Professional Documents
Culture Documents
ELIMINASI Cymbidium Mosaic Virus PADA Plbs ANGGREK Ribavirin
ELIMINASI Cymbidium Mosaic Virus PADA Plbs ANGGREK Ribavirin
MELISSA SYAMSIAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Eliminasi Cymbidium mosaic virus
pada Plbs Anggrek Dendrobium Menggunakan Zat Antivirus Ribavirin adalah
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Melissa Syamsiah
NIM G851090031
ABSTRACT
Orchid is an ornamental plant that has a fairly high level of demand and
ranked first compared to other ornamental plants. The beauty of orchid plants can
be reduced if infected by pathogenic virus like Cymbidium mosaic virus (CyMV).
CyMV is the one of the dominant pathogen infecting orchid plant in the world.
Detection of CyMV infection can be performed by DAS-ELISA (Double
Antibody Sandwich - Enzyme Linked Immunosorbent Assay) method. To further
confirm, it can be distinguished the pattern of CyMV protein bands by using
composite gel electrophoresis method. The aims of this study to determine the
optimum concentration of Ribavirin antiviral agent on CyMV elimination in
Dendrobium Jayakarta protocorm-like bodies (plbs) and to distinguish the patterns
of protein bands of healthy Dendrobium plants or CyMV free plbs and the
infected ones. Stages of this study included to detect CyMV in Dendrobium plbs,
infected plbs propagation in Vacin and Went liquid media, to eliminate CyMV by
Ribavirin antiviral treatments in six concentrations (0, 10, 20, 30, 40 and 50 ppm)
arranged in Randomized Completely Design with three replications and to
distinguish the CyMV protein banding pattern by using composite gel
electrophoresis method. The results of this study showed that CyMV was
eliminated by Ribavirin in D. Jayakarta plbs. The optimum concentration of
Ribavirin to eliminate 100% CyMV without growth inhibition of the plbs was 30
ppm. The result of CyMV protein banding pattern analysis by composite gel
electrophoresis method showed that CyMV infected plant and plbs had one band
with molecular weight approximately 28 kDa. There was no band on healthy or
CyMV free Dendrobium plant and D. Jayakarta plbs.
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ELIMINASI Cymbidium mosaic virus PADA Plbs ANGGREK
DENDROBIUM MENGGUNAKAN ZAT ANTIVIRUS
RIBAVIRIN
MELISSA SYAMSIAH
Tesis
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Judul Tesis : Eliminasi Cymbidium mosaic virus pada Plbs Anggrek
Dendrobium Menggunakan Zat Antivirus Ribavirin
Nama : Melissa Syamsiah
NIM : G851090031
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. Ir. Yoyo Sulyo, M.S.
Ketua Anggota
Diketahui
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah berjudul
Eliminasi Cymbidium mosaic virus pada Plbs Anggrek Dendrobium
Menggunakan Zat Antivirus Ribavirin. Kegiatan Penelitian ini dilakukan mulai
bulan Desember 2010 hingga April 2011 di Laboratorium Virologi Balai
Penelitian Tanaman Hias Segunung, Pacet, Kabupaten Cianjur.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Dr. drh. Maria
Bintang, MS dan Ir. Yoyo Sulyo, MS. yang telah memberikan bimbingan dan
arahan selama berlangsungnya penelitian serta dalam penyusunan karya ilmiah.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
selaku penguji luar komisi yang telah memberikan masukan dan saran dalam
penulisan tesis. Terima kasih penulis ucapkan juga kepada Bapak (Almarhum),
Mamah, Suami, Teteh, adik-adik, keluarga dan rekan-rekan yang tidak dapat
dituliskan satu persatu yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan doa
kepada penulis dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima
kasih penulis tujukan kepada Peneliti dan staf Laboratorium Virologi BALITHI,
Erniawati Diningsih, S.Si., M.Si., Laely Qodryah dan Jane Permata Sari atas kerja
samanya.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang terdapat dalam tulisan
ini. Namun demikian penulis harapkan semoga penelitian ini bermanfaat.
Melissa Syamsiah
RIWAYAT HIDUP
Halaman
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Latar Belakang
Tanaman tahunan atau tanaman yang diperbanyak secara vegetatif seperti
kentang, strawberry dan tanaman hias selama pertumbuhan dan perkembangannya
di lapangan tidak terlepas dari organisme pengganggu tanaman baik hama
maupun penyakit, termasuk penyakit yang disebabkan oleh virus. Menurut Bos
1983 dalam Muis 2002, virus mempunyai pengaruh yang bermacam-macam
terhadap tanaman, karena virus mempunyai daya tular yang tinggi sehingga
infeksinya pada tanaman budidaya berlangsung cepat dan dapat mencapai tingkat
epidemi.
Salah satu tanaman hias yang banyak terserang virus adalah tanaman
anggrek. Anggrek merupakan komoditas hortikultura yang banyak diminati
masyarakat karena memiliki variasi warna dan bentuk bunga yang indah. Daerah
sentra produksi anggrek di Indonesia adalah Jawa Barat, DKI Jakarta, Jawa
Tengah, Jawa Timur dan Bali. Permintaan anggrek banyak digunakan untuk
berbagai keperluan seperti upacara keagamaan, hiasan dekorasi ruangan, ucapan
selamatan serta ungkapan duka cita (Pranata 2007). Pada saat ini anggrek yang
dominan diminati masyarakat adalah jenis Dendrobium (34%), Oncidium Golden
Shower (26%), Cattleya (20%) dan Vanda (17%) serta anggrek lainnya (3%)
(BPTP 2005).
Ketersediaan benih tanaman anggrek berasal dari produksi dalam negeri dan
impor. Untuk benih anggrek diimpor dari luar negeri pada tahun 2005 sebesar 4,7
juta benih kemudian menurun pada tahun 2006 menjadi 2,9 juta dan tahun 2007
menjadi 2,7 juta benih. Menurunnya impor benih anggrek disebabkan karena
adanya peningkatan produksi benih anggrek di dalam negeri yaitu pada tahun
2005 dari 2,2 juta benih menjadi 10,2 juta benih pada tahun 2006, dan di tahun
2007 menjadi 11,2 juta benih (Dirjen Hortikultura 2008). Selain untuk memenuhi
kebutuhan anggrek dalam negeri, Indonesia juga mengekspor tanaman anggrek ke
beberapa Negara seperti Jepang, Belanda dan Amerika (Dirjen Hortikultura 2008).
Pada perdagangan internasional sebenarnya tidak ada aturan baku mengenai
standar mutu, akan tetapi lebih tergantung pada perusahaan pengimpor dari
Negara tujuan ekspor. Negara-negara tujuan ekspor memberikan syarat harus
2
bebas dari organisme pengganggu tanaman (OPT) baik berupa hama, penyakit,
maupun gulma, sedangkan perusahaan pengimpor menghendaki standar mutu
yang lebih dikaitkan dengan harga. Rendahnya standar mutu yang berorientasi
harga tanpa mempertimbangkan standar mutu yang berorientasi bebas dari OPT
akan memberikan dampak negatif bagi plasma nuftah Indonesia.
Tanaman hias ataupun tanaman tahunan dan tanaman yang diperbanyak
secara vegetatif jika terserang virus akan menyebabkan bibitnya menjadi tidak
vigor (Pearson&Cole 1991). Keindahan tanaman anggrek pun dapat berkurang
apabila tanaman tersebut terinfeksi virus patogen. Diantara patogen tersebut yang
paling banyak menimbulkan kerugian adalah Cymbidium mosaic virus (CyMV)
dan Odontoglosum ringspot virus (ORSV), disebutkan pula bahwa infeksi CyMV
memberikan pengaruh yang lebih berat dibandingkan dengan infeksi ORSV
(Pearson&Cole 2008). Hasil penelitian Tanaka et al. (1997) menunjukan bahwa
beberapa kultivar anggrek di Thailand terinfeksi Cymbidium mosaic virus
(CyMV) yaitu pada anggrek Denrobium (65.7%), Cattleya (45.5%), Oncidium
(35%), Phalaenopsis (25%) dan Vanda (51%).
Penyakit tanaman anggrek yang disebabkan CyMV pertama kali
diidentifikasi pada tahun 1950 oleh Jensen di California (ICTVdB 2002). Secara
etiologi agen diidentifikasi sebagai virus yang dinamai CyMV. Sejak itu CyMV
dilaporkan keberadaannya di beberapa Negara penghasil bunga potong di Eropa,
Aurstralia, Amerika, Afrika dan Asia. CyMV merupakan virus yang termasuk
family Flexiviridae dan genus Potexvirus (Gara et al. 1996). Gejala yang
ditimbulkan oleh CyMV pada tanaman anggrek adalah terjadinya nekrosis (bintik-
bintik, garis-garis atau lingkaran-lingkaran) pada tanaman, virus tersebut umum
ditemukan pada tanaman anggrek yang dibudidayakan, hal ini disebabkan virus
tersebut dapat ditularkan melalui alat-alat pertanian, seperti gunting dan pot yang
terkontaminasi dan tidak ditularkan oleh serangga ataupun biji (Wisler 1989).
Anggrek yang terserang CyMV harus dibebaskan, karena akan
mempengaruhi nilai estetika yang rendah, sehingga merugikan dalam sistem
ekspor anggrek ke luar negeri. Pembebasan virus pada tanaman dapat dilakukan
dengan berbagai cara misalnya, thermotherapy, meristem – tip culture dan
kemoterapi atau penambahan bahan kimia antivirus (Walkey 1985).
3
kedua virus ini dapat menginfeksi tanaman anggrek. Dari hasil elektroforesis ini
dapat dilihat perbedaan pola pita proteinnya, serta dapat ditentukan juga bobot
molekul (BM) dari CyMV tersebut. Hasil penelitian Morreira et al. (1998)
menunjukkan bahwa BM CyMV yang menginfeksi anggrek Phaius tankervilliae
adalah sekitar 28 kDa. Begitu pula untuk anggrek Dendrobium yang terinfeksi
CyMV menunjukan bobot molekul yang sama yaitu sekitar 28 kDa (Khalimi
2008).
Rumusan Masalah
Ribavirin telah diketahui dapat menghilangkan atau mengeliminasi
Cymbidium mosaic virus (CyMV) pada anggrek dengan perlakuan konsentrasi
tertentu. Namun sampai saat ini, hasil penelitian mengenai kajian eliminasi CyMV
pada anggrek Dendrobium menggunakan zat antivirus Ribavirin belum banyak
dilakukan dan belum mendapatkan hasil eliminasi yang cukup besar.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi optimum zat
antivirus Ribavirin dalam eliminasi CyMV pada protocorm like bodies (plbs)
anggrek Dendrobium. Membedakan pola pita protein tanaman anggrek
Dendrobium yang sehat atau bebas CyMV dengan tanaman yang sakit (terinfeksi
CyMV).
Hipotesis
Hipotesis penelitian ini adalah zat antivirus Ribavirin dengan konsentrasi
optimum dapat mengeliminasi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium. Selain itu
konsentrasi optimum Ribavirin tidak mengganggu pertumbuhan plbs anggrek
Dendrobium. Serta pola pita protein tanaman anggrek Dendrobium yang sehat
atau bebas CyMV dapat dibedakan dengan tanaman dan plbs yang sakit (terinfeksi
CyMV).
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai
perlakuan konsentrasi terbaik penambahan Ribavirin terhadap eliminasi
Cymbidium mosaic virus (CyMV) pada plbs anggrek Dendrobium. Plbs yang
telah bebas CyMV dapat menjadi bibit unggul untuk perbanyakan selanjutnya.
5
TINJAUAN PUSTAKA
sifat tumbuh anggrek dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu epifit, semi
epifit, terrestrial dan semi terrestrial (Pranata 2007).
Tanaman akan terangsang berbunga apabila terdapat perbedaan yang cukup
antara suhu pada siang hari dengan penurunan suhu pada malam hari. Anggrek
yang hidup di dataran tinggi membutuhkan suhu malam berkisar 13 – 18 oC dan
suhu siang 18 – 21 oC sedangkan anggrek yang hidup di dataran rendah
membutuhkan suhu malam berkisar 21 – 27 oC dan suhu siang 27 – 32 oC. Pada
umumnya anggrek membutuhkan kelembaban udara yang tinggi berkisar 60 –
80% (BALITHI 2003).
envelope dan mempunyai titik inaktivasi 60-70 oC selama 10 menit serta dapat
bertahan pada cairan perasan tanaman selama 25 hari pada suhu ruang dalam
kondisi in vitro. Genom CyMV merupakan ssRNA linear dan berukuran 8,1 kb.
Genom CyMV pertama kali diisolasi oleh Frowd dan Tremaine (1977) dan
mempunyai komposisi basa G 21.1%, A 28.9%, C24,4% dan U 25,6%.
Ribavirin dapat menghambat replikasi RNA dan DNA virus. (Wu et al.
2003) (Gambar 2). Ribavirin juga dapat digunakan sebagai obat pada manusia,
Ribavirin tersedia dalam bentuk tablet, spray (semprot), dan suntikan. Pada
penderita hepatitis C, Ribavirin biasanya ditujukan sebagai terapi kombinasi
bersamaan dengan terapi interferon alfa. Efek samping pada penggunaan
Ribavirin spray adalah iritasi ringan pada mata, bersin-bersin dan kemerahan pada
kulit. Sementara terapi Ribavirin tablet dan injeksi dapat menimbulkan efek
samping berupa sakit kepala, gangguan saluran pencernaan, kaku badan, dan
mengantuk. Pemakaian jangka lama Ribavirin dapat menyebabkan anemia,
limfopenia serta berkurangnya pembentukan sel darah. Ribavirin ini tidak boleh
diberikan pada ibu hamil dan pasien hepatitis C dengan kerusakan ginjal (Wu et
al. 2003).
pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan
mulai berjalan dengan baik. g) Aklimatisasi, kegiatan memindahkan eksplan
keluar dari ruangan aseptik ke bedeng.
Keuntungan dari teknik kultur jaringan adalah 1. Bibit (hasil) yang didapat
berjumlah banyak dan dalam waktu yang singkat 2. Sifat identik dengan induk
3. Dapat diperoleh sifat-sifat yang dikehendaki 4. Metabolit sekunder tanaman
segera didapat tanpa perlu menunggu tanaman dewasa. Sedangkan kekurangannya
adalah bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara
luar. Bagi orang tertentu, cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit.
Membutuhkan modal investasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium
khusus), peralatan dan perlengkapan. Diperlukan persiapan sumberdaya manusia
yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat
memperoleh hasil yang memuaskan.
14
Metode Penelitian
Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium (Clark and Adam 1977)
Untuk mendapatkan plbs tanaman anggrek yang terinfeksi CyMV dilakukan
deteksi terhadap plbs yang sudah tersedia di Laboratorium Balai Penelitian
15
Tanaman Hias Segunung – Cianjur melalui teknik DAS ELISA. Plbs yang tidak
terinfeksi CyMV digunakan sebagai kontrol negatif, sedangkan plbs yang
terinfeksi digunakan sebagai kontrol positif dan sebagai materi yang akan diberi
perlakuan.
Analisis Statistika
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Percobaan Acak
Lengkap (RAL) satu faktor dengan enam perlakuan (konsentrasi Ribavirin 0, 10,
20, 30, 40 dan 50 ppm) dengan banyaknya ulangan tiga kali. Masing-masing botol
perlakuan berisi lima buah plbs. Parameter yang diamati adalah % Hidup dan
%Bebas CyMV.
Model Linear RAL Satu Faktor (Walpole, 1993) :
Y ij = μ + T i + εij
Yij = Respon pada perlakuan ke-i ulangan ke-j, dimana :
μ = Rata-rata Umum
Ti = Pengaruh perlakuan ke-i
Εij = Pengaruh galat percobaan
i = Perlakuan (konsentrasi Ribavirin 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm)
j = Ulangan
Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) pada
tingkat kepercayaan 95% dan taraf 0.05 serta uji beda nyata dengan uji Duncan.
17
ELISA. Namun demikian, metode ISEM memerlukan biaya dan peralatan yang
lebih mahal dibandingkan dengan metode DAS-ELISA.
Walaupun konsentrasi CyMV yang rendah dalam sampel plbs merupakan
faktor pembatas dalam penggunaan metode DAS-ELISA, metode tersebut masih
tetap dapat digunakan dan dijadikan dasar pertimbangan dalam deteksi cepat
keberadaan virus tersebut pada bagian tanaman. Pendekatan yang dapat dilakukan
dalam memproduksi tanaman anggrek bebas CyMV adalah pengujian periodik
dengan metode DAS-ELISA pada tahapan produksi tanaman.
Dari ketiga subkultur, eliminasi CyMV pada plbs anggrek D. Jayakarta yang
paling baik terdapat pada subkultur ketiga, pada konsentrasi zat antivirus
Ribavirin 10 dan 20 ppm menghasilkan persen bebas sebesar 33.33% selanjutnya
pada konsentrasi 30, 40 dan 50 ppm menghasilkan persen bebas sebesar 100%.
Setelah dilakukan dengan uji ANOVA yang menunjukan P value < 0.05 yang
artinya perlakuan Ribavirin dapat membebaskan CyMV. Setelah dilakukan uji
lanjut Duncan (α=0.05) variasi tersebut hanya berbeda nyata terhadap konsentrasi
perlakuan zat antivirus Ribavirin 0 ppm dengan persen bebas CyMV pada anggrek
D. Jayakarta sebesar 0% (Tabel 3).
Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa zat antivirus Ribavirin pada
taraf konsentrasi yang diuji memiliki aktivitas antivirus terhadap CyMV dengan
kemampuan eliminasi berkisar antara 33.33 - 100%. Berdasarkan hal tersebut
maka untuk mendapatkan tanaman anggrek yang bebas CyMV dengan jumlah
yang memadai, dapat dilakukan perbanyakan dengan menggunakan plbs yang
sudah bebas dari infeksi virus tersebut.
Tabel 3 Persen Bebas CyMV dalam plbs anggrek D. Jayakarta pada setiap
subkultur
Perlakuan/ % Bebas CyMV
Konsentrasi
subkultur 1 subkultur 2 subkultur 3
Ribavirin (ppm)
0 0a 0a 0a
10 0a 0a 33.33 ab
20 0a 0a 33.33 ab
30 0a 0a 100 b
40 0a 0a 100 b
50 0a 0a 100 b
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
pada taraf uji Duncan 5%
95% planlet tanaman anggrek bebas virus dapat diperoleh setelah melakukan
subkultur sebanyak lima kali ke dalam media padat yang sama yang mengandung
Virazole 25 ppm, dan subkultur dilakukan setiap 18 hari. Sedangkan hasil
penelitian ini pada konsentrasi Ribavirin 20 ppm dapat membebaskan CyMV
pada plbs anggrek D. Jayakarta 33.33% dan pada konsentrasi 30 ppm sebesar
100% hanya dengan 3 kali subkultur dan dengan perlakuan subkultur yang sama
yaitu setiap 18 hari. Sehingga hasil penelitian ini menunjukan hasil yang lebih
baik dibandingkan dengan yang dilaporkan Albouy (1996). Selain penggunaan zat
antivirus Ribavirin, Diningsih et al. (2010) melakukan penelitian eliminasi CyMV
pada anggrek D. Burana Stipe dengan Ribavirin. Hasil penelitiannya menunjukan
pada konsentrasi Ribavirin 40 ppm, plbs yang bebas virus sebesar 20% setelah
kultur selama 2 bulan. Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini, dimana pada
konsentrasi Ribavirin 40 ppm ternyata plbs yang bebas CyMV adalah eliminasi
yang sempurna sebesar 100% setelah dilakukan subkultur sebanyak 3 kali pada
media padat yang sama dengan subkultur dilakukan setiap 18 hari, bahkan dengan
pada perlakuan konsentrasi Ribavirin 20 ppm saja sudah dapat menghasilkan plbs
anggrek D. Jayakarta sebanyak 33.33% bebas CyMV. Perbedaan hasil ini bisa
disebabkan karena suplai nutrisi bagi pertumbuhan plbs juga mempengaruhi. Pada
penelitian yang dilakukan Diningsih et.al (2010) tidak dilakukan subkultur tetapi
langsung proses kultur selama 2 bulan, dimana dimungkinkan tidak ada
pembaruan pemberian nutrisi pada media yang menyebabkan absorpsi zat
antivirus menjadi terhambat dan tidak merata.
Hal ini disebabkan karena Ribavirin akan bekerja terhadap CyMV yang
terdapat dalam plbs tanpa mengganggu pertumbuhannya. Dimana mekanisme
kerjanya adalah dengan menghambat kerja RNA polimerase pada virus sehingga
sintesis RNA menjadi terhambat pula (Wu et al. 2003). Walaupun dari hasil
penelitian tampak ada sebagian kecil ulangan perlakuan Ribavirin pada plbs
anggrek D. Jayakarta yang menunjukan penurunan persen hidup menjadi 83.33 –
89.89% (Tabel 7), akan tetapi tetap masih menunjukan hasil yang tidak berbeda
nyata dengan perlakuan yang lainnya. Hal ini terjadi dimungkinkan karena ada
beberapa plbs anggrek D. Jayakarta yang daya tahannya menurun dan tidak
mampu beradaptasi dengan media yang mengandung Ribavirin, sehingga
26
M 1 2 3 4
45 kDa
14,4 kDa
Gambar 8 Hasil analisis pita protein CyMV dengan Elektroforesis Gel Komposit
M = Marker; (1) Tanaman anggrek Dendrobium positif terinfeksi CyMV; (2)
Tanaman anggrek Dendrobium negatif terinfeksi CyMV; (3) Plbs anggrek D.
Jayakarta positif terinfeksi CyMVdan (4) Plbs anggrek D. Jayakarta negatif/ bebas
CyMV (hasil perlakuan zat antivirus Ribavirin 30 ppm)
Hasil analisis bobot molekul (BM) dari data yang diperoleh pada penelitian
dengan metode Elektroforesis Gel Komposit menunjukkan bahwa bobot molekul
protein CyMV pada tanaman anggrek Dendrobium positif terinfeksi CyMV
adalah sekitar 28.85 kDa, sedangkan pada plbs anggrek D. Jayakarta positif
28
terinfeksi CyMV yang dipakai untuk perlakuan antivirus Ribavirin adalah sekitar
27.82 kDa (Tabel 9).
Bobot molekul tersebut diperoleh dari hasil estimasi kurva Log BM Marker
dengan Rm (Relative mobility) (Anderson et al. 1974, Plikaytis et al 1986) dimana
nilai Rm diperoleh dari hasil bagi jarak pergerakan protein dari tempat awal
dengan jarak pergerakan warna dari tempat awal (Boyer 2000). Hasil analisis BM
CyMV dapat dilihat pada Tabel 8 dan 9 serta kurva estimasinya pada Gambar 9.
Berdasarkan hasil elektroforesis diketahui pada kolom Marker terdapat lima
pita potein yang tampak. Kelima pita Marker yang tampak memiliki bobot
molekul 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 18.4 kDa dan 14.4 kDa (Tabel 8). Nilai bobot
molekul Marker yang dipakai berasal dari protein Ovalbumin (Chicken egg
white), Lactate dehydrogenase (porcine muscle), REase Bsp 9 8 1(E. Coli), β -
Lactoglobulin (Bovine milk), Lysozyme (Chicken egg white) (Fermentas 2004,
2005).
Log BM
1,8
1,6
1,4
y = -2,680x + 3,415
1,2 R² = 0,99
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0 Rm
- 0,50 1,00
Begitu pula dengan yang dilaporkan Khalimi (2008) dimana bobot molekul
CyMV yang menginfeksi daun tanaman N. benthamiana dengan metode SDS-
PAGE juga menunjukan hasil sekitar 28 kDa. Sedangkan hasil penelitian yang
lain, seperti yang dilaporkan Miin (2005) dan Han et al. (1999) bahwa bobot
molekul CyMV yang menginfeksi tanaman anggrek di Malaysia dan Korea
diestimasi sekitar 27.64 kDa. Serta hasil penelitian Gara et al. (1996) yang
menuliskan bahwa bobot molekul CyMV yang menginfeksi anggrek Vanda
adalah 27.8 kDa.
Tabel 9 Hasil analisis pita protein positif terinfeksi CyMV pada sampel
tanaman dan plbs anggrek Dendrobium
Jarak
Panjang
Sampel pita pada Rm Log BM BM
gel (mm)
gel (mm)
Tanaman
anggrek (+)
62 85 1.46 28.85
terinfeksi 0.73
CyMV
Plbs anggrek (+)
terinfeksi 62.5 85 1.44 27.82
0.74
CyMV
30
SIMPULAN
Protocorm like bodies (plbs) anggrek Dendrobium Jayakarta yang
digunakan untuk perlakuan eliminasi Cymbidium mosaic virus menggunakan zat
antivirus Ribavirin positif terinfeksi CyMV. Konsentrasi optimum Ribavirin
paling baik untuk eliminasi CyMV pada plbs anggrek D. Jayakarta sebesar 30
ppm setelah dilakukan tiga kali subkultur (masing-masing subkultur dilakukan
selama 18 hari) dengan plbs bebas CyMV 100%. Konsentrasi optimum Ribavirin
30 ppm tidak mengganggu pertumbuhan plbs anggrek D. Jayakarta. Analisis pita
protein CyMV pada tanaman anggrek Dendrobium dan plbs anggrek D. Jayakarta
dapat dilakukan dengan menggunakan metode Elektroforesis Gel Komposit.
Tanaman anggrek Dendrobium dan plbs anggrek D. Jayakarta yang sakit atau
positif terinfeksi CyMV memiliki pita protein dengan ukuran BM sekitar 28 kDa.
Tanaman anggrek Dendrobium yang sehat maupun plbs anggrek D. Jayakarta
yang telah bebas CyMV hasil perlakuan zat antivirus Ribavirin 30 ppm tidak
memiliki pita protein dengan ukuran BM sekitar 28 kDa.
SARAN
Eliminasi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium dapat menggunakan zat
antivirus Ribavirin 30 ppm. Deteksi dan analisis protein CyMV pada tanaman
anggrek maupun plbs anggrek Dendrobium dapat menggunakan teknik
Elektroforesis Gel Komposit. Plbs anggrek D. Jayakarta yang telah bebas CyMV
dapat diperbanyak untuk penyediaan benih anggrek Dendrobium Jayakarta bebas
CyMV.
31
DAFTAR PUSTAKA
Burgess GW. 1995. Prinsip dasar ELISA dan variasi konfigurasinya, teknologi
ELISA dalam diagnosis dan penelitian GW. Burgess (Ed) Wayan T. Ariana
(terjemahan). Gajahmada University Press. Yogyakarta.
Cassells AC and Long RD. 1980. The regeneration of virus-free plant from
Cucumber mosaic virus and Potato virus Y infected tobacco explants cultured
in presence of virazole. Biochemistry and physiology of plant. 173.
Chang CA, Lin MC, and Chen CC. 2004. Improvement of virus indexing ang
elimination techniques for the certification of Oncidium seedlings. Dept. of
plant pathology, Taiwan Agricultural Research Institute. Taiwan
32
Frowd, JA and Tremaine, JH. 1977. Cymbidium mosaic virus genomic RNA.
Phytopathology 67:43.
Gomez KA and Gomez AA. 1976. Statistical procedures for agricultural research
with emphasis on rice. The International Rice Research Institute. Philippines.
Han JH, Joon LY, Ho LC. 1999. Use of triton X-100 and sephacryl S-500 HR for
the purification of Cymbidium mosaic virus from Orchid plant. Plant
Pathology Journal 15:34-37.
Lim ST, Wong SM, Goh CJ. 2008. Elimination of Cymbidium misaic virus and
Odontoglossum ringspot virus orchids by meristem culture and thin section
culture with chemotherapy. Annal of applied biology 122 (2) : 289 – 297.
Miin DOJ. 2005. Screening of a random peptide library with CyMV for potesial
development of diagnostic kits. Malaysia: Malaysia University of Science and
Technology.
Muis A. 2002. Sugarcane mosaic virus (SCMV) penyebab penyakit mosaik pada
tanaman jagung di Sulawesi. Jurnal Litbang Pertanian, 21(2).
Pearson MN and Cole JS. 2008. The effects of Cymbidium mosaic virus and
Odontoglossum ringspot virus on the growth oh Cymbidium orchids. J
Phtopathology 119 (3) : 193 – 197.
Plikaytis BD, Carlone GM, Edmons P and Mayer LW. 1986. Robust estimation of
standard curves for protein molecular weight and liniear duplex DNA base
pair number after gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 152 : 346-364
Sherpa AR, Hallan V, Pathak P, Zaidi AA. 2007. Complete nucleotide sequence
analysis of Cymbidium mosaic virus Indian isolate: futher evidence for natural
recombination among potexviruses. Journal Bioscience 32 : 663-669
Sutula CL, Gillet GM, Morrisey SM and Ramsdell DC. 1986. Interpreting ELISA
Data and Establishing The Positive-Negative Threshold. Plant Disease.
Journal of the American Phytopathological Society. Volume 70, Number 8 :
722-726.
Tanaka S, Nishii H, Ito S, Iwaki MK. 1997. Detection of Cymbidium mosaic virus
and odontoglossum ringspot tobamovirus from Thai orchids by rapid
Immunofilter Paper Assay. Plant disease 81: 167-170
35
Triwanto, J. 1998. Konsentrasi larutan pupuk daun pyponex dan macam media
tumbuh pada bibit anggrek cattleya. Tropica 6: 203-209.
Walkey, D. 1985. Applied Plant Virology. John Waley& son. New York.
Wisler GC. 1989. How to control orchid viruses : the complete guide book. USA:
Maupin House Publisher.
LAMPIRAN
37
Nilai toksisitas Non-Manusia : Rat LD50 oral 5,3 g / kg; Mouse LD50 oral 2 g /
kg; Ip Mouse LD50 0,9-1,3 g / kg; LD50 ip rat 2 g / kg.
Formula molekul : C 8 -H 12 -N 4 -O 5
Bobot molekul : 244.20
Warna / Bentuk : Tanpa warna/ Kristal putih bubuk
Bau : Tanpa bau
Rasa : Hambar
Melting Point : 166-168 oC (aq etanol); 174-176 oC (etanol).
Kelarutan : Larut air, Sedikit larut dalam alkohol. Dalam air, 142 mg /
mL pada 25 oC
Spectral Properties : Khusus rotasi optik: -36,5 derajat di 25 oC / D
Fitotoksisitas : 100 ppm
38
Coating/lapisi lubang plate dengan antibody-anti CyMV (IgG) yang dicampur dengan
penyangga “coating” ( 1,59 g Na2CO3 + 2,93 g NaHCO3 + 0.20 g NaN3 + H2O s/d 1 Liter)
(1:200), tiap lubang sebanyak 100 µl.
Masukan sampel ke dalam lubang plate sebanyak 100 µl, posisi sampel disesuaikan
dengan format yang telah diisi sebelumnya
Inkubasi selama 1 malam pada suhu 4oC Cuci kembali dengan penyangga
atau 2jam pada suhu 37oC PBST 3 x 3 menit
Masukan antibody-anti CyMV (yang telah dilabel dengan enzim alkalin fosfatase) yang
dicampur dengan ECl (20% PBS 5 x 0,02% tween 20; 20% PVP; 0,20% BSA, H2O)
(1:200) sebanyak 100 µl
Inkubasi selama 1 malam pada suhu 4oC Cuci kembali dengan penyangga
atau 2jam pada suhu 37oC PBST 3 x 3 menit
Setelah terjadi perubahan warna menjadi kuning, hentikan reaksi dengan NaOH 3 M
sebanyak 25 µl
Ukur intensitas perubahan warna (kandungan virus) dengan menggunakan Elisa Reader
pada panjang gelombang 410 nm
40
dilakukan
3 kali
Lampiran 6 Pembuatan Media Vacin and Went (VW) Cair dan Padat
sebanyak 1 liter.
STOK A: STOK B:
STOK D:
STOK C: Ca3(PO4)2 0,2 gr
Na EDTA 37,5 mg; (dilarutkan dalam HCl 1 N)
FeSO4.7H2O 27,8 mg;
(dilarutkan dalam 20 ml
aquades steril panas)
Prosedur:
Pewarnaan dengan Amidobalck (0,1 g Amidoblack dilarutkan dalam 100 ml asam asetat 7%)
Lampiran 8 Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium untuk perlakuan zat
antivirus Ribavirin
subkultur 1
Source DF SS MS F P
konsentrasi ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * *
Error 12 0.0000000 0.0000000
Total 17 0.0000000
S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *%
subkultur 2
Source DF SS MS F P
konsentrasi ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * *
Error 12 0.0000000 0.0000000
Total 17 0.0000000
S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *%
subkultur 3
Source DF SS MS F P
konsentrasi ribavirin 5 22512 4502 5.30 0.008
Error 12 10194 850
Total 17 32707
0 1.28 a 0 a
10 1.28 a 0 a
20 1.28 a 0 a
30 1.28 a 0 a
40 1.28 a 0 a
50 1.28 a 0 a
0 1.28 a 0 a
10 30.43 ab 33.33 ab
20 30.43 ab 33.33 ab
30 88.72 b 100 b
40 88.72 b 100 b
50 88.72 b 100 b
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
50
Keterangan:
Transformasi menggunakan rumus
Nilai 0% disubstitusi dengan 1/(4n)
Nilai 100% disubstitusi dengan [100 - 1/(4n)]
n = banyaknya plbs per perlakuan
51
subkultur 1
Source DF SS MS F P
Konsentrasi Ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * *
Error 12 0.0000000 0.0000000
Total 17 0.0000000
S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *%
subkultur 2
Source DF SS MS F P
Konsentrasi Ribavirin 5 531 106 1.00 0.458
Error 12 1274 106
Total 17 1805
subkultur 3
Source DF SS MS F P
Konsentrasi Ribavirin 5 1268 254 1.33 0.315
Error 12 2282 190
Total 17 3550
Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan
tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%