SẮC KÝ PHÂN BỐ (L-LC)

+ Sắc ký lỏng lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt mang rắn.

+ sắc ký pha liên kết: Các hạt chất nhồi rắn được gắn kết với các nhóm hóa học có khả năng liên kết với
chất phân tích.

- Chọn pha động pha tĩnh :

+ PT, PĐ, Chất phân tích : dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan.
+ PĐ : trị số P
+ Chất phân tích: nhóm chức ( độ phân cực: HC phẳng< olefin< HC thơm < dẫn chất halogen <
sulfid < ete< dẫn chất nitro < este = aldehyd = ceton < alcol = amin < sulfoxid < amid < acid
carboxylic < nước)
- Để tách sắc ký có 2 nguyên tắc:
1. Độ phân cực chất phân tích với độ phân cực PT và khác xa độ phân cực PĐ ( thành công hơn)
2. Độ phân cực chất phân tích hợp với độ phân cực PĐ và khác độ phân cực PT ( t R quá ngắn )
+ Thể tích ngoài cột ( thể tích chết): thể tích từ tiêm đến lúc phát hiện càng nhỏ , pic sắc ký
càng ít bị giãn -> detector các ống nối nhỏ đến mức có thể
+ Hệ số dung lượng K’ là thước đo thời gian lưu t R ( 1<=k<=5), độ phân giải 2 pic cạnh nhau
R>= 2, hệ số 0,9 <=AF<= 1,5
- Đặc tính của silicagel biến tính:
1. Thường chỉ 50% nhóm Si-OH phản ứng với hợp chất Clorosilan còn 50% nhóm –OH vần còn
trên bề mặt hạt silicagel
+ nếu chạy SK phân bố pha đảo : các nhóm silanol Si-OH ( mang tính phân cực) sẽ lưu giữ các
chất phân cực gây hiện tượng kéo đuôi.
+ Để hạn chế ảnh hưởng nhóm –OH -> khóa các nhóm này bằng cách
2. Silicagel pha liên kết chỉ bền trong vùng Ph = 2-8. Nên pha động chỉ pha trong vùng p H NÀY.
+ p H < 2 : Liên kết Si-R dễ bị thủy phân thành Si-OH
+ p H >8: Nền silica sẽ bị thủy phân.
 Pha tĩnh phân cực: - (CH2)2-NH2 ( Amino), -(CH2)2-CN ( Cyano), -(CH2)2-O-CH(OH)-CH2OH (
Diol)
 Pha tĩnh không phân cực : -(CH2)17-CH3 ( ODS (C18) : Octadecyl siloxan), -(CH2)7-CH3 (OS (C8):
Octa siloxan), -C6H5 (Phenyl siloxan ).
 Pha động:
+ Dung môi không phân cực: n-hexan, Benzen, metylen clorid
+ Dung môi phân cực trung bình : Tetrahydrofuran, ethyl acetat, cloroform, aceton, ethanol.
+ Dung môi phân cực mạnh: Acid acetic, Acetonitril, Methanol, N-NƯỚC
- Chất phân tích :
Độ phân cực của chất phân tích :
 Dựa vào khung hóa học:
+ Khung carbon càng dài, càng cồng kềnh càng kém phân cực
+ Hydrocarbon mạch thẳng kém phân cực hơn hydrocarbon thơm.
 Dựa vào nhóm chức:
+ Độ phân cực của nhóm chức hữu cơ tăng dần theo thứ tự:
 + Dẫn chất halogen < sulfid < ether < dẫn chất nitro < ester aldehyd ceton < alcol = amin < sulfon
< sulfoxid < amid < acid carbonxylic < nước.
+ Các nhóm chức có nguyên tử mang điện âm : O,N,S,F,Cl… như –OH, -CO, -NO2, -NH2, -COOH,
.. Là nhóm phân cực
+ chất phân tích càng nhiều nhóm phân cực thì càng mạnh
+ Các chất phân cực thường tan trong nước và các dung môi phân cực.
 Chất không phân cực: các chất HC không chứa các nhóm phân cực hoặc 1 nhóm phân cực yếu
+ Chất không PC đều tan trong ete và các dung môi không phân cực
+ Ngược lại, không tan trong nước và các dung môi phân cực.
 Chất phân cực trung bình: là chất không ion hóa, có số mạch C <5, có 1 nhóm PC nhưng không
phải là PC mạnh
+ chất phân cực trung bình là chất vừa tan trong nước vừa tan trong ete.
 Nguyên tắc chọn pha tĩnh và pha động :
- Nếu có hỗn hợp chất phân tích ;
1. Dự đoán độ phân cực của từng chất trong hỗn hợp dựa vào cấu trúc hóa học.
2. Chọn pha tĩnh có độ phân cực gần với độ phân cực của các chất phân tích
3. Chọn pha động có độ phân cực khác xa với phân cực pha tĩnh
 Sắc ký pha thuận và pha đảo:
- Pha tĩnh lỏng phân cực : triethylen glycol, nước.
- Pha động lf dung môi ít phân cực hơn; hexan, iso propyl ether
 Sắc ký pha thuận
- Pha tĩnh không phân cực như hydrocarbon
- Pha động phân cực hơn pha tĩnh : nước, acetonitril.
- Loại sắc ký này với độ phân cực của pha tĩnh và pha động ngược với sắc ký pha thuận
 Sắc ký pha đảo.
 Tại sao thường sử dụng pha đảo:
1. Thuốc muốn được hấp thu thường phải đi qua màng sinh học ; màng này có lớp lipid
kép nên đa phần thuốc thường dạng thân lipid ( không phân cực ) dễ hấp thu.
2. Dung môi phân cực rẻ hơn và và ít độc hơn dung môi không phân cực.
 Hạn chế của sk pha đảo
- Không phân tích được các chất rất phân cực
- Hỗn hợp nhiều thành phần có cả chất phân tích phân cực và không phân cực
- Phải chạy cả sắc ký phân bố pha thuận và pha đảo
 Giải thích tại sao khi định lượng B1,B2,B6 thường cho Natri heptansulfonat vào trong pha động?

SẮC KÝ HẤP PHỤ HIỆU NĂNG CAO:

 Cơ chế tác động của SK hấp thụ:

- Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.
- Lưu giữ chất phân tích la do lực hấp phụ
1. Pha tĩnh;
a. Silicagel
+ Silicagel trần ( Silica) là chất hấp phụ thân nước
+ Khả năng hấp phụ của nó là do các nhóm hydroxyl ( -OH) trên bề mặt quyết định
+ Ổn định trong vùng PH hẹp 2-8
 b. Nhôm oxid ( aluminas)
+ Nhôm oxid ổn định trong vùng PH= 2-12
+ Aluminas có các dạng khác nhau:
Dạng base với giá trị PH LÀ 9-10 dùng tách các chất có tính base như : amin, acid amin
Dạng acid với PH = 4-4,5 dùng để tách các hợp chất có tính acid
Dạng trung tính với PH=7-8 dùng để tách các hợp chất hydrocarbon no, aldehyd. Ceton.
2. Pha động;
 Để rửa giải các chất đã bị hấp thụ, người ta dùng pha động có sức rửa giả phù hợp dựa vào hằng
số điện môi
 Trị số hằng số điện môi càng lớn, sức rửa giải càng mạnh
 Nếu pha động gồm nhiều dung môi, dựa vào phân số mol của từng dung môi để tính trị số hằng
số điện môi của hệ .
SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION HIỆU NĂNG CAO:
- Dựa vào lực hút ion chất tan và vị trí mang điện tích trên PT
- Chất trao đổi anion mang điện tích dương trên PT hút anion chất tan và ngược lại
- Là polymer không tan trong nước là nhựa trao đổi ion
- Nhựa trao đổi ion có nhóm amin, trao đổi base mạnh có nhóm amin bậc 4, base yếu có amin bậc
2,3
- Copolymer styren và divinylbenzen ( nhựa SDB) dùng phổ biến
 SẮC KÝ LỎNG –RẮN: còn gọi là sắc ký hấp phụ. Pha tĩnh trong trường hợp này là chất rắn trơ đối
với các chất phân tích. Hệ số hóa lý cho quá trình là hệ số hấp phụ. Ngày nay đã có những pha
tĩnh được thiết lập đa dạng hơn để đáp ứng hiệu quả tách
SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION: trong kỹ thuật này pha động là những dung dịch đệm, còn pha tĩnh là rắn
có cấu tạo bề mặt gắn những nhóm trao đổi ion. Quá trình tách theo kiểu này được đặc trưng
bởi hệ số phân bố ion.
SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ: pha tĩnh trong kỹ thuật này là những vật liệu trên đó có những lổ xốp.
kích thước lổ là yếu tố đặc trưng cho quá trình tách. Các phân tử có kích thước phù hợp với kích
thước lổ sẽ được lưu giữ trong cột lâu hơn. Tùy thuộc vào bản chất pha động là dung dịch hay
dung môi hữu cơ mà ta có sắc ký lọc gel và sắc ký thẩm gel. Trong kỹ thuật này hệ số phân bộ
được gọi là hệ số phân tán.
SẮC KÝ LỎNG-LỎNG: Pha tĩnh là lỏng được phủ lên vật liệu trơ hay xốp ( giống như chất mang).
Quá trình tách các chất dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai hai pha tĩnh và động ( đều là pha
lỏng ), nên hệ số đặc trưng cho quá trình là hệ số phân bố. kỹ thuật hiện nay ít được dùng vì pha
tĩnh dễ bị hòa tan, người ta còn gọi là hiện tượng chảy máu cột.
SẮC KÝ PHA LỎNG – LIÊN KẾT:
 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền -> sắc ký pha liên kết
 Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký
pha lỏng lỏng vì:
+ pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng –lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh
trong thời gian sử dụng và gây ô nhiễm với hợp chất phân tích
+ Do pha tĩnh của sắc ký lỏng –lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng
phương pháp rửa giải gradient dung môi.
 THEO HIỆN TƯỢNG SẮC KÝ:
1. SẮC KÝ HẤP PHỤ: (absorption chromatography) : pha tĩnh là một chất rắn có khả năng hấp
phụ, đó là các phương pháp sắc ký lỏng – rắn và khí – rắn
2. SẮC KÝ PHÂN BỐ: (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng không hòa lẫn được với
pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là giá hay chất mang và
phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bố gồm sắc ký lỏng – lỏng , sắc ký
khí – lỏng.
3. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION: (ion - exchange chromatography): Pha tĩnh là chất nhựa trao đổi ion
chớp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi ion với các ion cùng dấu của
dung dịch hỗn hợp sắc ký.
4. SẮC KÝ THEO LOẠI CỠ (size - exclusion chromatography): Còn gọi là sắc ký trên gel. Các phân
tử cỡ lớn sẽ được loạt các phân tử nhỏ hợn sẽ được tách theo kích thước do các phân tử
nhỏ di chuyển chậm hơn.

SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION:

 Sự trao đổi ion là sự gắn kết có tính chất thuận ngịch giữa các phân tử có mang điện tích. Trong
sắc ký cột nhồi, pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang điện tích. Giả sử cho đi ngang qua
cột một hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều loại chất tan khác nhau, chất tan nào có mang
điện tích ngược dấu với điện tích của nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan sẽ đuổi đối ion C ra
thế chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đó những
chất khác của hỗn hợp mẫu chất tan ban đầu sữ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột. kỹ thuật này
tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu.
RG- + S + --- => RG-S + + C
Trong đó R là pha tĩnh hay gọi là nhựa, G là nhóm chức mang điện tích được cố định trên pha
tĩnh hay còn gọi là nhóm chức hoạt động của nhựa. C là đối ion của G . S là chất hữu cơ có mang
điện tích trái dấu với G.
+ Các loại hạt nhựa trao đổi ion : nhựa polystyren, silicagel, polymer carbonhydrate.
 Các bước trong sắc ký trao đổi ion:
- Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột; giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột. Nhựa trao
đổi ion đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa và thể tích dung môi sao cho có thể
rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra các bọt khí nằm giữa các hạt nhựa. Để yên 5-10 phút cho
các hạt nhựa lắng xuống. Khi nhồi cột hoàn tất , cần cân bằng cột bằng cách tráng cho dung dịch
đệm chày qua cột, cuối cùng kiểm tra PH của dung dịch chảy ra khỏi cột.
- Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp vào cột, lọc bằng tờ
giấy lọc hay ngang qua một lớp celite. Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng troa
đổi của nhựa. Điều qua trọng nhất là làm sao để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất
được hấp thu hết vào nhựa , tức là chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích mẫu. Để nạp mẫu lên cột
: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại. Dùng
pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở
trên đầu cột. Để yên 10-20 phút để cho mẫu tiếp xúc cân bằng với nhựa.
- Khi tất cả mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua, nối
cột với bình cung cấp dung dịch giải ly.
- Giải ly bằng cách tăng dần nồng độ dung dịch giải ly : hỗn hợp mẫu đang gắn vào nhựa trao đổi
ion trong dung dịch đệm có nồng độ thấp. Để có thể tách mẫu chất ra khỏi nhựa thường cần
 phải gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cách thêm NaCl. Khi có thêm NaCl trong dung dịch
đệm, ion của dung dịch đệm sẽ cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhóm
chức hoạt động cầu nhựa, đẩy hợp chất ra khỏi nhựa, rồi theo dòng chảy đi ra khỏi cột.
- Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn điện tích nhất định,
những hạt này sẽ tương tác với các phân tử mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt
mang điện tích âm, tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì tương tác với những
phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương, gọi là sắc ký trao đổi
ion, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy
ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta
tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt
mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác
trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích
dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo
độ lớn về điện tích.

Phương pháp trao đổi ion: Để khử đi các tạp chất ở trạng thái ion trong nước, phương pháp
được dùng nhiều nhất là trao đổi ion. Phương pháp này có thể khử tương đối triệt để các tạp
 chất ở trạng thái ion trong nước. Phẩm chất nước thu được còn tốt hơn so với nước cất. Vì vậy,
đây là một giai đoạn xử lí nước rất cần thiết để cấp nước cho các nồi hơi. Phương pháp trao đổi
ion được sử dụng rộng rãi trong các quá trình xử lí nước thải cũng như nước cấp. Trong xử lý
caaso nước, pp trao đổi ion thường được sử dụng để khử các muối, khử cứng, khử khoáng, khử
nitrat, khử màu, khử kim loại và các ion nặng và các ion kim loại khác có trong nước. Nhược
điểm chính của phương pháp chi phí đầu tư và vận hành khá cao nên thường được sử dụng cho
các trường hợp chất lượng xử lý cao. Ưu điểm của phương pháp này là rất triệt để và xử lý có
chọn lựa đối tượng. thời gian sử dụng nhựa lâu dài, tái sinh được nhiều lần với chi phí thấp,
năng lượng tiêu tốn nhỏ… đặc biệt là phương pháp xử lý thân thiện với môi trường vì nó chỉ hấp
thu các chất sẵn có trong nước.
 Cơ sỏ của phương pháp : là quá trình trao đổi ion dựa trên sự tương tác hóa học giữa các ion
trong pha lỏng và các ion pha rắn ( là nhựa trao đổi). Sự ưu tiên hấp thu của nhựa trao đổi dành
cho các ion trong pha lỏng nhờ đó các ion trong pha lỏng dễ dàng thế chỗ các ion có trên khung
mang của nhựa trao đổi. Qúa trình này phụ thuộc vào từng loại nhựa trao đổi và các loại ion
khác nhau.
 Về nguyên tắc, vật liệu dùng để trao đổi ion là những chất không hòa tan vvaf có chứa các ion có
thể dễ dàng trao đổi với các ion khác trong dung dịch phản ứng với nó. Sự trao đổi này không
làm biến đổi tính chất vật lý của vật liệu trao đổi ion. Nhiều hợp chất tự nhiên như protein,
cellulose, tế bào sống.. cso khả năng trao đổi ion và điều này đóng vai trò quan trọng trong các
quy trình trong tự nhiên. Nhựa trao đổi ion là một loại polymer có khả năng trao đổi những ion
cụ thể của nó với các ion khác hiện diện trong dung dịch chảy qua cột phản ứng.