phẩm. Hàm lượng ion canxi tối ưu là 0,5g/l.
b) P reg a strỉc lip a za
Enzym này được sản xuất từ nguồn động vật, từ cừu, dê. Enzym này
tham gia quá trình thuỷ phân axit béo chuỗi ngắn trong chất béo của
sữa. Chúng được sử dụng nhiều trong sản xuất phomai đặc biệt.
c) L ip a za từ vỉ s in h văt
Nhiều nước trên th ế giới sản xuất Iipaza từ vi sinh vật bằng phương
pháp lên men. Vi sinh vật sử dụng để sản xuất lipaza theo quy mô công
nghiệp là nấm sợi và vi khuẩn. Các chế phẩm thương mại này thường
chứa lipaza và esteaza.
- Lipaza từ Aspergillus: Trong công nghiệp ngưòi ta thưòng sử
dụng Aspergillus nỉger và một số’loài thuộc chi Aspergillus khác để sản
xuất lipaza. Khôi lượng phân tử của lipaza nấm sợi vào khoảng
20.000 - 25.000. pH tổi ưu nằm trong khoảng 4,5 —6,5. Loại enzym này
tham gia phân giải dầu dừa, dầu ô liu với hiệu suất 48 —93%. Ngoài ra,
chúng còn được sử dụng trong sản xuất phomai.
- Lipaza từ Candida cylỉndracca: Khôi lượng phần tử của enzym
này vào khoảng 120.000, pH tối ưu của chúng từ 5,2 —7,2. Enzym này
thuỷ phân dầu ôliu đến 95 —97%.
- Lipaza từ Rhừopus sp: Ngưòi ta sử dụng nhiều giống Rhizopus để
sản xuất lipaza như Rhizopus arrhizus, R. javanicus, R. nivens,
R. deỉemar. Trong đó, giông R. arrhizus được ứng dụng nhiều hơn cả.
Lipaza từ Rhizopus có khôi lượng phân tử 43.000. Enzym này là
glycopeptit chứa 13 - 14% mannoza, chúng hoạt động mạnh ở pH
5.0 - 7,0 và n h iệ t độ 30 - 45°c.
- Lipaza từ Mucor sp: Enzym này xúc tác cho chuyển este hoá
trong vị trí 1,3 của glyxerol. Chúng tham gia thuỷ phân cả axit béo và
axit béo ngắn.
- Lipaza từ Pseudomonas sp: Khối lượng phân tử của enzym này
vào khoảng 29.000. Chúng tham gia phân giải chất béo ở pH kiềm.
- Phospholipaza từ heo con: Người ta thường sản xuất phospholipaza
A. Chúng tham gia phản ứng chuyển hoá este hoá của lecithin thành
lysoleathin.
6.2.7. Lacaza (EC.3.2.1.23)
Enzym này còn được gọi là p - galactisidaza. Chúng tham gia thuỷ
phân lactoza thành glueoza và galactoza. Người ta sản xuất enzym này

197
từ nấm men và nấm sợi. Nấm sợi được sử dụng nhiều là Aspergillus
oryzae và A. niger.
Bảng 6.12. Tính chất của lacaza

Nguổn lacaza
TT
Tính chất của lacaza Nấm men Nấm sợi

1 pH hoạt động 6,5 - 7 ,0 4 ,5 - 6 ,5

2 Nhiệt độ tối Ưu 30 - 75°c 40 - 50°c

3 pH ổn định tối ưu và nhiệt độ tối ưu 6,5 -7 , 5; 30°c 4,5

6.2.8. O xydoreductaza
a) Gluco oxydaza (EC. 1.1.3.4)
Enzym này thường được sản xuất từ Aspergillus niger, A. oryzae và
Penicillium notatum. Chúng tham gia oxy hoá glucoza thành axit
gluconic khi có m ặt của oxy theo phương trình sau:
Glucoza + 0 2 + H20 —►5 —glưconolacton + H20 2
+ H20
Gluconic axit
Dưới tác dụng của catalaza, H2Oasẽ bị phân huỷ thành oxy và nưóc.
Glucooxydaza hoạt động trong khoảng pH 2,7 —8,5. Nếu nâng nhiệt
độ đến 80°c trong hai phút chúng sẽ bị biến tính. Enzym này được áp
dụng nhiều trong bảo quản nước quả, trong sản xuất mayonnais.
b) L ip o x yd a za (EC.1.13.1.13)
Enzym này còn được gọi là lipoxygenaza. Enzym này có thể thu nhận
từ bột đậu. Chúng tham gia oxy hoá axit béo. pH hoạt động từ 6,5 - 9,0.

6.3. ỨNG DỤNG ENZYM TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHAM

6.3.1. ứng dụng enzym trong chế biến bột và sản xuất bánh kẹo
Các nguyên liệu chứa tinh bột không chỉ là nguồn thực phẩm trực
tiếp quan trọng mà còn là nguồn nguyên liệu rấ t quan trọng để tạo ra
nhiều loại thực phẩm khác nhau.
Trong công nghiệp sản xuất bột và các sản phẩm từ nguyên liệu
chứa tinh bột, ở các nưốc Châu Âu và Châu Mỹ, người ta thường sử
dụng một số chế phẩm enzym thương mại theo bảng 6.13.

198
 Bảng 6.13. Một số chế phẩm enzym amylaza thương mại
TT C hế phẩm enzym Tên thương mại Hãng sản xuất
Tenaza Miles lab
1 a - amylaza vi khuẩn Optiamyl Miles Kali - chemie
BAN Novo - nordisk
Rapidaza Gist - brocades
Termamyl - 120L; Novo - nordisk
2 a - amylaza vi khuẩn Termamyl s c Miles iab
chịu nhiệt Taka-them II Miles lab
Taka-lite Miles Kali - chemie
opti-therm Maxamyl Gist - brocades
Diazym Miles lab
3 Amyloglucooxydaza Optidex Miles Kali - chemie
AMG Novo - nordisk
Spezym Fiun Biochemical
Amygaza Gist - brocades
4 p - amylaza Dextrozym (chứa AMG) Novo - nordisk
Promozym Novo - nordisk
5 Amylaza nấm sợi Biozym Amano
MKC. Fugal amylaza Novo - nordisk
Fungamyl claraza Miles lab

Ở các nước Châu Âu và Châu Mỹ, công nghiệp sản xuất bột bắp đă
phát triển từ rấ t lâu. Ngay ở Mỹ, nước có lịch sử không lâu như các nước
khác, nhưng công nghiệp sản xuất bột bắp cũng đã phát triển rấ t mạnh
ở th ế kỷ XIX. Khoảng 50% bột bắp trong tổng số 20 X 106 tấn bột bắp
được sản xuất hàng năm dùng để sản xuất mật tinh bột. Sô' còn lại dùng
cho chăn nuôi và làm các loại bánh.
6.3.2. ứng dụng enzym trong sản xuất xiro và các sản phẩm chứa đường
Hiện nay, các nước Châu Âu và Châu Mỹ sản xuất xiro đưàng
fructoza từ bột bắp (ngô) bằng phương pháp enzym phát triển rấ t mạnh.
Theo phương pháp này, phôi bắp được xử lý bằng S 0 2 và vi khuẩn lactic
dể hạt tinh bột mềm ra khỏi khối bột bằng ly tâm. Enzym chỉ được sử
dụng sau khi bột đã được hoà vào nước.
Chế phẩm enzym được sử dụng bao gồm xenlulaza, glucanaza,
proteaza, pectinaza. Công nghệ sản xuất xiro fructoza dược trình bày
như sau:

199
 Hình 6.1. Quá trinh chuyển hoá tính bột bắp (ngô) thành xiro fructoza

Theo công nghệ trên, dung dịch tinh bột bắp được điều chỉnh pH: 6 và
được hồ hoá ở nhiệt độ cao và được thực hiện theo phưdng pháp liên tục. ở
giai đoạn gia nhiệt này, người ta cho một lượng nhỏ a - amylaza để dịch
tinh bột có độ nhớt thấp, tránh hiện tượng cháy khét. Tiếp theo, người ta
cho lượng enzym còn lại vào. Đây là giai đoạn đưòng hoá rất mạnh để đạt
được giá trị DE (|dextrose equyvalents) 1 5 -2 0 phải mất hai giờ.
Ngoài tinh bột bắp, ngưòi ta còn sỏ dụng tinh bột khoai tây, tinh bột
mỳ, tinh bột sắn (khoai mỳ). Tuỳ theo nguồn nguyên liệu tinh bột mà
ngưòi ta áp dụng kỹ thuật khác nhau cho phù hợp.
Enzym được sử dụng trong công nghiệp sắn xuâ't xiro fructoza phải
là những enzym chịu nhiệt. Những enzym này thưòng được thu nhận từ
vi khuẩn Bacillus licheniformis, B. stearothermophilus. Ngoài ra, ngưòi
ta còn sử dụng a - amylaza từ nhiều vi sinh vật khác nhau. Đặc tính
của enzym a - amylaza từ các nguồn enzym khác nhau được trình bày
trong bảng 6.14. Đặc điểm quan trọng nhất cùa enzym amylaza là
chúng hoạt động ở pH gần trung tính (pH 6). Đặc điểm này giúp ta thực
hiện các quá trìn h đưòng hoá rấ t dễ đàng. Đặc điểm kỹ th u ật của từng
công đoạn sản xuâ't xiro fructoza được trình bày trong bảng 6.15. Trong
đó, hai giai đoạn dịch hoá và đường hoá đỏng vai trò rấ t quan trọng. Các
giai đoạn này thường quyết định các giai đoạn sau và quyết định đến
chất lượng sản phẩm.

200
 Bảng 6.14. Đặc tính enzym từ các nguồn vi sinh vật khác nhau

Khoảng pH, nhiệt Chất

Khoảng
Enzym Nguồn enzym nhiệt độ độ (°C) hoạt Chức năng
pH
<°c> phổ biến hoá
Gt - amylaza Aspergillus niger 4 -6 5 0 -7 0 4 ,5 - 6 ,5 Thuỷ phân
nấm sợi A. oryzae hạn chế
A. awamori tinh bột

a - amylaza Bacillus subtilis 6 -7 4 0 -8 0 6 -7 ,5 Ca2* Thuỷ phân

vi khuẩn ưa B. amylo - hạn chế
am liquefaciens tinh bột

u - amylaza B. licheniformis 5 - 6 ,5 9 0 - 120 5 -8 ,1 1 0 Ca2' Thuỷ phân

vi khuẩn chịu B. stearo - 4,5 - 6,5 6,115 tinh bột ở
nhiệt thermophilus nhiệt độ cao

[ỉ - amylaza B. polymyxa 4 -7 5 5 -7 5 5, 60 Tạo ra xiro

có DE thấp
Pulluanaza Bacillus sp 3,5 - 4 .5 5 5 -6 5 4, 60 Ca2* Phân cắt
mạch nhánh
Amyloglu - A. niger 3 - 4 ,5 5 5 -6 5 4, 60 Đường hoá,
cooxydaza cắt liên kết
1,4 glucozit

Bảng 6.15. Điều kiện chuyển tinh bột thành đường

trong công nghệ sản xuất xi ro fructoza

Hàm lượng
Hàm lưdng Nhiêt đô
Các công đoạn Chỉ s ố DE pH na2*
enzym (%) (°'c) ' Mg24
(mg/l) <mg/l)
Chuyển hoá tinh bột
- Dịch hoả lần 1 a —amylaza 2 -5 105 -115 5 ,5 - 6 ,5 50 -100
(0,01 -0 ,0 2 )
- Dịch hoá lần 2 a - amylaza 1 5 -2 0 9 0 -9 5 5,5 - 6 ,5 50 -100
(0,1 -0 ,2 )
Đường hoá Amylogluco - 9 8 -9 9 5 5 -6 5 4 - 4 ,5 50 -100
oxydaza (0,1)
Izome hoá Glucoza - 41% 5 5 -6 0 7 -8 2 2 5 -1 0 0
izomeraza fructoza
Làm giàu fructoza 5 5 -9 5 %
fructoza

201
 Trong công nghệ sản xuất xiro fructoza, nhiểu nước trên thế giới có
sử dụng enzym cô" định amyloglucooxydaza và pullulanza. Phương pháp
này thường thực hiện ỏ nhiệt độ 60°c và hàm lượng chất khô trong dịch
khoảng 30 — 35%. Các đặc tính cơ bản của công nghệ sản xuất xữo
fructoza bằng enzym cố định được trình bày trong bảng 6.16.
Bảng 6.16. Hiệu suâ't chuyển hoá tinh bột bằng enzym cố định
trong sản xuất xiro fructoza
Glucoza Maltodioza Maltotrioza Maltotetraoza
Enzym c ố dịnh
(%) (%) (%) (%)
ịi - amylaza 1 51 14 34
p - amylaza - pullulanaza 60 8 32
|ỉ - amylaza - pullulanaza - 2 69 18 11
a - amylaza

Ngoài công nghệ sản xuất xiro fructoza từ nguyên liệu ban đầu là
bột ngô ra, người ta còn tiến hành các quá trình izome hoá glucoza để
sản xuất xiro fructoza, izome hoá glucoza để sản xuất xiro fructoza.
6.3.3. ứng dụng enzym trong công nghệ sản xuất bánh mỳ
Các loại hoạt chất ngũ cốc như lúa mỷ, lúa nước, bắp (ngô), khoai
mỳ (sắn) là những nguồn nguyên liệu chính để làm bánh. Trong đó chỉ
có bột từ lúa mỳ mới là nguyên liệu để sản xuất bánh mỳ. Bánh mỳ như
là một loại lương thực chính của các nước Châu Mỹ và Châu Âu. Trong
vài thập niên gần đây, bánh mỷ được coi như một khẩu phần lương thực
của Việt Nam.
Trong quá trình sản xuất bánh mỳ, enzym được xem như một chất
phụ gia cho vào quá Lrình làm bánh để làm tăng chất lượng bánh mỳ.
Viện sĩ A.N. Bakh dã nói: “Trong điểu kiện công nghiệp sản xuât
bánh mỳ đã được tự động hoá thì quá trình hoá sinh xảy ra trong khi
chuẩn bị bột nhào, ổn định bột nhào và nướng bánh có ý nghĩa râ t lốn và
bây giò có thể nói chắc rằng, nếu không nắm được các kiến thức đó sẽ
không thể tổ chức san xuâ't bánh mỳ tốt được.
Trong sản xuất bánh mỳ, người ta sử dụng enzym nhằm giải quyết
một sô vân đề sau: Làm tăng nhanh thể tích bánh; làm màu sắc của
bánh đẹp hơn và làm tăng mùi thơm cho bánh. Sự tác động tương hỗ
giữa khả năng chuyển hoá của enzym cho vào trong quá trình chế biến
và sự hoạt động của nấm men sẽ làm tâng nhanh chất lượng bánh và
đảm bảo được những mục đích trên.

202
 Trong quá trình sản xuất bánh mỳ, người ta sử dụng những loại
enzym sau.
—Proteaza:
Enzym proteaza được sử dụng trong sản xuất bánh mỳ nhằm làm
giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, làm tăng hệ số tiêu hoá của
protein. Proteaza được sử dụng trong sản xuất bánh mỳ là những
proteaza trung tính.
- p - amylaza, a —amylaza:
Trong quá trình sản xuất bánh mỳ, người ta sử dụng cả a - amylaza
và p - amylaza. Các loại enzym này tham gia t h u ỷ phân tinh bột để tạo
thành đưòng. Nhò đó, nấm men Saccharomyces cerevỉsỉae sẽ dễ dàng
chuyển hoá chúng thành cồn, C 02l làm tăng thể tích của bánh và tạo ra
màu sắc, hương vị tốt cho bánh.
Nguồn amylaza thường sử dụng là từ malt. Tuy nhiên trong những
năm gần đây, nguồn nguyên liệu malt dần dần được thay thế bằng nguồn
nguyên liệu từ nấm sợi. Các chế phẩm enzym từ nấm sợi có ưu điểm là
trong chế phẩm này không chỉ chứa amylaza mà còn chứa proteaza và
một sô* enzym khác rất có lợi cho quá trình lên men. Trong khi đó, malt
chủ yếu chứa amylaza còn protaza và những enzym khác không đáng kể.
Chế phẩm enzym từ nấm sợi chủ yếu thu nhận từ Aspergillus oryzae.
Enzym amylaza từ nấm sợi có pH hoạt động tôì ưu là 4,5 - 5,5.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng enzym lipoxygenaza từ đậu nành để
tăng khả năng làm trắng bột, phospholipaza từ nguồn động vật,
hemixenlulaza để tăng lượng bột.
Tuỳ theo hoạt tính enzym và điều kiện xử lý bột, người ta thường
cho lượng enzym khác nhau. Thông thường lượng enzym cho vào bột để
làm bánh mỳ, bánh nổ là 2g/100kg bột, bánh biscuit là 15g/100kg bột.
Tiêu chuẩn enzym đưa vào xử lý các loại bột để làm bánh như sau: Khả
năng dextrin hoá: 200UI/g; khả năng đường hoá: 150UI/g và khả năng
phân giải protein: 7ƯI/g. f
Trong quá trình sử dụng chế phẩm enzym, người ta cho sulphat
amon vào bột như một chất đệm cho enzym hoạt động của amylaza.
Trong trường hợp muôn phosphat hoạt động mạnh, người ta lại sử dụng
chất đệm là phosphat amon. Người ta thường tạo chất đệm cho amylaza
bằng cách trộn lượng amylaza và tinh bột theo tỷ lệ 1: 1. Hỗn hợp này có
tác dụng làm ổn định hoạt tính enzym. Theo cách này, hoạt tính enzym
không thay đổi trong một năm bảo quản. Hỗn hợp enzym và amon
sulphat này khi cho vào bột để làm bánh, chất lượng bánh sẽ tăng lên
rấ t nhiều (tăng thể tích, độ xốp, khả năng giữ hình bánh, tâng mức ổn
định cấu trúc ruột bánh và làm giảm quá trình làm khô của bánh).
Ngoài ra, khi sử dụng chế phẩm enzym sẽ làm giảm tiêu hao nấm men
lỏng đến 20%.
Các kết quả nghiên cứu động học của các phản ứng xảy ra trong sản
xuất bánh mỳ cho thấy rằng, lượng đưòng có sẵn trong bột mỳ không đủ
cho sự chuyển hoá hoá học cũng như các chuyển hoá sinh học để đảm
bảo chất lượng của bánh mỳ. '
Mặt khác, chất lượng của bánh mỳ không chỉ phụ thuộc vào lượng
CO., tạo ra nhiều hay ít, mà phụ thuộc vào động thái của quá trình tạo
ra nó. Nếu lượng khí C02 tạo ra chỉ từ lượng đưòng có sẵn trong bột mỳ
thì lượng C 02 này sẽ đạt cực đại ỏ giờ đầu tiên và giờ thứ hai của quá
trình lên men, sau đó lượng khí sẽ giảm, bánh mỳ sẽ không đảm bảo
chát lượng. Trong công nghệ sản xuất bánh mỳ, lượng khí C 02 phải được
tạo ra liên tục từ giờ đầu tiên đến. giờ cuôì cùng của quá trình sản xuất.
Đặc biệt là quá trình tạo ra C 02 phải được ổn định 10 - 15 phút đầu khi
đưa bánh vào lò nưỏng.
Khi trong bột có p - amylaza hoạt động thì C 02 được tạo thành
trong quá trình chuẩn bị bột nhào xảy ra theo chiều hướng tăng và đạt
cực đại ở giò thứ tư của quá trình lên men. Quá trình này rất thuận lợi
và hoàn toàn phù hợp với những yêu cầu kỹ thuật của sản xuất bánh
mỳ. Như vậy, việc duy trì sự tạo thành lượng khí liên tục như vậy là đo
hoạt động enzym amylaza mà ta đưa vào bột trong quá trình nhào bột.
Điều này hoàn toàn khác với trường hợp là cho đường vào bột nhào.
Nếu cho đường vào bột nhào thì quá trình lên men sẽ xảy ra rất mãnh
liệt ở những giai đoạn đầu của quá trình lên men. Sau đó, lượng khí sẽ
giảm dần. Sự lôn men mạnh ở giai đoạn đầu sẽ làm giảm thay đổi cấu
trúc vật lý của khối bột và sẽ tạo ra màu, mùi không tõít cho sản phẩm.
Ớ đây cũng cần được làm rõ hơn ảnh hưởng của từng loại đường được tạo
ra trong hoạt động của enzym đối vâi chất lượng bánh, Trong quá trình
chuyển hoá tinh bột có trong bột mỳ, một loạt các loại đường được tạo
thành như glucoza, fructoza và maltoza. Trong đó, maltoza có ý nghĩa
quan trọng nhất đốĩ với chât lượng bánh mỳ.
Y nghĩa quan trọng của việc sử dụng chế phẩm enzym trong sản
xuất bánh mỳ là khi ta sử dụng enzym, nhò hoạt động của nó mà lượng
dường được tạo thành từ từ, không tập trung quá nhiều ở giai đoạn đầu

204
hoặc ở giai đoạn cuối của quá trình nhào bột. Chính vì thế, enzym như
một chất điều hoà rấ t có hiệu quả cho quá trình lên men, tạo C 0 2 trong
suốt quá trình kỹ thuật. Như vậy, ở một góc độ nào đó, sử dụng enzym
trong sản xuất bánh mỳ như một yếu tô" điều khiển kỹ th u ật cho quá
trình sản xuất này.
Các enzym thuỷ phân protein (proteaza) được ứng dụng như một
tác nhân làm giảm độ nhớt trong bột nhào. Nhờ đó bột nhào sẽ có đủ
điều kiện th u ận lợi nhất cho sự phát triển của nấm men và quá trình
tạo ra C 0 2 vừa ổn định, vừa cao, đảm bảo cho việc tạo thành các phản
ứng melanoidin trên vỏ bánh, khi nướng, bánh sẽ đẹp hơn m ẫu bánh
không có proteaza. Tuy nhiên cũng cần lưu ý rằng, nếu ta sử dụng
proteaza có hoạt tính quá mạnh, cấu trúc gluten sẽ bị phá huỷ và khi
đó khả năng giữ C 02 sẽ giảm, cấu trúc bánh sẽ rấ t dễ bị thay đổi, bánh
có nở nhưng sẽ nhanh chóng teo lại khi nhiệt độ bánh trở về nhiệt độ
thưồng của phòng.
Trong sản xuất bánh mỳ, người ta thường sử dụng proteaza axit của
nấm sợi. Cũng là chế phẩm của proteaza nấm sợi, proteaza của nấm sợi
từ phương pháp nuôi cấy bề m ặt có ưu điểm hơn proteaza của nấm sợi
nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm).
Các chế phẩm proteaza nấm sợi được bán rộng rãi trên th ế giới gồm
có Amano “A” của hãng Amano, Fungal proteaza của hãng Miles lab.
Tính chất của một sô' proteaza axit từ nguồn nấm sợi có thể tham khảo ở
bảng 6.10 “Tính chất proteinaza của nấm sợi”.
Chất lượng bánh mỳ được quyết định chủ yếu do hương và vị bánh.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, nguyên nhân của sự tạo màu của vỏ bánh
và chất thơm của bánh là do các phản ứng tương hỗ oxy hoá khử giữa
đưòng khử và các amino axit. Kết quả của các phản ứng tương hỗ -^ày là
tạo ra những phản ứng trung gian sinh furfurol,
Bột nhào và bánh mỳ chứa các amino axit tự do. Lượng amino axit
này giảm nhiều khi nướng bánh đo quá trình tham gia vào phản ứng
melanoidin. Lượng amino axit này giảm rấ t mạnh khi trong bột có chứa
nhiều đường khử, do đó phản ứng màu xảy ra rất mạnh.
Sự tạo thành oxy methyl furfurol có thể do đường bị phân huỷ bởi
nhiệt và cũng có thể do phản ứng Maiar. Chất oxy methyl furfurol chỉ
được tạo ra khi ở nhiệt độ cao và thây chúng tích tụ nhiều ở vỏ bánh.
Trong ruột bánh, nhiệt độ chỉ dừng lại ở 93 - 95°c, nên lượng oxy
methyl furfurol không thấy hình thành.
Khi ta sử dụng chế phẩm enzym từ nấm sợi Aspergillus ciryzae hay

205
Aspergillus awamori, lượng đường khử và các amino axit tự do tăng lên.
Đây là nguyên nhân chính dẫn tối sự tạo thành màu và mùi trong sản
xuất bánh mỳ.
Ở Nga, ngưòi ta sử dụng chế phẩm có tên thương mại là Amilorizin
- P810X. Chế phẩm này được sản xuất từ nấm sợi Aspergillus oryzae
chủng 476 - 1. Chế phẩm enzym amilorizin —P810X thưòng ở dạng cô
đặc tinh khiết và cả dạng bột. Lượng sử dụng chế phẩm amilorizin -
P810X dạng cô đặc là 0,002%.
Ớ Mỹ, hầu hết các xí nghiệp sản xuất bánh mỳ có sử dụng enzym.
Các chế phẩm enzym của Mỹ thường có dạng hạt. Hãng sản xuất chế
phẩm enzym dùng cho bánh mỷ lớn nhất ở Mỹ là hãng Rom và Khaac.
Hãng này sản xuâ't chế phẩm enzym có tên thương mại là Gumaza Nr - 150.
Ngoài ra, người ta còn bán các chế phẩm Vitaza và Vitola. Các chế phẩm
này là phức hợp lipoxygenaza của đậu nành, còn chế phẩm Del Park.P/A
là hỗn hợp enzym amylaza và proteaza được sử dụng rấ t phổ biến.
ở Anh, ngưòi ta sủ dụng các chế phẩm enzym amylaza chủ yếu từ
nấm sợi Aspergillus oryzae bằng phương pháp nuôi cấy chìm. Các enzym
proteaza và amylaza thường được tách riêng biệt. Khi sử dụng, họ
thưòng sử dụng liều lượng rấ t chính xác từng loại enzym.
0 Nhật, bánh mỳ không phải là lương thực chính nhưng những cd
sờ sản xuất bánh mỳ ứng dụng enzym rấ t cố hiệu quả. Việc ứng dụng
enzym vào sản xuất bánh mỳ ở Nhật bắt đầu từ năm 1952. Điểm đặc
biệt là trong công nghệ sản xuất bánh mỳ, Nhật không chỉ là nước Châu
Á dầu tiên sử dụng enzym mà cũng là nước sử dụng nhiểu loại enzym
nhất. Số loại enzym được sử dụng tại Nhật lên tới 50 loại. Các chế phẩm
enzym sử dụng để sản xuất bánh mỳ tại N hật thường là hỗn hợp
amylaza và proteaza.
6.3.4. ửng dụng enzym trong sản xuất bánh kẹo
Mục đích của việc sử dụng enzym vào sản xuất các loại bánh quy là
làm tăng mùi và vị của bánh. Khi chế biến bột thành các loại bánh quy,
các enzym proteaza và amylaza của bột hoạt động làm tăng hàm lượng
có amino axit tự do và làm tàng lượng đường khử. Đưòng khử và amino
axit có trong khối bột dó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy lioá khử
và kẽt qua. tạo cho bánh quy có mui, vị và màu hấp dẫn.
Tuy nhiôn, nếu chì tận dụng lượng enzym có sẵn trong bột thì phản
ứng trôn xảy ra không mạnh, nhất là khi sử dụng loại bột xấu để sản

206
xuất bánh. Do đó, người ta thường cho thêm proteaza và amylaza vào
chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Khi đó lượng đường khử
và lượng amino axit tự đo sẽ tăng lên, phản ứng oxy hoá khử sẽ được
tăng cường.
Trong công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đường, người ta thưòng
sử dụng các enzym thuỷ phân saccaroza. Các sản phẩm của quá trình
sản xuất này gồm kẹo viên, bánh quy kem với nhân trái cây, các loại kẹo
mềm. 0 Nga, khí sản xuất dác sản phẩm bánh kẹo từ đưòng, người ta sử
dụng chế phẩm invectin (tên thương mại của enzym invertaza).
6.3.5. ứng dụng enzym pectinaza sản xuất nước quả và rượu vang
a) Các c h ế p h ẩ m enzym
Trong sản xuất nưốc quả và rượu vang, việc sử dụng enzym là một
tiến bộ khoa học rấ t lớn. Các chế phẩm enzym được sử dụng trong sản
xuất nước quả và rượu vang có thể là một hỗn hợp nhiều loại enzym và
cũng có thể chỉ là một loại enzym riêng biệt. Việc sử dụng hỗn hdp
enzym hay từng loại enzym riêng biệt phụ thuộc vào nguyên liệu và
vào sản phẩm cần đạt tới. Ngoài ra, việc sử dụng các loại chế phẩm
enzym như trình bày trên còn phụ thuộc vào công nghệ sản xuất (các
yếu tố kỹ thuật).
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, ngưòi ta thưòng sử dụng
một trong sáu nhóm enzym sau:
- Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả đục: Mục đích
sử dụng nhóm chế phẩm enzym này là làm tăng hiệu suất trích ly để
thu được lượng sản phẩm lớn.
- Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nưốc quả trong, không
chứa pectin: Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzym này là làm tăng
hiệu suất trích ly và thủy phân hoàn toàn các chất protein, pectin, làm
giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước quả.
- Nhóm chế phẩm enzym dùng để làm tăng khả năng dồng hoá
nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả.
- Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu
vang, nhằm tạo hiệu suất trích ly của bán sản phâm.
- Nhóm chế phẩm enzym dùng để ngăn cản quá Lrình oxy hoá và
làm cản trỏ sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước
quả, trong rượu vang.
- Nhóm chế phẩm enzym dùng vào mục đích chống lại sự lại đường
trong sản xuất xiro thành phẩm.
207
 Việc sử dụng các chê phẩm enzym phải được xem xét cẩn thận trên
cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của
trái cây, người ta quan tâm nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của
sản phẩm. Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzym phải đảm bảo
giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu, hoặc tạo ra những m àu sắc theo ý
muôn bằng cách điều khiển phản ứng enzym. Theo màu sắc tự nhiên,
các loại trái cây được chia làm hai loại: (1) Trái cày có màu nhạt như
táo, lê, nho trắng, chuo'i, cam, bưởi...; (2) Trái cây có màu sẫm do chứa
nhiều antoxian như anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mơ, mận đen, dâu,...
Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, ngưòì ta sử dụng một loạt các
enzym sau:
- Enzym endo —PMG để làm giảm độ nhớt của dịch quả.
Í1 - Enzym PE làm tăng hiệu suất trích ly.
- Enzym khác như xenlulaza, hemixenlulaza, proteaza không bắt buộc.
Tuy nhiên, nếu cho thêm những enzym này vào sẽ làm tăng khả
năng trích ly vật chất hoà tan có trong tế bào quả.
Riêng enzym PTE, cần lưu ý là enzym này phân huỷ protopectin,
thường không có lợi cho việc thoát các chất có trong tế bào quả. Do đó,
trong trường hợp này, người ta không sử dụng enzym PTE.
Sự có mặt của enzym ascorbinatoxydaza thưòng gây ra sự phân giải
vitamin c. Các enzym tham gia quá trình oxy hoá như polyphenoloxydaza,
peroxydaza, catalaza thường làm biến màu nưốc quả và làm giảm giá trị
cảm quan khác. Do đó, trong chế biến nước quả không nên dùng những
loại enzym này. Khi chế biến nước quả có màu đỏ cẫn lưu ý phải bảo tồn
chất màu antocian. Chính vì thế không được dùng những loại enzym có
khả năng phân giải antocian.
Axit ascorbic là một trong những chỉ tiêu quan trọng của nước quả,
do đố khi chế biến nưâc quả tuyệt đối không được sử dụng enzym
ascorbinatoxydaza.
Trong nhiổu trường hợp, enzym proteaza đóng vai trò rất quan trọng
trong quá trình làm nước quả. Chính vì thế, khi cần làm trang nước quả,
người ta thưòng kết hợp proteaza axit với enzym phân huỷ pectin.
Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thưòng sử dụng chế
phẩm enzym bao gồm pectintrancelinutaza, xenlulaza, hemixenlulaza.
Trong đó, enzym pectintrancelinutaza đóng vai trò quan trọng nhất.
Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên, đặc biệt là không được chứa
enzym endopolygalacturonaza. Enzym này thường làm giảm độ nhớt
của nưốc quả và phá vỡ độ đồng nhất của nưâc quả.

208
 Việc sử dụng enzym vào chế biến nước quả và trong sản xuất rượu
vang bắt đầu từ năm 1930. Khi đó, Z.J. Kertesz và A. Meiliz được xem
như những người đầu tiên đưa ra ý tưởng sử dụng enzym trong chế biến
rau quả. Từ đó đến nay, trên th ế giới có rất nhiều loại chế phẩm thương
mại được sản xuất và ứng dụng trong chế phẩm rau quả. Các chế phẩm
đó được liệt kê trong bảng 6.17.
Ngoài những chế phẩm enzym trên, hiện nay trên thế giới có rất
nhiều chế phẩm pectinaza có hoạt tính rấ t cao như: Pectinex U ltra SP -
L, Pectinex 3XL, Rohapect (RM), Rohament (RM), Pectimex (NO),
Ultrazym (NO), Biopectinaza (BN), Panzym (BOI), Pectolaza (GT),
Klerzym (GB), spark (SOE), Sumizym (SN), Pectinol (GR).
Bảng 6.17. Khả năng hoạt động của một số chế phẩm enzym
sử dụng trong chế biến rau quả
Hoạt độ phân giải (Ul/g) Khả nâng phân huỷ (%)
TT Tên c h ế phẩm Xentuloza Proto — Hemi -
Pectin Protein Xenluloza
C1 C2 pectin xcnluloza

1 Pectavamorin
P 1 0 X -2 2 24,6 12,8 0,233 0,59 23 21 35

2 Pectavamorin
P 1 0 X - 16 22,6 6,12 0,213 1,14 29 90 61
3 Pednigrin OP - 10X 42,8 5,09 0 0,34 35 99 80
4 Pectnigirin G.10X 38,6 0 0,01 0,34 69 68 66
5 Pectnigrín P10X 37,9 10,26 0,04 0,32

6 Pectnigrin P10X
không chất độn 53.2 8,0 0,09 0,42
Pectnigrin P1QX
7 0,16
có bentonit 19,6 4,13 0,05

8 Rapidaza c
(Pháp) 53,1 9,79 0,14 0,12 98 100 91
9 Pectolitic (Anh) 53,1 1,6 0 0,1
10 Pectipol có chất 19,5 0,8 0 0,1
độn mạt cưa
11 Bistrin 16,5 0 0,03 0,17
12 Xenluzin (Nagaze) 100 98 59
13 Xenluzin 98 98 86
(Daivakazai)

b) Cơ c h ế tác động của enzym p ectin a za

Trong chế biên nước quả, ngưòi ta sỏ dụng các chế phẩm enzym
nhằm hai mục đích cơ bản: Phá v3 thành tế bào thực vật nhằm nâng cao
hiệu suất thu nước quả và làm trong và ổn định chất lượng nước.

209
 - Phá vỡ thành tế bào:
Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế bào), vỏ tế
bào như một lớp thành bảo vệ rấ t hữu hiệu và tạo hình cho tế bào. Ớ vỏ
tê bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất
ciment gắn các tế bào với nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện
cho các vật chất có trong tế bào thoát khỏi tế bào. Các chế phẩm enzym
có chứa không chỉ pectinaza mà còn chứa các enzym trong nhóm
xenlulaza. Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá
trình thu nhận dịch tế bào tốt hơn.
- Làm trong nước quả:
Nưỏc quả sau khi được tách khỏi tế bào thưòng chứa nhiều chất
khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường
gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả. Hàm lượng pectin ở
một sô" loại quả được trình bày ở bảng 6.18.
Bảng 6.18. Hàm lượng pectin của một sô' loại quả và djch quả
Pectin C hất este C hất este
Nguồn pectin Nguỗn pectin Pectin (%)
(%) hoá (%) hoá (%)
Nho 0,2 - 1 ,0 1 0 -6 5 Vỏ chanh 32,0 5 0 -6 5
Dịch nho 0 ,0 1 -0 ,0 9 - Thit chanh 25,0 -

Táo 0 ,5 - 1 ,6 1 0 -9 0 Vỏ cam 20,0

Vỏ lụa 29.0
Dịch quả 16.0
Dịch táo 0,2 - Củ cải đuởng 30,0
Khối nghiền nho đen 1,6 -

Các chất protein có trong bào tưdng, màng tế bào và gian bào.
Pectin chứa axit polygalacturonic, araban và galactan. Trong đó, lượng
axit polygalacturonic chiếm tới 40 —60%. Khi bị thuỷ phân, pectin tách
thành hai phần: Phần trung tính - phức chất galactanoaraban và phần
axit —axit pectic.
Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hoà tan. Trong màng tế bào và
gian bào, chúng nằm ỏ dạng không hoà tan gọi là protopectin. Protopectin
ở màng gian bào có chứa lượng kim loại khá cao và một lượng nhóm
metoxyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn protopectin ở màng tế bào
chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ metoxyl hoá cao. Vì thế, tê
bào thực vật có khả năng trương nỏ tốt.
Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào

210
khó liên kêt với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Pectin thưòng có
môi liên kết hydro và liên kết nguyên tử yếu hơn so với xenluloza.
Tham gia phân huỷ pectin gồm nhiều loại enzym và được tóm tắ t trong
bảng 6.19.
c) H ỉêu quả của vỉêc sử dung enzym p e ctin a za
- Những bất lợi khi sử dụng enzym:
Nước quả được sử dụng enzym có nhiều ưu điểm, tuy nhiên việc sử
dụng enzym cũng có những nhược điểm như xảy ra những biến đổi bất
lợi về vi sinh vật.
Nếu xử lý trong thời gian ngắn, quá trình oxy hoá và sự nhiễm vi
sinh vật không thành vấn đề lớn. Nhưng nếu xử lý trong thòi gian dài sẽ
xảy ra quá trìn h oxy hoá và sự nhiễm vi sinh vật.
Bảng 6.19. Các loại enzym pectinaza
TT Enzym Enzym Phản ứng xúc tác
(Tên gọi th eo hệ thống) (tồn thường gọi)
1 Pectin - pectinhydrolaza Pectinesteraza Pectin + HjO = n metanol + axit
(3.1.1.11) pectic
2 Poly - K - 1,4 galacturonit Endopoly Thuỷ phân liên kết a - 1,4 - D -
glycano hydrolaza galacturonaza galacturanic trong galacturonit không
PG (3.2.1.15) (E ndo-P G ) theo một trật tự nào
3 Poly - a - 1,4 - D Exopoly Thuỷ phân liên kết a - 1,4 - D -
galacturonit galacturon - galacturonaza galacturorút trong pectat, trong
hydrolaza (3.2.1.40) (exo - PG) gaiacturonit với sự đứt mạch cùa axit
galacturonic
4 Poly - a - 1,4 - D galactu Endopolymetil - Thuỷ phân liên kết a - 11,4 - D -
- ronit metilester - galacturonaza galacturonit trong pectin không theo
glycanohydrolaza (Endo - PMG) một trặt tự nhất định
(3.2,1.41)
5 Poly - a - 1,4 D galactu - Exo - Thuỷ phân liên kết a - 1,4 - D
ronit digalacturonolyaza pectatlyaza galacturonid trong pectat với sự tạo
(4.2.997) (exo-PKTE) thành 5 - 4 , 5 axit degalacturonit với
sự tạo thành nối đôi không theo một
trât tư nhất đinh
6 P o ly - a - 1 ,4 - D - Endopectatlyaza Thuỷ phàn liên kết a - 1,4 - D
galacturonit glycanoiyaza (PETE) galacturonit trong pectat, trong
(4 2 2.1) galacturonit với sự tạo thành nối đôi
không theo một trật tự nhất định

7 Poly " t t - 1 , 4 0 - Endopectinlyaza Thuỷ phân liên kết a - 1,4 - D

galacturonit metylester - (E ndo-PT E ) galacturonit trong pectin với sự tạo
glycanolyaza thành nối đôi không theo một trật tự
(4.2.99.8) nhất định

211
 Người ta ngăn ngừa quá trình oxy hoá trong nước quả bằng một
trong ba cách sau: Cho axit ascorbic; cho anhydric sulfur và cho enzym
glucooxydaza.
Trước khi dùng những chất chống oxy hoá trên, ngưòi ta thường
phải đun nống dịch quả. Khi đun nóng dịch quả, các enzym oxy hoá có
trong nưóc quả sẽ bị ức chế. Theo đó, nước quả được ly tâm để làm sạch
cơ học, sau đó nước quả được đun nóng tới 80°c và sau đó hạ đến nhiệt
độ tôi ưu của hoạt động của enzym. Người ta thường cho lượng axit
ascorbic tới 5mg/100g nưốc quả để hạn chế quá trình oxy hoá.
Để hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong trưòng hợp sử dụng
enzym để xử lý nước quả, người ta thường áp dụng những biện pháp sau:
+ S ử dụng axit sorbic, axit ascorbic, benzoat natri: Axit sorbic thường
dược sử dụng trong nước quả với liều lượng là 0,03%. Axit này hoạt động ỏ
pH râ"t rộng (pH 3,9 —9,2). Axit sorbic ức chế sự phát triển của nấm men và
nấm sợi, không làm thay đểì vị và mùi của sản phẩm. Benzoat natri
thường được sử dụng trong nưốc quả với liều lượng là 0,15%.
+ S ử dụng anhydric sulfur: Ngưòi ta thường sử dụng anhydric
sulfur để bảo quản nước quả bán thành phẩm. Chất này vừa có khả
năng tiêu diệt vi sinh vật, vừa có khả năng chông oxy hoá. Khi cho chất
anhydric sulfurd vào dịch quả, chúng dễ dàng bị oxy hoá. Khi đó lượng
oxy có trong dịch quả ít dần và đến mức triệt tiêu, gây ra trạng thái thê
hiệu oxy hoá - khử trong dịch quả thay đổi và vi sinh vật bị ức chế hoặc
bị tiêu diệt. Tuy nhiên, cần phải lưu ý rằng, nếu lượng anhydric sulfur
quá nhiều sẽ dẫn đến ức chế hoạt động của enzym. Các thí nghiệm cho
thấy, nếu hàm lượng anhydric sulfur 0,1% làm giảm hoạt tính chế phẩm
enzym, nếu hàm lượng 0,5% thì enzym hoàn toàn bị ức chế.
+ X ử lý nhiệt: Ngưòi ta có thể đun nóng dịch quả để bảo quản nước
quả. Tuy nhiên, việc đun nóng dịch quả không thể quá cao vì chính
nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chất cảm quan, thành phần hoá học và
hoạt tính enzym.
Đa số’ enzym phân giải pectin bị m ất hoạt tính ỏ 70°c và chúng
hoạt động m ạnh ở 45 —50°c. Tuy nhiên ở nước quả lên men, người ta
sử dụng enzym để xỏ lý nưỏc quả ngay d nhiệt độ thưàng (trùng vâi
nhiệt độ lên men).
d) H iêu q u ả của việc sử d u n g enzym
Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả

212
 và rượu vang cho thấy, khi sử dụng enzym pectinaza cho hiệu suất nưóc
quả và chất lượng rượu vang rất cao.
Khi tiên hành ứng dụng enzym trong sản xuất nước quả và sản xuất
rượu vang, người ta đặc biệt quan tâm đên hai yếu tô" có tính chất quyết
định đên hiệu quả enzym. Nguyên liệu và khả năng xay, nghiền và làm
nhỏ nguyên liệu.
- Nguyên liệu:
Không phải tất cả các loại quả đều có khả nàng cho hiệu suất cao
khi xử lý enzym. Khi sử dụng enzym trong chế biến nước quả và chế
biến rượu vang, người ta phải đưa ra độ chín kỹ thuật cho phù hợp. Khái
niộm này hoàn toàn khác khái niệm độ chín kỹ thuật trong công nghệ
không sử dụng enzym. Độ chín kỹ thuật để sản xuất nước quả là giai
đoạn chín của quả, đảm bảo tách dịch quả được tốt với sự tích tụ tối đa
các chất có giá trị dinh dưỡng cao và hương VỊ thích hợp.
Tuy nhiên cũng cần biết rằng, phần lớn nguyên liệu, hiệu suất dịch
, quả cao không trùng hợp với sự tích tụ các chết có giá trị dính dưỡng. Ở
nhiều loại quả, khả năng thoát dịch quả không trùng với mức độ chín.
Nhiều khi quả th ật chín, khả nãng tích tụ chất dinh dư3ng cao nhưng
lại không thuận lợi cho việc tách nước quả. Chính vì thế, từng loại quả,
ngưòi ta phải tiến hành phân loại và xác định độ chín kỹ thuật riêng,
sao cho phù hdp với việc sử dụng enzym và thu hồi địch quả.
Công việc thứ hai sau khi phân loại quả, việc nhất thiết phải làm
trước khi sử dụng enzym là quả phải được làm sạch bằng cách rửa nhiều
lần để loại bỏ những tạp chất, vi sinh vật. Sau đó là các quá trình kỹ
thuật như xé nhỏ, nghiền,... để tăng khả năng tác động của enzym và
tăng hiệu suất thu nhận địch quả.
- Khả nồng làm nhỏ nguyên liệu:
Làm nhỏ nguyên liệu là khâu kỹ thuật rất quan trọng, nó quyết
định đến hiệu quả tác động của enzym và hiệu suất thu nhận dịch quả
cũng như châ't lượng của dịch quả.
Tuỳ theo tính chất cơ lý và đặc điểm câu tạo của từng loại quả,
ngưòi ta chọn những phương pháp xử lý quả thích hợp như nghiền, cắt,
chà hay xé nhỏ.
Khi thực hiện một trong những phương pháp cơ học trên, một số' tế
bào sẽ bị phá huỷ, m ất tính chất bán thấm, do đó việc chọn phương pháp
cơ học làm nhỏ quả phù hợp vói từng loại quả rất có ý nghĩa công nghệ.

213
Những đặc điểm kỹ thuật sử dụng enzym cho từng loại quả và cho từng
loại sản phẩm từ quả được trình bày chi tiết như sau:
+ Sử dụng enzym để sản xuất nưóc quả thanh trùng uống trực tiếp
từ quả táo và quả vả.
Bảng 6.20. Hiệu quả xử lỷ nước táo và nước vả bằng chế phẩm pectinaza
Hiệu Hàm Điểm
Độ axit Chất
Loại suất lượng Đưòng Pectin đánh
TT chuẩn chát
nước quả nưỡc quả chất khô (%) (%) giá cảm
(%) (%)
<%) (%) quan
1 Nước táo
- Không cho chế 71,2 10,2 0,53 6,7 0,33 0,04 4,5
phẩm enzym
- Có cho chế 78,8 11,5 0,62 8,0 0,15 0,02 4.8
phẩm enzym
2 Nước và
- Không cho chế 49,2 8,5 0,91 5,62 0,26 0,09 3,8
phẩm enzyrn
- Có cho chế 72,4 10,2 1,16 7,4 0,12 0,16 4,3
phẩm enzym

Ngày nay, nưốc quả trong hoặc nước quả đục được sản xuất ỏ nhiều
nước trên th ế giới. Tuỳ theo hàm lượng đường và axit có trong quả, khi
chế biến nước quả người ta có cho thêm đường hoặc axit hay không. ĐỐI
với nước quả có hàm lượng đường và axit thấp, ngưòi ta thường phải bổ
sung đưòng hoặc axit để điều chỉnh chất lượng cuối cùng của sản phẩm.
Hàm lượng pectin cao trong dịch quả thưòng không có lợi vì khi đó độ
nhớt của sản phẩm rấ t cao. Việc thuỷ phân pectin có trong dịch quả còn
làm cho những sản phẩm dịch quả trong không bị đục. Tuy nhiên, việc
xử lý pectin bằng các enzym pectinaza không nên tiến hành phân giải
pectin đến cùng mà cần phải giữ một lượng pectin nhất định trong sản
phẩm nưổc quả. Chính lượng pectin này sẽ giúp cho chất lượng nước quả
tốt hơn.
Trong sản xuất nưóc quả táo và nước quả vả, người ta sử dụng chế
phẩm pectinaza cho hiệu quả rất cao. Khi xử lý nưóc quả ỏ 50°c trong 2
giờ, hiệu suất tách nước quả tăng được 20%; â 37 - 40°c sau 2 - 4 giờ xử
lý, hiệu suất tách nước quả tăng 20 - 25%. Các nghiên cứu và thực tế
sản xuất đểu cho thấy, hiệu quả xỏ lý nưôc táo rấ t cao. Chính vì thế,
việc sử dụng enzym pectinaza được áp dụng ồ tấ t cả các nhà máy sản
xuất nước táo trên thế giới. Trong khi xử lý nước quả bằng enzym

214
pectinaza, người ta thường cho thêm axit ascorbic vào để chống quá
trình oxy hoá của nưóc táo.
+ Sản xuất nước quả uông ngay từ dâu tây và mâm xôi:
Người ta thường sản xuất cả dạng nước quả trong và nước quả đục
từ các loại trái cây trên. Trong quá trình sản xuất, ngưòi ta cho thêm
đường và điều chỉnh lượng axit cho phù hợp.
Các loại nước quả này thường chứa nhiều pectin. Do đó việc sử
dụng các chế phẩm enzym pectinaza để loại bỏ khả năng gây đục cho
nước quả trong cũng như ổn định và nâng cao chất lượng dịch quả là
diều cần thiết.
Ngưòi ta rửa sạch các loại quả trên bằng cách dùng vòi hoa sen
phun nước. Sau đó, các loại quả trên được đem chà thành dạng purê.
Quả nghiền được đun nóng ỗ nhiệt độ 40 —50°c rồi cho vào máy trộn.
Tại đây nưóc quả được phôi trộn vối tỷ lệ 1 phần nước quả và 10 phần
dịch enzym có hàm lượng enzym 0,03%. Riêng đối với nước dâu tây,
người ta cho thêm vào 0,03% axit ascorbic để làm chất chống oxy hoá.
Hỗn hợp n ày được giữ ở n h iệt độ 40°c. Thời gian lưu ở n h iệ t độ 40°c là
4 - 8 giờ. Nước quả sau đó được cho qua máy ép và được đun nóng đến
45°c. Tiếp đó, người ta đem nước quả ly tâm và cuối cùng là lọc qua máy
ép lọc khung bản. Hiệu suất thu nhận nước quả theo phương pháp này
được trình bày trong bảng 6.21.
Bảng 6.21. Hiệu quả việc xử tý nước quả dâu tây, anh đào bằng enzym

Hiệu Chất C hất Điểm

Độ axit Đưdng Pectin
TT Loại nước quả su ất khô chát cảm
{%) (%) (%)
(%) {%) (%) quan

Nước quả dâu tây

1 - Không dùng enzym 71,2 10,2 0,53 6,7 0,33 0,04 4,5
- Dùng erưym 78,8 11,5 0,62 8,0 0,15 0,02 4,8

Nước quả mâm xôi

2 - Khòng dùng enzym 49,2 8,5 0,91 5,62 0,26 0,09 3,8
- Dùng enzym 72,4 10,2 1,16 7,4 0,12 0,16 4,3

+ Sản xuất nước quả từ quả nho:

Nưổc uống từ trái nho là loại nước uống trong chứ không thuộc loại
nước uống đục. Loại nước uông từ nho dạng trong thưòng được sản xuất
nhiều ỏ hầu hết cốc nước Châu Âu và Châu Mỹ. Tuy nhiên hiện nay,

215
người ta cung sản xuất nước uống từ nho dạng đục (chủ yếu từ nho có
màu đỏ). Trong đó, Ý là nước sản xuất nước uống dạng đục nhiều nhất,
sau đó là Pháp, Rumani. Nho là loại quả cho nhiều dịch có chứa nhiều
đường. Tuy nhiên, nước nho thường chứa nhiều th ịt quả. Trong thịt quả
có nhiều pectin, đễ gây đục, hoặc nếu thu nhận dịch quả trong thường
không cho hiệu suất cao, Chính vì thế người ta phải xử lý nước nho bằng
chê phẩm pectinaza. Lượng enzym pectinaza được sử dụng trong trường
hợp làm nát nho là 0,2% so với khối lượng nho. Thòi gian xử lý bằng
enzym là 3 giò ỏ nhiệt độ 45°c. Bằng phương pháp xử lý này ngưài ta đã
làm tăng hiệu suất thu nhận dịch nho từ 65,9 đến 77,3% đối với nho
trắng và từ 66 đến 82,2% đối với nho đỏ.
Đối với nho trắng nghiền kỹ, khi xử lý ertzym pectinaza trong thòi
gian 2 , 5 - 3 giò ở nhiệt độ 40 —45°c, hiệu suâ't tăng 14 —18%. Nếu tiếp
tục xử ỉý nưâc quả sau giai đoạn xử lý trên thêm 4 —5 giờ ở nhiệt độ
40 - 45°c, nước nho sẽ hoàn toàn trong, ở giai đoạn làm trong dịch quả
này, người ta đun nóng dịch quả ở giai đoạn 1 lên 90°c, sau đó người ta
hạ nhiệt xuông 50°c và khi đó mới sử dụng enzym để làm trong nước
quả. Trong khi những mẫu dịch không xử lý bằng enzym, quá trình làm
trong nước nho phải kéo dài 2 - 4 tháng, Hiệu suất thu^djph không sử
dụng enzym chỉ đạt trung bình 65%.
Quá trình sản xuất nước nho trắng có xử lý enzym pectinaza được
thực hiện như sau:
Nho được rửa sạch, tách cuống, loại hạt bằng máy xé và chứa trong
các thùng trong thời gian 6 - 8 giò, hoặc các thùng lên men liên tục
trong thòi gian 3 - 4 giò. Trong thòi gian lưu trữ này, người ta cho 0,02%
chế phẩm pectinaza và 0,01 anhydrit sulfur hoặc 0,03% axit ascorbic,
sau đó người ta ép để thu nhận dịch nho. Dịch nho được làm nóng đến
80°c, sau đó ngúội nhanh xuống 40ữc. Nưóc nho ở 40°c được cho thêm
0,01% enzym pectinaza. Tiến hành quá trình thuỷ phân cho độ nhớt
giảm tới độ nhớt của nưốc nho trong suốt. Thời gian thuỷ phân này kéo
dài khoảng 6 - 8 giờ. Kết thúc quá trình thuỷ phân, người ta lại đun
nóng dịch quả lần thứ hai đến 80°c, làm nguội đến 20°c và lọc nước quả
này qua máy lọc ép, tiến hành rót chai và đem thanh trùng.
Quy trình sản xuất nước nho đỏ có sử dụng enzym pectin a za như
sau: Nho đã rửa sạch, tách cuống, xé nhỏ và đun nóng đến 85 - 90DC
trong máy gia nhiệt và ngay lập tức làm nguội đến nhiệt độ 45 - 50°c.
Giủ dịch nho ở nhiệt độ này trong thời gian 4 —6 giờ trong thùng kín
216
 hoặc 3 —4 giờ trong nhưng thiêt bị lên men liên tục. Người ta thường
cho enzym pectinaza vào giai đoạn này với liều lượng 0,03%. Sau thời
gian thuỷ phân bằng enzym như trên, người ta tiến hành lọc ép. Dịch lọc
được cho thêm 0,03% enzym pectinaza để làm trong dịch quả. Quá trình
làm trong dịch quả được thực hiện trong thời gian 6 - 8 giờ. Sau đó nước
quả được lọc, rót chai và đem thanh trùng.

Bảng 6.22. Hiệu suất và chất lượng nước nho

sản xuất theo phương pháp xử lý pectinaza

Chất Hiệu Độ Chất Điểm

Đường Cặn
TT Nưổc nho khô suất axit chát cảm
(%) (%) quan
<%) (%) (%) <%)
1 Mầu đối chúttg 17,5 65,0 0,54 15,1 0,125 3,0 4,2
2 Màu xử lý bằng 19,0 70,1 0,68 16,85 0,135 Một ít căn 4,5
chế phẩm pectinaza pectat

» + Sản xuất nước mận:

Người ta thường sản xuất nước quả pha đưòng từ mận. Mận là loại
quả cho hiệu suất thu nhận nước ép rấ t thấp. Để thu nhận nước quả từ
mận, người ta phải áp dụng phương pháp nhiệt và enzym. Quá trình
công nghệ được thực hiện như sau:
Mận rửa sạch, đun nóng với nưổc. Nước được cho vào khoảng 15 - 20%
so vối khôi lượng mận. Nhiệt độ giữ ở 85 —90°c trong thời gian 5 —20
phút tuỳ thuộc vào độ chín của mận, Sau đó cho khối quả qua hệ thống
ép và xử lý enzym pectinaza ở nhiệt độ 40 —45°c trong thời gian 3 —6
giờ. Dịch quả được thu nhận bằng máy lọc ép lần nữa, đóng chai và đem
thanh trùng.
Phương pháp xử lý nhiệt và enzym kết hợp đã cho ta hiệu suất đạt
tới 78,9% so với hiệu suất 58,2% khi không xử lý enzym.
6.3.6. ứng dụng proteaza để làm trong và ổn định chất lượng nước quả
và rượu vang
Một trong những nguyên nhân chính gây khó khàn cho việc làm
trong nước quả và gây đục nước quả là protein. Hiện nay người ta sử
dụng các phương pháp sau đê phá huỷ protein và loại protein: (1) Xư lý
nhiệt; (2) x ử lý bằng chất keo tụ; (3) xử lý bằng chất hấp phụ và (4) Xử
lý bằng enzym.

217
 Phương pháp xử lý nhiệt, chất keo tụ, chất hấp phụ thường làm
giảm chất lượng sản phẩm. Phương phấp ưu điểm nhất là sử dụng
enzym proteaza. Các loại nước quả thường có độ pH thấp, do đó ta
không thể sử dụng proteaza trung tính và proteaza kiềm mà phải sử
dụng proteaza axit. Hiện nay, người ta đả sản xuất ra nhiều chế phẩm
pro te a za axit. Các chê phẩm proteaza axit được sử dụng để xử lý nưóc
quả thường hoạt động mạnh ở pH - 2,5 “ 3,5. Các proteaza axìt thường
dược sản xuất từ Aspergillus oryzae, A. awamori, A. niger, A. saitoi.
Trong sản xuất nước quả hay rượu vang, người ta thường làm trong
nước quả bằng enzym proteaza với liều lượng 0,1 - 0,3%. Thực tế cho
thấy, các chết bảo quản nước quả, rượu vang như axit sorbic 0,05 - 0,06%,
benzoat natri 0,06 - 0,07%, anhydric suníurơ 0,05 - 70,1% không ảnh
^ hưởng đến hoạt tính proteaza axit trong xử lý nước quả. Trong sản xuất
rượu vang, khi hàm lượng cồn đạt 8% cũng hoàn toàn không ảnh hưõng
đến hoạt tính proteaza axit.
6.3.7. Khử vị đắng của nước quả bằng chế phẩm enzym
Nưóc quả được sản xuất từ quả có múi như chanh, cam, bưởi thưòng
có vị đắng. VỊ đắng có trong các loại nước quả này là do glucozitnaringin
(7 - ramnocido - 3 - gìucosido - 4,5,7 trihydroxiflavon). Trong đó, ramnoza
nối vối glucoza bằng liên kết glucozit.
Khi enzym naringinaza thuỷ phân naringin sẽ tạo thành hỗn hợp
raninoza và prinin. Hỗn hợp này tiếp tục bị thuỷ phân tạo thành prinin
và naringinin, hoàn toàn không còn vị dắng.
ở N hật Bản, người ta sản xuất chế phẩm naringinaza từ nấm sợi
Aspergillus niger. Chê" phẩm có chứa hai loại enzym là ramnozidaza và
p - glucooxydaza. Ở Mỹ, người ta sản xuất chế phẩm pectinol 10 - M và
pectino - 100 - D. Các loại enzym hoạt động mạnh ồ pH 4. Ngựòi ta
thưòng sử dụng chế phẩm tinh khiết với liều lượng 0,025% trong thời
gian 1 giờ, pH 4, ồ nhiệt độ thường hoặc 0,015% trong thời gian 4 giờ.
Nếu tiến hành thuỷ phân ở nhiệt độ 40ơc trong 4 giò, quá trình thuỷ
phân sẽ nhanh hơn.
6.3.8. ứng dụng enzym khác trong sản xuất rượu vang
Nhiều công trình nghiên cứu và thực tế cho thây enzym được sử
dụng trong sản xuất rượu vang có những tác động râ't tốt như: làm tăng
quá trình trích ly dịch quả, làm trong địch lên men, làm tăng quá trình
tạo hương và làm tăng chất lượng rượu vang.

218
 Quá trình sản xuất rượu vang và phương pháp sử dụng enzym trong
các công đoạn sản xuất rượu vang được trình bày trong hình 6.2.

Nho

Nghiền hoặc Pectinaza

làm nát p-glucanaza

Lọc ép

Dịch quả
Dịch quả
đun nóng
Pectinaza
proteinaza

Lên men chính

Lên men phụ Pectinaza

Rượu vang

Hình 6.2. Công nghệ sản xuất rượu vang có sử dụng enzym

Trong dịch nho có chứa các chất trùng hợp. Hàm lượng các chất
trùng hợp phụ thuộc vào giống nho, vào khí hậu và đất trồng nho. Hàm
lượng các chất trùng hợp thưòng dao động trong một khoảng râ't rộng,
trung bình khoảng từ 700 - 1.400mg/l. Trong đó pectin chiếm khoảng
90 - 500mg/l. Tổng lượng và protein chiếm khoảng 54% so vđi tổng số"
chất trùng hợp. Ngoài pectin và protein, trong các chất trùng hợp còn có
các polyphenol, các polysaccarit và một sô'hợp chất cao phân tử khác.
a) P ro tein tro n g dich nho
Protein trong dịch nho bao gồm albumin, gluten còn globutin không
đồng nhất. Khi tiến hành điện di trong genaza, protein nho cho 4 - 5
phần chiỗt anot, trong gel polyacrylamit, protein của dịch nho có khối
lưựng phân tử tương đấì nhỏ (khoảng 1.800 - 23.000).

219
 b) P o lỵsa ccarit
Polysaccarit của dịch nho chiếm khoảng 3,21 — 4,10%. Trong đó
lượng pectin và xenluloza gần bằng nhau, hemixenluloza có hàm lượng
ít hơn. Trong pectin, protopectin chiếm lượng nhiều nhất. Các chất khác
gồm có lignin, các chất phenol và tro.
Trong polysaccarit, pectin có ý nghĩa rấ t lớn đối vối chất lượng rượu
vang. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, pectin có tác dụng làm dịu rượu
vang, tạo ra vị bơ cùng với glyxerol và dextran. Ngược lại cũng có nhiều
nghiên cứu cho rằng, sự hiện diện các chất cao phân tử, trong đó có chất
pectin làm hạn chế vị của rượu vang. Tuy nhiên, các nhà khoa học đều
thông nhất, vị rượu vang được quyết định bởi đường và các quá trình oxy
hoá, hàm lượng pectin cao trong rượu vang làm đuc rươu vang. Do đó
,*■ việc sử dụng enzym pectinaza để thuỷ phân pectin có trong rượu vang là
diều rất cần thiết, hoàn toàn không làm giảm hương vị của rượu vang.
c) S ử d ụ n g c h ế p h ẩ m enzyrn tro n g sản x u ấ t rượu v a n g
Trong sản xuất rượu vang, người ta thường sử dụng chế phẩm
enzym hỗn hợp. Các enzym này cùng lúc tham gia phân giải pectin,
protein, xenluloza, hemixenluloza và nhiều chất khác. Ở một số' nước lại
sử dụng phức hợp của một nhóm enzym có cùng bản chất.
- Nhóm enzym phân giải pectin:
Nhóm enzym này thưòng hoạt động mạnh ở pH axit (pH 5) và nhiệt
độ trong khoảng 30 - 40°c. Người ta thường sử dụng enzym phân giải
pectin vói liều lượng 0,1%*
- Nhóm các enzym phân giải protein:
Các chê phẩm proteaza từ Aspergillus oryzae, A. flavusi cazain ỞpH
7,7. Ngược lại proteaza từ A. awamori lại hoạt động Ở pH axit. Tác động
của protein dịch nho gần giông như albumin và y - globulin. Các
proteaza của A. niger cũng giông như proteazaA. awamori. Chúng hoạt
động cả trong môi trường axit mạnh (pH 1,8 - 2,0) và hoạt động mạnh ở
nhiệt độ 40°c. Các chế phẩm enzym proteaza axit thưòng được dùng để
xử lý dịch nho.
- Nhóm enzym phân giải hemixenluloza và xenluloza:
Khi cho các chê phẩm enzym phân giải pectin vào dịch nho nghiền,
trong dịch nho sẽ tăng hàm lượng các chất phenol tinh dầu, các hợp chất
chứa nitơ và cả chất khô trong địch nho. Trong xử lý nưốc nho, người ta
sử dụng cả phức hợp xenlulaza. Các chế phẩm xenlulaza sử dụng trong

220
sản xuất rượu vang hoàn toàn không phải là các chế phẩm tinh khiết
mà là phức hỢp enzym, bao gồm nhiều enzym khác như pectinaza,
proteaza,...
— Những yêu cầu cơ bản của chế phẩm enzym sử dụng trong sản
xuất rượu vang như sau:
+ Các chê phẩm enzym không được làm ảnh hưởng xấu tới vị, màu
và hương rượu vang.
+ Khi cho chê phẩm enzym vào dịch nho hay khôi nho nghiền, chế
phẩm enzym phải làm tăng khả năng trích ly dịch nho, làm trong dịch nho.
+ Khi cho chê phẩm enzym vào khối nho hay khôi nho nghiền, chế
phẩm enzym phải làm tăng khả năng lọc và lắng trong. Trong nhiều thí
nghiệm, khi người ta cho chế phẩm enzym để xử lý khôi dịch nho, chế
phẩm enzym làm tăng tốc độ lọc lên 3 - 4 lần
Người ta thường xử lý enzym trong 6 - 8 già ở nhiệt độ 18 - 20°c
hoặc 2 - 4 giờ ở nhiệt độ 35 - 40°c. Đổ làm tăng khả năng làm lắng,
ngưòi ta có sử dụng các chất tạo keo.
+ Chế phẩm enzym sử dụng trong xử lý dịch nho hoặc khối nho
nghiền làm táng mức ổn định của rượu vang, chông lại các nguyên nhân
gây đục do protein, polysaccarit hay do những nguyên nhân khác.
+ Các chế phẩm enzym oxy hoá như ascorbinatoxydaza, o - diphenol -
oxydaza, peroxydaza có khả năng chống lại sự mất màu đỏ của rượu
vang đỏ và vang trắng chuyển màu. Liểu lượng các enzym này không
được cao.
+ Khi sử dụng các chế phẩm enzym để xử lý dịch nho và khôi nho
nghiền phải đảm bảo được tính kinh tế, Khi sử dụng các chế phẩm
enzym để xử lý dịch nho, thành phần hoá học của dung dịch nho bị biến
đổi rấ t nhiều, đặc biệt là các hợp chất phenol. Các chất phenol thường
tăng lên rấ t nhíểu, từ đó làm thay đổi rấ t mạnh tính chất hoá học và
tính chất cảm quan của rượu nho. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, việc
xử lý nho bằng chế phẩm enzym làm tăng giá trị sinh học của dịch nho.
Trong dó antoxian có một giá trị sinh học nhất định trong sinh lý ngưòi.
Ngoài ra, việc xỏ ]ý dịch nho làm tăng nhanh quá trình tạo hương, rút
ngắn quá trình sản xuất nho.
Nếu trong khi nghiền địch nho, ta sử dụng chế phẩm enzym, hàm lượng
các hợp chất chứa phenol tăng lên rất nhiểu (có khi tăng đến 50 - 80%)
thì trong quá trình lên men, lượng các chất phenol và antoxian lại giảm

221
 rất mạnh. Điều đó giải thích tại sao trong quá trình tàng trữ, tổng lượng
phenol và châ't màu giảm. Hiện tượng này xảy ra rấ t mạnh trong những
năm đầu tiên khi tàng trữ. Sau 2, 3 năm tiếp theo, quá trình chuyển hoá
này xảy ra chậm hơn.
Các enzym oxy hoá có tác động rấ t mạnh đên chất lượng rượu nho.
Các enzym oxy hoá sẽ tăng hoạt lính khi đun nóng dịch nho, khi cho các
chế phẩm enzym vào dịch nho. Các enzym oxy hoá thưòng có sẵn trong
dịch nho tác động vào antoxian, kích thích nhanh các quá trình tạo màu
của dịch nho như màu vàng, màu gạch đỏ và một số màu khác.
Đối với rượu vang tráng, các enzym oxy hoá thường làm sẫm màu.
Các enzym polyphenoloxydaza thường có khoảng hoạt động rộng. Chúng
oxy hoá mạnh nhất chất odiphenol và ít tác động đến p —diphenol. Các
"H polyphenoloxydaza thường chứa trong vỏ và cả trong thịt quả. ơ trong
^' thịt quả, polyphenoloxydaza thường chứa nhiều hơn trong vỏ quả ỏ giai
đoạn bắt đầu chín của quả. Khi quả chín thì ngược lại, các
polyphenoloxydaza ở vỏ quả lại hoạt động mạnh hdn trong thịt quả đến
2 - 3 lần.

6.4. VẤN ĐỂ MÔI TRƯỜNG VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG TRONG SẢN

XUẤT VÀ SỬ DỤNG ENZYM TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHAM
6.4.1.Vấn để an toàn trong sẳn xuất và sử dụng enzym
Ngày nay enzym được sử dụng trong nhiều các sản phẩm, các quy
trình công nghiệp khác nhau và liên tục được ứng dụng vào các lĩnh vực
sản xuất mới. Nhò cố sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại,
ngay nay các enzym được phát triển cho các quá trinh mà trước đây
không có hy vọng ứng dụng enzym. Enzym được ứng dụng nhiều nhất là
vì enzym là chất xúc tác có hiệu quả thực hiện ở điều kiện nhẹ nhàng, do
đó bảo vệ hiệu quả nguồn tài nguyên thiên nhiên như năng lượng và
nước có ỉợi ích to lớn cho cả công nghiệp cũng như môi trường sống.
Trong một thế giới, vối việc ô nhiễm tăng rấ t nhanh và cạn kiệt nhiều
nguồn tài nguyên thiên nhiên, thì công nghệ enzym thực sự trở thành
cứu cánh cho nhiều ngành công nghiệp phải đôì m ặt với các thách thức
trong những năm tới đây, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm. Do
đó cần quan tâm đến môi trường và bảo vệ môi trưòng quá trình sản
xuất và sử dụng enzym.
Trưóc hết, bất kỳ sản phẩm enzym nào đưdc đưa ra thị trường củng
cần phải đảm bảo yêu cầu về chất lượng và tính hợp thức. Nhà sản xuất

222
 phải đăng ký sản phẩm vói cơ quan có trách nhiệm cho phép sử dụng.
Các tiêu chuẩn hiện hành phải được chấp thuận không chỉ sản phẩm mà
cả quá trình sản xuất như: sản xuất phải thực hiện theo tiêu chuẩn thực
hành sản xuất tôt (GMP) và hầu hết các cơ sở sản xuất enzym phải có
giấy chứng nhận ISO tương ứng. Các công ty hàng đầu trong sản xuất
enzym phải có tất cả các quá trình sản xuất được chứng nhận theo tiêu
chuẩn ISO 9001:2000.
Như trên đã trình bày, chế phẩm enzym phải an toàn cho người sử
dụng, vì enzym là protein và hít phải enzym có thể gây dị ứng đôi với
người mẫn cảm. Vài loại enzym có thể gây rá t da, làm đau m ắt và tạo
lởp màng nhầy trên da khi tiếp xúc lâu. Vì kích thước của enzym quá
nhỏ nên có thể dễ dàng tạo bụi trong không khí nếu bị khuấy mạnh.
Hơn nữa, sản phẩm enzym sánh ra ngoài có thể tạo bụi khi làm khô.
Chính vì vậy, vật liệu enzym bị bắn ra nên được xả sạch bằng nước, hoặc
lau bằng khăn ướt để tránh tạo bụi sương có lẫn enzym trong đó. Do đó,
trong quá trình sản xuất và sử dụng enzym cần trang bị các dụng cụ bảo
hộ theo quy định. Người trực tiếp sản xuất cần phải mặc áo quần bảo hộ,
đeo kính và khẩu trang, mang găng tay và đi ủng hoặc giày bảo hộ.
Gần đây người ta rấ t quan tâm đến công đoạn lập công thức enzym
bao gồm các bước thực hiện hoàn thiện cuối cùng, độ bền và tiêu chuẩn
hoá chế phẩm enzym. Như vậy, enzym được tinh sạch đến mức độ cần,
chế phẩm phải dược lập công thức theo mục đích sử dụng. Việc lập công
thức chế phẩm enzym là một nghệ thuật và được các nhà sản xuất giữ bí
mật chi tiết hoặc không tiết lộ đối với khách hàng, vì là bưóc sản xuất
quyết định tính cạnh tranh của nhà sẳn xuất.
Lập công thức không chỉ cho enzym hàng hoá lớn mà còn cho tất cả
các loại enzym, cần phải tuân theo những quy định nghiêm ngặt, các
quy định này được xác định đến quy mô lớn nhờ khách hàng sử dụng
enzym. Ví dụ: enzym sử dụng trong bột giặt, dệt, thuộc da, sản xuất giấy
được quy định như bất kỳ hoá chất khác sử dụng trong quá trình sản
xuất; enzym được sử dụng trong lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm
theo quy định của các cơ quan tương ứng (Cơ quan quản lý thực phẩm
và thuốc (FAD) ỏ Mỹ và các cơ quan tương ứng ở các nước khác). Do vậy,
quy định này bao trùm cả thế giới và thậm chí giữa các cộng đồng của
các nước. Không những phải dán nhãn an toàn cho enzym, mà các chủng
vi sinh vật sản xuất các loại enzym đó cũng phải được cấp phép an toàn.
Rủi ro dị ứng enzym trong công nghiệp bột giặt ngày nay cần được đánh

223
giá cẩn thận, do tranh cãi mà cuối những năm 1960, ngành công nghiệp
bột giặt không được phép bổ sung enzym vào bột giặt vài năm ở Mỹ.
Chính vì vậy, người ta rấ t quan tâm đến enzym cố định vì phần nào đã
khắc phục nhược điểm nay.
Chìa khoá để giữ hoạt tính enzym là giữ hình dạng cấu trúc liên kết
cộng hoá trị của enzym không bị cuộn lại, không bị giãn ra và không bị
thay đổi. Có ba cách tiếp cận, đó là: sử dụng chất bổ sung, sử dụng có
điều chỉnh sự thay đổi liên kết đồng hoá trị và cố định enzym (được thảo
luận kỹ ở chương 4).
Lập công thức enzym bao gồm các bước thực hiện hoàn thiện cuối
cùng, độ bền và tiêu chuẩn hoá chế phẩm enzym. Bước hoàn thiện cuôì
cùng nhằm hạn chế các chất nhiễm bẩn chưa loại bỏ trước đó. ĐỐI với
trường hợp sản xuất nhỏ các enzym đặc biệt để ứng dụng trong y học,
bước hoàn thiện bao gồm một số' bước có tính chất chìa khoá để loại bỏ
các chất nhiễm bẩn vết như pyrogen, nội độc tố, axit nucleic và virus.
Đối với trường hợp enzym công nghiệp, bước hoàn thiện cuối cùng
thường được xem xét loại bỏ muối và điều chỉnh pH nếu enzym được sản
xuất ở dạng lỏng và làm khô nếu enzym được sản xuất là chế phẩm rắn.
Việc lựa chọn giữa dạng rắn hay dạng lỏng có ý nghĩa lớn. Chế phẩm
rắn có ưu thế dễ mang vác, vận chuyển và đòi sông của nó tưdng đối cao,
tuy nhiên, vấn đề hình thành bụi trong phân xưởng sản xuất là một vấn
dề nghiêm trọng, do vậy chông nhiễm bẩn là cần thiết để giảm rủi ro dị
ứng cho công nhân làm việc. Chế phẩm lống có một số ưu điểm: không
gây nhiễm bẩn, không cần làm khô và liều dùng dễ dàng hơn. Mỗi công
ty sản xuất có triết lý riêng trong vấn đề này, nhưng nhìn chung, sử
dụng enzym cuối cùng vẫn là nhu cầu của người dùng. Enzym mà nó là
một phần của sản phẩm rắn (như enzym bột giặt) thường được sản xuất
ở dạng rắn, trong khi để ứng dụng cho các sản phẩm lỏng (như enzym
đường hoá và izome hoá để sản xuất xiro fructoza cao), tuy nhiên chế
phẩm enzym dạng lỏng cũng cần cô đặc thì tôi hớn. Trong một số trường
hợp, cần thao tác đặc biệt, như trường hợp proteaza bột giặt, cần gói bột
enzym thành hạt để tránh hình thành bụi trong quá trình sản xuất và
bảo vệ người sử dụng tiếp xúc trực tiếp enzym, còn chế phắm enzym
dạng lỏng có thể đóng chai hoặc cô đặc enzym trưóc khi loại muối bằng
lọc thẩm thấu hoặc sắc ký loại bỏ kích thưóc.
Mối quan tâm chính hiện nay là sản xuất enzym từ các cơ thể biên
đổi gen chưa được nhất trí, trong khi một sô" nưổc ngăn cản và quy định
224
nghiêm ngặt sản xuất enzym như vậy thì các nước khác chỉ đòi hỏi sản
xuất phai tuân thủ thực hành sản xuất tôt (GMP). Khía cạnh sức khỏe
và an toàn liên quan đên sản xuất và sử dụng enzym đã được tổng quan
toàn diện và quy định an toàn đôi với enzym thực phẩm đã được công bô
gần đây. Những điều cần biết về an toàn trong sản xuất enzym đã được
Chaplin MF & Bucke c, 1990 đưa ra là rất tiến bộ.
6.4.2. Vấn đề môl trường và bảo vệ môi trường trong sản xuất enzym
Chất thải và nước thải trong quá trình sản xuất enzym, nhất là sản
xuất enzym công nghiệp, cũng có ảnh hưởng đáng kể đến môi trường
nếu chúng ta không quan tâm đến nguổn chất thải và xử lý môi trường
chất thải, nưốc thải trước khi thải vào môi trưòng. Hơn nữa, trong quá
trình sản xuất dễ sinh chất thải, nước thải giàu chất hữu cơ, dễ phát
sinh bụi có chứa các chất hữu cơ và vi sinh vật. Do đó cần quét dọn và vệ
sinh sạch sẽ và định kỷ khỏ trùng môi trưòng làm việc là cần thiết.
Tuy nhiên, tuỳ từng loại enzym sản xuất và nguồn cơ chất sử dụng
mà các quá trình có ảnh hưởng đến môi trường ỗ mức độ khác nhau.
Người ta thường chia thành 2 loại quá trình sản xuất: Enzym có nguồn
gốc thực, động vật và enzym từ vi sinh vật. Sau đây là những điểm cần
quan tâm thu gom và xử lý chất thầi và nước thải trong quá trình sản
xuất enzym:
a) Sản x u ấ t enzym có nguồn gốc thực vật và động v ậ t
1) v ề chất thải
Sau khi thu nhận enzym, các chất thải là các loại bã dứa, bã vỏ, hạt
quả đu đủ, quả đậu rựa,... hay nội tạng động vật. Các chất thải này ít
độc, nhưng cần được thu gom ngay và chuyển sang khu xủ lý thải. Chất
thải này có thể xử lý bằng phương pháp ủ hiếu khí hay kỵ khí để sử
dụng làm phân bón hữu cơ. Tuy nhiên, tuỳ theo quy mô của quá trình
sản xua't enzym mà có hình thức xử ]ý phù hợp. Nếu là cơ sở sản xuất
lớn (> 1 tấn phế thải/ ngày) thì có thể xây dựng bể xử lý tại cơ sỏ sản
xuất, còn nếu sô' lượng ít thì có thể thu gom 'để mang đi xử lý chất thải
theo quy định chung.
2) v ề nước thải
Phần nước thải nhận được thông qua quá trình lọc ép, tách chiết và
làm sạch enzym cũng như nước rửa trong quá trình sản xuất cũng cần
được thu gom để xỏ lý bằng các biện pháp sinh học trước khi thải ra môi
trưòng. Nước thải của quá trình sản xuất này thường chứa các hợp chất

225
hữu cd và vô cơ với nồng độ tương đối cao, cho nên bùn hoạt tính sau khi
xử lý bằng biện pháp sinh học cũng có thể ủ để làm phân bón hữu cơ.
Các phương pháp xử lý chất thải dựa trên nguyên tắc xử lý nước thải
của các cơ sở sản xuất của ngành công nghiệp thực phẩm.
b) S ả n x u ấ t enzym từ vi sin h vâ t
1) v ề chất thải
Trong quá trình sản xuâ't enzym từ vi sinh vật, nguồn chất thải
khác nhau tuỳ thuộc vào các quá trình lên men. Nếu sản xuất enzym
bằng phương pháp lên men bề mặt hay trong môi trường xốp (solid State
fermentation) thì lượng chất thải thải ra nhiều hơn phương pháp lên
men chìm. Cũng giống như quá trình sản xuất enzym có nguồn gốc thực
vật, chất thải trong sản xuất enzym từ vi sinh vật thông thường là các
chất hữu cơ, có thể xử lý làm phân hữu cơ. Một điểm đáng chú ý của
chất thải trong quá trình sản xuất enzym từ vi sinh vật là trong chất
thải chứa nhiều tế bào hay bào tử của vi sinh vật thì nhất thiết phải loại
bỏ bằng phương pháp ủ, tránh phát tán ra môi trường.
Trong quá trình sản xuất enzym bằng phương pháp lên men trong
các thiết bị lên men, chất thải thu nhận được sau khi lọc hay ly tâm thu
nhận dịch lên men. Thông thường lượng chất thải ít hơn và là những
chất hữu cơ, có thể chế biến thành phân hữu cd sử dụng cho cây trồng,
hoặc làm thức ăn cho gia súc. Cũng tuỳ theo quy mô sản xuất, do lượng
chất thải ít cho nên cũng thu gom chung vào nước thải để xử lý.
Trong quá trình sản xuất enzym cũng cần lưu ý, chất thải từ các
công đoạn tách chiết, thu hồi và lập công thức enzym thì ngoài những
chất hữu cơ còn có các chất vô cơ. Tuy các chất như sulphat amon, các
chất làm chất mang không độc, nhưng vối lượng lớn cũng ảnh hưởng đến
môi trưòng,
2) v ề nước thải
Phần nước thải nhận được sau quá trình tách chiết và làm sạch
enzym, cũng như nước làm lạnh, nước rửa thiết bị trong quá trình sản
xuất. Thông thường nước thải loại này có cả sinh khối vi sinh vật và các
chất còn lại sau lên men. Do đó hàm lượng chất hữu cơ cao, vì vậy, cũng
cần được thu gom để xử lý bằng các biện pháp sinh học trước khi thải ra
môi trường. Bùn thải sau xử lý có thể ủ để làm phân bón hữu cơ. Các
phương pháp xử lý chất thải dựa trên nguyên tắc xử lý nước thải của các
cơ sở sản xuất của ngành công nghiệp thực phẩm.

226
 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG 6
1. Hãy cho biêt tình hình sản xuất và sử dụng enzym công nghiệp trên
thế giới và ở Việt Nam hiện nay.
2. Hãy nêu đặc điểm và tính chất của các loại enzym amylaza sử dụng
trong công nghiệp thực phẩm.
3. Hãy nêu đặc điểm và tính chất của các loại enzym xenlulaza và
hemixenlulaza sử dụng trong công nghiệp thực phẩm.
4. Hãy nêu đặc điểm và tính chất của các loại enzym proteinaza sử
dụng trong công nghiệp thực phẩm.
5. Hãy nêu đặc điểm và tính chất của các loại enzym lipaza, lactaza và
oxyreductaza sử dụng trong công nghiệp thực phẩm.
6. Hãy trình bày cách ứng dụng enzym trong chế biến bột và sản xuất
bánh kẹo.
7. Vì sao lại sử dụng enzym trong sản xuất xiro và các sản phẩm chứa
đưòng?
8. Vì sao lại sử dụng các chế phẩm enzym và cốc enzym chủ yếu sử
đụng trong sản xuất bánh mỳ?
9. Vì sao lại sử dụng enzym trong sản xuất nước quả và rượu vang?
Trình bày cơ chế tác động của enzym pectinaza trong sản xuất rượu
vang.
10. Hãy nêu đặc điểm của enzym proteaza và ứng dụng chúng để làm
trong và ổn định chất lượng nước quả và rượu vang.
11. Những điểm cần chú ý về an toàn và bảo vệ môi trường khi sử dụng
các chế phẩm enzym trong công nghiệp thực phâm.

227
 Phần thứ hai

PROTEIN VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEINm

Chương 7
SẢN XUẤT ĐƠN BÀO (SCP)

7.1. NGUỒN PROTEIN TỪ SINH KHỐI Ví SINH VẬT

7.1.1. Protein dơn bào
Trong thức ăn, ngoài nước, còn cần các nhóm chất: protein (chất
đạm), lipit (chất béo), gluxit (đường bột), vitamin, enzym, muôi khoáng
và các nguyên tố vi lượng. Trong số các nhóm chất trên, protein là nhóm
chất quan trọng. Đó là nguồn nitơ duy nhất cung cấp cho con ngưòi và
động vật. Trong quá trình đồng hoát protein được phân giải thành các
amino axit. Trong đó, cố các amino axit không thay th ế là rấ t cần thiêt
cho con người và động vật như: Valin, lơxin, izolơxin, metionin, treonin,
tryptophan, phenylalanin, lyzin.
Protein là thành phần rấ t quan trọng trong khẩu phần ăn, đặc biệt là
đốĩ vối trẻ em. Nếu thiếu protein sẽ dẫn đến sự chậm lớn, còi cọc, kém
phát triển trí tuệ. Đôi với ngưòi lổn, hàng ngày có tới hàng 100 tỷ tế bào
chết đi cần thay thế. Thiếu protein sẽ dẫn đến suy gan, lượng kháng thể
trong máu giảm đi, sức đề kháng giảm và dễ mắc bệnh tật. Nhu cầu
protein của con người mỗi ngày 60 - 80g (theo tài liệu khác lOOg). Một sô'
nhà dinh dưỡng đề nghị: lkg khối lượng cơ thể, mỗi ngày cần lg protein.
Trong đó nên sử dụng 70% protein thực vật và 30% protein động vật.
Đứng trưốc nhân loại hiện nay là vấn đề bùng nổ dân số. Hàng năm
táng khoảng gần 100 triệu người. Năm 1996 - 5,7 tỷ người. Năm 2000 -
trên 6 tỷ ngưòi. Con số ưóc tính đến 2020 là 8,5 tỷ và nếu không có sự
kiểm soát, có thể lên đến con số’ 10 tỷ vào năm 2050. Trong đó, gần 50%
là lứa tuổi trê em, đòi hỏi khẩu phần protein lổn hơn người lớn, nhưng
lại chưa lao động được.
Hiện nay, tốc độ tăng vể lương thực và thực phẩm không kịp với tốc
độ tăng dân sô'. Loài người đang gặp khó khăn lớn vể lương thực và thực
phẩm. Theo thông kê của tổ chức FAO và WHO thì hiện nay, nhiều nước
228
vẫn còn ở tình trạng thiếu hụt protein.Việc sản xuất và sủ dụng protein
đơn bào (SCP) sẽ giải quyết vấn để này.
Cơ sở khoa học của giải pháp này là lợi dụng sự sinh trưởng nhanh
chóng của vi sinh vật và sự phong phú về protein và amino axit trong tế
bào vi sinh vật để làm nguồn thớc ăn cho gia súc và cho con người.
Thuật ngữ “Protein đơn bào” (Single cell protein) là một thuật ngữ
được gọi theo quy ưốc, đùng để chỉ sinh khối tế bào vi sinh vật dùng làm
thức ăn cho người và động vật. Thông thường, sản phẩm tạo ra không
phải là protein thuần khiết mà là các tế bào đã được xử lý thuộc nhiều
loại vi sinh vật khác nhau, cả vi sinh vật đơn bào lẫn đa bào, bao gồm vi
khuẩn, nấm men, nấm mốc và tảo.
Thuật ngữ này được đưa ra ở viện Công nghệ M assachusetts vào
nãm 1966 và vẫn được sử dụng cho đến nay, để chỉ nguồn thức ăn sinh
khối vi sinh vật cho con người và dùng trong chăn nuôi, cả protein được
tách chiết từ tế bào lẫn vật liệu tế bào đều được gọi là SCP.
7.1.2. Ưu điểm của quá trình sản xuất protein đớn bào
Nguồn protein chủ yếu hiện nay được khai thác từ trồng trọt và
chăn nuôi. Lượng protein thiếu hụt hàng năm lên đến trên 20 triệu tấn.
Dân số ngày càng tăng thì nguy cơ đói protein ngày càng nghiêm trọng.
Ngành trồng trọt và chăn nuôi cũng không thể đáp ứng đủ nhu cầu mặc
dầu có nhiều tiến bộ về giống cây trồng, vật nuôi, vể phân bón và thức
ăn chán nuôi, nhưng diện tích canh tác cũng chỉ hữu hạn.
Do vậy, ngưòì ta quan tâm đến khai thác nguồn protein từ vi sinh
vật, vì:
- Không giông quá trình trồng trọt, chăn nuôi, sản phẩm protein từ vi
sinh vật (sinh khôi) có thể thu hoạch toàn bộ, dê dàng và hiệu suất cao.
- Diện tích để nuôi cấy vi sinh vật không lớn (để xây dựng xí nghiệp
vói hệ thống lên men).
- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật cao, tương ứng vối tốc độ sản sinh
protein, có thể gấp 100 —1.000 lần so với đại gia súc.
- Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu, thời tiết của
địa phương.
- Có thể phân lập và lựa chọn chủng giông thích hợp cho từng quy trình.
- Sản xuất protein từ vi sinh vật sử dụng nguyên liệu phi protein -
phê' liệu hoặc phụ phẩm từ công nghiệp khác. Nguyên liệu sử dụng đa

229
dạng phong phú và rẻ tiền như: rỉ đường, dịch thuỷ phân gỗ tạp, rờm rạ,
bã mía,... góp phần khắc phục ô nhiễm môi trường.
Chế phẩm protein từ vi sinh vật ở đây được hiểu là toàn bộ sinh
khôi tế bào vi sinh vật. Sinh khôi vi sinh vật chứa 40 - 60% phần chất
khô của tế bào (như tế bào nấm men, vi khuẩn lam).
Các vi sinh vật có khả năng phát triển rất nhanh tuỳ theo từng loài.
Trong cốc điều kiện thuận lợi, thời gian cho lượng sinh khối gấp đồi đối
vỡi từng loại sinh vật khác nhau: Đổi vói vi khuẩn là 0,3 - 2 giò, nấm
men 1 - 3 giò, tảo 2 - 6 giờ, nấm mốc 4 - 1 2 giò.
Các vi sinh vật thường có hàm lượng protein cao. ở vi khuẩn, hàm
lượng này có thể đạt 82%, nấm men 50 - 60%. Phần lớn, hàm lượng nitơ
protein chiếm 7 - 12%. Năng suất thu protein được tạo thành trong một
ngày đối với các vi sinh vật khác nhau (bảng 7.1).
Bảng 7.1. Hiệu suất sinh protein ả các đối tượng sinh vật khác nhau

Cđ th ể (1.000 kg) Sản lượng protein/ ngày (kg) Hiệu su ấ t / ngày (%)
Bò 1 0,1
Đậu tương 10 1
Nấm men 105 104
Vi khuẩn 1011 1010

Các vi sinh vật có ưu điểm là sử dụng được nguồn nitơ vô cơ rẻ tiền

như là muối amon, các nguồn cacbon cũng rẻ tiền. Riêng đối với bò, nhờ
có các vi sinh vật mà các loại động vật ăn cỏ có thể sử dụng thức ăn là
ure và xenluloza, rồi chuyển hoá thành thịt và sữa.
7.1.3. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon và giá trị của protein đơn
bào (sinh khối vi sinh vật)
Vi sinh vật có khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau. Khí
C 02 là nguồn cacbon cho các loại tảo và một sô" loài vi khuẩn. Một sô vi
sinh vật khác lại có khả năng đồng hoá cacbuahydro (xem bảng 7.2).
Nguồn các chất phê liệu của ngành chế biến nông sản, các ngành nông,
công nghiệp như rơm, rạ, bã mía, ri đường (phế thải của ngành công
nghiệp đưòng), dịch kiềm sulfit (phế thải ngành giấy) cũng là nguồn
nguyên liệu chủ yêu để sản suất phần lân các sản phẩm protein từ vi
sinh vật.

230
 Bảng 7.2, Vỉ sinh vật đồng hóa cacbuahydro
Vi sinh vật n - alcan olefin
Nấm men
Candida Pichia Candida
Cryptococcus Rhoơotorula Debaryomyces
Enơomyces Torulopsis Hansenula
Hansenula Trichosporon Rhodotoruìa
Mycotorula Saccharomyces
Nấm m ốc
Absidia Gliocladìdum Aspergillus
Acremonium Graphium Cephalosporium
Aspergillus Helicostylum Cunninghamella
Bortytis Helminthosporium Fusarium
Cephalosporium Monila Helmìnthosporium
Chaetomium Mucor Spicaria
Chloridium Oidioơendron
Cladosporíum Paecilomyces
Colleotrichum Penicíllium
Cunninghameila Rhizopus
Dematium Scolecobasidium
Epicoccum spicaria
Fusarium Syncephaìastrum
Trichoơerma

Giá trị dinh dưỡng của protein vi sinh vật thể hiện bảng 7.3
Bảng 7.3. Thành phẩn hoá học của tế bào vi sinh vật, % theo khối lượng khô

Thành phẩn Nấm sdi Tảo Nấm men Vi khuẩn

Nhơ 5 -8 7 ,5 - 1 0 7 ,5 -8 ,5 1 1 ,5 -1 2 ,5

Lipit 2 -8 7 -2 0 2 -6 1 ,5 -3 ,0

Chất tro 9 -1 4 8 -1 0 5 - 9 ,5 3 -7

Axit nucleic - 3 -8 6 -1 2 8 -1 6

Mặc dù nitơ amin chiếm 70 - 80% nitd tổng số trong các tế bào vi
sinh vật, ta thấy có m ặt cả cốc amino axit không thay thế, mà có thể so
sánh với protein của trứng và thịt bò (bảng 7.4).
231
 Bảng 7.4. Hàm lượng amino axit không thay thế của một sô' nguồn protein

Amino axit Lúa mỷ Trứng SpimUna Saccharomyces Cadìda Pseudomonas

maxima cerevisiae lipolytica (methanol)
Lyzin 2,8 6,5 4,6 7,7 7,8 5,3
Threonỉn 1.9 5,1 4,6 4,8 5,4 4,5
Methionín 1,5 3,2 1,4 1,7 1,6 1.8
Xystein 2,5 2,4 0,4 - 0,9 0,3
Tryptophan 1,1 1,6 1,4 1.0 1,3 -
Izoloxin 3,3 6,7 6,0 4,6 5.3 3,9
Lơxin 6,7 8,9 8,0 7,0 7,8 7,0
Valin 4,4 7,3 6,5 5,3 5,8 5.9
Phenylalanin 4,5 5,8 5,0 41 4,8 4,2

Trong khi nấm men chiếm ưu thế về hàm lượng lyzin thì vi khuẩn
chiếm ưu thế về hàm lượng methionin.
Ngoài ra, tế bào vi sinh vật chứa nhiều loại vitam in (bảng 7.5). Nấm
men giàu vitamin nhóm B, vi khuẩn chỉ chiếm ưu th ế về vitamin B12.
Tảo có chứa nhiều p —caroten (provitamin A) và tocopherol. Nấm mốc
chứa ít vitamin nhất.
Bảng 7.5. Hàm lượng vitamin trong 1O0g khối lượng chất khô, mg
Vitamin M orchella Candida Saccharom yces Pseudom onas
hortensis u tilis cerevlsiae m ethanica
Thiamin 0,52 0,53 5 -3 6 1,81
Riboflavin 1,31 4,50 3,6 - 4,2 4,82
Niaxirt 12,4 41,73 32 - 1 0 0 15,9
Pyridoxin 2,62 3,34 2 ,5 - 1 0 14,3
Axit pantothenic 12,6 3,72 10 2,42
Cholin 4,61 - - 968,0
Axit folic 1,09 2,15 1 ,5 - 8 —

Inositol 1,78 - — -

Biotin 0,015 0,23 0 ,5 - 1 ,8 —

Vitamin B,J 0 0 0 0,96

Axit p - aminobertzoic - 1,7 0 ,9 -1 0 -

Đánh giá giá trị protein người ta nhận thây, con người rấ t cần các
amino axit không thay thế được cung cấp trong thức ăn, vì không thể
tổng hợp được các amino axit này trong cơ thể. Nhu cầu hàng ngày về
các amino axit này đốì với người lớn (bảng 7.6).

232
 Bảng 7.6. Nhu cẩu hàng ngày vể các amino axỉt dối với người lớn
Amino axit không thay thê' Theo FAO (g) Lượng tối thiểu (g)
lzolơxin 1,4 0,7
Lyzin 1,6 0,8
Lơxin 2,2 1,1
Methionin 2,2 1,1
Phenylalanin 2,2 1,1
Threonin 1,0 0,5
Tryptophan 0,5 0,25
Valin 1,6 0,8
Tổng số 12,7 6,35

Nếu bị thiếu hụt một trong số’các amino axit này, hoặc không đủ về
lượng thì sẽ không thể đồng hoá hết lượng protein có trong cơ thể.
Chẳng hạn như: dôi với những ngưòi chỉ ăn gạo sẽ bị thiếu hụt lyzin và
chi’ có thể đồng hoá được 66% lượng protein trong loại thực phẩm này.
Thực ra, hầu hết các thực phẩm đều thiếu một hay nhiều loại amino axit
(trừ trứng) (bảng 7.7).
Bảng 7.7. Giá trị dinh dưdng của các sản phẩm thực phẩm khác nhau

Thực phẩm Loại amino axit thiếu hụt Phấn trăm thiếu
Trứng toàn phần Không có loại nảo 0
Thit bò Xystein + Methionin 29
Sữa bò Xystein + Meliiionin 32
Gao, lúa mỳ, ngỏ Lyzin 6 1 -7 2
Nấm men bánh mỳ Xystein + Methionin 55

Tuy nhiên trong trường hợp là protein từ vi sinh vật, sự có mặt của
lớp màng dày có thể làm giảm khả nãng sử dụng protein bên trong. Vì
vậy, cần thiết phải thực hiện các nghiên cứu thử nghiệm đối vói ngưòi
và động vật sao cho tỷ lệ loại protein này là hợp lý trong khẩu phần ăn.
Đối tượng thử nghiệm thường là chuột, protein vi sinh vật được đem
thử n hư một nguồn cấp nitơ.
Nếu gọi N là lượng nitơ có trong protein vi sinh vạt, p là lượng nitd
có trong phân và T là lượng nitơ có trong nưốc tiểu thì có 2 giá trị đặc
trưng sau đây:
Giá trị sinh học (BV): Biểu diễn phần trăm lượng nitơ được giữ lại so
với lượng nitd tổng, tính đến phần nitơ mất mát, không sử dụng được:

233
 Hệ s ố tiêu hoá (D) được tính theo phần trăm ni tơ đã được hấp thu
trên tổng số nitơ đã sử dụng:
N- P
D = 100 X — --------
N
Giá trị về hiệu quả sử dụng protein hay là tỷ lộ nitơ của protein
trong sản phẩm so với protein tương ứng của lòng trắng trứng. Người ta
cũng có thổ xác định khôi lượng động vật đạt được khi sử dụng loại
protein này so với protein đối chứng (bảng 7.8).
Bảng 7.8. Giá trj dinh dưỡng của protein nấm men
Dạng nấm men Đấí tượng Khả năng tiêu hoá, % Giá tri sinh học, %
Saccharomyces Chuột 81 59
cerevisiae
s. cerevisiae Người 7 9 -9 0 5 2 -8 7
*ỉ| Candida utilis Chuôt 8 5 -8 8 3 2 -4 8

Protein của vi khuẩn giàu amino axit chứa lưu huỳnh hdn so với
nấm men cho nên chúng có giá trị sinh học cao hơn. Nhưng nếu bổ sung
thêm methionin vào nấm men thì giá trị của nó sẽ tăng lên (bảng 7.9).
Bảng 7.9. Giá trì dinh dưõng protein của Candida utilis
Tỷ lệ Khả năng tiêu Giá trị sinh Hiêu quả protein
hoá, % học, % (PER)
Chỉ nấm men 85 48 0,9
Nấm men + 0,5% D,L - 90 90 2,3
methionin

Có thể sử dụng kết hợp protein của nấm men giàu lyzin và threonin
để bù vào các loại sản phẩm hạt ngũ cốc thiếu hụt các amino axit này
như là: lúa mỳ, gạo, sắn (bảng 7.10).
Bảng 7.10. Hiệu quả tăng giá trị dinh dưỡng khi bổ sung
nấm men khô vào bột gạo
Candida u tilis , % Lượng protein Tăng khối lượng, T ăng giá tri sử
th eo chê' độ, % g dung protein (lẩn)
0 6,5 30 1.87
2 5,9 36 2.19
4 7,3 68 2.90
6 7,8 95 3.13
8 8,2 108 3.29
10 9.9 122 3.03
12 11,0 137 2.93
14 11,9 132 2.75

234
 Tuy nhiên sau khi thử nghiệm với động vật, nhất thiết phải được
thủ đối với người để kiểm tra tính gây dị ứng hay bệnh đưòng ruột.
7.1.4, Thử nghiệm chế phẩm protein dơn bào
a) T hí n g h iệm dối với người
Nhiều thí nghiệm đối với người cho thấy, có thể chịu được lOOg/ngày
hỗn hợp tảo Chlorella và Scenedesmus. Nhưng với liều 200g/ngày thì
thấy có hiện tượng về đường ruột (buồn nôn, nôn, đầy hơi, đi ngoài).
Ngoài ra, dịch chiết cồn từ Chỉorelỉa pyrenoidesa thì chịu đựng tốt, còn
Scenedesmus obỉiquis thì không.
Việc thử nghiệm với protein của vi khuẩn không được thành công
cho lắm. Ngược lại, đốì với nấm men thì rất tốt. Một sô" ngưòi tình
nguyện có thể đã ăn đến 135g nấm men khô trong 9 ngày mà không bị
bệnh đường ruột. Tuy nhiên cần nhiều biện pháp xử lý tế bào trước khi
đem sử dụng làm thực phẩm.
b) X ử lỷ t ế bào trước k h i dem sử d ụ n g ỉàm thức ăn
Có một sô" yếu tố làm hạn chế khả năng sử dụng protein vi sinh vật,
chẳng hạn như thành tế bào khó tiêu hoá, hàm lượng axit nucleic cao,
màu sắc không phù hợp (chủ yếu là ỏ các loại tảo), vị không hấp dẫn
(tảo, nấm men).
Trưốc khi sử dụng cần phải làm chêt tê bào. Thực tê, tế bào vi sinh
vật có thể sông và phát triển trong đường ruột, gây lên men, sản sinh ra
các amin gây độc, sử dụng vitamin của vật chủ. Từ các nguyên nhân này
mà ta cần xử lý tế bào vổi mục đích tiêu diệt tế bào, loại bỏ bớt màng tế
bào gây cản trỏ quá trình tiêu hoá và đồng thòi làm giảm hàm lượng
axit nucleic.
Nhiều phương pháp tách chiết hoá học đã được áp dụng để thu nhận
protein đặc. Kết quả là trong sản phẩm có các liên kết ure - protein, cho
nên cần loại bỏ ure bằng phương pháp thẩm tích. Tiền xử lý tế bào bằng
xút làm tăng hiệu quả tách chiết (30% đôì với trường hợp Chlorella, 50%
đối với Torula) nhưng lại phá huỷ lyzin, xystin và tryptophan, đồng thời
làm giảm giá trị sử dụng của protein.
Chính do những hạn chế kể ra ở trên mà phương pháp enzym có
nhiều triển vọng. Trước hết cần có enzym phá huỷ màng tế bào như là
xenlulaza trong khi xử lý tế bào tảo Scenedesmus obliquus. Tuy nhiên
chỉ làm giảm được xenluloza, trong khi màng tế bào Chỉorophyceae còn
chứa nhiều thành phần khác nữa.
235
 Cũng có thể sử dụng phương pháp tự phân hay là làm co nguyên
sinh. Trong phương pháp này, các enzym nội bào được sử dụng để phân
huỷ màng tế bào. Tuy nhiên cần thòi gian dài (12 - 14 giờ, ở 45 —50°c,
pH 6,5), hiệu quả của quá trình chỉ đạt 50 —60%. Trong trường hợp làm
co nguyên sinh chất, ngưòi ta bổ sung NaCl ở nồng độ cao 25%. Trong
thực tế, người ta sử dụng phương pháp này để sản xuất cao nấm men.
Khi dùng axit mạnh (HC1) để thuỷ phân, sẽ phá huỷ tryptophan và
làm giảm hàm lượng một sô”amino axit khác. Một lượng lớn clorua natri
sõ được tạo thành sau khi trung hoà, sẽ làm hạn chế giá trị sử dụng của
sản phẩm. Đồng thời cần thực hiện thêm các công đoạn phức tạp để tách
riêng các amino axit.
Kỹ thuật khác được áp dụng trong việc xử lý tế bào là nghiền tế bào
bằng bi thuỷ tinh, bằng sóng siêu âm, bằng cách đưa địch huyền phù tế
bào vào Ống hẹp, dưới áp suất lớn. Trong trường hợp sau cùng, các tế bào
có thể được làm lạnh trước đến -25°c, sau đó dùng áp suất 4.Q00kg/cm2.
Vi cần loại bỏ nước khỏi dịch tế bào trước quá trình phá vỡ tế bào theo
cách này, cho nên tôn nhiều chi phí (dịch huyền phù ban đầu chỉ có 10%
khối lượng chất khô). Sau khi xử lý, khả năng tiêu hoá protein tăng lên,
do nitơ trong màng tế bào không bao giò sử dụng được (bảng 7.11).
Bảng 7.11. Khả nâng tiêu hoá của tê' bàữ nguyên vẹn
và thành phẳn tê' bào,%
Loii vi sinh vật Tê' bảo nguyên vẹn Tê' bão sau khi phá vd
Bacillus megaterìum 76 94
Candida utilis 65 95

Trong sô' các kỹ thuật rẻ tiền như: sử dụng phương pháp hấp dưới
áp suất đối vói tảo, hay tách nưóc tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, làm
táng giá trị dinh dưỡng, do phá vỡ được một phần tế bào, một phương
pháp mói hiện nay cho phép thu nhận được một sản phẩm tế bào nấm
men chứa 1 —5% nưốc, 7 - 15% chất béo, có vị dễ chịu, khả năng tiêu
hoá được là 82%. Nhưng vấn đề còn lại là cần loại bỏ bớt axit nucleic
trong sản phẩm.
c) L o a i bỏ a x ỉt nucleic
Trong tê bào vi sinh vật, hàm lượng axit nucleic chiếm khoảng 8 -
25% khối lượng protein, vượt quá xa so vối hàm lượng axit này có trong
gan (4g/100g protein). Các axit nucleic này, sau khi tiêu hoá, dưới tác
dụng của enzym nucleaza pancreatic, rồi bị thuỷ phân thành các
nucleozit nhò các enzym được tiết ra từ thành ruột.

236
 Khoảng 70 - 80% protein tổng số là các amino axit, phần còn lại là
axit nucleic. Hàm lượng axit nucleic thường cao ở nguồn protein của tất
cả các sinh vật phát triển nhanh.

Hlnh 7.1. Sd đồ phân giải axit nucleic

Các bazơ purin như adenin và guanin sau đố tiết ra dưói dạng axit
uric vì con người đã mất đi trong quá trình tiêu hoá, khả năng tổng hợp
enzym oxydaza urat để chuyển hoá axit uric khó hoà tan thành
allantoin dễ hoà tan.
0 0
Guanin
in jí Xanthin
deaminaza oxydaza

AV H

Xanthin
H ộợ H H
H yp oxa nthin

X anthine
oxydaza

C!MP: G uanosin AMP: Adonozin

5'-m<>nophnsphat 0 5' -m onophosphat

HNx *^'sị|— — N

H H

Hình 7.2. Sự hirth thành axit uric trong cơ th ể người

237
 Nếu trong thực phẩm có chứa nhiều axit nucleic thì trong cơ thể sẽ
tạo thành axit uric (hình 7.2). Cặn của axit này có thể giữ trong thận,
trong khớp, bàng quang, gây ra bệnh gút. Do đó, trong trường hợp sử
dụng quá 130g nấm men/ngày, kéo dài 1 tuần, axit uric trong máu sẽ
táng 4,8 - 8,3mg/100g và lượng axit này tăng gấp đôi trong nước tiểu.
Một chế độ ăn trong đó có 20g protein (chứa 8,5% axit nucleìc)/ngày là
chấp nhận được. Như vậy, giới hạn axit nucleic cho phép là
2g/người/ngày. Có một sô" nghiên cứu cho thấy, sử dụng axit nucleic
trong giới hạn cho phép có thể làm tăng chỉ số thông minh.
d) L à m g iả m hàm lượng a xỉt nucleic tro n g tê bào vỉ s in h vât
Không thể làm giảm hàm lượng axit nucleic bằng cách giảm tốc độ
sinh trưởng, vì như vậy sẽ làm mất đi những ưu thế của vi sinh vật. Có
một số biện pháp như sau:
- Xử lý bằng NaOH.
- Xử ]ý bằng NaCl 10%.
- Xử ]ý bằng sốc nhiệt.
Thuỷ phân bằng kiểm cho phép giảm hàm lượng ARN trước khi
tách chiết protein. Nhưng làm như vậy rất khó tránh khỏi vấn đê' làm
giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm cuối cùng. Cũng có thể tách bằng
dung dịch NaCl nóng, nồng độ 10%. Tuy nhiên khi tách chiết protein vi
sinh vật có áp dụng biện pháp tiền xử lý tế bào thì có thể thu được dung
dịch vâi hàm lượng axit nucleic thấp dưới 2% (Nghiền tế bào ở pH 9,5,
trong dung dịch muối nóng, kết tủa protein), sử dụng nucleaza của
tuyến tuỵ, sau khi làm sốc nhiệt đối với tế bào Candida utỉlis (30 giây, ở
80r,C) cho các kết quả tôl, làm giảm hàm lượng axit nucleic từ 7,5 - 9,0
xuông 1,5 - 2% (bảng 7.12). Nhưng enzym này, ngay cả khi chưa tinh chế
thì cũng đã quá đắt. Giải pháp tốt nhất là sử dụng phosphodiesteraza từ
nguồn enzym vi sinh vật.
Một phương pháp khác là xử lý tế bào nấm men bằng sốc nhiệt đê
tạo điểu kiện cho enzym nội bào hoạt động. Đầu tiên là đun nóng tê bào
dến 68“C trong vài giây đổ làm biến tính riboxom, sau đó hoạt hoá
ribonucleaza nội bào. Sau đó ủ 2 giò ở 45°c, rồi tăng đến 55UC trong 1 giờ,
dổ Lhuỷ phân ARN. Các phân tử có khôi lượng thấp sẽ đi vào môi trường.
Kết quá là hàm lượng axit nucleic sẽ được làm giảm đáng kể, từ 7%
giảm xuông còn 1% khối lượng chất khô (bảng 7.12).

238
 Bảng 7.12. Hiệu quả xử lý tê bào để làm giảm hàm lượng axỉt nucleic (biểu
diên % so với khối lưụng chất khõ) của loài Candida utilỉs
Thảnh phần Tẻ' bào Dịch nổi sau xử lý P hẩn lẳng
tế bào nguyen vẹn Bằng nhiệt Ribonucleaza (sau ly tâm)
Axil nucleic 7,5 - 9,0 2 ,0 -3 ,0 5 ,5 -6 ,0 1 ,0 -2 ,0
Protein 4 5 -5 5 4 ,0 -5 ,5 0 ,3 -0 ,5 40 - 50
Amino axít - 1 ,0 -1 ,1 0 ,2 -0 ,4 -

e) Vấn đ ề đôc t ố
Những vấn đề độc tô" đáng quan tâm ở nguồn protein vi sinh vật là
nấm men được nuôi trên môi trưòng dầu mỏ hay là n —alcan, do các sản
phẩm dầu mỏ hay chứa các chất gây ung thư. Hàm lượng các chất này
như là 3,4 —benzopyren, 1,2,5,6 - dibenzanthracen, methylcholanthren
trong các tế bào nấm men là vào khoảng 0,0002ppm, ta thấy hàm lượng
các chất này nhiều gấp 100 lần trong thịt hun khói. Do vậy, cần nghiên
cứu loại bỏ các hợp chất này trước khi dùng nguổn protein vi sinh vật để
làm thức ăn cho động vật.
Nguồn protein nấm men có thể thiếu hụt vitamin B12 và selenium.

7.2. NGUỒN PROTEIN TỪ Ví SINH VẬT

7.2.1. Vi khuẩn
a) Ví k h u ẩ n sử d ụ n g hydro (Hydrogenomonas.)
Một số vi khuẩn hiếu khí có khả năng sản sinh ra năng lượng bằng
cách oxy hoá hydro và cacbon từ khí C02. Một sô' loại vi khuẩn khác lại
là kỵ khí, cố thể sử dụng cùng loại các cơ chất nói trên nhưng bắt buộc
tự dưỡng quang năng. Khả năng sinh sản của chúng khá thấp, không có
tính cạnh tran h để sản xuất protein từ các loại vi sinh vật này. Các vi
khuẩn hiếu khí thuộc giống Hydrogenomonas. Môi trường dinh dưỡng
dể nuôi giống này là môi trường khoáng có thành phần như sau (trong
1 lít nước): NH 4CI - lg, Na 2H P 0,.l2H ,0 - 9g, KH2P 0 4 - l,5g. NaHCOa
0,5g; M gS0,.7H ,0 - 0,2g; FeNH4 x itra t- 5mg; CaCl2 - lOmg.
Lấy 15ml môi trưòng khoáng chứa trong các bình tam giác 100ml,
bổ sung Ig đất, rồi đặt vào một bình có chứa khí hỗn hợp (70% hydro,
20% oxy 10% C 02). Nuôi vi sinh vật ỏ 30"C trên máy lắc. Trong những
ngày đầu, môi trường đục, nhân giống nhỏ trong môi trương tương tự.
Sau đó giống được phân lập trên môi trường thạch 2%. Ngươi ta thây
chúng chủ yếu là các loại trực khuẩn G“, có chuyển động như chu mao,
và có môt sô”loài như sau: ỉĩ. eutrophữ, H. facihs, H. ruhlữỉidu.

239
 Cũng tồn tại các loài thuộc giống Actinomỵcetales có khả năng phát
triển trong môi trường nghiêm ngặt này. Các loài vi khuẩn thuộc giống
Hydrogenomonas là vi khuẩn ưa ấm, nhưng tổn tại loài ưa nhiệt mà
nhiệt độ tôi thích của nỗ là 50°c (H. thermophiỉus).
Thành phần môi trường dinh dưỡng dối với chúng rấ t đơn giản và
chúng sử dụng được muối amon, muôi nitrat, ure làm nguồn nitơ. Chúng
cần các ion kali, magiê, canxi, sắt, niken, và các anion phosphat, sulphat.
pH tối ưu trong vùng 6,5 - 7,5. Tuy nhiên nhũng vi khuẩn này là loại tự
dưỡng hoá năng tuỳ tiện, vì có thể phát triển tốt trong môi trưàng hữu cơ
trên cơ sồ axit hữu cơ và amino axit. Đối với các đường oza thì chỉ có
fructoza là sử dụng được vì chúng không có glucozo - permeaza. Sau khi
izome hoá xong, glucoza sẽ bị phân giải theo con đưòng Entner -
Doudorof. Nếu điều kiện là yếm khí thì vi khuẩn sẽ phát triển khi có mặt
của ion nitrat, các ion này đóng vai trò chất nhận hydro. Nhưng hydro sẽ
cản trỏ việc sử dụng các cơ chất hữu cơ do thực hiện sinh tổng hợp enzym
của đường hướng Entner - Doudorof, trong đó trao đổi chất luôn diễn ra
theo cách tự dưỡng vì có hydro và khí COi-
Trong những điều kiện tự dưỡng, thòi gian một thế hệ kéo dài từ
3 ,5 - 7 giò, ở 33 - 35°c, và có thể nhận được hiệu suất 28g/l sau 10 ngày.
Nếu nuôi liên tục, sự phát triển ở pha luỹ tiến sẽ dừng lại khi có đủ 3g/l
(khôi lượng chất khô), ngưòi ta có thể duy trì nồng độ này hàng tháng.
Nhu cầu vế oxy tăng lên, đạt 0,66 lít Oa/giờ/g chất khô. Nghĩa là, để có
lOg sinh khối khô thì cần 6,6 lít oxy, tương ứng 300mmol/giờ. Những
nghiên cứu trong thiết bị lên men liên tục đã chứng minh cho ta thấy
vai trò của hydro hay oxy như là các tác nhân hạn chế.
Bảng 7.13. Vai trồ của các tác nhân hạn chế (H2, 0 2) trong quá trình
sinh trưỏng của Hyơrogenomonas H16 trong thiết bj lên men
C ác thông sô' Tác nhân han c h ế
H, 02
Hè số sinh sản (giở-1) 0,08 0,08
Mặt độ vi khuẩn (mg/m!) 0,167 0,237
Hàm lượng polyhydroxybutyrat <1 23
Tỷ lệ hựo* 9,1 4,6

Tuy nhiên râ't khó thu được một hỗn hợp khí theo tỷ lệ mong muôn
tương ứng là Hị,/02 = 2 để có thể thực hiện dược điện ly dung dịch
khoáng trực tiếp trong thiết bị lên men nhò điện cực platin.
Trong thực tế, hydro và oxy là những sản phẩm được vi khuẩn sỏ
dụng, mà hỗn hợp này lại dễ bị cháy nổ.

240
 Những phản ứng xảy ra như sau:
Năng lượng- (1): 4H2+ 202 = 4H20 + 224kcal
Đồng hoá khí cacbonic (2): 2H2 + C02= HCHO + H20
Phản ứng tổng quát (3): 6H2 + 202+ C02= HCHO + 5H20
Phản ứng điện ly nước (4): 6H20 = 6H2+ 302
Tính theo khôi lượng chất khô, thành phần tê bào như sau: 50%
protein; 15% axit nucleic; 20% thành tế bào.
Thành phần amino axit của protein trong Hydrogenomonas eutropha
được trình bày ở bảng 7.14, được so sánh với loài Pseudomonas saccharophỉla
được nuôi trong môi trường hữu cơ phức (loài này cũng có thể phát triển
tốt trong môi trường khoáng mà nó sử dụng oxy và hydro như nguồn
năng lượng).
Bảng 7.14. Thành phẩn amino axit từ một số nguõn vl sinh vật
và cazein (g/16 ni tơ)
Amino axit Cazein H. euừopha p. saccharophila
Tryptophan 1,34 - -
Threomn 4,30 4,52 5,37
Lyzin 8,06 8,61 5,73
Melhionin 3,10 2,69 2,03
Xystein 0,38 - 0,36
Izoloxin 6,59 4,58 4,14
Lơxin 10,11 8,52 8,35
Phenylalanin 5,42 3,96 3,56
Tyrozin 5,86 3,26 2,32
Valin 7,44 7,13 7,55
Histidin 3,04 2,48 1,81
Acginin 4,10 8,00 5,01
Alanìn 3.38 8,80 13,57
Axit aspartic 7,44 9,57 9,72
Axit glutamic 2,32 11,17 10,52
Glyxỉn 2,00 5,47 9,65
Prolin 11,82 3,46 5,59
Serin 6,69 3,47 4,64

Các tế bào của Hydrogenomonas eutropha nghèo các amino axit

chứa lưu huỳnh, nhưng giàu lyzin giống như nấm men. Khả năng tiêu
hoá cùa chúng và giá trị sinh học được xác định sau khi thủ nghiệm trên
chuột cho thấy tương tự như cazein (bảng 7.15).
241
 Bảng 7.15. Giá trị dinh dưỡng của protein từ Hydrogenomonas eutropha

Nguổn protein Khả nâng tiêu hoá Giá trị sinh học
H. eutropha (sau khi tách) 93,8 77,0
H. eutropha {xử lý siêu âm) 93,3 77,0
E. coli 81,0 69,0
Cazein 98,9 77,1

b) Vi k h u ẩ n sử d ụ n g p a r a fin ( n - aỉcan)
Các nhà nghiên cứu của nhóm Esso khi sử dụng môi trường chứa
cacbua hydro như nguồn cacbon duy nhất, đã phân lập được từ đất một
SỐ’ chủng v i sinh vật (bảng 7.16).

Bảng 7.16. Một sô' chủng vi khuẩn phân hủy cacbuahydro

Nguồn Hàm lượng protein, Tỷ lệ am ino axit
% chat khô không thay thế, %
Brevibacteríum insectiphilum 53,6 60
ATCC N°15528
Corynebacterium sp 69,0 58
ATCC N°15529
Corynebacterium pourometa boltim 59,6 63,3
AJCC N°15529
Pseudomonas ligustri 60,9 46,8
ATCC N°15522
Pseudomonas orvitla 62,0 63,0
ATCC N°15524
Alcaligenes sp 70,0 74,1
ATCC NM5525
Cellulomonas galba 51,4 65,9
ATCC N° 15526

0 Đài Loan đã có một sô nghiên cứu đốì với chủng Pseudomonas

5401, loài này có khả năng sử dụng parafm cũng như dầu thô, sỏ dụng
muôi amon làm nguồn nitơ. Trong quá trình lên men, sau 4 giò bắt đầu
có sự phân giải dầu mỏ. Sau 24 giờ, ở điều kiện lên men 36 - 38°c, mật
độ tê bào đạt 16g/l (tính theo khối lượng chất khô). Khi lên men liên tục,
với hệ sô pha loãng là 0,12 giờ 1 cho khả năng thu nhận ở pha logarit
nồng độ tế bào là 10g/l. Hàm lượng protein tăng và đạt được 73,62% với
thành phần các amino axit tốt hơn so với nấm men, đặc biệt là hàm
lượng lyzin và methionin.

242
 Sinh khôi te bào vi sinh vật cần ly tâm, sau đó được rửa bằng dung
môi để loại bỏ cacbua hydro dư rồi đem sấy và nghiền nhỏ. s ả n phẩm
protein và vitamin từ những vi khuẩn này có thành phần tương đương
(bảng 7.17 và 7.18).

Bảng 7.17. Thành phẩn amino axit không thay thế trong các vi khuẩn nuôi
trên nguồn nguyên liệu n - alcan (tính theo % khối lượng sinh khối khô)
«

Pseudomonas 5401

Brev. insectiphilum

pourometa boỉum
£
8-

C orynebact
%
3
Nấm
I 1
Amino axit men
1 1
,3
§
Acginin 2,37 4,98 2,72 3,0 4,1 3,0
Glyxin 2,45 3,75 2,0 2,4 3,0 2,6
lzolơxin 2,35 3,34 2,3 3,4 1,8 2,5
Ldxin 3,60 6,57 3,5 3,7 4,8 3,0
Methionin - 1,27 0,72 0,75 1,2 0,75
Phenylalanin 2,17 3,29 1,5 1,7 1,8 1,7
Valin 2,60 3,48 2,5 2,6 3,8 2,7
Tryptophan 0,27 1,16 - - 1,0 1,2
Lyzin 3,89 4,29 2,4 2,3 5,0 0,9

Bảng 7.18. Hàm lượng vitamin trong tê'bào Pseudomonas 5401 sinh khối
trên môi trường cacbua hydro

Thành phần vitamin Khối lượng, (ig/g

Thiamin (Clohydrat) 2,88
Riboflavin 10,50
Niaxìn 180
Pantotennat canxi 7,0
Pyridoxin 1,6

c) Vi khuẩn sử dụng metan (Methylobacterỉa)

Metan là nguồn nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền, không gây độc trực tiếp.
Khả năng ít hoà tan trong nước cho phép dễ dàng thu hồi khi vi sinh vật
không sử dụng hết nguồn cacbon này.
Vi khuẩn sử dụng metan có rất nhiều trong đất, nước, bùn và ỏ ngoài

243
biển. Chúng là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, có chứa
catalaza và oxydaza, đều là loại dinh dưỡng vô cơ, có 5 giông (bảng 7.19).
Loài hay gặp nhất khi phân lập trong tự nhiên là Methylomonas
methanica, có khuẩn lạc màu hồng. Phân lập loài này rấ t khó, cần nuôi
trên môi trường khoáng lỏng, rồi phân lập trên môi trường thạch có
thành phần như sau:
Bảng 7.19. Phân loại vi khuẩn sử dụng metan
Giông Hình dạng Tính chuyển dộng Bao nhẩy
Methylosinus Hình que hay quả lê + +
Methylocycis Hình que, hình phẩy - -
Methylomonas Que cố bao nhẩy -/+ -
Methylobacter Que hoặc cầu - -
Methylococcus Hình cầu - -

Bảng 7.20. Thành phần môi trưởng phân iập và lên men vi khuẩn
M ethylom onas m ethanica

T hành phẩn Môi trường phân lập Môi trư òng lên men
(g/1) m
KH2PO, 1,60 0,67
Na2HP04 11,6 0,22
NaNOs 1,18 9,55
M gS04.7H20 0,080 0,32
FeS0„.7H20 0,014 0,029
Ca(N 03)2.4H20 0,075 0,18
C uS 0 4.5H?0 0,004 9,1 X 10“3
Z nS04.7H20 3 ,4 x 1 0 -* 1,1 X 1 0 -3
MnSO^.HjO 3 ,0 x 1 0 - “ 1,5 X 10"3
Na?Mo 0 4.2H20 2 ,4 x 1 0 - “ 6,4 X 1 0 '4
C oCI2,6H20 - 4,5 X 1Q 'S
H2S 0 4<36N) - 2,7ml

Nuôi sinh khôi sẽ đạt được tốt nhất khi sử dụng hỗn hợp khí thích
hợp: metan (10 - 98%), oxy (20 - 45%) và C 02 (0 - 20%).
Tuy nhiên có thể có một số loại vi khuẩn gây nhiễm cũng phát triển
trên môi trường cacbua hydro. Đối với một Bố chủng thì metanol có thể
gây độc ồ nồng độ thấp (0,1%). Muối amon và mum nitrat là nguồn nitơ
tốt cho các vi khuẩn nhóm sử dụng metan. pH tối thích 6,8, giới hạn là
5,8 —7,4. Nhiệt độ tối thích chủ yếu đôi với các chủng là 15 —35°c, tuy
244
nhiên có các chủng ưa nhiệt 45 —55°c sẽ cho hiệu suất cao hơn cả. Sự
oxy hoá metan diễn ra như sau:
CH,-> CHaOH -> HCHO -» HCOOH -> C 02
Trong công nghiệp, các chủng vi khuẩn được sử dụng là loài thuộc
giông Methyỉobacterium.
Bảng 7.21. Lên men liên tục của Methyỉobacteríum
Lượng khí đã
Tốc dộ Mật độ Lượng CH4
đồng hoá
pha loãng sinh khối Y[CHJ Y[o 2] chuyển hoá vào
(ml/phút/lít)
(g iở -1) (g/1) t ế bào và tạo COj
CH« o,
0,220 6,83 0,618 0,221 81,0 99,7 0,788
0,154 11,74 0,592 0,197 97,7 132,3 0,837
0,100 1,61 0,641 0,214 26,7 8,53 0,328

Bảng 7.22. Nhu cẩu oxy và nhiệt lượng phân giải trong trưdng hợp vi khuẩn
được nuôi liên tục từ các nguồn cacbon khác nhau (Hiệu suất thu được đều
đạt trong mọi trưởng hợp ỉả 3,5g tế bào/l/giở)
Nguồn Hiệu su ất Hiệu suất Nhu cẩu oxy Nhiệt lượng toả ra
cacbon (g tê bào/g cơ chất) (gtê'bào/g02) (mmol/l/gỉờ) (kcal/l/giờ)
Glucoza 0,5 2,1 53 6,4
Metanol 0,5 0,7 150 18,4
Metan 0,6 0,2 560 67,0
n - alkan 1,0 0,5 210 25,0

Bảng 7.23. Thành phẩn amino axit của protein vi khuẩn Pseudomonas
từ khí metan và metanol

Amino axit Chủng TM20 từ metanol Chủng M45 từ m etan

Xystin 0,32 0,35
Histidin 1,73 1,6
Lyzin 5,30 4,3
lzolơxin 3,90 5,0
Lơxin 6,96 7,9
Methionin 1,81 3,0
Phenylalanin 4,18 5,2
Valin 5,85 6,2
Tryptophan - 2,7
Tyrozin 2,91 3,8
Treonin 4,52 4,9

245
 Ngoài các chủng thuộc loài Methylobacteria, có nhiều chủng vi khuẩn
như Pseudomonas và cả nấm men có khả năng sử dụng metanoỉ.
Từ số liệu ỏ bảng 7.22 cho thấy, metanol có nhiều ưu thế, cần ít oxy
và toả ít nhiệt lượng hơn. Thành phần amino axit của các vi khuẩn sinh
khôi trên nguồn cacbua hydro cũng không thua kém so với các nguồn cơ
chất khác (bảng 7.23).
7.2.2. Nấm sợi
Trong suốt Chiến tranh thế giới thứ II, các chủng Fusarium và
Rhizopus đã được nuôi cấy trong các thiết bị lên men để dùng làm thực
phẩm protein. Sau này, rấ t nhiều thí nghiệm đã được tiến hành, chủ yếu
ở Anh (Viện Rowett Research Institute, trung tâm nghiên cứu Lord
Rank Research Center). Xenluloza, nguồn c và năng lượng dồi dào, lại
không đắt, đã được dùng cùng các canh trứòng hỗn hợp liên kết, hoặc
dùng nguồn xenluloza cũng tốt (Trichoderma virỉde). Nhưng đây là
những nấm men phân giải tinh bột, chúng đưa ra những vật thể nghiên
cứu sâu hơn. Trên thực tế, đại mạch —thức ăn cơ bản của lợn, chứa 10%
protein, trong khi nhu cầu của lợn non cần khẩu phần chứa 14 - 20%
protein. Để tránh đắt, đỡ tốn kém với protein động vật hay thực vật
nhập khẩu (bột cá và đậu tương), và cũng để bổ sung những thiếu hụt
lyzin trong đại mạch, các nhà nghiên cứu Anh đã có ý tưỏng dùng đại
mạch có chứa nitơ vô cơ ìàm môi trường cho phép nấm men sợi sinh sản.
Những môi trường này chuyển hoá tinh bột thành protein và cũng dùng
để bổ sung nitơ khẩu phần cơ sỏ là đại mạch. Trên thực tế, các hạt được
nghiển, trộn vói nước, thêm nitơ ở dạng ure hoặc (NH^aSO,,, và người ta
axit hoá môi trường để ngăn cản vi khuẩn tăng trưỏng. Việc lựa chọn
các chủng nấm được quyết định bằng việc ngưòi N hật tiêu thụ gia vị từ
đậu tương lên men bởi một chủng Aspergillus oryzae, hay người
Indonesia chuẩn bị món miso từ một chủng Rhizopus arrihizus. Do đó,
ta hiểu rằng, những chủng nấm sợi trên không gây ra độc tố.
Các nấm phân giải tinh bột thuỷ phân tinh bột thành glucoza tổng
hợp các protein ngay sau thuỷ phân, Hiệu suất chuyển hoá tinh bột
thành protein đạt 23% (Rhizopus) hoặc 40% (Aspergillus). Tỷ lệ sinh
trưởng phụ thuộc vào hàm lượng tinh bột trong môi trường và vào bản
chất nguồn đinh dưỡng nitơ.
Chủng tôi ưu là Aspergillus oryzae được nuôi cấy ở 30°c trong 34
giò, tạo ra 10,5g/l thể sợi nấm (khuẩn ty thể) chứa 45% protein. Không

246
cần phải tiệt trùng môi trường, ta trộn nó lên với đại mạch để chuẩn bị
khẩu phần mà lợn rấ t thích ăn. Hàm lượng các amino axit thiết yếu
được đưa ra ở bảng 7.24.
Vối những liên quan đến thực phẩm cho người, các kết quả thú vị đã
thu được từ chủng Fusarium gồm các protein chất lượng tốt.
Bảng 7.24. Hàm lượng amino axit thiết yấu trong nấm (%)
Amino axit Rhlzopus A spergillus Đại mạch Khẩu phần
thiết yếu arrhizus oryzae cân bằng lợn
Lyzin 6,2 7,1 4,1 5.5
Methionin,
3,8 3,1 3,6 3,5
Xystein
Treonin 4,0 4,3 3,6 2,5
Izotoxin 3,9 4,5 3,4 3,5
Lơxin 5,9 7,2 6,8 3,5
Valin 4,8 5,2 5,1 2,5
.Xytozin, Phenylalanin 6,5 6,2 8,4 2,5
Tryptophan 1,2 1,0 1.0 0,75
H istid in 2,4 2,1 2,1 1.0
Tổng các amino axií
36,7 41,2 38,0 25,3
thiết yếu

7.2.3. Tảo
Rất nhiều nhà nghiên cứu thích tảo vì chúng sử dụng năng lượng
Mặt trời, khí C 0 2 làm nguồn c . Lượng C02 trong khí thì không đủ để cho
hiệu suất cao, ngoài ra trong điều kiện dị dưdng ỏ môi trường thạch -
hiệu suất 30 - 40g/l cho chủng Chloroỉla pyrenoỉdosa, ta cũng vẫn phải
thêm C 02 vào dưới dạng khí đốt, cho vào dung dịch vô cơ. pH của môi
trưòng phải phụ thuộc vào khoảng kiềm (8,5 - 11) để nhận được H C03~ và
lúc đó hàm lượng C 02 không phụ thuộc vào áp suất riêng phần.
Trong những điều kiện trên, khi quang hợp, việc dùng phân tử C 02
ứng với việc m ất đi 1 ion H C03“ và tạo ra 1 ion OH theo phản ứng:
H C 03-+ 2H20 -> (CH20) + OH + C 02
pH tăng nhưng COjj thêm vào lại tạo lại H C03~
OH"+ C 02 -> HCO-f

247
 Hiệu suất chuyển hoá năng lượng ánh sáng tổi đa là 4%, điều này
cho phép có 3g tảo/kWgiờ. Cần thiết phải tính đến vấn để kinh tế trong
việc dùng năng lượng Mặt trời. Vì sự thâm nhập của ánh sáng vào một
chậu nước bị giâi hạn do nước bị đục (do sự phát triển của tảo), nên độ
sâu của chậu nước không được vượt quá 20 đến 30cm. Trong điều kiện
đó, ta thu được lượng sinh khối nhỏ. Để có lg/1 theo khôi lượng khô cần
0,4gC; 0,lgN; 0,01gp. Những nguyên tố này được đưa vào ở dạng muối
vô cơ. Trên thực tế, nếu canh trường quá dày đặc, ánh sáng thâm nhập
kém, tổn thất m ất mát do hiện tượng hô hấp tăng quá cao. Việc khuấy
trộn là cần thiết, nếu không các tế bào sẽ chìm xuống đáy, ở đó thiếu
ánh sáng, trong khi những tế bào ở bề mặt lại có nguy cơ bị khô. Nhiệt
độ phải giữ trong 25 - 30°c tuỳ chủng tảo. Trong chu kỳ công nghiệp,
các canh trường không trong điểu kiện vô trùng, và do vậy luôn có
nguyên sinh động vật lớn lên trong tảo. cần phải có những chậu mỏ để
tránh chi phí làm lạnh, nhất là mùa hèf lúc đó cần tạo các canh trường
trong những vùng có điểu kiện khí hậu (nhiệt độ, chiếu sáng) thích hợp.
Để kiểm soát sự biến thiên nhiệt độ theo mùa, người ta khuyên nên lựa
chọn loại tảo mà sự kê tiếp loài cho phép có nhiệt độ tôi ưu sinh trưởng
phù hợp từng mùa (bảng 7.25).
Việc thu gặt tảo đơn bào khá tốn kém, vì sinh khối này rất loãng, ta
phải quay ly tâm hoặc cho kết bông. Tuy nhiên trong những điều kiện
đặc biệt, khi đã để qua nhiều ngày nóng, hiện tượng tự kết bông sẽ diễn
ra vào các buổi chiều khi nhiệt độ và pH tăng đồng thòi (dẫn tới sự tiêu
thụ đáng kể khí COa). Khi đó, ta loại dung dịch dinh dưỡng nổi lên trên
bề mặt chậu, trong khi tảo tự kết bông được gạn lọc sang một chậu khác.
Dù sao, tảo thu được vẫn phải được loại nước (bằng phương pháp lọc), rồi
sấy khô. Phương pháp kinh tế nhất nhằm ồ việc sấy trên giưòng cát.
Trong trường hợp này, cần dự phòng một công đoạn xử lý phụ thêm
trước khi đem tiêu thụ nhằm có được một sản phẩm không nhiễm mầm
gây bệnh. Trên thực tế, vì việc kết bông tạo ra sản phẩm chứa tác nhân
kết bông, mà sự tự kết bông lại phụ thuộc vào điều kiện bên ngoài và do
quay ly tâm thì tôn kém, nên ngưòi ta đưa đến việc cấy tảo sdi
(jSpirulina, spirogyra, Vaueheria, Porphyra, Hormidium, Stigeoclonium,
Uronema), là những loài đễ thu hối bằng cách cào đơn giản. Việc lưu
thông các chất dinh dưổng qua một canh trường chứa những tầo trên có
thể diễn ra đơn giản nhờ lực hấp dẫn - trọng lực.

248
 Bảng 7.25. Nhiệt độ sinh trưởng tôi ưu và hiệu suất của các (oải tảo
Loài Nhiệt độ tối ưu {°C} kg protein/ha/năm
Chlorella pyrenoidosa 25 15.700
Tpirulina maxima 27 24.300
Chlamydomonas mundana 33 41.500
Anacystis nidulans 41 59.200

Những thử nghiệm dinh dưỡng protein tảo đã được tiến hành ở
nhiều nước, vì tảo chứa 50% protein, chỉ thiếu lyzin và luôn thiếu amino
axit chứa s. Tảo không có nhiều vitamin nhóm B. Con ngưòi dường như
có thổ tiêu thụ 30 đến 40g/ngày mà không bị ảnh hưởng (100g/l mẫu
thử thực phẩm người được thực hiện ở Nga). Trường hỢp những cư dân
vùng rìa sông Tchad, họ ăn Spiruỉina sấy khô nhờ Mặt trời từ thời tiền
sử. Nhưng khả năng tiêu hoá không cao và người dùng phàn nàn là
không ngon. Trên thực tế, một phần các protein ở dạng enzym được gắn
vào lipit thành phức phospho tổng hợp chứa sắc tô" diệp lục và chất
carotenoit, vì vậy thuỷ phân lipit cũng như oxy hoá axit béo gây ra
những vị khó chịu. Với động vật, các kết quả nhận được không làm thoả
mãn (với tảo Spirulina). Khả năng tiêu hoá kém có vẻ liên quan tới sự
tồn tại của thành tế bào (20% khối lượng khô), của thành phần phức
(xenluloza và hemixenluloza), làm cứng nhắc enzym, dẫn tới việc chiết
tách nhằm cải thiện là khá tôn kém (bảng 7.26).

Bảng 7.26. Giá trị dinh dưỡng của tảo

Scanedesm us obliquus Khả năng tiêu hoá (D%) ả ch u ộ t

T ế b à o n g u y ê n vẹn ban đầu 1 1 ,1 -3 3 ,4

T ế b à o s ấ y kh ô 7 0 -7 5

P ro te in ch iế t 85,6 - 87 ,4

Tuy nhiên nếu khả năng tiêu hoá hỗn hợp Chỉoreỉla và Scenedesmus
là 54% ỏ lợn, thì ở bò tăng lên 73%. Vì vậy ngưòi ta nghĩ cưng cấp thực
phẩm cho loài nhai lại, có thể phân huỷ thành tê bào, cách này cũng
đươc sử dụng cho những môi tntòng hình thành từ sự cung câp nhân tạo
(bảng 7.27).

249
Bảng 7.27. So sánh sức sản xuất các tảo dùng làm nguổn cung cấp nhân tạo

Hiệu su ấỉ protein Nhiệt độ sinh Protein thịt bò

Nguổn protein
(kg/ha/năm) trưỏng tối ưu (kg/ha/năm)

Cơ chất tự nhiên 670 - 60

Spirulina ptatensis 24.300 27°c 2.180

Chlorella pyrenmoidoza - - -
Nguồn chùng TX7 - 11 - 05 44.700 30°c 4.030

7.3. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TẢO

Một trong những con đường khắc phục sự thiếu h ụ t protein trên thế
giới là sản xuất tảo. Các loại tảo được tập trung sản xuất là tảo xanh
Chlorella và tảo lục Spirulina. Tảo không những giàu thành phần
protein mà còn chứa nhiều thành phần khoáng chất và vitamin. Công
nghệ sản xuất tảo phát triển ỏ Pháp, Đức, Ý, Mêhicô, Ấn Độ, Ai Cập,
Nhật Bẳn, Thái Lan, Đài Loan. Tảo được sản xuất phổ biến dùng làm
thực phẩm, làm thuốc chữa bệnh hoặc thức ăn chăn nuôi.
Tảo spirulina là loài vi tảo quang hợp, sông trong những hồ nước
giàu N aH C 03 ỏ vùng nhiều ánh sáng. Chúng có cấu tạo dạng sợi đa bào
dạng xoắn lò xo, không độc đổi với người và động vật. Tảo Spiruỉỉna gồm
chủ yếu 2 loài chủ yếu: s. platensỉs và s. maxima (hay Arthrospira
pỉatensis và Arthrospira maxima).
Hai loài đã nuôi cấy thực tế là Arthrospira pỉatensis và Arthrospira
maxima và trong khi những giống Arthrospira có hình xoắn và phân bô"
ở một sô nơi như Spiruỉỉna nhưng Arthrospỉra hoàn toàn khác về gen so
với Spirulỉna.
Tuy nhiên, tên loài Arthrospira vẫn được công nhận cho cả 2 loài
A. maxima và A. pỉatensis và cũng tiếp tục mang tên truyển thông là
Spirulina platensis và s. maxima.
Tảo Spiruỉina từ lâu được biết đến là nguồn giàu protein (đến 70%
khôi lượng chất khô) và chứa đầy đủ thành phần amino axit cần thiêt.
So với các nguồn cung cấp protein khác thì Spỉruỉina cho khả nảng cung
(•ấp vượt trội (bảng 7.28).
Về m ặt kỹ thuật, tế bào tảo Spỉrulina dễ được phá vỡ để tách
protein. Tảo xoári Spirulina có thể nuôi trồng ở hệ thống mở hoặc hệ
250
thông đóng kín, với dây chuyền liên tục (dạng trong ống), hoặc trong
nhà có mái che để điều chỉnh được điều kiện nuôi trồng (nhiệt độ, ánh
sáng). Trong môi trường nuôi trồng tảo cần có NaHC03 và nguồn cung
cấp ni tơ. Hàm lượng tôì thiểu đối vói NaHCOa là 0,2M và đô'i với KN03
là 0,001%.

Bảng 7.28. sản lượng protein của một số nguồn cung cấp protein
Sản lượng Hàm lượng Sàn lượng protein
Nguồn cung cấp
(tấn/ha/năm) protein (%) (tấn/ha/nãm)
Lúa mỳ 6,7 9,5 0,64
Ngô 14 7,4 1,04
Gạo 8 7,1 0,75
Đậu tương 4 35 1,4
spirulina platensis 6 0 -7 0 65 3 9 -4 5
Spirulina maxima 40 70 28

Bảng 7.29. Các cơ sở sàn xuất tảo trên thê' giới và sản lượng
Diện tích Sản lượng khô
Công ty Địa điểm Dạng bể Loài tảo
10*111* {tấn/năm)

Sữda - Hồ Texcoco, Bản tự nhiên 120 S. maxima 330

Texcoco Mèhicô
Proteus Calipatrìa, Mỹ Nhản tạo hở 50 s. platensis 130

Spirutec Chandler, Mỹ Nhãn tạo hỗ 20 s. platensis 5 0 -6 0

Tảo xiêm Đăng cốc Nhân tạo hỏ 18 s. platensis 60 - 100
Chlorella lục Đài Loan Nhân tạo hở 30 s. platensis 5 0 -6 0
Nippon Miyako, Nhật Bản Nhân tạo hỗ 13,5 s. platensis 1 0 -4 0
Xi nghiệp Thuận Hải Nhân tạo hỏ 2,1 s. platensis 3 -4
Vĩnh Hắo
China 50 s. platensis 100
Spirulina

Spìrulina Hawaii Bể 80 s. platensis 350

Pacifica Nước biển

Spiruỉina có nhiều ưu thế hơn tảo Chỉorella, vì loại tảo Spirưlina có

pH tốỉ thích từ 8,5 - 9,5 nên có thể giữ được nhiều C02 trong môi trường
có tính kiềm, và do vậy có điều kiện để thực hiện phản ứng quang hợp
tốt hơn các loại tảo chĩ thích hợp ở môi trường trung tính và kiềm nhẹ.
251
 sả n lượng Spirulina có thể đạt được 40kg/ha/năm (tảo khô). Vì tảo
Spirulịna có kích thước lớn dạng sợi đa bào nên có thể dễ dàng tách sinh
khối tảo bằng phương pháp lọc thường.
Tảo Spirulina có thành phần: 60 —68% protein. Thành phần các
vitamin như sau (mg/100g): p —caroten: 300 —600; riboflavin: 4 —6,6;
cobalamin: 0,1 - 0,18.
7.3.1. Đ ặc đ iểm hỉnh th á i và cấu tạo của tảo S p iru lin a

Loài s. platensis thuộc chi Spirulina, họ Oscillatoriaceae, bộ

Oscillatoriales, lớp Cyanophycea (Cyanobacteria: vi khuẩn lam), ngành
Cyanophyta —tảo lam (Cyanochlorophyta)
a) P h ả n bố: Spirulina phân bô' nhiều ở các vùng Bắc và Nam Phi;
Bắc và Nam Mỹ; miền Nam và Trung Á; vùng Đông Âu. Đặc biệt loại
tảo này phân bô' rộng rãi ở vùng nước giàu kiềm. Các nước có nhiều tảo
lự nhiên là Kênya, Xuđăng, Etiopia, Sat, Mêhicô.
b) H ìn h th ái: Spirulina platensis có dạng lò xo xoắn 5 —7 vòng đều
nhau. Trong tự nhiên có thể duỗi thẳng. Sợi không phân nhánh, không
có bao, phân chia thành các tế bào có vách ngăn ngang. Chiều dài
0,‘25mm hoặc dài hơn. Có khi vận động kiểu trượt, 5|im/s. Sinh sản vô
tính, phân cắt sợi.
c) ư u diêm : (1) Không có vỏ cứng nên dộng vật dễ tiêu hoá và
thuận lợi cho việc sấy; (2) Dài cho nên dễ vớt, dễ lọc.
Sọạtởnm

ft #
í /

Sợi tảo Spirulina Tế bào tảo Scenedesmus Tế bào tảo Chlorella

Hinh 7.3. Hỉnh ảnh m ột số loại tảo

d) Cấu tao
Theo nghiên cứu của Hendeskog. G và Hofsten A.v (1980), mỗi tế
bào sợi tảo rộng 0,5|am, dài 2|.im, không có lục lạp mà thay vào đó là các
tylacoit.

252
 - ỏ các tế bào già có các hạt xyanophyxin (đưòng kính 0,5|.im) phân
bô' trong chất nguyên sinh và là nơi xảy ra hô hấp.
—Trung tâm tê bào có các hạt volutin (polyphosphat) được các tylacoit
bao quanh.
- Tế bào tảo lam chưa có nhân điển hình, vùng nhân không rõ, chứa
ADN.
—Không có không bào, nhưng có không bào khí.
7.3.2. Đ ặc đ iểm sin h lý của tảo S p iru lin a

a) D in h dưỡng cacbon và q u a n g hợp

Spirulina thuộc ngành Vi khuẩn lam, chưa có nhân điển hình nên bộ
máy quang hợp (lục lạp) chưa hoàn chỉnh, phân tán trong toàn bộ tế bào.
Trong hồ tự nhiên, môi trường kiềm có pH = 9 ,5 -1 1 , nồng độ muối
cao, ion H C 0 3 ~lớn: 8,5 —200g/l, Spỉrulina ưa sống trong môi trường có
nhiều Na+, K+, có ít Ca2+, Mg2+ hoặc không có.
Trong nưóc, cacbon khoáng có nhiều dạng C02, H2C03, HCO3-, o c ^ .
Sự cân bằng giữa các dạng này thay đổi tuỳ theo pH môi trường.
Điều kiện nuôi tảo Spirulina: môi trường kiềm có sục khí C0 2 1 - 2%
dể cung cấp bổ sung cacbon, đồng thời duy trì pH 8,5 - 11.

Bảng 7.30. Ảnh hưởng của nồng độ NaHCOjden năng suất

và hàm lượng protein trong tảo s . platensis (có sục C 02 1 - 2%)

N ống độ H à m lư ợ n g c h ấ t k h ô (g /l) H à m lư ợ n g c h ấ t k h ô ,
N a H C O ](g /l) (% N~6,25)
Ban dầu K ế t th ú c

1,2 0,3 1,22 56 ,9 3

2,2 0,3 1,18 55 ,4 3

3,4 0,3 1,26 57 ,27

4,2 0,3 1,28 57 ,6 5

8,4 0,3 1,34 58,71

16,8 0,3 1,28 5 6 ,4 8

Sự đồng hoá cacbon ở dạng vô cơ HCCVlà dạng đồng hoá tự dưỡng

(autotrophic) thông qua quá trình quang hợp (photosynthetic). Nhiều
loài khác như Chlorella, Scenedestnus còn có khả năng đồng hoá nguồn
hữu cơ từ môi trường ngoài để tổng hợp hữu cơ cho cơ thể, tức là có khả
năng dị dưỡng (heterotrophic). Loài tảo vừa có khả năng dị dưỡng, vừa
có khả năng tự dưỡng gọi là dạng tạp dưỡng.
253
 Một sô' thí nghiệm cho thấy: Nếu nồng độ glucoza đến 2%, làm tăng
trưởng, khi có m ật độ tảo ở ngưỡng nhất định; và sẽ có quá trình tự
phân khi m ật độ tảo thấp dưới ngưỡng.
Quang hợp là ’quá trình quyết định năng suất. Cưồng độ ánh sáng
bão hoà đối với tảo: 45klux (Nguyễn Hữu Thước). Hoạt tính quang hợp
mạnh nhất ở cường độ 25 —30klux.
b) Ả n h h ư ở n g của n h iệ t độ và p H
Là thực vật ưa nhiệt. Nhiệt độ tăng, cưòng độ quang hợp tăng, đạt
cực đại 37,5 - 38,5°c. ở nhiệt độ 44°c, sau 6 - 9 giờ, tảo chết.
Tảo có pH tôi thích trong khoảng pH = 8,5 - 9. Khi pH kiểm nhẹ
(pH = 7 - 8) thì tôc độ phát triển của tảo giảm rõ rệt. Và ở pH 11,5 thì
tảo không có khả năng quang hdp.
c) D in h d ư ỡ ng n ỉtơ và kh o ả n g
—Nitơ:
Nitơ quan trọng vì chiếm 10 % khôi lượng khô của tảo Spirulina.
Thiếu nitơ dẫn đến giảm năng suất, giảm hàm lượng protein. Hàm
lượng nitơ tối thiểu cần thiết cho tảo là 30mgN/l.
Trong môi trường thiếu nitđ, hàm lượng protein của tảo và
phycoxyanin giảm nhưng phycoxyanin giảm nhanh hơn.
Dạng nitơ thích hợp nhất nuôi tảo là muối nitrat. Ure và lượng
sulphat amon có thể dùng với lượng sao cho hàm lượng nitơ trong môi
trường nhỏ hơn hoặc bằng lOOmg/1.
—P h o sp h o :

Khi không có phospho, tảo bị giãn vòng xoắn, tảo trồ nên vàng. Ở nồng
độ p nhỏ hơn 10mg/l thì không ảnh hưỏng. Ở nồng độ 360mg/l - hàm lượng
protein cao nhất, còn ồ nồng độ 90 - 180mg/l - năng suất tôì đa.
Như vậy, tảo có khả năng sinh trưỏng trong nồng độ phospho rộng
(> 200 mg/l), nhưng để đảm bảo quá trình sống chúng cần hàm lượng
p > 40mg/l, còn nếu thiếu phospho trong 10 ngày sẽ làm giảm hàm lượng
protein.
- Kali:
Khi có kali, vòng xoắn giãn ra, tảo bị vàng.
Thiếu kali, sau 2 ngày thì xuất hiện những biểu hiện nói trên. Hàm
lượng K 5g/l (KC1 10g/l) làm giảm sinh trưởng của tảo một ít.
- N atri và canxi:
Na cần cho sinh trưởng của tảo Spỉruỉỉna, nồng độ cao không gây

254
độc (đen 18g/l). Tỷ lệ K/Na <5/1, nếu lớn hơn, tảo chậm sinh trưởng, cao
hơn nữa thì phá câu trúc của tảo. Nếu thiếu canxi không có biểu hiện cụ
thể về hình thái.
- Các nguyên tô"khác:
Neu thieu magiê thì giông như thiếu phospho, tảo bị giãn vòng
xoắn. Thiêu clo, bộ xoắn của tảo bị chặt lại và cấu trúc bị phá huỷ. Nồng
độ clo cao không gây độc cho tảo.
Sắt là nguyên tô" cần thiết không thể thay thế được. Thiếu Fe không
những ảnh hưởng đến sinh trưỏng mà còn ảnh hưởng đến hàm lượng
protein trong tảo. Fe ò dạng chelat: Fe hữu cd kết hợp của muối Fe và
EDTA (etylen diamin tetraaxetic) thích hợp vì dạng này ít bị kết tủa
trong môi trưòng kiềm. Tuy nhiên có thể dùng muối vô cơ (FeS04,
Fe(S04)3) nhưng cần bổ sung đương lượng nhỏ.
Các nguyên tố vi lượng: Zn, Cu, Mn, B, ảnh hưỏng không rõ đến
sinh trưởng của tảo Spỉruỉina.
7.3.3. Ưu điểm của tảo spirulina
Hiện nay có các loại tảo được nuôi trồng phổ biến là spirulina,
Chlorella và Scenedesmus. Nhưng tảo Spiruỉina được nuôi trồng nhiều
hơn do nó có nhiều ưu việt hơn:
- Hàm lượng protein trong tảo spirulina đạt 60 - 70%, trong khi
tảo Chỉorella chỉ đạt 40 - 50%.
- Tôc độ sinh trưỏng cao, vòng đòi đơn giản, chỉ 3 - 5 ngày.
- Tảo Spiruỉỉna có hình sợi, dạng lò xo xoắn, kích thưốc lớn
(0,2 - 0 ,5 mm), nổi lên bề mặt nước nên kỹ thuật thu hoạch đơn giản,
trong khi đó tảo Chlorella có kích thước nhỏ hơn (0,000lmm) nên khi
thu hoạch phức tạp hơn, cần ly tâm tốc độ lớn.
- Tảo Spỉruỉina có thành tế bào mỏng, trong khi tảo Chlorella có
thành tế bào dày nên hệ sô" tiêu hoá cao hơn.
- Spirulỉna sinh trưỏng trong môi trưòng kiềm, còn Chlorella - môi
trường pH trung tính. Nếu dùng C 0 2 làm nguồn cacbon nuôi tảo thì hệ sô'
hấp thú C 02của môi trường kiềm cao hơn môi trưòng trung tính nhiều.
- Hiệu suất sử dụng năng lượng Mặt trời cao: 3 - 4,5% (lúa: 0,25%).
- Hệ sổ sử dụng cacbon (50 —85%), tảo Chỉoreỉla: 30%.
7.3.4. Giá trị dinh dưõng của tảo
Hàm lượng protein trong tảo rất cao, cao hơn bất cứ loại thức ăn nào
khác (55 - 71% khối lượng chất khô, có đầy đủ các amino axit không thay

255
thế), giàu vitamin A, D, E và các vitamin nhóm B, đặc biệt là vitamin B12,
các nguyên tô" khoáng ở dạng dễ hấp thụ, các sắc tố như p - caroten,
chlorophyll a và b, các axit béo chưa no: linoleic và 7 - linoleic,...
Bảng 7.31. Thành phẩn hoá học của một sấ loại tảo và đậu tương
(tính theo phẩn trăm chất khô) (Phang, 1992)

Loai tảo Protein Li pit Hydratcacbon C hất khoáng

Chlorella vulgaris 5 1 -5 8 1 4 -2 2 1 2 -1 7 5 -1 0
c. pyrenoidsa 57 2 26 5 -1 0
Scenedesmus obliquas 5 0 -5 6 1 2 -1 4 1 0 -1 7 8 -1 2
s. quaơrícauda 47 2 1 0 -1 5 8 -1 2
Spirulina plaíensis 4 6 -5 0 4 -9 8 -1 4 5 -1 0
S. maxima 6 0 -7 1 6 -7 1 3 -1 6 5 -1 0
Đậu tương 3 6 -4 0 1 5 -2 0 2 0 -3 6 5 -1 0

Tảo giàu vitamin B 12 hơn bất ký sản phẩm có nguồn gốc động, thực
vật nào. So với gan bò, hàm lượng vitamin BJ2cao gấp 2 - 6 lần.
Hàm lượng vitamin B 12 (mg/100 g nguyên liệu) như sau:
Spirulina 160 Phomat 1,0
Chỉorelỉa 40 Sữa 0,42
Scenedesmus 40 Trứng 2,0
Nấm men 2,0 Sữa chua 0,11
Gan bò 80,0 Cá hộp 2,2
7.3.5. ửng dụng của tảo
a) Tảo S piru lin a là thức ăn g ià u dinh dưởng có tác dung
chửa bệnh
Tảo spirulina dùng cho trẻ suy dinh dưỡng.
Ngoài làm thức ốn giàu dinh dưỡng, tảo Spirulina còn dược sử
dụng để chữa bệnh:
- Đái tháo đường: sau 30 —60 ngày dùng tảo Spirulina, tình trạng
trở lại bình thường.
- Viêm gan và xơ gan: Dùng cho ngưòi sau mổ và bị hoại gan, bảo vệ
gan khỏi bị đầu độc của rượu.
- Viêm tuỵ: Do có protein chất lượng cao, cân bằng, dễ dồng hoá (21
vièn/ngày, 5 - 8 tuần phục hồi).
- Phục hồi thị lực và mắt.
- Loét và sa dạ dày.

256
 - Rụng tóc.
- Hạn chế tăng cân và thừa md.
b) Tảo s p ir u ỉin a ỉà loại thức ăn tối cho người không có bệnh
Các loại thức ăn được chế biến từ tảo Spìruỉina (Durad - Chastel H.
và Santillan Sauchez c, 1975): Nước scít Spiruỉina, bánh mỳ trắng và
bánh ngọt (Nestle); thịt băm, sữa chua (Dijon); Bột sữa, sôcôla, rượu bia,
kem caramen, mứt nhừ. Bột mỳ, bột ngũ cốc, kẹo tấm, nước mật hoa quả.
Vận động viên sủ dụng 20 - 40g tảo/ ngày.
c) Tảo S p iru lin a là thức ăn g ià u dinh dưỡng cho động vậ t
Đốì với lợn: Dùng 12 % tảo Spỉruỉỉna vào khẩu phồn thức ăn sẽ tăng
khối ìượng lên 18,5% sau 2 tháng 80 vớì đối chững.
Trong chăn nuôi gà: Tăng màu sẵc đỏ của lòng đỏ trứng, vitamin A
tăng 1,5 - 2,5 lần. Lượng dùng Spirulina 1%, sau 6 tháng: kết quả
nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sông tăng 3%, số lượng trứng tăng 15 - 18%,
khối lượng 8 —10 %.
Tảo Spirulina là nguồn chất kích thích sinh học, đã làm tăng trọng
lượng, tăng tỷ lệ sống, làm tốt thành phần sinh hoá của gan, máu và
trứng gà.
Cho đến nay Spiruỉina được sử dụng dưới dạng khô, không khử màu.
Có thể dùng dung môi để loại bỏ sắc tô, đổ gây cảm giác hấp dẫn hơn.
7.3.6. Các phương pháp nuôi trồng tảo
Các phương pháp phổ bỉến là nuôi trong hổ tự nhíên hoặc hệ thống
bể nhân tạo. Trong các loại bể nhân tạo có thê là: Hệ thông bể kín, hệ
thống bể mở và hệ thống nuôi tảo dạng ổng.

Hình 7.4. Hệ thống b ể kín (bên trái) và hậ thống bề mở (bên phải)

257
 a) H ệ th ố n g b ể k ín
- Vật liệu được sử dụng là các màng polyethylen trong suốt với
chiều dày khoảng 0,3mm.
- Giữ nhiệt tốt.
- Giảm cường độ bức xạ.
- Chi phí tăng 15%.
b) Hệ th ố n g b ể m ở
Hệ thông bể dài, nông hoặc bể hình tròn, có guồng quay khuấy trộn
không khí. Thưòng có 2 loại: ( 1) Bể với các đường chảy làm bằng bêtông
vào (2) Đường hầm bằng đất được lót bằng nhựa PVC.
Diện tích 0,1 đến 0,5 hecta, độ sâu từ 15 đến 18cm.
Guồng quay loại lổn có D = 2 m, 10 vòng/phút hoặc
D = ũ,7m, 20 - 30 vòng/phút.
Dùng bơm để tạo dòng chảy trong bể thay cho guồng quay.
Nuôi tảo trong ống ngày nay dược tiến hành ỏ một số nước trên thê
giới như Đức, Mỹ. Hệ thống ông có thể làm bằng nhựa hoặc bằng thủy
tinh, đưồng kính 7 — 10cm. Bằng các hệ thông này vừa đảm bảo điểu
chỉnh được nhiệt độ và cưòng độ chiếu sáng, lại tiết kiệm diện tích.

Hinh 7.5. Hệ thống nuôi tảo trong ống

7.3.7. Sơ đổ công nghệ và kỹ thuật tách tế bào

Năng suất tảo phụ thuộc các yếu tô" nuôi trồng như cưòng độ chiêu
sáng, nhiệt độ, nguồn chất dinh dưỡng, hàm lượng nitơ...
Đổ xử lý tế bào có thể sử dụng nhiệt hay phương pháp cơ học. Kết
quả so sánh hiệu quả cho thấy ỏ bảng 7.32.

258
 Quá trình tách chiêt tảo được trình bày ở sơ đồ công nghệ (hình 7 .6).
Sản phẩm tảo giàu thành phần amino axit (bảng 7.28) ở dạng bột và
viên nang (hình 7.7).

Bảng 7.32. Hàm lượng các thành phẩn sau khi xử lý, % chất khô
Các phưong án xử lý Protein ARN AON
Trước khí xử lý 62,06 3,01 0,72
Sau khi xử lý nhiệt 10°c sau 10 phút 59,69 1,13 0,67
Dịch chiết protein ở 24 ± 1°c, trong 30 phút, sấy ỏ 66 1,16 0,99
105°c
Dịch chiết protein ở 24 ± 1°c, trong 30 phút, loại 75,64 1,52 1,15
chất béo bằng dung môi hữu cơ, sấy ở 105°c
Dịch chiết protein ô 3 ± 1 ° c , trong 22 giở, toại chất 82,00 1,44 1,03
béo bằng dung môi hữu cơ và sấy ở 105°c

Hình 7.6. Sơ đồ cống nghệ thu nhận dịch chiết protein từ tảo sp iru lin a
1. Thùng chứa; 2, 6, 8, 14, 16, 19 20, 24, 26, 28, 30 và 33. Bom; 3. Thiết bị lọc trống; 4,
22 và 29. Thùng chứa dịch lọc; 5. Thùng chứa nước; 7, 17, 18, 23, 25 v à 32. Thùng chứa.
9. Thùng chứa nước rửa; 10. Thùng chứa rnuoi; 11, 12. Vít tai; 13. Thiet bị nghiên; 15.
Thùng chiet; 21. Ly tâm; 27. Keo tụ; 31. Lọc chần không; 34. Thiết bị sấy phun; 35.
Xyclon; 36. Thiết bị bao gói.
A. Dịch huyền phù tảo spirulina; B. Cặn; c. Nưâc nóng

259
 Bảng 7.33. Bảng thành phần amino axit của Spirulỉna M êhicõ

Hàm lượng Hàm lượng

Amino axit Amino axit
(g/16g N) (g/16g N)
lzolơxin 5,7 Acginin 7,6
Lơxin 8.7 ~ 1 Axit aspartỉc 9,1
Lyzin 5,1 Xystein 0,9
Methionin 2,6 Axit glutamic 12,7
PhenvlaJanin 5,0 Glyxin 4,8
Threonín 5,4 Histidin 1.5
Tryptophan 1,5 Prolin 4,1
Valin 7,5 Serin 5,3
Alanin 7,9

Hình 7.7. Hình ản h tảo sả n phẩm dạng bộ t v i d ạn g viên nang

CÀU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG 7

1. Hãy định nghĩa' protein dơn bào. Protein đơn bào khác protein
thường ở đặc điểm nào?
2. Hãy trình bày các ưu điểm của quá trình sản xuất protein dơn bào.
3. Khả năng sỏ dụng các nguồn cacbon của vi sinh vật và giá trị
protein đơn bào của vi sinh vật.
4. Vì sao lại phải xử lý sinh khối tế bào vi sinh vật và loại bỏ axit
nucleic trước khi sử dụng làm thức ăn?
5. Hãy trình bày đặc điểm của protein từ một số loại vi khuẩn: Vi khuẩn
sử dụng hydro, vi khuẩn sử dụng parafin và vi khuẩn sử dụng metan.
6. Hãy chỉ rõ ý nghĩa của công nghệ sản xuất tảo.
7. Hãy trìn h bày các đặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh lý của tảo
Spiruỉỉna.
8. Hãy trình bày ưu điểm nuôi trồng và giá trị dinh dưõng của tảo.
9. Hãy trình bày các phương pháp nuôi trồng và kỹ th u ật tách tảo.
10. Vì sao lại phải quan tâm đến an toàn trong sản xuất và sử dụng
protein đơn bào?

260
 Chương 8
SẢN XUẤT NẤM MEN CHO NGƯỜI VÀ GIA s ú c

8.1. KHÁI NIỆM VỂ NẤM MEN s ử DỤNG TRONG THựC PHAM c h o

NGƯỜI, ĐỘNG VẬT VÀ TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
8.1.1. Định nghĩa vế nấm men thực phẩm
Dù được phát triển từ một loài hoặc trên một cơ chất, nấm men thực
phẩm dược định nghĩa bởi C.E.E như sau: "Nấm men thực phẩm là một
loại nấm men thuần khiết, có khả năng lên men, được làm khô.
Thành phần trung bình của một nấm men thực phẩm cho ngưòi
thưòng phải là (tính trên 100g): Độ ẩm từ 4 ~ 5%, protein (N X 6,25)
45 ~ 52%; lipit 5 ~ 9%; gluxit 27 ~ 36% và tro 7 ~ 9%".
Định nghĩa trên không đưa ra chỉ dẫn về hàm lượng amino axit,
hàm lượng vitamin và các thành phần quan trọng khác.
Những quy định về vi khuẩn học cho thực phẩm cho ngưòi như sau:
Vi sinh vật tổng sô" là 50.000 tế bào/g; Escherichia coỉi không được phép
có trong 0 ,lg mẫu xét nghiệm; Saỉmmeỉỉa không được phép có trong 25g
mẫu xét nghiệm; Staphylococcus không được phép có trong 0 ,lg mẫu xét
nghiệm; nấm mốc cho phép nhỏ hơn 100 tế bào/g. Thực tế, hàm lượng vi
khuẩn của nấm men thực phẩm nhỏ hơn các con số' này, còn vi sinh vật
hiếu khí tổng số thường từ 1.000 tới 10.000 tế bào.
8.1.2. Quy định về sử dụng nấm men trong thực phẩm cho ngưdi,
động vật và tro ng công nghiệp thực phẩm
Dù là được sử dụng trong thực phẩm cho ngưòi hay động vật, các nấm
men thực phẩm trước khi được sử dụng phải được giấy cho phép sử dụng
trên thị trường. Tài liệu này bắt buộc phải xác định loài (tên loài nấm
men) và tất cả các thành phần của nấm men. Còn nếu nó là một loài nấm
mới được sử dụng, các thử nghiệm với động vật phải được khẳng định
rằng, khi tiêu hoá nó không gây ra những rối loạn về trao đôi chât,
Theo C.E.E, danh sách nấm men thực phẩm cho phép sử dụng trong
thức ăn cho gia súc, gia cầm như sau:
— Saccharomyces cerevisiae (nâm men bia), nấm men này được nuôi
cây trên rỉ đường; Saccharomyces carỉsbergensis: nuôi cấy trên rĩ đưòng
và sản phẩm tinh bột.
261
 - Kluyưeromỵes ladies, Kluyveromyces fragilis: được cấy trên nưóc
sữa, axit lactic và dịcầ thuỷ phân thực vật.
- Candida utilis: được nuôi cấy trên dung dịch nước thải.sulphit.

8.2. NẤM MEN THựC PHAM t h u H ồl t ừ c á c q u á t r ìn h s ả n x u ấ t

THỰC PHẨM
Các nấm men thực phẩm có 2 nguồn gốc:
- Chúng được thu hoạch sau lên men công nghiệp, đó là trường hợp
trong các nhà máy, sau khi thu được bia, các nhà máy rượu và sản xuất
rượu từ nước củ cải đưòng.
- Chúng được nuôi cấy đặc biệt vối mục đích sản xuất nấm men, đó
là trường hợp: nuôi cấy trên rỉ mật của củ cải đưòng, trên dung dịch
nưóc thải sulphit của nhà máy giấy, bã rượu của nhà máy rượu và nước
sữa của nhà máy sản xuất phomat.
Danh sách này chưa kết thúc bởi các loại nấm men sinh sản ở tất cả
các môi trường có gluxit hoặc một sô' hợp chất cacbon khác.
8.2.1. Nấm men từ sản xuất bia
Sơ đồ thu hồi nấm men từ bia trình bày trên hình 8.1.
Lắng cặn bia sau khi lên men

1 nẩm
Bia hàm lượng " men cao

i...............
Tách bằng quay ly tâm hoặc rửa
Sữa nấm men từ 13-15% lượng chất chiết khô
;
Nhiệt phân (trong trưởng hợp tâng nổng độ bằng cách
bay hơi, sự nhiệt phán xảy ra đau iiên)

i
Tăng nồng độ bởi quay ly tâm tới 20-24% lượng chất chiết khô, hoặc bởi
phướng pháp lọc chân không từ 22-26% lượng chất chiết khô, hoàc bởi
bay hơi chân không 2 hoặc 3 lần

I
Sấy khô

ị ...
Bao gói sả n phẩm

Hinh 8.1. Sơ đổ thu hồi nấm men từ bia

262
 a) Lời ch ú liên q u a n đến nấm m en bia
Nấm men bia có vị đắng rất lớn, có từ bột hoa bia và được cố định
trên thành của nấm men. Từ đó, nó không thể được tiêu hoá bởi con
người. Sự giải đắng này nhằm lấy đi bột tuyến hoa bia bởi nhiều cách xỏ
lý khác nhau. Phương pháp đầu tiên và đơn giản nhất là rửa nấm men
nhiều lần bằng nưốc. Giữa mỗi lần rửa, dùng máy ly tâm giúp tăng nồng
độ của nấm men.
Các phương pháp khác hiệu năng cao hơn, nhằm rửa các nấm men
bằng dung dịch muối Na (phương pháp được sử dụng ở Anh), phương
pháp này hiệu quả hơn và cần ít lần rửa hơn. Các nấm men sau đó được
nhiệt phân và sấy khô và chúng m ất đi.
Tuy nhiên, các phương pháp xử lý này có hạn chế là gây nên sự mất
từ 2~4% protein và một phần lớn các vitamin nhóm B. Ngưòi Anh đă
khuyến cáo sự m ất mát này bằng vitamin chiết xuất hoặc tổng hợp.
Nấm men bia không được loại đắng có hàm lượng vitamin B cao nhất
trong các nấm men thực phẩm. Ghi nhận rằng sự vitamin hoá các sản
phẩm thực phẩm được cho phép ở Pháp. Các sắc lệnh số 81, 574 ngày
15/5/1981 (xuất bản JORF 17/5/1981 và 4/8/1981), dự định các điều kiện
cần có để thêm vitamin vào các thực phẩm.
b) Tầm q u a n tro n g của sản x u â t
Sản xuất nấm men bia ở Pháp từ 3.000 đến 4.000 tấn theo từng
năm. Nó chỉ góp phần nhỏ trong nền sản xuất bởi trong 100 lít bia
thành phẩm có thể thu hoạch từ 100 đến 105g nấm men. Sản xuất bia ở
Pháp trong năm 1978 là 22.781.000 (hl), tương ứng với nhu cầu từ
20.000 đến 22.000 tấn nấm men.
Sự thu lại và sấy khô nấm men bia được bắt đầu lần đầu tiên ở
Pháp khoảng năm 1930, ỏ mức độ nhỏ. Ngưòi ta làm điều này với những
nấm men khác từ năm 1950, việc sử đụng những nấm men thực phẩm
đã có bước phát triển hơn.
c) N h iệ t p h â n n ấ m m en
Để giảm một cách tối đa chi phí sấy khô, nấm men được cô đặc bởi
phương pháp lọc chân không, hoặc bằng quay ly tầm lăng cặn tự động,
bột nấm men chiếm khoảng 23-26% lượng chất chiết khô, nhưng với sự
làm tăng nồng độ này, bôt nấm men cố độ nhớt mà nó không the bơm
được, điều thiết yếu cung cấp cho các thiết bị sấy khô.
Sự nâng nhiệt ở 80~85°c trong vòng 3-5 phút giết chết các nấm

263
men và giải phóng các protein bằng sự thẩm tách qua màng tê bào, gây
nên sự lỏng hoá các nấm men, cho phép bơm chúng.
Những thành phần của nấm men dễ dàng chuyển hoá khi tiêu thụ
nó. Hệ số tiêu hoá của Saccharomyces cerevisiae được xác định bởi
Jaccfuot và AI (1942):
Lô sấy khô Lô nhiệt phân
Hệ số’tiêu hoố nitơ 62% 94%
Hệ số tiêu hoá calo 37% 92%
Một số người ủng hộ cách ăn uống tự nhiên khuyên tiêu thụ nấm
men "được sấy khô làm tăng sinh lực" sẽ có một hiệu quả thực phẩm cao
hơn các nấm men bị tiêu diệt bởi nhiệt phân. Như chúng ta vừa xem xét,
đó là một Bai lầm lón, Nấm men còn sống phải được dự trữ cho việc sử
dụng liệu pháp bỏi nó có thể đem lại một lợi ích lổn cho y học.
8.2.2. Nấm men tử sản xuất rượu
Nó được thu hồi sau lên men vã trưổc khi chưng cất (hình 8 .2).

Dịch dấm chín đ ể Sữa nấm men 13-

13-15% lượng
chưng cất chất chiết khô
k

Lọc hoàc quay ly tâm hoặc cô

đặc chân không

Hinh 8.2. Sd đổ thu hổi nấm men từ sản xuất rượu

264
 Các nâm men rượu có chất lượng tôt được rửa sau lần quay ly tâm
dầu tiên đê hạn che các cặn lên men. Chất lượng của nấm men rấ t khác
nhau theo các nhà máy vì mỗi nhà máy có một phương pháp lên men
khác nhau.
Nền sản xuất nấm men ỏ Pháp đạt lớn nhất đến 6.000 tấn vào năm
1960, từ đó sản xuât thụt lùi, một phần do sự tăng chi phí năng lượng,
m ặt khác sự cạnh tranh của đậu tương sản phẩm có giá nấm men thấp
hơn với cùng một lượng protein.
Hơn nữa, phương pháp lên men đã phát triển, với việc tái chế các
nấm men. Lượng nấm men sẵn có càng ngày càng ít, Nãm 1987, sản
xuất được khoảng 2.000 tấn và lượng này còn giảm đo những quy
định mới trong sản xuất rượu, đã khiến nhiều nhà máy rượu phải
đóng cửa.

8.3. NẤM MEN NUÔI CẤY CHO SẢN XUẤT ỏ NHÀ MÁY THỰC PHAM
Vối bất kể cơ chất nghiên cứu nào, việc sản xuất nấm men bao gồm
các việc tiên quyết sau:
- Nghiên cứu chủng nấm lên men các hợp chất cacbon: Chọn chủng
trong phòng thí nghiệm và xác định thông số’ lên men trong thùng lên
men thí nghiệm.
- Phân tích thành phần dung dịch để lên men và thử nghiệm
trong thùng lên men để thiết lập các muôi dinh dưỡng bổ sung và các
nguyên tô' đa lượng cần thiết để đảm bảo một sự sản xuất tối ưu các
nấm men.
Chúng ta không được mất quan điểm vì lợi nhuận hoặc ít nhất để
cân bằng lệ phí đầu tư và sản xuất, phải sản xuất 50% nấm men khô
theo điều kiện so vối khối lượng gluxit lên men, thậm chí những cấu tử
này không có giá trị thương mại.
8.3.1. Sơ đồ sản xuất nấm men nuôi cây (hình 8.3)
Chúng ta cần có sự quan tâm đặc biệt đến các nguyên tố đa
lượng, chúng đặc hiệu cho từng loại nấm men và sự vắng m ặt, hoặc
thiêu một trong sô chứng lồm giảm một cách đáng kê năng suât, ví
dụ: đồng (Cu) cần thiết cho Kỉuyveromyces ở một tỷ lệ thường ngăn
cản các nấm men khác.

265
 x ử lý dung dịch lên men

Chuẩn bị dụng dịch

Chuẩn bị nấm Cơ chất: Chất muối dinh dưỡng và
men giống lỏng lên men nguyên tố đa lượng

Thùng lên men

Ra khỏi thùng lên men

Chống nhũ hoá

I
Rửa

I ...
Nấm cô đặc + Nước

............. ị ................
Tách bằng ly tâm lần thứ 2 (13-15% chất chiết khô)

ị 1
Cô đặc bằng lọc Lọc hút chân không
(23-28% chất chiết khô) (23-28% chất chiết khô)

..... . * . 1
Nhiệt phàn bằng đun nóng ở ____ khỏ
82~85°c trong các thiết bị 2 vỏ ị
Bao gói sản phẩm

Hình 8.3. Sơ đồ sản xuất nấm men nuôi cấy

8.3.2. Quy trình nuôi cầy sản xuất nấm men

a) X ử lý nưởc thô
Nguyên liệu phải được lọc, sau đó xử lý để tách những thành phần
không mong muôn mà nấm men không thể lên men, chúng ngăn cản sự
lên men (trường hợp của protein trong rỉ đường củ cải đường và trong
nưóc sữa). Sự chuẩn bị những dung dịch để lên men can thiệp vào giai
đoạn này, cốc tác động nhiệt, thanh trùng hay diệt trùng cơ chất - các
phương pháp thuận tiện cho việc bảo quản ở kho và quá trình lên men.
b) C h u ẩ n bỉ các d u n g dich d in h dưỡng
Cấc nấm men cần nitd dưổi dạng sulphat, phosphat và cốc nguyên

266
lố đa lượng. Sử dụng các muối amoni dưới dạng tinh thể sẽ đẩy chi phí
lên cao. Trong các nhà máy sản xuất nếm men lớn (lên men từ 200.000
đến 500.000 lít dung dịch trong thòi gian hơn 1 ngày), người ta chuẩn bị
trực tiêp các dung dịch muôi amoniac từ amoniac của axit sulfuric, hoặc
axit phosphoric. Những dung dịch muối và nguyên tổ' đa lượng đã chuẩn
bị này, với một tỷ lệ xác định, được đưa trực tiếp vào trong các thùng lên
men, cùng lúc với dung dịch gluxit.
c) L ên m en
Hiện nay, tất cả các quá trình sản xuất nấm men được thực hiộn
bằng sự lên men liên tục, bởi những điểm mạnh mà chúng có được trong
quá trình lên men. Sự lên men liên tục cho một tỷ lệ tàng trưởng ổn
định, đưa đến một quá trình sản xuất có chất lượng thưòng xuyên nhò
vào các thông số điều chỉnh sự lên men.
Việc nuôi cấy liên tục cho một lượng sản xuất cao và không đổi theo
đơn vị thể tích thùng lên men, điều mà không thể có trong lên men gián
đoạn. Trong lên men liên tục công nghiệp, những điều kiện khai thác
không thay đổi theo thòi gian, với sự kiểm soát tự động các thông sô' tác
động cùng độ lớn như trong công nghiệp hoá học và hoá đầu. Việc sản
xuất liên tục nấm men lactic trong nưôc sữa trong thùng lên men của
nhà sản xuất phomat BEL, năm 1965, là một ví dụ.
- Chuẩn bị nước sữa (lactose'rum):
Nước sữa loại kem thu được phomat; nó được loại protein bằng
phương pháp siêu lọc và dự trữ trong 1 thùng 100 m3; bằng thép không
oxy hoá, ỗ 70nc, để tránh tất cả các sự xâm nhiễm trước khi lên men.
Nhà sản xuất phomat phải có một kho dự trữ rníóc sữa đáng kể cung cấp
cho các thùng lên men hoạt động 24/24 giờ và 365 ngày trong năm. Các
thùng lên men hoạt động trong nhiều năm không ngừng nghỉ.
Nước sữa đã loại protein có thành phần (g/1) như sau: 50 - 60g lactoza;
muôi khoáng 8 - 9g; rútơ phi protein 5 - 6g; pH: 5,5 - 6,5.
- Cốc nấm men nuôi cấy:
Các chủng được sử dụng là Kluyverromyces fragilis và Kluyveromyces
lactis. Chúng thuộc chi Saccharomyces, chúng được bổ sung: K. fragilis
phát triển bằng cách sử dụng ưu tiên đưòng lactoza, K. laetis phá huỷ
nhiều axit lactic hơn.
Nghiên cứu sinh thái học và cư dân của các thùng lên men trong
2 năm đã chỉ ra rằng, K. fragilis là loài chiếm ưu thế từ 60 ~ 70%. Trong

267
giai đoạn này, không một loài nấm men lạ nào có thể xâm nhập và phát
triển trong nước sữa đang lên men.
- Cung cấp cho các thùng lên men:
Nước sữa đã loại protein, dự trữ ở 70°c, qua một thiết bị trao đổi
nhiệt đạt 25°c, sau đó nó được thêm nước một cách tự động nhằm đưa
hàm lượng lactic khoảng 23~25g. Tỷ trọng kế điều chỉnh lượng nước cần
thiết khi tới thùng lên men. Đồng thời, muôi sulphat và phosphat amoni
và dung dịch các nguyên tô”trung lượng với tỷ lệ chính xác được đưa vào
thùng lên men.
Nhiệt độ lên men tốỉ ưu là 38DC, pH = 3,5, nồng độ lactoza được duy
trì từ 0,5 đến lg/1. Các thông sô" này phải được tuân thủ một cách chặt
chẽ. Để kiểm soát các yếu tố của quá trình lên men, thùng lên men được
trang bị máy dò liên kết với một bảng kiểm tra theo dõi liên tục bởi
ngưòi điều khiển quá trình lên men. Kiểm soát các thông số’ như sau:
nhiệt độ, pH, oxy hoà tan, sự cung cấp (nưổc sữa, muối amoni sulphat,
amoni phosphat, nguyên tô”đa lượng).
Quá trình làm lạnh là điều cần thiết thực hiện bỏi sự tuần hoàn
nước trong ông lồng thành kép và lượng nước được quy định để duy trì
n h iệ t độ 38°c.
Quá trình kiểm soát lượng dung dịch muối amoni là điều rấ t quan
trọng bỏi dựa vào đổ ngưòi ta duy trì pH = 4,5. Nếu pH bazơ hơn, thì hệ
thông điều khiển tăng lượng muối sulphat amoni; sự tiêu thụ ion amoni
giải phóng S 0 42- làm giảm pH. Song song vôi đó, lượng phosphat cũng
giảm đi.
Các nhà sản xuất phomat BEL và VENDOME có 3 thùng lên men
50m3 chứa thể tích chất lỏng lên men từ 22.000 - 23.000 lít. Người ta
thu được 6.500-7.000 lít mỗi giờ. Quá trình sục khí cần 1.700-1.800m3
khí mỗi giò. Thối gian lưu lại trong thùng lên men là 4 giờ. Chỉ có rấ t ít
lượng lỏng trong thùng lên men do tất cả khối lượng ỏ dạng nhũ tương
để đảm bảo khả năng khuấy trộn hỗn hợp tuần hoàn không khí qua hệ
thống các ống trung tâm và đi xuống ỏ xung quanh thùng.
Kiêm soát lượng bọt đôi khi khó khăn, người ta đạt được điều này
bằng pH khoảng 10 và sủ đụng chất chống bọt vói hàm lượng thấp.
Không khí được nén trong bình nén cao áp có ỉưu lượng 3.000m 3/giờ,
không khí trước tiên được lọc sạch vi khuẩn để tránh ô nhiễm và sau đó
là nguy cơ gây ra sự đình trệ và tắc các thiết bị.

268
 Các thùng lên men không đống kín vì không khí phải có khả năng
thoát tự do, các luông khí bay ra ngăn chặn sự rơi lại của các tác nhân
gây ô nhiễm vào các thùng lên men.
Quá trìn h lên men cũng được theo dõi bằng nhịp độ sản xuất nấm
men: vì đó, sự kiểm soát dễ dàng hơn bởi sự đánh giá quá trình ly tâm cô'
định ở một quá trình xác định.
Các vị trí làm lạnh của các thùng lên men tiêu thụ một lượng nưóc
lổn; cả 3 thùng lên men và rửa nấm men tiêu thụ khoảng 600~1.000m3
nước mỗi ngày. Nước làm lạnh được tuần hoàn trong nhà máy để phục
vụ cho quá trình sản xuất.
d) T ách n ấ m m en
Khi ra khỏi thùng lên men, chất lỏng chảy trong một ống hình chữ
nhật. Chất lỏng được bơm qua máy quay tách ly tâm. ở lần tách đầu
tiên, sữa nấm men chiếm khoảng 13-15% chất chiết khô. Nó được tiếp
nhận bỏi một ống, nơi tiếp nhận đồng thòi lượng nước vừa đủ để tách các
cặn lên men. Từ đây, sữa nấm men được đưa đến thiết bị tách thứ hai
tương tự nhưng để thu một loại sữa ỏ 18~20% chất chiết khô, quá trình
này có làm m ất nấm men theo nước chảy ra. Muôn thu lại lượng nấm
men này, nước này được đưa đến đầu vào của thiết bị tách thứ nhất.
"Sữa” (men) cô đặc ở 18~20% sẽ được lọc bỏi các thiết bị lọc quay
chân không. Bản ép nấm men có 25~26% lượng châ"t chiết khô và được
thu nhận trong các thùng ủ để nhiệt phân, hoặc nó được nâng nhiệt và
khuấy trộn trong vòng 3~5 phút ở 80~82°c, tiếp đó được đưa đến các
thiết bị sây, loại sấy phun và qua máy tạo hạt, tạo sợi. sản xuất nấm
men lactic hàng năm đạt 5.000 đến 7.000 tấn,

8.4. NẤM MEN THỰC PHẨM

8.4.1. Khái niệm vể sình khối nấm men

Ý tưởng dùng nấm men làm thực phẩm đã ra đời từ những ngày đầu
khi thực phẩm còn khan hiếm, rồi qua thời kỳ Chiến tranh Thế giới thứ
II. Việc đùng nấm men khô bổ sung vào dinh dưõng cho con người và
động vật đã ghi nhận giá trị đinh dưỡng của protein vi sinh vật và hiện
nay hàng năm th ế giới sản xuất khoảng 350.000 tấn nấm men, trong đó
150.000 tấn dùng làm bánh mỳ, phần còn lại là phục vụ nguồn thức àn
cho động vật.

269
 Bảng 8.1. Thành phẩn thõ của các loại nấm men thực phẩm khác nhau
(theo % của khối lượng khô)

Thành s. cerevisiae Cadida utiiis S. fragllis. s. cerivìsỉae

phẩn ri đưởng sulphit huyết thanh sữa bia
Protein 5,0 5,5 54 4,5
Lipit 6 5 1 6
Độ ẩm 5 6 7 6
Tro 7 8 9 8
Na 0,3 0,001 - 0,2

Nấm men có khả năng tổng hợp các amino axit từ N 2 và s vô cơ

(muối NH,,+ và SOị2-) cũng như từ các sản phẩm thứ cấp, nguồn dinh
dưỡng cacbon và nguồn năng lượng có nguồn gốc từ công nghiệp (rỉ
đường, tinh bột, nước sữa dịch huyết thanh, mô quả). Quá trình sản
xuất bia thải một lượng đáng kể nấm men dạng men thải công nghiệp
mà chúng ta có thể lợi dụng được. Các chủng nấm men được sử đụng
thay đổi theo cơ chất c , nhưng thành phần thô của tế bào khô thì ít
khác nhau (bảng 8 . 1 ). v ề thành phần amino axit thiết yếu trong những
nấm men phát triển trong điều kiện hiếu khí có vẻ ít phong phú hơn so
với nấm men phát triển trong điều kiện yếm khí. Đó là những nấm men
được nuôi cấy trên rỉ đường, chúng có vẻ có hàm lượng amino axit cao
hơn (báng 8 .2), nhưng vẫn thiếu amino axit chứa lưu huỳnh so vâi
cazein và so với lòng trắng trứng.
Bảng 8.2. Hàm lượng amỉno axỉt thiết yêu
trong những loại nấm men thực phẩm (theo % của protein tổng)

Amino axit
s. cerevlsiae Cadida utilis s. f ragitls s. cerivisìaữ
rỉ đưàng sulphit huyết thanh sữa bia
Lysin 8 ,2 6 ,7 8 ,8 7,3
Valin 5,5 6 ,3 6 ,6 5,2
Lơxin 7,9 7 ,0 9,9 6,3
Izoloxin 5,5 5,3 5,5 5,7
Threonin 4,8 5,5 5,5 4,8
Methionin 2,5 1,2 1,5 1,2
Phenylanin 4,5 4,3 3,9 4,4
Tryptophan 1,2 1.2 1,5 1,1
Histiđin 4,0 1,9 2,5 1,5
Acginin 5,0 5,4 4,9 4,7

270
 Việc tách các tế bào trong dịch lên men bia diễn ra nhờ quá trình
quay ]y tâm, nhưng những cao cặn phải được làm sạch cẩn thận để loại
bỏ những chất có thể gây ra màu không mong muôn hay làm hăng vị. Ví
dụ: các nấm men bia giũ một phần vị đắng của cây hoa bia. Sau khi lau
rửa nhò quay ]y tâm (có thể tuần hoàn nước rửa để tiết kiệm), các tế bào
men ép được làm m ất nước khi lọc chân không. Bánh men ép chứa 20
đến 40% vật chất khô, tiếp đó được sấy để cho sản phẩm cuối cùng có độ
ẩm từ 6 đến 10%. Hình 8.4 và bảng 8.3 tóm tắt những công đoạn trên.
Bảng 8.3. Hiệu su ấ t t ế bào phụ thuộc nồng độ n-hexadecan và NH4NOj
(mỉ th ể tích tế bào/10ml môi trường)

n-hexadecan
NH4NOj
0,5% 1% 2% 4%
0,25 0,20 0,31 0,46 0,50
0,50 0,20 0,36 0,68 0,67
1,0 0,2 0,36 0,48 0,64
2,0 0,18 0,32 0,46 0,62
4,0 0,16 0,30 0,40 0,61

8.4.2. Sản xuất nấm men từ hydrocacbon

Chi nhánh tại Pháp của Tổng Công ty dầu khí BP dưới sự hưóng
dẫn của A. Champagnat vả B.M. Lainé đã thực hiện một quá trình sản
xuất nấm men công nghiệp (chủng Candida ỉipolytica hoặc c . tropicalis)
từ các hyđrocacbon nhờ vào các nghiên cứu của J. Senez trong phòng thí
nghiệm hoá vi khuẩn của CNRS ỏ Macxây. Viện Dầu khí Pháp cũng đã
tiên hành những công việc tương tự.
Nguồn phân lập các chủng nấm men này từ những mẫu đất trong
vưòn, cánh đồng, được bổ sung hoặc nhiễm hydrocacbon. Thêm vào môi
271
trường vô cơ —thạch một lượng hexadecan và 0 ,002 % cloramphinicol là
đủ để ức chế sự sinh trưỏng của vi khuẩn bị nhiễm.
Mỗi lần phân lập và tinh sạch thì các chủng sẽ được nhận dạng (bảng
8.4). Ta cũng chú ý rằng KN0 3 không được dùng làm nguồn dinh dưỡng
nitơ, còn arbutin, gelatin thì không được thuỷ phân, biotin thì phải ở 25°c.
Bảng 8.4. Nghiên cứu phân loại của Candida tropicalis chủng N7Y1
Sinh trưỏng trong môi trường chiết nấm men và matt:
- Sau 3 ngày lên men ỏ 25°c, các tế bào có dạng tròn hoặc bầu dục, kích thước
{3 -7,5) X (3 - 8)|am, được phân lập hoặc tách từng cặp. Có cặn.
- Sau 1 tháng ở 17°c, tạo một vòng mảnh.
Sinh trưởng trên thạch chiết nấm men và malt:
Sau 1 tháng ở 17°C( canh trường khum lên, lổi ra nhẵn bống, mờ hoặc sảrig rựt,
giống kem, bao bọc bởi các giả khuẩn ty thể.
T hạch glucoza của khoai tây:
Giả khuẩn ty thể hình thành và phát triển, đôi lúc có các khuẩn ty thể thật.
Lẽn m en

Glucoza + Galactoza + Saccaroza +

Maltoza + Lactoza - Raffinoza -

Đổng hoá cơ chất có cacbon
Glucoza + Inulin - Dulcitol -
Galactoza + Tinh bôt - D-manitol +
Saccaroza + D-xyloza + D-sorbitol -
Maltoza + L-arabinoza + a-M e-D -glucozit-
Lactoza - D-arabin 02a - Silicin -
L-socbic axit - D-riboza - Gluconat -
Xenluloza - L-ramnoza - 2-xetoglutanat -
Trehaloza - Ethanol + DL-lactat -
Melibioza - Glyxerin + Sucxinat -
Raffinoza - Erythritol - Xitrat -
Melizitoza + Adonitol + inositol -

Môi trường nuôi cấy có chứa muôi vô cơ, nguồn nitơ, phospho và lưu
huỳnh. D ưòng như các ion sắt và magiê làm tăng hiệu suất nếu như nó
được dùng với lượng vừa đủ. Các tác nhân kích thích tăng trưởng có
trong dịch chiết nấm men cũng cho các kết quả tốt. Người ta giữ, kiểm
soát pH nhò nguồn dinh dư3ng nitơ. Ta chú ý rằng, hiệu suất lớn nhất
15,6g/l dạt được khi có 2% hexadecan và 0,5% NH 4N 0 3 trong môi trường
nuôi cấy.
Bảng 8.4 tóm tắt những kêt quả nghiên cứu phân loại chủng nấm
men Candida tropỉcaỉỉs chủng N7Y1.

272
 Có 2 khả năng sủ dụng hydrocacbon được miêu tả trong hình 8.5,
tóm lược theo BP.
Nhà má y tilih Chuẩn bị mõi trường Lẽn men Tách Chiết Sản phẩm
chế (chi mg cất) (loại parafin) cuối
Phưàng
1------- 1—
pháp n H Z U j L — 1 -----1 1----
parafin
(Grage - Tu ẩn hoàn gazoin vé
month) nơi tinh chế (90%)

Phương
pháp 1... 1 r —1
1 1 □ 1 — 1
gazoin
(Lavers I)
Tuẩn hoàn gazoin về
nơi tính cíiê’ (90%)

Hình 8.5. Sơ đổ sản xuất nấm m en từ các hydrocacbon

Trong những nhà mốy kiểu Grangemouth (Ecosse), các parafin

thông thường trong dầu gazoin được tách bằng lưới phân tử, dùng để
điều chế bia, trong khi phần còn lại quay về nhà máy tinh chế.
Ngược lại, kiểu Lavers I (Bouche-Đu-Rône), dầu gazoin được vào
quá trình lên men, sau đó các hydrocacbon không được tiêu thụ được thu
nhận và quay lại nhà máy tinh chế.
Chỉ phương pháp nào dùng parafin tinh khiết mới cần tiến hành
trong điều kiện vô khuẩn.
Việc thu tế bào nấm men được cấy nhờ hyđrocacbon có vẻ phức tạp
hơn nếu canh trưòng dùng cơ chất tan, vì hydrocacbon không bị tiêu thụ
sẽ nằm lại trên m ặt tếbào.
Vối những phương pháp dựa trên parafin thông thưòng, công nghệ
chiết tách là tương đối đơn giản. Dịch bia được quay ly tâm tạo 2 pha:
- Một phần pha nước được tuần hoàn lại để tránh m ất cơ chất dinh
dưỡng vô cơ.
- Các tế bào nhận được ả dạng kem là pha thứ hai, chứa những vết
hydrocacbon được hấp phụ trên bể mặt, thì được dẫn vào thùng lên men,
ở đó chúng chín dần trong điều kiện có không khí. Quá trình chín tế bào
cho phép chúng trao đổi những hydrocacbon còn lại.
Ta quay ly tâm lần nữa để thu các tế bào đă được rửa sạch. Thêm
vào các chất hoạt động bể .mặt khi dùng thực phẩm, ví dụ: một este của
saccaroza, cho phép loại bỏ các tạp chất ciso hoặc parafin vòng không
chuyển hoá được. Sau khi rửa nhiều lần bằng nước, tế bào được đem đi
sấy khô.

273
 Hình 8.6. Tách nấm m en khỏi dẩu khí

Từ gazoin, lần quay ỉy tâm một tạo ra 3 pha gồm các hydrocacbon
không được đồng hoá và các tế bào nấm men. Ta phải dùng Ig dung môi
để loại bỏ những hydrocacbon này,
Đầu tiên dùng dung môi phân cực (isopropanol, axeton, alcol) giúp
loại lipit và làm m ất nước trong tế bào. Việc chiết tách này diễn ra trong
thùng khuấy ở nhiệt độ trong khoảng 50 — 80°c. Dung môi được lọc
trong chân không, kết tinh lại và tái sử dụng.
Tiếp theo xử lý tế bào trong chất tách chiết thứ 2 bằng hỗn hợp
dung môi phân cực và không phân cực (20% C2H5OH + 80% CfiHu), loại
bỏ những vệt hydrocacbon cuối cùng và thu lại tất cả lipit. Các tế bào
lấy được ra bằng lọc và sấy, thiết lập nên chất cô đặc protein không lipit.
Tất nhiên với phương pháp dựa trên dầu gasoin thì cần thiết phải
chiết tách hoàn toàn nhò các dung môi.

Hlnh 8.7. Tinh chấnấm men trong dầu khi nhờ dung môl

274
 Ta biết lkg parafin cho 2kg tế bào theo khối lượng khô hoặc lkg
protein.
Thành phân tông chung (bảng 8.5) và thành phần amino axit (bảng
8 .6) của sản phẩm cuôì cùng.

Bảng 8.5. Thành phẩn nấm men trong dắu theo các phương pháp
sản xuất trên
Thành phần (%) Lavers I Grangem outh
Độ ẩm 5 5
Nitơ 10,6 10,0
Protein Nx6,25 66 62
Lipit 0,5 8
Tro 7,5 5,7
Phospho 1,9 1.4

Bảng 8.6. Thành phẩn của nấm men trong dầu khỉ (g/16gN)
Amino axit Grangemouth Levers I
izoldxin 4,5 5,3
Lơxin 7,0 7.8
Lyzin 7,0 7'8
Phenylalanin 4,4 4,8
Tyrosin 3,5 4,0
Xystein 1,1 0,9
Melhionin 1,8 1,6
Treonin 4,9 5,4
Tryptophan 1,4 1,3
Valin 5,4 5,8
Acginin 5,0
Axit aspartic 9,2 10,9
Axit glutamic 11,3 12,1
Glyxin 4,8 4,5
Histidin 2,0 2.1
Prolin 4,4 3,7
Xerin 4,8 5,1
Glucoza amin 1,8 2,0
Alanin 7,4 5,8

275
 Ta thấy hàm lượng lyzin cao nhưng hàm lượng amino axit chứa s
thì thấp, do vậy việc mang methionin sẽ cải thiện khả năng tiêu hoá và
giá trị sinh học.
Các thí nghiệm lâu dài đã được tiến hành trong nhiều nưâc khác
nhau (Anh, Hà Lan, Nga, Pháp) với rấ t nhiều động vật được nuôi đưỗng
từ nhớng protein cô đặc này. Kết quả khá thoả mãn một cách tổng thể.
Sau đây là những quan sát với lợn (bảng 8.7) và gà đẻ trứng (bảng 8 .8).
Bảng 8.7. Tăng trưởng của lợn có chế độ dinh dưỡng chứa 18,2% protein thô
trong vòng 0 đến 7 tuẩn
Kiểm chứng BP cô đặc + 7,5% BP cô đ ặc +15%
b ộ t cá methionin m ethionin
Tâng trọng trung bình 6,46 6,41 6,57
hàng ngày
Chĩ SỐ tiêu thụ 3,07 2,98 2,94

Bảng 8.8. sản xuất trứng thl nghiệm trong 32 tuẩn

Hàm lượng^>roteln trong Thành phần khẩu phẩn Sản xuất trứng
khẩu phẩn (%) (% kiểm c h ứ n g )
16 Kiểm chứng 100
16 +10% protein nấm men 100,3
20 Kiểm chứng 100
20 +20% protein nấm men 93,1

Những nấm men này có thể chứa các vệt hydrocacbon, với một lượng
rất nhỏ hydrocacbon, ví dụ 3,4 - xyclobenzopyren khi độ tinh khiết không
đủ. Cúng đã có những thí nghiệm hiện tại về độc tố được tiến hành trên
chuột. Sau 80 ngày, 40% các hydrocacbon bị hấp thụ đã vào máu. Một
phần được loại ra theo nước tiểu, phần khác bị giữ lưu lại trong gan và
các chất béo. Nhưng nếu không dùng nấm men, thì các hydrocacbon này
biến mất. Do vậy có lẽ là động vật có thể chịu một hàm lượng nhỏ
hydrocacbon cặn bã thải mà không bị gây hại đáng kể. Nếu như không
thì có thể loại được hydrocacbon ra khỏi cơ thể.
8.4.3. Dự án trong tương lai

Khó mà có thể thiêt lập giá thành các protein khác nhau nguồn gốc
từ vi sinh vật, vì lẽ nó sẽ có gây ra biến đổi giá cơ chất chính (dầu) và

276
VI n othương chi có những phân đơn vi rấ"t nhỏ được thử nghiệm về
chức năng. Các dự án chính được tóm lại trong bảng 8 . 9 , vè giá:thành
trong bảng 8 . 10 , nhưng tình hình kinh tế thực tế có thể đảo lộn những
dự báo này.
Những phương pháp khác hiện đang sản xuất, hoặc xuất phát từ
các sản phẩm dầu khí (IFP,URSS, Esso Research,...), hoặc từ tảo (IFP
với Spirulina ỏ Mêhicô, Sec-Xlovakia, URSS, Nhật), những nấm men là
vật liệu được nghiên cứu nhiều nhất về m ặt dinh dưỡng. Nếu CH3OH có
vẻ có những ưu điểm so với hydrocacbon về giá thành thấp và nhu cầu 0 2,
tuy vậy nhu cầu này lân hơn rấ t nhiểu so với glucoza. Nếu ta để hiếu khí
các canh trường liên tục trong 0 2 sạch, hiệu suất tế bào (Pseudomonas
AM I/CH3OH) lại giảm nếu áp lực riêng phần của 0 2 hoà tan vượt quá
lOOmmHg. Cũng vói canh trường từ CH3OH giàu hứa hẹn có thể giao
cho thử nghiệm dinh dưỡng và độc tố trên 1 thang chia 101*1.' Với'tất cả
các protein vi khuẩn, thành tế bào gây rấ t nhiều khó khăn so ’<>01 nấm
men, vẫn luôn không lấp đầy được những lợi thế của tỷ lệ sinh' ttưỏng
cao hơn.

Bảng 8.9. sản xuất dự tính của protein vi sinh vật

Sản xuất
Nhà sả n xuất Cỡ chất Vi sinh vật
hàng năm (tấn)
■'1
Dai Nippon Inkand Chemical,
n-parafìn 120.000 nấm<men
Nhật Bản
- f
Kanegafuchi Chemical Cakasago
n-parafin 60.000 nấm men
Phant, Nhật Bản

Kyowa Hakk Kogyo, Nhật Bản n-parafìn 100.000 nấm men

Mitsubishi Chemical Company,

ph. đoạn dầu 2.000 nấm men
Nhật Bản

BP Lavera- Pháp gazoin 16.500 nấm men

BP Ecosse n-parafin 4.000 nấm men

BP and ANIE - Italia n-parafin 100.000 nấm men

Reginal Rechesch Lab, Inđộ n-parafin 350 nấm men

Chinese Petrolium Corp. Forminse gazoin 50.000 vi khuẩn

Rank Movis Mc. Dougalí, Anh tinh bột 15.000 nấm sợi

277
 Bảng 8.10. Giá thành các protein khi so sánh với vì sinh vật

Cơ ch ất Vi sinh vặt Sản xuất (USO/kg) Protein (USO/kg)

Gluxit nấm men 1 5 -2 0 3 0 -4 0
Gazoin vi khuẩn 12,6 21
Paraftn thưởng vi khuẩn 14,2 24
Gazoin nám men 14,2 28
Parafpn thưởng nấm men 17,1 34
Metan ví khuẩn 17,5 29
Metanol vi khuẩn 25,0 42
Nước cứng tảo 6,7 - 20,2 1 3 -4 0
COz tảo 66,5 133

Còn phải xem xét làm thế nào các protein vi sinh vật có thể đến với
người tiêu dùng. Những protein cho động vật đã được đưa vào trong
thực phẩm cho gia súc vói con ngưòi, cần phải dự đoán hai giai đoạn.
Trong khi tinh chế, ta loại bỏ hết các đặc tính của sản phẩm gổc bằng
cách nhận 1 bột không màu, không mùi, không vị.
Sau đó việc quyết định lại có cho phép sát nhập chất protein đậm đặc
này vào thực phẩm đã có hay không, ví dụ; Bích quy giàu protein, cho
phép tách thành sản phẩm mới hay mô phỏng theo các sản phẩm đã tồn
tại. Trưòng hợp đơn giản nhất là dịch chiết nấm men được bổ sung vào
bột nhão để tạo mùi thơm. Nhưng cũng có thể tạo kết cấu các protein này
bằng cách tạo cho chúng cấu trúc sợi gần như sợi thịt, thớ thịt.
Đây là một xu hướng tương lai đầy triển vọng của ngành công nghệ
sinh học để bổ sung nguồn protein và các chất khác khi nguồn này từ
động vật và thực vật không cung cấp đầy đủ cho COĨ1 ngưòi và cho chăn
nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thuỷ sản đạt hiệu quả nhất. Chúng ta
cần quan tâm đến lĩnh vực này ỏ Việt Nam nhiều hơn và sẵn sàng áp
dụng có hiệu quả nhất trên nguồn nguyên liệu và phế liệu nông nghiệp,
công nghiệp có sẵn và rẻ tiền ỏ Việt Nam hiện nay và phát triển quy
hoạch vùng nguyên liệu cho tương lai.

8.5. NẤM MEN GIA s ú c

8.5.1. Sản phẩm nấm men từ nguồn hydratcacbon
Nấm men có thể tổng hợp amino axit từ ni tơ và muối amon và từ
nguon cacbon khác nhau: rỉ đưòng, tinh bột, lacto—serum, bã quả, dịch
kiềm sulphit, dịch thủy phân nguyên liệu thực vật và bã rư ợ u .
 Bảng 8.11. Thành phẩn của nấm men sinh khối
từ các nguổn nguyên liệu khác nhau
Thành phẩn S.cerevisiae Candida utilìs S .fragllls S.cerevislae
rỉ đường kiểm sulphit lacto serum nấm m en bia
Protein 50 55 54 45
Lipit 6 5 1 6
Độ ẩm 5 6 7 6
Chất tro 7 8 9 8
Natri 0,3 0,001 - 0,2

Dịch thủy phân nguồn nguyên liệu thực vật hay dịch kiểm sulphit
đểu được sử dụng để sản xuất nếm men làm thức ăn chăn nuôi. Loài
nấm men sử dụng là Candida tropicaỉỉs và c. utilis. Dịch thủy phân
nguyên liệu thực vật được thu nhận bằng cách thủy phân nguyên liệu
(bã mía, gỗ, rơm,...) đã nghiền nhỏ trong môi trường axit sulfuric nồng
độ 0,5% ở nhiệt độ 170 - 190°c. Phương pháp thủy phân bằng enzym
xenlulaza có nhiều ưu điểm nhưng chưa đáp ứng yêu cầu về hiệu quả
kinh tế. Dịch kiềm sulphit là phế thải của công nghiệp chế biến giấy,
được tạo thành sau khi nấu xenluloza và không thể thải ngay vào nguồn
nước thải. N 6 chứa lignin, hemixenluloza, nhựa, chất béo, các muối
khoáng và monosaccarit. Để có thể sử dụng dịch thủy phần nguyên liệu
thực vật hay dịch hồ sulphit để nuôi sinh khôi nấm men thì đều cần xử
lý trước khi lên men vói mục đích loại bỏ các tạp chất, tạp khuẩn và đưa
về giá trị pH phù hợp cho nấm men.
Bảng 8.12. Thành phần amino axit không thay thế của các loại nấm men
khác nhau, tính theo % protein tổng

Thảnh phẩn s . cerovisiae Candida utllís S. fra g ilis s . cerevìsiae

am ino axìt rỉ dường hố sulphit lactoserum nấm m en bia
Lyzin 8,2 6,7 8,8 7,3
Valin 5,5 6,3 6,6 5,2
Lơxin 7.9 7,0 9,9 6,3
Izoldxin 5,5 5,3 5,5 5,7
Threonin 4,8 5,5 5,5 4,8
Methìonin 2,5 1,2 1,5 1,2
Phenylalanin 4,5 4,3 3,9 4,4
Tryptophan 1,2 1,2 1,5 1,1
Histidin 4,0 1.9 2,5 1,5
Acginin 5,0 5,4 4,9 4,7

279
 Đối với dịch thủy phân nguyên liệu thực vật, các bước xử lý là: ( 1)
Chuyển đưòng nghịch đảo; (2) Trung hòa; (3) Tách cặn; (4) Làm nguội và
(5) BỔ sung các mum dinh dưỡng.
Đối vói dịch hồ sulphit, vĩ dịch kiềm sulphit có độ axit cao, chứa các
đưòng đôi, sợi xenluloza và các hợp chất chứa lưu huỳnh, cho nên cần xử
lý theo các bước sau: (1) Chuyển đường nghịch đảo; (2) Tách sỢi
xenluloza; (3) Desulphit hoá; (4) Trung hoà; (5) Tách cặn, làm trong và
(6) Bổ sung các muối dinh dưõng,
Nguồn bã rượu là nguyên liệu để sản xuất nấm men gia súc.
Bã thải của nhà máy sản xuất rượu cồn chứa 6 — 12 % chất khô.
Trong bã thải từ rỉ đường chứa (tính theo % chất khô): Protein 11 - 12;
đường không lên men 4 - 7; glyxerin 7 - 9; axit 13 - 20; betain 8 - 10;
glutam at 6 - 9 , các amino axit 1-3, chất keo, melanoidin, glucozit,
phenol, lipit 10 - 15%, (tất cả các chất hữu cơ chiếm 68 - 72%); K2O 12 - 15;
N20 2,5 - 3,5; CaO 0,2 - 1,3; P 2O5 0,2 - 0,3; các châ't vô cơ khác 10,5 - 11,9%;
(tất cả các hợp chất vô cơ 26 - 32%). Trong bã rượu còn chứa nhiều
vitamin (ng/g): Riboflavin 8 ; axit panto te nic 39; axit nicotinic 21; axit
piridoxín 30; biotin 1,5; axit folic 0,3,
Bã rượu từ ngũ cốc có thành phần khác nhau tùy thuộc vào nguồn
ngũ cốc sử dụng. Hàm lượng vitamin tính theo ịig/g chất khô như sau:
Riboflavin 3 - 4 ; tíamin 1,5 —4,5; axit pantotenic 4 - 8 , axit nicotinic 18 - 75.
Trong bã rượu các nguyên tố vi lượng như sắt, mangan, đồng, kẽm,
cobalt. Bã rượu có pH 4,2 và tỷ trọng trung bình l,04g/cm3.
Nguồn cacbon khác nhau cho hiệu suất thu nấm men rấ t khác nhau
(kg men khô/lOOkg nguyên liệu): axit hữu cơ 25 - 36, đường khử 40 - 45,
glucoza 57, etanol 69. Nếu coi như nấm men có độ ẩm 10 %, như vậy từ
lm 3 bã với nồng độ chất khô 8 - 9% có thể thu được 1 1 - 13kg nấm men.
Đe có thể sử dụng bã rượu làm môi trường nuôi cấy nấm men, cần
xử lý qua các công đoạn: khử trùng, tách cặn thạch cao và làm nguội.
Khử trùng ở nhiệt độ không thấp hơn 98°c trong vòng 1 giờ. Trong
trường hợp bã rượu có chứa CaO nhiều hơn 0 ,8 % thì cần bổ sung axit để
đạt pH = 4 —4,5 và giữ ở 80 - 85°c trong vòng 1 giờ, tách cặn rồi sau đố
làm nguội đến nhiệt độ cần thiết cho sinh khôi.
Môi trường sau khi làm nguội cần được bổ sung các muối khoáng để
đáp ứng nhu cầu của nấm men (p 20 9 3 - 3,5%; nitơ 7 - 8% chất khô).
Thành phần các muối cần bổ sung vào lm 3 bã như sau Gig): axit
phosphoric 0,9 —1,2 hoặc diamonphosphat 1 —1,2; hoặc super phosphat
(đung dịch 18%) 2,8 - 3,0; sulphat amon 2 - 2,5. Cần điểu chỉnh pH 4 - 4 5
bằng axit sulfuric hoặc axit clohydric.
Thành phần hydratcacbon không phải là tinh bột có thể thủy phân
băng enzym xenlulaza và hemixenlulaza từ vi sinh vật Geotrichum
candidum và Trichoderma viride. Nhiệt độ tối thích là 50°c, pH 4 5 - 5 0 .
Các enzym này thủy phân các polysaccarit nói trên thành glucoza, xyloza,
arabinoza và xenlobioza.
Với nguồn bã rượu từ rỉ đường có thể sử dụng các loài c. tropicalis
và c. utilis. Hiệu suất đạt 12 —18g chất khô/1. Nuôi nầm mốc Trichoderma
cutaneum đạt hiệu suâ't 24 - 25g/l.
Để đồng hoá lkg glucoza cần 0,77kg oxy. Để đồng hoá các axit hữu
cơ cần tôn oxy gấp 2 lần so với hydratcacbon, cho nên cần chứ ý cung cấp
nhiều không khí hơn. Cụ thể là, đô'i với lkg axit axetic cần l , 5 7 kg oxy;
lkg axit sucxinic cần l,56kg oxy.
Hiệu suất sinh khôi lốn nhất là 74,5g/l ở điều kiện pH 5,5 - 6 ,0 .
Nhưng khi đó trong môi trưòng nổi nhiều bọt, khó tách nấm men. Trong
thực tế cần giữ pH 4,5 —4,8 và khi đó hiệu suất đạt 65 - 69g/l.
Nồng độ chất khô của môi trường 7,5 - 8,1%; nhiệt độ tối ưu 30 —35°c.
Mật độ sinh khối tế bào đạt 10 kg/m3. Sau các lần ly tâm, mật độ nấm men
đạt: Lẩn 1: 120 - 160g/l; lẩn 2: 280 - 390g/l; lần 3: 345 - 45ỏg/l.
Nấm men c. tropicaỉỉs thành phẩm làm thức ăn gia súc, thu được từ
bã rượu rỉ đường có đặc điểm thành phần (%): Độ ẩm 10; protein: 47 - 55;
gluxit 14 - 17; lipit 2 - 5 và tro 8 - 10.
Hàm lượng các amino axit không thay thế (g/100g protein): Tryptophan
0,4 - 0,7; lyzin 2,5 - 3,6; methionin 0,7 - 1,0; acginin 1,4 - 2,6; histiđin
1,2 - 2,0; treonin 2,6 - 4,2; valin 2,6 - 3,0; izoldxin 2,3 - 5,1; lơxin 3,5 - 3,6;
phenylalanin 2,4 - 3,1 và xystein 0,4 - 0,6.
8.5.2. Sản phẩm nấm men từ cacbuahydro dầu mỏ
Từ những năm thập kỷ 70 của thế kỷ XX, thế giới chú ý nhiều đến
việc sử đụng các sản phẩm dầu mỏ để nuôi nấm men nhằm mục đích
thu nhận sản phẩm giàu protein làm thức an gia súc. Sản phẩm giàu
dinh dưỡng và có thể coi như là môt protein —amino axit đậm đặc, chứa
45 - 70% protein, giàu vitamin B, tiền vitamin D2, không mang mùi vị
nguyên liệu, không có độc tô" gây ung thư.
Từ 1 tấn parafin có thể thu được 0,38 tấn protein nấm men. Nhiều
nước trên th ế giới đã từng có các nhà máy san xuât protein nâm men tư
281
dầu mỏ vói công suất lớn như: Liên Xô 12.000 tấn/ năm; Nhật: 12.000
tấn/nà m và Ý 1.000 tấn/năm.
Đồng hoá hydrocacbua của các ví sinh vật là một quá trình phức tạp
và phụ thuộc vào các điều kiện sau:
- Khả năng thâm nhập vào tế bào của cacbuahyđro.
- Sự tổn tại các hệ thống enzym cần thiết để chuyển hoá nguồn
cacbon.
- Vi sinh vật phải bền với độc tính của cacbuahydro khi nồng độ cao.
Nấm men có khả nãng sử dụng cacbuahydro tốt nhất là những loài
nấm men thuộc họ Crỵptococcaceae, đặc biệt là nấm men thuộc giống
Candida. Trong sô" đó, thường sử dụng nhất là các loài c. tropicalỉs,
c. maltosa, c. lipolytica, c. robusta, c. peỉỉiculosa, c. scottii, c. rugosa.
Ngoài ra còn các nấm men thuộc giống Torulopsỉs và Rhodotorula,
như: T. coliccolusa, T. dattila, T. famata, T. sake, R. glutinỉs, R.
graciỉỉis. Trong họ Cryptococcaceae còn có một số chủng thuộc giống
Trichosporon, Brettanomyces và Cryptococcus. Trong nấm men có một aố
loài thuộc giống Candida có hoạt lực cao khi sử dụng nguồn cacbuahydro
là c. ỉipolytica, c. intermedia, c. tropỉealis, c. parasiỉopsis, nhưng thường
dùng Candida tropìcaỉis và c. ỉipolytica.
Đặc điểm phân loại của Candida tropicaỉis N7Y1 như sau:
- Phát triổn trên môi trưòng nước m alt và cao nấm men.
- Sau 3 ngày ỏ 25°c, tế bào tròn hoặc hình ôvan, có kích thước
3 - 7,5 X 3 - 8 fim, tách riêng hoặc cặp đôi, có cặn. Sau 1 tháng ỏ 17°c, có
tạo vòng nhẫn.
- Phát triển trên môi trường thạch nước malt và cao nấm men. Sau
1 tháng ở 17°c, nấm men kéo dài, trơn, bóng, màu kem có viền của giả
nấm sđi.
- Trên môì trường thạch nước khoai tây cho thây hệ giả nấm sợi
phát triển, đôi khi có tạo sợi.
- Khả năng lên men: Glucoza, maltoza, galactoza, saccaroza. Không
lên men lactoza, rafinoza.
Khác với khả năng đồng hóa cacbuahydro của vi khuẩn và nấm
mốc, nấm men chỉ phát triển được trên n-alkan và alken. Trong khi đó,
vi khuẩn có khả năng sinh trưỏng trên nhiều loại cacbuahydro hơn nấm
men và nấm môc. Nó có thể phát triển trên aỉkan mạch thẳng, mạch
nhánh, thậm chí cả cacbuahydro mạch vòng và khí tự nhiên. Còn nấm
282
môc phát triển trên n-alkan, có khả nàng phát triển kém hơn trên
alkan mạch nhánh.
Nấm men có the đồng hoá dễ dàng nhất các paraíìn cổ độ dài mạch
Cn-C 14. Đối với mạch dài hơn từ C15- c ,8 thì khó khăn hởn. Từ C19-C 21
thì khó hơn nữa và đặc biệt khó đồng hoá loại aỉkan mạch C21 và dài
hơn. Tuy nhiên, khi càng nhiểu số nguyên tử cacbon trong mạch thì hiệu
suất càng lớn, nhưng đốĩ với các mạch có chiều dài lân hơn C26 thì nấm
men không thể sử dụng được nguồn nguyên liệu này, vì ở nhiệt độ 20-15°C
cacbuahyđro loại này đã bị đông đặc.
Các loại cacbuahydro ít có lợi cho nấm men là các phân tử mạch
nhánh như izoparafin, cycloparafin và cacbuahydro mạch vòng, thậm
chí cả cacbuahydro nhẹ C2-C 8. Có thể nuôi cấy vi khuẩn trên môi trưòng
chứa n-parafin vối chiều dài mạch c n -C 30.
Cần chú ý rằng, đối vói nấm men gia súc cần kiểm tra nghiêm ngặt
thành phần cacbuahydro còn lại (không được phép quá 2 ,2 % khi có mặt
cacbuahydro thơm). Không được chứa quá 16% lipit, Đe đảm bảo các
tiêu chí nói trên, cần chú ý những điểm sau:
- Khi nuôi cấy nếm men, sử dụng paraíín lỏng đã được làm sạch ở mức
độ cao, nhiệt độ sôi trong khoảng 200 —320°c, với thành phần n-alkan
không ít hơn 99% và cacbuahydro vòng không quá 0,01%.
- Khi sử dụng cốc phân đoạn parafin có độ sạch bình thưòng cần
tiến hành làm sạch nấm men bằng cách tách chiêt bằng dung môi hữu
cơ. Khi đó sẽ làm tăng giá thành lên 15%.
- Chất lượng parafin ảnh hưởng đến hiệu suất nuôi nấm men. sản
phẩm phụ thuộc: (a) Độ sạch của nguồn cacbuahydro và (b) Thuộc tính
lý học (độ nóng chảy, độ nhốt, màu).
“ Sử dụng cacbuahyđro Ci2" C19*
- Paraíìn không khuếch tán vào môi trưòng nước, nên phải chọn
nhiệt độ thích hợp trên 40°c. Biện pháp nâng cao hiệu suất sử dụng cơ
chất: sử dụng kỹ thuật nuôi cấy liên tục, đưa liên tục parafin nóng vào
thùng lên men (50 - 60°C). Nồng độ parafin ban đầu 1,5-2% .
- Nuôi nấm men trên môi trường có parafin cần thổi khí mạnh gấp
2,6 - 2,8 lần so với môi trường hyđratcacbon.
8.5.3. Chuẩn bị nguyên liệu để nuôi nấm men
Cố 3 phưdng pháp để tách parafin từ các phân đoạn đầu mỏ:

283
 ( 1 ) Tinh thể hoá ở nhiệt độ thấp có sử dụng các dung môi; (2) Tách
parafin có sử dụng cacbamit và (3) Hấp phụ trên zeolit.
a) T ỉn h th ể h o á ở n h iệ t đô thấp
Bản chất của phưdng pháp là tinh thể hoá n -alkan sôi ở nhiệt độ
cao bằng cách làm lạnh từ từ các phân đoạn dầu mỏ trong các dung môi
đã chọn chẳng hạn như axeton, benzen, toluen. Sản phẩm thu được theo
phương pháp này từ dầu điêzel chứa 98% n -alkan với chiều dài mạch
CH-C 21, gần 0,5% cacbuahydro thơm, bắt đầu sôi ỗ 290°c.
b) T á ch p a r a fin b ằ n g cacbam it
Phương pháp dựa trên khả năng khác nhau của cacbuahydro khi
tạo hợp chât rắn vói cacbamit. Dễ tạo phức chất nhất là các paraíin có
phân tử lổn, các phân tử có kích thưốc càng nhỏ thì càng khó tạo phức
hơn. Các izoparafin mạch nhánh, cacbuahydro thơm mạch vòng và
cacbuahydro naphten mạch nhánh dài hầu như không tạo phức hđp với
cacbamit. n—parafin dễ tạo với cacbamit thành các liên kết dễ phân cắt.
Quá trình này gồm các công đoạn sau:
- Tạo và thu nhận hợp chất cacbamit.
- Tách hợp chất khỏi pha lỏng bằng cách lọc chân không.
- Rửa bằng metylenclorit để loại bỏ cacbuahydro thơm và nhựa hấp
phụ bề mặt.
- Tách hợp chất bằng hơi nước hoặc bằng nước nóng.
- Tách và làm sạch n-parafin.
- Tái sinh cacbamit.
Parafin lỏng thu được theo phương pháp này chứa 85 - 92% n-alkan
và 5% hợp chất vòng alkyl.
c) H ấp th ụ trên zeo lit
Dựa trên cơ sỏ là zeolit có khả năng hấp phụ lựa chọn các chất vỏi
kích thưóc và hình dạng xác định của phân tử. Để thu được n—parafin
ngưòi ta sử dụng pha hơi trên zeolit.
Nguyên liệu ở áp suất 0,275.105 Pa, đốt nóng đến 315 - 400°c và
ngưòi ta đưa zeolit vào pha hơi này. Sau khi chất đầy chất hấp phụ vào
cột hấp phụ, ngưòi ta thổi n—hecxan đế loại bỏ khoảng trống giữa các
hạt zeolit và tạp chất. Sau đó tiến hành nhả hấp phụ do áp suất riêng
phần của n—hecxan. Hỗn hợp parafin và n—hecxan đi vào cột chưng cất.
Bàng cách này có thể nhận được n-parafin có chiều dài C4-C 22 với nồng
độ 99%, cacbuahydro thơm 0,25%, mức độ thu hồi nguyên liệu 97 —98%.
284
 Người ta còn sử dụng chất nhả hấp phụ chứa NH3, cho phép thu
n-paraíĩn với độ tinh khiết 98-99%, 0,4-0,8% chất thơm và hiệu suất 95%.
Nhiều khi các phương pháp sử dụng không đáp ứng được độ sạch
can thiet cua paraíìn cho vi sinh vật. Khi thành phần cacbuahydro thơm
trong khoang 0 ,2—2 % thì cân làm sạch thêm bằng cách sử dụng các
phương pháp hoá học và lý học.
Cac yêu câu đôi với parafin đe lên men tạo sinh khôi nấm men
như sau:
- Tỷ trọng ở 20°c đạt 0,8.
- Nhiệt độ sôi: Từ 200 - 345°c.
- Tỷ lệ cacbuahydro thơm 0,01 - 0,5; lưu huỳnh: 0 - 0,05%.
- Không chứa nước, axit, kiềm.
- Thành phần cacbuahydro C]2—C19.
Trên môi trưòng paraíĩn lỏng thường nuôi cây các loài thuộc giông
Candida. Chúng có khả năng tích tụ nhiều protein (45 - 60%) với tốc độ
dòng chảy lớn (0,16 - 0,221/giò) và hiệu suất đạt 84 - 103%.
Loài nấm men c. maltosa có nhiệt độ tối thích 32 - 34°c, pH 4 - 4,2.
Hiệu suất đạt 90 - 100% với tốc độ chảy ó,2 - 0,251/giò. Hàm lượng
protein thô đạt 58 - 63%, protein tinh khiết là 42 - 47%.
Sản xuất sinh khôi nấm men từ sản phẩm dầu mỏ và từ nguồn
hydrat cacbon tương tự như nhau.
Quy trình sản xuất gồm các giai đoạn: chuẩn bị môi trường dinh
dưỡng, nhân giông và lên men, tách và rửa sinh khôi nấm men, sấy khô.
Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng có thành phẫn (kg/1.000 lít): n-parafin
12,5; Ca 2(P 0 4)3 2 ,7 ; (NH4)2S 0 4 0,45; Nước amoniac 4,0; KC1 0,56;
M gS0 4 0,28. Ngoài ra, bổ sung các nguyên tố vi lượng dưới dạng muôi
FeCl3.6H20 , M nS0 4.H20, ZnS0 4.7H20, CuS0 4.5H20, KI, Na 2Mo04. HaO.
Sau khi lên men thu được dịch huyền phù nồng độ tế bào 25g/l, các
bước xử lý dịch sau khi lên men như sau:
- Bằng phương pháp ly tâm 2 cấp thu được 8 —13% chất khô.
- Làm co nguyên sinh ở nhiệt đô 85°c trong 50 phút (sục hơi nóng).
- Làm nguội bằng thiết bị tự bốc hơi. Khi đó nồng độ tăng 17 - 22 %.
Nhiệt độ giảm từ 83 - 100°c xuống còn 60 - 80°c.
- Sấy phun. Nhiệt độ không khí vào là 230 - 450°c. Nhiệt độ sấy
bên trong nhỏ hơn 100 °C.
285
 d) Đ ặc điểm, sả n p h ẩ m
Bên ngoài: dạng bột hoặc dạng h ạt có màu vàng n hạt hoặc nâu xám,
có mùi nấm men đặc trưng. Độ ẩm nhỏ hơn 10%; protein 56 - 60%, lipit
16%; ]yzin 4,6%; gluxit 2,2 —1,6%.
Thành phần các nguyên tô”(< ng /kg): Chì - 5; asen - 2, thuỷ ngân -0,1;
cadimi - 0,3.
Sản phẩm không cho phép có vi khuẩn Salmoneta. Lượng tế bào nấm
men trong lg sản phẩm < 102, trong đó lượng vi sinh vật chung < 10 3.
Bảng 8.13. Hiệu suất sinh khối của một số loài vi sinh vật
trên nguổn cacbuahydro
Nhiệt độ Thài gian Hiệu s u ấ t Sô' lượng tè
Vi sinh vật nuôi cấy một th ế hệ chuyển hoá bào/oxy
(°C) (giở) (%) (g/g)
Torulopsis 30 7 72 0,29
Candida intermedia 30 4 ,5 -6 ,5 81 0,35
Candida tipolytica 32-38 3,65 102 0 ,3 6 -0 ,3 9
Pseudomonas 30 - 103 0.5
Micrococcus 30 1,4 130 1,12

8.6. S ự ĐA HÌNH THÁI CỦA NẤM MEN

Các nấm men rấ t đa hình thái. Các tế bào của loài K. lactis và
K. fragilis thì tròn và hơi hình oval khi nuôi cây trong phòng thí nghiệm
và trong các thùng lên men để chuẩn bị bột chua khi thông gió kém. Sau
hai th ế hệ, chúng có hình thái của những trực khuẩn hình que lớn sau
8 giờ lên men hiếu khí ở pha bọt.
Điểu này cũng đúng với các loài nấm men khác. Đó là một đặc tính
cần biết khi người ta xác định bằng kiểm tra hiển vi các nấm men thực
phẩm bị giết và làm khô.
8.6.1. Các thành phẩn của nấm men thực phẩm
Hiộu quả đinh dưỡng của một sản phẩm thực phẩm phụ thuộc vào
thành phần hoá học của nó và khả năng sẵn có của các thành phần này.
Những nấm men thực phẩm được đặc trưng bởi hàm lượng protein, axit
nucleic, vitamin nhóm B, glutathion, choline cao. Hệ sô' tiêu hoá của nó
là từ 80 ~ 85%.

286
 a) P ro tein
Cac protein đại diện hơn 45% thành phần các nấm men thực phẩm.
Chúng giàu amino axit cần thiết, trong đó có lyzin. Chỉ những amino
axit chửa lưu huỳnh (methionin và xystein) thì xuất hiện vối lượng nhỏ
so với hàm lượng của chúng trong albumin trứng gà.
Sự hieu hụt tương đôi methionin có thê được bù đắp bằng cách thêm
amino axit này hoặc sử dụng cốc sản phẩm giàu methionin, glutathion
bổ sung sự thiếu hụt này.
b) A x it n u cleic
100g nấm men khô có 50% vật chất protein, có 3g axit nucleic. Thịt
sống có hàm lượng axit nucleic là từ 0,9 ~ lg/ 100g. So với lượng protein,
hàm lượng axit nucleic của nấm men và thịt gần nhau, thì th ịt sống
chứa 16 ~ 20g protein trong khi nấm men chứa từ 48 ~ 50%. Khi tiêu
đùng lOOg th ịt đỏ thu được trong đó 16 ~ 20g vật chất protein chứa lg
axit nucleic; với 40g nấm men thực phẩm cứ 20g protein lại chứa l,2g
axit nucleic. Do đó sự tiêu thụ nấm men thực phẩm của con người
không gây nên nguy cơ tai biến axit uric huyết não, với cùng lượng
protein ăn uống.
Sự phân bố nitớ nucleic trung bình như sau: axit ribonucleic 50 ~ 55%,
axit dezoxyribonucleic từ 40 - 45%, nucleic từ 8 ~ 10%.
c) N ỉtơ nucleic, n h â n tô'tăng trưồng
Sau các thử nghiệm dinh dưỡng trên các con bê non, người ta nhận
thấy rằng, cốc sản phẩm giàu nitơ nucleic có tác động thuận lợi rấ t rõ
xuống sự tăng trưởng của chúng (Vrignaud, 1984) điều này đã được chỉ
rõ bởi một nghiên cứu được tiến hành từ 1979 đến 1981 (hợp đồng
DGRST).
Sự tác động thuận lợi này rất rõ trong thời kỳ tăng trưởng nhưng
không còn xuất hiện ở các động vật trưởng thành. Sự thúc đẩy này kéo
theo việc cô đỉnh được xúc tiên của vitamin A bỏi gan.
d) G ỉu x it
Khoảng từ 28 - 35 % thành phần nấm men là các hợp chất rấ t quan
trọng, nó đem lại cho nấm men sự hoạt hoá sinh học đặc biệt. Thành
phần cùa gluxit như sau (%): glucoza, fructoza và các đưòng khác 0,5 —0,6;
mesonititol 0,05 - 0 ,1 ; glycogen 5 - 6 ; manne và các polyme khác
2 3 ,5 -2 4 ,5 .
287
 e) L ip it
Nó chiếm từ 6 - 9% thành phần nhưng chúng thường có một tỷ lệ từ
10% đa ax it béo không no, thúc đẩy chức năng gan.
f) Các p h ầ n tử k h á c
- Glutathion: tripeptit, hợp chất của glycocolle, của cysine và axit
glutamic thường xuyên có mặt trong nấm men vói lượng lán, từ 500-
600mg/100g. Glutathion có vai trò trung tâm trong các phản ứng oxy
hoá sinh học, nó có hàm lượng nhỏ của methìonin và xystin, điểu này
được giải thích trong các thử nghiệm dinh dưỡng ỏ động v ật dưòng như
không có sự thiếu h ụ t amino axit chứa lưu huỳnh. G lutathion tăng khả
năng chống chịu của các cơ thể trước sự xâm nhiễm và khả nàng chông
ngộ độc đối vói các chất độc hoá học và vi khuẩn rấ t quan trọng. Liên
kết vói selenium tạo th àn h glutathion-peroxydaza, bảo vệ m àng tế bào.
- Cholin: Với 100 - 500mg chólin cho lOOg, nấm men là nguồn giàu
vitam in này n hất. Cholin cần thiết cho chức năng của các tế bào gan
(xuất hiện trong nhóm metyol).
- Các muối khoáng: Các nấm men thực phẩm thu được bằng quá
trình vô cơ hoá (hoá tro) đạt 6 - 9% tuỳ theo từng loài và điểu kiện nuôi
cấy. Các chất khoáng của tế bào tồn tại dưối dạng có thể đồng hoá được
bởi nguồn tiêu thự. Nó bao gồm chủ yếu p, Ca, Na, K, Mg và nhiều
nguyên tô' đa lượng như Fe, Cu, Mn, Co, Se.
- Vitamin: Nấm men ìà nguồn quan trọng của các vitamin nhóm B
và vitam in E, D2 và c . Các vitam in tự nhiên có trong thực phẩm như
sữa và nấm men có hiệu quả lớn hơn các vitam in chiết xuất hay tổng
hợp riêng rẽ. Sự tồn tại của tấ t cả các vitamin nhóm B trong nấm men, ở
đó bao gồm axit folic, là sự bảo đảm rằng tấ t cả các th à n h phần thực
phấm có thê được chuyển hoá, nấm m en đem đến các vitam in từ các
enzym trong đó trao đổi chất của chúng.
Sự tác động phong phú của nó có được bởi nhiều tác n h ân có trong
thực phẩm và phản ứng tổng th ể của nó.
8.6.2. s ử dụng dinh dưỡng
Các n ấm m en thực phẩm được sử dụng trong thức ăn cho người hay
động vật có cùng nguồn gốc với thức ăn cho người, theo thứ tự quan
trọng được sử dụng: Những nấm men bia thô và đã giải đắng, các nấm
men lactic, nấm men Candida utilis nuôi cấy trên các dung dịch kiểm
sulfuric.

288
. a) Giới th iệ u
Với thức ăn cho người, nấm men được giói thiệu dưới hai dạng:
- Dạng vảy, (ú được nhò sấy phun. Chúng được thêm vào các loại
canh, món ăn nâu sẵn, các salađe,...
- Dạng bột, có được nhò nghiền hoặc sấy tự động. Nó được sử dụng
trong các loại canh nưỏc hoa quả và các loại đồ uống khác, ở dạng này
nó được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm.
b) Thử c ă n cho người
Nấm men bia, sản phẩm được biết đến và sản xuất lâu đòi nhất, đã
được sử dụng trong thức ăn cho người. Các thử nghiệm dinh dưỡng đầu
tiên được thực hiện dưới sự kiểm soát y tế và khoa học vào năm 1935 tại
Anh, Mỹ, Pháp và Đức trên động vật. Tất cả các thử nghiệm đều thuận
lợi. Các thí nghiệm đầu tiên trong dinh dưỡng cho ngưòi đã được tiến
hành năm 1945 bằng cách sử dụng các nấm men bia bị giết và sây khô.
Tại Pháp, năm 1957, thỏ nghiệm đầu tiên của nấm men lactic trong
thức ăn chăn nuôi, dưới sự kiểm soát y tế, thực hiện bởi trung tâm
nghiên cứu Foch, dưới sự chỉ đạo của giáo sư Gounelle de Fontanel trên
116 thiếu niên có chế độ ăn uống 3.000 calo, 69 người nhận thêm lOg
nấm men mỗi ngày, sau 13 tuần, những người ăn thêm nấm men nặng
hơn 1.590g còn những ngưòì khác là 990g.
Nhiều cuộc thử nghiệm dinh dưỡng dưới sự kiểm soát y tế đã được
thực hiện tại các trung tâm y tế, trên các bệnh nhân và những người ở
thòi kỳ lại sức, người già, các vận động viên và các em học sinh. Tất cả
các thử nghiệm này đều lấy 15/20g mỗi ngày, nấm men đã được chấp
nhận, nó luôn tạo ra sự cải thiện trạng thái chung và aự chống chịu mệt
mỏi lớn hơn.
Cuộc sông thành thị gây ra nhiều stress có biểu hiện mệt mỏi
thường xuyên, bực tức, m ất ngủ (nêu ta chỉ nêu ra các phản ứng thưòng
xuyên). Hơn nữa, cách ăn uống bất cân bằng protein, điều này trầm
trọng thêm bởi việc uống rượu và hú i thuốc, chúng phá huỷ một phần
vitamin B. N ếu dùng 5 —lOg nârọ men mỗi ngày sẽ bô sung một lượng
lớn sự thiếu h ụ t amino axit cần thiết và vitamin nhóm B. Sự tiêu thụ ưa
thích nấm men thực phẩm diễn ra ỏ bữa sáng, với sữa, càfê hoặc các
dung dịch khác.
Trong các chế độ ăn chay hoặc thực vật, kể cả giảm béo ở hàm lượng
calo thâp, nấm men đưa lại các loại protein có chất lượng bị thieu trong

289
các chê độ ãn này (lyzin). Trong các chế độ ăn này, 30 —40g nấm men
thực phẩm mỗi ngày có thể chấp nhận tô't. Trong tất cả các trạng thái ăn
thúc đẩy hoạt động chung của cơ thể.
Từ sự giàu protein đến giá trị tương đương vối thịt, hàm lượng
vitamin nhóm B, sự tự bảo vệ miễn dịch khi .tiêu thụ chúng, nấm men có
thể giữ vai trò quan trọng để đấu tranh chông lại sự kém dinh dưdng.
Nấm men thêm vào trong thực phẩm truyền thống không thay đổi tính
chất cảm quan của thực phẩm, điểu chủ chốt trong việc chấp nhận nó,
và cải thiện cân bằng protein và vitamin trong chế độ ăn cơ bản. Nấm
men dạng bột hay dạng chế phẩm bảo quản là những sản phẩm dễ dàng
vận chuyển và bảo quản trong các túi đay hoặc giấy kép của túi nhựa
kín. Nấm men được dự trữ đễ dàng trong khí hậu nhiệt đới.
Vì tất cả những lý do đó, nấm men được sử dụng thành công ở các
vùng quê để chông lại nạn đói của th ế giói. Nhiều cuộc thử nghiệm đã
được tiến hành ỏ Ấn Độ, Bò biển Ngà, Madagascar, đảo Mautrice và
Reunion. Từ năm 1965, Hội đồng Pháp chông lại nạn đói sử dụng
thưòng xuyên các nấm men lactic trong tất cả các can thiệp cấp bách
chông lại nạn đói.
8.6.3. Nâ'm men trong công nghiệp thực phẩm
a) N ấ m m en n h ư m ôt chất tao hương
Dưới dạng chất tự tiêu có vị và hương nước dùng của thịt, các nấm
men được sử dụng từ khoảng năm 1920, hoặc dưới dạng bánh, hoặc dưới
dạng dịch cô đặc: Kub, Magie, Liebig, Mamite... Trong trường hợp sản
xuât chất tự tiêu từ nấm men, tác động này được đưa đến điểu kiện pH
và nhiệt độ xác định vói từng loài nấm men. Đương nhiên rằng, sự tự
tiêu phải được thực hiộn trong các điều kiện vô trùng.
b) S ử dụng tron g trạ n g th ái
Khả năng liên kết và giữ nước. Hai tính chất này là do sự giàu
protein của nấm men và thành phần gluxit bổ sung. Những tính chất
này dẫn đên khả năng nén (dạng hạt hoặc viên nén). Các nấm men ổn
định hoá các bột trong các sản phẩm từ tinh bột (tạo khung, bột thực
phâm, sản phẩm ép đùn).
Đó là những chất bổ trợ nhũ tương không làm cứng cấu trúc (thịt
lợn, thức ăn muối). Nó cũng cho phép sự ổn định độ nhốt của các hợp
chấL lỏng hoặc nửa lỏng (crêpe, bánh xốp lâp). Khả năng dày hoá làm
tăng sự chông chịu lại các sốc nhiệt lâu dài (nưóc sốt, canh, thực phẩm
290
cho tre nho). No làm giam độ âm tương đôi cân bằng của các sản phẩm
tươi hoặc nửa tươi cuối cùng.
Do sự giàu vê' hàm lượng axit glutamic, các nấm men có thể thay đổi
các muôi n atri glutamic, sử dụng trong các nước sốt, canh hoặc các sản
phẩm thịt. Đó ]à những lốp nền cho các chất hương và gia vị mặn, và các
chất củng cố’hương cho các bột phomat.
Các glutathion có một tác động rõ rệt đến cấu trúc gluten làm mềm
sản phẩm. Tính chất này có ứng dụng trong sản xuất bột lá hay vỡ gẫy,
nói chung trong tất cả các sản phẩm có nhiều bột. Các nấm men cũng
chỉ sử dụng như các chất bổ trợ nấu để ép đùn. Nó điều khiển sự trương
nở theo đưòng kính và theo chiều đài của các mạch đùn.
8.6.4. Nấm men trong thức ăn cho độhg vật

Sản xuất nấm men thực phẩm ở Pháp năm 1941 là 1,800 tân, gần
như chỉ có nấm men bia. Năm 1966, sản xuất ỏ Pháp đạt 10.000 tấn do
sự thu lại các nấm men rượu (từ năm 1946) và việc sản xuất nấm men
nuôi cấy. Các nấm men lactic và Candida trên dung dịch kiểm sulphit
của nhà máy giấy sản xuất ổn định từ 7.000 - 8.000 tấn đến năm 1988,
năm mà ngưòi ta nhận thấy sự quay lại của sản xuất do lợi nhuận đáng
kể ngày càng lớn của các nhà sản xuất thức ăn gia súc. Nấm men thực
phẩm luôn là một nguồn bổ sung cho các động vật khi chúng không
đắng. Trong các thực phẩm cho bú đôi với bê, các nấm men thực phẩm
được sử dụng tới 15% theo công thức vói các con bê giết thịt và 20% đối
với bê nuôi, ỏ các con lợn con, sự tăng trưởng được cải thiện với 3 - 10%
nấm men trong thành phần thức ăn. Lợn cái có sự lên men lactic nhiều
hơn và ]Ợn con có khả nồng chông chịu bệnh tôt hơn. Lợn vỗ béo có sự
phát triển tốt hơn vối 3 -4 % nấm men trong chế độ ăn uống của nó.
Tất cả các loài động vật có thể tiêu hoá nấm men có lợi cho sức
khoẻ: động vật đang vỗ béo, động vật bầy đàn như ngựa, chim và cả
con ốc (sò đốm).
8.6.5. Sự bảo vệ miễn dịch liên tục khi tiêu hoá nấm men thực phẩm
Tại Pháp, từ 1915, tất cả các chuyên gia thực phẩm cho động vật đă
quan sát, sự tiêu hoá các nấm men thực phâm đem đen cho cơ thê sinh
vật tiêu thụ một khả năng chông chịu xâm nhập vi sinh vật, điều đó rất
quan trọng trong chăn nuôi công nghiệp.

291
 Các công trình nghiên cứu được thực hiện bởi Viện Pasteur năm
1984, theo yêu cầu của Nghiệp đoàn các nhà sản xuất nấm men thực
phẩm tại Pháp, đã phát động quá trình miễn dịch phòng thủ trong cơ
thể người và động vật, điều đã được khẳng định bởi các công trình khoa
học Israel. Các nấm men còn sống hay chết gây ra các phản ứng miễn
dịch với cường độ hơi khác nhau. Các thành tế bào và nguyên sinh chất,
màng, dường như giữ một vai trò quan trọng.
Tóm lại, từ năm 1950, nghiên cứu về thành phần nấm men thực
phẩm, các thử nghiệm sạch sẽ cân bằng trong ăn uống dưới sự kiểm soát
y tế, và chỉ ra rằng nấm men là sản phẩm thực phẩm giàu amino axit
cần thiết và vitam in nhóm B nhất. Đó là thực phẩm duy n h ất mà khi
tiêu hoá đảm bảo sự bảo vệ miễn dịch một cách khoa học.

8.7. VẤN ĐỀ MÔI TRƯỜNG VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG TRONG SÀN

XUẤT PROTEIN
8.7.1. Vấn đề an toàn trong sản xuất và sử dụng protein đơn bào
a) ư u điểm và n h ữ n g điều cần chú ỷ tro n g sả n x u ấ t p ro te in
đơn bào từ vi s in h vậ t
- Một số ưu điểm:
+ Sinh khối vì sinh vật là một thể thông nhất, do đó có thể thu
hoạch một cách đơn giản và dễ dàng (khác với các loại cây trồng trong
sản xuất nông nghiệp).
+ Nuôi cấy vi sinh vật chỉ cần một diện tích không đáng kể để xây
dựng xí nghiệp (trồng trọt và chăn nuôi thưòng chiếm diện tích lớn).
+ Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất cao, đồng thời tốc độ sinh tổng
hợp protein trong tế bào vi sinh vật cũng rấ t cao, có thể cao hơn từ
100 - 10.000 lần so với bò.
+ Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu cũng như thòi
tiết trong năm, quá trình nuôi cây được tiến hành trong các nồi lớn, dễ
dàng ổn định các điều kiện kỹ thuật như thành phần môi trưòng, nhiệt
độ, pH... bằng các hệ thống điều chỉnh tự động.
—Những điểu cần chú ý:
Như trên dã định nghĩa, cả protein được tách chiết từ tế bào lẩn vật
liệu tế bào đều được gọi là SCP. Do đó, trong quá trình sản xuất cũng
phải lựu ý đến các điểm saụ:
+ Có thể phân lập và lựa chọn vi sinh vật có ích và thích hợp cho các
292
quá trình công nghệ sản xuất, nhưng các chủng đó phải thuần khiết
khong bị tạp nhiem, điíỢc xác định là những loài đuơc phép sử đụng
trong công nghiệp thực phẩm, không độc cho người, gia súc và cây trồng
+ Trong quá trình sản xuất phải đảm bảo tránh nhiễm tạp các vi
sinh vật lạ. Cho đến nay chưa được phép sử dụng vi sinh vật biến đổi
gen để sản xuất protein đơn bào.
+ Trong thành phần protein vi sinh vật có đầy đủ các loại amino
axit và đặc biệt là các amino axit không thay thế có giá tri dinh dưỡng
cao. Tuy nhiên, chế phẩm protein phải được kiểm tra an toàn sinh học.
b) C ần th ử n g h iêm trước k h í sử d u n g
Nhiều thí nghiệm đốì với người cho thấy, có thể chịu được lOOg/ngày
hỗn hợp tảo Chlorella và Scenedesmus. Nhưng với liều 200 g/ngày thì
thây có hiện tượng về đường ruột (buồn nôn, nôn, đầy hơi, đi ngoài).
Ngoài ra, dịch chiết cồn từ Chlorella pyrenoidesa thì chịu đựng tốt, còn
Scenedesmus obliquỉs thì không.
Việc thử nghiệm với protein của vi khuẩn không được thành công
cho lắm. Ngược lại, đối với nấm men thì rấ t tốt. Một số ngưòi tình
nguyện có thể đã ăn đến 135g nấm men khô trong 9 ngày mà không bị
bệnh đường ruột. Tuy nhiên cần nhiều biện pháp xử lý tế bào trước khi
đem sử dụng làm thực phẩm.
Ngoài ra, hiện tượng gây dị ứng do protein lạ cũng xuâ't hiện ở một
sô' trường hợp. Do vậy, bất kỳ chế phẩm nào cũng phải được kiểm tra
nghiêm ngặt về an toàn thực phẩm trước khi bán ra thị trưòng,
c) X ử lý t ế bào trưóc k h i đem sử dụng làm thức ăn
Có một số yếu tố làm hạn chế khả năng sử đụng protein vi sinh vật,
chẳng hạn n h ư thành tế bào khó tiêu hoá, hàm lượng axit nucleic cao,
màu sắc không phù hợp (chủ yếu là ồ các loại tảo), vị không hấp dẫn
(tảo, nấm men).
Trưốc khi sử dụng cần phải làm chết tế bào. Thực te, tê bào vi sinh
vật có thể sống và phát triển trong đường ruột, gây lên men, sản sinh ra
các amin gây độc, sử dụng vitamin của vật chủ, Từ các nguyên nhân này
mà ta cần xử lý tế bào với mục đích tiêu diệt tế bào, loại bỏ bớt màng tế
bào gây cản trở quá trình tiêu hoá và đồng thòi làm giảm hàm lượng
axit nucleic.
Nhiều phương pháp tách chiêt hoá học đã được áp dụng đe thu nhận
protein đặc. Kêt quả là trong sản phâm có các liên ket ure—protein, cho

293
nên cần loại bỏ ure bằng phương pháp thẩm tích. Tiền xử lý tê bào bằng
xút làm tăng hiệu quả tách chiết (30% đôi vói trưòng hợp Chỉoreỉỉa, 50%
đối với Torula) nhưng lại phá huỷ lyzin, xystin và tryptophan, đồng thời
làm giảm giá trị sỏ dụng của protein.
Chính do những hạn chế kể ra ở trên mà phương pháp enzym có
nhiều triển vọng. Trước hết cần có enzym phá huỷ màng tế bào như là
xenlulaza khi xử lý tế bào tảo Scenedesmus obliquus. Tuy nhiên chỉ làm
giảm được xenluloza, trong khi màng tế bào Chlorophyceae còn chứa
nhiều thành phẫn khác nữa.
Cũng có thể sỏ dụng phương pháp tự phân hay là làm co nguyên
sinh. Trong phương pháp này, các enzym nội bào được sử dụng để phân
huỷ màng tế bào. Tuy nhiên cần thòi gian dài (12 - 14 giờ, ở 45 - 50°c,
pH 6,5), hiệu quả của quá trình chỉ đạt 50 — 60%. Trong trưòng hợp làm
co nguyên sinh chất, ngưòi ta bổ sung NaCl ỏ nồng độ cao 25%. Trong
thực tế người ta sử dụng phương pháp này để sản xuất cao nấm men.
Khi dùng axit mạnh (HCl)'để thuỷ phân, sẽ phá huỷ tryptophan và
làm giảm hàm lượng một số amino axit khác. Một lượng lớn clorua natri
sẽ được tạo thành sau khi trung hoà, sẽ làm hạn chế giá trị sử dụng của
sản phẩm. Đồng thồi cần thực hiện thêm các công đoạn phức tạp để tách
riêng các amino axit.
Kỹ thuật khác được áp dụng trong việc xử lý tế bào là nghiền tế bào
bằng bi thuỷ tinh, bằng sóng siêu âm, bằng cách đưa dịch huyền phù tế
bào vào ống hẹp, dưới áp suất lổn. Trong trường hợp sau cùng, các tế bào
có thể được làm lạnh trước đến -25°c, sau đó dùng áp suất 4.000kg/cm2.
Vì cần loại bỏ nước khỏi dịch tế bào trước quá trình phá vd tế bào theo
cách này, cho nên tốn nhiều chi phí (dịch huyền phù ban đầu chỉ có 10 %
khối lượng chất khô). Sau khi xỏ lý, khả năng tiêu hoá protein tăng lên,
do nitơ trong màng tế bào không bao giò sử dụng được.
Trong số các kỹ th u ật rẻ tiền, sử dụng phương pháp hấp dưới áp
suất đối với tẳo, hay tách nưóc tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, làm
tăng giá trị dinh dư3ng, do phá võ được một phần tế bào. Một phương
pháp mới hiện nay cho phép thu nhận được một sản phẩm tế bào nấm
men chứa 1 —5% nước, 7 —15% chất béo, có vị dễ chịu, khả năng tiêu
hoá được là 82%. Nhưng vấn đề còn lại là cần loại bỏ bốt axit nucleic
trong sản phẩm, vì trong tế bào vi sinh vật, hồm lượng axit nucleic
chiếm khoảng 8 - 25% khối lượng protein, vượt quá xa so với hàm lượng
axit này có trong gan (4g/100g protein). Các axit nucleic này, sau khi

294
tiêu hoá, dưói tác dụng của enzym nucleaza pancreatic, rồi bị thuỷ phân
thành các nucleozit nhò các enzym được tiết ra từ thành ruột. Khoảng
70 - 80% protein tổng sô' là các amino axit, phần còn lại là axit nuleic.
Hàm lượng axit nucleic thưòng cao ở nguồn protein của tất cả các sinh
vật phát triển nhanh.
Đối với nấm men được nuôi trên môi trường dầu mỏ hay là n-alkan
protein đơn bào có thể chứa các chất gây ung thư. Do vậy, cần nghiên
cứu loại bỏ các hợp chất này trước khi dùng nguồn protein vi sinh vật để
làm thức ãn cho động vật.
8.7.2. Vấn để môi trường và bảo vệ môi trường trong sản xuấỉ protein
Trong sản xuất protein đơn bào, phần lớn cơ chất là sản phẩm nông
nghiệp hoặc phế phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm. Mặt
tích cực là tận thu các sản phẩm tạo nguồn protein có giá trị cao và cũng
là biện pháp giảm thiểu chất thải bảo vệ môi trưòng. Ngưòi ta sử dụng
nước thải của nhà máy chế biến tinh bột, nhà máy đường giàu chất hữu
cờ để sản xuất sinh khối vi sinh vật hay sử dụng nước thải của cơ sở chế
biến rác thải để sản xuất sinh khối tảo.
Ngày nay, nhiều cơ sở sản xuất sinh khối tảo không những làm thức
ăn cho tôm cá, cách làm như vậy một mặt nhằm aản xuất sinh khối, mặt
khác lại trực tiếp làm sạch môi trưòng sống.
Tuy nhiên, cũng giông như quá trình sản xuất enzym từ vi sinh vật,
các cơ sở sản xuất cũng dễ phát sinh chất thải và nước thải gây ô nhiễm
môi trường. Điều quan trọng của việc kiểm soát môi trường trong cơ sở
sản xuất là phải xác định được các nguồn phát sinh và đặc tính của
chúng để từ đó chọn các biện pháp ngân ngừa, giảm thiểu và xử lý nưóc
thải cho phù hợp.
Ngoài những cơ sô sản xuất protein đơn bào từ các nguồn dầu mỏ
hoặc gỗ thải phải sử dụng hoá chất để xử lý trước khi lên men, thì chất
thải và nước thải của quá trình sản xuất protein đơn bào giàu chất hữu
cơ và không độc hại. Chất thải và nước thải có thể xử lý bằng biện pháp
sinh học.
Tùy thuộc quy mô sản xuất của các cơ sỗ sản xuât, chất thai có thê
xử lý bằng phương pháp ủ hiêu khí hay kỵ khí đê sử dụng làm phân bón
hữu cơ hay làm thức ăn gia súc, còn nước thải được xử lý băng phương
pháp sục hiếu khí (quá trình bùn hoạt tính), phương pháp lọc sinh học,
phương pháp ao hồ ổn định hay phương pháp lên men kỵ khí (bể biogas),

295
nhưng phương pháp thường sử dụng nhất là phương pháp sục hiếu khí
(bùn hoạt tính), bùn thải có thể sử dụng làm phân bón hữu cơ.

CÂU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG 8

1. Hãy cho biết th ế nào là nấm men thực phẩm.
2. Hãy trình bày quy trình thu hồi nấm men từ quy trình sản xuất
thực phẩm.
3. Nêu sự giông và khác nhau giữa quy trìn h th u n hận nấm men
của quá trìn h sản xuất thực phẩm và quy trìn h nuôi cấy sản xuất
nấm men.
4. Hãy trìn h bày sơ đồ và quy trình công nghệ sản xuất nấm men
thực phẩm.
5. Vì sao lại phải xử lý nấm men trong quá trình sản xuất nấm men
thực phẩm?
6. Hãy trình bày quá trình thu nhận sinh k h ổ nấm men từ cacbuahydro.
7. Sản phẩm nấm men gia súc và nấm men từ cacbuahydro dầu mỏ có
đặc điểm gì khác nhau?
8. Những ứng dụng của nấm men trong công nghiệp thực phẩm.
9. Vì sao lại phải quan tâm đến an toàn khi sử dụng nấm men thực phẩm?
10. Vì sao lại phải quan tâm đến môi trường và bảo vệ môi trường trong
sản xuất protein đơn bào?

296
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Nasseri A.T., s. Rasoul —Amini, M.H. Morowvat and Y. Ghasemi.

Single Cell Protein: Production and Process. American Journal of
Food Technology, 6 : 103 n-116, 2011.
2 Andrés Illanes (ed.). Enzyme Biocatalysis - Principles and Applications
Springer, 2008.
3. Becker, E.W., Microalgae, Biotechnology and Microbiology.
Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1994.
4. Buchholz K., V. Kasche, u . T. Bomscheuer, Biocatalysts and
Enzyme Technology, WILEY - VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,
Weinheim, 2005.
5. Buchholz K., V. Kasche, u . T. Bornscheuer. Biocatalysts and Enzyme
Technology, WILEY - VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim,
2005.
6. Chaplin, M. and Bucke, c. Enzymes and Enzyme Technology,
Cambridge University Press, 1990.
7. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/filtration.html, Martin
Chaplin. Enzyme Technology, 2004.
8. John M. Walker. The protein protocols handbook, Humana Pres,
2002.
9. Josse M. Guisan, Immobilization o f Enzymes and Cells, Second
Edition, Hum ana Press Inc., Totowa, New Jersey, 2006.
10. Lê Gia Hy, Giáo trình Công nghệ vi sinh vật xử lý chất thải, NXB
Giáo dục Việt Nam, 2010.
II. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng.
Enym vỉ sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2002.
12. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa. Công nghệ sinh học, Tập
ba: Enzyme và ứng dụng, NXB Giáo dục , 2007.
13. Protein purificatwn handbook, Edition AB 18 —1132 —29. Amersham
Pharm acia Biotech AB, Uppsala. 1999.
14. Romanius, Andreas Sebatian, Risbel, Bettina R. Bioco.to.lySIS —
Fundamentals and Applications, Wiley - VCH, 2004.

297
 MỤC LỤC

Lời mỏ đ ầ u ..........................................................................................................3
Phẩn thứ nhất
ENZYM VÀ CÁC ỨNG DỤNG CỦA ENZYM
Chương 1
NHỮNG KHÁI NIỆM cơ BẨN VỂ ENZYM
1. 1 . Giới thiệu về enzym........ ..............................................................................5
1.2. Phát triển nghiên cứu và ứng dụng enzym trong các ngành
kinh tế quốc dân............................................................................................ 6
Câu hỏi ÔĨ1 tập chương 1 ......................................................................................16
Chương 2
SẨN XUẤT ENZYM TỪ THựC VẬT
2 .1 . Sản xuất enzym từ hạt nảy mầm (Malt)....................................................... 17
2.2. Sản xuất enzym thực vật khác......................................................................52
2.3. Các enzym thương mại có nguồn gốc thực vật, động vật
và hướng thay thế chúng bằng enzym vi sinh vật........................................ 60
2.4. Các enzym thương mại có nguồn gốc động vật
và hướng thay thế chúng bằng enzym vi sinh vật........................................ 62
Câu hỏi ôn tập chương 2 ..................................................................................... 64
Chương 3
CỒNG NGHỆ SẦN XUẤT ENZYM TỪ VI SINH VẬT
3.1. Nguồn enzym...............................................................................................65
3.2. Quy trình công nghệ lên men sản xuất enzym............................................. 70
3.3. Quy trình công nghệ lên men sinh tổng hợp enzyra......................................72
3.4. Quá trình thu nhận enzym từ vi sinh vật.....................................................85
3.5. Tinh sạch enzym vi sinh vật.........................................................................94
3.6. Lập công thức và hoàn thiện chế phẩm enzym......................................... 105
3.7. Một số quy trình công nghệ lên men sản xuất enzym công nghiệp.............110
3.8. Tổng quí chung các công đoạn thu nhận enzym....................................... 113
Câu hỏi ôn tập chương 3 .................................................................................115
Chương 4
CỐ ĐỊNH ENZYM VÀ ỨNG DỤNG ENZYM c ố ĐỊNH
4.1. Giới thiệu chung về cô"định enzym.............................................................116
4.2. Các phương pháp cố định enzym................................................................ 121
4.3. Động học của enzym cố định...................................................................... 135
4.4. Các thiết bị phản ứng (bình phản ứng) chứa enzym cố định.....................139
4.5. Sủ dụng enzym cố định trong công nghiệp và y học....................................142
Câu hỏi ôn tập chương 4 ................................................................................... 148

298
 Chương 5
GIỚI THIỆU MỘT SỐ ENZYM CHỦ YÊU VÀ ÚNG DỤNG
5.1.Amylaza ........................................... 1QQ
5.2. Proteaza.............................. J 54
5.3. Pectinaza......................................... 157
5.4. Xerdulaza............................................ 100
5.5. Saccaraza và glucooxydaza............................... 162
5.6. Một sô enzym của hãng NOVO và ứng dụng của chúng................. 163
Câu hỏi ôn tập chương 5 ................................... 182
Chương 6
ỨNG DỤNG ENZYM TRONG CÔNG NGHIỆP THựC PHẨM
6.1. Tình hình ứng dụng enzym trong công nghiệp trên thế giối
và ở Việt Nam.......................................................................................... 184
6.2. Một số enzym quan trọng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm............186
6.3. ứng dụng enzym trong công nghiệp thực phẩm....................................... 198
6.4. Vấn đề môi trường và bảo vệ môi trường trong sản xuất và sử dụng
enzym trong công nghiệp thực phẩm........................................................ 222
Câu hỏi ôn tập chương 6 ..................................................................................227
Phẩn thứ hai
PROTEIN VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEIN
Chương 7
SẨN XUẤT ĐON BÀO (SCP)
7.1. Nguồn protein từ sinh khôi vi sinh vật.....................................................228
7.2. Nguồn protein từ vi sinh vật.................................................................... 239
7.3. Công nghệ sản xuất tảo............................................................................250
Câu hỏi ôn tập chương 7 .................................................................................260
Chương 8
SẦN XUẤT NẤM MEN CHO NGƯỜI VÀ GIA s ú c
8 .1. Khái niệm về nấm men sử dụng trong thực phẩm cho người,
động vật và trong công nghiệp thực phẩm................................................ 261
8.2. Nâm men thực phẩm thu hồi từ các quá trình sản xuất thực phẩm..... . 262
8.3. Nấm men nuôi cấy cho sản xuất ỏ nhà máy thực phẩm............................. 265
8.4. Nấm men thực phẩm................................................................................269
8.5. Nấm men gia súc......................................................................................278
8 .6 . Sự da hình thái của nấm men................................................................... 286
8.7. Vấn đề môi trường và bảo vệ môi trường trong sản xuất protein...............292
Câu hỏi ôn tập chương 8 .................................................................................296
Tài liệu tham khảo.......................................................................................297
Mục lục.......................................................................................................... 298

299
 Chịu trách nhiệm xuất bản:
Chủ tịch Hội đồng Thành viên kiêm Tổng Giám đốc NGÔ TRẦN ÁI
Tổng biên tập kiêm Phó Tổng Giám đốc NGUYỄN QUÝ THAO

Tổ chức bản thảo và chịu trách nhiệm nội dung:

Phó Tổng biên tập NGUYỄN VĂN T ư
Giám đốc Công ty CP Sảch ĐH-DN NGÔ THỊ THANH BÌNH

Biên tập nội dung: NGUYỄN HỐNG ÁNH

Biên tập mĩ thuật: XUÂN DŨNG
Thiết kẹ sách: KIM DUNG
Trình bày bìa: ĐINH XUÂN DŨNG
Sửa bản in: NGỤVỄN HỔNG ẢNH
C hế bằn: TRỊNH THỤC KIM DUNG

Công ty CP sách Đại học - Dạy nghể, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam
giữ quyển công bố tác phẩm.

CỒNG NGHỆ SẢN XUẤT

ENZYM, PROTEIN VÀ ỨNG DỤNG

M ã số: 7K918Y2 - DAI

Số đăng kí KHXB : 172 - 2012/CXB/28 - 144/GD.
In 700 cuốn (QĐ in số : 12), khổ 16 X 24 cm.
In tại Xí nghiệp in - NXB Lao động xã hội.
In xong và nộp lưu chiểu tháng 3 nãm 2012.