ISSN 0301-732x

ISSN 0717-6201

Archivos de Medicina Veterinaria

VOL. 43, Nº 3, 2011

Comité Editor

Presidente: Gustavo Monti, M.V., Mg.Sc., Ph.D.

Enrique Paredes H., M.V., Dr. med.vet.
Rubén Pulido F., M.V., Mg.Sc., Ph.D.
Jorge Toro Y., M.V., M.Sc., Ph.D.

Asistente Editorial: Claudia Cárdenas A., Ing. Agr.

Comité Editor Asesor

Arturo Ferreira, M.V., Ph.D. - Universidad de Chile, Chile

Carmen Fuentealba, M.V., M.Sc., Ph.D. - University of Calgary, Canada
Carlos Hermosilla, M.V., Dr. med.vet., DipEVPC, Dr. habil. - University of London, UK
Oscar Illanes, M.V., Ph.D. - University of Calgary, Canada
Raúl Mainar, M.V., M.Sc., Dr. Vet., DipECVPH - Centro de Invest. y Tec. Agroalimentaria, España
Claudia Muñoz-Zanzi, M.V., MPVM, Ph.D. - University of Minnesota, USA
Manuel Quezada, M.V., Dr. med.vet. - Universidad de Concepción, Chile
Sergio Recabarren, Lic. Biología, M.Sc. - Universidad de Concepción, Chile
Gerhardt Schurig, M.V., Ph.D. - Virginia Tech, USA
Pedro Smith, M.V., M.Sc.- Universidad de Chile, Chile
Francisco Uzal, M.V., M.Sc., Ph.D., Dipl. ACVP - University of California Davis, USA
Gerdien van Schaik, M.Sc., Dipl Anim Sci, Ph.D. - Gezondheidsdienst voor Dieren, The Netherlands

Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Veterinarias
Casilla 567 - Valdivia, Chile
 VOLUMEN 43, Nº 3, 2011

CONTENIDOS

EDITORIAL��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� V

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Tendinopatía del tendón flexor digital superficial y desmopatía del ligamento suspensorio en caballos: fisiopatología
y terapias regenerativas.
JU Carmona, C López������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 203

ARTÍCULO ORIGINAL
Effect of citric acid supplemented diets on aflatoxin degradation, growth performance and serum parameters in
broiler chickens.
L Salgado-Tránsito, JC Del Río-García, JL Arjona-Román, E Moreno-Martínez, A Méndez-Albores��������������������������������� 215
Potenciales evocados auditivos del tallo cerebral en monos rhesus (Macaca mulatta) en diferentes etapas fisiológicas
en condiciones de cautiverio.
A Ibáñez-Contreras, A Durend-Rivera, B Hernández-Godínez, S Reyes-Pantoja����������������������������������������������������������������� 223
Blood cytology of the common jollytail (Galaxias maculatus) (Jenyns, 1842) (Osmeriformes: Galaxiidae) at postlarval
and adult stages.
I Valdebenito, K Busse, N Jaramillo, A Hernández���������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 233
pH ruminal y balance metabólico de Mg en vacas lecheras en pastoreo suplementadas con óxido de magnesio.
P Sepúlveda, F Wittwer, H Böhmwald, RG Pulido, M Noro�������������������������������������������������������������������������������������������������� 241
Algunos aspectos sobre el estado de colonización y estado serológico en cerdas vacunadas contra Mycoplasma
hyopneumoniae y de sus lechones según el número ordinal de partos.
P Tamiozzo, A Carranza, J Parada, B Pelliza, A Ambrogi������������������������������������������������������������������������������������������������������ 251
Aplicación del bioensayo EROD-H4IIE para la determinación de dioxinas en carnes de pollos broiler: un estudio
de equivalencia con la cromatografía de gases de alta resolución acoplada a espectrometría de masas de alta
resolución.
JT Schoffer, C Bustos-López, P Sotomayor, CA Mattar, A González, C Robles, F Samsing, O Acevedo, CE Valdovinos������� 259
Adecuación y análisis de sensibilidad de un modelo para la estimación de la capacidad de carga del hábitat de
venado cola blanca.
FX Plata, GD Mendoza, JA Viccon, R Bárcena, FC Sánchez, OA Villarreal������������������������������������������������������������������������� 267
Metabolismo energético en ovejas gestantes esquiladas y no esquiladas sometidas a dos planos nutricionales. Efecto
sobre las reservas energéticas de sus corderos.
L Cal-Pereyra, A Benech, S Da Silva, A Martín, JR González-Montaña������������������������������������������������������������������������������� 277
Insumos utilizados en la preparación de alimentos en producción porcina y su potencial de contaminación por
dioxinas en la carne.
F Samsing, C Bustos-López, JT Schoffer, CA Mattar, A González, C Robles, O Acevedo, CE Valdovinos������������������������� 287

COMUNICACIONES
Identificación por PCR de Brucella canis en sangre y leche canina. Reporte de un caso.
M Olivera, CA Giraldo, C Di-Lorenzo����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 295
Un caso de hermafroditismo verdadero 78, XX en una perra Weimaraner.
L Martin, AAM Quero, DM Ferré, L Albarracín, V Hynes, IB Larripa, NB Gorla���������������������������������������������������������������� 299
Surgical correction of degenerative lumbosacral stenosis in a puma (Puma concolor araucana).
C Verdugo, M Gómez, M Alvarado-Rybak, H Bustamante, L Cardona, M Mieres��������������������������������������������������������������� 303
Efecto de tres ambientes de transporte sobre el tiempo de aparición de la autólisis en muestras de alevines de trucha
arcoíris (Oncorhynchus mykiss).
AR Ortloff, PA Peña, R Ildefonso������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 307
Uso de concentrados autólogos de plaquetas intraarticulares como coadyuvantes en el tratamiento quirúrgico de la
rotura del ligamento cruzado anterior en una perra.
RF Silva, CMF Rezende, JU Carmona����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 313
 VOLUME 43, Nº 3, 2011

CONTENTS

EDITORIAL��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� V

REVIEW ARTICLE
Superficial digital flexor tendon tendinopathy and suspensory ligament desmopathy in horses: pathophysiology
and regenerative therapies.
JU Carmona, C López������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 203

ORIGINAL ARTICLES
Effect of citric acid supplemented diets on aflatoxin degradation, growth performance and serum parameters in
broiler chickens.
L Salgado-Tránsito, JC Del Río-García, JL Arjona-Román, E Moreno-Martínez, A Méndez-Albores��������������������������������� 215
Brainstem’s auditory evoked potentials in rhesus monkeys (Macaca mulatta) in different physiologic stages under
captivity.
A Ibáñez-Contreras, A Durend-Rivera, B Hernández-Godínez, S Reyes-Pantoja����������������������������������������������������������������� 223
Blood cytology of the common jollytail (Galaxias maculatus) (Jenyns, 1842) (Osmeriformes: Galaxiidae) at postlarval
and adult stages.
I Valdebenito, K Busse, N Jaramillo, A Hernández���������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 233
Ruminal pH and magnesium metabolic balance in dairy cattle on grazing and supplemented with magnesium oxide.
P Sepúlveda, F Wittwer, H Böhmwald, RG Pulido, M Noro�������������������������������������������������������������������������������������������������� 241
Some aspects about the colonization and serologic state of Mycoplasma hyopneumoniae vaccinated sows and their
piglets by parity distribution.
P Tamiozzo, A Carranza, J Parada, B Pelliza, A Ambrogi������������������������������������������������������������������������������������������������������ 251
Application of the EROD-H4IIE bioassay for the determination of dioxins in broiler chicken meat: an equivalence
study with high resolution gas chromatography coupled to high resolution mass spectrometry.
JT Schoffer, C Bustos-López, P Sotomayor, CA Mattar, A González, C Robles, F Samsing, O Acevedo, CE Valdovinos�� 259
Fitness and sensitivity analysis of a model to estimate carrying capacity in the habitat from white tailed deer.
FX Plata, GD Mendoza, JA Viccon, R Bárcena, FC Sánchez, OA Villarreal������������������������������������������������������������������������� 267
Energy metabolism in shorn and unshorn pregnant ewes under two different nutritional planes. Effects on the
energetic storage of their lambs.
L Cal-Pereyra, A Benech, S Da Silva, A Martín, JR González-Montaña������������������������������������������������������������������������������� 277
Feed materials used in the preparation of food in pork production and its potencial for dioxin contamination in the
meat.
F Samsing, C Bustos-López, JT Schoffer, CA Mattar, A González, C Robles, O Acevedo, CE Valdovinos������������������������� 287

communications
PCR identification of Brucella canis in canine blood and milk. A case report.
M Olivera, CA Giraldo, C Di-Lorenzo����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 295
A case of true hermaphroditism 78, XX Weimaraner bitch.
L Martin, AAM Quero, DM Ferré, L Albarracín, V Hynes, IB Larripa, NB Gorla���������������������������������������������������������������� 299
Surgical correction of degenerative lumbosacral stenosis in a puma (Puma concolor araucana).
C Verdugo, M Gómez, M Alvarado-Rybak, H Bustamante, L Cardona, M Mieres��������������������������������������������������������������� 303
Effect of three transport conditions on the appearance time of autolysis in samples of rainbow trout fry (Oncorhynchus
mykiss).
AR Ortloff, PA Peña, R Ildefonso������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 307
Use of intra-articular autologous platelet concentrates as coadjutants in the surgical treatment of a cranial cruciate
ligament rupture in a bitch.
RF Silva, CMF Rezende, JU Carmona����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 313
Arch Med Vet 43, V (2011)

Editorial

Archivos de Medicina Veterinaria se destacó en el año 2011 por alcanzar un notable

aumento del Factor de Impacto alcanzado, el cual pasó de ser 0,240 en 2009 a 0,500 en 2010,
según lo dio a conocer Thomson Scientific en junio de 2011. Esto es otro gran logro para la
revista, ya que ratifica la tendencia sostenida en los últimos cuatro años al crecimiento del
Factor de Impacto. Esto implica una mayor visibilidad y citación de los trabajos publicados,
lo que a su vez la hace cada vez más atractiva como medio de divulgación para trabajos
de investigación. También el número de trabajos recibidos ha ido aumentando hasta alcanzar
el año pasado un récord (83) y superó el de 2009 que había sido el mayor dentro de los 41
años de existencia de la revista. Actualmente se encuentran disponibles en la página web de
la Revista (www.veterinaria.uach.cl ) los títulos de los trabajos ya aceptados en Archivos de
Medicina Veterinaria con antelación a su aparición en la revista impresa, y esperamos que
pronto lo hagan los trabajos completos, de modo que los lectores puedan acceder en forma
temprana a las publicaciones. También han ido aumentando año a año los trabajos extranjeros
ingresados al proceso de edición, alcanzando en el 2010 al 45% de los trabajos, mientras que
se mantiene la participación de autores de la Universidad Austral de Chile en un 17%. Todos
estos indicadores muestran que Archivos de Medicina Veterinaria se ha ido internacionalizando
y difundiendo cada vez con más rapidez en Chile y el mundo.
Además, este año hemos cristalizado un viejo anhelo, que es la total operatividad del
proceso editorial con la puesta en marcha de eQuipu, una plataforma online que está agilizando
el proceso, desde el envío hasta la impresión. Esto significó una inversión importante en el
equipamiento de la revista, pero seguramente veremos los frutos el año próximo.
Finalmente, queremos agradecer a los miembros del Comité Editorial Asesor por su
constante apoyo, su trabajo como revisores, y también a todos los revisores nacionales y
extranjeros, que de manera profesional y generosa han contribuido en forma sustancial a los
logros antes señalados.
Aprovechamos la ocasión para desearles a nuestros lectores una Feliz Navidad y un
¡Próspero Año Nuevo!
Arch Med Vet 43, 203-214 (2011)

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Tendinopatía del tendón flexor digital superficial y desmopatía del ligamento

suspensorio en caballos: fisiopatología y terapias regenerativas

Superficial digital flexor tendon tendinopathy and suspensory ligament desmopathy

in horses: pathophysiology and regenerative therapies

JU Carmonaa*, C Lópeza,b
aGrupo de Investigación Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.
bBecaria COLCIENCIAS “Generación Bicentenario”, Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad de Caldas,
Manizales, Colombia.

SUMMARY

Tendon and ligament injuries are frequent in horses. The superficial digital flexor tendon (SDFT) and the suspensory ligament (SL) are the most
frequently affected structures. The clinical form of these pathologies is generally chronic and degenerative. The treatments commonly used do not result
in a definitive cure of the problem and most of the patients relapse or do not recover their initial athletic capacity. Advances in molecular pathophysiology
of tendonitis and desmitis in man, horses and other animals have shown the presence of catabolic cytokines, which are possibly responsible for the
general dysfunction observed in these pathologies. The current objectives of the treatments of these problems are the regeneration and not the repair
(scar formation) of the injured tissue. In the horse, novel experimental and clinical treatments have been described. These treatments include the injection
of bone marrow aspirates, mesenchymal stem cells, recombinant growth factors such as insulin-like and platelet rich plasma (also termed autologous
platelet concentrates), amongst others. The observed results have been promising when these novel therapies were used. However, just as with other
treatments, further research is needed to demonstrate that its clinical use can be effective and safe in horses.

Palabras clave: equino, tendinopatía, desmopatía, tejido conectivo, medicina regenerativa.

Key words: equine, tendinopathy, desmopathy, connective tissue, regenerative medicine.

INTRODUCCIÓN (PSGGs), inyección de corticosteroides (CS), ácido

Las enfermedades más comunes en el caballo son
aquellas que afectan su aparato musculoesquelético.
Estudios realizados en caballos de carreras sugieren que
estas lesiones producen importantes pérdidas económicas
(Halper y col 2006) y que representan cerca del 82% de
los problemas de pérdida de rendimiento manifestado
clínicamente como cojera; entre el 46 y el 53% son
lesiones de tendones y ligamentos (Thorpe y col 2010).
Estos sanan muy lentamente y el tejido reparado no
tiene las mismas características de elasticidad y fuerza
que el tejido original (Dahlgren 2007). Uno de los
principales dilemas relacionados con las tendinopatías
y desmopatías del caballo es la elección del tratamiento
(Smith y Schramme 2003, Dowling y Dart 2005). Muchos
veterinarios toman decisiones terapéuticas basados en sus
experiencias clínicas (Paavola y col 2002) y pocas en el
conocimiento actual de la fisiopatología de tendones y
ligamentos lesionados (Smith y Schramme 2003).
El tratamiento médico convencional de estas patologías
en el caballo incluye la utilización de antiinflamatorios no
esteroideos (AINEs), glicosaminoglicanos polisulfatados
Aceptado: 28.04.2011.
* Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Caldas, Colombia; carmona@ucaldas.
edu.co
hialurónico (HA) y de fumarato de β-aminopropionitrilo
(BAPN) (Ross y Dyson 2002, Smith y Schramme 2003,
Dyson 2004, Gaujoux-Viala y col 2009).
En los casos de tendinopatía y desmopatía agudas se
emplean fármacos combinados con reposo, hidroterapia y
vendajes a presión. En la fase subaguda de la tendinopatía
del tendón flexor digital superficial (SDFT) se utilizan HA
o BAPN, combinados con monitorización ecográfica de la
lesión y un programa de ejercicio controlado (Dowling y
col 2000, Smith y Schramme 2003, Dyson 2004). Algunos
clínicos también usan en esta fase las ondas de choque,
rayos infrarrojos y láser frío, entre otros. La utilización
de CS como tratamiento de estas lesiones es un tema
controversial. Existen datos que desaconsejan su empleo,
ya que aumentan el riesgo de roturas del tendón (Paavola
y col 2002, Chang y col 2010). Sin embargo, muchos
veterinarios y médicos humanos persisten con su uso
(Dowling y col 2000, Smith y Schramme 2003, Gaujoux-
Viala y col 2009, Peters-Veluthamaningal y col 2009).
En casos crónicos, cuando estos tratamientos fallan,
el clínico puede recurrir a la cirugía (Dowling y col
2000, Smith y Schramme 2003, Kaneps 2007) o a otros
procedimientos poco convencionales como la aplicación
de puntos de fuego (menos usado y no justificado),
en el caso de las tendinopatías. Los procedimientos
quirúrgicos más usados en la tendinopatía del tendón

203
JU Carmona, c lópez
flexor digital superficial (SDFT) son la estimulación
de la revascularización de las lesiones crónicas y
la desmotomía del ligamento accesorio (AL) del
tendón flexor digital superficial (AL-SDFT) (Kaneps
2007). Aunque ambas cirugías fueron ampliamente
utilizadas, actualmente su uso no está justificado
(Dowling y col 2000, Smith y Schramme 2003). Las
lesiones del ligamento suspensor (SL), especialmente
de los miembros posteriores y que son refractarias
al tratamiento médico, han sido manejadas mediante
fasciotomía plantar profunda e incluso neurectomía del
nervio tibial o de la rama profunda lateral del nervio
plantar (Dyson y col 1995, Dyson y Genovese 2003,
Kaneps 2007). Recientemente, se ha demostrado que las
neurectomías producen atrofia por denervación del SL
y podrían predisponer a una rotura catastrófica de esta
estructura anatómica (Pauwels y col 2009).
Los mecanismos de reparación natural no permiten
que los tendones y ligamentos lesionados se recuperen
completamente. Esto hace que los caballos afectados con
estos problemas tengan una predisposición de recaída
aproximadamente del 80% (Halper y col 2006), a pesar
de emplear cualquier tipo de tratamientos convencionales
(clásicos) o terapia física. Esta situación no es diferente a lo
que sucede en seres humanos afectados por tendinopatías o
desmopatías, especialmente crónicas (Paavola y col 2002).
Durante los últimos años se ha incrementado el
conocimiento de la biología del tejido conectivo y se
han podido esclarecer a nivel molecular varios procesos
bioquímicos relacionados con la fisiopatología de estas
Falange proximal
P1
Falange media
P2
Falange distal
P3
Figura 1. Anatomía básica de un dígito en el caballo.
Basic anatomy of a digit in the horse.
204
lesiones (Goodship y col 1994, Kobayashi y col 1999,
Abramowitch y col 2003, Woo y col 2008ª,b, Souza y col
2010). Esto ha permitido esclarecer, en parte, la causa de
los fracasos obtenidos con la terapéutica convencional y ha
abierto una nueva era en el tratamiento de estas lesiones,
la era de la terapia regenerativa.
En este trabajo se presenta una revisión de los
principales tratamientos regenerativos (experimentales
y clínicos) que se han propuesto como terapia para
tendinopatías y desmopatías del caballo, y para ello se
describe previamente la morfofisiología de los tendones
y ligamentos de este animal.
Morfofisiología de los tendones y
ligamentos del caballo
La anatomía de los tendones y ligamentos varía entre
miembros anteriores y posteriores y entre caballos. Sin
embargo, es muy similar en la región digital de ambos
miembros (figura 1). En cada extremidad se pueden
identificar tres partes anatómicas principales: el SDFT y su
AL-SDFT, el tendón flexor digital profundo (DDFT) y su
ligamento accesorio (AL-DDFT) y el aparato suspensorio
(SA), compuesto por el tercer músculo interóseo (SL),
el escudo proximal, los ligamentos sesamoideos distales
(DSLs) y la brida extensora (Denoix 1994).
Los tendones y ligamentos son estructuras muy
parecidas desde el punto de vista ultraestructural. Los
tendones son continuación de los músculos y están
formados por una trama de colágeno que da soporte a las
Ligamento suspensor
Tendón extensor digital común
Sesamoideo proximal
Tendón flexor digital superficial
Tendón flexor digital profundo
Hueso navicular o sesamoideo distal
Almohadilla distal
 equino, tendinopatía, desmopatía, tejido conectivo, medicina regenerativa
fibras musculares contráctiles. Aparecen como bandas o
cordones blancos de tejido conectivo denso que conectan
el vientre muscular a un elemento esquelético distal.
El corte transversal de una superficie tendinosa revela
la presencia de septos interfasciculares. Los fascículos
varían en tamaño y forma y funcionan de manera
independiente. Están formados por fibrillas y éstas a su
vez por subfibrillas. Las subfibrillas están compuestas por
microfibrillas de tropocolágeno (figura 2) (Kastelic y col
1978, Thorpe y col 2010).
Las células que forman los tendones son fibroblastos
especializados, los tenocitos. Están representados por
tres poblaciones celulares específicas que cumplen
diferentes funciones bioquímicas dentro del tendón, pero
principalmente generan matriz extracelular (Goodship y
col 1994, Dowling y col 2000, Smith y Schramme 2003,
Dahlgren 2007). Los tendones también son infiltrados
por pequeños vasos sanguíneos que recorren los espacios
interfasciculares de las fibras de colágeno. La normal
vascularización del tendón favorece el transporte de
nutrientes, enzimas proteolíticas, mediadores de la
inflamación, entre otros (Bosch y col 2010).
La matriz extracelular (ECM) del tendón o ligamento
está conformada por diferentes tipos de macromoléculas:
colágeno, elastina, proteoglicanos, glicoproteínas y agua.
El colágeno y la elastina forman el componente fibroso
que da fuerza tensil al tendón y al ligamento (Dahlgren
2007). La molécula de colágeno (tropocolágeno) está
formada por tres cadenas de polipéptidos enrolladas hacia la
derecha en forma de superhélice (figura 2). En los tendones
y ligamentos existe una gran proporción de colágeno
MOLÉCULA DE FIBRILLA DE FIBRA DE
COLÁGENO MICROFIBRILLA COLÁGENO COLÁGENO
1,5 nm 10 nm 1,5 nm 1-20 µm
Diámetro
TENOCITO
INTRAFASCICULAR
1,4 nm
BANDAS
TROPOCOLÁGENO 64 nm
1,4 nm
Figura 2. Organización microestructural y funcional del tendón (modificado de Kastelic y col 1978 y Thorpe y col 2010).
Microstructural and functional organization of the tendon (modified from Kastelic et al 1978 and, Thorpe et al 2010).
tipo I (Col-I) (95%) (Dahlgren 2007), aunque también se
encuentran pequeñas proporciones de Col-II, III, IV, V y VI.
El Col-II se expresa particularmente en las zonas donde el
tendón sufre fuerzas de compresión, tales como la región
metacarpiana o a su paso entre los huesos sesamoideos. Por
otro lado, el Col-III predomina después de las lesiones y
traumatismos, en procesos reparativos tempranos y forma
microfibrillas de pequeño diámetro (Goodship y col 1994,
Dowling y col 2000, Smith y Schramme 2003).
El colágeno se organiza a manera de fibrillas en
paquetes de 67 nm. La organización depende de la
colocación de cada haz en sentido hidrofílico e hidrofóbico
y de las uniones entre cada molécula. Los proteoglicanos
y las glicoproteínas influyen sobre la matriz de colágeno y
sobre la agregación de las fibrillas de colágeno (Goodship
y col 1994, Dahlgren 2007). En estado de relajación, las
fibrillas de colágeno presentan forma de espiral (resorte o
crimp). El crimp imparte elasticidad al tendón en las fases
tempranas de carga (19-20° y 17-19 µm) y esta disminuye
con la maduración del tendón o con el ejercicio (12-17°
y 11-15 µm) (Dowling y col 2000). A los dos años de
edad el tendón es morfológicamente maduro y presenta
características mecánicas de mayor rigidez (disminución
en el ángulo de elasticidad, disminución en el tamaño
de los fascículos) (Patterson-Kane y col 1997). Esta
disminución en la elasticidad y aumento de la rigidez del
tendón podrían favorecer la presentación de tendinopatías
en el caballo. Por otra parte, el diámetro (forma) y el
número de las fibrillas disminuye con la edad, lo que
predispone a los caballos viejos a sufrir lesiones tendinosas
(Birch y col 1999, Edwards y col 2005).
FASCÍCULO TENDÓN
50-300 µm 15 mm
MEMBRANA
RETICULAR
TENOCITO
INTERFASCICULAR
MEMBRANA
FIBROBLASTO FASCICULAR
205
JU Carmona, c lópez
Biomecánica
Los tendones y ligamentos del caballo son estructuras
muy fuertes que soportan altas cargas y tensiones
durante la estación y el movimiento (Denoix 1994). El
aparato elástico que forman se encarga principalmente
de dar soporte al menudillo, prevenir la hiperextensión
del carpo, amortiguar la energía del impacto y sostener
completamente el peso corporal durante la propulsión
(Dowling y col 2000).
Los tendones y ligamentos de caballos jóvenes se
adaptan a las diferentes cargas producidas en su desarrollo
(Smith y col 1999). Sin embargo, a medida que estos
alcanzan la madurez esquelética (5 años) (Dahlgren y
col 2002), muchos de ellos son propensos a acumular
microlesiones a causa de la fatiga constante producida
en su actividad atlética (Pool y Meagher 1990, Patterson-
Kane y col 1998). Smith y col (2002) estudiaron la
distribución de la proteína oligomérica de la matriz del
cartílago (COMP) en tendones de caballo. Esta proteína
se encuentra en gran cantidad en los tendones de animales
en desarrollo, por lo que se cree que es importante en la
formación de la ECM del tendón en los primeros estadios
de vida. La COMP disminuye a medida que el animal
envejece y es posible que este fenómeno lo haga más
susceptible a padecer lesiones tendinosas. En caballos
se encontró que su cantidad difiere entre poblaciones
y quizás por esto se podría explicar el amplio rango de
variación en las propiedades mecánicas de los tendones
entre individuos y razas de equinos (Crevier-Denoix y col
1997, Smith y col 2002).
Durante la locomoción, los tendones flexores y
el SL actúan como un mecanismo elástico que disipa
energía e incrementa el rendimiento durante la marcha
(Denoix 1994) y actúan como resortes para proteger
las fibras musculares durante movimientos fuertes,
súbitos o inesperados (figura 3) (Goodship y col 1994).
6
5 tendón
Fuerza (Kn)
3 Energía
disipada
2
1
2 4 6 8
Tensión (%)
Figura 3. Ciclo de carga del tendón flexor digital superficial
en un caballo (adaptado de Goodship y col 1994).
Charging cycle of the superficial digital flexor tendon in a
horse (adapted from Goodship et al 1994).
206
Los tendones son altamente ténsiles, fuertes, flexibles
y elásticos y al igual que los ligamentos, exhiben
características de deformación no lineares frente a la
carga. Esto se traduce a que pequeños incrementos en la
carga pueden producir gran extensión del tendón, hasta un
límite o punto crítico. Después de cada incremento en la
carga, se genera un cambio similar en la extensión. Si la
carga cesa en ese punto, la estructura vuelve a su estado
normal y elimina la energía en forma de calor (figura 4).
Si la carga continúa después del punto crítico, se produce
el fenómeno llamado deformación plástica y finalmente
el tendón o ligamento fallan y se rompen (Goodship y
col 1994, Dowling y col 2000, Smith y Schramme 2003,
Smith y col 2003).
El componente no linear de la fuerza elástica de
los tendones y ligamentos se debe a las características
microestructurales de las fibrillas de colágeno (Goodship
y col 1994). El valor de la resistencia elástica del tendón
es muy estrecho. La rotura del SDFT ocurre cuando se
exceden las cargas de tolerancia fisiológica por encima
de un 12-20%. Por esta razón, el nivel máximo de
rendimiento en un equino atleta puede estar cercano a
ese punto crítico de rotura (figura 4) (Goodship y col
1994). En el SDFT se presenta inicialmente daño de su
región central. Este fenómeno se debe principalmente a
procesos degenerativos que intervienen con la calidad de
la formación de las espirales del colágeno y es común en
caballos viejos (Crevier-Denoix y col 1997).
Estudios ex vivo han mostrado que el cuerpo del SL
puede romperse cuando se excede su carga entre 10-12%
(Goodship y col 1994). En situaciones in vivo, el aparato
suspensor de los miembros anteriores es normalmente
el más afectado por roturas catastróficas (Thorpe y col
2010). Éstas se pueden localizar en el cuerpo del SL o
cerca de la región de los huesos sesamoideos proximales,
especialmente al lado del cóndilo lateral del tercer hueso
metacarpiano.
Rotura del
Estrés
Región
Región lineal
basal
Tensión
Figura 4. Curva de carga y rotura de un tendón equino (adaptado
de Goodship y col 1994).
Charging curve and rupture of an equine tendon (adapted
from Goodship and col 1994).
 equino, tendinopatía, desmopatía, tejido conectivo, medicina regenerativa
Biopatología de las lesiones de
tendones y ligamentos
Las lesiones del SDFT representan más del 30% de
las lesiones de equinos atletas en Europa (Pool y Meagher
1990, Wong y col 2003). Las afecciones pueden ir desde
roturas parciales menores a rotura bilateral completa de
tendones. Los SDFTs de los miembros anteriores son
generalmente más afectados (Pool y Meagher 1990,
Dowling y col 2000, Smith y Schramme 2003, Wong y
col 2003). Lesiones similares también pueden ocurrir
en los miembros posteriores, aunque en este caso son
más frecuentes las lesiones del DDFT y SL (Goodship
y col 1994). Por su parte, las lesiones del SL pueden
representar hasta el 3,6% en caballos purasangre inglés
(Dyson 2004).
Las desmopatías de los SLs de los miembros anteriores
son más frecuentes en caballos de carrera, mientras que
las desmitis del LS de los miembros posteriores son más
frecuentes en trotadores. La desmitis bilateral del SL de
los miembros anteriores puede llegar a presentarse en el
31% de los caballos afectados. Este mismo trastorno en
los miembros posteriores puede representar un 20% de
los caballos afectados (Dyson 2004).
El daño preferencial de un tendón o un ligamento
dependerá en gran medida de la carga funcional de estas
estructuras en diferentes pasos o aires y en asociación
con diferentes demandas locomotoras (Denoix 1994).
Las fuerzas impuestas sobre los tendones y ligamentos
son modificadas por el tipo de actividad, gradientes del
terreno, superficie, tipo de herraje aplicado al casco y la
conformación del caballo (Goodship y col 1994, Anderson
y col 2004). Además, la edad, el nivel de entrenamiento
y la historia de ejercicio están implicados en la génesis
de la lesión (Goodship y col 1994, Dowling y col 2000,
Smith y Schramme 2003).
Las tendinopatías del SDFT pueden clasificarse como
agudas (tendinitis) o crónicas (tendinosis). Las lesiones
del SDFT pueden comprender desde una degeneración
subclínica de la región central del tendón, hasta rotura
completa del mismo (Pool y Meagher 1990, Kobayashi
y col 1999). La lesión puede surgir a partir de una carga
mecánica sobreaguda, como causa de un movimiento
no coordinado (factores extrínsecos) o por estrés
acumulado a partir de una lesión subclínica repetida
(factores intrínsecos) (Smith y Schramme 2003). La lesión
degenerativa (tendinosis o tendinopatía) del SDFT guarda
gran semejanza con la tendinopatía del tendón de Aquiles
en seres humanos (Dahlgren y col 2002, Paavola y col
2002, Birch y col 2008). En ambas patologías se aprecia
deterioro generalizado de la ECM, con disminución
significativa del Col-I, ausencia de reacción (infiltración)
inflamatoria del tendón y vascularización disminuida.
Las desmopatías del SL también pueden clasificarse
de igual manera que las tendinopatías. La gravedad de las
lesiones del SL dependerá de su magnitud, región afectada
y grupo de miembros comprometidos. Las desmopatías
proximales del SL (PDSL) de los miembros anteriores
son menos drásticas que las de los miembros posteriores
(Denoix 1994). En general, los caballos afectados por
PDSL de los miembros anteriores pueden retornar a su
nivel de entrenamiento normal, después de reposo y un
programa de ejercicio controlado durante tres meses. Los
caballos que padecen este problema en los miembros
posteriores tienen muy mal pronóstico, continúan con
diferentes grados de cojera y casi nunca regresan a su
nivel de entrenamiento normal (Dyson y col 1995, Ross
y Dyson 2002).
Las desmopatías de las ramas del SL (BDSL) de
los miembros anteriores son más frecuentes que en los
miembros posteriores y están asociadas con un proceso
crónico. Algunas lesiones de este tipo sanan muy
lentamente (algunas pueden llegar hasta 18 meses) y
muchos caballos no retornan a su nivel de trabajo normal,
hasta 9 meses de haberse producido la lesión (Dyson y
col 1995, Ross y Dyson 2002). Las desmopatías de las
BDSL de los miembros posteriores se presentan más a
menudo en caballos ambladores (ej.: paso peruano y paso
colombiano), de doma clásica y en animales rectos de
corvejones o largos de cuartillas (pandos).
Los tendones y ligamentos, después de lesionados,
cicatrizan lentamente y nunca vuelven a recuperar sus
características biomecánicas originales (Goodship y col
1994, Crevier-Denoix y col 1997). Cuando un caballo ha
sufrido un episodio de tendinitis o desmitis es muy probable
que se vuelva a repetir la lesión, en un grado semejante a
la anterior o incluso con mayores consecuencias (Dowling
y col 2000, Smith y Schramme 2003). Se han propuesto
diferentes teorías (mecanismos) para tratar de explicar
la causa de la lesión central degenerativa del SDFT
equino. Estos mecanismos se pueden dividir en físicos
y bioquímicos. Las causas bioquímicas pueden incluir
mecanismos por hipoxia-isquemia, reperfusión, entre
otros. Las causas físicas incluyen sobrecarga e hipertermia
(Goodship y col 1994, Dowling y col 2000, Smith y
Schramme 2003, Carmona y col 2009).
Es importante considerar, independientemente de
la causa inicial, que se producen cambios bioquímicos
(ej.: expresión de citocinas catabólicas y activación
exagerada de las metaloproteinasas de matriz (MMPs))
y celulares (ej.: apoptosis de tenocitos y proliferación
de miofibroblastos, entre otros) (Goodship y col 1994,
Paavola y col 2002, Carmona y col 2009, Thorpe y col
2010) que producen impactos estructurales y funcionales
negativos sobre el tendón, que con el tiempo terminan
en una lesión clínica (Dowling y col 2000, Smith y
Schramme 2003). De esta manera, se sabe que los
tendones rotos (o próximos a rotura) presentan aumento
de la expresión génica y producción exagerada de MMP-
1 (colagenasa), mientras que la expresión génica de la
MMP-3 (estromelisina) se encuentra disminuida (Thorpe
y col 2010).
207
JU Carmona, c lópez
Después de la lesión, el proceso de reparación del
tendón o ligamento sigue los mismos patrones básicos
que se observan en la mayoría de los tejidos corporales.
La rotura fibrilar inicial es seguida por hemorragia y
formación de un hematoma con la consecuente formación
de una malla de fibrina, acompañado de edema e
inflamación. Luego, llegan los macrófagos que eliminan
los residuos del proceso inflamatorio y de manera
superpuesta los fibroblastos comienzan a formar una
cicatriz. En el nuevo tejido de cicatrización se presenta una
deposición inicial desorganizada de colágeno inmaduro
(Col-III). Posteriormente, se presenta un proceso de
maduración con incremento de fibrillas de Col-I, que
poseen mayor diámetro y son organizadas en distribución
paralela, más parecida a la forma tendinosa original. Este
proceso puede durar de semanas a meses (Goodship y
col 1994, Dowling y col 2000, Smith y Schramme 2003,
Dahlgren 2007).
Terapia regenerativa
La medicina regenerativa se centra en estrategias
terapéuticas que permitan reemplazar o restaurar tejidos
dañados o contrarrestar el envejecimiento de las células en
el cuerpo y así mejorar su función (Gurtner y col 2007).
La regeneración implica la reposición de células originales
(del tejido lesionado), después de una sección o una
lesión, seguida por la generación de células progenitoras
de regeneración y morfogénesis (Brockes y Kumar 2008).
Su principal objetivo es obtener la regeneración de los
tejidos y evitar la reparación (cicatrización) de los mismos.
Diferentes revisiones sobre la fisiopatología de las
lesiones de tendones y ligamentos han hecho énfasis sobre
la influencia de los factores físicos (ej: estrés mecánico e
hipertermia) en el deterioro de estas estructuras (Goodship
y col 1994, Henninger 1994, Smith y Schramme 2003,
Smith y col 2003, Carmona y col 2009). Sin embargo,
actualmente es necesario incluir algunos factores
bioquímicos, que anteriormente habían sido tímidamente
considerados dentro de este mecanismo patológico.
Recientemente se describió la presencia de citocinas
catabólicas (factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e
interleucina 1 alfa (IL-1α) y beta (IL-1β) en biopsias de
tendones de equinos con tendinopatía crónica del SDFT
(Hosaka y col 2002). Tsuzaki y col (2003) demostraron
in vitro en tenocitos humanos que el desafío exógeno
con IL-1 estimula la expresión de IL-1 propia y, a su
vez, IL-6, ciclo-oxigenasa 2 (COX-2), MMPs y todas
las consecuencias catabólicas que conlleva la expresión
de éstas moléculas. Además, se ha encontrado que
algunos factores de crecimiento (GFs), como el factor
de crecimiento transformador beta (TGF-β) disminuyen
sus concentraciones en la ECM del tendón, a medida
que el animal envejece. Se sabe que este factor es crucial
en la síntesis de colágeno (Smith y Schramme 2003).
Sin embargo, parece que tuviera una función dual en la
208
fisiopatología de las tendinopatías del caballo, ya que su
expresión exagerada puede inducir fibrosis y alterar la
producción de colágenos juveniles o embrionarios (tipos
XII y XIV) en el tendón (Arai y col 2002).
Es probable que el mecanismo molecular de las
tendinopatías y desmopatías del caballo pueda tener
similitud con la fisiopatología de la osteoartritis (OA)
(Carmona y Prades 2009). La OA es una enfermedad
crónica en la que se produce una respuesta reparativa
insuficiente del cartílago articular (Carmona y col 2009)
debido a un desequilibrio entre los péptidos que inducen
la síntesis y degradación de la ECM del cartílago articular.
El cartílago es una estructura de tejido conectivo
modificado, compuesto por células especializadas
(condrocitos) embebidas en una ECM rica en Col-II. La
estructura general del cartílago, tendones y ligamentos
es muy parecida (Carmona y Prades 2009). No obstante,
en la ECM de estas dos últimas estructuras predomina el
Col-I (Goodship y col 1994). Se sabe que en esta clase
de ambiente tisular las células interactúan entre sí por
medio de numerosos mensajeros celulares (citocinas),
GFs y diversas enzimas proteolíticas. Esta interacción
es muy importante para mantener la salud del tejido,
puesto que se asegura un equilibrio entre la proliferación
de las células residentes, la síntesis y degradación de los
diferentes componentes de la ECM (Carmona y col 2009,
Carmona y Prades 2009).
A la luz del concepto teórico anterior, se podría
tratar de explicar la causa del fracaso de los tratamientos
convencionales de las tendinopatías y desmopatías en el
caballo, especialmente en sus fases crónicas. En general,
la farmacoterapia con NSAIDs y CS sólo puede actuar
de manera sintomática e incluso estas sustancias podrían
agravar la lesión, al inhibir la síntesis de moléculas (ej.,
prostaglandinas) o la expresión de genes clave (ej., genes
de las ciclooxigenasas) en los procesos de resolución de
la inflamación, reparación o regeneración del tendón o
ligamento, tal como se ha observado en la OA. También
sería lógico pensar que los tratamientos con HA y
PSGGs podrían ser más racionales en el manejo de estas
patologías, ya que ambas sustancias son componentes
naturales de la ECM. Sin embargo, se ha demostrado
extensamente que estos fármacos no representan una
ventaja terapéutica frente al reposo o a un programa
de ejercicio controlado en caballos con tendinopatías o
desmopatías (Dowling y col 2000, Smith y Schramme
2003, Dyson 2004).
Actualmente, se han desplazado las sustancias con
un efecto sintomático y se ha iniciado la búsqueda
de fármacos o compuestos biológicos con efectos
regenerativos: “terapia regenerativa”. Durante los últimos
años se han producido avances significativos en este
campo en el caballo y otras especies animales. En equinos
se han realizado diferentes investigaciones in vitro (Nixon
y col 1999, Dahlgren y col 2001) e in vivo (Herthel
2001, Dahlgren y col 2002) sobre algunos enfoques de
 equino, tendinopatía, desmopatía, tejido conectivo, medicina regenerativa

terapia regenerativa en lesiones del SL y SDFT. También
se ha documentado una investigación clínica sobre el
uso de concentrados de plaquetas como tratamiento de
desmopatías crónicas del SL (Carmona y col 2009) y
del cuerpo del SL (Waselau y col 2008); la inyección
intralesional de células mesenquimales autólogas como
tratamiento de un caso de tendinosis del SDFT (Smith y
col 2003) y un estudio experimental sobre el efecto de la
hormona del crecimiento recombinante equina (re-GH)
(Dowling y col 2002). En otras especies animales (estudios
in vivo e in vitro) se ha investigado el efecto individual y la
combinación de varios GFs en el metabolismo de tendones
y ligamentos (cuadro 1) (Zhang y col 2003).
Factores de crecimiento
Los factores de crecimiento (GFs) son péptidos
producidos por células, que pueden actuar de manera
autocrina, paracrina y endocrina. Estas moléculas son
mal denominadas GFs, ya que cuando algunas de ellas
fueron aisladas por primera vez se observó que producían
proliferación celular in vitro. Sin embargo, actualmente se
reconoce que no sólo estimulan la proliferación celular,
sino que también son clave en diversos procesos, como la
cicatrización y angiogénesis. Por esta razón se deberían
denominar como péptidos polifuncionales.
Los GFs han ganado gran interés en el campo de la
terapia regenerativa de numerosas patologías del hombre
y los animales, tales como la OA (Platt y col 1998,
Carmona y Prades 2009); la cicatrización patológica de
la piel y otros tejidos (Nam y col 2010); las tendinopatías
y desmopatías (Zhang y col 2003), entre otras. Los
GFs pueden antagonizar los efectos catabólicos y pro-
inflamatorios de la IL-1 o del TNFα (Van Miert 2002).
Estas citocinas están implicadas en la génesis o en la
fisiopatología de varias enfermedades (ej. OA) (Carmona y
Prades 2009). Además, como se mencionó anteriormente,
posiblemente podrían jugar un papel importante en la
biología de las lesiones de los tejidos blandos del aparato
locomotor (Hosaka y col 2002).
Diferentes investigaciones, in vitro e in vivo (cuadro 1)
en humanos y otras especies animales, han demostrado
efectos positivos de varios GFs sobre el metabolismo de
tendones y ligamentos (Murray y col 2003). En general,
el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), factor
de crecimiento vasculoendotelial (VEGF) y el factor
de crecimiento transformador beta (TGF-β) producen
angiogénesis en el sitio de la lesión (Carter y col 2003,
Murray y col 2003, Carmona y col 2009). El factor de
crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), IGF-I, FGF
y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) estimulan
migración y mitosis de los tenocitos (Murray y col 2003,
Tang y col 2003, Wong y col 2003, Zhang y col 2003).
El TGF-β, IGF-I y FGF estimulan la síntesis de ECM
(Spindler y col 2003).
Factor de crecimiento insulínico tipo-I. El IGF-I pertenece
a la familia de péptidos relacionados con la insulina,
esenciales para un normal desarrollo y crecimiento
(Verwilghen y col 2009). Este factor de crecimiento,
es regulado por el eje de la hormona del crecimiento y
producido principalmente por el hígado, aunque puede
ser sintetizado por muchos tejidos. La principal reserva
de IGF-I es el plasma sanguíneo.
El IGF-I posee dos isoformas, A y B. Estas proteínas
han sido secuenciadas en el caballo y guardan homología
con otros mamíferos (Nixon y col 1999, Verwilghen y
col 2009). Estas moléculas son transportadas por seis

Cuadro 1. Ejemplos de algunas investigaciones sobre terapia regenerativa de tendones y ligamentos en humanos y otras especies
animales.
Examples of some investigations on tendon and ligament regenerative therapy in humans and other animal species.

Especie y tipo de Factor de

Clase de terapia Estructura Resultados Autor
investigación crecimiento
Humano (in vitro) TGF-β1, PDGF-AB, Diferentes Explantes de PDGF-AB ↑ proliferación Murray y col
EGF, bFGF combinaciones ligamento cruzado de fibroblastos ↑ Síntesis de 2003
de GFs anterior colágeno. bFGF ↑ Síntesis de
colágeno
Humano (in vitro) PDGF Combinación con Explantes tendón PDGF contrarresta los efectos Wong y col
dexametasona patelar catabólicos producidos por la 2003
dexametasona
Leporino (in TGF-β1, PDGF Utilización Ligamento colateral TGF-β1 ↑ la fuerza de tensión Spindler y col
vivo) Evaluación independiente y medial de la rodilla de la cicatriz 2003
biomecánica. combinada de GFs.
Leporino (in vitro) bFGF Terapia única Explantes de tendón bFGF ↑ proliferación de Tang y col
intrasinovial fibroblastos ↑ Síntesis de 2003
colágeno
GFs: Factores de crecimiento. TGF-β1: Factor de crecimiento transformador beta 1. PDGF: Factor de crecimiento derivado de las plaquetas AB. EGF:
Factor de crecimiento epidérmico. bFGF: Factor de crecimiento fibroblástico básico.

209
JU Carmona, c lópez
proteínas de unión (IGFPBs) que modulan su acción.
El IGF-I se expresa de manera abundante en animales
jóvenes, pero su nivel disminuye en caballos viejos (Nixon
y col 1999). A nivel articular, el IGF-I induce el aumento
de la síntesis de ECM, así como también de colágeno,
proteoglicanos y ácido hialurónico (Verwilghen y col
2009) y antagoniza los efectos de la IL-1, por esta razón,
estimula la reparación tisular (Platt y col 1998). En seres
humanos la compresión articular dinámica que se genera
con el ejercicio controlado aumenta las concentraciones
de IGF-I en el líquido sinovial y mejora la absorción de
este factor de crecimiento en el cartílago (Verwilghen y
col 2009). Parece ser que el IGF-I podría actuar de manera
similar en tendones y ligamentos equinos (Dahlgren y col
2002, Schnabel y col 2009).
Dahlgren y col (2002) describieron una acción positiva
del IGF-I recombinante humano (rh-IGF-I) sobre la
reparación tisular de un modelo equino de tendinitis
del SDFT inducida con colagenasa. En ese estudio se
observó que en las lesiones tratadas con IGF-I se obtenía
un mejor registro sonográfico, tenían menor grado de
inflamación y se producía una mayor cantidad de colágeno
(hidroxiprolina) y ADN que en las lesiones tratadas con
solución salina (Dahlgren y col 2002).
El esquema posológico de esa investigación incluyó la
aplicación diaria de 2 mg de IGF-I intralesional, durante
10 días (Dahlgren y col 2002). El tratamiento con IGF-I
parece esperanzador. Sin embargo, su costo es elevado,
por lo que esta terapia podría ser prohibitiva para muchos
propietarios. Además, no existe un estudio clínico doble
ciego en el que se describa el comportamiento de esta
sustancia en caballos con enfermedad natural.
Hormona del crecimiento recombinante equina. La
hormona del crecimiento recombinante equina (re-GH)
ha sido evaluada en equinos por sus efectos sobre la
condición corporal y la recuperación de heridas (Dart y
col 2003). Cuando se administra sistémicamente (IM) esta
hormona, aumenta la concentración de IGF-I en el plasma.
Esto se ve reflejado en el mejoramiento de la condición
corporal en yeguas viejas (Dart y col 2003). Los autores
de esas investigaciones trabajaron sobre la hipótesis de
que la administración exógena de re-GH aumentaría las
concentraciones de IGF-I en el líquido sinovial de las
articulaciones y modularía el metabolismo del cartílago
articular. Los resultados evidenciaron a nivel articular un
aumento en las concentraciones de IGF-I. Por tanto, este
hallazgo sugeriría una posible aplicación en lesiones de
tejidos blandos como tendones y ligamentos en caballos.
Sin embargo, en un modelo equino de tendinitis inducido
por colagenasa (Dowling y col 2002) se evaluó el efecto
de la re-GH. En ese trabajo se demostró que la hormona
no alteró el curso de la tendinitis, ni afectó el proceso de
reparación, al comparar los miembros tratados con los
no tratados.
210
Concentrado autólogo de plaquetas
(Plasma rico en plaquetas)
Los concentrados autólogos de plaquetas (APC) y el
plasma rico en plaquetas son preparados hematológicos
que se obtienen por centrifugación de la sangre extraída
con anticoagulantes del mismo paciente. Los APCs
concentran entre 300 y 600 mil plaquetas/µl (Carmona
y col 2011) y el PRP concentra más de un millón de
plaquetas/µl (Marx 2004). Ambos (PRP y APC) son una
fuente natural de varios GFs, principalmente TGF, TGF-,
PDGF, FGF, VEGF y EGF y otras proteínas que modulan
la reparación tisular (Anitua y col 2004, Argüelles y col
2006, Carmona y col 2009, Carmona y col 2011).
El PRP se puede obtener por métodos automatizados
(aféresis), semiautomatizados o manuales y los APCs,
mediante la centrifugación doble en tubo (Carmona y col
2009). En caballos se han documentado por lo menos tres
técnicas para obtener PRP. Carter y col (2003) emplearon
un método de aféresis, y a partir de un litro de sangre entera
con un promedio 120 x 103 plaquetas/µl obtuvieron una
concentración de 490 x 103 plaquetas/µl, y unos niveles
de 74,8 ± 1,31 ng/ml de TGF-β1 y 7,45 ± 0,12 ng/ml de
PDGF-AB.
Sutter y col (2004) describieron la obtención de
PRP equino por medio de dos métodos, un método
semiautomatizado y por aféresis (automatizado).
La concentración de plaquetas obtenidas con ambas
técnicas fue de 855 y 1.472 células/µl, respectivamente.
La concentración de IGF-I fue de 183,4 y 107,4 ng/µl,
respectivamente. La concentración de TGF-β1 fue de
23,6 y 15,3 ng/µl y la de TGF-β2- fue de 4,3 y 1 ng/µl,
respectivamente. El número de leucocitos concentrados
fue de 33,7 y 32,5 células/µl, respectivamente (Sutter y
col 2004).
Se han realizado estudios in vitro (Anitua y col 2005,
Smith y col 2006, Schnabel y col 2007, Schnabel y col
2008, Maia y col 2009, McCarrel y Fortier 2009, Bosch
y col 2010) que han podido esclarecer el comportamiento
y efecto del PRP/APC en ligamentos y tendones en
caballos y seres humanos. Asimismo se han podido
realizar descripciones anecdóticas (Sánchez y col 2003)
y trabajos clínicos controlados (Abellanet 2009, Carmona
y col 2009) de estas sustancias en tendones y ligamentos
en las mismas especies (Carmona y col 2011).
El PRP (APC) in vitro incrementa la capacidad
proliferativa y metabólica de fibroblastos y tenocitos al
aumentar la expresión de colágeno tipo I y la síntesis de
proteína oligomérica de matriz del cartílago (COMP)
(Smith y col 2006, Schnabel y col 2007, Schnabel y col
2008). En explantes de tendón humano, Anitua y col
(2005) demostraron que estas sustancias promovían la
angiogénesis mediante el incremento de la expresión
del factor de crecimiento vasculoendotelial (VEGF) y
el factor de crecimiento hepatocitario (HGF) (Anitua
y col 2005).
 equino, tendinopatía, desmopatía, tejido conectivo, medicina regenerativa
En un modelo equino de tendinitis inducida por
colagenasa (Maia y col 2009) se observó que a los 36
días los caballos tratados con APCs, obtenidos con un
método manual, tenían una mejor disposición histológica
de las fibras de colágeno y fibroblastos sobre la matriz
de sus tendones en comparación con los caballos del
grupo control. Sin embargo, el número de fibroblastos
y vasos sanguíneos no fue diferente entre ambos grupos
(Maia y col 2009). En otro estudio, Bosch y col (2010)
realizaron un estudio sobre la calidad de la reparación
de lesiones tendinosas centrales (core lesion) inducidas
mecánicamente en caballos tratados con PRP (obtenido
mediante un método semiautomatizado). Se observó
que a los seis meses el grupo de caballos tratados con
APC presentó una mejor arquitectura histológica, mayor
contenido de colágeno, glicosaminoglicanos y DNA
y mayor resistencia ténsil que el grupo control. Por
otro lado, los tendones tratados con PRP estimularon
la neovascularización del sitio de la lesión debido a la
concentración de factores de crecimiento especialmente
VEGF (Bosch y col 2010). En estos dos estudios se
puede concluir que tanto el método manual como el
semiautomatizado promueven resultados biológicos muy
similares (Carmona y col 2011).
Se han realizado descripciones anecdóticas de su uso
en patología del tendón de Aquiles en dos atletas y para
tratar una avulsión cartilaginosa no traumática en un
futbolista (Sánchez y col 2003). Sánchez y col (2007)
realizaron un estudio clínico en 12 atletas con lesión
del tendón de Aquiles. Un grupo de seis fue sometido a
reparación abierta con sutura y PRP, el otro grupo (seis
atletas) se trató sin la adición de PRP. Los atletas que
recibieron PRP recuperaron su rango de movimiento
anterior 7 ± 2 semanas frente a 11 ± 3 semanas y
reanudaron sus actividades en 14 ± 0,8 semanas frente
a 21 ± 3 semanas (Sánchez y col 2007). Los resultados
fueron esperanzadores. Sin embargo, es necesario realizar
más investigación clínica y molecular en este campo.
De manera hipotética, se podría pensar que la
utilización de PRP podría servir para tratar las tendinopatías
y desmopatías en el caballo. Se emplearía un tratamiento
biológico autólogo con un costo de obtención asequible
a la mayoría de los propietarios y se infiltraría una
concentración elevada de diferentes GFs en una proporción
posiblemente ideal (Dowling y col 2000).
Se ha investigado el efecto clínico de la infiltración
intralesional del APC en tendinopatías y desmopatías
de caballos (figura 5) (Abellanet 2009, Carmona y col
2009). El método empleado por estos dos autores para
obtener los APCs es una técnica de doble centrifugación
en la que se puede lograr una concentración de 350-470
x 103 plaquetas/µl (Argüelles y col 2006). Carmona y col
(2009) encontraron que esta sustancia (APC) mejoraba
la apariencia sonográfica y disminuía la cojera asociada
con la lesión. Además, los animales retornaron a su
nivel de ejercicio normal, más rápido de lo que lo hacen
los controles históricos (propios o los descritos en la
literatura), tratados con terapia conservadora o con reposo
(Carmona y col 2009).
Abellanet (2009) realizó un estudio clínico controlado
donde evaluó el uso clínico de APCs (obtenidos mediante
el método del tubo (Argüelles y col 2006, Carmona y col
2009) en caballos trotones. 10 caballos con tendinopatía
del flexor digital profundo, 16 con lesiones del ligamento
suspensorio y 72 con tendinopatía del tendón flexor digital
superficial. Los caballos con tendinopatía del tendón
flexor digital profundo que recibieron tratamiento con
APCs presentaron mejoría del 100% en comparación con
el 0% del grupo control (n= 4) y una recidiva del 17% en
los caballos tratados. Los caballos con desmopatía del
ligamento suspensor presentaron una mejoría clínica del
90% vs 0% para el grupo control (n = 16). De aquellos
que fueron tratados con APCs recayó el 10%. Los caballos
con tendinopatía del tendón flexor digital superficial
presentaron una mejoría clínica del 80% vs 45% para
el grupo control (n = 9). De los que fueron tratados con
APCs recayó el 22% en comparación con el 80% del
grupo control. Todos los caballos tratados con APCs se
recuperaron al cabo de 6 meses (Abellanet 2009).
Aspirados de médula ósea y células
mesenquimales
Herthel (2001) describió la utilización de aspirados
de médula ósea como tratamiento de 100 caballos con
desmopatía del SL. El 50% de estos pacientes también fue
tratado con fasciotomía plantar. Los resultados obtenidos
fueron buenos y más del 85% de los caballos recuperaron
un nivel de función normal a los seis meses y otro 5%
continuó con cojera moderada. Sin embargo, no demostró
si la mejoría clínica en esos caballos se pudo presentar
por repoblamiento celular o por el efecto modulador
de la respuesta biológica, que pudo ser desencadenado
por GFs presentes en esos aspirados medulares, o por la
fasciotomía que fue realizada en el 50% de los caballos
(Herthel 2001).
El grupo de Smith (Smith y col 2003) fue uno de
los primeros en usar células mesenquimales autólogas
como tratamiento en lesiones de tendón en caballos. En
el 2003 ese equipo (Smith y Schramme 2003) describió
una técnica para aislar y replicar células mesenquimales
obtenidas de la medula ósea esternal de un caballo de polo
con una lesión crónica central grave de un SDFT con una
cronicidad de cinco meses de duración. En ese caso, solo
se empleó sedación y anestesia local, tanto para obtener
el aspirado medular, así como para la posterior aplicación
de las células mesenquimales, 16 días posteriores a su
obtención. Esos investigadores reexaminaron el paciente a
los 10 días y seis semanas posteriores a la infiltración. Las
evaluaciones ecográficas mostraron una clara disminución
del proceso patológico y una estructura tendinosa casi
normal a las seis semanas (Smith y Schramme 2003).
211
JU Carmona, c lópez
Los resultados descritos fueron buenos para ese
paciente. Sin embargo, no se puede concluir que la
implantación de las células mesenquimales haya sido
responsable de los cambios ecográficos observados.
Es necesario considerar que la calidad de la imagen
ecográfica no está correlacionada con la calidad de la
ECM del tendón (Dowling y col 2000).
En el 2008 Smith publicó un valioso trabajo donde
evaluó el tratamiento con células mesenquimales
autólogas en 168 caballos de deporte con lesión en el
SDFT. Luego de 48 semanas de rehabilitación, los caballos
retornaron a su entrenamiento habitual. De los caballos
que se introdujeron a un entrenamiento continuo solo
reincidió el 18% contra un 56% reportado con terapias
convencionales (Smith 2008).
Recientemente, el equipo de Smith (Guest y col
2010) realizó una investigación en ocho caballos con
lesión del SDFT, los cuales fueron tratados con células
embrionarias alogénicas y con células mesenquimales
estromales autólogas. Lo más llamativo de este estudio
fue la supervivencia que tuvieron las células embrionarias
(60%) frente a las células mesenquimales (< 5%) en la
sección inyectada del tendón. Por otra parte, se estableció
que no hubo ningún tipo de respuesta inmune en los
caballos luego de la aplicación intralesional de las células
embrionarias alogénicas (Guest y col 2010).
Crovace y col (2010) realizaron un estudio
histológico e inmunohistoquímico en seis caballos, en
el que evaluaron el efecto de tres tratamientos: 1) células
estromales de medula ósea, 2) células mononucleadas
de médula ósea y 3) placebo (solución salina) en un
modelo de tendinitis inducida por colagenasa. En
los tratamientos 1 y 2 hubo mayor presentación de
colágeno tipo I (2,6 y 3,0 unidades semicuantitativas
de clasificación histológica (USCH) respectivamente)
y menor presentación de colágeno tipo  III (1,2 y 1,4
USCH respectivamente). Asimismo, la concentración
de COMP se encontró aumentada (2,2 y 2,4 USCH
respectivamente). El grupo placebo, por el contrario,
experimentó un aumento en la presentación de fibras
de colágeno tipo III (2,3 USCH) menor presentación
de fibras de colágeno tipo I (1,3 USCH) y menor
concentración de COMP (1,3 USCH). Los resultados
de este trabajo sugieren una regeneración del tejido
lesionado experimentalmente en los tratamientos 1 y 2,
mientras que en el tratamiento 3 sugiere una reparación
cicatricial en el área dañada experimentalmente
(Crovace y col 2010). Aunque los tratamientos 1 y 2
no difirieron estadísticamente, el posible uso de células
mononucleadas derivadas de médula ósea podría ser una
opción terapéutica más económica y menos sofisticada
para tratar lesiones en tendones equinos con enfermedad
natural. Sin embargo, es necesario realizar más estudios
donde se obtenga información bioquímica y molecular
de estas sustancias y así afianzar su uso en la clínica
equina.
212
conclusión
Los nuevos conocimientos moleculares del
comportamiento fisiopatológico de las lesiones de los
tendones y ligamentos del caballo y otras especies
animales han permitido desarrollar nuevas estrategias
para el desarrollo de tratamientos regenerativos de estas
patologías. Sin embargo, solo a través de investigaciones
experimentales y clínicas estrictamente planificadas,
desarrolladas y evaluadas se podrá conocer el lugar
adecuado de cada una de las terapias regenerativas
presentadas en esta revisión.
RESUMEN
Las lesiones de tendones y ligamentos son frecuentes en caballos.
Las estructuras más afectadas son el tendón digital flexor superficial
(SDFT) y el ligamento suspensor (LS). La forma clínica de estas
patologías generalmente es crónica y de naturaleza degenerativa. Los
tratamientos comúnmente empleados no producen curación definitiva
del problema. Una gran mayoría de pacientes recaen o no vuelven a
recuperar su capacidad atlética inicial. El avance del conocimiento
molecular de la fisiopatología de las tendinopatías y desmopatías del
hombre, caballo y otros animales ha permitido evidenciar la presencia
de citocinas catabólicas, las cuales posiblemente sean responsables del
trastorno general observado en estas patologías. El objetivo actual del
tratamiento de estos problemas es la regeneración y no la reparación
(cicatriz) del tejido lesionado. En el caballo se han descrito tratamientos
experimentales y clínicos novedosos. Estos tratamientos incluyen la
inyección de aspirados de médula ósea, células madre mesenquimales,
factores de crecimiento recombinantes como el factor de crecimiento
insulínico tipo I y plasma rico en plaquetas (también llamado concentrado
autólogo de plaquetas), entre otros. Los resultados observados han sido
prometedores cuando estas novedosas terapias han sido empleadas. Sin
embargo, al igual que lo que sucede con otros tratamientos, es necesario
realizar más investigaciones para demostrar que su uso clínico puede ser
efectivo y seguro en caballos.
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ORIGINAL ARTICLE

Effect of citric acid supplemented diets on aflatoxin degradation,

growth performance and serum parameters in broiler chickens#

Efecto de dietas suplementadas con ácido cítrico en la degradación de aflatoxinas,

el crecimiento y los parámetros sanguíneos de pollos de engorda

L Salgado-Tránsito, JC Del Río-García, JL Arjona-Román, E Moreno-Martínez, A Méndez-Albores*

Facultad de Estudios Superiores, Universidad Nacional Autónoma de México, UNIGRAS-Unidad de Investigación
Multidisciplinaria, Cuautitlán Izcalli, México.

RESUMEN

Este estudio fue realizado para investigar los efectos del ácido cítrico (CA) sobre la degradación de las aflatoxinas, el crecimiento y algunos
componentes del suero sanguíneo de pollos de engorda. 300 pollos de un día de edad (Ross) fueron divididos aleatoriamente en cinco grupos con tres
repeticiones de 20 pollos cada uno. Cuatro grupos recibieron la dieta suplementada con CA (6,25, 12,5, 25 y 50 g/kg), mientras que el otro sirvió como
grupo control. La dieta fue preparada con base en las recomendaciones de la NRC, y el experimento fue terminado cuando las aves alcanzaron 28 días
de edad. Los resultados mostraron que las aflatoxinas en la dieta a una concentración de 39 ng/g fueron degradadas (92%) por el procedimiento de
acidificación. En general, el peso vivo (LBW) fue ligeramente mayor en los animales alimentados con la adición de CA; la dieta con la concentración
más alta (50 g CA/kg) resultó en un aumento significativo en el LBW y una mejora en el índice de conversión. Sin embargo, a medida que se incrementó
la concentración de CA, valores altos en la actividad de la enzima aspartato aminotransferasa fueron registrados. Por el contrario, el hematocrito, las
proteínas totales y la albúmina no fueron afectados por cualquier nivel de inclusión de CA en la dieta. De estos resultados, se concluye que el CA puede
ser usado como un aditivo para degradar a las aflatoxinas en la dieta, así como para promover el crecimiento en pollos de engorda jóvenes.

Key words: broilers, aflatoxins, citric acid, serum parameters.

Palabras clave: pollos de engorda, aflatoxinas, ácido cítrico, parámetros sanguíneos.

INTRODUCTION form a unique group of highly oxygenated, naturally

The poultry industry is continuously searching for
additives to improve feed efficiency and animal health;
among these compounds, organic acids are promising
alternatives. Dietary organic acids and their salts inhibit
microorganism growth in feed, and maintain the microbial
balance in the gastrointestinal tract (GIT) (Naidu 2000).
Several authors have reported positive effects of certain
organic acids in poultry diets (Runho et al 1997, Jin et al
1998), since acidifiers might improve poultry performance
by reducing colonization of pathogenic microorganisms
and toxic bacterial metabolites such as ammonia and
amines (Chaveerach et al 2004). Moreover, Méndez-
Albores et al (2007) have observed that citric acid degrades
aflatoxins in the ration.
Aflatoxins (AF) are a group of acutely toxic metabolites
produced by toxigenic strains of Aspergillus flavus Link,
Aspergillus parasiticus Speare, and Aspergillus nomius
Kurtzman et al (Feibelman et al 1998, Weidenbörner
2007). These toxins have closely similar structures and
Accepted: 19.01.2011.
# CONACYT project Nº 117893.
* Cuautitlán Izcalli, C.P. 54714, México; albores@unam.mx
occurring heterocyclic compounds. Four principal AF
are produced by those fungi: AFB1, AFB2, AFG1, and
AFG2. AF causes a wide range of clinical and sub-
clinical problems in poultry related to many different
toxic effects; among them, reduced performance, hepatic
intoxication, adverse effects on carcass as well as on egg
shell quality, immunosuppression, and carcinogenicity
have been reported by different authors (Charmley et al
1995, Hussein and Brasel 2001, Kermanshahi et al 2007).
At present, unfortunately, aflatoxins are considered
unavoidable contaminants of feed and foods. The Food
and Agriculture Organization (FAO) estimates that at
least 25% of world cereal production is contaminated
with mycotoxins (Dowling 1997). For this reason,
developments of detoxification procedures are needed.
Such detoxification procedures should not only reduce
the concentration of toxins to “safe” levels (below
regulatory limits), but also to prevent production of new
toxic products derived from the aflatoxin degradation,
and of course non-reduction of the nutritional value of
the treated commodities. A number of methods have
been investigated in connection with their effectiveness
to inactivate aflatoxins in contaminated feedstuffs; the
aims of these methods are either to remove or to destroy
the toxin, and can be classified into physical, biological
and chemical methods.

215
L Salgado-Tránsito et al

Citric acid (CA) is one of the most widely-used food
additives, which is commonly used as a preservative,
acidulant, pH control agent, flavor enhancer, and
antioxidant in many foods. Global production (mainly
through microbiological fermentation) is estimated to be
approaching 45 tons per year (Kristiensen et al 1999). The
US Food and Drug Administration classify CA as a GRAS
(Generally Recognised as Safe) substance.1 However,
some toxic effects of CA have been also studied (Aktaç
et al 2003a, 2003b, Yılmaz et al 2008, Abd-AlGadir et al
2009).
Our recent studies indicated that aqueous CA had
a detoxification effect when used to treat aflatoxin-
contaminated feeds (Méndez-Albores et al 2009).
Considering that the acidic treatment protects ducklings
from chronic aflatoxin toxicity and greatly reduces the
mutagenic and carcinogenic activity of aflatoxins in the
Ames test (Méndez-Albores et al 2005), the purpose of
the present study was to determine the effect of dietary
CA on the stability of B-aflatoxins in feed, as well as on
growth performance and biochemical parameters in the
blood of young broiler chickens.
MATERIAL AND METHODS
drying. The chicks were fed with five diets: (1) CA-
supplemented feed with 6.25 g/kg; (2) CA-supplemented
feed with 12.5 g/kg; (3) CA-supplemented feed with 25
g/kg; (4) CA-supplemented feed with 50 g/kg citric acid;
and (5) the control diet, consisting of CA-free feed. The
pH of the diets was determined according to the 02-52
AACC method (AACC 2000). All diets were tested for
total aflatoxins before and after CA addition.
Aflatoxin analysis
The total aflatoxin content in the feed was determined
according to the 991.31 AOAC (1995) method using
monoclonal antibody columns for aflatoxins B1
and B2 (VICAM Science Technology, Watertown,
MA, USA). The detection limit for aflatoxins with
the immunoaffinity column (IAC) via fluorescence
measurement is approximately 0.5 ng/g (Hansen 1990).
Aflatoxin identification was performed by a modification
of the HPLC-AFLATEST procedure. A Waters HPLC
equipment with two pumps (Model 510. Waters
Associates, Milford, MA), and a Waters nova-pak C18
reverse phase column (5 µm, 3.9mm  150mm) was used.

Chemicals Table 1. Ingredients and nutrient composition of the control

experimental diet.
Anhydrous citric acid (99.9% purity) was obtained Ingredientes y composición de nutrientes de la dieta control
from Mallinckrodt Baker (JT Baker, Xalostoc, Mexico). experimental.
The chemical properties of citric acid are as follows:
chemical formula C6H8O7, and molecule weight 192.13 Ingredient % Calculated analysis4 %
g/mol. All other chemicals used were analytical reagent Sorghum 50.33 ME (Kcal/Kg)5 3010
grade. Soybean meal (48) 41.52 Crude protein 24
Sunflower oil 3.46 Calcium 1
Diets
Orthofosfate 1.86 Phosphorus, total 0.5
A control sorghum-soybean meal based diet was Calcium carbonate 1.56 Methionine + Cystine 1.6
prepared based on National Research Council (NRC 1994) Salt (NaCl) 0.41 Lysine 1.5
recommendations. The composition and chemical analysis
Alimet 881 0.35 Threonine 0.97
is presented in table 1. For preparing other treatments,
the control diet was supplemented with aqueous CA at L-Lisine HCl 0.19 Zinc (mg/kg) 45
levels of 6.25, 12.5, 25 and 50 g/kg, respectively. No Choline chloride 0.1 Analyzed
antibiotic or anticoccidial drug was used in those diets. Vitamine premix2 0.1 Crude protein 23.75
The moisture content (M.C.) of the diets was adjusted
Mineral premix3 0.05 Calcium 1.1
to 30% by adding 265 ml/kg of aqueous CA solutions.
Samples were mixed at low speed for 15 min in a mixer Sugar + zinc 0.05  Phosphorus, total 0.57
(model C-100, Hobart Corp., Troy, OH). After mixing, L-Threonine 0.03  
samples were transferred to plastic bags and stored at
1 Aqueous solution of 2-hydroxy-4-(methylthio) butanoic acid (HMTBA).
4ºC for 72 h, in order to achieve M.C. equilibration. The 2 Vitamine premix supplied/kg diet: Vitamin A, 12 000 IU; Vitamin
acid-treated feed was dried in a vacuum oven at 40ºC for D3, 2 500 IU; Vitamin E, 15 mg; Vitamin K3, 2mg; Vitamin B1,
48h, and thoroughly mixed. The final average M.C. of the 2.25mg; Vitamin B2, 7.5 mg; Vitamin B6, 3.5mg; Vitamin B12,
diets was 12%, determined by drying replicate portions of 0.020mg; folic acid, 1.5mg; pantothenic acid, 12.5mg.
3 Mineral premix supplied/kg diet: Cu, 8mg as CuSO4.5H2O; Mn,
5–10 g each of feed at 103 ºC for 72 h, with percentages
100mg as MnO; Fe, 80mg as FeSO4.H2O; I, 1mg as ethylenediamine
calculated on a wet-weight basis. The control diet (non
dihydroiodide (EDDI); Se, 0.15mg as Na2SeO3.
CA added) was treated similarly to the CA treated diets 4 Data on dry matter.

regarding M.C. adjustment, mixing, equilibration and 5 ME: Metabolisable energy.

216

Standards as well as samples collected from the IAC (20
µl), were injected into a HPLC and eluted isocratically
with a mobile phase of 12.5 mN acetic acid:acetonitrile
(1:1, v/v, pH=3.5) at a flow rate of 1ml/min. Aflatoxins
were fluorometrically detected and identified using a
fluorescence detector (Waters model 470); the excitation
and emission wavelengths were 338 and 425 nm,
respectively. Aflatoxins (standards and samples), were
analyzed by HPLC without derivatization. Aflatoxins
were identified by their retention time (Rt), compared
with those for a pure aflatoxin standard solution under
identical conditions.
Animals
For the experiment, 300 one-day-old Ross broiler
chicks were divided into four experimental groups and
one reference group (such that the average weight of the
animals in the groups differed by less than 1 g). Twenty
birds of mixed sex (three replicates) were housed in
plastic cages, 113 cm (l)  90 cm (w)  60 cm (h), in a
light-cycled room (12 h cycle), maintained within the
temperature range of 30–32 ºC with free access to food
and water. In each cage, local heat sources from IR lamps
of 250W were used to maintain the body temperature of
the birds between 39 and 42 ºC. The floor was covered
with 5  cm deep wood shavings and two 2 L capacity
chick cup drinkers were placed per cage. When birds
were 14 days old, the cup drinkers were replaced by
trough drinkers. During the first seven days of age, chicks
were fed in a tray feeder, over which a 1 cm mesh plastic
screen was placed to prevent feed wastage. After seven
days of age, feed was offered in trough feeders 91.5 cm
(l)  11.5 cm (w)  5.4 cm (d).
Collection of samples and measurements
Feed and water were provided ad libitum during the
whole period of the experiment (28 d). Broilers were
Table 2. Efficiency of aflatoxin degradation of aqueous citric acid and pH in the diet.
Eficiencia del ácido cítrico acuoso en la degradación de las aflatoxinas y valores de pH de la dieta.
Total aflatoxins (ng/g)*
(g CA/kg)
Before CA addition After CA addition
6.25 40 ± 1.5ª 4 ± 0.7a
12.5 37 ± 1.2ª 3 ± 0.6a
25 42 ± 1.9ª 3 ± 0.9a
50 38 ± 0.7ª 3 ± 0.3a
0 39 ± 0.4ª 42 ± 2.6b
Mean of three replicates ± s.e.
Column means with common superscripts do not differ (P > 0.05).
* AFB1 and AFB2.
broilers, aflatoxins, citric acid, serum parameters
individually weighed at the beginning of the experiment,
then at weekly intervals until the end of the experiment.
Live body weight (LBW), feed consumption (FC), and
feed conversion ratio (FCR) were recorded during these
periods. After 28 days, blood was drawn by cardiac
puncture under anesthesia (the bird was exposed for
one minute to 40% carbon dioxide, 30% oxygen, and
30% nitrogen) from 15 randomly selected birds from
each treatment, and serum prepared. Total protein and
albumin were determined using commercially available
kits (Wiener Lab, Rosario Argentina). The serum alanine
aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase
(AST) activities were determined according to Reitman
and Franked (1970). The bled animals were then exposed
to 80% carbon dioxide, 5% oxygen, and 15% nitrogen for
euthanasia (Coenen et al 2000). Proventriculus, gizzard,
liver plus gall bladder, spleen and bursa were excised,
washed in cold saline and their relative percentages
estimated. The intestinal weight was also considered and
pH values in different parts of the GIT (proventriculus,
gizzard, duodenum, jejunum and ileum) were also
registered immediately by using a digital pH meter
(HANNA, model HI 99163, Romania).
Experimental design and statistical analysis
The experiment was conducted as a completely
randomized design with three replicates. Data were
assessed by analysis of variance (ANOVA) and means
were separated by the Dunnet procedure using the
Statistical Analysis System (SAS 1998). A significance
value of ( = 0.05) was used to distinguish significant
differences between treatments.
RESULTS
Table 2 shows the result of the aflatoxin analysis.
Results showed that feed contained 39 ± 0.8 ng/g of total
aflatoxins. However, in the CA supplemented diets, the
Disappearance Final pH
of fluorescence (%) of diet
90 5.6 ± 3.4-4a
92 5.1 ± 4.3-4b
93 4.5 ± 6.3-4c
92 3.9 ± 3.6-4d
- 6.2 ± 4.2-4e
217
L Salgado-Tránsito et al

post-reaction aflatoxin content was 3 ± 0.3 ng/g. This
reduction in the aflatoxin content represents approximately
92%. The chromatograms of the HPLC (not presented)
indicate that the toxins in the feed were AFB2 and AFB1,
with concentrations of 3 and 36 ng/g, respectively. In
extracts of CA-supplemented diets, the fluorescence of
AFB2 was not detected, while AFB1 fluorescence was
much weaker than in the untreated samples. Table 2 also
shows the pH values for the ration; as the CA concentration
increased, the pH value was decreased. Samples with no
acid presented an average pH value of 6.2; while the lowest
pH value (3.9) was observed in the ration prepared with
the addition of 50 g CA/kg.
The effects of dietary CA supplementation on growth
performance of broiler chickens are summarized in
table 3. The results indicated that LBW was significantly
improved in birds fed diet supplemented with 12.5, 25
and 50 g CA/kg, with average values of 913, 892 and
1013 g, respectively. In general, LBW was slightly
higher in animals fed with the addition of CA in their
diet, as compared to the control. Additionally, FC did not
significantly differ between groups; the average value was
57 g/bird/day. Birds fed supplemental CA had significantly
better FCR values compared to the control diet (1.99 g
feed/g gain). However, no difference was found in birds
fed with the addition of 6.25, 12.5 and 25 CA/kg; in those
groups FCR values were 1.81, 1.81 and 1.82 g feed/g gain,
respectively. The lowest value in FCR was registered in
birds fed a diet containing 50 g CA/kg (1.55 g feed/g gain).
Dietary supplementation of CA did not significantly
affect the values of hematocrite and the serum
concentrations of total protein and albumin (table 4).
However, significant differences were found for both serum
AST and ALT activities levels. As the CA concentration
increased, higher AST values were registered. The animals
fed diet supplemented with 50 g CA/kg, presented the
highest AST value (45 U/L), as compared to the control
(23 U/L). On the contrary, supplementation of CA lowered
the values of the ALT activity.
Organ weights were not affected due to the addition of
CA to the ration (table 5). Moreover, the effect of dietary
acidification on pH values of different GIT segments
are presented in table 6. The results indicated that CA
supplementation had no effect on the proventriculus,
gizzard, duodenum, jejunum and ileum pH values.
DISCUSSION
Sorghum is considered the fifth most important
crop in the world after wheat, rice, maize, and barley,
due to its resistance to drought and high temperatures
(ICRISAT/FAO 1996). Its nutritional value is quite
similar to maize and it has been used as an ingredient
for inclusion in foods and feeds. Unfortunately, sorghum

Table 3. Effect of dietary citric acid on growth performance of broiler chickens.

Efecto del ácido cítrico sobre el desempeño del pollo de engorda.

Dietary organic acid supplementation (g CA/kg)

Parameter
6.25 12.5 25 50 0 (control)
LBW (g) 851 ± 13.6ab 913 ±15.4bc 892 ± 15.5bc 1013 ± 47.8c 786 ± 11.4a
FC (g/bird/day) 55 ± 2.3a 59 ± 2.7a 58 ± 2.9a 56 ± 3.8a 56 ± 2.0a
FCR (g feed/g gain) 1.81 ± 0.02b 1.81 ± 0.02b 1.82 ± 0.02b 1.55 ± 0.03c 1.99 ± 0.02a

Mean ± s.e.
Row means with common superscripts do not differ (P > 0.05).
LBW = live body weight; FC = feed consumption; FCR = feed conversion ratio.
n = 60.

Table 4. Effect of dietary citric acid on some serum constituents in broiler chickens.
Efecto del ácido cítrico sobre algunos constituyentes del suero sanguíneo de los pollos de engorda.

Dietary organic acid supplementation (g CA/kg)

Parameter
6.25 12.5 25 50 0 (control)
Hematocrite (%) 63 ± 1.7ª 67 ± 1.2ª 67 ± 2.7ª 66 ± 1.0a 63 ± 1.8ª
Total protein (g/L) 3.8 ± 0.1ª 3.6 ± 0.1ª 3.6 ± 0.1ª 3.6 ± 0.1ª 3.6 ± 0.1ª
Albumin (g/L) 1.1 ± 0.1ª 1.2 ± 0.1ª 1.3 ± 0.1ª 1.2 ± 0.1ª 1.2 ± 0.1ª
AST (U/L) 30 ± 0.9b 32 ± 1.0b 38 ± 1.2c 45 ± 0.8d 23 ± 1.7a
ALT (U/L) 5 ± 0.3b 6 ± 0.9b 6 ± 1.3b 8 ± 0.3b 21 ± 0.8a

Mean of 15 replicates ± s.e.

Row means with common superscripts do not differ (P > 0.05).
AST = aspartate aminotransferase; ALT = alanine aminotransferase.

218

is invaded by fungi during its development and harvest
in the field, as well as during the process of transport
and storage. Therefore, one of the factors affecting the
sanitary quality of feeds prepared with this grain is
aflatoxin contamination produced by certain species
of fungi, among them strains of Aspergillus flavus. In
this research, the aflatoxin quantification/identification
method indicates that the toxins in the diet were only
AFB2 and AFB1, with a total concentration of 39 ng/g.
These total aflatoxin concentration are commonly found
in commercial grains of underdeveloped countries being
one of the major causes of low productivity in animals.
Animals which consume high levels of these toxins may
develop various health problems, depending on their
susceptibility. In the case of poultry, aflatoxicosis is
characterized by weakness, anorexia with lower growth
rate, poor utilization, decreased weight gain, decreased
egg production, increased susceptibility to environmental/
microbial stress and increased mortality (Leeson et al
1995, Bailey et al 1998, Kubena et al 1998, Dershant-Li
et al 2003, Kermanshahi et al 2009).
Supplementation with aqueous CA substantially
reduced the pH of the diets according to the added
content (table 2). This effect is interesting because the
acidic treatment reduced the aflatoxin concentration in
the feed up to 92%. The chromatograms of acidified
samples may provide support for detoxification activity.
It also suggests that the molecule structure in post-treated
aflatoxin contaminated samples changes, the lactone ring
may be opened. Thus, detoxification initially involves
the formation of the b-keto acid structure (catalyzed
by de acidic medium), followed by hydrolysis of the
lactone ring yielding the AFD1 molecule, derivated from
decarboxylation of the lactone ring-opened form of
AFB1 (Méndez-Albores et al 2005), which is 130 times
less mutagenic in the Ames test and presenting 20-fold
toxicity decrease (Schroeder et al 1985). Therefore, the
fluorescence strength varies in the HPLC chromatograms
at the same retention time values.
Organic acids are also extremely efficient against
bacteria in poultry, and their antimicrobial effect increases
with concentration/length of the carbon chain (Van
Immerseel et al 2006). At a pH below 3.5, almost all
organic acids are effective in controlling bacterial growth.
As an alpha-hydroxy-carboxylic acid, CA has higher
dissociation capacity and its carboxylic group links with
ammonia in equimolar quantity (one molecule of CA
saturated three molecules of ammonia), thus CA possesses
inhibiting, bacteriostatic, and neutralizing effects against
ammonifying bacteria, E. coli, and Salmonellae (Ivanov
2001).
Organic acids also have a positive effect on growth
performance; since dietary acidification increases gastric
proteolysis and protein/amino acid digestibility by
enhancing digestive enzyme activities (Langhout 2000).
The reason why protein is better used when CA is added
broilers, aflatoxins, citric acid, serum parameters
to diet is due to the fact that pepsinogen is converted to
pepsin, which increases pepsin activity and improves
protein digestibility. Moreover, peptides arising from
pepsin proteolysis trigger the release of hormones
(including gastrin and cholecystokinin) which regulate
the digestion and absorption of protein. The results of
LBW, FC and FCR obtained in this experiment confirm
those reported by Khosravi et al (2008) in broilers fed
diet supplemented with 2 g/kg propionic acid during 21 d
period. In those birds, LBW, FC and FCR registered values
of 612 g, 48 g and 1.5, respectively. The improvement
of FCR and the increase of LBW have already been
demonstrated in broilers fed a diet supplemented with
acidifiers (Denli et al 2003). However, test results for
the inclusion of certain organic acids in broiler rations
remain limited and controversial. Yesilbag and Colpan
(2006) investigated the effect of three levels of an
organic acid mixture (formic/propionic/ammonium
salts) on performance, egg production/quality and serum
parameters in laying hens. In general, growth performance
(LBW and FC), and egg quality parameters were not
significantly affected by supplementing diets with 0.5, 1
or 2% dietary organic acid mixture. Cave (1984) and Jacob
et al (1990) reported a decrease in food consumption in
broiler chickens fed with a diet containing 3% and 7.5%
lactic acid, respectively. It is well known that organic
acids have a low tendency to free their H+ ions and the
strong taste is associated with them. Consequently, high
amounts of organic acid supplementation may reduce the
feed consumption, because of changes in diet palatability.
In this research, the highest addition of CA to diets (50 g/
kg) was successfully tolerated by the chickens (table 3).
In summary, the better LBW and FCR values in some
acidified diets may be due to the effect of CA by reducing
the aflatoxin content, or either by controlling pathogenic
bacteria, or maintaining the health of GIT improving the
broilers performance.
Among the different serum parameters measured,
hematocrite, serum total protein, and albumin
concentrations were not significantly affected at the end
of the experiment in broilers receiving the four dosages
of CA (table 4). These results are consistent with those
obtained in broiler chicks due to acetic acid inclusion
(Abdo 2004). Abdel-Fattah et al (2008) also reported
that total protein and albumin were not affected due to
the inclusion of 1.5 or 3% CA in broiler chickens fed
during 42 d period.
While the increment of the enzymatic values in birds
varies with the different species, the elevation of the
enzymatic activity has been correlated with hepatocellullar
damage. The most frequent cause of the elevation of the
AST activity in birds is hepatic disease; birds with AST
values in the upper 230 U/L range are considered abnormal
(Campbell and Coles 1986). A moderate increase (2–4
fold) in the AST enzyme is observed when there is soft
weave injury, whereas in the hepatic necrosis, a more
219
L Salgado-Tránsito et al

remarkable elevation is caused. In this research, the results
demonstrate that the inclusion of different concentrations
of CA in the feed, significantly affects the AST activity;
however, the maximum increase in the AST activity
(1.9 fold), was observed in birds fed a diet with 50 g CA/kg
(table 4). In the case of ALT activity, lower values were
registered due to the inclusion of CA. These results are in
agreement with those reported by Brenes et al (2003) who
reported ALT values of 1 and 1.5 U/L in broiler chickens
fed a diet containing 20 g CA/kg at different levels of
available phosphorous (2.5 and 3.5 g/kg, respectively).
Aktaç et al 2003a reported that CA (LD25 = 480 mg/
kg.bw) applied intraperitoneally to mice increases serum
AST level (from 177.8 to 307.2 UI/L), and decrease ALT
activity (from 695 to 101 UI/l). Microscopic examination
of liver showed histopathological changes such as tissue
degeneration, cytoplasmic vacuolisations, nuclear
membrane invaginations, picnotic nucleus and necrosis
of hepatocytes, in part attributed to acidosis and calcium
deficiency. Those findings are in close agreement with the
results found in the present investigation; however, the
effect of CA on transaminase activity might be related to
differences in gender and lines of the animals.
As shown in table 5, no statistical differences were
noted among all treatments in the relative proventriculus,
gizzard, liver, intestine, spleen and bursa percentages.
These results confirmed those of Denli et al (2003) who
found that dietary organic acids had no effect on carcass
yield and liver weight of broiler chickens at 42 d old.
Yesilbag and Colpan (2006) also concluded that dietary
supplementation with organic acids did not affect interne
organ weights (hearth, liver, and spleen) in laying hens
fed with a diet containing up 1.5% organic acid mixture
during 18 week period.
The effect of dietary acidification on pH values of
different GIT segments are presented in table 6. The
results indicate that CA supplementation slightly reduced
proventriculus, gizzard, duodenum, jejunum and ileum pH
values, compared with the control group. However, the
differences are not significant. These results are consistent
with Denli et al (2003) who reported that giving broilers
an organic acid mixture showed no significant reduction
in the intestinal pH. Hernández et al (2006) reported
no effect on intestinal pH with the use of a product
containing a combination of propionic/formic acid. These
authors attributed this insignificant effect to the strong
buffering action of the GIT in broiler chickens. Prior to
birth, the GIT of birds is free of any strains of microbial
populations, and bacteria from the diet, water, excreta and
environment begin to colonize the GIT almost shortly.

Table 5. Effect of supplemental citric acid on some organs as a percentage of body weight in broiler chickens.
Efecto de la suplementación de ácido cítrico en algunos órganos expresado como porcentaje del peso corporal de los pollos de engorda.

Dietary organic acid supplementation (g CA/kg)

Parameter
6.25 12.5 25 50 0 (control)
Proventriculus 0.5 ± 0.03ª 0.5 ± 0.01ª 0.6 ± 0.05ª 0.5 ± 0.02ª 0.6 ± 0.01ª
Gizzard 2.4 ± 0.10ª 2.3 ± 0.18ª 2.4 ± 0.14ª 2.4 ± 0.08ª 2.5 ± 0.27ª
Liver 2.8 ±0.19ª 2.9 ± 0.14ª 2.5 ± 0.21ª 2.5 ± 0.17ª 2.9 ± 0.15ª
Intestine 5.1 ± 0.13ª 5.2 ± 0.31ª 5.3 ± 0.26ª 5.4 ± 0.16ª 6.0 ± 0.72ª
Spleen 0.08 ± 0.01ª 0.12 ± 0.03ª 0.08 ± 0.01ª 0.09 ± 0.01ª 0.10 ± 0.01ª
Bursa 0.23 ± 0.02a 0.25 ± 0.02ª 0.23 ± 0.06a 0.28 ± 0.02ª 0.24 ± 0.02a

Mean of 15 replicates ± s.e.

Row means with common superscripts do not differ (P > 0.05).

Table 6. Effect of supplemental citric acid on pH values of some gastrointestinal tract segments in broiler chickens.
Efecto de la suplementación de ácido cítrico en los valores de pH de algunos segmentos del tracto gastrointestinal de los pollos de engorda.

Dietary organic acid supplementation (g CA/kg)

Parameter
6.25 12.5 25 50 0 (control)
Proventriculus 3.5 ± 0.11ª 3.4 ± 0.17ª 3.3 ± 0.11ª 3.3 ± 0.08ª 3.4 ± 0.08ª
Gizzard 2.4 ± 0.11ª 2.6 ± 0.03ª 2.9 ± 0.33ª 2.5 ± 0.14ª 2.6 ± 0.21ª
Duodenum 6.2 ± 0.04ª 6.1 ± 0.12ª 6.1 ± 0.08ª 6.4 ± 0.06ª 6.3 ± 0.05ª
Jejunum 6.3 ± 0.04ª 6.4 ± 0.06ª 6.3 ± 0.03ª 6.4 ± 0.04ª 6.4 ± 0.01ª
Ileum 6.6 ± 0.10ª 6.5 ± 0.11ª 6.4 ± 0.03ª 6.6 ± 0.06ª 6.5 ± 0.10ª

Mean of 15 replicates ± s.e.

Row means with common superscripts do not differ (P > 0.05).

220

Consequently, the pH level in specific areas of the GIT is
a factor which establishes a specific microbial population,
and also affects the digestibility and absorption of most
nutrients. Taking into account that most pathogens grow
at a pH close to 7, and that beneficial microorganisms
live in an acidic media (5.8-6.2) in which they compete
with pathogens, CA could be used as an alternative for
immune system development as well as for increasing
bird performance.
In conclusion, the current study showed that the
aqueous CA treatment significantly reduce the aflatoxin
content in the ration. CA supplementation also promotes
growth performance of young broiler chickens; however,
CA increases serum AST levels and decrease ALT activity.
According to these results, it seems that CA may be
beneficial when used in broilers chickens. Nevertheless,
further studies are needed on the effect of these organic
acid concentrations on the complete broiler growing cycle.
SUMMARY
This study was undertaken to investigate the effects of citric acid
(CA) on aflatoxin degradation, growth performance and some serum
constituents in broilers. 300 one-day-old Ross broiler chickens were
randomly divided into five treatment groups of three replicates, 20 chicks
each. Four groups received the diet supplemented with CA (6.25, 12.5,
25 and 50 g/kg), while the other served as a control. Diet was prepared
following the NRC guidelines and the experiment was terminated
when chicks were 28 d old. The results showed that aflatoxins in the
diet, at a concentration of 39 ng/g were almost degraded (92%) by the
acidification procedure. In general, live body weight (LBW) was slightly
higher in animals fed with the addition of CA; diet containing the highest
concentration (50 g CA/kg) resulted in a significant increase in LBW and
improvement of feed conversion ratio. However, as the CA concentration
increased, higher serum aspartate aminotransferase activity values were
registered. On the contrary, hematocrite, total protein and albumin were
not affected by any level of added CA. From these results, it is concluded
that dietary CA supplementation can be used as an additive to degrade
aflatoxins in the ration as well as to promote growth performance in
young broiler chickens.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors would like to thank CONACYT for their financial
support.
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ARTÍCULO ORIGINAL

Potenciales evocados auditivos del tallo cerebral en monos rhesus (Macaca mulatta)
en diferentes etapas fisiológicas en condiciones de cautiverio

Brainstem's auditory evoked potentials in rhesus monkeys (Macaca mulatta)

in different physiologic stages under captivity

A Ibáñez-Contrerasa,b*, A Durand-Riverac, B Hernández-Godíneza,b, S Reyes-Pantojaa,b

aUnidad de Primates no Humanos del Centro de Investigación Proyecto CAMINA A.C., Ciudad de México, México.
bBIOINVERT®, Unidad de Experimentación Animal, Edo. México, México.

cLaboratorio de Neuroprotección del Instituto Nacional de Rehabilitación, Ciudad de México, México.

SUMMARY

In the phylogenetic scale, audition plays a very important role in the development of elaborated behaviors. The aim of this study was to evaluate the
auditive response in the Macaca mulatta species at different physiologic stages, through brainstem's auditory evoked potentials (BAEP). 30 non-human
primates Macaca mulatta were allotted into two groups of 15 males and 15 females distributed in five age-dependant groups of 2 males and 2 females
as follows: Group 1 (0,1-3,1 year old); Group 2 (3,2-6,1 year old); Group 3 (6,2-9,1 year old); Group 4 (9,2-12,1 year old) and Group 5 (12,2-27,1
years and older). The BAEP were obtained by the stimulation of the ear with rarefaction “clicks” of 50 dB of intensity. The cerebral electric activity
was picked up by gold disc electrodes, placed in the Cz (+), A1, A2 (–) and Fz derivations as land, according to the 10/20 international system. Four
waves were detected in the five evaluated groups. Since no significant differences were found in the ANOVAs by separated afferences, an ANOVA of
united afferences was done. It was observed that groups 1 and 5 provided significant differences in all evaluated waves, showing the extended latencies
in relation to other groups. It was concluded that BAEP made it possible to identify changes that are generated from the development, maturation and
aging in rhesus monkeys.

Palabras clave: generadores neurales auditivos, latencias, potenciales evocados auditivos de tallo cerebral.
Key words: Macaca mulatta, auditory neural generators, auditive response, brainstems auditory evoked potentials.

INTRODUCCIÓN Los primates no humanos (PNH) son un excelente

Estudios relacionados con la audición en animales han
sido empleados con diferentes enfoques, en los cuales
se han utilizado los potenciales evocados auditivos de
tallo cerebral (PEATC), determinando la funcionalidad
auditiva, detección de hipoacusias neonatales por factores
adversos al nacimiento, neuropatía auditiva, patologías
retrococleares (Church y Shucard 1986, Doyle y Webster
1991, McFadden y col 1999, Laughlin y col 1999, Torre
y Fowler 2000, Fowler y col 2002, Malmierca 2003,
Kretzmer y col 2004, Henry 2004, Torre y col 2004,
Harland y col 2006, Fowler y col 2010), así como en
múltiples experimentos con animales de laboratorio en
la valoración del funcionamiento de implantes auditivos,
restricción calórica, etc. (Kraus y col 1985, McFadden
y col 1999, Fowler y col 2002, Malmierca 2003, Henry
2004, Fowler y col 2010). Los PEATC se caracterizan por
al menos cuatro ondas positivas permanentes en animales
y cinco en los humanos, dichas ondas reflejan la actividad
eléctrica de núcleos específicos localizados en el tallo
cerebral (Laughlin y col 1999, Recanzone 2000).
Aceptado: 24.03.2011.
* Av. Tlalpan #4430, Col. Toriello Guerra, C.P. 14080 México, D.F.,
México; ibanez.alejandra@hotmail.com, jany2104@hotmail.com
modelo para el estudio de los mecanismos neurales
fundamentales en la función auditiva (Torre y col 2000,
Populin 2006, Fowler y col 2010), esto es, por la posición
que ocupan en el árbol evolutivo, siendo la especie animal
más similar filogenéticamente al humano (Wilson y Sarich
1969, Groves 2001, Fowler y col 2010). Dentro del orden
de los primates la especie más utilizada en la investigación
biomédica son los monos rhesus (Macaca mulatta) (Segal
1989, Schapiro 1996, Rowe 1996, Jones 1999, Kemnitz y
col 2000, Groves 2001, Isa 2009). Se estima que el tiempo
de vida de estos organismos es de aproximadamente 30
años en condiciones de cautiverio (Rowe 1996, Ankel-
Simons 2000), lo que facilita y complementa los estudios
de tipo longitudinal, para el conocimiento de procesos
tales como desarrollo, maduración y envejecimiento de
la vía auditiva. En lo referente a la utilización de los
PNH en el estudio de la función auditiva se ha empleado
a los monos rhesus para el estudio del funcionamiento
de distintas partes anatómicas específicas de la corteza
auditiva, así como en la evaluación de la audición a partir
de la restricción calórica y solo algunos autores detallan
los procesos de maduración de la vía auditiva en esta
especie (Doyle y Rood 1979, Doyle y Webster 1991,
Laughlin y col 1999, Torre y Fowler 2000, Torre y col
2000, Torre y col 2004, Fowler y col 2010), por lo que

223
A Ibáñez-Contreras y col
el objetivo de este trabajo es evaluar la respuesta de la
vía auditiva en la especie Macaca mulatta, en diferentes
etapas fisiológicas desde neonatos hasta adultos mayores
a través de los PEATC.
MATERIAL Y MÉTODOS
La investigación se realizó de acuerdo a la NOM-062-
ZOO-1999, así como la Normatividad internacional del
Código Zoosanitario Internacional de la Organización
Mundial de la Salud (OMS) y fue aprobada por el Comité
Interno de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
(CICUAL) y por las comisiones de Ética e Investigación
del Centro de Investigación Proyecto CAMINA, A.C.
Los sujetos de estudio fueron PNH de la especie
Macaca mulatta, alojados en condiciones de cautiverio
en el Centro de Investigación Proyecto CAMINA para
Curar la Parálisis A.C. en México D.F. C.P. 1405. La
unidad de PNH del Centro de Investigación Proyecto
CAMINA A.C. está dada de alta y registrada con el número
DGVS-PIMVS-CR-IN-1014-D.F./08 ante la SEMARNAT
(Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales).
La colonia de PNH consiste en 68 individuos alojados en
condiciones grupales de alojamiento, en donde existen 34
hembras y 24 machos de diferentes edades (entre 0 a 27
años de edad, de los cuales se lleva un registro desde el
nacimiento). Las instalaciones en donde se alojan a los
PNH se encuentran divididas en cuatro áreas, cada área
conforma un grupo social independiente de animales con
el objetivo de promover su bienestar. Dentro de cada área
se encuentran bebederos automáticos, los depósitos de
alimento se encuentran colocados por fuera de las paredes
de cada área para evitar el contacto del alimento con heces
y orina. Fueron alimentados, con base en el 4% de su peso
corporal, con alimento Monkey chow Purina 5045® (25%
proteína) dos veces al día y agua ad libitum.
En este estudio se utilizaron 30 PNH de la especie
Macaca mulatta. Ya que las latencias absolutas de los
PEATC se afectan significativamente por el sexo y la edad
de los sujetos (Lille y col 1991, Don y col 1993, McFadden
y col 1999, López-Escámez y col 1999, Stuart y col 2001,
Yadav y col 2002, Henry 2004, Hultcrantz y col 2006),
en este estudio los PNH fueron divididos de acuerdo al
sexo en 15 machos y 15 hembras. Cada grupo  estuvo
constituido por 3 machos y 3 hembras: Grupo 1 (Infantiles
A 0,1-3,1 años); Grupo  2 (Infantiles B 3,2-6,1 años);
Grupo 3 (Juveniles 6,2-9,1 años); Grupo 4 (Adultos 9,2-
12,1 años) y Grupo 5 (Adultos mayores 12,2-27,1 años)
(Ibáñez- Contreras y col 2010).
De acuerdo con Barajas (1985) y Rosete (1996), los
PEATC no se ven afectados por los estados de vigilia, sueño
o sedación, por lo que en nuestro estudio los animales fueron
sedados con Tiletamina- Zolacepam (Zoletil®) en una dosis
de 4  mg/kg, por vía intramuscular (Booker y col 1982,
Galván-Montaño y col 2010). Los PEATC se realizaron en
el Laboratorio de Neuroprotección del Instituto Nacional
224
de Rehabilitación (INR). Se utilizó una computadora para
potenciales marca Viasis Healthcare Niccolet®, a la cual se
le programaron los filtros pasabanda que permitieron el paso
de frecuencias entre 100 y 3000 Hz, con una sensibilidad
de 10 μV, promediando 2000 estímulos. La estimulación
de los oídos fue con “clicks” o chasquidos de rarefacción
(polaridad negativa) a 50 dB de intensidad (Elías 1996), con
una duración de 0,1 msec; dichos “clicks” fueron liberados
a través de los audífonos que forman parte del equipo. El
oído contralateral fue enmascarado con ruido blanco a
20 dB debajo de la intensidad explorada, el cual en cualquier
prueba audiométrica y sobre todo en los PEATC es utilizado
el fenómeno de respuesta producido por el entrecruzamiento
de la vía auditiva (Barajas 1985, Chiappa 1997). La señal
proveniente de los electrodos se mantuvo por debajo de los
5 kΩ y la respuesta se replicó por lo menos una vez para
asegurar la reproducibilidad de los eventos. Los animales
fueron rasurados y se limpió el área con agua y jabón
neutro para reducir la impedancia. La actividad eléctrica
cerebral se recogió por medio de electrodos de disco
colocados en A1 y A2 (–) y el vértice del cráneo Cz (+), y
finalmente Fp (fronto polar) como tierra, según el sistema
10/20 internacional (Poblano 2003). En este trabajo solo se
evaluaron las latencias de acuerdo a lo descrito por Chiappa
(1997 y Durand-Rivera y col (2004) que mencionan que
las latencias son los indicadores de la maduración de la
vía auditiva. Estas representan el tiempo en que se genera
la respuesta del estímulo de las asambleas neuronales que
conforman la vía auditiva, evaluado en mseg.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo por medio del
programa SPSS versión 17.0 para Windows. Se obtuvieron
medidas de tendencia central, medias y desviación
estándar en todos los grupos de edad en las diferentes
ondas. Se realizó estadística paramétrica (comparación de
medias) utilizando la prueba “t” de student para cotejar la
respuesta de las ondas I, II, III, y IV entre los individuos
de un mismo grupo. Posteriormente con la misma prueba
se compararon ambas aferencias (derecha-izquierda).
Finalmente se contrastaron los grupos de edad a partir
de la prueba de ANOVA de un factor utilizando los test
post-hoc Tukey y T3 de Dunnet, dichos post-hoc fueron
distinguidos por la prueba de homogeneidad de varianzas.
RESULTADOS
Se observaron cuatro ondas constantes y definidas
en todos los grupos de edad, tanto en machos como en
hembras. Las figuras  1 y 2 muestran la morfología de
las cuatro ondas obtenidas a 50  dB en los diferentes
grupos de edad evaluados. Estas ondas corresponden a
las siguientes asambleas neuronales; la Onda I en monos
equivale a las Ondas I y II en el humano referente al
nervio auditivo y a los núcleos cocleares, la Onda II en
 Generadores neurales auditivos, Latencias, Potenciales evocados auditivos de tallo cerebral

IV 0,1 uV I IV 0,1 uV
II II
1,5 mseg
1,5 mseg
I III
Grupo 5 Adultos III Grupo 5 Adultos
mayores IV mayores
(12,2-27,1 años) II (12,2-27,1 años)
II
I IV
III
I
Grupo 4 Adultos
(9,2-12,1 años) Grupo 4 Adultos III
II IV (9,2-12,1 años)

II
IV
I I
III
Grupo 3 Juveniles Grupo 3 Juveniles
(6,2-9,1 años) (6,2-9,1 años) III
IV
II
II IV
I

I III III
Grupo 2 Infantiles B
(3,2-6,1 años)
Grupo 2 Infantiles B IV
(3,2-6,1 años) II
IV
II I
I III
III
Grupo 1 Infantiles A
(0,1-3,1 años)
Grupo 1 Infantiles A
(0,1-3,1 años)

Figura 2. Morfología de las ondas obtenidas a partir de los

PEATC en hembras a 50 dB.
Morphology of the waves obtained from the BAEP in females
Figura 1. Morfología de las ondas obtenidas a partir de los
at 50 dB.
PEATC en machos a 50 dB.
Morphology of the waves obtained from the BAEP in males
at 50 dB.

monos se relaciona a la Onda III en humanos expresando DISCUSIÓN

la actividad del complejo olivar superior, la Onda III
en monos sería análoga a la Onda IV en humanos que
concuerda al lemnisco lateral y finalmente la Onda IV en
monos estaría relacionada a la Onda V en humanos que
equivale al colículo inferior. En el caso de los resultados
arrojados por la prueba “t” de student en la evaluación
de los individuos de un mismo grupo, no se encontraron
diferencias estadísticamente significativas (P = < 0,05),
al igual que en la comparación entre ambas aferencias. A
partir de las medidas de tendencia central, las figuras 3 y
4 muestran el proceso de desarrollo de la vía auditiva tanto
en hembras como en machos a través del alargamiento de
las latencias en los primeros grupos de edad.
Al no presentarse diferencias estadísticamente
significativas (P = < 0,05) dentro de los distintos grupos
de edad, así como entre las aferencias, se realizó el análisis
de ANOVA con aferencias unidas. En los cuadros 1 y 2
así como en las figuras 5 y 6 se observan las diferencias
estadísticamente significativas (P = < 0,05), encontrando
diferencias principalmente en los grupos 1 y 5 en relación
a los demás grupos.
Se han observado en humanos y en varias especies
de mamíferos no humanos diferencias en el desarrollo y
maduración de la audición en su seguimiento desde etapas
neonatales hasta juveniles (Anggard 1965, Moore 1985,
Rosete 1996, Laughlin y col 1999, Moore y Linthicum
2001, Moore y Linthicum 2007), así como a medida que
los organismos envejecen se ha reportado que existe una
disminución progresiva de la audición (Spehlmann 1985,
Church y Shucard 1986, Torre y Fowler 2000, Torre y
col 2000, Boettcher 2002, Torre y col 2004, Fowler y
col 2010). Se ha descrito que los PEATC pueden ser
registrados tras la estimulación por clicks desde los
primeros momentos de vida en los humanos (Hecox y
Galambo 1974, Barajas y col 1981, Laughlin y col 1999).
Sin embargo, se ha comprobado en diversos trabajos que
los PEATC son afectados por el grado de maduración y
mielinización del sujeto (Spehlmann 1985, Rosete 1996,
Elías 1996, Moore y Linthicum 2001). Tal es el caso
de Elías (1996), quien menciona que la maduración del
sistema nervioso central (SNC) durante los primeros años

225
A Ibáñez-Contreras y col

de vida en los humanos produce cambios significativos la Onda II sería homóloga a la Onda III en el humano,
en los PEATC entre los neonatos y niños de dos años de que expresa la actividad del complejo olivar superior, y
edad, observándose el alargamiento de las latencias, al finalmente la Onda IV en los monos equivaldría a la Onda
igual que en pacientes de más de 50 años. Con base a V que muestra la actividad del colículo inferior (Durand-
estos antecedentes en este trabajo se observa el mismo Rivera 1998, Kandel 2001, López 2003).
comportamiento entre humanos y primates no humanos, De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo,
observándose que en los grupos 1 y 5, independientemente se observan diferencias significativas en la Onda I en
del sexo, las latencias absolutas son más alargadas que el ambos sexos principalmente en el grupo 1. En el caso de
resto de los grupos (figuras 3 y 4). los machos se observan diferencias significativas en el
Por otro lado, de acuerdo con Laughlin y col (1999), grupo 1 contra el grupo 2 con una P = 0,015 y el grupo 3
los generadores de la vía auditiva en el mono rhesus no son con una P = 0,006 (cuadro 1). En el caso de las hembras,
equivalentes a los generadores neuronales de los humanos. las diferencias se observan entre el grupo  1 contra el
Laughlin y col (1999) reportan que la Onda I en el mono grupo  3 con una P = 0,007, así como entre el grupo  3
rhesus equivale a las Ondas I y II en el humano, reflejando contra el grupo 4 con una P = 0,030 y contra el grupo 5
la actividad del nervio auditivo y los núcleos cocleares, con una P = 0,040 (cuadro 2). En el caso del grupo 1 se
7,00

6,00
Latencias absolutas aferencias unidas (ms)

5,00

4,00

3,00 Onda I

Onda II
2,00
Onda III
1,00
Onda IV

0,00
1 2 3 4 5
(0,1-3,1 años) (3,2-6,1 años) (6,2-9,1 años) (9,2-12,1 años) (12,2-27,1 años)

Figura 3. Latencias (ambas aferencias) de las cuatro ondas auditivas en machos a 50 dB.
Latencies (united afferences) of the four auditives waves in males at 50 dB.

7,00

6,00
Latencias absolutas aferencias unidas (ms)

5,00

4,00

3,00 Onda I

Onda II
2,00
Onda III

1,00 Onda IV

0,00
1 2 3 4 5
(0,1-3,1 años) (3,2-6,1 años) (6,2-9,1 años) (9,2-12,1 años) (12,2-27,1 años)

Figura 4. Latencias (ambas aferencias) de las cuatro ondas auditivas en hembras a 50 dB.
Latencies (united afferences) of the four auditives waves in females at 50 dB.

226
 Generadores neurales auditivos, Latencias, Potenciales evocados auditivos de tallo cerebral

Cuadro 1. Diferencias significativas entre los grupos de edad en machos a 50 dB.

Significant differences between age groups in males at 50 dB.

ONDAS Grupo Grupo Significancia

Grupo 2 (Infantiles B)
Grupo 1 (Infantiles A) P = 0,0158
ONDA I 2,26±0,18
3,00 ±0,53 P = 0,0067
Grupo 3 (Juveniles)
2,18±0,32
Grupo 2 (Infantiles B)
3,13±0,17
P = 0,0012
Grupo 1 (Infantiles A) Grupo 3 (Juveniles)
ONDA II P = 0,0006
3,92±0,15 3,09±0,30
P = 0,0128
Grupo 4 (Adultos)
3,30±0,41
Grupo 2 (Infantiles B)
5,07±0,54
P = 0,0027
Grupo 1 (Infantiles A) Grupo 3 (Juveniles)
P = 0,0015
5,07±0,54 4,02±0,29
P = 0,0029
ONDA III Grupo 4 (Adultos)
4,08±0,36
Grupo 3 (Juveniles)
Grupo 5 (Adultos mayores)
4,02±0,29 P = 0,0450
4,74±0,55
Grupo 2 (Infantiles B)
4,86±0,15
P = 0,0004
Grupo 3 (Juveniles)
Grupo 1 (Infantiles A) P = 0,0002
4,80±0,33
6,10±0,50 P = 0,0001
Grupo 4 (Adultos)
4,82±0,36
ONDA IV
Grupo 2 (Infantiles B)
4,86±0,15
P = 0,0005
Grupo 5 (Adultos Mayores) Grupo 3 (Juveniles)
P = 0,0008
5,98±0,60 4,80±0,33
P = 0,0004
Grupo 4 (Adultos)
4,82±0,36

puede observar que la latencia de los machos como la de
las hembras es más prolongada que el resto de los grupos
(figuras 3 y 4 ), coincidiendo con lo señalado por Shannon
y col (1984), Rosete (1996) y Helmer y col (2006), quienes
indican como principal característica en la evaluación de
los PEATC, que la Onda I se encuentra más alargada en
neonatos que en los adultos debido al posicionamiento de
los electrodos, los cuales se encuentran más cercanos a la
cóclea, a consecuencia de un menor tamaño encefálico.
Por otro lado, en el caso de las hembras se ha descrito que
la influencia hormonal en el ciclo estral genera cambios
en la función electrofisiológica en humanos. Yadav y
col (2002) describen que a mayores concentraciones
de progesterona existe una disminución de las latencias
absolutas de los PEATC en mujeres, observándose este
mismo comportamiento en los PNH evaluados. Las fases
del ciclo estral en esta especie de PNH son distinguibles,
ya que al momento de la ovulación, periodo en el cual las
concentraciones de estrógenos se encuentran elevadas,
esta especie de PNH presenta piel sexual, generando
una hinchazón en las extremidades, cara y genitales,
que al colocar los electrodos para la evaluación de
los PEATC la impedancia es por demás alta. Con este
referente se excluyó a las hembras que estuvieran en
ovulación, por lo que relacionando este dato con lo antes
mencionado por Yadav y col (2002), es claro notar que
las hembras del grupo 3 se encontraban en una fase en
donde las concentraciones de progesterona eran más altas,
obteniendo de esta manera latencias en el grupo 3 más
pequeñas que los grupos 4 y 5 (figuras 5 y 6 ).
Se observan diferencias en la Onda II en machos entre
el grupo 1, contra el grupo 2, con una P = 0,001, el grupo 3
con una P = 0,0006 y contra el grupo 4 con un P = 0,012
(cuadro 1). De acuerdo a Laughlin y col (1999), la Onda II
de los monos es homóloga a la Onda III de los humanos,
equivalente al complejo olivar superior, cuya función es
localizar la fuente sonora mediante la audición biaural
(Kandel 2001, López 2003). El aumento de la latencia
absoluta del grupo 1 a los demás grupos podría deberse a
que la vía auditiva central se encuentra inmadura, es decir,
existe una falta de mielinización de las fibras del nervio
auditivo, por lo que existen retrasos en la conductibilidad

227
A Ibáñez-Contreras y col

del estímulo, representándose con el alargamiento de la significativa (P = 0,030) entre el grupo  3 y el grupo  5
latencia, por parte del grupo 1, en relación a los demás (figuras 5 y 6). De acuerdo a Laughlin y col (1999), la
grupos (figura 3). Aunque en las hembras no se observaron Onda III de los monos es homóloga a la Onda IV de los
diferencias estadísticamente significativas (figura  6b), humanos, equivalente al lemnisco lateral. Kandel (2001)
se aprecia en la figura 4 el mismo fenómeno que en los y López (2003) describen la participación del lemnisco
machos de alargamiento de las latencias por parte del lateral en la regulación de los movimientos oculares en
grupo 1 en relación a los demás grupos. relación con la información auditiva, además de que emite
En la evaluación de la Onda III se observa que proyecciones colaterales a los núcleos del V y del VII
los machos y las hembras presentaron diferencias nervio craneal. Estas conexiones, según López (2003),
significativas entre los mismos grupos (cuadros 1 y 2). En intervienen en el control de los movimientos de los
el caso de los machos se reporta la presencia de diferencias músculos de la oreja, así como del martillo y del estribo,
significativas en el grupo 1, contra el grupo 2, con una regulando así la transmisión de las vibraciones hacia el
P = 0,002, contra el grupo 3 con una P = 0,0015 y contra oído interno. Como ya se ha mencionado en párrafos
el grupo 4 con una P = 0,002. También se observó una anteriores, las estructuras anatómicas del oído interno
diferencia significativa (P = 0,045) entre el grupo  3 y en humanos y en primates no humanos no se encuentran
el grupo 5. Para las hembras los grupos en los cuales se maduras en los primeros años de vida (Rosete 1996), lo
observan diferencias significativas fueron, en el grupo 1 que reduce la conductibilidad eléctrica, además de que
contra el grupo  2 con una P = 0,009 contra el grupo  3 neurofisiológicamente las fibras del nervio auditivo del
con una P = 0,000, contra el grupo 4 con una P = 0,0003 grupo  1 se encuentran en un proceso de mielinización
y contra el grupo 5 con una P = 0,024. Además al igual (Elías 1996, Rosete 1996, Oliver y col 1997, Moore
que los machos, en las hembras se observa una diferencia y Linthicum 2001), por lo que es claro observar que

4,00 5,00

4,50 3,92 ± 0,15

3,50
3,00 ± 0,53 3,47 ± 0,41
4,00 3,30 ± 0,41
2,49 ± 0,40
3,00
3,50 3,13 ± 0,17 3,09 ± 0,30
2,18 ± 0,32
2,26 ± 0,18 2,37 ± 0,35
2,50
3,00
Onda 2
Onda 1

2,00 2,50

2,00
1,50
1,50
1,00
1,00
0,50
0,50

0,00 0,00

1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1 1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1
Edad en años Edad en años
Figura 5a Figura 5b

6,00 5,07 ± 0,54 7,00 6,10 ± 0,50 5,98 ± 0,60

5,50 4,74 ± 0,55 6,50
6,00
5,00
4,08 ± 0,20 4,08 ± 0,36 5,50 4,80 ± 0,33 4,82 ± 0,36
4,50 4,02 ± 0,29 4,86 ± 0,15
5,00
4,00 4,50
3,50 4,00
Onda 3

Onda 4

3,00 3,50
3,00
2,50
2,50
2,00
2,00
1,50 1,50
1,00 1,00
0,50 0,50
0,00
0,00
1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1
1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1
Edad en años
Edad en años
Figura 5c Figura 5d

Figura 5. Gráficas de caja de ANOVAs con aferencias unidades en machos.

4,00 Graphic ANOVAs box with united afferencies in males. 5,00
3,70 ± 0,73
3,50 4,50
3,27 ± 0,54
228 2,68 ± 0,33 2,47 ± 0,32 4,00 3,20 ± 0,49
3,00 2,26 ± 0,32 3,29 ± 0,18
3,50
3,04 ± 0,07
2,50
2,16 ± 0,06 3,00
 0,50 0,50
0,00
0,00
1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1
1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1
Edad en años
Edad en años
Figura 5c
Generadores neurales auditivos, Latencias,Figura 5d
Potenciales evocados auditivos de tallo cerebral

4,00 5,00
3,70 ± 0,73
3,50 4,50
3,27 ± 0,54
2,68 ± 0,33 2,47 ± 0,32 4,00 3,20 ± 0,49
3,00 2,26 ± 0,32 3,29 ± 0,18
3,50
3,04 ± 0,07
2,50
2,16 ± 0,06 3,00
1,87 ± 0,16

Onda 2
Onda 1

2,00 2,50

1,50 2,00

1,50
1,00
1,00
0,50
0,50

0,00 0,00

1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1 1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1
Edad en años
Figura 6a Edad en años
Figura 6b

6,00 5,12 ± 0,56 7,00

6,02 ± 0,56
5,50 6,50 6,04 ± 0,56
4,44 ± 0,30 6,00 5,16 ± 0,41
5,00 4,35 ± 0,28
5,50 4,88 ± 0,45 4,70 ± 0,43
4,50 4,08 ± 0,32 5,00
4,00 3,78 ± 0,27
4,50
3,50 4,00
Onda 3

Onda 4

3,00 3,50

2,50 3,00
2,50
2,00
2,00
1,50
1,50
1,00 1,00
0,50 0,50
0,00 0,00

1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1 1,1-3,1 3,2-6,1 6,2-9,1 9,2-12,1 12,2-27,1
Edad en años Edad en años
Figura 6c Figura 6d

Figura 6. Gráficas de caja de ANOVAs con aferencias unidades en hembras.

Graphic ANOVAs box with united afferencies in females.

la latencia absoluta del grupo  1 en machos como en hipótesis surge a partir de que los Potenciales Evocados
hembras es más alargada que las latencias de los grupos de (PE's), ya sean auditivos, visuales o somatosensoriales, se
mayor edad (figuras 3 y 4). Por otro lado, las diferencias realizan mediante técnicas de promediación de la actividad
observadas entre el grupo  3 y el grupo  5 en ambos del EEG en un periodo breve determinado, por lo que
sexos se podrían relacionar a cuestiones hormonales con base a una funcionalidad similar entre estos tipos
y procesos naturales de envejecimiento. Poblano y col de estudios neurológicos se podrían así relacionar los
(2004) mencionan que las concentraciones más altas datos obtenidos en este trabajo, los cuales demuestran
de testosterona se encuentran en monos juveniles de que el grupo 3 presenta latencias absolutas más pequeñas
aproximadamente de 7 años de edad. Esta elevación en que el grupo 5, relacionándose con los datos obtenidos
la concentración de testosterona produjo una disminución por Poblano y col (2004), aun cuando en este trabajo
en la actividad eléctrica cerebral del electroencefalograma no se evaluaron perfiles hormonales de los individuos
(EEG), concluyendo que la testosterona acelera la (cuadro 1). Aunado a esto Barajas (1985) describe
maduración neurofisiológica de los animales (Poblano el diagnóstico de la hipoacusia coclear en humanos
y col 2004). Ya que existen pocos trabajos en los cuales a través de los PEATC, observando que a menudo
se realicen comparaciones endocrinológicas con la en adultos mayores es imposible identificar algunos
aplicación de estudios neurológicos en PNH, en especial componentes, demostrando la existencia de algún tipo
en monos rhesus, la diferencia encontrada en este trabajo de lesión coclear o retrococlear, probablemente por
a partir de los PEATC entre los monos del grupo 3 contra cambios degenerativos propios de la edad, por esta
el grupo  5 podría deberse a los efectos causados por razón se observa que la latencia del grupo  5 es más
las concentraciones hormonales de testosterona. Esta alargada que la del grupo 3. En el caso de las hembras,

229
A Ibáñez-Contreras y col

ocurre el mismo fenómeno. De acuerdo con Tandon
2001, menciona que las latencias absolutas en mujeres
menopáusicas tienden a aumentar en comparación con
mujeres jóvenes, tal como se observa en la diferencia
estadística (P = 0,030) antes descrita entre los grupos 3
y 5, por lo que en este caso este alargamiento de las
latencias en el grupo 5 se debe al retraso que existe en la
transmisión neuronal principalmente a causa del cambio
hormonal que se experimenta después de la menopausia
(cuadro 2 y figuras 4 y 6).
Finalmente se observan diferencias en la Onda IV en
ambos sexos en los mismos grupos. De acuerdo a Laughlin
y col (1999), la Onda IV en los monos equivaldría a la
Onda V que muestra la actividad del colículo inferior,
encargado de la integración multisensorial de aferencias
vestibulares, somestesicas y visuales, además de la
coordinación de los movimientos hacia la fuente
sonora (Kandel 2001). En el caso de los machos se
reporta la presencia de diferencias significativas entre
el grupo  1 contra el grupo  2 (P = 0,0004), contra el
grupo 3 (P = 0,0002) y contra el grupo 4 (P = 0,0001).
Además el grupo  5 muestra diferencias contra el
grupo  2 (P = 0,0005), contra el grupo  3 (P = 0,0008)
y contra el grupo 4 (P = 0,0004) (cuadro 1 y figura 5).
Para las hembras las diferencias se observan entre el
grupo 1contra el grupo 2 (P = 0,003), contra el grupo 3
(P = 0,006) y contra el grupo 4 (P = 0,038). Además al
igual que en los machos, el grupo 5 de hembras presenta
diferencias contra el grupo  2 (P = 0,003), contra el
grupo  3 (P = 0,005) y contra el grupo  4 (P = 0,034)
(cuadro 2 y figura 6). De acuerdo a Shannon y col (1984)
y Helmer y col (2006), mencionan que el alargamiento
de la Onda V (homóloga a la Onda IV en los monos) es
un indicador de inmadurez en los niños, el cual tiende a
disminuir conforme a la edad. Barajas (1985) menciona
que la latencia de la Onda V es más prolongada que la
del adulto, por el incremento aislado de la latencia de la
Onda I, alcanzando una estabilidad hasta después de los
tres años de vida, tal y como se observa en los PNH. En el
caso de los monos rhesus Oliver y col (1997) mencionan
que el proceso de mielinización de las diferentes vías
sensoriales en los monos culmina aproximadamente a
los 36 meses de edad. De acuerdo a estos datos podemos
observar que las latencias de los PEATC del grupo  1
tienden a disminuir conforme al incremento de la edad,
estabilizándose en el grupo 2 (cuadro 1), relacionándose
de esta manera con lo mencionado por Oliver y col
(1997). En el caso de las diferencias descritas entre
el grupo  5 contra los demás grupos, Tandon (2001),
Henry (2004), Hultcrantz y col (2006), Fowler y col

Cuadro 2. Diferencias significativas entre los grupos de edad en hembras a 50 dB.

Significant differences between age groups in females at 50 dB.

ONDAS Grupo Grupo Significancia

Grupo 1 (Infantiles A) Grupo 3 (Juveniles)
P = 0,0079
2,68 ±0,33 1,87±0,16
ONDA I Grupo 4 (Adultos)
Grupo 3 (Juveniles) 2,47 ±0,32 P = 0,0301
1,87±0,16 Grupo 5 (Adultos Mayores) P = 0,0406
2,16±0,06
Grupo 2 (Infantiles B)
4,35±0,28
Grupo 3 (Juveniles) P = 0,0091
Grupo 1 (Infantiles A) 3,78±0,27 P = 0,0000
5,12±0,56 Grupo 4 (Adultos) P = 0,0003
ONDA III 4,08±0,32 P = 0,0242
Grupo 5 (Adultos Mayores)
4,44±0,30
Grupo 3 (Juveniles) Grupo 5 (Adultos Mayores)
P = 0,0302
3,78±0,27 4,44±0,30
Grupo 2 (Infantiles B)
4,88±0,45
P = 0,0036
Grupo 1 (Infantiles A) Grupo 3 (Juveniles)
P = 0,006
6,02±0,56 4,70±0,43
P = 0,0384
Grupo 4 (Adultos)
5,16±0,41
ONDA IV
Grupo 2 (Infantiles B)
4,88±0,45
P = 0,0031
Grupo 5 (Adultos Mayores) Grupo 3 (Juveniles)
P = 0,0058
6,04±0,56 4,70±0,43
P = 0,0341
Grupo 4 (Adultos)
5,16±0,41

230
 Generadores neurales auditivos, Latencias, Potenciales evocados auditivos de tallo cerebral
(2010) reportan la pérdida de la audición en relación a
procesos hormonales en distintas especies. El grupo 5 son
adultos mayores cuya función endocrina y fisiológica es
decreciente, relacionando esta diferencia principalmente
a los procesos naturales de envejecimiento.
A través de los PEATC es posible conocer los cambios
que se generan a partir del desarrollo, maduración y
envejecimiento de los monos rhesus. Es importante
destacar que aunque está más que descrito que el sexo de
los individuos es un factor determinante en la evaluación
de los PEATC, en este trabajo se observó que tanto en
machos como en hembras se presentaron diferencias
significativas entre los mismos grupos. En este trabajo no
se realizaron estudios endocrinológicos, siendo claro que
la influencia hormonal está relacionada directamente con
el comportamiento neurofisiológico y con el alargamiento
de las latencias. Con base a estos antecedentes se podría
concluir que los procesos de desarrollo y maduración de
los PNH son homólogos al del humano, lo que enriquece
el trabajo experimental con los PNH como biomodelos en
la comprensión de la fisiología de la vía auditiva.
RESUMEN
La audición juega un papel importante en el desarrollo de
conductas más elaboradas en los organismos a medida en que se
asciende en la escala filogenética. El objetivo de este estudio fue
evaluar la respuesta de la vía auditiva en la especie Macaca mulatta,
en diferentes etapas fisiológicas, a través de los Potenciales Evocados
Auditivos del Tallo Cerebral (PEATC). Se utilizaron 30 primates no
humanos de la especie Macaca mulatta divididos en dos grupos de 15
machos y 15 hembras. Cada grupo estuvo constituido por 3 machos y
3 hembras: Grupo 1 (0,1-3,1 años); Grupo 2 (3,2-6,1 años); Grupo 3
(6,2-9,1 años); Grupo 4 (9,2-12,1 años) y Grupo 5 (12,2-27,1 años).
Los PEATC se obtuvieron mediante la estimulación de los oídos con
“clicks” de rarefacción a 50 dB de intensidad. La actividad eléctrica
cerebral fue recogida por medio de electrodos de disco, colocados en
las derivaciones Cz (+), A1, A2 (–) y Fz como tierra, según el sistema
10/20 internacional. Se observaron cuatro ondas; debido a que no se
encontraron diferencias significativas en t de student por aferencias
separadas, se realizó ANOVAs con las aferencias unidas. Se observó
que los grupos 1 y 5 presentan diferencias significativas en todas las
ondas evaluadas, presentando las latencias más alargadas en relación
a los demás grupos. Se concluye que a través de los PEATC es posible
conocer los cambios que se generan a partir del desarrollo, maduración
y envejecimiento de los monos rhesus.
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Arch Med Vet 43, 233-239 (2011)

ORIGINAL ARTICLE

Blood cytology of the common jollytail (Galaxias maculatus) (Jenyns, 1842)

(Osmeriformes: Galaxiidae) at postlarval and adult stages

Estudio de la citología sanguínea del puye (Galaxias maculatus) (Jenyns, 1842)

(Osmeriformes: Galaxiidae) en estado postlarval y adulto

I Valdebenitoa, b*, K Bussec, N Jaramilloa, A Hernándeza,b

a Escuela de Acuicultura, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco, Chile.
b Centro de Genómica Nutricional Agroacuícola, Temuco, Chile.

c Museum Alexander Koenig, Bonn, Germany.

Resumen

El puye (Galaxias maculatus) es un pequeño pez nativo de gran interés para la diversificación de la acuicultura chilena, debido al alto valor
comercial de su estado postlarval cristalino. La presente investigación entrega los primeros antecedentes respecto de la citología sanguínea de postlarvas
y adultos de esta especie, determinada mediante microscopía óptica utilizando frotis sanguíneos preparados con May Grünwald-Giemsa. Los resultados
muestran que en la sangre circulante de G. maculatus en estado de postlarva no se observan eritrocitos maduros y la sangre es de aspecto transparente.
Sin embargo, en adultos se pudo observar la línea eritrocitaria completa y en leucocitos no se observó la presencia de células de grano grueso como
son los basófilos y eosinófilos. La morfología de las células encontradas en ambos estados del desarrollo del puye mantienen las características propias
entregadas en la literatura para peces teleósteos.

Key words: fish haematology, blood cells, Galaxias maculatus, whitebait.

Palabras clave: hematología de peces, células sanguíneas, Galaxias maculatus, puye.

Introduction and Los Lagos regions, being more prevalent in Chiloé

Common Jollytail or “Puye” (Galaxias maculatus), is
a small native fish that inhabits fresh and estuarine waters
in Southern Chile. This species is very widespread in the
Southern Hemisphere and occurs in a variety of habitats
including freshwater (still or slow-flowing waters, river,
lakes) and coastal streams in Australia, New Zealand,
South Africa, Patagonian South America and the Malvinas
Islands. Diadromic populations initiate the free life stage
in brackish environments and after 4-6 months they return
to freshwater as larvae with a transparent aspect and
eel-like shape, and for this reason are commonly called
“cristalinos” in Chile. After returning to freshwater they
go through a metamorphosis phase that transforms them
in pigmented juveniles with a high condition index (K)
(figure 1 A and B). During the larvae transparent state,
specimens are captured intensively and commercialized
as a highly valuable food. Their physical attributes
allow them to be considered comparable to “elvers” (i.e.
transparent baby eels) and as such are well appreciated
food product in Europe, New Zealand and Mexico,
reaching high retail prices (Bórquez et al 1996, Dantagnan
et al 2002). Currently, chilean natural capture fisheries
for “Puye” are mainly located in Araucanía, Los Ríos
Accepted: 07.04.2011.
* Casilla 15-D Temuco, Chile; ivisler@uct.cl
and Aysen. However, high extractive pressure on this fish
in Chile has resulted in a significant reduction of natural
populations (Barile et al 2003). As a result of the high
market value and commercial interest for “cristalinos”
this fish has been described as a potential new species
for Chilean aquaculture diversification. The School of
Aquaculture of the Catholic University of Temuco, Chile,
has been involved in the research and development of
larval rearing and feeding techniques for the culture of
G. maculatus for over ten years (Bórquez et al 1996,
Dantagnan et al 2002, Barile et al 2003, Dantagnan et al
2004, Dantagnan et al 2005, Dantagnan et al 2007). The
success when introducing a new species to aquaculture
relies on, among other things, the detailed knowledge
of the physiology of the species. Describing the cellular
characteristics of the blood can provide information useful
not only for the culture of the species but also for assessing
the physiological status of the fish (Pavlidis et al 2007).
The wide geographical distribution of this species and its
interesting ecological attributes, as well as the existence
of diadromic behavior, have attracted the attention of
many ichthyologists. There are numerous studies related
to different aspects (systematic, biology, natural history,
population genetics, etc) of G. maculatus (Campos 1970,
McDowall 1970, McDowall  1971, McDowall 1981,
McDowall 1984, McDowall 1988, Berra et al 1996, Waters
and Burridge 1999, Busse and Möser 2006). However,

233
I Valdebenito et al
Figure 1. Adult (up) and postlarvae (down) specimens of
G. maculatus.
Especímenes adulto (arriba) y postlarval (abajo) de G.
maculatus.
there are still many unknown biological aspects. Besides
some few works about the absent of red blood in larvae,
there is scarce information regarding haematological
studies in this species (Busse 1993, Busse and Campos
1996).
As mentioned previously, research concerning blood
cytology studies in G. maculatus has been very limited.
Hence, to further elucidate some of these unknown aspects
a series of studies were conducted in this species under
laboratory conditions. The aim of this study was to gather
preliminary information about the haematological profile
of G. maculatus.
Material and Methods
Experimental conditions
Adults sampled were reared under laboratory
conditions in 0.5 m3 fiberglass tanks with a total water
exchange per hour according to methods described
previously (Dantagnan et al 1995) at the facilities of the
School of Aquaculture, Catholic University of Temuco,
at a stocking density of 13 kg/m3. They were hand fed
commercial dry pellets for salmon (3 mm of diameter)
ad libitum twice daily. Water source was obtained from
a deep well with an average temperature of 12.5 ± 4.5º
and oxygen concentration of 8.5 ± 0.5 ppm. Larvae
were captured from the estuary of Toltén River in the
Araucanía Region, Chile, and held in 0.5 m3 fiberglass
tanks under same condition than adults. None of the fish
was undergoing treatment of any kind and their health
condition was considered clinically normal.
Sampling
Blood sampling was conducted in sixty larvae and
thirty adults of G. maculatus, apparently healthy, with
a body weight that fluctuated between 0.2 to 0.4 and
7.8 to 13.0 g respectively. Fish were anaesthetized with
BZ20® (Veterquímica, Chile) and blood was taken from
the caudal vein in the case of adult fish, using an insulin
234
syringe (1.0 cc, 29G x 1/2’’ needle). Blood from larvae was
collected through direct heart punction using a modified
microhematocrit tube. Smears from adults and larvae were
prepared immediately after blood sampling, using whole
blood and stained with May Grünwald-Giemsa solution
for optical microscopy following the method described
by Oppenheim (1973).
Microscopy
Differential cells counts were carried out in the best 10
blood smears, from either adults or larvae. The slides were
examined under oil-immersion at 100X magnification
using an optical microscope (Eclipse E400, Nikon).
For each slide three areas were randomly chosen and
100 cells counted and recorded as either erythrocyte or
leucocyte. Leucocytes were differentiated and classified
into four types: lymphocytes, neutrophils, eosinophils and
monocytes. Maturity state of erythrocytes and the presence
and types of thrombocyte were also recorded. Cellular
elements found in peripheral blood of G. maculatus
were identified using cytological criteria based on the
nomenclature proposed by Conroy (1972) for Atlantic
salmon. Cells size was determined using a 10X graduated
ocular (Wolfe Wetzler, Germany) with a magnification of
1000X and an accuracy of 0.09 µm.
Statistical analysis
Statistical analyses of the cells size and percentages
were performed using the program StatMost (Dataxiom,
USA). Significant differences were determined through
the application of the Student’s t-test. Normality of the data
was verified by the Kolmogorov-Smirnov’s test. Level of
significance was set at P > 0.05.
Results
The results showed that circulating blood of G.
maculatus adults is composed in a 97.64 ± 6.2% by
erythrocytes, 1.34 ± 0.1% by leucocytes and 1.01 ± 0.03%
of thrombocytes. Data on the differential cell counts
determined in the peripheral blood from adults and
larvae of G. maculatus are presented in table  1. This
shows that mature erythrocytes were not found in
larvae, although immature stages of the erythrocyte
line were very abundant, such as the polychromatocytes
with 68.90 ± 5.30%. However, in adults, the mature
erythrocytes are the most abundant cells of the erythrocyte
line with 96.34 ± 1.65% and in relation to leukocyte line
the neutrophils represent 20.20% considering both, the
mature and immature stages. In larvae, lymphocytes are
around 69.63 ± 0.06% of the leucocytes cell types. Figure
2 presents the different types of cells identified in the blood
samples from adults and larvae of G. maculatus expressed
as cumulative percentage.
 fish haematology, blood cells, Galaxias maculatus, whitebait

Table 1. Differential cell counts (%) determined in the Erythrocyte cell line
peripheral blood of postlarvae and adults G. maculatus.
Recuento diferencial (%) determinado en sangre periférica Erythroblasts. The erythroblasts found among both
de larvas a adultos de G. maculatus.
groups of fish were round/oval-shaped, characterized by an
eccentric and big rounded nucleus, with heterogeneously
ERYTHROCYTES Postlarve Adult
distributed chromatin and intense basophilic cytoplasm
Erythroblast 22.68a ± 3.02 0.05b ± 0.01 (figure 2A and a). Quantitative parameters in measured
Polychromatocyte 68.90a ± 5.30 0.47b ± 0.05 erythroblasts were not significantly different (P > 0.05)
between both groups of fish (table 2).
Immature erythrocytes 4.00a ± 8.81 0.00b ± 0.00
Polychromatocytes. These cells presented a round
Mature erythrocytes 0.00a ± 0.00 96.34b ± 1.65 shape with blue-grey cytoplasm and a central nucleus
Erythrocyte in haemolysis 3.09a ± 0.04 0.76b ± 0.04 characterized by compact and basophilic chromatin. In
larvae, cellular aggregates were observed and they were
Ghost cell 1.1a ± 0.25 2.2a ± 0.24
characterized by red nucleus with heterogeneous aspect
LEUKOCYTES (figure 2b). Polychromatocytes measured between both
Immature neutrophil 18.42a ± 0.04 17.50a ± 0.05 groups of fish did not present significant differences
Mature neutrophil 3.06a ± 0.03 2.7a ± 0.01
(P > 0.05) (table 2).
Mature erythrocytes. They present an elliptical form
Lymphocyte 69.63a ± 0.06 71.20a ± 0.09
in the same way that the nucleus, which is in the center of
Monocyte 8.9a ± 0.08 8.6a ± 0.07 the cell, surrounded by a slightly eosinophilic cytoplasm
THROMBOCYTES with homogenous aspect (figure 2 C). Measures found in
these cells are expressed in table 2.
Immature 2.00a ± 0.37 6.00a ± 0.56
Erythrocyte haemolysis. Cells that were in initial
Mature 98.00a ± 0.60 94.00a ± 0.56 haemolysis were characterized by the increment in
Means within the same rows followed by the same superscript letters are the nuclear size as result of kariolysis (figure  2D and
not significantly different (p>0.05. All values are means ± SD. d). Erythrocytes in advanced haemolysis presented a

Table 2. Linear length (µm) of cells found in the peripheral blood of G. maculatus.
Longitud lineal (µm) de células de sangre periférica de larvas y adultos de G. maculatus.

Cell Nucleus
POSTLARVAE
Major axis Minor axis Major axis Minor axis n

Polychromatocyte 8.09a ± 1.62 –       – 4.99a ± 1.07 –       – 50

Erythroblast 7.61a ± 1.00 –       – 6.09a ± 0.94 –       – 50
Lymphocyte 5.8a ± 0.11 –       – –       – –       – 50
Monocyte 10.3a ± 2.17 –       – 6.76a ± 2.03 –       – 50
Mature neutrophil 8.22a ± 0.67 –       – 6.44a ± 1.22 –       – 3
Immature neutrophfl 8.77a ± 1.56 –       – 5.67a ± 1.20 –       – 50
Mature Thrombocytes 8.22a ± 0.67 –       – 6.44a ± 1.22 –       – 50
Immature Thrombocytes 6.91a ± 1.58 2.35 ± 0.93 6.22a ± 1.59 1.74 ± 0.42 20

ADULT
Mature erythrocytes 9.47a ± 1.08 6.88 ± 1.01 4.00a ± 0.68 2.88 ± 0.58 100
Polychromatocyte 6.22a ± 1.17 –       – 3.41a ± 1.02 –       – 20
Erythroblast 6.99a ± 1.06 –       – 5.48a ± 1.10 –       – 50
Lymphocyte 3.41 ± 0.84 –       – –       – –       – 50
Monocyte 10.59a ± 2.34 –       – 5.68a ± 1.61 –       – 50
Mature neutrophil 8.46a ± 0.51 –       – 6.35a ± 1.08 –       – 4
Immature neutrophil 8.37a ± 1.89 –       – 4.47a ± 1.97 –       – 50
Mature Thrombocytes 8.46a ± 0.51 –       – 6.35a ± 1.08 –       – 50
Immature Thrombocytes 7.83a ± 2.35 2.53 ± 0.62 4.99a ± 0.73 1.42 ± 0.73 20
Means within the same collumn followed by the same superscript letters are not significantly different (P > 0.05). All values are means ± SD.

235
I Valdebenito et al

Figure 2. Microphotography of swabs taken from circulating blood of adult and postlarvae of puye (G. maculatus) stained with May
Gründwald-Giemsa. 1000x. ADULT: A) Erythroblast. B) Polychromatocyte. C) Mature erythrocytes. D) Erythrocyte in early haemolysis.
E) Erythrocyte in late haemolysis. F) Erythrocyte in late haemolysis. G) Erythroplastid. H) Lymphocyte. I) Monocyte. J) Myelocyte.
K) Metamyelocyte. L) Band Neutrophil. M) Mature Neutrophil. N) Immature Thrombocytes. O) Immature Thrombocytes. LARVAE:
a) Erythroblast. b) Polychromatocyte. d) Polychromatocyte in early haemolysis. e) Polychromatocyte in late haemolysis. f) Ghost
cell. g) Erythroplastid. h) Lymphocyte. i) Monocyte. j) Myelocyte. k) Metamyelocyte. l) Band Neutrophil. m) Mature neutrophil.
n) Immature Thrombocytes. o) Immature Thrombocytes. Each bar in all figures represents 2µm.
Microfotografía de frotis sanguíneo tomada desde sangre periférica de larvas y adultos de puye (G. maculatus) teñidas con May Gründwald-
Giemsa. 1000x. ADULTO: A) Eritroblasto. B) Policromatocito. C) Eritrocitos maduros. D) Eritrocito en hemolisis temprana. E) Eritrocito en hemólisis
tardía. F) Eritrocito en hemólisis tardía. G) Eritroplastido. H) Linfocito. I) Monocito. J) Mielocito. K) Metamielocito. L) Neutrófilo en banda. M)
Neutrófilo maduro. N) Trombocitos inmaduros. O) Trombocitos inmaduros. LARVAE: a) Eritroblasto. b) Policromatocito. d) Policromatocito en hemo-
lisis temprana. e) Policromatocito en hemólisis tardía. f) Célula fantasma. g) Eritroplastido. h) Linfocito. i) Monocito. j) Mielocito. k) Metamielocito.
l) Neutrófilo en banda. m) Neutrófilo maduro. n) Trombocitos inmaduros. o) Trombocitos inmaduros. Cada barra en las figuras representa 2µm.

kariolytic and eccentric nuclei (figure 2E and e). Ghost
cells were also observed, corresponding to erythrocytes
(figure 2F and f) and erythroplastids cellular remains and
cytoplasmatic residues (figure 2G and g).
Leukocyte cell line
Lymphocytes. The cells vary in form, but they
predominantly are round-shaped, the nucleus occupies
most of the cell and is surrounded by scarce cytoplasm

236
 fish haematology, blood cells, Galaxias maculatus, whitebait
with basophilic aspect. Pseudopods were frequently
observed (figure  2H and h). Lymphocytes measured
between both groups of fish did not present significant
differences (P > 0.05) (table 2).
Monocytes. Monocytes were observed as cells with
irregular shape and big size. The nucleus was eccentric
and surrounded by a slightly basophilic cytoplasm, where
the vacuoles occasionally found (figure 2I and i). There
was not significant difference (P > 0.05) between the
monocytes measured in both group of fish (table 2).
Neutrophils. Myelocytes: this is the first maturation
stage of the neutrophils, characterized by an eccentric
round nucleus surrounded by a basophilic cytoplasm
replete with fine granules of the same color (figure  2J
and j).
Metamyelocytes: The second stage in the development
of neutrophils, characterized by an eccentric reniform
nucleus with a basophilic cytoplasm rich in fine granules
of the same color (figure 2K and k).
Juvenile neutrophils (band): characterized by a nucleus
in form of band with a basophilic cytoplasm (figure 2L
and l). The immature neutrophils measured between both
groups of fish did not present significant differences
(P > 0.05) (table 2).
Mature neutrophils: characterized by a lobulated
nucleus surrounded by basophilic cytoplasm containing
great amount of fine granules of the same color. In
G. maculatus the lobules of the mature neutrophil are
around two or three (figure  2M and m). The mature
neutrophils measured between both groups of fish did
not present significant differences (P > 0.05) (table 2).
Thrombocyte cell line
Immature thrombocytes.These cells have an elliptical
form. The nucleus is elongated, occupying a great part of
the cell and surrounded by a slightly basophilic cytoplasm
(figure 2N and n). The immature thrombocytes between
both groups of fish did not present significant differences
on size (P > 0.05) (table 2).
Mature thrombocytes. These cells are generally gathered
in cells groups. The nucleus is round and surrounded by
scarce slightly basophilic cytoplasm (figure 2O and o). The
mature thrombocytes between both groups of fish did not
present significant differences on size (P > 0.05) (table 2).
Discussion
The morphology of mature erythrocytes observed in G.
maculatus is coincident with the morphologic descriptions
reported for teleosts by different authors (Roberts 1981,
Brown 1993, Stoskopf 1993, Takashima and Hibiya 1995,
Tavares-Diaz 2006a,b, Pavlidis et al 2007).
Mature erythrocytes in G. maculatus have smaller
size than that described for Atlantic salmon, salmonids
and teleosts in general (Lester and Budd 1979, Yasutake
and Wales 1983, Takashima and Hibiya 1995, Ballarin et
al 2004, Pavlidis et al 2007). Furthermore, the relation
lenght/width is low resulting in a more rounded shape. This
could indicate that adults of G. maculatus have a less active
behavior in comparison with other salmonids since the
form of the erythrocytes is less efficient for the transport
of oxygen, round-like shape cells have less contact surface
in comparison with elliptical cells (Conroy 1972).
The erythroblasts in adult fish of G. maculatus
represented 0.05% of the total erythrocyte cell line and
they had a bigger size than the mature erythrocytes,
contrary to what happens in mammals (Stoskopf 1993),
but similar to what is reported by Lancioni et al (2005) for
Esox lucius. Polychromatocytes were found in 0.48%, a
value that is considered to be normal for teleosts by Ellis et
al (1981), who also indicate that a fish considered healthy
present around 1% of these cells. Ghost cells were detected
in 2.20% of the total cells that were evaluated. These
cellular remains indicate the destruction of erythrocytes
which is a normal process that takes place at the end of
the life cycle of such cells (Conroy 1972). The specialized
literature does not make reference to the normal values
for these erythrocyte remains but indicates that they are
common part of the blood. The erythroplastids were found
in 0.15% of the total analyzed cells. Again, there is not a
reference value for healthy fish but it has been observed
that there is a scarce presence of these cells in the periferic
blood of healthy fish (Conroy 1972).
The lymphocytes, like the rest of the leucocytes found
in G. maculatus, were morphologically similar to those
described by previous authors (Conroy 1972, Ellis 1977,
Roberts 1981, Yasutake and Wales 1983, Stoskopf 1993) in
different species of fish and were present in most abundant
amount than the rest of leucocytes (77.20 ± 0.98%). In
adults of G. maculatus the monocytes, which are the
blood cells with the biggest size (10.59 ± 2.34 μm), were
the less frequent leucocytes (8.6%). The concentration
of monocytes in the blood tissue is depleted by bacterial
diseases such as BKD and vibriosis (Lester and Budd
1979) and by the consumption of diets without vitamin
E (Garcia et al 2007). Furthermore, the presence of
monocytes is abundant in inflamed tissues (Suzuki and
Iida 1992, Bruno and Poppe 1996).
In adults of G. maculatus, mature plus immature
neutrophils were the second group of leucocytes in
abundance, with 21.48% which is a value considered
among the normal rank for teleosts (Olabuenaga 2000).
The morphology of these cells is similar to Salmo salar
(Conroy 1972). These leukocytes of fine grain were
mainly observed in their immature state. The scarce
adult neutrophils presented a bilobulated nucleus in most
of the cases. Stoskopf (1993) established that hyper-
segmentations in the nucleus of these cells are a symptom
of chronic and severe inflammations.
From the five groups of leukocytes, only three
were present in adult fish of G. maculatus: leukocytes,
237
I Valdebenito et al
monocytes and neutrophils. The absent of thick grain
leukocytes (basophiles and eosinophils) is coincident with
other reports that indicate these cells are scarcely present in
the periferical blood, furthermore, their absence is usual in
most teleosts fish (Olabuenaga 2000, Tavares-Diaz 2006a).
This might be related to the fact that the granulocytes
are located in other tissues, such as dermis, intestinal
tissue, gills, natatory bladder, hematopoietic tissue, nasal
epithelium, heart and inflamed tissue in general (Ellis et al
1981, Suzuki and Iida 1992, Olabuenaga 2000, Valenzuela
et al 2003). The granulocytes of thick grain belongs to an
heterogeneous group of cells named mastocytes which
plays a defensive role and are located in different tissues
in the organism (Reite 1998).
There were no significant differences in the size and
percentage between leucocytes of adult and larvae, so
the leucocitary analysis that was done to adult fish of G.
maculatus is similarly applicable to larvae.
The identification of thrombocytes is confusing,
because the similarity of these cells in their mature stage
with the lymphocytes (Tavares-Diaz 2006a). However,
mature thrombocytes are generally conforming cellular
aggregates or coagulated groups; the nucleus stain with
a more intense color than in lymphocytes, they do not
have pseudopods and the cytoplasm is less basophilic
in comparison with lymphocytes. There were not
significant differences in the size and percentage between
thrombocytes of adult and larvae, so the thrombocyte
analysis for G. maculatus is applicable to adults and
larvae.
Larvae of G. maculatus were characterized by the
total absence of mature erythrocytes. This is also valid
for previous stages of the development and could explain
why Campos (1972) did not detect the state of the vitelline
circulation in embryos of this species, and as opposed
to Brachygalaxias spp., where there was circulation of
erythrocytes in the Cuvier’s duct. In larvae of G. maculatus
the elements of the erythrocyte line corresponded to
polychromatocytes, characterized by the presence of a
nucleus in state of cariolysis. These cells could participate
in the transport of oxygen in a less efficient way, because
the maturation process of hemoglobin has not concluded.
However, this possibility is discarded by Harding (1977)
who mentions that the synthesis of hemoglobin takes place
during the maturation of the erythrocyte cell and this is
only mature when the erythrocyte reaches the adult stage.
These cells are not capable to conclude the maturation
process of hemoglobin and they reach a previous stage
to the uptake of ferrous, when they are eliminated as
product of the depigmentation strategy. It can be assumed
that there is no presence of mature ferroproteins, which is
in agreement with other investigations that describe the
absence of iron in the peripheral blood of G. maculatus
during the larvae state (Busse and Mösse 2006).
The blood cytology in larvae of G. maculatus
is comparable to that described by Love (1970) for
238
Chaenocephalus aceratus or blackfin icefish, which also
have a total absence of mature erythrocytes that transport
oxygen in blood. This teleost is exposed to extremely low
temperatures, a condition that generated, at one point of
its evolution cycle, the production of antifreeze substances
like serum nitrogen, calcium, cholesterol and glucose
among others (Love 1970). The increasing viscosity in
blood led to the total elimination of erythrocytes to obtain
acceptable blood fluidity. In order to solve the problem
of oxygen transport, this is restricted to the portion that
is physically dissolved in the blood plasma (Malcom
1970, Busse and Campos 1996). Another fish with
similar haematological characteristics is the larval stage
of Anguilla spp. which lives in more warm temperatures
(Haro and Krueger 1987). Therefore, this haematological
phenomenon is not exclusive of fish living in extremely
cold environments. This feature in G. maculatus might
also be related to the morphology of the fish. The eel-like
shape in larvae confer a higher contact surface (Busse and
Campos 1996). Furthermore, the heart in larvae is 6 to 7
times bigger than a normal heart considering the body
mass. This cardiac hypertrophy, which is even higher than
that described for other species without hemoglobin (such
as Channichthydae spp.), drive to a boost of the blood
caudal, improving the effectiveness of oxygen transport.
The strategy for the oxygen transportation in larvae of G.
maculatus is less efficient with the increment of water
temperature which is normally between 7 and 15oC for
this specie (Campos 1970).
It can be concluded that the blood cytology of common
jollytail (G. maculatus), during the adult stage is similar
to that observed in other teleosts. However, during
the larval period this species does not exhibit mature
erythrocytes in blood. In both states, neither the presence
of eosinophils nor basophiles was detected in circulating
blood. The results of the present report represent the
first antecedent related to the blood haematology of G.
maculatus. This basic information is highly valuable for
the determination of blood parameters and it is also an
important haematological tool for the pathologic diagnosis
in this specie which is considered to have a high potential
for Chilean aquaculture diversification.
Summary
“Puye” (Galaxias maculatus) is a small freshwater fish species of
great interest to Chilean aquaculture diversification, because of the high
commercial value reached by its transparent larvae or “cristalino”. This
study presents the first data with regard to blood cytology in larvae and
adults of this specie. Blood smears stained with May Grünwald-Giemsa
were analysed through optical microscopy. The results show that in G.
maculatus larvae the flowing blood has a transparent look and mature
erythrocytes were not observed, as opposed to the adults of this species
where the complete erythrocyte developmental line could be observed. In
leucocytes, there was no presence of coarse grain cells such as basophils
and eosinophyls. In general, the morphology of the blood cells found in
larvae and adults of G. maculatus have the same characteristic traits as
described elsewhere in reports of other teleosts.
 fish haematology, blood cells, Galaxias maculatus, whitebait
Acknowledgements
The authors would like to thank the Agro-aquaculture Nutritional
Genomic Center (CGNA), belonging to the Regional Program of Scientific
and Technological Development from CONICYT, and to the General
Deanship of Research at the Catholic University of Temuco (DGI-UCT)
for supporting this research work.
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239
Arch Med Vet 43, 241-250 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

pH ruminal y balance metabólico de Mg en vacas lecheras

en pastoreo suplementadas con óxido de magnesio

Ruminal pH and magnesium metabolic balance in dairy cattle on grazing

and supplemented with magnesium oxide

P Sepúlvedaa, F Wittwerb, H Böhmwaldb, RG Pulidoc, M Norob

aEscuelade Graduados, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
bInstituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
cInstituto de Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

SUMMARY

The aim of this study was to evaluate the influence of magnesium oxide (MgO) supplementation at different times and doses on ruminal pH and
magnesium (Mg) metabolic balance in lactating dairy cows grazing on a permanent pasture. Four ruminal-fistulated Friesians cows were used. Animals
were arranged in a 4x3 design, with 3-experimental periods in each experiment. After twenty days of pre-experimental period, measurement periods
lasted 1 day and with an inter-experimental time of 3 days. MgO was given as oral drench after milking. Experiment-1: C = control, MS = 60 g/cow as
morning-supplementation and ES = 60 g/cow as evening-supplementation. Experiment-2: C = control, MgO-60 = 2 doses 30 g/cow and MgO-90 = 2
doses 45 g/cow. Ruminal fluid and blood samples were obtained at 8:30, 10:30, 13:00, 17:30, 19:30, 22:00 and 02:30 hours to determine rumen pH, Mg,
potassium (K) and ammonia-N (N-NH3) concentrations and plasma Mg concentrations. In Experiment-1, pH decreased in C during the day, showing
the lowest values in the afternoon, whereas in MS pH remained without variation during the day and in ES pH increased after the administration. In
Experiment-2, MgO-60 kept pH without changes during the day. Ruminal-Mg concentrations increased in cows receiving ES (Experiment-1) and in
cows receiving MgO-90 (Experiment-2). Magnesemia was greater in MS than C or ES (Experiment-1) and in cows supplemented (Experiment-2).
K and N-NH3 concentrations were similar among treatments in both experiments. It is concluded that 60g MgO, supplied as a single dose in the morning
or as two doses of 30 g each in the morning and evening, respectively, increases ruminal pH of cows reducing the natural decline observed during the
day and increasing magnesemia.

Palabras clave: pH ruminal, óxido de magnesio, pastoreo, vaca lechera.

Key words: ruminal pH, magnesium oxide, grazing, dairy cow.

INTRODUCCIÓN La suplementación con Mg a vacas durante el periodo

El magnesio (Mg) es fundamental para numerosos
procesos fisiológicos y bioquímicos en el organismo (Rosol
y Capen 1997) y por esta razón no es sorprendente que su
deficiencia se manifieste en una variedad de desórdenes en
el bovino, como disminuciones en el consumo de alimento,
fermentación ruminal (Ammerman y col 1971) y produc-
ción de leche (Wilson 1980), e incluso provocar la muerte
producto del cuadro clínico de tetania hipomagnesémica
(Underwood y Suttle 1999). No se ha descrito un mecanismo
hormonal que regule las concentraciones plasmáticas de
Mg, por esto, si la cantidad de Mg excretada por la leche,
orina y heces excede a la cantidad de Mg absorbido se pro-
duce el cuadro de hipomagnesemia (Martens y Schweigel
2000). Este cuadro es una de las alteraciones metabólicas
que ocurre frecuentemente en sistemas de pastoreo de la
zona sur de Chile, particularmente durante el periodo de
primavera y otoño (Scandolo y col 2004).
Aceptado:14.04.2011.
* Casilla 567, Valdivia, Chile; mirelanoro@gmail.com
de la lactancia se ha convertido en una práctica rutinaria en
la mayoría de los predios lecheros, siendo necesaria para
prevenir problemas de salud y reducciones en la produc-
ción de leche de los animales del rebaño (Underwood y
Suttle 1999). Una de las fuentes más usadas en la suple-
mentación de vacas lecheras es el óxido de Mg (MgO) y
se ha reportado que su utilización en dosis de 50 g/vaca/
día es capaz de mantener la magnesemia dentro de límites
fisiológicos (Wittwer y col 1997). El MgO además de ser
una buena fuente de Mg es un alcalinizante ruminal y ha
sido utilizado, en dosis mayores, para moderar el rápido
aumento en la acidez del rumen cuando las vacas son
alimentadas con elevadas cantidades de carbohidratos de
rápida fermentación y aliviar la consecuente reducción
en el apetito y la producción de leche (Thomas y Emery
1969, Jesse y col 1981, Thomas y col 1984, Erdman 1988).
A diferencia de los antecedentes respecto a su utilización
como fuente de Mg, la información disponible sobre su
efecto y dosis a utilizar como fuente alcalinizante del pH
ruminal en vacas en condiciones de pastoreo es escasa
(Valentine y col 1993, Scandolo 2005).

241
P Sepúlveda y col
El pH ruminal presenta variaciones durante el día
(Bretschneider y col 2001, Kolver y de Veth 2002, Pulido
2010); es así como en un estudio realizado en el sur de
Chile con vacas fistuladas mantenidas en pastoreo perma-
nente se observó un valor máximo de 6,7 en horas de la
mañana y un mínimo de 5,9 al final de la tarde (Scandolo
y col 2007). Diversos estudios señalan que la solubilidad
del Mg en el líquido ruminal es dependiente del pH en el
rumen (Johnson y col 1988, Emanuele y Staples 1994,
Dalley y col 1996), ya que su solubilidad disminuye
cuando el pH aumenta sobre 6,5 y aumenta cuando el
pH disminuye (Jittakhot y col 2004b). Basado en estos
antecedentes es posible inferir que para elaborar una
estrategia de suplementación con Mg se debe considerar
como un factor importante el horario de administración
del mineral. En este sentido, y según los antecedentes
de Scandolo y col (2007), el horario más adecuado sería
entre las 11:00 y 17:00 horas. Considerando condiciones
de suplementación prácticas para el personal a cargo del
rebaño, se debería suplementar a los animales en el mo-
mento de la ordeña de la tarde, sin embargo, no existen
antecedentes al respecto.
Por otra parte, es fundamental que el pH del líquido
ruminal de las vacas esté dentro de valores que permitan
una adecuada digestión de forrajes, siendo óptimo un
pH de 6,35 (Kolver y de Veth 2002, Wales y col 2004).
Como se mencionó anteriormente, el pH puede variar
considerablemente durante el día y presentar valores
sobre o bajo el óptimo estipulado. Se ha descrito que la
digestibilidad ruminal in vitro del forraje disminuye a
un pH < 5,8 (Kolver y de Veth 2002, Wales y col 2004)
a causa de un efecto negativo sobre la digestión de la
celulosa y en el desarrollo de bacterias celulíticas (Russell
y Dombrowski 1980). A su vez, cuadros de acidosis
ruminal subaguda (SARA) han sido diagnosticados en
rebaños lecheros del sur de Chile, la mayoría de los casos
asociados a problemas en el manejo nutricional de los
animales (Noro y col 2010). Por lo tanto, el reducir las
variaciones de pH ruminal en vacas a pastoreo podría
dar oportunidad de mejorar la digestión de la materia
orgánica por los microorganismos ruminales, y conse-
cuentemente la ingesta de materia seca y la producción
de leche (Wales y col 2004). En este sentido, el efecto
alcalinizante del MgO podría ser una alternativa eficiente
y de bajo costo.
No se ha determinado si la utilización del MgO en
vacas mantenidas en pastoreo podría, por una parte,
mejorar el balance metabólico de Mg y, por otro lado,
mantener el pH ruminal dentro de límites fisiológicos y
con menores fluctuaciones durante el día. La presente
investigación tuvo como objetivo determinar y comparar
el efecto de una suplementación con MgO matutina o
vespertina y en diferentes dosis sobre el pH ruminal y el
balance metabólico de Mg de vacas lecheras en pastoreo
de primavera.
242
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales y alimentación
Los ensayos fueron realizados en el predio experimental
Vista Alegre de la Universidad Austral de Chile, ubicado
a 9 km al norte de la ciudad de Valdivia, Región de Los
Ríos, Chile, 39º48' LS y 73º13' LO, desde fines de octubre
a inicios de diciembre del año 2008.
Se utilizaron cuatro vacas Frisón Negro fistuladas con
cánulas ruminales permanentes, clínicamente sanas, con
un peso promedio de 500 ± 50 kg, de 3 a 5 años de edad,
entre su 3º a 5º mes de lactancia, con una producción de
leche entre 25 a 30 L/día y con una condición corporal
de 2,5 a 3,5 puntos (escala 1 a 5) (Ferguson y col 1994).
Las vacas fueron mantenidas en pastoreo rotativo de pra-
deras permanentes con predominio de Lolium perenne y
Bromus valdivianus, y libre acceso a agua en potreros de
1 a 4 ha de superficie y con sistema de rotación en franjas
asignadas dos veces al día. Además, cada animal recibió
durante la ordeña de la mañana (8:00 h) y tarde (17:00 h)
2,5 kg de concentrado comercial para vaca en lactancia1,
sin un aporte adicional de sales minerales.
Diseño experimental y tratamientos
El diseño experimental fue dividido en dos etapas. En
la primera etapa (ensayo 1) se determinó el efecto de una
suplementación matutina o vespertina con 60 g/día de MgO,
y en la segunda (ensayo 2), el efecto de una suplementa-
ción con 60 g/día o 90 g/día de MgO. En ambos ensayos
la suplementación se realizó con un suplemento mineral
comercial de MgO granulado2, el que fue suministrado a
cada vaca con agua por vía oral.
Antes de iniciar los ensayos los animales pasaron por
un período de adaptación, durante el cual permanecieron
20 días con una dieta control, constituida de forraje y
concentrado. Luego se inició el ensayo 1 y posteriormen-
te el ensayo 2, ambos de nueve días de duración. Entre
ambos ensayos los animales permanecieron tres días sin
suplementación de Mg. De esta manera, el experimento
en total tuvo una duración de 41 días, incluido el periodo
de adaptación.
Ensayo 1. Se utilizó un diseño de 4 x 3 (4 animales y 3
tratamientos), con 3 periodos experimentales de 1 día de
duración cada uno y 3 días de descanso entre periodos. En
cada periodo experimental las vacas recibieron tratamientos
distintos (4 repeticiones por tratamiento), según lo descrito
a continuación: Tratamiento 1, control: sin suplementación
con MgO; Tratamiento 2, suplementación matutina: 60
g/vaca/día de MgO, suministrado posterior a la ordeña
de la mañana (8:40 h); Tratamiento 3, suplementación
1 Suralim Mega 2132. IANSAGRO. Quepe. Chile
2 Agrícola Nacional, Chile.

vespertina: 60 g/vaca/día con MgO, suministrado posterior
a la ordeña de la tarde (17:40 h). creatinina, las muestras se diluyeron 1:1.300 con LaCl3
Ensayo 2. Al igual que el ensayo 1, se utilizó un diseño
de 4 x 3 (4 animales y 3 tratamientos), con 3 periodos
experimentales de 1 día de duración cada uno y 3 días de
descanso entre periodos. En cada periodo experimental las
vacas recibieron tratamientos distintos (4 repeticiones por
tratamiento), según lo descrito a continuación: Tratamiento 1,
control: sin suplementación de MgO; Tratamiento  2,
MgO 60: 60 g/vaca/día de MgO, suministrado mitad en la
mañana (8:40 h) y mitad en la tarde (17:40 h); Tratamiento 3,
suplementación MgO 90: 90 g/vaca/día de MgO, suministrado
mitad en la mañana (8:40 h) y mitad en la tarde (17:40 h).
Muestras y análisis
Líquido ruminal. Se obtuvieron 50 mL de líquido ruminal
del saco caudoventral del rumen de forma manual a través
de la cánula ruminal en siete oportunidades: a las 8:30 horas
(previo a la administración de MgO), posteriormente a las
10:30, 13:00 y 17:30 horas (previo a la administración de
MgO en la tarde) y a las 19:30, 22:00 y 2:30 horas del día
siguiente. Inmediatamente se determinó el pH mediante
un peachímetro portátil3. Para la determinación de Mg
y potasio (K) se obtuvo una alícuota de líquido ruminal
para ser centrifugada a 3.000 g durante 15 minutos y el
sobrenadante obtenido se congeló a –20 °C en microtubos
de 1,5 mL hasta su posterior análisis. Para la determinación
de nitrógeno amoniacal (N-NH3) se traspasaron 10 mL
de muestra, previamente filtrada, a tubos con 0,1 mL de
H2SO4 al 50% y se mantuvieron refrigerados. Luego, las
muestras fueron transportadas al laboratorio dentro de tres
horas desde su obtención y centrifugadas a 2.000 g durante
15 minutos a 4 °C, traspasando 1,5 mL del sobrenadante a
microtubos y congeladas a –20 °C hasta su posterior análi-
sis. Las concentraciones ruminales de Mg se determinaron
mediante el empleo de un EAA4 y las concentraciones
ruminales de K mediante fotometría de llama4 utilizando
una dilución de 1:2.500 y 1:200 con cloruro de lantano
(LaCl3) al 0,1%, respectivamente. La concentración de
N-NH3 se determinó en duplicado mediante colorimetría5,
utilizando la reacción de indofenol (Bal y col 2000). Los
resultados fueron expresados en mmol/L.
Orina. Se obtuvieron muestras de 50 mL de orina por
micción natural inducida mediante estimulación de la
región subvulvar a las 8:30, 13:00, 17:30 y 22:00 horas.
Inmediatamente se traspasó un volumen de 5 mL en tubos
con 0,3 mL de HCl 6N y luego fueron centrifugadas a 270 g
durante 10 minutos, traspasando 1,5 mL del sobrenadante
a microtubos y congelados a –20 °C hasta su posterior
3 Peachímetro portátil HI 98127. HANNA Instruments.
4 Espectrofotómetro de absorción atómica Thermo Solaar®.
5 Fotocolorímetro Hitachi 4020®, Boehringer Mannheim.
pH ruminal, óxido de magnesio, pastoreo, vaca lechera
análisis. Para determinar las concentraciones de Mg y
al 0,1% y 1:50 con agua, respectivamente. La concentra-
ción de Mg se determinó con un EAA4 y la de creatinina
mediante colorimetría (Jaffé, Human®), utilizando un
autoanalizador de bioquímica clínica6. Los resultados se
expresaron en mmol/L. Además se determinó el clearance
de Mg urinario o Mg-u corregido por creatinina (CUM)
por la fórmula: CUM (mmol/L)  = Mg-u (mmol/L) /
creatinina-u (mmol/L) (Sutherland y col 1986).
Plasma. Muestras de sangre fueron obtenidas mediante
venopunción yugular utilizando tubos heparinizados de
5 mL a las mismas horas de obtención de las muestras de
líquido ruminal. Fueron centrifugadas a 270 g durante 10
minutos para la obtención de plasma, el que fue traspasado
a microtubos y congelados a –20 °C hasta su posterior
análisis. Se determinó la concentración de Mg por EAA4
utilizando una dilución de 1:100 con LaCl3 al 0,1%. El
resultado se expresó en mmol/L.
Alimento. Se obtuvieron dos muestras de pradera que co-
rrespondieron al día de inicio de cada ensayo y una muestra
compuesta del concentrado. Cada muestra de pradera para
digestibilidad correspondió a un corte sobre los 7 centímetros
(altura de residuo postpastoreo), recolectando el mismo tipo
de material que consumían las vacas. Se determinó materia
seca (MS) (horno de ventilación y estufa), proteína bruta
(PB) (Micro Kjeldahl), energía metabolizable (EM), fibra
detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA),
cenizas totales (combustión a 550 °C) y Mg y K (EAA)7.
Sus valores se presentan en el cuadro 1.
Análisis estadístico
Los datos obtenidos se analizaron mediante estadística
descriptiva (X ± EE). La normalidad se evaluó utilizando
la prueba de Shapiro-Wilk y la homoscedasticidad por la
prueba de Bartlett. Se utilizó un diseño lineal general de
AOV/AOCV considerando el efecto de la hora del día
de suplementación (ensayo 1) o dosis de MgO (ensayo
2); el efecto fijo del período de muestreo; el efecto de la
interacción entre el suplemento y el período de muestreo;
el efecto de la interacción entre el suplemento y el hora
del día; considerando el efecto del animal como covaria-
ble. Las medias se contrastaron mediante la prueba de
comparaciones múltiples de Tukey. Se utilizó un valor
de P < 0,05 como criterio de aceptación de efectos es-
tadísticamente significativos (Petrie y Watson 2006). El
programa computacional utilizado fue el Statistix 8.0 para
Windows (Analytical Software, Roseville, MN, USA)
(Statistix 2003).
6 MetroLab 2300®, Wiener Lab.
7 Espectrofotómetro de absorción atómica Unicam 969®.
243
P Sepúlveda y col

Cuadro 1. Composición química de la pradera y del concentrado suplementación con MgO vespertina comparado con el
(en base a MS) otorgados a las vacas durante el estudio. tratamiento control o suplementación matutina (cuadro 2).
Chemical composition of the forage and concentrate Las vacas controles no presentaron variaciones durante el
(% of DM) offered to the cows during the experimental period.
transcurso del día (P > 0,05) a diferencia de los animales
que recibieron suplementación matutina, los que aumen-
Pradera
taron sus concentraciones posterior a la suplementación
Parámetro Ensayo 1 Ensayo 2 Concentrado
(P < 0,05) para luego mantenerlas estables y similares
(17/11/08) (1/12/08)
al grupo control (figura  1). Las vacas que recibieron
MS (%) 20,5 19,9 89,5 suplementación vespertina mostraron un aumento de las
PB (%) 26,2 25,0 9,98 concentraciones posterior a la suplementación (P < 0,05),
EM Mcal/kg MS 2,80 2,70 2,95 para luego disminuir en las horas posteriores (figura 1).
FDN (%) 38,4 41,2 9,67 K y N-NH3 ruminal. Las vacas que recibieron suple-
FDA (%) 26,0 27,4 5,23 mentación no presentaron diferencias (P > 0,05) en las
CT (%) 9,30 8,30 13,8 concentraciones de K en relación a las vacas controles
Mg (%) 0,20 0,20 0,25
(cuadro  2). Sin embargo, se observaron diferencias
(P < 0,05) entre los horarios de muestreo, presentando
K (%) 1,00 1,00 0,47
las menores concentraciones en horas de la mañana
MS: materia seca; PB: proteína bruta; EM: energía metabolizable; FDN: (21,1 ± 1,62 mmol/L) y los mayores en horas de la tarde
fibra detergente neutro; FDA: fibra detergente ácido; CT cenizas totales; (30,6 ± 2,23 mmol/L). Con respecto al N-NH3, las vacas
Mg: magnesio; K:potasio.
que recibieron suplementación no presentaron diferencias
(P > 0,05) en las concentraciones en relación a las vacas
RESULTADOS controles (cuadro 2). Sin embargo, al igual que con el K,
se observaron diferencias (P < 0,05) entre los horarios de
Ensayo 1 muestreo, presentándose los menores valores a las 8:30
horas (12,2 ± 4,45 mmol/L) y los mayores (24,3 ± 4,02
pH ruminal. Las vacas que recibieron suplementación mmol/L) entre las 17:30 y 19:30 horas.
con MgO, matutina y vespertina, presentaron valores de Mg plasmático y CUM. La magnesemia fue superior
pH ruminal superiores (P < 0,05) a las vacas controles en las vacas que recibieron suplementación matutina, si
(cuadro 2). Los animales que recibieron suplementación bien todos los valores se encontraron dentro de los límites
matutina mantuvieron los valores de pH ruminal sin varia- fisiológicos (cuadro 2 y figura 2). No se observaron cambios
ciones durante el día (P > 0,05) y los con suplementación (P > 0,05) en el CUM entre tratamientos (cuadro 2), sin
vespertina aumentaron su pH posterior a la suplementación embargo, se observó una tendencia a aumentar las con-
(P < 0,05), manteniendo estos valores sin cambios hasta centraciones en las horas posteriores a la suplementación.
las 2:30 horas. Por el contrario, en las vacas controles se
observó una disminución (P < 0,05) del pH ruminal en Ensayo 2
horas de la tarde, presentando los valores promedio más
bajos (5,9) a partir de las 17:30 horas (figura 1). pH ruminal. Las vacas que recibieron suplementación
Mg ruminal. Las concentraciones ruminales de Mg con MgO, 60 y 90 g, presentaron valores de pH ruminal
fueron superiores (P < 0,05) en los animales que recibieron superiores (P < 0,05) a las vacas controles (cuadro 3) y

Cuadro 2. Valores (X ± EE) de pH ruminal, concentraciones ruminales de potasio (K), magnesio (Mg) y nitrógeno amoniacal (N-NH3),
concentración plasmática de Mg y de clearance urinario de Mg (CUM) en vacas lecheras a pastoreo con una suplementación matutina
o vespertina de 60 g de óxido de magnesio (MgO) y controles.
Ruminal pH, potassium (K), magnesium (Mg) and ammonia-N (N-NH3), concentrations, Mg plasma concentrations and urinary clearance
of Mg (X ± EE) from grazing cows with a morning or evening supplementation of 60 g of magnesium oxide (MgO) and controls.

Tratamientos Valor de P
Parámetro
Control MgO matutino MgO vespertino Entre tratamientos Tratamiento x tiempo
pH líquido ruminal 6,07 ± 0,10b 6,30 ± 0,10a 6,28 ± 0,10a 0,0000 0,0028
Mg rumen (mmol/L) 1,80 ± 0,18b 1,98 ± 0,24b 2,16 ± 0,31a 0,0046 0,1119
K rumen (mmol/L) 27,08 ± 1,73a 27,36 ± 1,94a 26,68 ± 2,42a 0,8707 0,9415
N-NH3 (mmol/L) 27,78 ± 4,15a 26,98 ± 6,86a 27,93 ± 4,9la 0,7595 0,9341
Mg plasma (mmol/L) 0,83 ± 0,03b 0,89 ± 0,04a 0,86 ± 0,03b 0,0014 0,4508
CUM (mmol/L) 2,94 ± 0,53a 3,18 ± 0,53a 2,90 ± 0,50a 0,3088 0,1029
Letras diferentes entre columnas indican diferencias significativas entre tratamientos (P < 0,05).

244
 pH ruminal, óxido de magnesio, pastoreo, vaca lechera

Control MgO matutino MgO vespertino Control MgO matutino MgO vespertino
7,10 7,10

6,80 6,80
pH ruminal

pH ruminal
6,50 6,50

6,20 6,20

5,90 5,90

5,60 5,60

3,50 3,50

3,00 3,00
Mg ruminal (mmol/L)

Mg ruminal (mmol/L)
2,50 2,50

2,00 2,00

1,50 1,50

1,00 1,00

1,05 1,05
Mg plasmático (mmol/L)

Mg plasmático (mmol/L)
1,00 1,00

0,95 0,95

0,90 0,90

0,85 0,85

0,80 0,80

0,75 0,75

0,70 0,70
08:30 10:30 12:30 14:30 16:30 18:30 20:30 22:30 00:30 02:30 08:30 10:30 12:30 14:30 16:30 18:30 20:30 22:30 00:30 02:30
Tiempo (horas) Tiempo (horas)

( ) Indica los horarios de suplementación según tratamientos. ( ) Indica los horarios de suplementación según tratamientos.

Figura 1. Variación (X ± EE) de pH ruminal y de las concentra-
ciones ruminales y plasmáticas de magnesio (Mg) desde las 8:30
a las 2:30 horas en vacas a pastoreo y con una suplementación
matutina o vespertina de 60 g de óxido de magnesio (MgO).
Diurnal variation (X ± EE) of ruminal pH and ruminal and
plasma magnesium (Mg) concentrations between 8:30 and 2:30 hours
in grazing cows with a morning or evening supplementation of 60 g of
magnesium oxide (MgO).
Figura 2. Variación (X ± EE) de pH ruminal y de las concentra-
ciones ruminales y plasmáticas de magnesio (Mg) desde las 8:30
a 2:30 horas en vacas mantenidas en pastoreo (control) y con una
suplementación de 60 g o 90 g de óxido de magnesio (MgO).
Diurnal variation (X ± EE) of ruminal pH and ruminal and
plasma magnesium (Mg) concentrations between 8:30 and 2:30 hours
in grazing cows supplemented with 60 g or 90 g of magnesium oxide
(MgO).

mantuvieron los valores de pH ruminal sin variaciones
durante el día (P > 0,05, figura  2). Al igual que en el
Ensayo 1, en las vacas controles se observó una dismi-
nución (P < 0,05) del pH ruminal en horas de la tarde,
presentando los valores más bajos a partir de las 19:30
horas (figura 2).
Mg ruminal. Las concentraciones de Mg ruminales
fueron mayores en los animales que recibieron suple-
mentación versus el control, siendo mayores (P < 0,05)
en las vacas que recibieron una suplementación de 90 g
de MgO (cuadro 3). A su vez, los animales control y los
suplementados con 60g MgO mantuvieron constantes las
concentraciones de Mg ruminales durante el transcurso del
día (P > 0,05), en tanto que los animales que recibieron 90
g aumentaron (P < 0,05) sus concentraciones a las 19:30
horas, manteniendo altos valores hasta las 22:00 horas.
K y N-NH3. Al igual que en el ensayo 1, las vacas que
recibieron suplementación presentaron concentraciones de
K similares (P > 0,05) a las vacas controles (cuadro 3). Sin
embargo, se observaron los menores valores en horas de la
mañana (24,4 ± 3,77 mmol/L) y los mayores en horas de la
tarde (40,0 ± 2,23 mmol/L) en todos los grupos (P < 0,05).
Resultados similares se observaron en relación al N-NH3,
donde las concentraciones fueron semejantes entre los
grupos (P > 0,05), presentándose los menores valores a las
8:30 (23,9 ± 3,46 mmol/L) y los mayores entre las 19:30 y
22:00 horas (33,9 ± 4,24 mmol/L).
Mg plasmático y CUM. La magnesemia fue superior
(P < 0,05) en los animales que recibieron suplementación,
si bien todos los valores se encontraron dentro de los límites
fisiológicos (cuadro 3 y figura 2). El CUM del grupo MgO
90 fue superior (P < 0,05) comparado con el control, pero
similar (P > 0,05) al grupo MgO 60 (cuadro 3).

245
P Sepúlveda y col
Cuadro 3. Valores (X ± EE) de pH ruminal, concentraciones ruminales de potasio (K), magnesio (Mg) y nitrógeno amoniacal (N-NH3),
concentración plasmáticas de Mg y valores de clearance urinario de Mg (CUM) en vacas lecheras a pastoreo con una suplementación
de 60 g o 90 g de óxido de magnesio (MgO) y controles.
Ruminal pH, potassium (K), magnesium (Mg) and ammonia-N (N-NH3), concentrations, Mg plasma concentrations and urinary clearance
of Mg (X ± EE) from grazing cows with a supplementation of 60 g or 90 g of magnesium oxide (MgO) and controls.
Tratamientos
Parámetro
Control MgO 60
pH líquido ruminal 6,19 ± 0,15b 6,51 ± 0,17a
Mg rumen (mmol/L) 1,90 ± 0,20b 1,98 ± 0,24ab
K rumen (mmol/L) 27,78 ± 4,15a 26,98 ± 6,86a
N-NH3 (mmol/L) 27,88 ± 3,02a 30,40 ± 3,2la
Mg plasma (mmol/L) 0,79 ± 0,06b 0,86 ± 0,08a
CUM (mmol/L) 2,34 ± 0,27b 2,65 ± 0,29ab
Letras diferentes entre columnas indican diferencias significativas entre tratamientos (P < 0,05).
DISCUSIÓN
pH ruminal
La suplementación con MgO produjo un aumento en
el pH ruminal promedio diario de las vacas tratadas en
relación a las vacas controles de ambos ensayos, lo que se
explica por el efecto neutralizante que posee esta fuente
mineral sobre la acidez del contenido ruminal, aumentando
así su pH (Schaefer y col 1982, Erdman 1988, Xin y col
1989, Christiansen y Webb 1990).
El pH ruminal promedio observado durante las horas de
muestreo en los animales no suplementados (controles) varió
desde 6,5 (a las 8:30 horas en el ensayo 1 y 2) a 5,9 (17:30
y 19:30 horas en los ensayos 1 y 2, respectivamente); estos
resultados son similares a los descritos en otros trabajos
para vacas en condiciones semejantes de manejo, donde
los mayores valores se observan en horas de la mañana
y los menores en horas de la tarde (Bretschneider y col
2001, Kolver y de Veth 2002, Scandolo y col 2007). Esto
se debe en parte al patrón de pastoreo diurno de la vaca,
a la periodicidad del consumo MS y, consecuentemente,
a los periodos de rumia durante el día (Hinostroza 2004,
Wales y col 2004). La disminución del pH ruminal en
vacas a pastoreo se produce cuando la ingesta de MS de
alta digestibilidad es mayor (Williams y col 2001, Wales y
col 2004), lo que provoca una mayor fermentación ruminal,
producción de dióxido de carbono (CO2) y ácidos grasos
volátiles (AGVs), los cuales son los principales responsa-
bles de la acidificación ruminal (Kolver y de Veth 2002).
Los valores de pH del líquido ruminal de las vacas
control contrastan con lo observado en las vacas que
recibieron suplementación con MgO en ambos ensayos,
donde los valores de pH se mantuvieron sobre 6,25 y sin
variaciones significativas a lo largo de las horas posteriores
a su administración. Sin embargo, las vacas que recibieron
suplementación vespertina, al igual que las vacas controles,
246
Valor de P
MgO 90 Entre tratamientos Tratamiento x tiempo
6,50 ± 0,13a 0,0031 0,0626
2,29 ± 0,27a 0,0380 0,1485
27,93 ± 4,91a 0,5295 0,4423
26,52 ± 4,12a 0,5763 0,9949
0,87 ± 0,12a 0,0006 0,0067
2,99 ± 0,36a 0,0333 0,4013
alcanzaron valores de 5,9 previo a ser suplementadas (17:30
horas). Diversos estudios han demostrado la importancia
del pH en la digestión de celulosa y se ha señalado que
breves periodos de tiempo con pH inferiores a 6,0 no
afectarían la digestión ruminal (Calsamiglia y col 2002);
sin embargo, periodos más extensos (de varias horas) con
pH < 6,2 (Hoover 1986, Calsamiglia y col 2002, Kolver y
de Veth 2002) son desfavorables para la digestión de la fibra
y la función del rumen. En las vacas controles de ambos
ensayos y en las vacas que recibieron suplementación en
horas de la tarde, si bien mostraron un promedio de pH
ruminal durante el día superior a 6,1, hubo varias horas
durante la tarde en que el pH fue de 5,9, lo que sugiere
que la digestión de los forrajes en estos animales no fue
del todo adecuada. La reducción en la digestión de fibra
se debe a que las bacterias celulolíticas del rumen son
sensibles al ácido (Plaizier y col 2008). Estas bacterias
generalmente no toleran un pH bajo 6,0, el cual puede
causar reducciones en la tasa de crecimiento y número de
organismos celulolíticos y, consecuentemente, la digestión
de la fibra (Hoover 1986, Shi y Weimer 1992, Russell y
Wilson 1996). Se ha demostrado en estudios in vitro que
la digestión de celulosa es inhibida por completo cuando
el pH es menor de 5,2 (Stewart 1977). La disminución en
la digestión de la fibra reduce el contenido energético neto
de la dieta y puede presentar un impacto negativo sobre
el consumo de alimento (Allen 2000). Wales y col (2004)
indican que la digestibilidad del alimento y la producción
de leche pueden ser incrementadas con estrategias de
alimentación que minimicen la variación diurna de pH,
manteniendo valores sobre 6,1 durante todo el día. En este
sentido, el efecto de la suplementación con MgO en una
sola dosis de 60 g en horas de la mañana (ensayo 1) o con
dos dosis de 30 g o 45 g en la mañana y otra en la tarde
(ensayo 2) fueron capaces de mantener estables y dentro de
los límites fisiológicos el pH ruminal de las vacas durante
todo el día. Estos resultados serían favorables al promover

una mayor estabilidad del ambiente del rumen en vacas
lecheras en sistemas de pastoreo en las condiciones del
presente trabajo.
Concentraciones ruminales de Mg, N-NH3 y K
En ambos ensayos, la concentración de Mg ruminal en
las vacas que recibieron MgO fue más elevada que en las
vacas controles a las 2 horas posterior a la suplementación,
indicando que la suplementación de Mg incrementa la
concentración de Mg en el líquido ruminal postingesta,
similar a lo informado en otros estudios (Dalley y col 1997,
Jittakhot y col 2004a). Al mismo tiempo, la concentración
ruminal de Mg disminuyó a valores cercanos a los iniciales
a las 8 horas posteriores a la suplementación conforme a
lo descrito por (Xin y col 1989). Esto se relaciona con la
mayor tasa de pasaje del forraje (Tafaj y col 2002) y con
la ingesta de agua durante la alimentación, incrementan-
do el flujo de los nutrientes hacia el duodeno (Xin y col
1989, Carter y Grovum 1990, Cole 2000), no estando
influenciada por la concentración de K ruminal (Jittakhot
y col 2004b). Por otro lado, vacas sin suplementar no
presentaron variaciones en las concentraciones rumina-
les de Mg durante el transcurso del día, manteniendo en
promedio valores de 1,76 y 1,90 mmol/L en el ensayo 1
y 2, respectivamente. Estos resultados son inferiores a lo
descrito por Scandolo y col (2007), quienes encontraron
que el contenido promedio de Mg ruminal en horas de la
noche (21:00 horas) alcanzó los 6,6 mmol/L, y además se
encuentran levemente bajo los límites de 2,0 a 4,0 mmol/L
establecido por Schweigel y col (2000).
La información obtenida en el ensayo 1 muestra que las
vacas suplementadas con 60 g de MgO en horas de la tarde
(suplementación vespertina) presentaron concentraciones
ruminales promedio de Mg superiores a los animales
controles y a los animales suplementados en horas de la
mañana, alcanzando las mayores concentraciones a las
2 horas posteriores a su suplementación (19:30 horas)
y manteniendo estos valores elevados por lo menos por
4,5 horas postsuplementación. Estudios han demostrado
que las concentraciones de Mg en el líquido ruminal son
mayores a medida que el pH disminuye, indicando que la
solubilización es dependiente del pH ruminal (Johnson y
col 1988, Emanuele y Staples 1994, Underwood y Suttle
1999). Johnson y col (1988) describen que las concentra-
ciones de Mg ultrafiltrable en el líquido ruminal de vacas
disminuyen de 6,0 mmol/L a 0,05 mmol/L cuando el pH
ruminal aumenta de 5,6 a 7,2, y por otra parte, Dalley y
col (1997) informan que la solubilidad in vitro de Mg
en el líquido ruminal disminuye de un 80% a un 20%
aproximadamente, cuando el pH aumenta de 5,0 a 7,0.
Estos antecedentes permiten suponer que la diferencia
encontrada en las concentraciones de Mg en el líquido
ruminal en los animales que recibieron una suplementa-
ción matutina comparado con la vespertina, se asocia al
elevado pH ruminal en horas de la mañana (6,5) versus
pH ruminal, óxido de magnesio, pastoreo, vaca lechera
al de la tarde (5,9), debido probablemente a la mayor so-
lubilización del Mg en horas de la tarde cuando el pH es
más bajo. Esta misma tendencia se observó en el ensayo
2, en el tratamiento de 90 g de MgO en dos dosis, donde
la suplementación de la mañana fue menos efectiva en
aumentar las concentraciones de Mg en el rumen (de 1,73
mmol/L previo a la suplementación a 2,10 mmol/L posterior
a la suplementación), a diferencia de lo observado en la
suplementación de la tarde (de 2,20 mmol/L previo a la
suplementación a 2,78 mmol/L posterior a la suplemen-
tación), a pesar de suplementar con dosis similares de 45
g de MgO en cada oportunidad.
La concentración de N-NH3 en el líquido ruminal no
se afectó por la suplementación, pero sí se observaron
diferencias a lo largo del día con valores menores durante
la mañana y mayores en la tarde. La concentración de
N-NH3 en el rumen es consecuencia de la concentración
de amonio (NH4+) y amoníaco (NH3) en dependencia del
pH ruminal (Visek 1968, Chalupa 1972, Fernández y col
2001). Cuanto más elevado es el pH ruminal mayor es la
proporción de la forma no ionizada o libre (NH3) y, cuanto
más ácido es el pH ruminal mayor será la proporción de la
forma ionizada (NH4+) (Visek 1968), lo que coincide con
lo observado en los animales sin suplementar. Un aumento
repentino en la concentración de NH4+ ruminal reduce la
absorción de Mg (Martens y col 1988) y disminuye la
concentración plasmática y urinaria de Mg (Head y Rook
1955). No obstante, este efecto solo es transitorio, ya que
un aumento de NH4+ ruminal sostenido en el tiempo no
provoca alteraciones en el metabolismo del Mg, debido a
la adaptación de la pared ruminal (Martens y Schweigel
2000). Sin embargo, las razones de este efecto depresor
temporal del NH4+ sobre la absorción de Mg y los meca-
nismos adaptativos de la pared ruminal aún son inciertas.
Las vacas de ambos ensayos presentaron elevadas
concentraciones ruminales de K durante el día y, al igual
que lo notado con el NH4+, se observaron diferencias entre
las horas de muestreo presentándose los menores valores
en horas de la mañana y mayores en horas de la tarde,
semejante a lo informado en otro trabajo en condiciones
similares de manejo (Scandolo y col 2007). El K se en-
cuentra en elevadas concentraciones en el rumen por ser
un mineral 100% soluble (Emanuele y Staples 1994). La
variación observada en las horas de muestreo se explica
por el patrón de comportamiento de vacas lecheras a
pastoreo, siendo el consumo de MS de pradera mayor en
horas de la tarde (Amaral-Phillips y col 1997, Hinostroza
2004). Por otro lado, la concentración de K ruminal no
fue afectada por la suplementación con Mg, similar a lo
informado en otros estudios (Ram y col 1998, Jittakhot
y col 2004b). Se ha descrito que el alto contenido de K
en la dieta afecta negativamente la absorción de Mg en
los rumiantes (Tomas y Potter 1976, Greene y col 1983,
Leonhard-Marek y Martens 1996, Martens y Schweigel
2000), informándose que concentraciones de K en la dieta
superiores al 2,0 % MS disminuyen la absorción del mineral
247
P Sepúlveda y col
(Sykes 1993). En las condiciones del presente trabajo el
contenido de K en la pradera fue de un 1,0% MS y por lo
tanto se puede asumir que no tuvo un efecto significativo
sobre la absorción de Mg.
Magnesemia y CUM
Las vacas de ambos ensayos presentaron concentracio-
nes plasmáticas de Mg dentro de los límites de referencia
(0,7-1,1 mmol/L) señalado para bovinos en el sur de
Chile (Wittwer y Böhmwald 1986). A su vez, las vacas
suplementadas con MgO presentaron un incremento de
la concentración de Mg plasmático dentro de las prime-
ras horas de recibida la suplementación, para disminuir
gradualmente en el transcurso de las horas, coincidiendo
este aumento con el incremento observado en el CUM,
similar a lo descrito en otros trabajos (van Ravenswaay y
col 1989, Dalley 1994).
Se describe una elevada correlación (r = 0,91) entre
la cantidad de Mg absorbido y la concentración de Mg
plasmático (Jittakhot y col 2004a). En el ensayo 1 se ob-
servó que la magnesemia promedio del día en las vacas
suplementadas en horas de la mañana fue mayor a la de las
suplementadas en la tarde, pese a que se utilizó la misma
dosis de 60 g y a que en estas últimas se observaron las
mayores concentraciones de Mg en el rumen posterior a la
suplementación. En el ensayo 2, en tanto, se observó que
la magnesemia promedio del día fue mayor en las vacas
suplementadas dos veces al día comparado con el grupo
control. Cabe señalar que la absorción de los minerales
no depende sólo de la concentración en la pastura o en el
suplemento, sino también de la ingesta y de su disponibi-
lidad (Towers 1982). Se ha descrito que la salida diaria de
Mg desde el rumen se incrementa cuando el pH decrece,
indicando que el pH ruminal y la absorción de Mg tienden
a correlacionarse de manera inversa (Johnson y col 1988,
Emanuele y Staples 1994). Esta situación podría explicar
las menores concentraciones de Mg plasmático en los
animales que recibieron suplementación vespertina, si
bien todos se encontraron dentro del límite de referencia.
Además, como se mencionó anteriormente, tanto el K
como el NH4+ interfieren en la absorción del Mg y en
este estudio se presentaron en mayores concentraciones
en horas de la tarde.
Los resultados del trabajo permiten concluir que 60 g
de MgO, suministrado como dosis única en la mañana o
como dos dosis de 30 g cada una por la mañana y tarde,
logra minimizar las fluctuaciones diarias de pH en el
líquido ruminal e incrementar la magnesemia en vacas
lecheras en sistemas de pastoreo.
RESUMEN
El objetivo del trabajo fue evaluar una suplementación con óxido
de magnesio (MgO) en diferentes horarios y dosis sobre el pH ruminal
y balance metabólico de magnesio (Mg) en vacas lecheras en pastoreo.
248
Se utilizaron 4 vacas Frisonas Negro-Chileno con cánulas ruminales. El
diseño experimental fue de 4x3, con 3 periodos experimentales de 1día
de duración en cada ensayo y 3 días de descanso entre periodos. El MgO
se suministró oralmente posterior al ordeño. Ensayo-1: C = control;
SM = 60g/vaca como suplementación-matutina y SV = 60g/vaca como
suplementación-vespertina. Ensayo-2: C = control, MgO-60 = 2-dosis
30g/vaca y MgO-90 = 2 dosis 45g/vaca. Se obtuvieron muestras de
líquido ruminal y sangre a las 08:30, 10:30, 13:00, 17:30, 19:30,
22:00 y 02:30 horas, determinándose los valores de pH ruminal,
concentraciones ruminales de Mg, potasio (K), N-amoniacal (N-NH 3)
y Mg plasmático. En ensayo-1, el pH-ruminal disminuyó durante el
día en C con valores más bajos durante la tarde, en SM no varió y en
SV incrementó postsuplementación. En ensayo-2, MgO-60 mantuvo el
pH-ruminal constante durante el día. Concentraciones de Mg-ruminal
aumentaron en las vacas que recibieron SV (ensayo-1) y MgO-90
(ensayo-2). La magnesemia fue mayor en SM (ensayo-1) y en MgO-60
y MgO-90 (ensayo-2). Las concentraciones de K y N-NH 3 fueron
semejantes entre grupos. Se concluye que 60 g de MgO, suministrado
en la mañana como dosis única o en dos dosis de 30 g, minimiza las
fluctuaciones diarias del pH ruminal e incrementa la magnesemia en
vacas lecheras en pastoreo.
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250
Arch Med Vet 43, 251-258 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

Algunos aspectos sobre el estado de colonización y estado serológico en cerdas vacunadas

contra Mycoplasma hyopneumoniae y de sus lechones según el número ordinal de partos#

Some aspects about the colonization and serologic state of Mycoplasma hyopneumoniae
vaccinated sows and their piglets by parity distribution

P Tamiozzoa,b*, A Carranzaa, J Parada a,c, B Pellizaa, A Ambrogia

aGrupo Salud Porcina, Departamento Patología Animal, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto,
Córdoba, Argentina.
bConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina.

cConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Ministerio de Ciencia y Técnica de la Provincia de

Córdoba, Córdoba, Argentina.

Summary

The aim of this study was to determine the colonization and serologic state of piglets and sows of different ordinal number of farrowings. Between
78 and 81 sows, multiple-vaccinated against Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), were sampled (from 1st to 9th parity) at day 0 of gestation, 8 weeks
of pre-farrowing and post-farrowing, and 163 piglets at two weeks old, taking blood samples (for enzime-linked immunosorbent assay test, ELISA)
and nasal swabs (for polymerase chain reaction, PCR). In addition to the percentages of seropositive and PCR positive, other values were obtained
to determine the concentration of antibodies and to analyze the dynamics of antibodies in sows and piglets. The percentage of seropositive sows and
title values were both high. The same was observed in piglets, allowing to conclude that the multiple vaccinations of the first ones guarantees a high
level of antibodies in their offspring, but not 100%. The sows of intermediate parity number showed a higher variability in those values that reflected
concentration of antibodies; at day zero of gestation the sows of first farrowing showed these lower values. At post-farrowing, younger sows and their
offspring showed the highest percentage of nPCR positive. Sows (and piglets) showed a higher concentration of antibodies when increasing the number
of ordinal farrows, although this can be due to vaccination and the repeated exposure of the animals to Mh under field conditions.

Palabras clave: Mycoplasma hyopneumoniae, hembras, lechones, colonización, ELISA, nPCR.

Key words: Mycoplasma hyopneumoniae, sows, piglets, colonisation, ELISA, nPCR.

INTRODUCCIÓN nPCR), sería un posible indicador de la diseminación del

Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) es el agente etiológico
de la neumonía enzoótica porcina (NEP), una enfermedad
respiratoria crónica que afecta principalmente a los cerdos
en las etapas de desarrollo-terminación.
La transmisión por contacto con secreciones nasales
y la circulación del patógeno puede ocurrir de manera
horizontal (de cerdos infectados a cerdos sanos) o de las
hembras a sus lechones (Thacker 2006). Para reducir la
transmisión de las hembras a los lechones, la vacunación
de las mismas (para asegurar una alta concentración de
anticuerpos en el calostro) y/o el tratamiento antibiótico
tanto de hembras como de lechones (para minimizar la
diseminación del patógeno) son medidas de control de la
enfermedad usadas frecuentemente (Maes y col 2008).
Se ha sugerido que la prevalencia inicial de la coloni-
zación nasal en lechones al destete, utilizando la reacción
en cadena de la polimerasa anidada (sus siglas en inglés,
Aceptado: 12.05.2011.
# Financiado por el Proyecto PICT-O 30511/2005-ANPCyT-FONCyT.
* ptamiozzo@ayv.unrc.edu.ar
patógeno por parte de las hembras (Ruiz y col 2003), si
bien no está claro el rol de los anticuerpos maternos en
la prevención de la colonización de los lechones, pues
no se sabe con certeza si la hembra vacunada disemina
menor cantidad de Mh o la inmunidad pasiva protege a
los lechones de la colonización.
Por un lado, la transmisión madre-lechón estaría in-
fluenciada por el número ordinal de partos de las mismas.
Desde hace tiempo se ha sugerido que las cerdas jóvenes
son más propensas a transmitir Mh a sus lechones (Goodwin
1965) y si bien recientemente se ha informado lo mismo
(Calsamiglia y Pijoan 2000, Fano y col 2006) no existe
una determinación taxativa del número ordinal de partos
crítico en la transmisión del patógeno.
Por otro lado, las estrategias de vacunación contra
Mh dependen de diversos factores como el tipo de piara o
sistema de producción. En condiciones de campo, la vacu-
nación de las hembras es implementada frecuentemente.
Recientemente se ha demostrado que la vacunación de las
hembras no influye en la colonización de los lechones, sin
embargo aumenta el porcentaje de lechones seropositivos
al destete y reduce las lesiones pulmonares compatibles
con NEP en matadero (Sibila y col 2007).

251
P Tamiozzo y col
La protección debida a anticuerpos maternos sería
suficiente para el control de la infección de Mh. La inmu-
nidad pasiva es útil en programas de erradicación basados
en la despoblación parcial; sin embargo, el resultado de
los programas de erradicación dependerían de la cantidad
de anticuerpos maternales consumidos por los lechones
(Rautiainen y Wallgren 2001).
Pocos estudios han informado sobre los efectos de la
vacunación de las hembras en el estado serológico y estado
de colonización de los lechones al destete (Ruiz y col 2003,
Sibila y col 2007). Sin embargo, la presencia de Mh y de
anticuerpos en lechones provenientes de madres vacunadas
de manera múltiple no ha sido estudiada, tal vez por ser
considerado obvio. Esto es importante teniendo en cuenta
que la efectividad de la vacuna sería menor en piaras con
baja presión de infección (Maes y col 1999).
Finalmente, debido al hecho de que la vacunación de
las cerdas no afecta la colonización de los lechones, a los
diferentes resultados acerca del estado serológico y estado
de colonización de hembras y lechones teniendo en cuenta
el número ordinal de partos y a que la efectividad de la
vacuna sería menor en piaras con baja presión de infección,
los objetivos del presente estudio fueron: 1) Determinar el
estado serológico y el estado de colonización de hembras
con múltiples vacunas contra Mh y lechones según el
número ordinal de partos y 2) Analizar la dinámica de la
concentración de anticuerpos en las cerdas.
MATERIAL Y MÉTODOS
La granja
Se trabajó en una granja múltiple sitio, con 4.100
madres aproximadamente. Todos los animales reproduc-
tores (cerdas, machos y primerizas) recibían como mínimo
cinco dosis de vacuna contra Mh (RespiSureONE, Pfizer,
Argentina). Las hembras eran vacunadas tres semanas pre-
parto y el esquema de vacunación había sido adoptado tres
años antes aproximadamente. La granja se consideró de
mínima enfermedad, por haber desarrollado un programa de
despoblación parcial poco antes del estudio. Los animales
enviados a matadero presentaban un bajo porcentaje de
lesiones pulmonares compatibles con NEP.
Diseño del estudio y colecta de muestras
Se realizó un estudio de cohorte longitudinal. El n de
hembras fue obtenido estimando una prevalencia del 10%,
con 95% de confianza y 5% de exactitud (Win.Episcope
2.0), ajustando el tamaño del muestreo a la población bajo
estudio. Las cerdas fueron elegidas al azar considerando
todos los números ordinales de parto (de 1 a 9) en cada
muestreo, con una distribución proporcional a la pobla-
ción total de la granja en ese momento. Por la pérdida
de algunas muestras, finalmente fueron procesadas 79,
80 y 79 por serología y 81, 80 y 78 por nPCR en los tres
252
muestreos realizados a las hembras, respectivamente (ver
más adelante).
Por cada hembra, dos lechones fueron aleatoriamente
seleccionados. Las hembras y los lechones fueron iden-
tificados con autocrotal. No se realizó cruce de camadas
durante el desarrollo del estudio. Por la pérdida de una
muestra, se trabajó finalmente con 163 lechones.
Se tomaron muestras de sangre (para serología, sin
anticoagulante) e hisopado nasal (poliestireno + viscosa
estéril en hembras y aluminio + viscosa estéril en lecho-
nes, Deltalab, España) a las hembras en los días cero de
gestación, ocho semanas preparto y 2-5 días postparto y a
los lechones a las dos semanas de edad. Se tuvo especial
cuidado al introducir el hisopo profundamente dentro de la
nariz, al retirarlo de la misma y al colocarlo en el interior
del tubo con medio de transporte de Amies modificado a
fin de evitar la contaminación del mismo.
Procesamiento de las muestras
Serología. Las muestras de sangre fueron centrifuga-
das a 800 x g por 10 min en centrífuga de sedimentación
(Modelo 2036, Rolco, Argentina) y el suero obtenido fue
congelado a –20ºC hasta su procesamiento. Para detectar
la presencia de anticuerpos contra Mh se utilizó el kit de
ELISA (HerdChek® Mycoplasma hyopneumoniae, IDEXX,
Maine, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Aquellos sueros con valores de densidad óptica (DO)
mayores al punto de corte fueron considerados positivos
y el resto (dudosos y negativos) como negativos.
Con el fin de obtener una idea aproximada de la concen-
tración de anticuerpos anti-Mh se calcularon: el promedio de
los valores de la DO, el rango (valor de DO máximo-mínimo),
la razón muestra: positivo (M:P=[ DO de la muestra-DO del
control negativo / [DO del control positivo-DO del control
negativo]), el título (antilogaritmo del log10 del título) para
lo cual debió calcularse primero el log10 del título (1.09 [log10
M: P] + 3.36), y el valor de grupo de título (teniendo en
cuenta la tabla de cuantificación del kit utilizado (IDEXX
HerdCheck* Mycoplasma hyopneumoniae)1, para comparar
la concentración de anticuerpos en las hembras y lechones
de acuerdo a los diferentes números ordinales del parto, las
hembras en los diferentes momentos de muestreo y en los
lechones a las dos semanas de edad.
nPCR. Los hisopos nasales fueron resuspendidos en 1
mL de agua estéril contenida en tubo plástico de 1,5 mL,
vortexeados y retirados del tubo. Luego fueron centrifu-
gados a 22.000 x g durante 10 min a 4ºC y se trabajó con
el sedimento obtenido. El ADN fue extraído utilizando
el kit comercial (DNAzol®, InvitrogenTM, CA, USA) de
acuerdo a las instrucciones del fabricante. Cada 10 mues-
tras un hisopo vacío fue incluido como control negativo.
1 Brochure, disponible en: http://www.idexx.com/pubwebresources/
pdf/en_us/livestock-poultry/herdchek-mhyo-information-sheet.pdf.
Accessed march 2010.
 Mycoplasma hyopneumoniae, hembras, lechones, colonización, ELISA, nPCR

La nPCR fue realizada de acuerdo a previos estudios RESULTADOS

(Calsamiglia y col 1999) con la única excepción que no
se utilizó glicerol al 5%. Cada cinco muestras se incluyó
ADN de Mycoplasma floccculare como control negativo
de la amplificación. Como control positivo se utilizó ADN
de cultivo puro de Mh ubicándolo en la última posición de
cada tanda de muestras procesadas (no más de 15 por vez).
Para minimizar los riesgos de contaminación, cada uno de
los pasos del proceso (extracción de ADN, amplificación
y visualización) fue realizado en habitaciones diferentes.
El producto amplificado (352 pb) fue corrido en gel de
agarosa al 1% y teñido con bromuro de etidio (0,5 µg/ml)
y visualizado con un transiluminador (Luz UV).
Análisis estadístico
Para los análisis estadísticos se utilizó el programa
EPIDAT (Versión 3.1, Galicia, España). Para analizar el
efecto del número ordinal de partos las hembras fueron
divididas en los siguientes grupos: A- Bajo número de
parto (1er), B- Intermedio número de parto (2do- 4to), C-
Alto número de parto (5to- 9no).
Se compararon las proporciones de los siguientes
parámetros: i) número de hembras seropositivas y nPCR
positivas en los diferentes muestreos, ii) número de
hembras seropositivas y nPCR positivas de acuerdo al
número ordinal de partos en cada uno de los muestreos y
iii) número de lechones seropositivos y nPCR positivos
según el número ordinal de parto de sus madres.
Se realizó una comparación de medias por un t-test,
previa verificación de la normalidad de los datos, de los
valores promedio de DO y de las razones M:P de hembras
de diferentes números de partos en los distintos muestreos.
Para analizar la relación entre el estado serológico y
estado de colonización de la madre y el lechón se usaron
tablas de contingencia (2x2) considerando el número
ordinal de partos de las cerdas.
El porcentaje de hembras seropositivas fue alto en
todos los muestreos (cuadro  1). No hubo diferencia
estadísticamente significativa (P > 0,05) entre hembras
seropositivas en los diferentes muestreos, ni entre hembras
seropositivas con distinto número ordinal de parto a pesar
de que se observaron diferentes comportamientos entre los
grupos. A saber: en el muestreo del día cero de gestación,
los porcentajes de seropositivas fueron aumentando acorde
aumentaba el número ordinal de partos. En los siguientes
muestreos, hembras de los grupos A y C fueron 100%
seropositivas y fueron las hembras de intermedio número
de partos quienes mostraron menor porcentaje.
La misma diferencia en el comportamiento de los
resultados se observa en relación al número ordinal de
partos con los valores de DO, razón M:P y título (cuadro 2)
donde, al día cero de gestación, todos los valores aumen-
taron de acuerdo al aumento en el número de partos. Esto
se ve resaltado por el hecho de que hembras del grupo
A mostraron un valor de grupo de títulos de anticuerpos
de 3 vs los grupos B y C donde este valor fue de 4. A las
8 semanas preparto y al postparto, las hembras del grupo
B mostraron los valores más bajos de DO y razón M:P.
Los valores de grupos de título fueron de 4 a las 8 semanas
preparto y de 5 al postparto, para todas las hembras, más
allá del número ordinal de partos. El rango (diferencia
entre valor máximo y valor mínimo) de DO fue mayor
en hembras del grupo B respecto los otros grupos en los
tres muestreos. Sólo hubo diferencia estadísticamente
significativa (P = 0,05) entre los promedios de DO y razón
M:P en hembras del grupo B respecto las del grupo A y
C a las 8 semanas preparto y al postparto.
El porcentaje de hembras nPCR positivas varió de
14% a 50% (cuadro 1) en todos los muestreos. Sólo en el
muestreo del postparto se encontró diferencia estadística-
mente significativa (P = 0,0023) entre hembras del grupo
A respecto al grupo B (cuadro 1). El mayor porcentaje

Cuadro 1. Número de positivos/muestreados (y porcentaje) para nPCR y ELISA, de las cerdas al día 0 de gestación, a las 8 semanas
de preparto y a los 2-5 días postparto y lechones de 2 semanas de edad de acuerdo a la distribución del número ordinal de partos.
Number of positives/sampled (and percentage) by nPCR and ELISA, of sows at 0 day of pregnancy, at 8 weeks pre-farrowing and at 2-5
days post farrowing and 2 week old piglets according to parity distribution.

Grupos según Lechones de 2 semanas

Día 0 de gestación 8 semanas preparto 2-5 días postparto
n ordinal de de edad
partos nPCR ELISA nPCR ELISA nPCR ELISA nPCR ELISA
A 2/14 (14,2) 13/14 (92,8) 3/13 (23) 13/13 (100) 7/14* (50) 13/13 (100) 7/27 (25,9) 23/27 (85,1)
B 13/39 (33,3) 38/39 (97,4) 17/40 (42,5) 38/40 (95) 6/40* (15) 39/41 (95,1) 17/81 (20,9 74/81 (91,3)
C 5/28 (17,8) 26/26 (100) 11/27 (40,7) 27/27 (100) 6/24 (25) 25/25 (100) 6/55 (10,9) 52/55 (94,5)
Total 20/81 (24,6) 77/79 (97,4) 31/80 (38,7) 78/80 (97,5) 19/78 (24,3) 77/79 (97,4) 30/163 (18,4) 149/163 (91,4)

A-  Hembras de bajo número de parto (1er), B- Hembras de intermedio número de parto (2do-4to) y C- hembras de alto número de parto (5to-9no).
A-  Sows from low parity number (1st), B- Sows from low intermediate parity number (2nd-4th) y C- Sows from high parity number (5th-9th).
*    Diferencia estadísticamente significativa (P = 0,0023) entre ambos muestreos.
*    Statistical significant difference (P = 0.0023) between both samplings.

253
P Tamiozzo y col

Cuadro 2. Valores promedio de densidad óptica [DO], rango (valor DO máximo-mínimo), Razón M: P, título y grupo de título de
las hembras (al día 0 de gestación, a las 8 semanas preparto y a los 2-5 días postparto) y de los lechones a las 2 semanas de edad de
acuerdo al número ordinal de partos.
Average values of optical density [OD], range (OD maximum value- minimum), S:P ratio, titer and antibody titer groups of sows (at 0
days of pregnancy, at 8 weeks pre-farrowing and at 2-5 days post-farrowing) and piglets at 2 weeks old according to parity distribution.

Grupos según número ordinal de partos

Valor
A (1ro) B (2do- 4to) C (5to- 9no)
Prom DO (rango) 0,738 (0,644) 0,787 (1,03) 0,819 (0,66)
gestación
Día 0

Razón M:P 1,490 1,612 1,690

Título 3539 3854 4055
Grupo de título 3 4 4
Prom DO (rango) 0,895 (0,901) 0,750* (0,906) 0,799 (0,886)
preparto
8 sem.

Razón M:P 1,875 1,521 1,641

Título 4549 3614 3926
Grupo de título 4 4 4
Prom DO (rango) 1,141 (0,599) 0,998* (0,996) 1,019 (0,756)
postparto
2-5 días

Razón M:P 2,477 2,128 2,180

Título 6151 6039 5357
Grupo de título 5 5 5
Promedio Título 4756 4502 4446
Hembras Grupo de título 4 3 4
Prom DO (rango) 0,727 (1,262) 0,778 (1,284) 0,846 (1,389)
Lechones 2
sem. edad

Razón M:P 1,584 1,716 1,890

Título 3784 4130 4581
Grupo de título 4 4 4

A- Hembras de bajo número de parto (1er), B- Hembras de intermedio número de parto (2do- 4to) y C- hembras de alto número de parto (5to- 9no).
A- Sows from low parity number (1st), B- Sows from low intermediate parity number (2nd- 4th) y C- Sows from high parity number (5th- 9th).
* Diferencia estadísticamente significativa (P = 0,05) entre A, B y C.
* Statistical significant difference (P = 0.05) among A, B and C.

promedio de hembras nPCR positivas fue hallado a las
8 semanas preparto, aunque hubo diferencias entre los
diferentes grupos. A saber: en los muestreos del día 0
de gestación y a las 8 semanas preparto, las hembras del
grupo B mostraron los mayores porcentajes de nPCR
positivas, mientras que en el muestreo del postparto las
que mostraron ese mayor porcentaje fueron hembras
del grupo A.
El porcentaje de lechones seropositivos varió entre 85,1%
y 94,5%. No hubo diferencia estadísticamente significativa
(P > 0,05) entre el número de lechones seropositivos según
el número ordinal de parto de sus madres, ni entre lechones
nPCR positivos según el mismo parámetro. Al igual que
las hembras al día cero de gestación, tanto los porcentajes
de seropositivos como los valores promedios de DO, razón
M:P y título aumentaron de acuerdo al número ordinal de
parto de sus madres (cuadro 2) aunque el valor de grupo
de título fue siempre de 4. Lo contrario ocurrió con los
porcentajes de nPCR positivos que fueron decreciendo a
medida que aumentaba el número ordinal de parto de sus
madres (cuadro 1).
No hubo diferencia estadísticamente significativa entre
el estado serológico o de colonización de las hembras y los
lechones. Ciento cuarenta y cinco lechones seropositivos
(sobre 149; 97,3%) provenían de madres seropositivas,
siendo 52/55 (94,5%) hijos de hembras de alto número de
partos, 70/75 (93,3%) de hembras de intermedio número
de partos y 23/27 (85,2%) de hembras de bajo número
de partos.
Del total de lechones hijos de madres seropositivas (157),
treinta fueron nPCR positivos (19%), siendo 7/27 (25,9%)
hijos de hembras de bajo número de parto, 17/75 (22,6%)
hijos de hembras de intermedio número de partos y 6/55
(11%) de hembras de alto número de partos (cuadro 3).
Solo 7/30 lechones nPCR positivos (23,3%) provenían
de madres nPCR positivas, siendo 5 de ellos (71%) hijos
de hembras de bajo número de partos (cuadro 3). No hubo
lechones nPCR positivos de madres seronegativas.
DISCUSIÓN
El porcentaje de hembras seropositivas fue más alto a
los obtenidos en estudios previos donde las hembras eran
vacunadas por primera vez, dos veces antes del parto (Ruiz
y col 2003, Sibila y col 2007). A pesar de que no hubo
diferencia estadísticamente significativa entre hembras

254
 Mycoplasma hyopneumoniae, hembras, lechones, colonización, ELISA, nPCR

Cuadro 3. Resultados de ELISA y nPCR de los lechones a 2 semanas de edad, teniendo en cuenta el estado serológico y de coloniza-
ción de las cerdas a los 2-5 días postparto según la distribución del número ordinal de partos.
ELISA and nPCR results of piglets at 2 weeks of age, taking into account the serologic and colonisation state of sows at 2-5 days post-
farrowing according their parity distribution.

Lechones de 2 semanas de edad

ELISA nPCR
Grupos según (n=163) (n=163)
n ordinal
de partos + – + –
Total Total
(n=149) (n=14) (n=30) (n=133)
A ( n=13) 23 4 27 7 20 27
B ( n=39)* 70 5 75 17 58 75
+
C ( n=25)** 52 3 55 6 49 55
Total (n=77) 145 12 157 30 127 157
ELISA

A ( n=0) 0 0 0 0 0 0
B ( n=2) 4 2 6 0 6 6
-
Hembras al postparto

C ( n=0) 0 0 0 0 0 0
Total (n=2) 4 2 6 0 6 6
TOTAL (n=79) 149 14 163 30 133 163
A ( n=7) 11 3 14 5 9 14
B ( n=6) 9 2 11 0 11 11
+
C ( n=6)‡ 19 0 19 2 17 19
Total (n=19) 39 5 44 7 37 44
nPCR

A ( n=7) 12 1 13 2 11 13
B ( n=34)† 65 5 70 17 53 70
-
C ( n=18) 33 3 36 4 32 36
Total (n=59) 110 9 119 23 96 119
TOTAL (n=78) 149 14 163 30 133 163

A- Hembras de bajo número de parto (1er), B- Hembras de intermedio número de parto (2do-4to) y C- hembras de alto número de parto (5to- 9no).
A- Sows from low parity number (1st), B- Sows from low intermediate parity number (2nd-4th) y C- Sows from high parity number (5th- 9th).
* En una muestra se consideró el resultado de ELISA de muestreo anterior (8 semanas pre-parto) debido a la pérdida del suero del muestreo postparto.
** En dos muestras se consideraron los resultados de ELISA de muestreo anterior (8 semanas preparto) debido a la pérdida del suero del muestreo
postparto.
‡ En 3 muestras se consideraron los resultados de nPCR del muestreo anterior (8 semanas preparto) debido a la pérdida del ADN del muestreo
post-parto.
† En una muestra se consideró el resultado de nPCR del muestreo anterior (8 semanas preparto) debido a la pérdida del ADN del muestreo postparto.
* In 1 sample was considered the ELISA result of previous sampling (8 weeks pre-farrowing) due to loss of a serum of post-farrowing sampling.
** In 2 samples were considered the ELISA results of previous sampling (8 weeks pre-farrowing) due to loss of a serum of post-farrowing sampling.
‡ In 3 samples were considered the nPCR results of previous sampling (8 weeks pre-farrowing) due to loss of a DNA of post-farrowing sampling.
† In 1 sample was considered the nPCR result of previous sampling (8 weeks pre-farrowing) due to loss of a DNA of post-farrowing sampling.

de los diferentes muestreos, ni entre hembras con distinto
número ordinal de parto, hubo hembras seronegativas.
La presencia de estas hembras seronegativas y los di-
ferentes comportamientos entre los grupos en los distintos
muestreos podrían explicarse por el hecho de que el kit de
ELISA utilizado no es 100% sensible (pudiendo dar falsos
negativos; Erlandson y col 2005), a que la vacuna no es
100% efectiva (Giesecke 2002), a distintas respuestas a la
vacunación por parte de los animales o a la generación de
respuesta inmune celular a la vacuna (Thacker y col 1998)
ya que se ha demostrado que la seroconversión inducida al
utilizar bacterinas comerciales, es entre el 30% al 100%
(Mattsson y col 1995, Thacker y col 1998).
Estas diferencias, sumadas al hecho de que en hem-
bras del grupo B el rango de la DO fue mayor en todos
los muestreos respecto a hembras de los otros grupos, y a
que en el muestreo del día cero de gestación el valor del
grupo de título para hembras del grupo A fue menor al
resto, es interesante ya que refuerza la idea previa de que
la población de hembras en una piara no es homogénea,
sino un conjunto de subpoblaciones con diferente estado
inmune, acordando con estudios previos (Dee 1996).
La falta de evidencia estadísticamente significativa no
nos permitió establecer taxativamente la relación entre
el estado serológico y el número ordinal de partos de las
hembras.

255
P Tamiozzo y col
Se ha sugerido que hacia el postparto las hembras se
vuelven más susceptibles a la infección por Mh porque los
anticuerpos protectores son transferidos desde la sangre
hacia la glándula mamaria durante el último mes de ges-
tación (Wallgren y col 1998), pero bajo las condiciones
de este estudio a las 8 semanas preparto el porcentaje
promedio de hembras seropositivas fue el más alto y los
otros valores (DO, razón M:P, título y grupo de título)
no demostraron caída, lo que podría deberse a que en el
momento de dicho muestreo los anticuerpos no estaban
siendo transferidos hacia la glándula mamaria aún o al
hecho de que las hembras estaban hiperinmunizadas.
En el muestreo postparto, el promedio total de valores
de DO así como también la razón M:P, título y grupo de
título, aumentaron. Este incremento en los niveles de
anticuerpos podría deberse a la respuesta a la vacuna-
ción, ya que las cerdas se vacunaron aproximadamente 3
semanas antes de parir. Aunque también podría tratarse
de una seroconversión debido a una infección natural, que
puede tardar de 4 a 9 semanas (Sitjar y col 1996) o más
teniendo en cuanta la baja la presión de infección asumida
en el presente estudio.
En todos los muestreos, la razón M:P fue más baja que
otras obtenidas al postparto, en suero de cerdas vacunadas
por vez primera, dos semanas antes del parto (Martelli y
col 2006), provenientes de una piara con antecedentes
de Mh. Esto es interesante porque quizás en ese estudio
(Martelli y col 2006) la respuesta a la vacuna fue más
exacerbada y en el presente estudio, dada la baja presión
de infección debida al programa hiperinmunización apli-
cado desde hace tiempo y al programa de despoblación
parcial llevado a cabo, el comportamiento de la respuesta
a la vacunación fue diferente de acuerdo a los métodos de
detección utilizados.
En el muestreo del día cero de gestación de las cerdas
y en el de los lechones (2 semanas de edad), los valores
promedio de DO, razón M:P y títulos se incrementaron
acorde al número ordinal de partos, lo que junto con el
alto porcentaje de cerdas seropositivas en el grupo C (alto
número de partos), sugieren que el aumento de la concen-
tración de anticuerpos maternos quizás podría deberse
tanto al esquema de hiperinmunización implementado
en la granja, como también la exposición repetida de las
cerdas al Mh en condiciones de campo, siendo las cerdas
más viejas las que mayor concentración de anticuerpos
presentaron.
Sin embargo, en el muestreo de las 8 semanas pre-
parto las cerdas de intermedio número de partos (2do a 4to)
mostraron los valores más bajos (promedio de DO, razón
M: P, título y grupo de título) respecto a hembras de bajo
y alto número de partos. Esto, sumado al hecho de que las
hembras del grupo B mostraron el mayor rango de DO en
todos los muestreos puede deberse a que estas hembras
pertenecen a una subpoblación con mayor variabilidad en
la concentración de anticuerpos, ya que tanto las hembras
más jóvenes, al enfrentarse por primera vez con el agente
256
como las hembras más viejas, que han estado expuestas
por largo tiempo al agente, además de las vacunaciones,
presentan una concentración de anticuerpos más alta.
Los resultados de nPCR señalan la presencia del
patógeno en la piara. Nosotros asumimos que el Mh está
presente, pero en cantidad insuficiente para causar enfer-
medad ya que no había tos (datos inéditos) a pesar de que
el porcentaje de nPCR positivos es mayor al obtenido en
otros estudios (Ruiz y col 2003, Fano y col 2006, Sibila y
col 2007) ya que debemos tener en cuenta la capacidad de
la PCR de detectar microorganismos viables o no viables
y el mayor riesgo de obtener falsos positivos al utilizar
una PCR anidada.
Asumiendo que el muestreo postparto es el que mejor
representa la relación entre la madre y el lechón, y teniendo
en cuenta la evidencia estadísticamente significativa obte-
nida en los resultados de nPCR de las cerdas de grupo A vs
grupo B, se sugeriría que las hembras de primer parto son
más propensas a transmitir el Mh a sus lechones, ya que
también fueron los hijos de esas hembras los que mayor
porcentajes de nPCR positivos demostraron si bien no
existió en éstos evidencia estadísticamente significativa.
Estos resultados concuerdan parcialmente con otros en
donde se ha señalado como grupo de riesgo a hembras
jóvenes (Goodwin 1965, Calsamiglia y Pijoan 2000, Fano
y col 2006), aunque no pudo demostrarse y sigue poco
claro cuál es el número de partos crítico en la transmisión
del patógeno ya que los diferentes autores consideramos
de manera distinta hembras de bajo, intermedio o alto
número de partos. Además, en ese muestreo, las hembras
de intermedio número de partos fueron las que menores
porcentajes de nPCR positivos mostraron, no refleján-
dose lo mismo en sus lechones. Esto puede deberse a la
eliminación intermitente del patógeno (Ruiz y col 2003).
Solamente en dos momentos coincidieron los porcen-
tajes más altos de nPCR positivos y los porcentajes más
bajos de seropositivos, en el grupo B de hembras a las 8
semanas preparto y en los lechones. A primera vista, estos
resultados sugerirían que un menor nivel de anticuerpos
protectores predispone a una mayor diseminación del Mh
pero sería un error aseverar esto ya que en el resto de los
muestreos no hubo tal coincidencia. Esta falta de coinci-
dencia, además del hecho de que no hubo lechones nPCR
positivos hijos de madres seronegativas se deba quizás, por
un lado, a que, como se dijo anteriormente, los animales
no presenten anticuerpos pero sí estén protegidos por
inmunidad celular (Thacker y col 1998), y por otro lado a
la diseminación intermitente de Mh, responsable también
del comportamiento dispar de los resultados de nPCR
entre los grupos (Ruiz y col 2003). Estos dos fenómenos
constituyen el principal obstáculo en estudios de este tipo.
Además, al día 0 de gestación, las hembras del grupo A
no sólo mostraron el porcentaje más bajo de seropositivos,
sino también los valores más bajos de promedio de DO,
razón M:P, título y grupo de título de todos los muestreos
realizados en las hembras. Esto puede ser explicado por
 Mycoplasma hyopneumoniae, hembras, lechones, colonización, ELISA, nPCR
el hecho de que los anticuerpos vacunales decayeron, ya
que en el primer muestreo las hembras habían sido vacu-
nadas 12 semanas antes y de acuerdo a estudios anteriores
(Maes y col 1999) llevado a cabo no en hembras, sino en
cerdos en crecimiento, la concentración de anticuerpos
sin el efecto “booster” de una infección natural, decaen
en 3 meses aproximadamente siendo el grupo de hembras
más jóvenes el que más caída de anticuerpos demostró.
Sin embargo luego aumentaron, por lo que se trataría de
una seroconversión debido a una infección natural o bien
debido a la vacunación realizada preparto.
Más del 85% de los lechones fueron seropositivos,
seguramente debido estado serológico de las cerdas. El
97,3% de los lechones seropositivos procedían de cerdas
seropositivas, mostrando una alta tasa de transferencia
de anticuerpos maternos. El hecho de que el 100% de los
lechones hijos de hembras seropositivas no fueran sero-
positivos puede deberse a la vida media de los anticuerpos
en el suero de los mismos que varía de 6,5 a 22,5 días
(Curtis y Boumer 1972) o a la menor cantidad de calostro
ingerido por algunos de ellos.
Teniendo en cuenta la distribución según el numero
ordinal de partos, el porcentaje más alto de lechones sero-
positivos procedían de cerdas del grupo C (alto número de
partos) 94,5% vs 91,3% en el grupo B y 85,1% del grupo
A. El promedio de lechones nPCR positivos (18,4%) fue
superior al informado en estudios previos (Ruiz y col
2003, Sibila y col 2007), a pesar de que las cerdas fueron
repetidamente vacunadas. Sólo el 23,3% de los lechones
nPCR positivos provenían de cerdas de nPCR positivas.
Siendo el 71% de esos positivos, hijos de cerdas de bajo
número de partos. Esto sugiere que la colonización nasal
de los lechones refleja el estado de la colonización de las
cerdas (24,3% de las cerdas fueron nPCR positivos al
postparto). La coincidencia entre el menor porcentaje de
seropositivos y el mayor porcentaje de nPCR positivos,
en lechones hijos de hembras del grupo A, sugeriría que
las cerdas de primer parto son más propensas a transmitir
Mh a sus lechones, como se señalara anteriormente, pero
no existió evidencia significativa.
Como se dijo, no está claro el papel de los anticuerpos
maternos en la prevención de la colonización los lechones.
Nuestros resultados muestran que no hubo lechones nPCR
positivos hijos de madres ELISA negativas y que el 100%
de los lechones nPCR positivos provenían de cerdas ELISA
positivas, eso sugiere, como se informó anteriormente
(Ruiz y col 2003, Sibila y col 2007), que los anticuerpos
maternos no protegen a los lechones de la colonización.
En resumen, bajo las condiciones descritas en este estudio,
la múltiple vacunación de las cerdas garantiza un alto nivel
de anticuerpos en los lechones, aunque no es 100%. Las
cerdas de intermedio número de partos (2do a 4to) presentaron
una mayor variabilidad en aquellos valores que reflejan la
concentración de anticuerpos. Al postparto las hembras más
jóvenes y su descendencia mostraron los mayores porcen-
tajes de nPCR positivos. Si bien las cerdas, al aumentar el
número ordinal de partos, tienen mayor concentración de
anticuerpos (y sus lechones), esto puede deberse tanto a la
vacunación como a la exposición repetida de cerdas al Mh
en condiciones de campo o seguramente a ambas.
RESUMEN
Para determinar el estado de colonización y el estado serológico
de lechones y de cerdas de diferente número ordinal de partos, entre
78 y 81 hembras vacunadas de manera múltiple contra Mycoplasma
hyopneumoniae (Mh) fueron muestreadas (de 1er a 9no parto) al día 0 de
gestación, a las 8 semanas de preparto y al postparto y 163 lechones a las
dos semanas de edad, tomando muestras de sangre (para enzimoinmuno
ensayo, ELISA) e hisopados nasales (para reacción en cadena de
polimerasa, PCR). Además de los porcentajes de seropositivos y PCR
positivos, se calcularon otros valores para determinar la concentración
de anticuerpos y así analizar la dinámica de los anticuerpos en hembras
y lechones. El porcentaje de cerdas seropositivas fue alto, al igual que
los valores de título. Lo mismo se observó en los lechones, por lo que se
concluyó que la múltiple vacunación de las primeras garantiza un alto
nivel de anticuerpos en sus crías, aunque no es del 100%. Las cerdas
de intermedio número de partos presentaron una mayor variabilidad en
aquellos valores que reflejan la concentración de anticuerpos; siendo
al día cero de gestación las hembras de primer parto las que mostraron
estos valores más bajos. Al postparto las hembras más jóvenes y su
descendencia mostraron los mayores porcentajes de nPCR positivos. Si
bien las cerdas (y los lechones), al aumentar el número ordinal de partos,
presentaron una mayor concentración de anticuerpos, esto puede deberse
tanto a la vacunación como a la exposición repetida de los animales al
Mh en condiciones de campo.
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ARTÍCULO ORIGINAL

Aplicación del bioensayo EROD-H4IIE para la determinación de dioxinas

en carnes de pollos broiler: un estudio de equivalencia con la cromatografía
de gases de alta resolución acoplada a espectrometría de masas de alta resolución#

Application of the EROD-H4IIE bioassay for the determination of dioxins

in broiler chicken meat: an equivalence study with high resolution gas chromatography
coupled to high resolution mass spectrometry

JT Schoffera, C Bustos-Lópezb, P Sotomayora, CA Mattara, A Gonzáleza, C Roblesa,

F Samsinga, O Acevedoa y CE Valdovinosa*
aCentro de Investigaciones Ecotoxicológicas, Facultad de Ciencias Silvoagropecuarias, Universidad Mayor, Santiago, Chile.
bDepartamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias, Universidad Santo Tomás, Santiago, Chile.

SUMMARY

The EROD bioassay with H4IIE cell line was applied in this study to determine the equivalence of the results for chicken meat between the EROD-
H4IIE Bioassay in pg TCDD-EQ/g of tissue, and the results of the gas chromatography coupled to high resolution spectrometry (HRGC/HRMS) in pg
WHO-TEQ/g of fat of TEQs. 41 compound samples of chicken drumsticks were used. The samples were obtained in slaughtering plants of 4 different
production facilities of Chile, during the sacrifice of animals (38 and 43 days old) between 2004 and 2007. Each sample was analysed with both
analytical techniques. A regression model for the equivalence of both techniques was determined from the results. The model obtained was: HRGC/
HRMS = 0.481 + 0.051[EROD-H4IIE]2, R2 = 0.885, therefore for a value in EROD-H4IIE of 2.2 pg TCDD-EQ/g of tissue it is estimated that it will
correspond to 0.73 pg WHO-TEQ/g of fat in HRGC/HRMS. Also, for the same value of EROD-H4IIE with a 95% confidence, an estimate as an upper
limit equal to 0.83 pg WHO-TEQ/g of fat in HRGC/HRMS will be obtained. An upper limit equal to 0.88 pg WHO-TEQ/g of fat in HRGC/HRMS is
estimated by taking the same value of EROD-H4IIE with 99% confidence. It is concluded that de EROD-H4IIE bioassay can be applied as a screening
method in animal production systems and specifically in broiler chicken production.

Palabras clave: dioxina, bioensayo H4IIE, HRGC/HRMS, EROD.

Key words: dioxin, H4IIE bioassay, HRGC/HRMS, EROD.

INTRODUCCIÓN reducción del peso testicular y de la espermatogénesis

Con el nombre genérico de dioxinas, se conoce a un
grupo de compuestos orgánicos tricíclicos halogenados.
El grado de cloración y la posición de los átomos de cloro
determinan la existencia de 75 congéneres de dibenzodioxi-
nas (PCDDs) y 135 de dibenzofuranos (PCDFs). Sólo los
compuestos que son clorados en las posiciones 2, 3, 7 y
8 presentan toxicidad. Esto incluye 7 dibenzodioxinas,
10 dibenzofuranos y 12 bifenilos policlorinados (PCBs)
(Roeder y col 1998). El compuesto de dioxina más tóxico
es la 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD), tam-
bién conocida con el nombre de dioxina Seveso (Whyte
y col 2004).
En humanos y otros vertebrados, las dioxinas son
consideradas como factores de riesgo para el desarrollo
del cáncer (Fingerhut y col 1991), inmunodeficiencia
(Weisglas-Kuperus y col 2000), menor tamaño de la próstata,
(EC 2001), disminución de los niveles séricos de testosterona
(Egeland y col 1994), desarrollo de patologías del sistema
nervioso central y periférico (Guo y col 2003), disrupción
endocrina y mayor incidencia de diabetes (Longnecker y
Michalek 2000, Sweeney y Mocarelli 2000), trastornos a
la tiroides, alteraciones broncopulmonares (Nakanishi y
col 1985) y otros.
Los seres humanos están expuestos a las dioxinas prin-
cipalmente a través de la dieta: carne, productos lácteos,
huevos y pescado (Spiro y Stigliani 2004, Saegerman y
col 2006). Por tanto, debido a los casos de contaminación
de carnes de aves de corral en Estados Unidos, la “Crisis
de PCB/dioxinas de Bélgica” de 1999 (Hayward y col
1999, Covaci y col 2008), el hallazgo de dioxinas en
carne de cerdo de Chile en 2008 (Valdovinos 2009) y el
caso reciente en Alemania en 2010, que afectó a granjas
avícolas y porcinas (PoultryMed),1 es necesario contar
con una metodología de cribado (Unión Europea 2006)

Aceptado: 12.05.2011. 1 http://www.poultrymed.com/Poultry/Templates/showpage.asp?D

# Proyecto FONDEF D03I1035. BID=1&LNGID=1&TMID=178&FID=871&PID=0&IID=11684.

* Casilla 235 correo 34, Santiago, Chile; carlos.valdovinos@umayor.cl Fecha de consulta: 07 de enero de 2011.

259
JT SchoffeR y col
para la detección rápida y de bajo costo, previo al análisis
químico confirmatorio.
Una manera efectiva de detección es a través de los
efectos toxicológicos de estos contaminantes, que ocurren
mediante el receptor de hidrocarburos aromáticos (AhR),
factor de transcripción nuclear activado por unión de
ligandos y que media la toxicidad del TCDD. El AhR en
ausencia del ligando es citosólico, pero es transportado
al núcleo cuando se activa con un ligando exógeno. La
activación de AhR produce una serie de cambios bioquí-
micos en la célula, incluyendo la inducción del citocromo
P4501A (CYP1A), utilizado para medir la actividad de
la 7-etoxyresorufina-O-deetilasa (EROD) como biomar-
cador de exposición a dioxinas y compuestos similares a
dioxinas (Richter y col 2001, Okey y col 2005), a través
del bioensayo in vitro con la línea celular H4IIE. Por
tanto, el objetivo del presente estudio es determinar la
ecuación de equivalencia para los resultados en carnes
de pollo, entre el bioensayo EROD-H4IIE en pg TCDD-
EQ2/g de tejido muestreado contra los resultados de la
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas de alta resolución (HRGC/HRMS) en pg WHO-
TEQ/g de grasa, considerando a este último como método
de referencia, mediante la determinación de un modelo
de regresión, que permita estimar el valor esperado de
contaminación por dioxinas que se obtendría a través de
HRGC/HRMS si sólo se cuenta con los resultados del
bioensayo EROD-H4IIE.
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestras
Para el presente estudio se utilizaron 41 muestras
compuestas de trutros de pollo obtenidas en la planta
faenadora de 4 planteles de Chile, codificados como P1,
P2, P3 y P4, durante el beneficio de animales (38 y 43
días de edad) entre los años 2004 y 2007. Cada muestra
compuesta se obtuvo en duplicado, a partir de muestras
elementales constituidas por los trutros sin cuero y sin
hueso de 10 animales del mismo origen. Las muestras
fueron trituradas en la planta faenadora con una moledora
industrial (BESTE® TK-12), obteniéndose 2 muestras de
250 g para el bioensayo EROD-H4IIE y 2 muestras de 250
g para el análisis HRGC/HRMS (muestra y contramues-
tra). Éstas fueron depositadas en bandejas de aluminio
(previamente tratadas con acetona técnica al 99,5%) y
selladas, siendo congeladas a –70 °C en el laboratorio a
la espera de su análisis.
2
En este documento se utilizará TCDD-EQs para denominar los
tóxicos equivalentes (TEQs) derivados del bioensayo EROD-H4IIE.
260
Extracción y purificación para aplicación
del bioensayo celular H4IIE
De acuerdo al método descrito por Nicks y Tillitt
(2003), se pesaron 20 g de muestra de carne de ave,
adicionando una cantidad 3 veces superior al peso de la
muestra (60 g) de sulfato de sodio (Na2SO4) para el secado
de líquidos existentes en la matriz. Posteriormente, se
procedió a homogeneizar la muestra seca en una licuadora
(Osterizer® 4172). El proceso de extracción de la grasa
se realizó en un Soxhlet automático (VELP® Scientifica
SER 148) durante 2 horas y 30 minutos, con una mezcla
de diclorometano-hexano 1:1. La determinación del con-
tenido lipídico del extracto se efectuó mediante cálculos
gravimétricos a partir de la diferencia de peso de 1 mL del
extracto, antes y después de ser sometido a calor para la
evaporación de solventes y agua. El proceso de limpieza
del extracto se realizó con el paso de la muestra a través
de dos columnas de vidrio; la primera rellena con Na2SO4,
silicato de potasio (KS), sílica 60:40 (sílica gel Grade 62,
60-200 mesh, 150 Å; SIGMA-ALDRICH® mezclada con
H2SO4) y sílica 70:30 (sílica gel Davisil® Grade 635,
60-100 mesh, 60 Å; SIGMA-ALDRICH® mezclada
con H2SO4) con diclorometano. La segunda columna de
limpieza contenía Na2SO4, sílica gel 60 (sílica gel Grade
60, 70-230 mesh, 0.063-0.200 mm; Merck®), KS y sílica
60:40 con una mezcla de diclorometano: hexano/3:97.
La muestra obtenida fue reducida mediante el uso de
rotaevaporador (Heidolph® Laborota 4000) alcanzando
un volumen de 1 mL aproximadamente. Este volumen de
muestra fue sometido al proceso de cambio de solvente,
a través del uso de nitrógeno gaseoso, obteniéndose un
extracto final de 150 µL disuelto en isooctano. La totalidad
de los solventes utilizados fue grado HPLC.
Bioensayo celular EROD-H4IIE
Se aplicó el bioensayo EROD-H4IIE para la detec-
ción de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs, según el protocolo
descrito por Tillitt y col (1991) y modificado por Nicks y
Tillitt (2003). Se utilizó la línea celular de hepatoma de
Rattus norvegicus, importada de la American Type Culture
Collection (ATCC®, código CRL-1548™). La línea celular
fue cultivada en un medio D-MEM, enriquecido con un
15% de SFB, mantenida bajo condiciones estándares (37°C,
5% CO2) y se le permitió crecer de 4 a 5 días. Las células
fueron sembradas en placas de microtítulo de 96 pocillos
de fondo plano, Nunc®, en un volumen de 300 µL/pocillo
con una densidad de 1,2 x 104 células/pocillo. Después de
24 horas de crecimiento, se procedió a dosificar el estándar
de TCDD en 7 diluciones seriadas en razón 1:2 (50 pg/
pocillo a 0,069 pg/pocillo) en cuadruplicado. Dicho estándar
fue usado para generar una curva de dosis respuesta con
la cual todas las muestras fueron relacionadas.
Los extractos de las muestras se dosificaron con 7
diluciones en razón 1:3, en cuadruplicado. Junto con

dichas muestras también se dosificaron, de igual manera,
un control positivo (PC) correspondiente a tejido de
Cyprinus carpio Linnaeus y un control negativo o matriz
blanco (MB) correspondiente al Lepomis macrochirus
Rafinesque, materiales de referencia del Columbia
Environmental Research Center de Missouri, Estados
Unidos. Además de estos controles se utilizó un blanco
de procedimiento (PB) correspondiente a una solución
de diclorometano-hexano 1:1 (grado HPLC). Luego de
la dosificación se dejó a las células bajo condiciones
estándares por 72 horas para su posterior lectura. Para
ello el medio fue removido a través de un lavador de
placas (Thermo® Weelwash 4 Mk 2), que utiliza agua
ultrapura, dejando aproximadamente 60 µL de medio/
pocillo. Terminado el lavado se incubó la placa por 5
minutos, para generar citólisis osmótica, dando como
resultado la exposición del CYP1A1. Pasado el tiempo se
retiró la placa de la incubadora y se le agregaron 20 µL de
buffer a 37 °C con 80 µL de dicumarol. Posteriormente,
se adicionaron 20 µL de 5 µM de etoxiresorufina y 20 µL
de 5 µM de NADPH. Finalmente, se colocaron las placas
en un lector de fluorescencia (BioTek® FLx800™), que
realiza lecturas por 20 minutos con un filtro de excitación
530 nm y con un filtro de emisión de 580 nm para la
lectura de la actividad EROD. Para la determinación de
la proteína celular se realizó una lectura de 1 minuto con
un filtro de excitación de 400 nm y un filtro de emisión
de 460 nm. Este método permite evaluar la actividad
EROD y la proteína en el mismo pocillo (Kennedy y
Jones 1994). En la etapa final del ensayo se utilizaron
curvas de dosis respuestas para determinar la potencia
relativa del extracto (RPFs), comparando los valores de
las pendientes de los extractos de las muestras con los
valores de la pendiente del estándar de TCDD para ob-
tener los equivalentes tóxicos (TCDD-EQs) expresados
en pg/g de muestra (Mason y col 1985, Tillitt y col 1993,
Whyte y col 2004).
Cromatografía de gases de alta resolución
acoplada a espectrometría de masas de alta
resolución
El análisis HRGC/HRMS fue realizado en el Research
and Productivity Council de New Brunswick, Canadá. Para
esto se utilizaron los métodos: US EPA Method 1613B,
“Tetra-through Octa-Chlorinated Dioxins and Furans
by Isotope Dilution HRGC/HRMS” y US EPA Method
8290A, “Polychlorinated Dibenzodioxins (PCDDs) and
Polychlorinated Dibenzofurans (PCDFs) by High-Resolution
Gas Chromatography/High-Resolution Mass Spectrometry
(HRGC/HRMS)”, cada uno con modificaciones leves
(procedimientos estándares de RPC DX08 y DX09).
Se enriqueció la muestra (20 a 60 g) con una solución
que contenía cantidades especificadas de cada uno de
los 15 estándares internos de PCDD/PCDFs marcados
isotópicamente (Wellington Laboratories Inc., Guelph,
dioxina, bioensayo H4IIE, HRGC/HRMS, EROD
Ontario, Canadá). Posteriormente, se realizó la extracción
mediante Soxhlet por 16 h con diclorometano/hexano
1:1 (grado GC); luego se concentró en rotaevaporador
(BÜCHI® RE 121 o Yamato® RE47). El contenido de
grasa se determinó por análisis gravimétrico; el extracto
se disolvió en hexano (grado GC). Luego se realizó una
digestión usando sílica 70:30 (sílica gel 60, 100-200 par-
ticle size; Caledon® mezclada con H2SO4). El extracto se
cromatografió en una columna de sílica ácida/básica/con
nitrato de plata (AgNO3) y en una segunda columna de
sílica con carbón activado. Cuando existió interferencia
con éteres difenílicos clorados, se cromatografió en una
tercera columna de alúmina básica. El extracto final se
enriqueció con una solución que contenía cantidades es-
pecificadas de dos estándares de recuperación de PCDD
marcados isotópicamente (Wellington Laboratories Inc.,
Guelph, Ontario, Canadá). Se obtuvo un volumen final
de 20 µL. El análisis HRGC/HRMS fue realizado con
un cromatógrafo de gases Hewlett Packard® HP 5890
serie II, acoplado con espectrómetro de masas de alta
resolución VG Autospec®, resolución >10.000, con
monitoreo de iones específicos multigrupo; volumen
de inyección 1 µL; columna de cromatografía de gases
Rtx-Dioxin2 60 m x 0,25 mm x 0,25 µm (Restek). La
cuantificación fue realizada usando estándares internos
y los resultados fueron corregidos por recuperaciones de
estándares internos.
Análisis estadístico
Se utilizaron los programas estadísticos Minitab®
versión 15.0 para Windows (Minitab Inc, State College,
PA, USA), S-Plus® versión 6.4 para Windows (TIBCO
software Inc, Somerville, MA, USA) y SigmaPlot® versión
11.0 para Windows (Systat Software Inc, San Jose, CA,
USA). Una vez obtenidos los resultados expresados en pg
WHO-TEQ/g de grasa para HRGC/HRMS y pg TCDD-
EQs/g de tejido para EROD-H4IIE, fueron representados en
un gráfico de dispersión (figura 1). Se propuso un modelo
para explicar la relación entre los resultados del bioensayo
EROD-H4IIE y del análisis cromatográfico. Para su ajuste
se aplicó el modelo: Yi = β0+ β1xi + β2xi2 + ··· + βpxip  + 
εi, donde, Yi son los valores obtenidos de HRGC/HRMS,
xi los obtenidos por EROD-H4IIE, βi los coeficientes del
modelo de regresión y εi corresponde al error aleatorio.
RESULTADOS
En el cuadro 1 se observa que el plantel 4 (P4) tiene un
promedio de los resultados obtenidos por HRGC/HRMS
mayor al resto, con una desviación estándar (DE) elevada,
coherente con lo obtenido en el bioensayo EROD-H4IIE.
Se realizó un Anova entre planteles, cuyo resultado nos
indica que existen diferencias entre planteles y los intervalos
de confianza simultáneos de Tukey al 95% muestran que
esta diferencia está dada por P4.
261
 JT SchoffeR y col

Cuadro 1. Resultados promedio obtenidos por el bioensayo retirado del modelo. El resultado de análisis de varianza
EROD-H4IIE y por HRGC/HRMS. de M2 muestra que la prueba F de Fisher es significativa
Average results obtained by the EROD-H4IIE bioassay (P < 0,0001). Para este modelo el coeficiente de determi-
and by HRGC/HRMS.
nación ajustado (R2-ajustado) es de 0,879. Al analizar los
resultados de las estimaciones para los parámetros M2,
HRGC/HRMS H4IIE
(WHO-TEQ/g de (pg TCDD-EQ/g de bajo la dócima de t de Student, muestra que el coeficiente
grasa) tejido) asociado a EROD-H4IIE no es significativo (P > 0,95) en
el modelo, por lo cual fue retirado. Es importante destacar
Plantel Promedio DE Promedio DE n
que bajo la misma dócima t de Student, el coeficiente de
P1 0,58 0,17 0,64 0,81 6 intercepto como el coeficiente asociado a EROD-H4IIE
P2 0,57 0,21 1,39 1,34 13 al cuadrado, son significativos (P < 0,001) para el modelo
P3 0,40 0,19 0,75 0,73 15 propuesto. Como consecuencia de lo anterior se propu-
P4 2,61 1,99 4,67 3,67 7 sieron 2 nuevos modelos: modelo 3 (M3): Yi = β1xi + εi
y modelo 4 (M4): Yi = β0 + β2xi2 + εi. Del análisis de
M3 se puede observar que para la prueba F de Fisher se
6 obtuvo un valor F significativo (P < 0,0001), con un R2
Resultados HRGC/HRMS pg/g de grasa de TEQs

de 0,849. Bajo la prueba t de Student para la nulidad del

5 coeficiente, se puede destacar que éste es significativo
en M3 (P < 0,0001). Se realizó el mismo análisis para el
4
modelo 4 obteniendo los mismos resultados tanto para
3 el análisis de varianza como para la estimación de los
parámetros, con un R2 de 0,885.
2 Con el objetivo de seleccionar el mejor modelo que
permitiera realizar una equivalencia entre ambas técni-
1 cas, se consideraron los siguientes criterios: Criterio de
Información de Akaike (AIC) (Akaike 1973, Anderson y
0
col 1994) y el Criterio de Información Bayesiano (BIC)
(Posada y Rosero 2007). Del análisis precedente se con-
0 2 4 6 8 10 12
cluyó que el modelo más adecuado es M4. De esta forma
Resultados EROD-H4IIE ñg/g de tejido de TCDD-EQs
el modelo estimado es:
Figura 1. Gráfico de dispersión de resultados EROD-H4IIE
expresado en pg/g de tejido de TCDD-EQs contra el resultado HRGC/HRMS = 0,481 + 0,051[EROD-H4IIE]2
de HRGC/HRMS expresado en pg/g de grasa de TEQs, para 41
muestras de trutro de pollo. Se observa una buena correlación El gráfico de ajuste de M4 (figura  2) muestra las
(r = 0,878), sin embargo, en la mayoría de los datos existe una estimaciones de los niveles determinados por HRGC/
sobrestimación de los resultados obtenidos por bioensayo EROD- HRMS contra EROD-H4IIE y el límite superior para la
H4IIE por sobre los obtenidos por HRGC/HRMS. estimación a un 95% y 99% de confianza, en carne de
Scatter plot for EROD-H4IIE results expressed in pg/g pollo, donde se puede determinar que, si se obtiene un
tissue of TCDD-EQs vs HRGC/HRMS the results expressed in pg/g fat
of TEQs, for 41 sample of broiler chicken drumstick. The data reveal
valor en EROD-H4IIE de 2,2 pgTCDD-EQ/g de tejido
a good correlation (r = 0.878), however, in most of the data there is an se estima que corresponderá a 0,73 pg WHO-TEQ/g de
overestimation of the results obtained by EROD-H4IIE bioassay above grasa en HRGC/HRMS. Además, para el mismo valor de
the ones obtained by HRGC/HRMS. EROD-H4IIE con un 99% de confianza, se obtendrá una
estimación como límite superior que equivaldrá a 0,83 pg
WHO-TEQ/g de grasa en HRGC/HRMS.

Análisis de modelos Análisis de sensibilidad

Se consideraron 2 modelos bajo el principio de par-
simonia: modelo 1 (M1): Yi = β0 + β1xi + εi y modelo
2 (M2): Yi = β0 + β1xi + β2xi2 + εi. Los resultados del
análisis de varianza de M1, muestran que bajo la prueba
F de Fisher el modelo es significativo (P < 0,0001), con
un coeficiente de determinación (R2) de 0,770. Bajo la
prueba t de Student para la significancia de los coefi-
cientes de M1, se obtuvo un valor P no significativo para
el intercepto (P > 0,05), por lo que este coeficiente fue
Se realizó un análisis de sensibilidad para las estimacio-
nes de los coeficientes del modelo de regresión estimado,
tanto para el intercepto (β0) como para el coeficiente aso-
ciado a EROD-H4IIE al cuadrado (β2). En el histograma de
las estimaciones de β0 (figura 3) se muestra la estabilidad
de este parámetro durante el proceso de análisis. En la
figura se observa que el comportamiento es asintóticamente
normal, compacto, centrado y con un ligero sesgo hacia la
izquierda, pero con una estimación bastante estable para el

262
 dioxina, bioensayo H4IIE, HRGC/HRMS, EROD

Resultados HRGC/HRMS

Resultados HRGC/HRMS pg/g de grasa de TEQs

6
Límite superior 95% confianza
Límite superior 99% confianza
Resultados HRGC/HRMS estimados
5

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Resultados EROD-H4IIE pg/g de tejido de TCDDE-Qs

Figura 2. Gráfico de ajuste de los resultados estimados por M4, donde se muestra la equivalencia de los resultados entre el bioensayo
EROD-H4IIE y HRGC/HRMS y las estimaciones para los límites superiores con 95% y 99% de confianza.
Adjustment plot of the estimates results for M4, were the equivalence of the results between the EROD-H4IIE Bioassay and HRGC/HRMS
and the estimations for the upper limits with 95% and 99% confidence is shown.

30 40

25
30
20
Porcentaje
Porcentaje

15 20

10
10
5

0 0
0,44 0,46 0,48 0,50 0,52 0,049 0,050 0,051 0,052 0,053
Coeficiente β0 Coeficiente β0

Figura 3. Histograma para la distribución de las estimaciones Figura 4. Histograma para la distribución de las estimaciones
del coeficiente β0 en M4, expresadas como porcentaje, donde del coeficiente β2 en M4, expresadas como porcentaje, donde
se puede observar el comportamiento para las estimaciones y se puede observar el comportamiento para las estimaciones y
estabilidad para el modelo y conjunto de datos. estabilidad para el modelo y conjunto de datos.
Histogram for the distribution of the β0 coefficient estimation Histogram for the distribution of the β2 coefficient estimation
in M4, expressed as percentage, where the behavior and stability for the in M4, expressed as percentage, where the behavior and stability for the
model and data set is shown. model and data set is shown.

coeficiente y el conjunto de datos. En el histograma de las DISCUSIÓN

estimaciones asociadas a β2 (figura 4) se puede observar una
distribución asintóticamente normal, mucho más compacta La utilización del bioensayo con línea celular H4IIE
y centrada que para β0 y con valores extremos a ambos ofrece una herramienta útil, alternativa y/o complementaria
lados de la distribución, lo que sugiere una distribución para estimar la presencia de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs
con colas más pesadas (t de Student). en carnes de pollo además de otras matrices. Según Whyte

263
JT SchoffeR y col
y col (2004) entre las ventajas que posee el bioensayo se
encuentran: 1) Utiliza un mecanismo de acción común
para la detección de dioxinas, la presencia de compuestos
inductores del citocromo P4501A1 en el extracto es medida
en conjunto, además el bioensayo puede evaluar estos
compuestos aun en concentraciones menores al límite de
detección del análisis químico; 2) al analizar de manera
simultánea los compuestos inductores del citocromo
P4501A1, el bioensayo integra interacciones entre los
diferentes congéneres presentes en el extracto; 3) el bio-
ensayo es más económico que la HRGC/HRMS (10-25%).
Como ejemplo de uso del bioensayo, el US Geological
Survey (USGS) ha ejecutado el programa Biomonitoring
of Environmental Status and Trends (BEST) en las cuencas
del río Yukon, Columbia, Río Grande y Mississippi, con
el fin de detectar contaminantes orgánicos persistentes
(COPs) y disruptores endocrinos. Dicho programa se
ha llevado a cabo en parte a través de la aplicación del
Bioensayo EROD-H4IIE en peces (USGS 2002, USGS
2004a, USGS 2004b, USGS 2004c). Este programa de-
muestra que es factible utilizar dicho bioensayo a gran
escala, con óptimos resultados y ha permitido identificar
las áreas contaminadas de las cuencas, así como aquellas
con problemas emergentes, permitiendo además evaluar
el éxito de las actividades de remediación (USGS 2004c).
Las ventajas del bioensayo han permitido que sea utilizado
para evaluar la potencia de los extractos que contienen
hidrocarburos halogenados planares (PHH), provenientes
de 22 especies de peces, 14 especies de aves y 4 especies
de mamíferos (Whyte y col 2004).
En el presente trabajo se puede observar que los resul-
tados promedio obtenidos por el bioensayo EROD-H4IIE
(cuadro 1) tienden a ser mayores a los de HRGC/HRMS,
comportamiento similar al obtenido por Till y col (1997)
en un estudio efectuado en cenizas. Esta diferencia entre
ambas técnicas se puede deber a que en el bioensayo los
hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) y compo-
nentes no identificados posean actividad similar a dioxinas
(Chaloupka y col 1993) y a la presencia de DL-PCBs, los
cuales no fueron analizados mediante HRGC/HRMS.
Respecto a esto último, el aporte a la toxicidad final o a
su valor de equivalente tóxicos (TEQs) en el extracto es
muy reducido, considerando sus bajos valores de factores
de equivalencia tóxica (TEFs) (van den Berg y col 1998).
A pesar de que existen otros bioensayos muy eficientes
como DR CALUX®, XDS CALUX® o DR-EcoScreen®
(Behnisch y col 2002, Hoogenboom 2002, Denison y col
2004, Anezaki y col 2009), para los dos primeros se necesita
adquirir la licencia a un costo oneroso, la cual debe renovarse
anualmente, adquirir los equipos, capacitación y un pago
por número de muestras analizadas a las empresas que co-
mercializan dichos bioensayos (BioDetectionSystems)3. El
bioensayo con células DR-EcoScreen® fue desarrollado por
3 http://wwww.biodetectionsystems.com/. Fecha de consulta: 07 de
abril de 2010
264
el Instituto de Salud Pública de Hokkaido, Japón (Kojima
y col 2010) y tampoco es de libre disposición. En cambio,
el bioensayo EROD-H4IIE no requiere del pago de una
licencia comercial, por tanto, es una alternativa adecuada
para realizar estudios de biomonitoreos a gran escala.
Con respecto al modelo de equivalencia, éste se ajusta a
la tendencia del gráfico de dispersión de la figura 1. Además
éste tiene un nivel inicial de 0,481 (cuando el resultado
de H4IIE es cero), es decir, considera un nivel basal de
concentración de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs. Para los
valores de las estimaciones asociadas a β2 el efecto sobre
los resultados es de un 5,1%. En general, es un modelo
significativo para todos sus parámetros y coeficientes y
que bajo los criterios de selección es el más adecuado
entre los otros modelos propuestos.
Al comparar el presente estudio con el realizado por Wan
y col (2004) se puede observar que en ambos estudios hay
un modelo de equivalencia propuesto para EROD-H4IIE
contra HRGC/HRMS, que para el caso de Wan y col es un
modelo lineal. Además ambos modelos proponen un nivel
basal de concentración de dioxinas, furanos y DL-PCBs. En
el modelo propuesto por Wan y col el nivel basal es menor
que en el presente estudio y R2 es mayor. Esta diferencia
podría estar dada por el pequeño tamaño de muestra (6
muestras) señalado en dicho trabajo y también por el tipo
de matriz analizada (sedimentos, colina clorada, desper-
dicio electrolítico, benceno quinona tetraclorada, cenizas
y suelo). Este tamaño de muestra también podría explicar
la diferencia en el tipo de modelo, que para Wan y col es
lineal y el del presente estudio es cuadrático.
Till y col (1997) encontraron en extractos de cenizas
de incineradores de basura, madera, crematorios y de
reciclado de metales, valores de correlación semejantes al
presente estudio. La correlación en cenizas fue de 0,750 y
0,900 dependiendo del origen de la matriz, mientras que
en el actual estudio para los extractos de las muestras de
pollos broiler fue de 0,878 (figura 1).
El bioensayo con línea celular H4IIE entrega estima-
ciones razonables y confirma que la inducción de CYP1A
está dada principalmente por PCDD/Fs y, por tanto, es una
técnica útil para el biomonitoreo de estos contaminantes y
puede ser aplicado como método de cribado en sistemas
de producción animal y específicamente en producción
de pollos broiler, aunque todo resultado positivo debe ser
analizado mediante HRGC/HRMS como método confir-
matorio de identidad.
RESUMEN
En el presente estudio se aplicó el bioensayo EROD con línea celular
H4IIE para determinar la equivalencia de resultados para carnes de
pollo, entre el bioensayo EROD-H4IIE en pg TCDD-EQ/g de tejido y
los resultados de la cromatografía de gases de alta resolución acoplada
a espectrometría de alta resolución (HRGC/HRMS) en pg WHO-TEQ/g
de grasa. Para lo anterior se utilizaron 41 muestras compuestas de trutros
de pollo. Éstas fueron obtenidas en la planta faenadora de 4 planteles
diferentes de Chile, durante el beneficio de animales (38 y 43 días de

edad) entre los años 2004 y 2007. Cada muestra fue analizada mediante
ambas técnicas analíticas. Con los resultados se determinó un modelo
de regresión para la equivalencia de ambas técnicas. De esta forma el
modelo obtenido fue: HRGC/HRMS = 0,481 + 0,051[EROD-H4IIE]2,
R2 = 0,885, en que para un valor en EROD-H4IIE de 2,2 pg TCDD-EQ/g
de tejido se estima que corresponderá a 0,73 pg WHO-TEQ/g de grasa
en HRGC/HRMS. Además, para el mismo valor de EROD-H4IIE con
un 95% de confianza, se obtendrá una estimación como límite superior
que equivaldrá a 0,83 pg WHO-TEQ/g de grasa en HRGC/HRMS. Al
tomar el mismo valor de EROD-H4IIE con un 99% de confianza, se
estima un límite superior que equivaldrá a 0,88 pg WHO-TEQ/g de
grasa en HRGC/HRMS. De esta manera se concluye que el bioensayo
EROD-H4IIE puede ser aplicado como método de cribado en sistemas
de producción animal y específicamente en producción de pollos broiler.
AGRADECIMIENTOS
A Columbia Enviromental Research Center (CERC) del US Geological
Survey, en especial al Dr. Donald Tillitt, a Diane Nicks y Mike Tanner,
a la Asociación de Productores Avícolas de Chile A.G, a la Comisión
Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) y a
Hugo Schöffer.
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ARTÍCULO ORIGINAL

Adecuación y análisis de sensibilidad de un modelo para la estimación

de la capacidad de carga del hábitat de venado cola blanca

Fitness and sensitivity analysis of a model to estimate carrying capacity

in the habitat from white-tailed deer

FX Plataa, GD Mendozaa, JA Viccona, R Bárcenab, FC Sánchezc, OA Villarreald*

aUniversidad Autónoma Metropolitana, Xochimilco, México.
bColegio
de Postgraduados, Montecillo, México.
cColegio de Postgraduados, San Luis Potosí, México.

dBenemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México.

SUMMARY

The aim of this study was to fit a model to estimate the carrying capacity (K) for white-tailed deer and to perform a sensitivity analysis using
data of a hunting ranch located in the semi-arid region of Aguascalientes, Mexico. The model had two main components, the first one calculates the
metabolizable energy available in a given area from the accessibility of vegetal matter by strata (forbs, grasses, shrubs, trees and the total biomass), and
the second component considered the energetic cost of the deer based on its physiological state, sex, approximated live weight and time of the year.
The sensitivity analysis revealed that the variables with a higher impact on the value of change of K (> 5%) are the digestibility of the food, the total
available biomass and the live weight of the animal. The lower impact on K (< 5%) is caused by the type of plant, their proportion in the site and the
sex or the physiological state of the animal. It was possible to observe that the increase in the plant variables improves the carrying capacity whereas
the increase in the animal energy requirements reduces it.

Palabras clave: capacidad de carga, modelos matemáticos, venado cola blanca, requerimientos energéticos.
Key words: carrying capacity, mathematical models, white-tailed deer, habitat, energetic requirements.

INTRODUCCIÓN y col 1976, Mautz 1978, McLeod 1997, Bork y Werner

En México la cacería de venado cola blanca se practica
legalmente en unidades de manejo para la conservación de
la vida silvestre, las cuales son reguladas por la Secretaría
del Medio Ambiente y Recursos Naturales1; dicha ley es-
tablece que, para el otorgamiento de los permisos de caza,
se requiere un plan de manejo que incluye la estimación
de la capacidad de carga (K) y de la densidad poblacional
de la especie silvestre que se va a aprovechar en la unidad.
Existen diversos métodos para determinar K del hábi-
tat del venado cola blanca en vida libre, pero uno de los
más reportados en la literatura es el del aporte nutricional
(McCall y col 1997), donde se relacionan los compo-
nentes nutricionales requeridos por el animal (materia
seca, energía digestible, energía metabolizable y proteína
cruda) con los kg de materia vegetal y/o los componentes
nutricionales disponibles para el consumo animal (Mautz
Aceptado: 05.05.2011.
* mazamiztli@yahoo.com.mx
1 Ley General de Vida Silvestre (2007). Nueva Ley publicada en
el Diario Oficial de la Federación el 3 de julio de 2000. Última
reforma publicada DOF 01-02-2007. http://www.diputados.gob.
mx/LeyesBiblio/pdf/146.pdf.
1999) asumiendo que toda la biomasa disponible es con-
sumida por el venado, lo cual no es una suposición válida.
Debido a que el venado cola blanca es un herbívoro con
una alta tasa de fermentación ruminal prefiere alimentos
de rápida fermentación y evita los alimentos altos en fibra
o con una baja tasa de digestión ruminal (Van Soest 1994,
1996), lo que trae como consecuencia que sus hábitos
alimentarios sean los de un ramoneador con una mayor
preferencia hacia las herbáceas y arbustivas (Ramírez
2004). Varios estudios muestran que aun bajo condiciones
de excelente pastizal los venados solo consumen alrededor
de un 8% de gramíneas del total de su dieta (Hansen y col
1977, Stuth y Winward 1977, Bryant y col 1979, Stuth y
Sheffield 2001), por lo que la diversidad y disponibilidad
de plantas útiles para la alimentación del venado en un
área dada es un componente que tendría que considerarse
en la estimación de K.
Por otro lado, la estación del año modifica tanto la
disponibilidad de alimento como la velocidad del viento
y la temperatura ambiental alterando tanto la actividad
física como los requerimientos energéticos del venado
cola blanca (Moen 1976), ocasionando conductas esta-
cionales y cambios en su metabolismo que modifican sus

267
FX Plata y col
requerimientos energéticos (Robbins 1993). Actualmente,
los requerimientos energéticos de los venados están de-
finidos en una forma estática (NRC 2007) a pesar de que
las fluctuaciones en los mismos por efecto de la época
del año, del peso vivo y del estado fisiológico pueden ser
determinados con el modelo de estimación del metabolismo
en vida libre desarrollado por Moen (1978).
Los modelos de estimación de K en función de la dispo-
nibilidad de nutrientes han sido evaluados por McCall y col
(1997) quienes analizaron el aporte de diferentes compuestos
nutricionales para la estimación de K. Posteriormente Plata
y col (2011) evaluaron los modelos más sobresalientes de
dichos autores y los compararon con otros modelos menos
conocidos (presión de pastoreo y metabolismo ecológico).
Estos modelos mostraron un buen acercamiento con la den-
sidad de población; sin embargo, sus resultados muestran
que sobrestiman la K de un sitio.
La utilidad de los modelos matemáticos como herra-
mienta para la toma de decisiones depende del grado de
precisión y exactitud que tienen para predecir un resultado,
por lo que estas variables requieren de una evaluación que
puede ser utilizada como evidencia para su aceptación
(Tedeschi 2006). Una de las estrategias más comunes
para evaluar un modelo es el análisis de sensibilidad, el
cual consiste en determinar la magnitud del cambio en
la respuesta, al cambio de valores en los componentes
Época del año
Disponibilidad
Cambios en
y calidad el consumo
del forraje de alimento y
de peso vivo
Capacidad
de
carga
Figura 1. Modelo para determinar K en venado cola blanca.
Model to determine K in white-tailed deer.
268
del modelo (Vélez-Pareja 2003). El impacto puede ser
negativo, cero o positivo y se expresa como porcentaje
de cambio (Bossel 1994).
Considerando lo anteriormente expuesto, se plantea-
ron dos objetivos en este trabajo: 1) Adecuar el modelo
de metabolismo ecológico para estimar K a partir tanto
de la disponibilidad y las características nutritivas de los
grupos vegetales presentes en una región dada, como
de las preferencias alimenticias y el gasto energético en
diferentes épocas del año estimado a partir del metabo-
lismo en vida libre del venado y 2) Evaluar la relevancia
de la inclusión de dichos factores a través de un análisis
de sensibilidad.
MATERIAL Y MÉTODOS
Organización del modelo
El diagrama del modelo se presenta en la figura 1. Se
reconoce que la época del año modifica tanto la disponi-
bilidad, tipos de forraje (Otto y col 2001), digestibilidad
y energía metabolizable de los mismos (Clemente y col
2005), así como los requerimientos nutritivos del animal
(NRC 2007). Estos factores interactúan para modificar el
consumo voluntario del animal y su velocidad de creci-
miento, todo lo cual impacta sobre K de una región dada.
Metabolismo en vida libre
del animal
 capacidad de carga, modelos matemáticos, venado cola blanca, requerimientos energéticos
Área de estudio
Se utilizó la información del muestreo de vegetación
en un rancho cinegético localizado en el municipio de San
José de Gracia, Aguascalientes, México. En este trabajo
la vegetación se estimó mediante 19 sitios de muestreo
con una extensión de 400 m2 (20 x 20 m) cada uno. La
expresión matemática del modelo de metabolismo eco-
lógico, las características nutricionales de la vegetación,
clima y densidad de población que fueron utilizados para
establecer las modificaciones a las características del
modelo fueron publicados previamente (Clemente y col
2005, Plata y col 2011).
Componentes del modelo modificado
Para estimar la capacidad de carga, en este modelo se
divide la energía metabolizable utilizable a partir de las
arbóreas, arbustivas, herbáceas y gramíneas (considerando
sus restricciones) entre el requerimiento energético de
un animal de un peso y sexo dados durante un periodo j.
Matemáticamente, el modelo completo tiene la si-
guiente expresión:
 EM u + EM g 
K =  (1)
 MEVp 
K = Capacidad de carga (venados/ha)
EMu = Energía metabolizable útil (kcal/kg)
EMg = Energía metabolizable de gramíneas (kcal/kg)
MEVp = Metabolismo en vida libre de un venado durante
el periodo p
Energía metabolizable útil (EMu). Debido a que el con-
sumo máximo de forraje es inversamente proporcional
al tamaño de los animales y a la selectividad que tiene el
venado cola blanca, Stuth y Sheffield (2001) encontraron
que la capacidad máxima de consumo del venado cola
blanca en hábitats dominados por herbáceas es del 30%
y que la variación estimada del uso de este recurso para
en el venado cola blanca es el 5%, lo que sugiere que esta
especie tiene un consumo equivalente al 35% del hábi-
tat, por lo que el modelo debe garantizar que el residuo
de forraje es igual al 65%; considerando lo anterior, la
biomasa se ajusta en función de dicho coeficiente y se le
denomina EM utilizable.
EMu = 0,35 * EMa (2)
Donde:
EMu = Energía metabolizable utilizable
0,35 = Capacidad máxima de consumo (Stuth y Sheffield
2001)
EMa = Energía metabolizable del área
Energía metabolizable del área. La EM que puede estar
contenida en la biomasa vegetal de un área dada (a) depende
de la cantidad de biomasa (B; kg/ha) de cada grupo vegetal
(exceptuando gramíneas) y su EM (kcal/kg), por lo que
la EMa es el resultado de la sumatoria de los productos
de la B de cada estrato vegetal por su respectiva EM por
el área total:
EM a = ∑ Bn ∗ EM n ∗ a (3)
1…n
Donde:
EMa = Energía metabolizable del área
n = Grupo vegetal (arbórea, herbácea, arbustiva)
∑ Bn ∗ EM n ∗ a = Sumatoria del producto de la biomasa
1…n
por la energía metabolizable de cada grupo vegetal por el
área problema (ha)
Energía metabolizable de un grupo vegetal n (EMn). Para
el cálculo de la EM de un grupo vegetal n se consideran
los valores de energía digestible (ED), la cual se estima
con la información de calor de combustión y la digesti-
bilidad in vitro promedio de la materia seca del mismo
(Clemente y col 2005). Debido a que bajo condiciones de
mantenimiento la eficiencia de conversión de la energía
digestible a metabolizable es del 82% (Ullrey 1970), el
valor de ED se multiplica por 0,82. Por lo tanto, la energía
metabolizable de un grupo vegetal n es:
EMn = EBn * DIVMSn * 0,82 (4)
Donde:
EMn = Energía metabolizable del grupo vegetal n
EBn = Calor de combustión del grupo vegetal n
DIVMSn = Digestibilidad in vitro del grupo vegetal n
0,82 = Eficiencia de conversión de ED a EM
Energía metabolizable de gramíneas. Asumiendo que el
consumo de gramíneas es reducido y se encuentra entre
el dos y el ocho por ciento de la dieta total del venado
(Arnold y Drawe 1979, Gallina 1993) la biomasa total de
este grupo se condicionó a la presencia de arbustivas en
la zona, por lo que la energía metabolizable aportada por
las gramíneas en un área dada (EMg) es expresada como:
 Bh * 0, 08 * a * Bg * a 
EMg =   * EBg * DIVMSg * 0, 822
 Bg * a
(5)
Donde:
Bh = Biomasa total de herbáceas por ha
Bg= Biomasa total de gramíneas por ha
a = Área total (ha)
EBg = Energía bruta de las gramíneas
DIVMSg = Digestibilidad in vitro de las gramíneas
0,82 = Eficiencia de conversión de ED a EM.
269
FX Plata y col

Cuadro 1. Ecuaciones para la determinación estacional del metabolismo en vida libre del venado cola blanca.
Equations to predict seasonal changes in metabolism of white-tailed deer in wildlife.

Ecuación de Moen (1978) para hembras con cría

 
2 ⋅ 56894  0.19602(C )  

{  (   )
1.0285 Sin  DJ + 170 .053 0.15488(C ) 0.9863  + .0281  0.19 + 0.05(C )  } 


 + 8.81 − 0.05(C )  
EMV=

{( ){ } }
0.75
⋅70  1.617 + 0.381 ln( EED ) ⋅ Sin ( DJ )(0.9863) + 90  ⋅ 0.1 + 0.90  0.90
 

Ecuación de Moen (1978) para machos

({1.0285Sin (DJ ) ⋅ 0.9863 + 239 + .0281} + 2.67) ⋅ 70 {( ) ⋅ {Sin (DJ )(0.9863) + 90  ⋅ 0.1 + 0.90} 0.90}
0.75
EMV= 1.617 + 0.381 ln( EED )

Ecuación de Moen (1978) modificada por Clemente (1984) para hembras.

{ ( ) } {(
EMV= 2.56894  0.19602(C )  1.0285 Sin  DJ + 170.053 0.15488(C ) ⋅ 0.9863  + 281  0.19 + 0.05(C )  +  0.81 − 0.05(C )  ⋅ 70  0.9928 + ln( PV ) − .0771

      )}
0.75

Ecuación de Moen (1978) modificada por Clemente (1984) para machos

({1.0285 Sin (DJ ) ⋅ 0.9863 + 239 + .0281} + 2.67) ⋅ 70 {( )}

0.75
0.9928 + ln( PV ) − .0771
EMV=

EMV = Es el requerimiento de EM en vida libre del animal (hembras con cría). DJ = Es el día juliano en el cual se estima el gasto energético.
C = Es el número de crías. PV = Es el peso vivo del venado.

Requerimientos energéticos del venado. Para estimar el Análisis de sensibilidad

metabolismo en vida libre de un animal de un sexo y peso
vivo determinado (MEV) se utilizan las ecuaciones mate-
máticas desarrolladas por Moen (1978) y modificadas por
Clemente (1984) cambiando la edad del animal por el peso
vivo como una variable para estimar el peso metabólico
del animal y en consecuencia el gasto de energía para
mantenimiento. Dichas ecuaciones permiten estimar los
cambios en los requerimientos energéticos del animal a
lo largo del año, y modifican dicho gasto en función del
sexo, peso vivo, estado fisiológico del animal (lactancia) y
número de crías. Tanto el modelo original de Moen (1976)
como el modificado por Clemente (1984) se encuentran
en el cuadro 1. El metabolismo en vida libre del venado
(MEVp, kcal/día) se calcula utilizando una hoja de cálculo
del programa Excel de Microsoft Office disponible en la
plataforma de Bioeficencia2, con el cual se estima el re-
querimiento energético diario, por lo que el metabolismo
energético de un periodo (p) a evaluar está dado por:
MEVp = ∑ MEV
(6)
1− i
Donde:
MEV= Metabolismo ecológico del venado (kcal/día)
j es el último día de un periodo dado.
2 Plata PF, GD Mendoza, E Riquelme. 2006. Metabolismo ecológico
del venado cola blanca. En: www.bioeficiencia.avanzavet.com/index.
php?option=com_content&task=view&id=84&Itemid=1, consultado
el 12 de febrero de 2008.
Se realizó un análisis de sensibilidad siguiendo la téc-
nica descrita por Bossel (1994). Dentro de esta técnica, la
variación en los datos se analiza individualmente, mediante
la modificación de un valor a la vez, asumiendo que todos
los demás permanecen sin alteración alguna (Vélez-Pareja,
2003). Para la generación de los parámetros iniciales
en dicho análisis se utilizó información proveniente del
rancho cinegético “El Altrialgo” localizado en el municipio
de San José de Gracia, Aguascalientes, México. Dicha
información fue publicada anteriormente (Plata y col
2011). Sin embargo, en el cuadro 2 se resumen los valores
principales de la biomasa total por cada grupo vegetal así
como los estimados de EMn, EMa y la EMu. También se
presentan los valores de gasto energético por concepto de
metabolismo en vida libre para un venado macho de 60 y
una hembra de 45 kg con una y dos crías. Dicha estimación
se realizó considerando los días julianos 31, 59, 90, 120,
151, 181, 212, 243, 273, 304, 330 y 365 que corresponden
al día último de cada mes respectivamente y periodos de
aproximadamente 30 días.
Utilizando como referencia los datos anteriores se
definió un intervalo de valores normales para las variables
evaluadas y se estimó K. Después, los valores biológicos
de cada variable fueron sustituidos uno a uno, desde el
valor menor al mayor, y se estimó el valor de cambio para
cada incremento de la variable; dicho valor de cambio fue
dividido entre el intervalo de cambio, de tal forma en que
un valor cercano a cero indicó baja sensibilidad del modelo

270
 capacidad de carga, modelos matemáticos, venado cola blanca, requerimientos energéticos

Cuadro 2. Biomasa y compuestos nutricionales disponibles por grupo vegetal y época del año, usados para estimar capacidad de
carga.
Biomass and available nutrients by group of plants and season of the year used to estimate K.

Materia Seca total (MS), kg/ha

Época del año1 Gramíneas Herbáceas Arbóreas Arbustivas Total
Verano 617,89 114,72 137,17 16,86 886,64
Otoño 311,99 114,53 72,94 12,22 511,68
Invierno 162,21 195,31 118,39 20,61 496,52
Materia Seca Disponible, kg/ha
Verano 216,26 40,15 48,01 5,90 310,32
Otoño 109,20 40,09 25,53 4,28 179,09
Invierno 56,77 68,36 41,44 7,21 173,78
Energía Metabolizable de los grupos vegetales (EMn)2, kcal/kg
Verano 904.49 1913.64 1187.57 1385.74
Otoño 942.80 1994.44 1237.88 1443.23
Invierno 963.25 2037.71 1264.57 1476.16
EMg, kcal/kg Energía Metabolizable del área (EMa)3, kcal/kg
Verano 2.905,21 142.023,7
Otoño 3.023,74 117.737,2
Invierno 5.267,84 202.345,0
4
Energía Metabolizable útil (EMu) , kcal/kg
Verano 144.928,93
Otoño 120.760,94
Invierno 207.612,86
Metabolismo en vida libre del venado cola blanca
1 cría 2 crías Machos
Verano 318.058,714 384.294,523 361.771,367
Otoño 267.717,05 251.400,831 231.846,368
Invierno 399.590,394 487.320,536 504.129,479
1 La duración estimada de los periodos de tiempo fue: Verano (91 días), Otoño (61 días) e Invierno (213 días).
2 La DIVMS estuvo alrededor del 23 al 56%, por lo que la EM por kg de MS fue de entre 1000 a 2000 kcal por kg.
3 La sumatoria de la EM aportada por herbáceas, arbóreas y arbustivas.
4 La sumatoria de EM más EM .
a g

a la variable. También se estimó el valor porcentual de
cambio para cada variable.
RESULTADOS
En el cuadro  3 se presentan los resultados del aná-
lisis de sensibilidad del modelo para K y en la figura 2
se observan los cambios estimados en K de acuerdo al
aumento de cada una de las variables contenidas en el
modelo. En contraste con los modelos nutricionales de
estimación de K, se puede observar que, exceptuando las
gramíneas, el modelo es altamente sensible a los cambios
en las características vegetales, las cuales mejoran la K
mientras que el aumento en el requerimiento energético
del animal la reduce.
En la figura 3 se muestran los cambios en el requeri-
miento energético (metabolismo en vida libre) de animales
con un peso determinado (45 y 60 kg) pero considerando
diferentes estados fisiológicos. Se puede observar que
mientras durante el primer tercio del año los requerimientos
energéticos son menores a lo largo del año se incrementa
dicho requerimiento dependiendo del estado fisiológico
del animal y del número de crías.
DISCUSIÓN
En este trabajo, el análisis de sensibilidad reveló que
los cambios en la DIVMS o en la EMgv pueden incrementar
K de un sitio dado hasta en un 28,4%. Dicho aumento es
explicado como una consecuencia directa del aumento en la

271
FX Plata y col

Cuadro 3. Análisis de sensibilidad de los componentes principales del modelo.

Sensibility analysis of the main components of the model.

% Promedio de
Variable Promedio Máximo Mínimo Intervalo Δ K1
cambio
Arbustivas, kg ms/ha 16,41 20,61 12,22 1,398 0,0006 0,67
Gramíneas, kg ms/ha 390,05 617,89 162,21 75,95 0,0000 0,00
Arbóreas, kg ms/ha 105,055 137,17 72,94 10,71 0,0039 5,13
Herbáceas, kg ms/ha 154,65 195,31 114 13,55 0,0053 7,02
MS total kg/ha 661,37 961,37 361,37 100 0,0264 27,67
DIVMS, % 41,55 60,7 22,4 6,38 0,0218 28,48
Número de crías 1 2 0 1 –0,0025 –2,79
Peso vivo machos, kg 45 75 15 10 –0,0243 –11,64
Peso vivo hembras con una cría, kg 45 75 15 10 –0,0202 –11,64
Peso vivo hembras con dos crías, kg 45 75 15 10 –0,0235 –11,64
Día juliano 196 361 31 55 –0,0027 –3,01
Día juliano ajustado* 0,0125 16,03
1  Valor de cambio promedio en K.
* El ajuste se realizó elevando al cuadrado las diferencias de los intervalos y después se sacó la raíz cuadrada del promedio, de tal forma que los valores
de cambio se convirtieron en valores absolutos.

0,01 1.400
Requerimiento energético mensual

0,008 1.200
K animales/ha

0,006 1.000

800
0,004
600
0,002
400
5E-18
0 1 2 3 4 5 6 200
–0,002
0
Intervalo de incremento de la variable
31 59 90 120 151 181 212 243 273 304 330 365

Digestibilidad Herbáceas Día juliano correspondiente al último día del mes

Gramíneas Arbustivas
Hembras con una cría Hembras con dos crías Machos
Densidad vegetal Día juliano
Peso vivo

Figura 2. Efecto del incremento de las diferentes variables
evaluadas mediante el análisis de sensibilidad en la capacidad
de carga para venado cola blanca.
Effect of the increasing value of different variables evaluated
in the sensibility analysis on the carrying capacity for white-tailed deer.
Figura 3. Efecto del peso vivo y el estado fisiológico del animal
en el requerimiento energético del venado cola blanca.
Effect of live weight and physiological stage on the energy
requirement of white-tailed deer.

energía metabolizable del forraje. De acuerdo con Hanley
(1997) la energía bruta de las diversas especies vegetales
varía relativamente poco, por lo que la digestibilidad es
la variable de mayor interés cuando se considera el aporte
energético de un forraje. En las plantas silvestres la digesti-
bilidad es variable, por lo que promover la vegetación con
mayor digestibilidad podría favorecer tanto el crecimiento
corporal como el número de venados.
Fryxell (1991) evaluando un modelo de consumo de
energía digestible para rumiantes silvestres encontró que
el aumento en la energía digestible del forraje permitía
un incremento en el número de animales por hectárea que
se podían mantener, lo cual coincide con el análisis de
sensibilidad de este trabajo. En el trabajo de dicho autor
el aumento era dependiente de la tasa de crecimiento del
forraje y del nivel de consumo de ED del animal. Trabajos
publicados por Bergman y col (2001) muestran que el
consumo voluntario de los búfalos americanos (Bison
bison) en vida libre estuvo asociado en forma positiva a
los cambios en digestibilidad del forraje, de tal forma que
el consumo de energía neta de ganancia se incrementó en
forma lineal conforme aumentó la digestibilidad del forraje.

272
 capacidad de carga, modelos matemáticos, venado cola blanca, requerimientos energéticos
También, el modelo desarrollado por Gordon e Illius (1994)
utilizando diferentes tipos de rumiantes y herbívoros no
rumiantes muestra la misma tendencia.
El análisis de sensibilidad muestra que el aumento en
la biomasa total disponible tuvo un impacto importante
(27,67%) en K; este aumento puede ser explicado por la
interacción entre la disponibilidad de alimento, tasa de
consumo y respuesta funcional de los rumiantes, la cual
ha sido establecida desde hace mucho tiempo (Gross y col
1993). En antílopes africanos, Brashares y Arcese (2002)
encontraron que la abundancia y calidad del forraje eran
determinantes en el grado de dispersión dentro y entre los
grupos de hembras estudiados. Sus resultados muestran
que el coeficiente de correlación entre el tamaño del grupo
y la biomasa era de 0,55 (P < 0,001). Farnsworth e Illius
(1998) definieron un modelo de selección de dieta óptima
para herbívoros mayores, el cual está fundamentado en
la necesidad del animal de buscar y consumir alimento,
lo cual ocurre en momentos separados, de tal forma que
cuando la disponibilidad de forraje se reduce el tiempo
de búsqueda aumenta, dicho comportamiento se explica
en este modelo porque al aumentar la biomasa vegetal
en forma independiente de la DIVMS, K aumenta. Por
el contrario, cuando la biomasa se reduce, los hábitos de
consumo del venado cola blanca cambian junto con una
reducción en la talla corporal de los mismos, lo cual tiene
como finalidad poder mantener su condición reproductiva
(Anouk Simard y col 2008).
El análisis de sensibilidad indicó que los cambios oca-
sionados por el incremento de MS a partir de los diversos
grupos vegetales (a excepción de las gramíneas) fueron
directamente proporcionales a la materia seca disponible
que aportaban para el mantenimiento de los animales, de
tal forma que a mayor aporte de MS mayor incremento
en K. Estos grupos vegetales tenían un impacto de entre
un 5 y 8% sobre K dependiendo de la magnitud del au-
mento de la MS y son menos relevantes que los cambios
en la DIVMS o la biomasa total (figura 2). Sin embargo,
no reflejó cambios de otra magnitud, debido a que la
metodología de dicho análisis no permite la evaluación
de la interacción nutriente y disponibilidad de MS. Así, la
DIVMS se analizó en forma separada de la disponibilidad
de MS. Evidentemente, el impacto de las especies vege-
tales en K está determinado tanto por el incremento de la
biomasa como por el aporte de EMgv que realizan al área
evaluada. Trabajos recientemente publicados (Codron y col
2007) mencionan que el aporte nutricional de las diversas
especies vegetales cambia a lo largo del año dependiendo
de la precipitación, por lo que su digestibilidad cambia
en forma estacional; estos cambios en la digestibilidad
están asociados a cambios en la relación de nitrógeno,
fibra detergente neutro y lignina, por lo que dependiendo
de la magnitud del cambio de estas variables, los valores
nutritivos de las especies se modifican. También los datos
de estos autores muestran que en algunas ocasiones las
gramíneas tienen una mayor digestibilidad que los otros
estratos vegetales, por lo que el aporte energético de los
grupos puede ser similar, lo que ocasiona que su impacto
sobre K sea solo determinado por su incremento en la MS.
El análisis de sensibilidad sugiere que el modelo no
modifica K cuando se modifica la cantidad de gramíneas
(cuadro 3), lo cual es explicado por el reducido aporte de
las mismas al limitar su consumo a la disponibilidad de
herbáceas. El trabajo de Gallina (1993) muestra que el
venado cola blanca prefiere en su dieta hasta un 85% de
arbóreas y arbustivas, mientras que las gramíneas ocuparon
apenas un 2% de la dieta, la cual cambia de componentes
vegetales de acuerdo a la época del año. Stuth y Sheffield
(2001) estimaban que el consumo total de gramíneas para
dicha especie era alrededor del 10% y que el consumo de
herbáceas o arbustivas dependía del predominio de estas
especies en el sitio. Sin embargo, el trabajo de Reyna-
Hurtado y Tanner (2005) muestra que el venado cola
blanca modifica sus preferencias por el hábitat cuando se
presentan alteraciones en el mismo.
En contraste a las variables anteriores, el análisis
de sensibilidad muestra que el peso vivo tuvo un efecto
negativo en K. Se sabe que el requerimiento energético
de los venados se incrementa conforme se incrementa su
peso metabólico (Moen 1978) y aunque dicho incremento
no es lineal se ha demostrado que el aumento de tamaño
implica un mayor gasto de energía total por día (Hanley
1982). El trabajo realizado por Owen-Smith (2008)
muestra que el número de animales en un área dada se
reduce cuando el peso vivo aumenta, lo cual se explica
como un efecto directo que tienen los animales sobre la
fisonomía, composición y funcionamiento de las plantas,
las cuales pueden ser afectadas cuando los animales
consumen diversas estructuras vegetales que garantizan
la supervivencia de la planta (Skarpe y Hester 2008). No
sólo el incremento en el consumo de nutrientes y los daños
a la vegetación explican la reducción de K; debido a que
el mayor consumo reduce las especies preferidas por el
venado, la búsqueda de alimento subsecuente aumenta el
tiempo dedicado a la misma y reduce el tiempo de ingesta
(Hanley 1982). Etzenhouser y col (1998) mencionan que
el venado modifica sus recorridos para encontrar deter-
minado tipo de arbustivas que constituyen la base de su
dieta. También los cambios de peso están relacionados
con el ciclo reproductivo, alcanzando el peso máximo al
inicio del otoño antes de que comience dicha actividad
(Bartness y col 2002).
El día juliano parece tener un efecto reducido sobre K, lo
cual se explica porque la época del año puede incrementar
o disminuir la misma, de tal forma que el promedio de los
cambios de esta variable tienden a cero; sin embargo, cuando
se evalúa el impacto porcentual neto (independiente del
efecto negativo o positivo) K puede ser afectada hasta en un
15% por esta variable. Moen (1978) desarrolló este modelo
partiendo de algunas premisas fundamentales, que incluyen
la existencia de ciclos circadianos que se presentan a lo
largo del año y que determinan la estacionalidad de muchas
273
FX Plata y col
de las conductas de los animales; esos comportamientos
cíclicos han sido reportados en aspectos reproductivos,
aspectos hormonales, aspectos nutricionales y cambios de
peso (Snyder y col 1983, Anderson y col 2003, Baker y col
2004). Los datos muestran que durante la época de invierno
se observa una reducción en el requerimiento energético
del venado; la cual está asociada a una reducción de la tasa
metabólica basal, mientras que en el verano dicho reque-
rimiento aumenta (Moen 1976, Arnold y col 2004). Este
incremento en el requerimiento de energía está asociado
a un mayor consumo de MS por animal por día (Clauss y
col 2003), lo cual reduce K.
El modelo mostró alta sensibilidad a los cambios en las
características de los compuestos nutricionales de las plantas
y a los cambios en la biomasa de las mismas, excluyendo a
las gramíneas, todo lo cual modifica la capacidad de carga.
Además, el modelo mostró una gran influencia al efecto de
los cambios en los requerimientos energéticos del animal
ocasionados por las modificaciones del peso vivo, el género
y el estado fisiológico del animal. El modelo estima una uti-
lización adecuada de gramíneas condicionada a la presencia
de herbáceas y evita la sobres­timación de K ocasionada por
una alta cantidad de MS de este grupo vegetal.
RESUMEN
Se adecuó un modelo para estimar la capacidad de carga (K) de
venados de cola blanca y se realizó un análisis de sensibilidad utilizando
datos de un rancho cinegético localizado en la región semiárida de
Aguascalientes, México. El modelo está compuesto por dos componentes,
el primero estima la energía metabolizable disponible en un área dada
a partir de la disponibilidad de materia vegetal por estratos (gramíneas,
herbáceas, arbustivas, arbóreas y la biomasa total) y el segundo estima el
gasto energético del venado basado en su estado fisiológico, sexo, peso
vivo aproximado y época del año. El análisis de sensibilidad reveló que
las variables con mayor impacto en el valor de cambio de K (> 5) son la
digestibilidad del alimento, la biomasa total disponible y el peso vivo
del animal. El menor impacto sobre K (< 5%) lo tuvieron los tipos de
estratos vegetales, la proporción de los mismos en el sitio y el sexo o el
estado fisiológico del animal. Se pudo observar que el aumento en las
variables vegetales mejora la capacidad de carga del hábitat, mientras que
el aumento en el requerimiento energético del animal reduce la misma.
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275
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ARTÍCULO ORIGINAL

Metabolismo energético en ovejas gestantes esquiladas y no esquiladas sometidas

a dos planos nutricionales. Efecto sobre las reservas energéticas de sus corderos

Energy metabolism in shorn and unshorn pregnant ewes under two different nutritional planes.
Effects on the energetic storage of their lambs

L Cal-Pereyraa, A Benechb, S Da Silvab, A Martína, JR González-Montañac*

a Departamento
de Patología, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
b
Departamento de Fisiología, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
c Departamento de Medicina, Cirugía y Anatomía Veterinaria, Facultad de Veterinaria, Universidad de León, León, España.

Summary

The aim of this work was to evaluate the role of nutrition and shearing during last third of pregnancy, on the energetic metabolism of ewes and the
energetic storage of their lambs at parturition. 38 Corriedale ewes carrying single fetus were randomly divided in two groups at 90 days of pregnancy,
R (n = 12, supplemented with ruminant concentrate) and CN (n = 26, fed on natural pastures). The energetic status of the ewes was evaluated using
glicaemia and seric levels of ß-hidroxybutyrate. When reaching 110 days of gestation, half of the ewes in CN group were shorn (E). Newborn lambs
were blooded to study glicaemia levels at parturition and 24 h afterwards, weighed at birth and after 24, 48 and 72 h, and total weight and energetic value
of their perirenal brown fat was measured. Ewes in groups R and E presented glicaemia levels higher than those in CN in the days before at parturition,
whereas hydroxybutyrate was more elevated in groups CN and E than in group R. The weight of ewe-lambs at birth did not differ between groups,
but by this time glicaemia levels were higher in group R than in CN. Glicaemia was also higher in lambs of both groups R and E by 24 h after birth.
Perirenal brown fat in group E had highter caloric value compared to CN, which suggests a relationship between the energetic status and management
of ewes at parturition and the energetic storage of their lambs at birth.

Palabras clave: nutrición materna, esquileo, cordero, reserva energética.

Key words: maternal nutrition, shearing, lambs, energetic storage.

Introducción pérdida de calor puede ser debida a la evaporación de los

La obtención de un elevado número de corderos desteta-
dos por oveja reproductora constituye el objetivo básico
de la producción ovina. Son varias las razones por las
cuales debe maximizarse este índice, ya que los corderos
producidos serán los futuros reemplazos reproductivos, los
elementos sobre los cuales se ejercerá presión de selec-
ción y el objetivo final en la producción de carne y lana.
En la mayoría de los países donde se produce el ganado
ovino las pérdidas de corderos al destete se sitúan entre
un 15 y un 20% de los corderos nacidos (Dennis 1974,
Corner y col 2005, Dwyer y Morgan 2006). Estas muertes
se producen fundamentalmente durante o de inmediato
después del parto, y principalmente en los primeros tres
días de vida, citándose como principales causas la inanición
y la exposición al frío (Azzarini 1974, Mari 1987).
Inmediatamente después del parto el cordero es sometido
a la acción directa del medio ambiente, y debe poner en
funcionamiento sus mecanismos de termorregulación. La
Aceptado: 04.08.2011.
* jramirogonzalez@unileon.es
líquidos fetales, la lluvia, la temperatura ambiente y a las
corrientes de aire (Faurie y col 2004), siendo los corderos
más livianos los que mayor cantidad de calor pierden, ya
que tienen mayor relación área/peso corporal (Stephenson
y col 2001).
La generación de calor se produce fundamentalmente
por dos vías, una física dependiente de las contracciones
musculares debidas a los escalofríos que son responsables
de aproximadamente el 55% del calor total producido y una
segunda bioquímica, gracias a la combustión de la grasa
parda, que proporciona el restante 45% del calor (Encinias
y col 2004, Clarke y Symonds 1998). Este último proceso
es muy importante en el ganado ovino, ya que al parto el
100% de sus reservas son de grasa parda (Encinias y col
2004). Este tipo de grasa, presente en los grandes mamíferos
y especialmente en las dos últimas semanas de gestación,
se localiza principalmente alrededor de ciertas vísceras
como riñones y corazón (McFarlane 1965, Avram y col
2005). Posee una importante irrigación sanguínea y un alto
valor oxidativo energético (Clarke y col 1997b). Durante
la exposición al frío la irrigación de la grasa parda puede
llegar a quintuplicarse, lo que demuestra la importancia
fundamental de este tejido para la producción de calor en
los corderos (Encinias y col 2004).

277
L Cal-Pereyra y col
La glucosa es un metabolito de enorme importancia
en el metabolismo energético de la futura madre. Es el
principal sustrato energético a nivel cerebral, es además
fundamental para la síntesis de triglicéridos, la contracción
muscular, la síntesis de lactosa en la glándula mamaria y
para el aporte de energía al feto (Pell y Bergman 1983,
Lindsay y Setchell 1976).
El desarrollo y el crecimiento de algunos tejidos fetales,
altamente especializados, es más costoso, en términos de
nutrientes y necesita más alimento por unidad de peso
ganado que en el animal adulto (Gibbons 1996). El re-
querimiento energético para la unidad feto-placenta puede
llegar a representar hasta el 45% de la glucosa materna y el
72% de la oferta de aminoácidos maternos (Bell 1995). El
incremento de los requerimientos al final de la gestación
está causado por el hecho de que cerca del 85% del creci-
miento fetal ocurre durante las últimas seis semanas de la
gestación (Rook 2000, Robinson 1996, Russel 1984). El
aumento de las demandas fetales puede ser de tal magnitud
que Rook (2000) sugiere que en la gestación avanzada los
requerimientos energéticos de las ovejas aumentan sobre
los de mantenimiento hasta un 150% en aquellas ovejas
que gestan un solo feto y hasta un 200% en ovejas con
gestaciones dobles. Por ello existe una estrecha relación
entre el nivel de nutrición de la oveja durante este período
y el peso del cordero al nacimiento (Osgerby y col 2002).
Además el peso corporal de las ovejas al parto ejerce una
influencia crítica sobre el peso de la placenta, el tamaño
de los corderos al nacimiento y la supervivencia postnatal
(Clarke y col 1997c).
El esquileo realizado un mes antes del parto aumenta el
consumo de alimento por las ovejas (Vipond y col 1987).
Según Revell y col (2000) el incremento del peso en los
corderos nacidos de ovejas esquiladas está asociado a un
aumento del ingreso de la glucosa no insulinodependiente
a la unidad fetoplacentaria. Se ha demostrado además
que los corderos nacidos de ovejas esquiladas presentan
mayor tamaño y mayor cantidad de grasa parda, con mayor
actividad termogenética, que aquellos nacidos de ovejas
no esquiladas; registrándose además un incremento en la
irrigación de la grasa parda como consecuencia del estrés
producido por la disminución de la temperatura corporal de
las ovejas (Clarke y col 1997a, Gate y col 1999, Encinias
y col 2004). El estrés por frío, inducido por el esquileo,
parece inhibir la secreción de insulina dando lugar a un
aumento de la glucemia (Symonds y col 1986, Symonds
y col 1988). El incremento de la glucosa circulante es
directamente aprovechado por la glándula mamaria para la
producción de lactosa, lo que incrementa el valor nutricional
del calostro producido y, secundariamente, contribuye a
hacerlo menos viscoso (Banchero y col 2004b, Banchero
y col 2006).
La concentración de cuerpos cetónicos en sangre es
un buen indicador del estado energético de las ovejas en
la gestación y permiten conocer si sus requerimientos
energéticos están siendo satisfechos (Russel 1984, Rhind
278
2004, McMullen y col 2005). Russel y col (1977) estimaron,
en función de los valores del B-Hidroxibutirato (BHOB),
el grado de nutrición de ovinos en condiciones extensi-
vas y establecieron las siguientes categorías: nutrición
normal = BHOB < 0,71 mmol/l, subnutrición modera-
da = BHOB < 1,1 mmol/l y subnutrición severa = BHOB
>1,6 mmol/l. Andrews (1997) propuso una escala similar
para evaluar la condición nutricional de ovejas gestantes:
nutrición normal = BHOB < 0,8 mmol/l, moderada sub-
nutrición = valores de BHOB entre 0,8 y 1,6 mmol/l y
valores de BHOB > 1,6 mmol/l indican severa subnutrición.
En el presente trabajo se pretende evaluar si los cor-
deros nacidos de ovejas que han recibido un suplemento
nutricional en el último tercio de la gestación, o bien de
aquellas que han sido esquiladas en el día 110 de preñez,
poseen mayor peso y mayores reservas energéticas al
nacimiento que los nacidos de ovejas control.
Material y Métodos
Se utilizaron animales alojados en el Campo Experimental
Nº 2 (Libertad) de la Facultad de Veterinaria de la Universidad
de la República, Uruguay, situado en el Departamento de
San José (34° 38'S; 56° 39'W), entre los meses de febrero
y agosto de 2006. El protocolo experimental fue aprobado
por la Comisión Honoraria de Experimentación Animal
(CHEA) de dicha Universidad.
Las temperaturas medias oscilaron en este periodo
entre 25,3° y 5,3 °C, con temperaturas máxima de 32 °C
a mediados de febrero y mínima de 0,5 °C en los primeros
días de agosto. La humedad relativa osciló entre el 50 y
100%, y si bien la mayoría de los días no llovió, en la última
semana de febrero se registraron 125 mm de agua/día.
Diseño experimental
Se sincronizaron los celos de 71 ovejas Corriedale
adultas (4 a 6 años), identificadas por medio de crotales
numerados, mediante esponjas intravaginales que contenían
60 mg de medroxiprogesterona (Sincrovin®, Santa Elena)
durante 12 días. Una vez retiradas las esponjas, las ovejas
fueron cubiertas, mediante monta natural, por dos carneros
de la misma raza con arneses marcadores. El control de
las montas se realizó durante cuatro días, registrándose el
día de la cubrición como día cero (0) de la gestación. A
los 60 días se realizó el diagnóstico de gestación mediante
ultrasonografia (Buckrell 1988), descartándose las ovejas
vacías y aquellas con gestaciones múltiples. Así fueron
seleccionadas 38 ovejas gestando un solo feto.
Posteriormente a la cubrición, todos los animales pasaron
a alimentarse en una pradera con pasto natural compuesta
fundamentalmente por Cynodon dactylon. Cada 100 g
de pasto (MS) proporcionaron 8,72% de proteína bruta y
1,52 Mcal/kg MS de energía metabolizable (Laboratorio
de Nutrición, Facultad de Veterinaria, Universidad de
la República, Uruguay). Esta pradera se reservó para el
 nutrición materna, esquileo, cordero, reserva energética
presente trabajo experimental, de modo que ningún animal
se alimentó en ella hasta el ingreso de nuestras ovejas.
A partir del día 90 las ovejas se dividieron en dos
grupos. Un grupo estuvo compuesto por 12 animales de-
nominado grupo ración (R) que se alimentó en 1/3 de la
pradera y suplementando su alimentación con una ración
balanceada (ración González Lamela para lanares, nº 2,
cuadro 1). Se administraron 4.800 g de concentrado para
todo el grupo, lo que aproximadamente permitió ingerir
unos 400 gramos/día a cada oveja, distribuido en dos
comidas. Otro grupo, denominado grupo campo natural
(CN) (n = 26), se alimentó con los 2/3 restantes de la
pradera y únicamente con pasto.
En el día 110 de gestación se esquiló (esquila preparto)
a la mitad de las ovejas del grupo Campo Natural. Por tanto
la totalidad de las ovejas quedan distribuidas en tres grupos:
grupo ración (R) (n = 12), grupo esquileo (E) (n = 13) y
grupo campo natural (CN) (n = 13), que fue considerado
como grupo control. El aporte de pasto fue similar para
los tres grupos, ya que se trató de la misma pradera (con
idéntica composición botánica) y que fue subdividido en
partes iguales mediante un alambrado eléctrico. La super-
ficie del recinto donde se alojaron entre el día 90 y 140
de la experiencia fue de 8 ha, lo que permitió alimentarse
sin problemas a la totalidad de los animales.
Todos los partos se produjeron entre los días 143 y
153 de gestación, controlándose los mismos durante las
24 horas del día.
Peso vivo de las ovejas
Las ovejas fueron pesadas a las 9:00 horas de la
mañana, mediante una balanza digital para ovinos, con
una sensibilidad de 0,1 kg . Las mediciones se hicieron
a los 90 días de gestación, coincidiendo con el inicio de
la alimentación diferenciada, en el día 110, coincidiendo
con el esquileo y en el día 140 de gestación y en ningún
caso se dejaron a las ovejas en ayunas para hacer el pesaje.
Determinaciones en sangre de las ovejas
Las ovejas se muestrearon a los 90, 110 y 140 días de
gestación. Las muestras de sangre, obtenidas por punción
de la vena yugular, se utilizaron para la determinación
de glucemia y ß-hidroxibutirato (BHOB). Se utilizaron
tubos al vacío y agujas 18G. La glucemia se midió a
partir de sangre recogida en tubos con fluoruro de sodio
y EDTA, antes de 12 horas tras el muestreo, utilizando un
método enzimático colorimétrico (Glucose Liquicolor®,
Human) y efectuando la lectura en un fotocolorímetro
digital (Humalyser Junior) a una λ = 500 nm. El BHOB
se midió, una vez extraído el suero, con el kit comercial
Ranbut® (Randox Laboratories Ltd.) en el fotocolorímetro
anteriormente indicado y a una λ = 330 nm.
Determinaciones en sangre de los corderos
Inmediatamente tras el nacimiento y 24 horas después
se obtuvieron muestras sanguíneas de todos los corderos
mediante punción de la vena yugular. Se utilizaron tubos
al vacío y agujas 21G. Se determinó la glucemia de manera
similar a lo indicado para las ovejas.
Peso vivo de los corderos
Se registraron los pesos vivos de todos los corderos
inmediatamente tras el nacimiento y a las 24, 48 y 72
horas de vida. Se utilizó una balanza mecánica con una
sensibilidad de 0,01 kg.
La ganancia relativa de peso de los corderos fue cal-
culada mediante la siguiente fórmula:
kg peso vivo a las 72 h – kg peso vivo al nacimiento
x 100
kg peso viso a las 72 h
Necropsias de los corderos
Inmediatamente tras el parto cinco corderos de cada
grupo (R, E y CN) fueron sacrificados mediante la apli-
cación intravenosa de una sobredosis de tiopental sódico
(Tiopental sódico®, Laboratorio Cruz del Sur). Durante las
necropsias se disecó totalmente la grasa parda perirrenal,
la cual se pesó y posteriormente se extrajo una muestra
para medir su valor energético expresado en calorías por
gramo de materia seca (cal/g MS). Se mantuvo congelada a
–20 °C hasta su procesamiento en una bomba calorimétrica.
Producción de calostro
Se recogió el calostro de las ovejas a las que se les sa-
crificaron sus corderos dentro de la primera hora postparto
y 24 horas después del parto. Tres minutos después de la
administración i.m. de 10 UI de oxitocina (Hipofamina®,
Dispert.) se consiguió el vaciado completo de la ubre
mediante ordeño manual (O'Doherty y Crosby 1997). El
calostro se midió mediante un matraz aforado.
Valoración del pasto y del concentrado
Se colectaron muestras del pasto y del concentrado
utilizado en la alimentación de los animales. Se evalua-
ron la materia seca (MS), cenizas (Cen), fibra neutro
detergente (FND), fibra ácido detergente (FAD), proteína
bruta (PB) y energía metabolizable por kg de materia seca
(EM/kg MS).
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con el progra-
ma Statistica 6.0 (Stat Soft Inc, 1995). Todos los valores
279
L Cal-Pereyra y col

se presentan como valor medio ± desviación estándar
(χ ± DE). Tras comprobar la distribución normal de los datos
encontrados, las diferencias entre los distintos grupos para
la glucemia de las madres y de los corderos, el BHOB, los
pesos vivos de las madres y de sus corderos, el volumen
de calostro al parto y el producido a las 24 horas y el peso
y la energía de la grasa parda de los corderos se evaluaron
mediante un análisis de varianza (ANOVA), seguido del
test de Tukey. Se consideraron diferencias significativas
cuando α < 0,05.
Resultados
Los resultados del análisis del concentrado, así como
del pasto con los que fueron alimentadas las ovejas durante
la experiencia se muestran en el cuadro 1.
En el día 90 de gestación no hubo diferencias estadís-
ticamente significativas entre el peso vivo de las ovejas de
los tres grupos (R, E y CN). Los valores medios fueron
52,39 ± 5,19 kg, 52,93 ± 4,68 kg y 52,27 ± 4,51 kg para
los grupos R, E y CN, respectivamente. Tampoco se en-
contraron diferencias estadísticamente significativas en el
día del esquileo (día 110 de gestación), siendo los pesos
medios para los grupos R, E y CN de 53,95 ± 5,04 kg,
51,86 ± 4,45 kg y de 50,83 ± 4,02 kg, respectivamente. Sin
embargo, en el día 140 de gestación las ovejas pertenecien-
tes a los grupos R (57,29 ± 4,86 kg) y E (56,01 ± 4,33 kg)
Cuadro 1. Análisis de composición del concentrado usado como
suplemento y del pasto.
Analysis of concentrate and pasture composition.
Componentes Concentrado
Materia Seca (MS) 89,5
Cenizas (Cen) 5,1
Proteína Bruta (PB) 12,5
Fibra Neutro Detergente (FND)
Fibra Acido Detergente (FAD) 10,1
Energía Metabolizable (EM) 2,6
(EM se presenta en Mcal/kg de MS y fue estimada en base al NRC).
alcanzaron un peso significativamente mayor (P < 0,005 y
P < 0,01) que aquellas que se alimentaron exclusivamente
con pasto natural (52,04 ± 4,14 kg). Aunque el peso medio
de las ovejas suplementadas con concentrado fue más
alto que las esquiladas, esta diferencia no mostró carácter
significativo.
Tampoco la glucemia medida en el día 90 de gesta-
ción mostró diferencias estadísticas entre los tres grupos
(cuadro 2). En el día del esquileo la glucemia de las ovejas
del grupo R mostró valores superiores que la de las madres
de los demás grupos, aunque sin significación estadística.
Como puede observarse en el cuadro  2, en el día 140
de preñez la glucemia de los tres grupos disminuyó de
forma considerable, con valores incluso inferiores a los
encontrados en el día 90 de gestación. En este momento
la glucemia del grupo R fue significativamente mayor
(P <0,0001 y P < 0,037) al compararla con la de los
grupos CN y E respectivamente. Asimismo la glucemia
de las madres del grupo E fue significativamente más alto
(P < 0,001) que las del grupo CN (cuadro 2).
Los valores de BHOB sérico medido en el día 90
y en el día 110 de gestación no mostraron diferencias
significativas entre los tres grupos. Los valores de este
cuerpo cetónico en sangre, en el día 140 de gestación,
fueron significativamente más altos (P < 0,005) en las
ovejas alimentadas exclusivamente a campo natural que
en las del grupo R. También en el mismo día las ovejas
del grupo E presentaron valores superiores (P < 0,05)
que las del grupo R, aunque estas diferencias no fueron
significativas (cuadro 2).
Aunque sin carácter significativo, el volumen de
calostro obtenido tras el parto fue mayor en las ovejas
suplementadas con concentrado (R), mientras que el más
Pasto bajo se obtuvo de las madres del grupo CN (cuadro 3). A
las 24 horas del parto el calostro producido se incrementó
42,36 en más del doble en los tres grupos, manteniéndose las
9,35 diferencias de forma similar a lo encontrado en el primer
8,72 registro. Tampoco mostró significación estadística entre
76,22 los grupos (cuadro 3). La producción de calostro presentó,
49,61
tanto en el primero como en el segundo ordeño, una va-
riación muy amplia en los tres grupos. Así para el primer
1,52
ordeño, en los grupos R y E osciló desde 120 a 320 ml,
mientras que en el grupo CN varió desde 50 a 290 ml. A
las 24 horas la variación individual fue de 450 a 600 ml

Cuadro 2. Niveles maternos de glucemia y del β-hidroxibutirato de los diferentes grupos.

Maternal levels of glicaemia and β-hydroxybutyrate.

Grupo Ración (R) Grupo Esquileo (E) Grupo Campo Natural(CN)

Glicemia BOHB Glicemia BOHB Glicemia BOHB
Día 90 de gestación 68,85 ± 12,02 0,36 ± 0,13 68,24 ±13,67 0,36 ± 0,11 69,00 ± 7,47 0,30 ± 0,12
Día 110 de gestación 74,25 ± 10,79 0,34 ± 0,14 70,18 ± 15,45 0,34 ± 0,17 70,49 ± 14,36 0,31 ± 0,11
Día 140 de gestación 56,65 ± 7,12a 0,47 ± 0,21d 49,72 ± 5,58b 0,69 ± 0,25 41,26 ± 6,01c 0,91 ± 0,41e
Medias ± DE. Glucemia (mg/dl), β-hidroxibutirato (β-HOB, mmol/l). Diferencias estadísticas: a-b P < 0,037; a-c P < 0,0001; b-c P < 0,001 y d-e P < 0,005.

280
 nutrición materna, esquileo, cordero, reserva energética

Cuadro 3. Volumen de calostro (mL) de los diferentes grupos.

Colostrum volume (mL) of different groups.

Grupo Ración (R) Grupo Esquileo (E) Grupo Campo Natural (CN)
Parto 222 ± 76,6 200 ± 74,8 146 ± 91,0
24 horas 516 ± 56,8 506 ± 176,3 378 ± 165,1
(Medias ± DE).

Cuadro 4. Peso vivo de los corderos (g) de los diferentes grupos.

Lamb live weight (g) of different groups.

Grupo Ración (R) Grupo Esquileo (E) Grupo Campo Natural (CN)
Parto 4441 ± 421,9 4419 ± 659,7 4326 ± 353,9
24 horas 4794 ± 510,9a 4388 ± 656,2 4116 ± 332,9b
48 horas 4969 ± 554,8c 4606 ± 623,6 4356 ± 375,5d
72 horas 5244 ± 692,0 4906 ± 698,2 4643 ± 465,6
(Medias ± DE. Letras diferentes en la misma línea indican diferencias significativas entre los grupos).

Cuadro 5. Glucemia de los corderos (mg/dl) de los diferentes grupos.

Lamb glicaemia (mg/dl) of different groups.

Grupo Ración (R) Grupo Esquileo (E) Grupo Campo Natural (CN)
Parto 83,0 ± 10,1a 74,34 ± 20,3 60,46 ± 16,8b
24 horas 121,0 ± 8,2 123,83 ± 11,3c 98,93 ± 15,0d
(Medias ± DE. Letras diferentes en la misma línea indican diferencias significativas entre los grupos. Diferencias estadísticas: a-b P < 0,007 y c-d P < 0,001).

Cuadro 6. Peso (g) y energía (cal/g MS) de la grasa parda de los diferentes grupos.
Brown fat weight (g) and energy (cal/g DM) of different groups.

Grupo Ración (R) Grupo Esquileo (E) Grupo Campo Natural (CN)
Peso 28,63 ± 7,59 26,12 ± 2,68 25,39 ± 3,88
Energía 7505,4 ± 627,1 7968,7 ± 347,7 7359,0 ± 462,9
(Medias ± DE. Letras diferentes en la misma línea indican diferencias significativas entre los grupos).

en el grupo R, de 250 a 670 ml para el grupo E y de 150
a 600 ml para las ovejas alimentadas con pasto natural.
La supervivencia de los corderos fue del 100%, ya que
a las 72 horas postparto no había muerto ningún cordero
en ninguno de los grupos experimentales.
Los pesos de los corderos se muestran en el cuadro 4.
En todos los momentos en que se registraron los pesos los
corderos nacidos de las ovejas suplementadas con ración
(R) fueron en promedio los más pesados, mientras que los
nacidos de las ovejas del grupo CN fueron en promedio
los más livianos. Estas diferencias, a las 24 y 48 horas,
tuvieron significación estadística (cuadro 4). Al calcular
la ganancia relativa de peso se observa que los corderos
nacidos del grupo R lograron una ganancia de peso a las
72 horas de vida de un 15,31% con respecto al peso al
nacimiento, mientras que para los nacidos de los grupos E
y CN esta ganancia fue respectivamente de 9,93% y 6,83%.
Los corderos nacidos de los grupos R y E presentaron
valores de glucemia, en el momento del parto, superiores
a los nacidos del grupo CN, esta diferencia tuvo carácter
significativo (P < 0,007) únicamente entre los grupos R y
CN. La misma tendencia fue comprobada en la glucemia
de los corderos medida a las 24 horas de vida. En ese
momento hemos encontrado diferencias significativas
(P < 0,001) entre los grupos E y CN (cuadro 5).
El peso y la energía de la grasa parda perirrenal de los
corderos eutanasiados se muestran en el cuadro  6. Los
corderos nacidos de ovejas esquiladas (E) presentaron
más calorías por gramo de materia seca en las muestras
de grasa que los corderos de los grupos R y CN, sin que
estas diferencias fueran estadísticamente significativas.
Los corderos del grupo R presentaron más energía bruta
en la grasa parda que la de los del grupo CN, pero esta
diferencia tampoco logró tener significación estadística.

281
L Cal-Pereyra y col
Discusión
Según el análisis de la alimentación suministrada a las
ovejas, las madres alimentadas exclusivamente con pradera
natural (CN) fueron las que recibieron menor aporte de
energía y de proteínas durante el último tercio de la gestación.
Es posible que este aporte de nutrientes no lograse cubrir
totalmente los requerimientos energéticos de la fase final
de la preñez, lo que explica los altos valores de BHOB y el
menor peso registrado en el día 140 de gestación. Tanto la
alimentación suministrada a las ovejas del grupo R como
la esquila realizada a las ovejas del grupo E permitieron
un aumento de peso similar al propuesto por Bonino y col
(1987), quienes sugieren que las ovejas al final del perío-
do de gestación deberían aumentar un kilo por semana y
sobre todo evitar perder peso. Resultados similares fueron
reportados por Chandler y col (1985) quienes encontraron
que la media de peso en ovejas gestando un solo feto se
incrementó alrededor de tres kilos durante los últimos 20
días de preñez. Sin embargo, las ovejas del grupo CN no
mostraron aumento del peso corporal durante el último
tercio de la gestación, según Borrelli (2001), debido a que
si la demanda energética es superior a la energía ingerida
la oveja moviliza y consume sus reservas grasas, lo que
conduce a una pérdida de peso.
Como consecuencia del importante crecimiento fetal
en las últimas semanas de gestación la oveja experimenta
un aumento de sus necesidades nutritivas, y especialmente
de energía, lo que obliga a ésta a aumentar el consumo
de nutrientes, a incrementar la eficiencia de utilización de
esos nutrientes por los tejidos e incluso a movilizar, si es
preciso, sus reservas corporales (Gibbons 1996).
En opinión de Russell (1984), las concentraciones de
BHOB son un buen indicador de la nutrición en ovinos
criados en condiciones extensivas. Teniendo en cuenta las
clasificaciones propuestas por Russell y col (1977) y por
Andrews (1997) observamos que las ovejas pertenecientes
al grupo CN (BHOB = 0,91 ± 0,41 mmol/l) presentaron al
parto una condición de subnutrición moderada, en tanto
las ovejas del grupo R (BHOB = 0,47 ± 0,21 mmol/l) y
las del grupo E (BHOB = 0,69 ± 0,25 mmol/l) presentaron
valores de nutrición normal.
La diferencia encontrada en este cuerpo cetónico, en
el momento del parto, entre las ovejas de los grupos R y
E se explica porque en las últimas semanas de gestación
la capacidad física del rumen se ve comprometida como
consecuencia del incremento de tamaño del útero gestante
(Gibbons 1996, Andrews 1997, Rook 2000). Si bien la
esquila preparto y el estrés por frío que es capaz de pro-
vocar elevan el consumo de alimento de estos animales
(Vipond y col 1987) la menor capacidad ruminal disminuye
la capacidad de ingesta, a lo que se suma la mala calidad
del pasto. Esto no sucedió en las ovejas del grupo R, ya
que su alimentación se suplementó con un concentrado
energético. Symonds y col (1986) además concluyen que
las ovejas preñadas esquiladas antes del parto incrementan
282
de forma manifiesta sus requerimientos energéticos, que
satisfacen en gran medida mediante la oxidación de los
depósitos de grasa corporal.
El aumento de las demandas fetales de nutrientes, y
especialmente de glucosa, en las últimas semanas de ges-
tación explicaría la disminución de los valores de glucemia
en las ovejas de los tres grupos en el día 140 de gestación
(Gibbons 1996, Montossi y col 2005). La glucemia fue
más elevada en las ovejas del grupo suplementado con
concentrado (R), mientras que las alimentadas exclusiva-
mente con pasto natural (CN) mostraron la glucemia más
baja, lo que concuerda con los resultados de Symonds y
col (1986) en ovejas con esquila preparto, y con Banchero
y col (2004a) al suplementar la alimentación de las ovejas
al final de la gestación. El aporte extra de suplementos
energéticos provoca un incremento considerable de ácidos
grasos volátiles, principalmente propiónico, que incremen-
ta los niveles de glucosa en sangre vía neoglucogénesis
(Ndi bualonji y Godeau 1993), y especialmente porque
la intensidad de la neoglucogénesis depende en primer
lugar del nivel de alimentación (Baird y col 1983). Las
ovejas esquiladas antes del parto mostraron una tendencia
a aumentar su glucemia, posiblemente debido a que la
exposición al frío inhibe la secreción de insulina, dando
lugar a un aumento de la glucosa en sangre (Symonds y
col 1986, Symonds y col 1988). Además la exposición
continuada al frío produce una disminución de la relación
insulina:glucagón plasmático, lo que estimula la neoglu-
cogénesis hepática (Symonds y col 1988).
Aunque sin mostrar diferencias significativas el volumen
de calostro recogido tanto en el día del parto, como 24 horas
más tarde, fue mayor en las ovejas del grupo suplementado
(R) que en las ovejas que únicamente ingerían pasto. Así,
en todos los grupos, la cantidad de calostro producido 24
horas tras el parto incluso duplica la cantidad recogida
inmediatamente tras el parto. Por tanto, se evidencia una
respuesta positiva, en la producción de calostro, por las
madres a la suplementación y que puede explicarse al
tener en cuenta la glucemia de las ovejas (Pattinson 1991,
Banchero y col 2004a, Banchero 2005 y Banchero y col
2006). En opinión de Banchero y col (2004a) y Banchero
(2005) el volumen de calostro producido se relaciona con
la disponibilidad de glucosa para la síntesis de lactosa, la
cual al ser un azúcar osmóticamente activo incrementa
el paso de líquido hacia la glándula mamaria, y por tanto
produciendo una mayor cantidad y una consistencia mucho
más líquida del calostro, facilitando así al amamantamiento
del cordero.
Existe una relación positiva entre el consumo de ener-
gía y el flujo sanguíneo hacia el hígado, lo que da lugar
a un mayor catabolismo de hormonas antagónicas a la
producción de lactosa, como puede ser la progesterona.
Esta hormona inhibe la síntesis de lactosa y, por ende,
su disminución provoca un mayor volumen de calostro
acumulado (Banchero y col 2004a). La cantidad de calos-
tro obtenido de las ovejas en ambos ordeños mostró una
 nutrición materna, esquileo, cordero, reserva energética
importante variación entre los individuos, e incluso entre
ovejas pertenecientes al mismo grupo. Esta particularidad
también fue observada por O'Doherty y col (1997), por
Chirstley y col 2003 y por Pattinson y Thomas (2004),
quienes lo atribuyeron a diferencias genéticas individuales.
El peso vivo al nacimiento de los corderos de los tres
grupos experimentales se ubicó dentro del considerado
como óptimo por varios autores (Dalton y col 1980, Corner
y col 2005, Montossi y col 2005, Corner y col 2007). El
rango de peso al parto, que teóricamente aumentaría la
supervivencia de los corderos, se situó entre 3,5 y 5,5 kg.
Aquellos corderos nacidos con peso inferior poseerían
menores reservas energéticas para contrarrestar las pérdi-
das de temperatura y menor vigor. Como consecuencia se
incrementaría el tiempo preciso para incorporarse y para
amamantarse (Gibbons 1996). Los corderos que al parto
superaran este peso tenderían a provocar partos distócicos
(Montossi y col 2005).
Las diferencias en el peso al nacimiento de los corderos
de los distintos grupos han sido descritas por varios inves-
tigadores (Cardelino 1974, Chirstley y col 2003, Encinias
y col 2004, Banchero y col 2004a, McMullen y col 2005,
Banchero y col 2006). Sin embargo no existe consenso
sobre el efecto de la suplementación y del esquileo sobre
los corderos. Según Revell y col (2000) la esquila preparto
temprana incrementa significativamente el peso de los
corderos mellizos y no afecta al peso vivo de corderos de
partos simples. Sin embargo también se ha señalado un
incremento significativo del peso vivo al nacimiento en
corderos únicos hijos de madres suplementadas, así como
de aquellas esquiladas antes del parto (Cardelino 1974,
Robinson 1983, Symonds y col 1986, Revell y col 2000,
Osgerby y col 2002, Banchero y col 2004b, Rhind 2004,
Corner y col 2005, Corner y col 2007). Posiblemente el
mayor peso al nacimiento en corderos nacidos de madres
suplementadas se debería a la mayor disponibilidad de
energía y de proteínas, que son destinadas al crecimiento
fetal, si un balance positivo durante las fases finales de
la gestación (Russel 1984, Gibbons 1996, Montossi y
col 2005).
El esquileo puede provocar un mayor ingreso de glucosa
no insulinodependiente a la unidad placentofetal (Revell y
col 2000), a lo que se suma que el estrés por frío inducido
por la esquila inhibe la secreción de insulina, lo que pro-
voca un aumento de la glucemia materna (Symonds y col
1986, Revell y col 2000). Montossi y col (2005) sugieren
que la placenta tiene un papel esencial en el control de
los nutrientes al feto, lo que condiciona el peso al nacer
del cordero y que podría justificar el mayor peso de los
corderos procedentes de ovejas esquiladas. El tamaño
de la placenta y el número y tamaño de los cotiledones
pueden verse afectados por el esquileo preparto y por el
manejo nutricional durante la preñez. Además la placenta
crece a partir del día 30 hasta llegar al desarrollo máximo
aproximadamente en el día 90 de gestación, momento en
el cual su tamaño se estabiliza. Así si la esquila se realiza
entre los días 60 y 90 de la gestación, la respuesta en los
pesos de los corderos al nacimiento será mayor (Montossi
y col 2005). Osgerby y col (2002) proponen que la dis-
minución de la masa placentaria, la concentración de
glucosa amniótica y alantoidea y los niveles maternos de
glucosa plasmática en ovejas subalimentadas en la última
etapa de la gestación pueden comprometer el desarrollo
fetal. De forma similar, el efecto de la subnutrición en
ovejas gestantes sobre el peso de sus corderos al parto
depende de la severidad y de su duración, así como de
la condición corporal de las ovejas en el momento que
comenzó (McMullen y col 2005). La subnutrición tiene
un efecto más marcado sobre el peso vivo de la oveja
que sobre el peso fetal, demostrando la habilidad de la
madre para mantener los aportes nutricionales al feto,
incluso a expensas de sus reservas corporales (Gibbons
1996). La ganancia relativa de peso en las primeras 72
horas de vida de los corderos de los diferentes grupos
puede deberse a las reservas energéticas presentes al
nacimiento, al consumo de esas reservas para soportar
las condiciones medioambientales durante ese período y
al aporte energético del calostro.
Los valores más elevados de glucemia al parto en
los corderos nacidos de las ovejas de los grupos R y E
se relacionan con una mayor concentración de glucosa
sérica disponible, en los últimos días de la gestación, en
las ovejas de estos grupos con respecto a las de ovejas
alimentadas exclusivamente con pasto (CN). La glucosa
sanguínea de los corderos a las 24 horas tras el parto mostró
un comportamiento similar, lo cual puede ser atribuido a
las mayores reservas energéticas de los corderos, y que
se hace más visible en el grupo E. A partir de la segunda
mitad de la gestación el exceso de carbohidratos es acu-
mulado en el hígado y en los músculos de los corderos
en forma de glucógeno, siendo la fuente energética de
utilización inmediata durante las primeras horas de vida
(Gibbons 1996).
El peso de la grasa parda perirrenal de los corderos
no mostró diferencias significativas entre los tres grupos.
Resultados similares fueron obtenidos al comparar los
pesos de la grasa parda perirrenal entre corderos nacidos
de madres esquiladas en el preparto y ovejas sin esquilar
(Clarke y col 1997b) y entre corderos nacidos de madres
suplementadas y sin suplementar (Encinias y col 2004). Sin
embargo, Symonds y Clarke (1998) demostraron que los
corderos nacidos de ovejas livianas tenían menos cantidad
de tejido adiposo pardo que aquellos nacidos de ovejas
pesadas. Estos corderos pudieron adaptar su temperatura
corporal cuando nacían a temperatura ambiente benigna,
pero no lograron adaptarse en ambiente frío, padeciendo
hipotermia. Observamos que los datos obtenidos de la
energía de la grasa parda perirrenal, si bien son tendencias,
son coincidentes con los descritos por Clarke y col (1997b).
Estos investigadores indican que la grasa parda perirrenal
de los corderos nacidos de madres esquiladas mostró una
superior actividad termogénica del tejido adiposo pardo,
283
L Cal-Pereyra y col
además de exhibir una mayor concentración plasmática
de triiodotironina al compararlos con corderos nacidos
de madres no esquiladas. Para ello estimaron la actividad
termogénica de la grasa parda mediante el análisis de
contenido de UCP-1 y de las catecolaminas presentes
(Clarke y col 1997b) mientras que nosotros utilizamos
una bomba calorimétrica.
Los resultados de este trabajo sugieren que tanto la
suplementación energética de las ovejas en el último tercio
de gestación como el esquileo preparto (en el día 110
de preñez) repercuten positivamente en el metabolismo
energético de las ovejas al parto. Los corderos nacidos de
madres suplementadas nacen con mayor peso corporal
y mayor glucemia y los nacidos de madres esquiladas
poseen grasa parda con mayor eficiencia energética. Ambas
situaciones permitirían a los corderos afrontar en mejores
condiciones las posibles adversidades medioambientales
en sus primeras 72 horas de vida.
Resumen
El objetivo fue evaluar los efectos de la alimentación y el esquileo,
durante el último tercio de la gestación, sobre el metabolismo energético de
las ovejas y su repercusión sobre las reservas energéticas de sus corderos.
A los 90 días de gestación 38 ovejas Corriedale adultas, gestando un
solo feto, fueron divididas en dos grupos, R (n = 12, suplementado con
concentrado) y CN (n = 26, alimentado a campo natural), evaluándose
su estado metabólico mediante determinaciones de la glucemia y del
ß-hidroxibutirato. A los 110 días de gestación se esquiló a la mitad
de las ovejas del grupo CN, quedando dividido en dos nuevos grupos
(E, esquiladas, n = 13 y campo natural, CN, n = 13), estudiándose el
efecto de la esquileo sobre los mismos parámetros. En los corderos se
determinó la glucemia (al parto y a las 24 horas), el peso (al parto, a las
24, 48 y 72 horas) y el peso y valor energético de grasa parda perirrenal.
En el día 140 de gestación las ovejas alimentadas con concentrado y las
esquiladas presentaron valores superiores de glucemia que las alimentadas
exclusivamente con pasto natural; los valores de ß-hidroxibutirato sérico
fueron más elevados en las ovejas de pasto natural y las esquiladas
que las suplementadas con concentrado. Al nacimiento el peso de los
corderos no presentó diferencias entre los tres grupos. La glucemia
de los corderos nacidos de ovejas suplementadas con concentrado fue
mayor que los de ovejas de pasto natural, al parto y a las 24 horas y en
las esquiladas mayor en que se alimentaban exclusivamente de pasto a
las 24 horas. Los corderos de las ovejas esquiladas presentaron grasa
parda con mayor valor energético que los provenientes de ovejas que
pastaban exclusivamente hierba, demostrándose así relación entre el
estado energético de las ovejas al parto y las reservas energéticas con
las que nacen sus corderos.
Agradecimientos
Este trabajo fue posible gracias a la colaboración del Dr. Bruno López,
Director del Campo Experimental Nº 2 de la Facultad de Veterinaria y
al personal de dicha institución, especialmente el Sr. Gustavo Cazard.
También deseamos agradecer la colaboración del personal del Laboratorio
de Análisis Clínicos y de Nutrición de la Facultad de Veterinaria. El
valor energético de la grasa parda de los corderos se procesó en una
bomba calorimétrica en el Laboratorio de Nutrición de la Facultad de
Agronomía gracias a la desinteresada colaboración de la Dra. Cristina
Cabrera. Agradecemos asimismo a la Comisión Sectorial de Investigación
Científica (CSIC), Universidad de la República, por su apoyo en la
financiación de la experiencia.
284
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energy metabolism of the pregnant ewe. Br J Nutr 56, 635-643.
Vipond JE, ME King, DM Inglis. 1987. The effect of winter shearing
of housed pregnant ewes on food intake and animal performance.
Anim Prod 45, 211-221.
285
Arch Med Vet 43, 287-294 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

Insumos utilizados en la preparación de alimentos en producción porcina

y su potencial de contaminación por dioxinas en la carne

Feed materials used in the preparation of food in pork production

and its potential for dioxin contamination in the meat

F Samsinga, C Bustos-Lópezb, JT Schoffera, CA Mattarac, A Gonzáleza,

C Roblesa, O Acevedoa y CE Valdovinosac*
aCentro de Investigaciones Ecotoxicológicas, Facultad de Ciencias Silvoagropecuarias, Universidad Mayor, Santiago, Chile.
bFacultad de Ciencias, Universidad Santo Tomás, Santiago, Chile.

cPrograma de Doctorado en Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

SUMMARY

This study assessed the contribution of various feed ingredients used in swine feeding as a source of dioxins, furans and dioxin like polychlorinated
biphenyls (DL-PCBs) contamination in pork, considering the dietary changes during breeding, raising and fattening. Raw materials or feed ingredients
were separated into different categories, developing a dataset with EROD/H4IIE bioassay results (determination of 7-Ethoxyresorufin O-Deethylase
activity in H4IIE hepatoma cell line). Two types of diets were established that considered the varying percentages of ingredients necessary during the
productive cycle of these animals. These two diets were based on those of common use in Chile. A descriptive analysis of the information contained in
the dataset was performed, characterising the observations behaviour. A transfer model in which the body burden of dioxin increases proportionally to
the consumption of contaminated food was proposed. The highest average contaminant concentration, expressed as 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
equivalent toxics derived from the EROD/H4IIE bioassay (TCDD-EQ/g) was found in ingredients of mineral origin (16.21 pg TCDD-EQ/g), followed
by those of fatty acid mixtures (2.03 pg TCDD-EQ/g), while the lowest average concentrations were found in dietary premixes (0.29 pg TCDD-EQ/g)
and vegetable oils (0.35 pg TCDD-EQ/g). With regard to the fransfer model, the evaluation of the contribution of the different feed ingredients to the
total amount of diet contamination showed that the vegetable components had the highest value, due to the high proportion of them in feed. The second
highest contributor was the raw material of mineral source.

Palabras clave: compuestos orgánicos persistentes, contaminantes en carnes, químicos liposolubles, xenobióticos.
Key words: persistent organic pollutants, pollutants in meats, lipid-soluble chemicals, xenobiotics.

INTRODUCCIÓN Similarmente, se detectó contaminación por dioxinas en

Las dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDDs), los diben-
zofuranos policlorados (PCDFs) y los bifenilos policlorados
similares a dioxinas (DL-PCBs) son compuestos orgánicos
persistentes que se forman como subproductos en procesos
industriales y que, mediante procesos de bioacumulación
y biomagnificación, llegan a encontrarse en los alimentos.
Es por ello que la alimentación es la principal vía a través
de la cual los seres humanos sufren exposición a dichos
compuestos (Svenson y col 1991). Los principales casos
descritos de contaminación por dioxinas señalan que ésta
se puede producir a diferentes niveles de la cadena alimen-
taria, siendo las materias primas contaminadas una de las
principales vías de ingreso. Tal es el caso del descubrimiento
en Estados Unidos y Europa de una alta contaminación
por estos xenobióticos contenidos en arcillas caolínicas, y
que fueron incorporadas a las dietas para peces y aves de
corral (European Commission 2000, Schecter y col 2006).
Aceptado: 12.08.2011.
* Casilla 235 correo 34, Santiago, Chile; carlos.valdovinos@umayor.cl
pellets de pulpa cítrica de Brasil y en grasa reciclada en
Bélgica (Malisch 2000). Por otra parte, Corea detectó, en
julio de 2008, la presencia de dioxinas en carne de cerdo
chilena identificándose al óxido de zinc en una premezcla
de minerales utilizada en las raciones como causa del
incidente (Valdovinos, 2009). Estos hallazgos motivan a
formular la pregunta de si ciertos insumos utilizados en
las raciones presentan un mayor riesgo de contaminar la
carne como producto final. Por lo tanto, el objetivo del
presente estudio es evaluar la contribución de los diversos
insumos utilizados en la alimentación de los cerdos, como
fuente de contaminación de la carne, considerando las
variaciones dietarias durante la recría, crianza y engorda.
MATERIAL Y MÉTODOS
Elaboración de bases de datos
Según Valdovinos (2009) y Samsing (2010), las
fuentes de contaminación de los animales de producción
y en especial de los animales de granja, de acuerdo a la
legislación de la Unión Europea (2006) y considerando la

287
F Samsing y col
realidad chilena, podrían afectar a las siguientes categorías
de materias primas o insumos que conforman las raciones
de cerdos: materias primas de origen vegetal (excepto
aceites), aceites vegetales, materias primas de origen mi-
neral, ácidos grasos de origen animal, harinas de origen
animal, harinas y aceites de pescado, aglutinantes y anti-
aglomerantes, productos lácteos y premezclas (complejos
vitamínicos, aminoácidos, antibióticos y otros). Además de
los insumos mencionados se agregó la categoría “mezcla
de ácidos grasos”, que en Chile se suele incorporar en la
dieta como suplemento energético.
Para esto se consideró un conjuntos de datos (“EROD/
H4IIE”) que incluye los insumos utilizados en la alimentación
de cerdos, ordenados por categorías, y los resultados de los
análisis de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs, expresados en pg
TCDD-EQ1/g, realizados mediante el bioensayo in vitro
con la línea celular H4IIE, en el Centro de Investigaciones
Ecotoxicológicas de la Universidad Mayor (CIEMAYOR)
entre los años 2008 y 2010. Para aplicar el bioensayo se
consideró el protocolo modificado de Tillitt y col (1991),
el cual utiliza la línea celular de hepatoma de Rattus nor-
vegicus, importada de la American Type Culture Collection
(ATCC®, CRL-1548™). La línea celular fue cultivada en
un Medio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM),
enriquecido con un 15% de suero fetal bovino (SFB). Las
células fueron mantenidas bajo condiciones estándares
(37 °C, 5% CO2) y se les permitió crecer entre 4 a 5 días,
luego fueron sembradas en placas de microtítulo de 96
pocillos de fondo plano, Nunc®, en un volumen de 300
µL/pocillo con una densidad de 1,2 x 104 células/pocillo.
Después de 24 horas de crecimiento se procedió a dosi-
ficar el estándar de 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina
(TCDD) en un set de 7 diluciones seriadas en razón 1:2
(50 pg/pocillo a 0,069 pg/pocillo) con tres réplicas cada
una (dilución 1:2). Dicho estándar fue usado para generar
una curva de dosis respuesta con la cual todas las muestras
fueron relacionadas.
Los extractos de las muestras y los controles de
calidad se dosificaron en un set de 7 en razón 1:3, con 3
réplicas cada una. Luego de la dosificación se dejó a las
células bajo condiciones estándares por 72 horas para
su posterior lectura. Para ello el medio fue removido a
través de un lavador de placas Thermo® Weelwash 4 Mk
2, que utiliza agua ultrapura, dejando aproximadamente
60 µL de medio/pocillo. Terminado el lavado se incuban
las células por 5 minutos, lo que produce citólisis osmó-
tica, dando como resultado la exposición del citocromo
P-4501A1 (CYP1A1). Pasado el tiempo se retiró la placa
de la incubadora y se le agregaron 20 µL de buffer a 37 °C
con 80 µL de dicumarol. Posteriormente, se adicionaron
20 µL de 5 µM de etoxiresorufina y 20 µL de 5 µM de
NADPH. Finalmente, se colocaron las placas en un lector
de fluorescencia (BioTek® FLx800™), que realiza lecturas
1 En este documento se utilizará TCDD-EQs para denominar los tóxicos
equivalentes (TEQs) derivados del bioensayo EROD-H4IIE.
288
por 20 minutos con un filtro de excitación 530 nm y con
un filtro de emisión de 580 nm. Este método permite la
lectura de la actividad EROD así como también la lectura
de la proteína en el mismo pocillo (Kennedy y Jones 1994).
En la etapa final del ensayo se utilizaron curvas de dosis
respuestas para determinar la potencia relativa del extracto
(RPFs) comparando los valores de las pendientes de los
extractos de las muestras con los valores de la pendiente
del estándar de TCDD para obtener los equivalentes tóxicos
(TCDD-EQs) expresados en pg/g de muestra (Mason y
col 1985, Tillitt y col 1993, Whyte y col 2004).
Mediante entrevistas a médicos veterinarios a cargo
del área de sanidad y producción de dos empresas, que en
conjunto generan el 70% de la carne de cerdo en Chile2,
se establecieron dos dietas de referencia utilizadas en el
país (D1 y D2, cuadro  1), las cuales consideraron los
porcentajes de incorporación de materias primas, que
varían a lo largo del ciclo productivo del cerdo (crianza,
recría y engorda).
Análisis estadístico
Se realizó un análisis descriptivo de la información
contenida en el conjunto de datos, utilizando el software
Minitab® versión 15.1 para Windows (Minitab Inc, State
College, PA, USA), caracterizando el comportamiento de
las observaciones y se propuso un modelo de transferencia.
Contribución de los insumos a la contaminación
final
Se tomaron los promedios de contaminación para cada
insumo del conjunto de datos (cuadro 2), para obtener la
contribución promedio porcentual en la dieta de crianza,
recría y engorda (cuadro 1), en pg TCDD-EQ/g para D1
y D2. Finalmente, se llevó a porcentaje la contribución de
los insumos a la contaminación final en todas las dietas.
Modelo de transferencia de PCDDs, PCDFs y DL-
PCBs a la carne de cerdo.
A fin de predecir los niveles de PCDDs, PCDFs y
DL-PCBs en el tejido, Fries (1996) propone un modelo
de transferencia desde la dieta al producto final, dado por
la siguiente expresión:
Ct = Bt /Ft , si t>0. (1)
Donde Ct es la concentración de dioxinas al tiempo t, Bt
es la carga corporal de dioxinas al tiempo t y Ft es la grasa
corporal al tiempo t. Según Fries (1995), el modelo tiene
como supuesto inicial que las PCDDs, PCDFs y DL-PCBs
se distribuyen en concentraciones relativamente uniformes
en el tejido graso. Además, se considera que la captación de
estos xenobióticos es un proceso pasivo y la eliminación,
2 http://www.asprocer.cl Fecha de consulta: 09 de junio de 2011.
 Compuestos orgánicos persistentes, contaminantes en carnes, químicos liposolubles, xenobióticos

Cuadro 1. Dieta de referencia usada en Chile en producción porcina (D1 y D2).

Reference diet used in Chile in pork production (D1 & D2).

Recría Crianza Engorda

Insumos
(21-70 días) (71-120 días) (121-180 días)
D1 D2 D1 D2 D1 D2
Materias primas de origen vegetal 61,17 61,17 92,02 91,05 92,74 91,05
Harina de pescado 10,50 10,50 – – –  –
Materias primas de origen mineral 2,25 2,25 1,69 2,15 1,73 2,15
Ácidos grasos Mezclas (a) – – 3,50 – 2,75 –
Origen animal – – – 2,10 – 2,10
Aceite vegetal – – – 4,05 – 4,05
Harinas de origen animal (b) – – 1,75 –  1,75 –
Aglomerantes y antiaglutinantes – – 0,21 – 1,21 –
Próductos lácteos 25 25 – – – –
Premezclas(c) 1,08 1,08 0,83 0,65 0,82 0,65

(a)  Mezclas de ácidos grasos de origen animal, vegetal y aceites reciclados (e.g. de frituras).
(b)  Harinas de carne y hueso, de sangre, de plumas y otros subproductos de animales terrestres.
(c)  Incluye enzimas, complejos vitamínicos, aminoácidos, antibióticos y otros aditivos alimenticios.

según Fries (1996) y Huwe (2006), es despreciable durante
la vida del cerdo con tasas de 0,005% (200 días de vida
media) a 0,01% (100 días de vida media).
Luego, Huwe (2006) propone:
Ft = 0,0028 ∙ t1,8173, si t>0. (2)
Por consiguiente, el presente trabajo propone un
modelo multiplicativo para determinar Bt. a través de una
adaptación del modelo de Fries (1996), en que la carga
corporal de dioxinas aumenta en forma proporcional al
consumo de alimentos contaminados. El modelo propuesto
es el siguiente:
Bt = A ∙ I ∙ D ∙ CA ∙ t, si t>0. (3)
Donde A es el coeficiente de absorción, I es el porcentaje
del insumo incluido en la dieta, D es la contaminación
promedio del insumo, CA es el consumo diario de alimento
y t los días de exposición.
Se determinó mediante (3) la carga corporal de dioxinas
en cada etapa de crecimiento del animal, puesto que los
valores de I y CA varían en el ciclo productivo. Aunque
diversos autores afirman que la absorción de estos xeno-
bióticos, a través de la dieta es de aproximadamente un
20% (Iben y col 2003, Huwe 2006, Brambilla y col 2008),
se proponen porcentajes de absorción para A, que fluctúan
entre 5% y 100%. Los valores de I se obtuvieron de las
dietas de referencia utilizadas en Chile, D se obtuvo del
análisis descriptivo del conjunto de datos “EROD/H4IIE”.
Bajo condiciones de alimentación ad libitum, el consumo
diario de alimento está en función del peso corporal (P) y se
obtiene de la siguiente ecuación (Fries 1996, Huwe 2006):
CAP = 4,003 (1 – e-0,01768∙P) (4)
Para el cálculo de la carga corporal de cada etapa se
utiliza CA, promedio del consumo al inicio y al final de la
etapa, P (en kg) se obtiene de la propuesta de Huwe (2006):
Pt = 0,7716∙t – 2,9701   , si t>0. (5)
RESULTADOS
Las dietas D1 y D2 varían en los porcentajes de insumos
incorporados en la crianza y engorda, mientras que en la
recría la composición de la dieta es la misma. A su vez,
D1 utiliza como fuente energética las mezclas de ácidos
grasos, mientras que D2 incluye ácidos grasos de origen
animal y aceites vegetales.
Del conjunto de datos “EROD/H4IIE” (cuadro 2), la
media de contaminación más alta corresponde a las mate-
rias primas de origen mineral, con 16,21 pg TCDD-EQ/g
(valor máximo de 429,15 pg TCDD-EQ/g), seguido por
las mezclas de ácidos grasos (2,03 pg TCDD-EQ/g). Las
concentraciones medias más bajas de contaminación se
presentan en las premezclas (0,29 pg TCDD-EQ/g) y los
aceites vegetales (0,35 pg TCDD-EQ/g).

289
 Cuadro 2. Estadísticas descriptivas de conjunto de datos EROD/H4IIE.

290
Descriptive statistics of EROD/H4IIE dataset.

Ácidos
Materias Aceites Materias Ác. grasos Harinas Harina de Aceite Aglomerantes Productos
grasos
F Samsing y col

primas de vegetales primas de de origen animales pescado de pescado y lácteos Premezclas

mezclas
  origen vegetal (pgTCDD- origen mineral animal (pgTCDD- (pgTCDD- (pgTCDD- antiaglutinantes (pgTCDD- (pgTCDD-EQ/g
(pgTCDD-
(pgTCDD-EQ/g EQ/g de (pgTCDD-EQ/g (pgTCDD- EQ/g EQ/g EQ/g (pgTCDD-EQ/g EQ/g muestra)(a)
EQ/g
de muestra)(a) grasa) de muestra)(a) EQ/g de grasa) muestra)(a) muestra)(a) de grasa) muestra)(a) muestra)(a)
de grasa)

n 16 28 45 20 35 28 12 9 7 7 31
Media 0,57 0,35 16,21 1,56 2,03 1,12 0,50 0,43 1,62 0,40 0,29
Desviación estándar 0,55 0,28 69,64 3,90 4,04 1,85 0,44 0,31 1,84 0,25 0,24
Varianza 0,31 0,08 4849,37 15,22 16,36 3,41 0,19 0,10 3,39 0,06 0,06
Mínimo 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,05 0,20 0,07 0,02 0,03 0,03
1er cuartil (Q1) 0,28 0,11 0,42 0,07 0,18 0,28 0,20 0,12 0,16 0,08 0,07
Mediana 0,44 0,26 0,82 0,31 0,46 0,49 0,38 0,46 0,56 0,45 0,27
3er cuartil (Q3) 0,59 0,56 2,45 0,63 1,51 1,04 0,57 0,74 3,14 0,59 0,42
Máximo 2,32 0,99 429,15 12,95 17,62 9,23 1,75 0,87 4,72 0,69 0,90
Rango 2,29 0,96 429,10 12,92 17,59 9,18 1,55 0,80 4,70 0,66 0,87
Rango intercuartil 0,32 0,45 2,00 0,55 1,33 0,76 0,36 0,62 2,98 0,51 0,35
Sesgo 2,43 1,00 5,39 2,87 2,87 3,49 2,46 0,26 0,87 –0,70 0,96
Kurtosis 6,79 0,06 30,26 6,97 7,80 14,11 6,91 –1,70 –0,74 –0,98 0,16
I.C.(b) para la media 0,57 ± 0,29 0,35 ± 0,11 16,22 ± 20,92 1,56 ± 1,83 2,03 ± 1,40 1,12 ± 0,72 0,50 ± 0,28 0,43 ± 0,24 1,62 ± 1,70 0,40 ± 0,231 0,29 ± 0,09
(a) Sobre la base de un contenido de humedad del 12% (base peso húmedo).
(b) Intervalo de confianza.
 Compuestos orgánicos persistentes, contaminantes en carnes, químicos liposolubles, xenobióticos

Cuadro 3. Concentraciones de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs (Ct) en la carne de cerdo al término de cada etapa del ciclo productivo,
usando D1 y considerando como fuente de contaminación las materias primas de origen vegetal (media= 0,57 pg TCDD/g de muestra,
conjunto de datos “EROD/H4IIE”) y ácidos grasos (promedio contaminación = 2,03 pg TCDD/g de muestra, conjunto de datos “EROD/
H4IIE”).
PCDDs, PCDFs and DL-PCBs concentrations (Ct) in pork at the end of each stage of production cycle, using D1 and considering the ve-
getal origin raw materials (mean = 0.57 pg TCDD/g sample, “EROD/H4IIE” dataset) and fatty acid (mean = 2.03 pg TCDD/g sample, “EROD/H4IIE”
dataset) as contamination source.

Concentración (pg TCDD-EQ/g de grasa)

Absorción C70 C120 C180(a) C220
MPOV(b) AG(c) MPOV(b) AG(c) MPOV(b) AG(c) MPOV(b) AG(c)
100% 4,42 0,00 6,00 0,59 5,94 0,61 5,68 0,59
80% 3,54 0,00 4,48 0,47 4,76 0,49 4,54 0,47
60% 2,65 0,00 3,60 0,35 3,57 0,36 3,41 0,35
40% 1,77 0,00 2,40 0,24 2,38 0,24 2,27 0,23
20% 0,88 0,00 1,20 0,12 1,19 0,12 1,14 0,12
10% 0,44 0,00 0,60 0,06 0,59 0,06 0,57 0,06
5% 0,22 0,00 0,30 0,03 0,30 0,03 0,28 0,03
(a) Concentración de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs al momento de la faena (180 días).
(b) Materias primas de origen vegetal.
(c) Ácidos grasos.

Resultados del modelo propuesto
Considerando distintos porcentajes de absorción de
dioxinas (100%, 80%, 60%, 40%, 20%, 10% y 5%) en (4)
se obtiene la contaminación estimada de la carne (en pg
TCDD-EQ/g de grasa) al final de cada etapa del ciclo
productivo (final de recría o C70; final de crianza o C120;
final de engorda o C180 y final de postengorda o C220), para
cada una de las dietas. El cuadro 3 muestra las concen-
traciones estimadas de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs en la
carne de cerdo, para la dieta D1 considerando las materias
primas de origen vegetal y los ácidos grasos como fuente
de contaminación, las cuales presentan una media de 0,57
y 1,56 pg TCDD-EQ/g respectivamente (cuadro 2). Por
otra parte, la dieta D1 no considera el aporte de mezclas de
ácidos grasos, por tanto, la carga corporal al final de esta
etapa es cero (C70 = 0). Los resultados de la estimación
aumentan hasta alcanzar cierto nivel y disminuyen después
de los 120 días (figura 1A). Para una absorción del 20%,
la estimación de la concentración más alta es de 1,20 pg
TCDD-EQ/g de grasa a los 120 días, en cambio a los 180
días la concentración estimada es de 1,19 pg TCDD-EQ/g
de grasa. Si la faena es a los 220 días, la concentración se
estima que disminuye a 1,14 pg TCDD-EQ/g de grasa. En

A B
7 0,95
100% absorción D1
6 80% absorción 0,90 D2
(pg TCDD-EQ/g muestra)

(pg TCDD-EQ/g muestra)

60% absorción
5
40% absorción 0,85
Concentración

Concentración

4 40% absorción
20% absorción 0,80
3 10% absorción
5% absorción 0,75
2

1 0,70

0 0,60

0,00
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
Edad Edad
(Días) (Días)

Figura 1. (A) Concentraciones de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs en la carne de cerdo, considerando las materias primas de origen
vegetal como fuente de contaminación (media = 0,57 pg TCDD-EQ/g de muestra, conjunto de datos “EROD/H4IIE”) administrando
D1 (dieta1). (B) Concentraciones de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs en la carne de cerdo, considerando como fuente de contaminación
las materias primas de origen mineral (media = 16,21 pgTCDD-EQ/g de muestra, conjunto de datos “EROD/H4IIE”) con un 20% de
absorción, en D1 (dieta1) y D2 (dieta 2).
(A) PCDDs, PCDFs and DL-PCBs concentrations in pork considering the vegetal origin raw materials as a contamination source
(mean = 0.57 pg TCDD-EQ/g sample, “EROD/H4IIE” dataset) administering D1 (diet1). (B) PCDDs, PCDFs and DL-PCBs concentrations in pork
considering the mineral origin raw materials as a contamination source (mean = 16.21 pg TCDD-EQ/g sample ”EROD/H4IIE” dataset) with a 20%
absorption in D1 (diet 1) and D2 (diet 2).

291
F Samsing y col
la figura 1B se observa que D1 y D2 difieren levemente
en el comportamiento de la concentración estimada en el
tejido para el insumo de origen mineral.
DISCUSIÓN
Diversos esfuerzos se han realizado para estimar las
concentraciones de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs en carne
de cerdo, aves de corral y carne de vacuno, en relación
con la exposición a través de los insumos de la dieta, los
cuales utilizan los resultados de los análisis realizados
mediante HRGC/HRMS (Fries 1996, Guruge y col 2005,
Van Eijkeren y col 2006, Brambilla y col 2008). En cambio,
en el presente trabajo los insumos de las dietas de los
cerdos fueron analizados mediante el bioensayo EROD/
H4IIE, utilizado en Chile como método de screening o
cribado para la detección de PCDDs y PCDFs en carnes
de pollos broiler (Schoffer y col 2011). Dicho bioensayo
se caracteriza por su rapidez y confiabilidad en la entrega
de resultados y menor costo, frente al método cromato-
gráfico (Whyte y col 2004, Schoffer y col 2011) y puede
ser utilizado en programas de monitoreo de insumos de
alimentos para animales.
Los modelos desarrollados para estimar la contamina-
ción en la carne deben considerar diferentes variables, tales
como perfil de congéneres, características fisicoquímicas
y toxicocinéticas, tiempo de exposición, genética, estado
fisiológico de los animales, régimen de alimentación y otras
(Hoogenboom y col 2004, Brambilla y col 2008). El modelo
propuesto incorporó la mayoría de las variables mencionadas,
mediante la aplicación de fórmulas de crecimiento y aumento
de la masa corporal. La variable perfil de congéneres no
fue considerada, ya que el resultado del bioensayo EROD/
H4IIE entrega un resultado total o valor de equivalencia
total (TEQ), en que no se diferencian los congéneres. Con
respecto a las propiedades toxicoquinéticas de PCDDs y
PCDFs, Pirard y De Pauw en 2005 demostraron que no
existen diferencias significativas en la absorción de ambos
grupos. Una vez absorbidos por el organismo, la metabo-
lización de estos compuestos es muy baja y, por tanto, su
excreción es casi despreciable (Fries 1996, Hoogenboom y
col 2004, Spitaler y col 2004), observándose una prolongada
vida media de las dioxinas en seres humanos, que oscila
entre 7 y 11 años (Pirkle y col 1989).
La absorción de PCDDs y PCDFs también va a depender
de la matriz a la cual se encuentran asociados, afectando
su biodisponibilidad. Al respecto, la absorción desde
matrices lipídicas (aceites y ácidos grasos) sería mayor
(Fries y Marrow 1975, Jones y col 1989), por tanto, estos
insumos contaminados constitutirían un riesgo mayor.
El modelo propuesto por Huwe (2006) utiliza fórmulas
de crecimiento y de aumento de la grasa corporal obtenidas
de un estudio realizado en cerdos de engorda de raza mixta
en el Biosciences Research Laboratory del Agricultural
Research Service (ARS), que depende del Departamento
de Agricultura de los Estados Unidos (USDA). Es posible
292
que las razas de cerdo criadas en Chile no presenten la
misma tasa de crecimiento, por lo que el modelo podría
ser más preciso, si se ajustan estas fórmulas a la realidad
de Chile e incluso a la de cada plantel. Las razas de cerdo
han cambiado notoriamente en los últimos 20 años, las
cuales tienden hoy a presentar una mayor masa muscular
y un menor contenido de grasa y, como consecuencia,
una concentración de PCDDs y PCDFs en el tejido adi-
poso presumiblemente mayor (Brambilla y col 2008). El
modelo desarrollado en el presente estudio considera que
la concentración de dioxinas en la grasa equivale a la carga
corporal total dividida por la grasa total acumulada, por lo
tanto, un menor tenor graso en el organismo implicará que
los compuestos se encuentren más concentrados.
Según los resultados obtenidos en este trabajo, las con-
centraciones de PCDDs, PCDFs y DL-PCBs son mayores
a los 120 días que al momento del beneficio (180 días), por
esta razón faenar a los animales a edades más tempranas
no sería una medida recomendable. Al respecto, Fries
(1996) comparó la concentración predicha y observada
de heptacloro y oxyclordano, en cerdos contaminados,
que comenzaron a ingerir una dieta limpia a los 77 días de
edad, observándose una disminución de la concentración
de estos compuestos en los animales. El autor explica dicha
reducción por la dilución en el pool graso, el cual aumenta
a medida que el animal crece y asume que hallazgos si-
milares son esperables con PCDDs, PCDFs y DL-PCBs.
Hoogenboom y col (2004) también evidenciaron que los
niveles de dichos xenobióticos disminuyen rápidamente
en animales en crecimiento.
Los resultados de la contribución de cada una de las
categorías de insumos al total de contaminación presente
en la grasa de cerdo muestran que las materias primas de
origen vegetal son las que más aportan, debido a que se
incorporan en un alto porcentaje en las raciones (~90%) y
el segundo mayor aporte fue el de las materias primas de
origen mineral. Aún así, se ha visto que los forrajes son
de bajo riesgo, a menos que exista depósito vía aérea de
contaminantes al ubicarse en zonas cercanas a sitios de
incineración de basura (Rappe y col 1987, Brambilla y col
2004) u otras fuentes de emisión. Por otro lado, el suelo
también podría originar la contaminación presente en los
insumos de origen vegetal, sin embargo, se ha visto que
la absorción de dioxinas desde la tierra es despreciable
(Roeder y col 1998) y que la única vía por la cual podrían
contaminarse sería por el depósito de polvo en su superficie
(European Commission 2000), el cual puede ser lavado
posterior a la cosecha, dejando de ser un riesgo
En general, todas las categorías de materias primas
del conjunto de datos “EROD/H4IIE” presentaron valores
bajos, concentrados a la izquierda de la distribución, pero
con la presencia de valores extremos en algunos grupos.
La categoría “materias primas de origen mineral” fue la
que presentó la media más alta de contaminación (16,21 pg
TCDD-EQ/g), seguida por la categoría “mezcla de ácidos
grasos” (2,03 pg TCDD-EQ/g).
 Compuestos orgánicos persistentes, contaminantes en carnes, químicos liposolubles, xenobióticos
RESUMEN
En el presente estudio se evaluó la contribución de los diversos insumos
utilizados en la alimentación de los cerdos, como fuente de contaminación
de dioxinas, furanos y bifenilos policlorados similares a dioxinas (DL-
PCBs) de la carne, considerando las variaciones dietarias durante la recría,
crianza y engorda. Las materias primas o insumos fueron separadas en
diferentes categorías, elaborándose un conjunto de datos con los resultados
de análisis mediante el bioensayo EROD/H4IIE (determinación de la
actividad de 7-Etoxiresorufina –O-detilasa en la línea celular de hepatoma
de rata H4IIE). Además se establecieron dos dietas tipo utilizadas en
Chile, considerando los porcentajes de incorporación de materias primas,
los cuales varían a lo largo del ciclo productivo del cerdo. Se realizó un
análisis descriptivo de la información contenida en el conjunto de datos,
caracterizándose el comportamiento de las observaciones. Se propuso un
modelo de transferencia, en que la carga corporal de dioxinas aumenta
en forma proporcional al consumo de alimentos contaminados. Como
resultados se obtuvo la media de contaminación más alta, expresada como
equivalentes tóxicos de 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina derivados
del bioensayo EROD/H4IIE (TCDD-EQ/g), en las materias primas de
origen mineral, con 16,21  pg TCDD-EQ/g, seguido por las mezclas
de ácidos grasos (2,03 pg TCDD-EQ/g). Las concentraciones medias
más bajas de contaminación se presentaron en las premezclas (0,29 pg
TCDD-EQ/g) y los aceites vegetales (0,35 pg TCDD-EQ/g). Respecto
del modelo de transferencia, al evaluar la contribución de los diferentes
insumos al total de contaminación de la ración, las materias primas de
origen vegetal fueron las que más aportaron, debido al alto porcentaje
en que éstas se incorporan en las dietas tipo. El segundo mayor aporte
fue el de las materias primas de origen mineral.
AGRADECIMIENTOS
Al Columbia Enviromental Research Center (CERC) del US Geological
Survey, en especial al Dr. Donald Tillitt, a Diane Nicks y Mike Tanner, a
la Asociación Gremial de Productores de Cerdo de Chile A.G, al Fondo de
Fomento al Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDEF-CONICYT),
al Dr. Pedro Cattan y a Hugo Schoffer.
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293
F Samsing y col
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COMUNICACIÓN

Identificación por PCR de Brucella canis en sangre y leche canina. Reporte de un caso

PCR identification of Brucella canis in canine blood and milk. A case report

M Oliveraa*, CA Giraldob, C Di-Lorenzoc

a,b Grupo Vericel, Grupo Biogénesis, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
c Laboratorio de Inmunología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina.

SUMMARY

Canine brucellosis is a disease caused by Brucella canis that is associated to reproductive problems in dogs, and it is also known as zoonosis.
These bacteria are excreted in urine, milk, fetus or semen of infected animals, and the transmission occurs via sexual, oral, nasal or conjunctival
contact. Diagnosis is usually done through serology but confirmation requires isolation of bacterial culture, a costly process that requires laboratory
biosafety level 3. Molecular techniques are a valid method to determine the bacterial DNA, offering high specificity and sensitivity. This study reports
the evaluation of a PCR test usually applied to isolates, as a test for clinical use. A healthy female canine with a history of previous brucellosis, feeding
her 4-day old healthy newborns, was submitted to a rapid serologic test with 2β-mercaptoethanol, haemoculture and PCR, of milk and blood. All the
tests resulted positive to Brucella canis. This is the first report of a positive result to B. canis by PCR and it confirms that clinically healthy individuals
shed the bacterium through milk, representing a risk of infection for neonates and humans.

Palabras clave: zoonosis, neonatos, asintomático, cronicidad.

Key words: zoonosis, neonates, asymptomatic, chronicity.

INTRODUCCIÓN prueba requiere un periodo prolongado de tiempo hasta

La Brucella canis (B. canis), aislada por primera vez en
1967 (Carmichael y Kenney 1968), es la principal bacteria
causante de enfermedades reproductivas en los caninos.
Epidemiológicamente se distribuye a nivel mundial (Myers
y Varela-Díaz 1980, Wanke 2004). En Colombia se aisló
por primera vez de sangre en 2005, con un reporte de casos
positivos del 17,2% (Jara y col 2005), y desde entonces
los reportes muestran frecuencias de positividad sérica
entre un 1,4 a un 11% en mascotas, criaderos y albergues
(Giraldo y col 2009, Ruiz y col 2010, Pardo y col 2009).
La transmisión de la enfermedad se da por vía sexual,
oral, nasal o conjuntival, por la eliminación de la bacteria
en la orina (Serikawa y col 1981), leche (Di-Lorenzo y
Olivera 2008), fetos o semen de los animales enfermos,
placenta y líquidos placentarios contaminados (Borie-
Polanco 2005, Keid y col 2007a). Cuando la enfermedad se
vuelve crónica, es común encontrar pacientes asintomáticos
seropositivos o con bacteremia (Hollet 2006).
En el diagnóstico de rutina se usa la prueba serológica
de aglutinación rápida en placa 2β-mercaptoetanol (PRAP-
2ME), que detecta anticuerpos específicos (Badakhsh y
col 1982), con el problema de que hay una proporción
significativa de resultados falsos negativos (Keid y col
2009). La confirmación del diagnóstico serológico se
realiza por medio del aislamiento de la bacteria. Esta
Aceptado: 19.01.2011.
* Facultad de Ciencias Agrarias, Ciudadela de Robledo Carrera 75
Nº 65·87, A.A. 1226, Medellín, Colombia; syngamia@gmail.com
la identificación del agente y laboratorios de bioseguridad
de nivel 3 (Lara y col 2007, Bounaadja y col 2009), lo que
limita su implementación.
Los métodos de amplificación del ADN como la reac-
ción en cadena de la polimerasa (PCR) han demostrado
ser confirmatorios en el diagnóstico de brucelosis (Bricker
2002, Keid y col 2009), permiten acortar el tiempo de
diagnóstico, reducir los riesgos de exposición y simplificar
los requisitos de infraestructura necesarios.
Este trabajo presenta resultados de la utilización de la
PCR para el diagnóstico clínico de brucelosis a partir de
sangre total y leche en una perra recién parida, con historia
previa de brucelosis.
MATERIAL Y MÉTODOS
Anamnesis
Hembra canina de 24 meses de edad, perteneciente a
un criadero de 64 caninos donde 14 meses antes se había
diagnosticado brucelosis canina con una seroprevalencia
del 14%. Las recomendaciones que se hicieron al propie-
tario para controlar la enfermedad no fueron tenidas en
cuenta (sacrificio de seropositivos, seguimiento serológico,
cuarentena).
La perra se encontraba de una semana posparto, asin-
tomática y amamantando cuatro cachorros aparentemente
sanos. Su historia demostró que ya se le había aislado pre-
viamente B. canis (# Nº10135-5 Dirección de Brucelosis
de la Administración Nacional de Laboratorios e Institutos

295
M Olivera y col

de Salud “Dr. Carlos Malbrán”, Rep. Argentina), además
de haber sido positiva a las pruebas de PRAP-2ME,
Inmunofluorescencia indirecta y ELISA Indirecta.
Pruebas de laboratorio
Muestras. Se tomaron muestras de sangre en tubo seco,
sangre en caldo infusión cerebro-corazón con citrato de
sodio, sangre en tubo con EDTA y leche. Se le realizaron
PRAP-2ME, hemocultivo y PCR a las muestras de sangre
total y leche entera.
Examen serológico PRAP-2ME. Se mezclaron 25 μl del
suero, 25 μl de 2β-mercaptoetanol y 50 μl de antígeno
(B. canis M-). Se espera dos minutos y se reportan como
positivos si se presentan pequeñas aglutinaciones visibles
a contraluz (Carmichael y Joubert 1987).
Hemocultivo y aislamiento. Se realizó un hemocultivo a
partir de la sangre de la paciente, en medio caldo cerebro-
corazón con citrato de sodio, durante 48 horas a 37 °C,
con repiques ciegos en agar tripticasa soya, durante 24
horas a 37 °C.
La muestra de leche fue sembrada directamente en
agar y se incubó de la misma forma.
La identificación de los microorganismos obtenidos a
partir del crecimiento de colonias pequeñas se realizó por
las pruebas bioquímicas y morfológicas rutinarias para
B. canis y se certificaron en el Instituto Carlos Malbrán.
Diagnóstico por PCR
Se extrajo ADN de las muestras de sangre total, leche,
hemocultivo y de la cepa aislada, utilizando el kit comer-
cial Genomic DNA Purification Kit (Fermentas). Para la
cuantificación de ADN se usó un kit comercial (Quant-
iT™ dsDNA HS Assay Kit, Lot 55810ª, Invitrogen) y se
leyó en un flurómetro (Fluorometer Qubit, Invitrogen).
Para los cebadores y la PCR se usó el método descrito
por García-Yoldi y col (2006) (cuadro 1). Como controles
de especificidad de cebadores se usaron suspensiones de
cepas de B. abortus cepa 19 y B. abortus cepa RB51; como
control de la cepa de B. canis se usó la cepa de referencia
usada por García-Yoldi RM6/66 (ATCC23365); como
control interno se utilizó el gen constitutivo GAPDH;
como control negativo se usaron todos los reactivos de
PCR sin DNA.
Para la PCR se utilizó 1 ul de ADN en un volumen
final de 25 ul que contenía: buffer KCL 1X sin MgCl2,
3mM de NgCl2, 400uM de dNTP (Promega corp®),
1,5 U de taq DNA polimerasa (Invitrogen®) y 6,25 pmol
de cada primer. La amplificación se realizó en un MJ
Research Peltier Termal Cycler PTC 100 en un total de
25 ciclos. Cada ciclo consistía en una temperatura de
desnaturalización de 95 °C por 1 minuto, alineamiento de
los primers a 64 °C por 45 segundos; la extensión de los
primers se realizó a 72 °C por tres minutos. Después de los
25 ciclos se realizó una extensión final de 72 °C por seis
minutos. Los productos de la PCR fueron visualizados en

Cuadro 1. Primers usados para la PCR de este estudio. aLos números BMEI o BMEII designan el loci para el genoma de B. melitensis,
y BR para el genoma de B. suis. bDebido a una inserción en el gen bp26 del ADN, el tamaño del amplicón de las cepas de Brucella
aisladas de mamíferos acuáticos es de 1.320 bp. f, forward; r, reverse.
PCR primers used in this study. aBMEI or BMEII numbers designate loci in B. melitensis genome, and BR in B. suis genome. f, forward;
r, reverse. bDue an DNA insertion in the bp26 gene, the amplicon size in Brucella strains isolated from marine mammals is 1,320 bp. f, forward;
r, reverse.

Primera Secuencia (5'-3') Tamaño amplicón (bp)

BMEI0998f ATC CTA TTG CCC CGA TAA GG 1.682

BMEI0997r GCT TCG CAT TTT CAC TGT AGC
BMEI0535f GCG CAT TCT TCG GTT ATG AA 450 (1.320)b
BMEI0536r CGC AGG CGA AAA CAG CTA TAA
BMEI1436f ACG CAG ACG ACC TTC GGT AT 794
BMEI1435r TTT ATC CAT CGC CCT GTC AC
BMEII0428f GCC GCT ATT ATG TGG ACT GG 587
BMEII0428r AAT GAC TTC ACG GTC GTT CG
BR0953f GGA ACA CTA CGC CAC CTT GT 272
BR0953r GAT GGA GCA AAC GCT GAA G
BMEI0752f CAG GCA AAC CCT CAG AAG C 218
BMEI0752r GAT GTG GTA ACG CAC ACC AA
BMEII0987f CGC AGA CAG TGA CCA TCA AA 152
BMEII0987r GTA TTC AGC CCC CGT TAC CT

296

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1000 pb
50 pb
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio. Línea 1, Marcador de peso molecular 100 pb (Fer-
mentas); línea 2, B. canis Rm6/66 1; línea 3, control negativo; línea 4, B. abortus RB51; línea 5, B. abortus S19; línea 6, B. canis
directamente de muestra de sangre total; línea 7, B. canis directamente de muestra de leche.
Agarose gel electrophoresis stained with 1.5% ethidium bromide. Line 1, molecular weight marker 100 bp (Fermentas); line 2, B. canis
Rm6/66 1; line 3, negative control; line 4, B. abortus RB51; line 5, B. abortus S19; line 6, B. canis directly from whole blood sample; line 7: B. canis
directly from milk sample.
una electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, teñido con
bromuro de etidio y evaluado bajo luz UV. Se utilizó un
marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas Gene
Ruler 100 bp DNA Ladder 0,5 ug/ul).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La prueba sérica fue positiva, el hemocultivo (sangre
#11907-1, leche #11907-12) y la PCR resultaron positivos
para la sangre y para la leche, lo que indica que la perra
continuó infectada crónicamente.
En cuanto a la PCR, a partir de sangre total y leche
se observó el mismo patrón que reportaron García-Yoldi
y col (2006): 4 bandas (152, 272, 450, 587 pb) corres-
pondientes a B. canis; además mostró la 794 pb, que está
reportada para B. suis, pero que García-Yoldi en comuni-
cación personal con los autores confirma que hay cepas
de campo que la presentan; la banda de 1682 de B. canis
no se observó, debido posiblemente a la cantidad de DNA
que puede extraerse de una muestra clínica. Las cepas
B. abortus RB51 4 bandas (152, 450, 580 y 794 bp) y S19
4 bandas (152, 450, 794 y 1682 bp) fueron utilizadas como
controles de especificidad (figura 1).
La prueba de PCR diseñada por García-Yoldi y col
(2006) se corrió sobre extracciones de ADN a partir de
cultivos bacteriales de las cepas de referencia; sin embargo,
al probar la técnica en una muestra clínica de sangre y
leche de un animal crónicamente infectado bacterémico
y asintomático se determina que tiene muy buen valor
diagnóstico. Keid y col (2007b) ya habían demostrado que
la prueba de PCR usando el 16S-23S rADN interspacer
tiene una sensibilidad y especificidad diagnóstica del
100%, con una capacidad de detección de 3.8 fg de ADN
de B. canis que representa una concentración bacterial de
al menos dos bacterias.
zoonosis, neonatos, asintomático, cronicidad
1682 pb
794
587
450
272
152
Por primera vez se demuestra que la técnica de PCR
sirve para el diagnóstico directamente de la leche, lo que
aumenta los usos de la prueba. Algunos investigadores la
habían aplicado para el diagnóstico clínico a partir de sangre,
hisopados vaginales y semen (Keid y col 2007a), mientras
que otros la usaron para el diagnóstico a partir de muestras
de ganglios linfáticos (Aras y Uçan 2010). Los autores
concuerdan en que el diagnóstico molecular por PCR es
una herramienta útil, especialmente porque hay un grupo
significativo de animales infectados, que aparecen negativos
en las pruebas serológicas. Además puede convertirse en un
protocolo de laboratorio que no es peligroso para el personal
y puede ser realizado en un día (Aras y Uçan 2010).
Se corrobora con este caso que un animal con historia
de infección por B. canis puede dar a luz camadas vivas y
a término con o sin tratamiento de la enfermedad (Hollett
2006, Wanke y col 2006); es importante anotar que la leche
es una vía de eliminación de la bacteria, lo que sería una
posible vía de infección a los neonatos, aunque aún no
se ha demostrado. Los resultados del trabajo confirman
el riesgo de transmisión tanto horizontal (la leche) como
vertical (aislamiento bacteriológico en la madre) que un
animal positivo puede representar en un criadero, no sólo
para los demás animales convivientes sino también para
los humanos en contacto con las secreciones (Olivera y
Di-Lorenzo 2009), por ser una zoonosis.
Con respecto a la clasificación de la evolución de la
enfermedad, aunque Keid y col (2009) clasifican un hallazgo
positivo al aislamiento y positivo a PCR como determinante
de una fase aguda de la infección, el reporte de este caso no
concuerda, ya que el animal estaba crónicamente infectado,
no presentaba ningún signo clínico de la enfermedad y
había parido cachorros. Es decir, que la enfermedad puede
cursar como crónica, asintomática pero bactéremica y con
eliminación por fluidos como la leche.
297
M Olivera y col
RESUMEN
La brucelosis canina, producida por Brucella canis, es una enfermedad
asociada a problemas reproductivos y de carácter zoonótico. Estas bacterias
son excretadas en orina, leche, fetos o semen de los animales infectados
y la transmisión ocurre por contacto vía sexual, oral, nasal o conjuntival.
El diagnóstico de rutina se realiza por serología, pero la confirmación
requiere aislamiento del cultivo bacterial, lo cual es costoso y requiere
laboratorios con nivel 3 de bioseguridad. Las técnicas moleculares son
una posibilidad reconocida para determinar el ADN bacterial, con alta
especificidad y sensibilidad. Este reporte evaluó como prueba de aplicación
clínica una técnica de PCR desarrollada para cultivos bacteriales. A
una hembra canina asintomática, con historia previa de la enfermedad,
amamantando una camada sana de 4 días de nacidos, se le realizó la
prueba serológica rápida en placa con 2β-mercaptoetanol, hemocultivo y
PCR, de leche y de sangre. Todas las pruebas fueron positivas a Brucella
canis. Este es el primer reporte de diagnóstico en leche por PCR, lo que
corrobora que animales clínicamente asintomáticos eliminan la bacteria
por esta vía, lo que constituye un riesgo de infección para los neonatos y
el riesgo zoonótico para veterinarios, propietarios del animal o personas
que intervengan en el parto si no se toman medidas higiénicas preventivas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a Miriam Sánchez por su contribución a
la discusión del artículo, al profesor Carlos Muskus y a María Teresa
Guerra por la ayuda en el laboratorio molecular.
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Arch Med Vet 43, 299-302 (2011)

COMUNICACIÓN

Un caso de hermafroditismo verdadero 78, XX en una perra Weimaraner#

A case of true hermaphroditism 78, XX Weimaraner bitch

L Martina, AAM Querob, DM Ferréb, L Albarracínb, V Hynesb, IB Larripac, d, NB Gorlab, d*

a Unidad
de Prácticas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias y Ambientales (FCVA),
Universidad Juan Agustín Maza (UMaza), Mendoza, Argentina.
bGenética, Área de Ciencias Básicas, FCVA, Juan Agustín Maza, Mendoza, Argentina.

cDepartamento de Genética, Academia Nacional de Medicina, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

dCONICET

SUMMARY

XX true hermaphroditism was identified in a 14 months Weimaraner female with a 3 cm radiopaque os clitoris analogue the male os penis, shown as
a reddish structure protruding from the vulva. Giemsa metaphases revealed a normal female 78, XX chromosomal complement. The in situ fluorescence
hybridization confirmed the presence of two X chromosome centromeric zones in each analyzed cell. The bitch presented a normal estrous cycle follow
by pregnancy and delivery. The hystopathological findings of the dog confirmed hermaphroditism with bilateral ovotestis.

Palabras clave: intersexualidad, canino, citogenética.

Key words: intersexuality, dog, cytogenetics.

INTRODUCCIÓN el examen clínico, métodos de laboratorio y de imágenes

Los intersexos se categorizan en anormalidades del
sexo cromosómico, anormalidades del sexo gonadal o
anormalidades del sexo fenotípico (Meyers-Wallen 2000).
El diagnóstico diferencial de las quimeras, mosaicos,
síndrome de reversión sexual y el hermafroditismo en
machos o hembras en individuos con signos de intersexo
deben estar basados en la inspección de los cromosomas,
las gónadas y la apariencia fenotípica de los órganos
reproductivos (Kuiper y Distl 2004).
Los hermafroditas son clasificados como hermafroditas
verdaderos, pseudohermafrodita macho o pseudoher-
mafrodita hembra. Los hermafroditas verdaderos tienen
tejido gonadal de ambos sexos y pueden ser de tres tipos:
a) bilateral, cuando presenta ovotestis en ambos lados; b)
unilateral, cuando tiene un ovotestis de un lado y tejido
ovárico o testicular del otro lado y c) lateral, cuando pre-
senta tejido ovárico de un lado y testicular del otro lado. El
pseudohermafrodita macho tiene tejido gonadal testicular
y órganos genitales con algunas características de hembra,
mientras que el pseudohermafrodita hembra tiene tejido
gonadal ovárico y órganos genitales con características
de macho (Hare 1976).
El objetivo de este estudio fue investigar las causas de
la ambigüedad sexual en una perra Weimaraner, mediante
Aceptado: 16.03.2011.
# Financiado por Universidad Juan Agustín Maza, Mendoza, Argen-
tina.
* Acceso Este, lateral Sur 2245, (5519) Guaymallén, Mendoza,
Argentina; noragorla@gmail.com
complementarios para poder definir un diagnóstico de
certeza.
MATERIAL Y MÉTODOS
El caso clínico se investigó en las instalaciones de la
Unidad de Prácticas Veterinarias (UPV) de la Facultad de
Ciencias Veterinarias y Ambientales (FCVA), Universidad
Juan Agustín Maza (UMaza) durante el año 2008. Los estu-
dios complementarios fueron realizados por profesionales
de la UPV y los estudios citogenéticos fueron desarrollados
por el Laboratorio de Genética de la Facultad.
A los 14 meses de edad se efectúa el primer examen
clínico a una perra de raza Weimaraner en la que se observa
una vulva infantil y un aumento de tamaño del clítoris.
Se realizaron los siguientes métodos complementarios de
diagnóstico: ecografía abdominal, radiografía ventrodorsal
de zona perineal, medición de testosterona pre y postesti-
mulación con hormona gonadotrofina coriónica humana
(hCG) y cultivo de linfocitos para obtener metafases y
efectuar Hibridación in situ por Fluorescencia (FISH) con
sondas centroméricas de los cromosomas sexuales X e Y.
Para obtener metafases se efectuaron cultivos de lin-
focitos de sangre periférica de 72 h, a 37 °C: el medio de
cultivo utilizado fue 7,5 ml de medio F10, enriquecido
con 2,5 ml de suero fetal bovino, 100 µl de fitohemoa-
glutinina como inductor de mitosis y 40 µl de penicilina y
estreptomicina (Moorhead y col 1960). Luego de agregar
a los cultivos 120 µl de colchicina durante los 30 minutos
finales de cultivo, se agregó solución hipotónica de cloruro

299
L Martin y col
de potasio a 0,075 M, se efectuó fijación con solución de
metanol:ácido acético (3:1) y el material extendido sobre
portaobjetos fue coloreado con Giemsa 10%. Se analiza-
ron y dibujaron 20 metafases al microscopio óptico con
1000X. Para la técnica de FISH se efectuó pretratamiento
de los extendidos con ARNasa (100 µl/2xSSC), pepsina
0,005% en HCl y lavados en formaldehído/ 1xPBS/ Cl2 Mg
(150  ml). Se efectuó la desnaturalización con solución
de formamida 70%/ 2xSSC/ 75º/ 3’ y deshidratación en
series de etanol frío. Luego de la desnaturalización de la
sonda se permitió la hibridación a 37 °C con la sonda XY
(Vysis). El cromosoma X emite una señal roja (región
centromérica alfa satélite, Xp11.1-q11.1), mientras que
el cromosoma Y emite una señal verde (ADN satélite
Yq12). Se analizaron 200 núcleos en el microscopio de
fluorescencia. A los 15 meses la perra presentó exudado
sanguinolento en vulva y se efectuó citología vaginal,
progesteronemia y ecografía nuevamente. A los 16 meses
durante la ecografía de control se diagnostica una preñez
múltiple de 40 días. La gestación continúa y concluye
con el nacimiento de 10 cachorros mestizos sanos. A los
30 meses se realiza una ovariohisterectomía y análisis
histopatológico de ambas gónadas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el examen clínico se observa hipoplasia vulvar y
un clítoris en forma de dedo que mide 3 cm de largo y
sobresale de los límites de la vulva (figura 1). La radio-
grafía (figura 2) permite apreciar en la zona perineal una
formación radio-opaca compatible con un os clitoris,
análogo al os penis en los machos. Se realizó la compa-
ración con las medidas esperadas para la raza, se observó
que estaba por encima del promedio en altura, peso y
desarrollo muscular. La medición de testosterona antes y
después de la estimulación con hCG dio valores basales.
Los órganos andrógeno-dependientes se masculinizan
Figura 1. Vista general de genitales externos. Clítoris hipertro-
fiado protruyendo de los labios vulvares.
General view of external genitalia. Hypertrophied clitoris
protruding from the labia.
300
Figura 2. Radiografía, proyección ventrodorsal. En el interior
del círculo se observa estructura radioopaca compatible con os
clitoris.
Radiography, ventrodorsal projection. Inside the circle a
radiopaque structure compatible with os clitoris can be observed.
durante el desarrollo con agrandamiento del clítoris. La
obtención de mediciones elevadas de testosterona previas
o posteriores a la estimulación con hCG sugiere la pre-
sencia de tejido testicular; sin embargo, la obtención de
niveles basales de testosterona no confirma la presencia
o ausencia del mismo (Lyle 2007). En la ecografía abdo-
minal se explora el área de proyección de ovarios y útero,
no se advierten alteraciones; asimismo, no se observan
imágenes compatibles con testículos intraabdominales,
tampoco ningún otro vestigio correspondiente al aparato
reproductor masculino.
En las metafases observadas con microscopía óptica
(figura 3) se evidencian 76 cromosomas acrocéntricos, y
dos cromosomas X, los únicos metacéntricos de la dotación
diploide. Mediante la técnica de FISH (figura 4) se confirma
la presencia de dos centrómeros de cromosomas X en todas
las células analizadas, sin fluorescencia correspondiente
al centrómero de cromosoma Y.
La citología vaginal y la progesteronemia seriadas
realizadas durante el período en el que observó el exudado
sanguinolento confirmaron la aparición del primer ciclo
estral. Este hecho y la posterior gestación y parto demuestran
que la perra es fértil a pesar de la ambigüedad morfológica
que demuestran sus órganos reproductores externos.
En la ovariohisterectomía se observó que las gónadas
estaban situadas normalmente en caudal de los riñones
y en craneal de los cuernos uterinos; la ubicación del
útero en el abdomen también fue normal y no presenta-
ba alteraciones macroscópicas (figura 5). En el estudio
histopatológico, las gónadas estaban compuestas princi-
palmente por células intersticiales y túbulos seminíferos,
 intersexualidad, canino, citogenética

Figura 3. Metafase. 2n: 78. XX. Todos los autosomas presentan

una estructura acrocéntrica y ambos cromosomas X (flechas)
presentan estructura metacéntrica.
Metaphase. 2n: 78. XX. All autosomic chromosomes have
an acrocentric structure and both X chromosomes (arrows) present
metacentric structure.

Figura 5. Vista macroscópica de las gónadas y útero bicornual.

Macroscopics view of gonads and bicornuate uterus.

Figura 4. Hibridación in situ fluorescente en una célula inter-

fásica. Manifestación de dos señales rojas que demuestran la
presencia de ambos cromosomas X.
In situ fluorescent hybridization in an interphase cell. The
two red signals show the presence of both X chromosomes.

también se observaron folículos ováricos en la corteza
(figura 6). Cada gónada tenía túbulos deferentes, plexo
pampiniforme, fimbrias, oviductos y cuernos uterinos. Los
hallazgos en la perra sugieren hermafroditismo verdadero
con ovotestis bilateral.
Se aprecia un individuo en donde el sexo cromosómico
es femenino y el sexo gonadal presenta tejido histológico
femenino y masculino, con presencia de una anomalía en
sus genitales externos. Este agrandamiento del clítoris fue
descripto en varios casos de intersexo en caninos (Chaffaux
y Cribiu 1991, Sommer y Meyers- Wallen 1991, Melniczek
y col 1999, Kuiper y Distl 2004, Nowacka y col 2005, Kim
y Kim 2006). Los derivados de los conductos müllerianos se
desarrollan normalmente, formando los oviductos, el útero
Figura 6. Corte histopatológico de ovotestis derecho. Nótese el
tejido ovárico en el borde superior izquierdo (flecha) y el tejido
testicular en el borde inferior derecho (flecha). 400x.
Hystopathological section of right ovotestis. Note the ovarian
tissue in the top left corner (arrow) and testicular tissue in the bottom
right corner (arrow). 400x.
y la vagina craneal. La sustancia anti-mülleriana (MIS) se
encontraría presente en estos casos; sin embargo, la falla
en la regresión completa de los conductos müllerianos se
puede deber a: deficiencia de la producción cuantitativa
de MIS, que esta sustancia se produzca antes o después
del tiempo crítico para inhibir el desarrollo testicular,

301
L Martin y col
falla en los receptores de los tejidos blanco o que haya
alguna sustancia aún no determinada que intervenga en
la inhibición del desarrollo testicular (Meyers-Wallen y
col 1987, Lyle 2007).
En el presente estudio el sexo cromosómico femenino
se confirmó por cariotipo y FISH. Sin embargo, la ausen-
cia de centrómero del cromosoma Y no es suficiente para
descartar alguna deleción génica. Además, los genes de
determinación sexual en esta especie son aún un interro-
gante. Varios trabajos han reportado casos de hermafroditas
verdaderos, Sry negativos, cuestionando la participación de
este gen en el desarrollo de ovotestis en caninos (Hubler
y col 1999, Nowacka y col 2005, Kobayashi y col 2007).
Algunos casos de hermafroditismo verdadero han
sido reportados en perros en las siguientes razas: Basset
Hound (Hubler y col 1999), Beagle (Kobayashi y col
2007), Cocker Spaniel (Selden y col 1978, 1984, Kim
y Kim 2006), German Shorthaired Pointer (Sommer y
Meyers-Wallen 1991), Doberman (Sobti y col 1990),
Yorkshire Terrier (Sinzinger y Gutbrod 1991), Norwegian
Elkhounds (Melniczek y col 1999), Pug (Stewart y col
1972), German Pinscher (Poth y col 2010), Berger Picard
(Poth y col 2010) y mestizos (Chaffaux y col 1990). Sólo
Selden y col en 1984 reportan un caso de hermafrodita
verdadero que se reproduce como hembra, produciendo
crías anatómicamente normales, como las del presente
trabajo. Según la nomenclatura propuesta recientemente
por Poth y colaboradores (2010) este sería un caso de “78,
XX ovotesticular Disorder Sexual Development)(DSD)”.
En el presente estudio y en la práctica de la clínica vete-
rinaria la citogenética es una herramienta complementaria
que aporta al diagnóstico y permite un acercamiento rápido
a la constitución y morfología cromosómica del animal.
La información de la anatomía externa, la histopatología
genital y el sexo cromosómico permitieron el diagnóstico
diferencial entre reversión del sexo, pseudohermafroditismo
y hermafroditismo verdadero.
RESUMEN
Una perra Weimaraner con ambigüedad sexual al nacimiento fue
diagnosticada como hermafrodita verdadera. A los 14 meses presentaba
un agrandamiento del clítoris, una protuberancia rojiza que sobresalía
3 cm de la vulva, un os clitoris radioopaco análogo al os penis en los
machos. Las metafases coloreadas con Giemsa revelaron una hembra
normal con complemento cromosómico 78, XX. La hibridización in situ
por fluorescencia confirmó la presencia de dos zonas centroméricas del
X en cada célula analizada. La perra presentó un ciclo estral normal
302
seguido de una preñez y parición. Los hallazgos histopatológicos en la
perra muestran ovotestis bilateral y confirman hermafroditismo verdadero.
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Arch Med Vet 43, 303-306 (2011)

COMMUNICATION

Surgical correction of degenerative lumbosacral stenosis in a puma

(Puma concolor araucana)

Corrección quirúrgica de estenosis lumbosacral degenerativa en un puma

(Puma concolor araucana)

C Verdugoa*, M Gómezb, M Alvarado-Rybakc, H Bustamanted, L Cardonad, M Mieresd

aCentrode Rehabilitación de Fauna Silvestre, CEREFAS, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
bInstituto de Farmacología y Morfofisiología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

cInstituto de Patología Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

dInstituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

RESUMEN

Un ejemplar de puma (Puma concolor araucana) macho intacto, adulto (12 años), fue evaluado debido a una paraparesis y deambulación anormal
de los miembros pélvicos. Al examen neurológico se determinó una paraparesia progresiva, ataxia simétrica de los miembros pélvicos y parálisis de la
cola. Se obtuvieron radiografías simples y una tomografía computarizada (TC) del segmento lumbosacro como exámenes diagnósticos para determinar
posibles causas. El examen de TC confirmó una estenosis del canal vertebral en el segmento vertebral L7-S1. Se realizó una laminectomía dorsal con
el fin de descomprimir el área afectada. Se tomaron muestras de tejido blando del área afectada para su análisis histopatológico. El material colectado
presentó moderadas células inflamatorias e hipertrofia del ligamento flavum. Dos semanas después de la cirugía, el animal mostró un mejoramiento
neurológico progresivo y retornó a una ambulación normal.

Key words: cougar, laminectomy, ligamentum flavum, lumbosacral compression, Puma concolor.
Palabras clave: laminectomía, ligamento flavum, compresión lumbosacra, puma, Puma concolor.

INTRODUCTION and decreases the spinal nerve compression (Danielsson

and Sjöström 1999, Sharp and Wheeler 2005). Here, we
Degenerative Lumbosacral Stenosis (DLSS) is a spinal describe a clinical case and successful surgical treatment
disorder commonly reported as a clinical syndrome in of DLSS in a puma (Puma concolor araucana) caused by
domestic dogs, although is rarely recognized in felines the hypertrophy of the L7-S1 ligamentum flavum.
(De Risio et al 2000). Compressive lesions at the cauda
equina (i.e. sacral caudal and L7 spinal nerve and nerve MATERIAL AND METHODS
roots) (De Risio et al 2000) combined with other abnor-
malities (e.g. trauma, vascular causes, infectious and
CASE REPORT
inflammatory diseases, and neoplasia), lead to degenerative
changes including soft tissue hypertrophy of supporting
A 12 year old, 53-kg intact male puma (Puma conco-
ligamentous structures such as the ligamentum flavum
lor araucana) was presented to the Veterinary Teaching
(Sharp and Wheeler 2005). The DLSS or lumbosacral
Hospital at Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile,
syndrome may cause signs in the pelvic limbs, bladder,
because of pelvic limb paraparesis and walking difficulty
anal sphincter, and tail innervations. These can range from
of two weeks duration. The animal came from a private
flaccid weakness to paralysis of pelvic limbs, including
reproduction center, where it was housed separately with
reluctance to movement, pelvic limb gait abnormalities,
one other puma, and was provided with beef and water
uni or bilateral lameness, paraesthesia or dysesthesia, tail
ad libitum. During the examination the animal was alert
paresis or paralysis, and urinary or fecal incontinence (De
and responsive but showed evident ambulatory difficulty,
Risio et al 2000). However, the most consistent clinical
crouched stance, reluctance to rise and jump, symmetric
sign is lumbosacral pain, indicated by characteristic pos-
pelvic limb ataxia, and tail paralysis. In addition, there
tures which increases the diameter of the vertebral canal,
was a decreased muscle tone and atrophy of the pelvic
limb muscles, whereas thoracic limb muscle tone was
normal. Patellar reflexes were normal but flexor reflexes
Aceptado: 19.01.2011.
of the pelvic limbs were decreased. Because of the nature
* College of Veterinary Medicine, University of Florida, Gainesville,
FL 32610, USA; Casilla 567, Valdivia, Chile; cverdugo@ufl.edu of the animal, further visual and palpable examinations

303
C Verdugo et al
and diagnostic procedures were only achievable with the
anesthetized animal. The animal was immobilized with
a combination of medetomidine1 (0.04 mg/kg, I.M.) and
ketamine2 (3 mg/kg, I.M.), and then it was intubated and
maintained with isofluorane3 (1-3%) in oxygen. There
were no palpable abnormalities of the vertebral column
and pelvic limbs. Head, thoracic and abdominal physical
examinations were also normal. CBC and plasma bioche-
mistry profile were unremarkable. Based on the clinical
signs, the neuroanatomic diagnosis indicated Lower Motor
Neuron (LMN) deficit of the tail musculature (caudal
nerves) and caudal thigh and crural musculature (sciatic
nerve) indicating compromise of the L6, L7, sacral and
caudal spinal cord segments, the spinal roots and spinal
nerves. Differential diagnosis included external injury,
degenerative lumbosacral stenosis, intervertebral disk
disease, diskospondylitis, myelitis, neoplasia, fibrocar-
tilaginous embolic myelopathy or thromboembolism.
Survey radiographs of the vertebral column revealed
sclerosis of the articular facets of L7-S1, as well as an
increase of radiographic density similar to soft tissue in
the vertebral canal between L7-S1. A computed tomogra-
phic4 (CT) scan of the lumbosacral region was performed
with the animal in dorsal recumbency with flexed pelvic
limbs. Transverse soft tissue CT images showed loss of
epidural fat in the L7-S1 vertebral canal and increased soft
tissue opacity dorsally at the location of the ligamentum
flavum (LF) (figure 1). Although dynamic studies were
not performed in this clinical case to evaluate instability
of the lumbosacral joint, anatomical variations were not
evident at the CT images. Bone window images revealed
smooth bone margins, but marked dorsoventral stenosis
of the L7-S1 vertebral canal, with no evidence of a dyna-
mic lesion. Epaxial muscles over the affected area were
symmetrically atrophied. Based on the above findings, a
spinal surgical decompression was performed the following
day, using the same anesthetic procedure, with an epidural
regional analgesia using lidocaine5 (2 mg/kg diluted in 10 ml
of saline solution). A dorsal midline incision was made
over the caudal lumbar spine with the animal in sternal
recumbency. A dorsal laminectomy and osteotomy of
spinous process of L7 and the median sacral crest, with
preservation of vertebral pedicles and articular facets
(Funkquist type B) was performed using rongeurs and a
high-speed burr. The sacral and caudal spinal nerves were
displaced ventrally by abundant connective tissue from the
LF. All the compressive soft tissue was removed by sharp
dissection using a surgical blade No. 15 and the retraction
was done with Adson-Brown forceps; then the area was
1 Domitor® , Pfizer, Exton, Pennsylvania 19341, USA.
2 Ketostop, Drag-Pharma, Invetec S.A., Santiago 0675645, Chile.
3 Isoflorano USP, Baxter Health Care Corporation, Guayama, Puerto
Rico 00784, USA.
4 4th generation CT scanner, IQ/PQ 4.25 Diagnostics, Picker Interna-
tional Inc., Cleveland, Ohio 44143, USA.
5 Lidocaína 2%, Laboratorio Chile, Santiago 7780050, Chile.
304
Figure 1. Transverse soft tissue window CT image at L7-S1
vertebral canal from a puma (Puma concolor araucana)
showing evident dorso-ventral narrowing of the vertebral canal
and decrease of epidural fat (arrow) (IW: ilial wing; ID: L7-S1
intervertebral disk; SW: sacral wing; SCD: right sacrocaudalis
dorsalis lateralis muscle).
Imagen transversa de tomografía computarizada (TC) obtenida a nivel
del canal vertebral de L7-S1 en un puma (Puma concolor araucana)
adulto en donde se muestra evidente estrechamiento dorsoventral del
canal vertebral y una disminución de grasa epidural (flecha) (IW: alas
del ilion; ID: disco intervertebral L7-S1; SW: ala sacral; SCD: músculo
sacrocaudalis dorsalis lateralis derecho).
irrigated with sterile isotonic saline. After decompression
repair, sacral and caudal spinal nerves returned to their
normal anatomic positions. A fat graft harvested from the
subcutaneous tissue was placed into the defect of the la-
minectomy. Muscular, subcutaneous and skin planes were
closured routinely. All collected tissue was placed in 10%
buffered formalin for histologic examination. Postoperative
treatment included ketoprofen6 (1 mg/kg, q24h, I.M.), and
amoxicillin with clavulanic acid7 (7mg/kg, q24h, I.M.)
for five days. To minimize postsurgical complications the
animal was kept in a space-limited cage for two weeks. The
locomotion of the animal and the tail movements improved
within three days after surgery. In two weeks, the animal
recovered its normal ambulation and was moved to his
definitive captivity place. Histologic examination of the
tissue samples collected from the LF at surgery and stained
with hematoxilin-eosin revealed adipocytes surrounded
by abundant dense connective tissue, predominantly thick
collagen bands, moderate level of lymphocytes, neutrophils,
and erythrocytes infiltrates, and proliferation of blood
vessels (figure 2). In order to determine the composition
of the connective tissue found in the samples, two diffe-
rent stains were prepared: Heidenhain-Azan (H-A) and
Verhoeff stain targeting collagen fibers and elastic fibers,
respectively, also allowing the evaluation of the amount and
condition of these tissues. H-A stained samples indicated
abundant collagen band proliferation and scarce elastic
6 Ketofen, 10%, Merial SAS, Lyon F-69348 Cedex 07, France.
7 Mastilac, Pfizer Inc, New York, New York 10017 USA.
 cougar, laminectomy, ligamentum flavum, lumbosacral compression, Puma concolor
Figure 2. Tissue removed from L7-S1 by laminectomy in a puma
(Puma concolor araucana) revealing abundant dense connec-
tive tissue, mainly collagen bands, infiltrated by neutrophils,
lymphocytes, and erythrocytes. Haematoxylin & Eosin stain.
Scale bar = 60 μm.
Tejido removido del segmento L7-S1 por laminectomía en un puma.
Se observa abundante tejido conectivo denso, principalmente bandas
de colágeno, infiltrado neutrofílico, linfocitario y eritrocítico. Tinción
de hematoxilina y eosina. Barra de escala = 60 μm.
Figure 3. Tissue removed from L7-S1 by dorsal laminectomy
in a puma (Puma concolor araucana) showing irregular and
abundant collagen bands. Elastin fibers (light gray), usually in a
more equal ratio, are replaced by a proliferation of collagen fibers
(dark gray). Heidenhain-Azan stain. Scale bar = 60 μm.
Tejido removido del segmento L7-S1 por laminectomía en un puma
(Puma concolor araucana). La tinción Heidenhain-Azan permite observar
abundantes bandas de colágeno de distribución irregular. Usualmente,
las fibras de elastina (gris claro) se presentan a razón 1:1, sin embargo,
han sido reemplazadas por la proliferación de fibras de colágeno (gris
oscuro). Barra de escala = 60 μm.
fibers (figure 3). Additionally, Verhoeff stained samples
showed profuse collagen band proliferation. Based on these
findings, a DLSS caused by inflammation and hypertrophy
of LF was diagnosed.
DISCUSSION
Although DLSS lesions are commonly reported in the
canine patient (Sharp and Wheeler 2005), these conditions
are rarely reported in cats (Cariou et al 2008). Captive non
domestic felids, however, can be prone to spinal disease
because of inadequate exercise, obesity, and inappropriate
enclosure surfaces (Kolmstetter et al 2000). In dogs, the
most common causes of cauda equina compression are
age-related pathologic changes including DLSS (De Risio
et al 2005, Danielsson and Sjöström 1999). Degenerative
changes, such as soft tissue overgrowth of ligamentous
structures, are thought to result from the considerable
transfer of forces and high mobility of the lumbosacral
joint, mainly by flexion movements between L7 and the
sacrum (Sharp et al 2005, De Risio et al 2005). Degenerative
changes lead to compensatory skeletal changes such as
lumbosacral end plate sclerosis, articular facet osteophytes,
LF and joint capsule hypertrophy, and dorsal annulus
bulging, producing clinical problems by spinal cord or
spinal nerve compression (De Risio et al 2005). Animals
with DLSS show decreased lumbosacral mobility due, in
part, to LF hypertrophy compressing the cauda equina.
The termination of the spinal cord (conus medullaris) and
cauda equina apparently is variable in felines ranging from
caudal border of L7 vertebrae to the caudal border of S3
vertebrae (Dyce et al 2004). The LF also known as the
interacuate or yellow ligament connects the space between
the lamina of adjacent vertebrae. The extracellular matrix
of normal LF is composed of parallel elastin and collagen
fibers (e.g. in humans, elastin:collagen are in a 2:1 ratio)
(Kosaka et al 2007). The elastin fibers provide elasticity
and the collagen provides stiffness and stability (Kosaka et
al 2007). In cases of LF hypertrophy, this ratio decreases
resulting in a poor elasticity and augmented stiffness or
fibrosis (Kosaka et al 2007, Sairyo et al 2007). The causes
of LF hypertrophy are multifactorial and include age, ac-
tivity levels, and mechanical stress. Mechanical loading
causes minor injury of the LF inducing inflammation
and degeneration of the tissue. During wound healing,
inflammation leads to scar formation. In this case, there
was a notable increase in collagen and decrease in elastic
fibers, with a loss of the parallel arrangement of cells. The
latter change increases ligament volume and has also been
described in humans as age-related changes (Kosaka et
al 2007, Sairyo et al 2007, Schräder et al 1999). Fibrosis
is a type of scarring resulting from injury. This animal
with hypertrophied ligaments is, therefore, likely to have
suffered a stress- and age-related injury leading to scar
formation and clinical signs. Expression of inflammatory
cytokines, including COX-2, and IL-1, 6, 8, and 15, has
been detected in human LF tissue (Sairyo et al 2007).
Thus, future studies may be directed to determine whether
hypertrophy of LF in feline patients can be a controllable
condition at least to some extent, by controlling the scar
formation with drugs such as COX-2 inhibitors or steroids.
In conclusion, this report confirms degenerative changes
of the ligamentum flavum resulting in lumbosacral syn-
drome in a puma. These changes should be considered as
a differential diagnosis for pelvic limb paresis in elderly
patients and may be surgically managed in order to reduce
vertebral canal stenosis.
305
C Verdugo et al
SUMMARY
A 12-year-old adult, intact male puma (Puma concolor araucana)
was evaluated because of abnormal hind limb gait and paresis.
Neurological examination revealed a progressive paraparesis, bilateral
pelvic limb proprioceptive deficit and tail paralysis. Survey radiographs
and computed tomography (CT) were taken at the lumbosacral region
in order to determine possible causes. CT study confirmed a stenotic
vertebral canal at the L7/S1 level. A dorsal laminectomy was performed
in order to decompress the affected area. Histopathologic examination
of the harvested material revealed inflammation and hypertrophy of
the ligamentum flavum. Two weeks after the surgery, the puma showed
progressive neurologic improvement and normal ambulation.
REFERENCES
Cariou M, C Störk, A Petite, R Rayward.2008. Cauda equina syndrome
treated by lumbosacral stabilisation in a cat. Vet Comp Orthop
Traumatol 21, 462-466.
Danielsson F, L Sjöström. 1999. Surgical treatment of degenerative
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De Risio L, W Thomas, N Sharp. 2000. Degenerative lumbosacral stenosis.
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Kolmstetter C, L Munson, E Ramsay. 2000. Degenerative spinal disease
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of loss of elasticity and hypertrophy of lumbar ligamentum flavum
in elderly patients with lumbar spinal canal stenosis. Spine 32,
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Sairyo K, A Biyani, V Goel, D Leaman, R Booth, J Thomas, N Ebraheim,
I Cowgill, S Mohan. 2007. Lumbar ligamentum flavum hypertrophy
is due to accumulation of inflammation-related scar tissue. Spine
32, E340-E347.
Schräder PK, D Grob, BA Rahn, J Cordey, J Dvorak. 1999. Histology of
the ligamentum flavum in patients with degenerative lumbar spinal
stenosis. Eur Spine J 8, 323-328.
Sharp NJ, SJ Wheeler. 2005. Small Animal Spinal Disorders: Diagnosis
and Surgery. 2nd ed. Elsevier Mosby, Oxford, UK.
Arch Med Vet 43, 307-312 (2011)

COMUNICACIÓN

Efecto de tres ambientes de transporte sobre el tiempo de aparición de la autólisis

en muestras de alevines de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)

Effect of three transport conditions on the appearance time of autolysis in samples

of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss)

AR Ortloffa*, PA Peñaa, R Ildefonso

a Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile.

SUMMARY

The aim of this work was to compare three types of transport conditions on the appearance and progress of autolytic changes in samples of dead
fry sent to be processed for histopathological analysis. 300 whole fry corpses were subjected to three transport conditions: submerged in water at 4 °C,
submerged in water at 15 °C and dry atmosphere at 4 °C. Every hour from 0 to 24 hours, groups of 4 fry per condition were fixed in 10% formalin and
processed using the conventional hematoxylin and eosin stain technique (H&E). The appearance time of the autolytic changes in the different segments of
the kidney and liver were determined in each group, classifying the changes as early autolytic, advanced autolytic and complete autolysis. It was observed
that the autolytic changes appeared first in the livers of the corpses at 4 °C under dry condition while last ones to be affected were the corpses submerged
in water at 4 °C (1 and 6 hours, respectively). The first autolytic changes appeared in the kidneys of the corpses at 4 °C in the dry atmosphere and the
last in the corpses submerged in water at 4 °C (3 and 9 hours, respectively). It was concluded that out of the three transport conditions studied, the one
preserving for longer the histological and cytological structure of the fish tissue for histological analysis was water preservation at 4 °C, demonstrating
the key role of the temperature and atmospheric humidity in the progress of fish autolysis.

Palabras clave: trucha arcoíris, autólisis, histología.

Key words: rainbow trout, autolysis, histology.

INTRODUCCIÓN siguen cuatro etapas: el rigor mortis, la resolución del

En acuicultura se realizan muestreos de tipo sanitario,
epidemiológico y productivo. Los muestreos sanitarios
consisten en la extracción y envío de muestras de peces
enfermos (moribundos) o sanos a los laboratorios para
el diagnóstico de enfermedades. Debido a las grandes
distancias entre los laboratorios y los centros de cultivo es
frecuente que en el traslado de las muestras muchos peces
mueran, comenzando inmediatamente con el proceso de
autólisis de los tejidos. Una de las técnicas diagnósticas
usadas en la acuicultura es el análisis histopatológico
de peces enfermos, siendo fundamental conocer si las
alteraciones tisulares observadas corresponden a lesiones
propias de una enfermedad o corresponden a cambios
autolíticos producidos en los peces que han muerto en el
trayecto (Tomita y col 2004).
La investigación histológica juega un rol importante en
el examen post mórtem para dilucidar la causa y mecanis-
mo de muerte y/o lesiones. En este contexto, al momento
de evaluar deben tenerse en consideración los cambios
autolíticos dependientes de condiciones ambientales como
temperatura y humedad (Janssen 1984, Tomita y col 2004).
Los cambios post mórtem en los peces habitualmente
Aceptado: 07.04.2011.
* Casilla 15 D, Temuco, Chile; aortloff@uct.cl
mismo, autólisis y la descomposición bacteriana. Estas
etapas se producen con mayor o menor rapidez, depen-
diendo de la especie, el estado fisiológico de los peces, la
contaminación microbiana y la temperatura (Ayala y col
2010, Ocaño-Higuera y col 2009).
La autólisis celular es el proceso de desintegración que
comienza luego de producida la muerte y en el cual no
existe participación de bacterias, dependiendo sólo de la
acción de las enzimas celulares (Trezza 2006). La autólisis
de tejido normal producida en un individuo muerto se
diferencia de la necrosis producida en individuos vivos,
debido a que la primera es difusa y no involucra a células
inflamatorias (Tomita y col 1999, 2004). En la autólisis,
la secuencia de eventos que se generan comienza con el
déficit celular de oxígeno, produciendo daños irreversibles
en la estabilidad de la membrana celular, en la síntesis de
proteínas, la cadena respiratoria celular y en el material
nuclear. La desestabilización estructural de las membranas
celulares y de sus organelos genera profundos cambios en
el intercambio iónico y de fluidos, los que adicionados a
los cambios hidroelectrolíticos y del pH celular alteran
progresivamente las estructuras de los organelos citoplas-
máticos, generando la liberación de enzimas hidrolíticas
al citoplasma conllevando la digestión de los distintos
constituyentes celulares. Este proceso depende de diversos
factores como el tipo de tejido y la condición nutricional
previa del sujeto, entre otros (Trezza 2006).

307
AR Ortloff y col
En mamíferos se han descrito la morfología y la ul-
traestructura de los cambios post mórtem producidos bajo
distintas condiciones de temperatura para diversos órganos
(Ilse y col 1979, Andersson y Collins 1983, El-Shennawy
y col 1985, Cingolani y col 1994, Tomita y col 1999).
En el caso de los peces se han realizado varios estudios
que evalúan los cambios post mórtem, específicamente
en el músculo esquelético, por ser este órgano de interés
comercial (Caballero y col 2009, Ocaño-Higuera y col
2009, Ayala y col 2010). Sin embargo, no existen estudios
que determinen y caractericen en el tiempo, bajo condi-
ciones controladas, la aparición del proceso de autólisis
en órganos de interés sanitario.
Este estudio comparó tres condiciones ambientales
de transporte de alevines, analizando histológicamente el
tiempo de aparición de los procesos autolíticos en tejido
renal y hepático.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material biológico
Se utilizaron 300 alevines de trucha arcoíris (Oncorhyn-
chus mykiss) con un peso promedio de 1 gr adquiridos de
una piscicultura ubicada en Región de La Araucanía (Chile),
la cual presentaba mortalidades promedio de 0,01%/día.
Los ejemplares fueron mantenidos en el laboratorio de
Ictiopatología de la Universidad Católica de Temuco en
estanques de fibra de vidrio, bajo las mismas condicio-
nes de cultivo relacionados con la densidad (20 kg/m3),
temperatura del agua (10 °C) y horas/luz (24 horas). Los
peces fueron mantenidos en aclimatación durante 24 h,
tiempo en el cual se mantuvieron en ayuno. Posterior a
la aclimatación, se procedió a extraer los peces de forma
individual, realizando la eutanasia mediante contusión
cerebral aguda. Las muestras se distribuyeron en tres
grupos según las distintas condiciones ambientales de
transporte estudiadas.
Condiciones ambientales de transporte y
conservación
Se compararon tres condiciones ambientales de trans-
porte de muestras de alevines sin fijar: (i) Alevines muertos
sumergidos en agua de la piscicultura mantenidos a 4 °C,
(ii) alevines muertos sumergidos en agua de la piscicultura
a temperatura ambiente constante de 15 °C y (iii) alevines
muertos almacenados sin agua (seco) en ambiente refrige-
rado a 4 °C. Las condiciones ambientales (i) y (iii) fueron
conservadas a 4 °C en un refrigerador, con monitoreo de
la temperatura por medio de un termómetro de máxima y
mínima, asegurándose que la temperatura se mantuviera
constante y con una fluctuación de ± 1 °C durante todo el
experimento. Las tres condiciones intentan recrear situa-
ciones de transporte de muestras en terreno, y se basaron
en los siguientes criterios: i) 4 °C es la temperatura en la
308
que frecuentemente están los equipos de refrigeración,
por lo que es probable que al momento de enviar muestras
desde el centro de cultivo hasta el laboratorio se procure
mantener esta temperatura mediante el uso de hielo y otro
elemento que mantenga el frío en el transporte. ii) 15 °C
es la temperatura ambiental promedio a la que se mantiene
el agua cuando es transportada sin un medio refrigerante
(esto fue registrado empíricamente transportando agua
de una piscicultura en buses de servicio regular de enco-
mienda), por lo que representa otra condición probable de
transporte en la práctica cuando no se cuenta con hielo u
otro elemento que mantenga el frío. iii) 4 °C sin agua (en
seco) es una condición de transporte utilizada para enviar
muestras cuando las empresas de encomienda no aceptan
transportar medios líquidos, por lo que las muestras son
transportadas en seco y con elementos de enfriamiento.
Obtención de muestras, procesamiento y criterios
de análisis
Para cada condición descrita anteriormente se extrajeron
cuatro alevines (cuadruplicado) al tiempo cero (controles)
y cada hora hasta la hora 24. A los cuatro cadáveres de
alevines de cada muestreo se les realizó una incisión en la
región ventral para favorecer la penetración de la solución
fijadora (formalina tamponada al 10%), siendo mantenidos
en contenedores rotulados durante 48 h. Una vez fijados
todos los cadáveres, fueron procesados simultáneamente
mediante técnica histológica convencional (Kiernan 2008).
Durante el proceso de inclusión, los cadáveres de alevines
fueron orientados longitudinalmente, a fin de obtener sec-
ciones histológicas que permitan la observación de todos
los órganos ubicados medial y paramedialmente. Para esto
se seleccionaron tres cortes de 5 µm de grosor (uno medial
y dos paramediales) que en conjunto tenían secciones de
hígado, riñón, estómago, intestinos y ciegos pilóricos.
Los cortes fueron montados en portaobjetos y teñidos con
tinción convencional de hematoxilina y eosina. De cada
corte histológico se analizó hígado completo (superficie en
contacto con pared abdominal y cara medial en contacto
con estómago) y riñón (región anterior, media y posterior).
Se analizaron la preservación de la arquitectura histológica
del órgano, las características citoplasmáticas y nucleares
de los hepatocitos, de las células epiteliales de los túbulos
contorneados, tejido hematopoyético y eritrocitos. Como
signo de autólisis se consideró: (i) el incremento de la
eosinofilia citoplasmática, (ii) presencia de núcleos con
cromatina condensada, o con cariólisis, (iii) tumefacción
del citoplasma y (iv) pérdida del detalle estructural de las
células, así como de sus límites nuclear y citoplasmático.
Se definieron arbitrariamente tres estados de au-
tólisis: i)  Autólisis temprana: en riñón, se caracterizó
porque la mayoría de los túbulos contorneados distales y
proximales cortados transversalmente presentaban hasta
cuatro células con núcleo con cromatina condensada y/o
cariorrexis, aumento de la eosinofilia citoplasmática si se
 trucha arcoíris, autólisis, histología

comparaba con las vecinas, se mantenía la unión entre las
células epiteliales tubulares y la arquitectura del órgano se
conservaba, reconociéndose las unidades estructurales y
funcionales. En el hígado se analizó en aumento 100X y
este estado se caracterizó por la presencia de eritrocitos
con núcleo con cromatina condensada y hemólisis, y
menos del 15% de los hepatocitos por campo con núcleo
con cromatina condensada, cariorrexis y/o cariólisis y
eosinofilia citoplasmática. Los límites citoplasmáticos
de los hepatocitos se mantenían definidos. ii) Autólisis
avanzada: en riñón se caracterizó porque la mayoría de
los túbulos contorneados distales y proximales cortados
transversalmente presentaban más de cuatro núcleos con
cromatina condensada y/o con cariorrexis, aumento de la
eosinofilia citoplasmática y pérdida de la unión entre cé-
lulas epiteliales. Los límites citoplasmáticos se mantenían
definidos. En hígado se caracterizó porque más del 15%
de los hepatocitos tenían cambios nucleares y citoplasmá-
ticos autolíticos, sin embargo fue posible reconocer los
límites citoplasmáticos que definían un hepatocito. iii)
Autólisis completa: en el riñón se caracterizó por la severa
distorsión de la arquitectura histológica, reconociéndose
sólo vestigios de las principales estructuras renales. No
fue posible reconocer células individualmente, las cuales
aparecieron como estructuras eosinófilas amorfas. Las
células del tejido hematopoyético se reconocieron, pero no
fue posible su caracterización e identificación. El hígado
se caracterizó por la severa distorsión de la arquitectura
histológica, reconociéndose sólo vestigios de las principales
estructuras hepáticas. En la mayoría de los cortes no fue
posible reconocer en detalle hepatocitos individualmente,
los cuales aparecieron como estructuras eosinófilas amorfas,
con restos basófilos que correspondían al núcleo.
Análisis de las muestras histológicas
El análisis de las muestras histológicas fue realizado
con un microscopio marca Olympus modelo BX-41, las
imágenes fueron capturadas con una cámara marca Jenoptik
modelo ProgRes C3, y el análisis de imágenes se realizó con
el software ProgRes® Mac CapturePro 2.7.6. El análisis
de las imágenes consistió en la identificación y el conteo
de núcleos con cambios autolíticos para clasificar a la
muestra dentro de los tres estados de autólisis.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el cuadro 1 se presentan los distintos tiempos de
aparición de los cambios autolíticos en riñón e hígado en
los tres tratamientos.
Riñón
Se observaron diferencias en cuanto a los tiempos de
aparición de los cambios autolíticos entre las tres regiones
del riñón. Independiente de la condición ambiental evaluada,
en las regiones media y posterior del riñón los cambios
autolíticos se presentaron en el mismo período de tiempo,
a diferencia del riñón anterior, cuyos cambios autolíticos
aparecieron una hora antes, patrón que se repitió en las
tres condiciones ambientales (cuadro 1). Las caracterís-
ticas morfológicas de los tres períodos de autólisis que se

Cuadro 1. Tiempo de aparición de los cambios autolíticos tempranos, avanzados y autólisis completa entre los tres ambientes de
transporte: sumergidos agua a 4 °C (A); sumergidos agua a 15 °C (B); ambiente seco a 4 °C (C).
Appearance time of the early and advanced autolytic changes and complete autolysis in the three transport atmospheres: submerged water
at 4 °C (A); submerged water at 15 °C (B); dry atmosphere at 4 °C (C).

PROCESO DE AUTÓLISIS
Órgano Temprana Avanzada Completa
Hígado cara medial 5h 20 h 23 h
Hígado cara lateral 6h 21 h 24 h
A Riñón anterior 8h 14 h 17 h
AMBIENTE DE TRANSPORTE

Riñón medio 9h 15 h 18 h
Riñón posterior 9h 15 h 18 h
Hígado cara medial 2h 14 h 17 h
Hígado cara lateral 3h 15 h 18 h
B Riñón anterior 5h 11 h 14 h
Riñón medio 6h 12 h 15 h
Riñón posterior 6h 12 h 15 h
Hígado cara medial 1h 5h 8h
Hígado cara lateral 1h 6h 9h
C Riñón anterior 2h 8h 11 h
Riñón medio 3h 9h 12 h
Riñón posterior 3h 9h 12 h

309
AR Ortloff y col

definieron para el riñon pueden observarse en la figura 1:
autólisis temprana (figura 1a, d, g), autólisis avanzada
(figura 1b, e, h) y autólisis completa (figura 1c, f, i).
Hígado
En la región medial del hígado, que está en estrecho
contacto con el estómago, los cambios autolíticos aparecen
aproximadamente una hora antes si se compara con otras
regiones del mismo órgano (para comparar los tiempos,
ver cuadro 1). Este patrón se repitió en las tres condiciones
ambientales. Las características morfológicas de los tres
períodos de autólisis que se definieron para el hígado pueden
observarse en la figura 1: autólisis temprana (figura 2a, d,
g), autólisis avanzada (figura 2b, e, h) y autólisis completa
(figura 2c, f, i).

Figura 1. Cortes histológicos de la región anterior de riñones de alevines de trucha arcoíris. a, d, g: Cambios autolíticos tempranos de
alevines mantenidos sumergidos en agua a 4 °C (8 h), sumergidos en agua a 15 °C (5 h) y en ambiente seco a 4 °C (2 h), respectivamente.
Túbulo contorneado con estructura histológica conservada, célula epitelial con eosinofilia citoplasmática y núcleo con concentración de
la cromatina (flecha). Inserto: riñón fijado inmediatamente después de la muerte (control). b, e, h: Cambios autolíticos avanzados de
cadáveres de alevines mantenidos sumergidos en agua a 4 °C (14 h), sumergidos en agua a 15 °C (11 h) y en ambiente seco a 4 °C (8
h), respectivamente. Aumento en el número de células con núcleo con su cromatina concentrada (flecha) y desprendimiento de células
epiteliales tubulares, desorganizando parcialmente la estructura histológica renal. c, f, i: Autólisis completa de cadáveres de alevines
mantenidos sumergidos en agua a 4 °C (17 h), sumergidos en agua a 15 °C (14 h) y en ambiente seco a 4 °C (11 h), respectivamente.
Estructura histológica está completamente alterada, las células aparecen como estructuras eosinófilas amorfas sin detalle ni límite
citoplasmático definido. (H&E); Escala: 20 µm.
Histological cuts of rainbow trout fry kidneys. a, d, g: Early autolytic changes in fry corpses maintained submerged in water at 4 °C (8 h),
submerged in water at 15 °C (5 h) and in a dry atmosphere at 4 °C (2 h), respectively. Convoluted tubuli with histological structure preserved, epithelial
cell with cytoplasmic eosinophilia and nucleus with concentration of chromatin (arrow). Insert: Kidney fixed immediately after death (control). b, e, h:
Advanced autolytic changes in fry corpses maintained submerged in water at 4 °C (14 h), submerged in water at 15 °C (11 h) and in a dry atmosphere
at 4 °C (8 h), respectively. Increase in the number of cells with nucleus with its chromatin concentrated (arrow) and detachment of tubular epithelial
cells, partially disrupting the histological structure of the kidney. c, f, i: Complete autolysis in fry corpses maintained submerged in water at 4 °C (17 h),
submerged in water at 15 °C (14 h) and in a dry atmosphere at 4 °C (11 h), respectively. Histological structure is completely altered, the cells appear as
amorphous eosinophilic structures with no detail or defined cytoplasmic limit. (H&E); Scale: 20 µm.

310
 trucha arcoíris, autólisis, histología

Figura 2. Cortes histológicos de región lateral de hígados de alevines de trucha arcoíris. a, d, g: Cambios autolíticos tempranos de
cadáveres de alevines mantenidos sumergidos en agua a 4 °C (6 h), sumergidos en agua a 15 °C (3 h) y en ambiente seco a 4 °C (1 h),
respectivamente. Cromatina concentrada en núcleo de eritrocitos (flecha) y leve tumefacción de los hepatocitos. La estructura histo-
lógica está conservada. Inserto: hígado fijado inmediatamente después de la muerte (control). b, e, h: Cambios autolíticos avanzados
de cadáveres de alevines mantenidos sumergidos en agua a 4 °C (21 h), sumergidos en agua a 15 °C (15 h) y en ambiente seco a 4 °C
(6 h), respectivamente. Aumento en el número de células con eosinofilia citoplasmática, núcleo con cromatina concentrada (flecha)
y/o agregación de la cromatina en el borde del núcleo. Pérdida parcial de la estructura histológica hepática. c, f, i: Autólisis completa
de cadáveres de alevines mantenidos sumergidos en agua a 4 °C (24 h), sumergidos en agua a 15 °C (18 h) y en ambiente seco a 4 °C
(9 h), respectivamente. Estructura histológica completamente alterada, la mayoría de las células aparecen como estructuras eosinófilas
amorfas sin detalle ni límite citoplasmático definido. (H&E); Escala: 20 µm.
Histological cuts of rainbow trout fry livers. a, d, g: Early autolytic changes in fry corpses maintained submerged in water at 4 °C (6 h),
submerged in water at 15 °C (3 h) and in a dry atmosphere at 4 °C (1 h), respectively. Erythrocytes with nuclear concentration of chromatin (arrow),
slight swelling of hepatocytes with histological structure preserved. Insert: Liver fixed immediately after death (control). b, e, h: Advanced autolytic
changes in fry corpses maintained submerged in water at 4 °C (21 h), submerged in water at 15 °C (15 h) and in a dry atmosphere at 4 °C (6 h), respec-
tively. Increase in the number of cells with citoplasmic eosinopfilia with its nuclear chromatin concentrated (arrow) and/or aggregation of chromatin in
the nuclear border, partially disrupting the histological structure of the liver. c, f, i: Complete autolysis in fry corpses maintained submerged in water
at 4 °C (24 h), submerged in water at 15 °C (18 h) and in a dry atmosphere at 4 °C (9 h), respectively. Histological structure is completely altered, the
cells appear as amorphous eosinophilic structures with no detail or defined cytoplasmic limit. (H&E); Scale: 20 µm.

Se observó que los cambios autolíticos, tanto en hígado
como riñón, se presentaron primero en los cadáveres de
alevines que fueron mantenidos a 4 °C en ambiente seco,
seguido por el grupo de alevines mantenidos sumergidos
en agua a temperatura ambiente de 15°C. El grupo que
mantuvo por más tiempo la integridad histológica fue el
de los cadáveres mantenidos sumergidos en agua a 4 °C.
Estos resultados podrían explicarse en parte porque la tem-
peratura ambiental influye directamente en la temperatura
corporal de los peces. Cuando la temperatura es baja, el
pH se mantiene elevado por más tiempo y el metabolis-
mo celular disminuye, resultando en una autólisis más
lenta (Berka 1986, Gunn 2009). Complementariamente
a la temperatura se debe considerar el efecto que posee

311
AR Ortloff y col
la sumersión en agua o humedad de las muestras. Para
muestras sumergidas, la descomposición es dos veces
más lenta que si estuvieran expuestas al aire, debido a
que el oxígeno es necesario en los procesos oxidativos de
la descomposición, siendo la concentración menor en el
agua que en el aire (Dent y col 2004, Gunn 2009). Si bien
el fenómeno de descomposición es diferente a la autólisis,
ambos procesos ocurren casi en forma simultánea, espe-
cialmente en cuerpos de menor superficie en ambientes
con abundante flora bacteriana saprófita, y los efectos de
uno de estos fenómenos influyen sobre el desarrollo del
otro. Posiblemente en las muestras del ambiente frío y
seco el efecto del ambiente aerobio predominó sobre el
efecto retardante de la temperatura baja, aumentando la
velocidad de descomposición y autólisis de las muestras.
Adicionalmente se observó que el proceso de autólisis
comienza antes en el tejido hepático y riñón anterior que en
el tejido renal medio y posterior. Esto podría explicarse por
la estrecha relación anatómica topográfica entre el hígado
(región medial) y riñón anterior con el estómago, el cual
se observó desintegrado y con su contenido libre por lo
menos una hora antes de que se observaran los primeros
cambios tanto en hígado como en riñón. Esto facilitaría la
autólisis y descomposición, especialmente en las regiones
con mayor contacto debido a la actividad química y enzimá-
tica del contenido gástrico post mórtem (Trezza 2006). En
este mismo contexto, el riñón se mantiene por más tiempo
aislado anatómicamente del aparato digestivo por medio
de la vejiga natatoria, impidiendo momentáneamente el
contacto con las enzimas digestivas de los jugos gástricos
en las primeras etapas post mórtem, las cuales aceleran
los procesos de descomposición y autólisis.
De acuerdo con los resultados de este estudio se concluye
que, para condiciones de terreno en las que no se disponga
de métodos químicos de fijación de tejidos, las muestras
de alevines vivos, agónicos o muertos destinadas a análisis
histopatológico se transporten sumergidos en agua a 4 °C,
siendo fijados al llegar al laboratorio de análisis antes de
los tiempos de autólisis descritos en el cuadro 1.
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue comparar el efecto de tres tipos de
ambiente de transporte sobre el tiempo de aparición y progreso de los
cambios autolíticos de muestras de alevines muertos, enviados para
ser procesados para análisis histopatológico. Para ello se depositaron
300 cadáveres de alevines completos en tres ambientes de transporte:
sumergidos agua a 4 °C, sumergidos agua a 15 °C y ambiente seco a
4 °C. Cada una hora, desde el tiempo cero hasta las 24 horas, grupos de
4 alevines por ambiente fueron fijados en formalina al 10% y procesados
con la técnica histológica convencional de hematoxilina&eosina. En
312
todos los grupos se determinó el tiempo de aparición de los cambios
autolíticos en los distintos segmentos del riñón e hígado, clasificándose
en cambios autolíticos tempranos, avanzados y autólisis completa. Se
observó que los cambios autolíticos se evidencian primero en los hígados
de los cadáveres a 4 °C en ambiente seco y al último en los cadáveres
sumergidos en agua a 4 °C (1 y 6 horas, respectivamente). Respecto al
riñón, los primeros cambios autolíticos se presentaron en cadáveres a
4 °C en ambiente seco y al último en los cadáveres sumergidos en agua
a 4 °C (3 y 9 horas, respectivamente). De este estudio se concluye que
de los tres ambientes de transporte comparados, el que conserva por más
tiempo la estructura histológica y citológica de los tejidos de los peces
para análisis histológico es la conservación sumergidos en agua a 4 °C,
evidenciando el rol clave de la temperatura y humedad ambiental en el
progreso de la autólisis de peces.
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COMUNICACIÓN

Uso de concentrados autólogos de plaquetas intraarticulares como coadyuvantes

en el tratamiento quirúrgico de la rotura del ligamento cruzado anterior en una perra

Use of intra-articular autologous platelet concentrates as coadjutants in the surgical treatment

of a cranial cruciate ligament rupture in a bitch

RF Silva*a,b, CMF Rezendeb, JU Carmonaa

aGrupo de Investigación Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.
bEscola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

SUMMARY

Cranial cruciate ligament rupture (CCLR) is one of the main orthopedic problems that could produce hind limb lameness in dogs. Even though
this problem can be surgically treated the development and progression of osteoarthritis are typical features. A case of a dog that received postoperative
intra-articular injections of autologous platelet concentrates (APCs) after the surgical reparation of a CCLR is described. The clinical, radiographic,
and gait analysis results could potentially support the postoperative use of intra-articular injections of APCs as an adjunctive therapy in the CCLR
surgical reparation.

Palabras clave: perro, rotura del ligamento cruzado anterior, plasma rico en plaquetas, terapia regenerativa.
Key words: dog, cranial cruciate ligament rupture, platelet rich plasma, regenerativ therapy.

INTRODUCCIÓN artropatías en caballos (Carmona y col 2009) y seres hu-

La rotura del ligamento cruzado anterior (RLCA) es
causa frecuente de cojera en perros (Johnson y col 1994,
Vasseur 2003). Las técnicas quirúrgicas más utilizadas para
tratar esta enfermedad son la estabilización extracapsular
o intracapsular y técnicas modificadoras de la biomecá-
nica de la articulación femoro-tibio-rotuliana (Kim y col
2008). Sin embargo, independientemente del tratamiento
quirúrgico realizado, son frecuentes la impotencia funcio-
nal del miembro afectado y la aparición y progresión de
osteoartritis (OA) de la articulación femoro-tibio-patelar
(Elkins y col 1991, Hurley y col 2007).
Los concentrados autólogos de plaquetas (APCs)
–también conocidos como plasma rico en plaquetas
(PRP)– son una fuente autóloga de factores de crecimien-
to, principalmente factor de crecimiento transformante β
(TGF-β), factor de crecimiento derivado de las plaquetas
(PDGF) y de otras proteínas que modulan la inflamación
y la cicatrización (Carmona y col 2009). Los APCs han
sido evaluados experimentalmente y han sido empleados
clínicamente en diferentes campos de la medicina humana
y veterinaria, con el fin de disminuir la inflamación y dolor
posoperatorios, acelerar la cicatrización y producir la rege-
neración de los tejidos afectados (Carmona y Prades 2009).
Resultados recientes han indicado que los APCs pueden
ser empleados de manera segura para el tratamiento de
Aceptado: 02.06.2011.
* Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Colombia; raul.silva@ucaldas.edu.co
manos (Kon y col 2009, Filardo y col 2010). La inyección
intraarticular de APCs reduce el dolor y mejora la función
articular durante periodos de tiempo prolongados y con
efecto superior al producido por terapia convencional
(Carmona y col 2009). Solo se ha descrito el uso de APCs
como coadyuvante en el manejo artroscópico de una lesión
de osteocondritis disecante del hombro en un perro con
excelentes resultados (Neumann y Viefhues 2010).
El objetivo de este artículo es describir el uso de APCs,
obtenidos mediante el método del tubo (Silva y col 2011),
como tratamiento coadyuvante en un caso de RLCA en
un canino, que fue operado mediante técnica quirúrgica
artroscópica para reemplazar el ligamento por injerto au-
tólogo de fascia lata. Lo novedoso de este reporte estriba
en los buenos resultados obtenidos en la deambulación
en plataforma de fuerza y en el retraso en la progresión
de cambios radiológicos degenerativos articulares en
comparación con controles históricos.
MATERIAL Y MÉTODOS
DESCRIPCIÓN DEL CASO CLÍNICO
Una perra intacta SharPei de 19 meses de edad y con
19,5 kg, fue evaluada por cojera unilateral del miembro
posterior derecho con 7 días de duración, tras haber sufrido
una caída desde una altura 1,5 m. En el examen clínico
se detectaron positivas las pruebas del cajón anterior
(con desplazamiento de ~5 mm) y de compresión tibial.
Se realizó una artroscopia para confirmación diagnóstica

313
RF silva y col
de RLCA y tratamiento quirúrgico mediante reemplazo
del ligamento cruzado anterior por injerto de fascia lata
(Muzzi y col 2009). Después de la cirugía, la paciente
recibió carprofeno 2,2 mg/kg, cada 24 horas, y cefalexi-
na 20 mg/kg cada 12 horas, ambos por vía oral, durante
7 días. Se realizó inyección intraarticular de APCs como
tratamiento postoperatorio coadyuvante. La paciente fue
evaluada en el tiempo para determinar la evolución de los
cambios radiológicos asociados con la posible instauración
y evolución de un cuadro de osteoartritis (OA) de rodilla
y evaluación objetiva de marcha en plataforma de fuerza
para determinar las fuerzas de apoyo verticales de cada
miembro.
OBTENCIÓN Y USO DE LOS CONCENTRADOS AUTÓLOGOS
DE PLAQUETAS
Los APCs fueron preparados de manera aséptica,
según la técnica descrita por Silva y col (2011). Se obtuvo
sangre de la paciente mediante venopunción safena con
un catéter mariposa 21 G (Shandong Weigao Group,
China). La sangre fue depositada en 2 tubos de 8,5 mL
con 1,5  mL de solución A de ACD (citrato de trisodio
(22 g/L), ácido cítrico (8 g/L) y dextrosa (24,5 g/L)) (BD,
New Jersey, USA). La sangre fue centrifugada a 191 g
durante 6 minutos. Con la ayuda de una aguja espinal
18G se recolectó 1 mL de plasma adyacente a la interfaz
eritrocitos-plasma. Los APCs fueron analizados mediante
hemograma automatizado (Abacus Junior Vet, Austria) y
comparados contra los valores celulares de la sangre entera
mediante una prueba T para muestras apareadas con un
nivel de significancia del 95%.
Tres dosis de 1,5 mL de APC fueron inyectadas vía
intraarticular con un intervalo de dos semanas entre cada
aplicación. La primera inyección fue efectuada al final del
procedimiento quirúrgico. El volumen de APC aplicado
fue igual a la cantidad de líquido sinovial retirado antes
de la artroscopia. Los APCs fueron activados con glu-
conato de calcio (–9,3 mg/mL–) (Ropsohn Therapeutics
Ltda®, Bogotá, Colombia) en una relación 10:1 antes de
ser inyectados en la articulación.
EVALUACIÓN RADIOGRÁFICA
La evaluación radiográfica de la rodilla afectada se
realizó antes de la cirugía y a los quince, treinta, sesenta,
noventa y 150 días posoperatorios. La articulación femoro-
tibio-rotuliana fue evaluada en las posiciones medio-lateral
y craneocaudal. Los signos radiográficos de OA fueron
analizados mediante la escala de Innes y col (2004), en
la que se evalúan 4 parámetros: efusión articular (0-2),
osteofitosis (0-3), mineralización intraarticular (0-2) y
esclerosis subcondral tibial (0-1). La puntuación global
de severidad de la enfermedad es obtenida mediante la
suma y promedio de los valores de cada parámetro. En
este sentido, 0 es normal y 3 es osteoartritis grave.
314
EVALUACIÓN DE APOYO EN PLATAFORMA DE FUERZA
La evaluación de la marcha (para determinar el grado
objetivo de cojera –dolor–) fue evaluada con una pla-
taforma de fuerza ubicada en una pista de marcha de 3
metros de longitud, 50 cm de ancho y 10 cm de altura. Las
fuerzas verticales de reacción del suelo que actúan entre
el miembro y la plataforma de fuerza fueron evaluadas en
la fase de apoyo del ciclo de marcha. La paciente caminó
a su propio ritmo (velocidad media 1,73 ± 0,44 m/s). La
velocidad de marcha fue calculada con base en el tiempo
de ciclo de la extremidad posterior izquierda, mediante
la fórmula: velocidad = frecuencia (ciclos/s) x amplitud
(m) (Bertram y Ruina 2001), para lo cual se utilizó una
videocámara a 60 Hz (Sony DCR-SX63, China). Se evalua-
ron tres ciclos válidos por cada extremidad. Se consideró
como ciclo válido el apoyo ipsilateral de los miembros.
Los datos fueron adquiridos a una velocidad de 300 Hz y
procesados con el programa DasyLab 10 (Measurement
Computing, USA).
Los valores evaluados fueron el pico de fuerza vertical
(Pfz) y el impulso vertical (Ifz). Estos fueron normalizados
a la masa corporal (N/kg y N/kg/s, respectivamente). Cada
variable se expresó como porcentaje del total de la fuerza-
impulso ejercido por todos los miembros mediante el uso de
la fórmula: X%(miembro A) = F(miembro A) / (F(miembro A)+F(miembro
B)+F(miembro C)+F(miembro D)) (Katic y col 2009), donde X%
representa el porcentaje de masa corporal distribuido a
través del miembro; miembros A, B, C y D representan
los cuatro miembros del perro y F representa el valor de
fuerza-impulso evaluado del miembro correspondiente.
Se calculó la media del valor de los tres ciclos de marcha
por miembro para la normalización de las variables y
se utilizó este valor para realizar los análisis. El análisis
cinético fue realizado durante los mismos tiempos que
fueron empleados para la evaluación radiográfica.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La paciente no mostró ninguna complicación sisté-
mica o local asociada con los sitios de incisión o con la
inyección intraarticular de los APCs. Los APCs presen-
taron un conteo plaquetario estadísticamente (P = 0,001)
superior (707,633 ± 22,354 plaquetas/µL), respecto a los
conteos de plaquetas en sangre entera (389,333 ± 13,456
plaquetas/µL). El conteo de leucocitos fue estadísticamente
(P = 0,001) inferior en los APCs (9016±367 células/ µL)
respecto al número de leucocitos presentes en sangre entera
(11,146 ± 234 células/ µL). Estos valores concuerdan con
los resultados para concentrar plaquetas caninas con el
método del tubo (Silva y col 2011).
Los registros de la evaluación radiográfica mediante
la escala de Innes y col (2004) fueron semejantes antes
de la cirugía y a los 15, 30, 60 y 150 días posoperatorios
(figura 1). En todos los momentos la puntuación de los
parámetros radiográficos evaluados fue cero. Esto indica
 perro, rotura del ligamento cruzado anterior, plasma rico en plaquetas, terapia regenerativa

Cuadro 1. Valor medio de pico de fuerza vertical e impulso

vertical en las cuatro extremidades y porcentaje de cada fuerza
ejercida por cada miembro, antes del tratamiento quirúrgico y
hasta 150 días posoperatorios.
Mean peak vertical force and vertical impulse in all
the limbs and percentage of each force exerted by each limb,
before surgery and up to 150 postoperative days.

Variable Tiempo (días) MAD MAI MPD* MPI

Valor medio 6,80 6,53 1,40 4,93
0
DMC % 34,6 33,2 7,1 25,1
Valor medio 7,54 8,51 3,45 7,30
15
DMC % 28,1 31,8 12,9 27,2
Valor medio 7,91 8,47 3,73 6,05
30
Pfz DMC % 30,2 32,4 14,3 23,1
N/kg Valor medio 5,94 6,38 3,85 4,39
60
DMC % 28,9 31,1 18,6 21,4
Figura 1. Radiografías craneocaudales (A, B y C) y medio
Valor medio 6,74 6,40 4,19 4,66
laterales (D, E y F) de la paciente, antes (A y D) y a los 60 (B y 90
DMC % 30,6 29,1 19,1 21,2
E) y 150 (C y F) días posoperatorios.
Valor medio 7,62 7,16 5,30 5,40
Cranio-caudal (A, B, and C) and medial-lateral (D, E, and 150
F) radiographs of the patient, before (A and D) and 60 (B and E) and DMC % 29,9 28,1 20,8 21,2
150 (C and F) postoperative days.
Valor medio 1,80 2,34 0,37 1,44
0
DMC % 30,3 39,3 6,2 24,2
que no se presentaron signos radiológicos de OA hasta Valor medio 1,41 1,37 0,48 0,99
15
el momento de haber tomado la última proyección (150 DMC % 33,1 32,3 11,4 23,2
días posoperatorios). Valor medio 1,22 1,53 0,49 0,83
La evaluación de la locomoción en la plataforma de 30
Ifz DMC % 30,0 37,5 12,0 20,5
fuerza indicó que los valores de Pfz e Ifz comenzaron a N/kg/s Valor medio 1,74 1,85 0,91 1,03
homogeneizarse desde el 15º día posoperatorio, hasta 60
DMC % 31,5 33,4 16,5 18,6
alcanzar finalmente valores muy iguales entre miembros Valor medio 1,65 1,81 0,93 1,01
contralaterales a los 90 días posoperatorios. Antes de la ci- 90
DMC % 30,6 33,5 17,2 18,7
rugía, la distribución porcentual de la masa corporal respecto Valor medio 1,26 1,63 0,80 0,94
a los valores de Pfz presentaron una distribución del 68% 150
DMC % 27,2 35,3 17,2 20,3
hacia los miembros anteriores y del 25% hacia el miembro
contralateral. Estos porcentajes de apoyo comenzaron a MAD: miembro anterior derecho, MAI: miembro anterior izquierdo,
presentar un comportamiento homogéneo desde los 15 días MPD: miembro posterior derecho, MPI: miembro posterior derecho.
DMC: Distribución de masa corporal. *Miembro tratado.
posoperatorios y fueron muy similares entre los miembros
contralaterales a los 90 días posoperatorios (cuadro 1).
Los resultados clínicos, radiográficos y cinemáticos corregir la misma enfermedad. Cabe aclarar que en esa
observados en la paciente de este estudio fueron excelentes investigación sólo fueron tomadas dos radiografías, una
y por tal motivo los autores decidieron reportar el uso de antes del tratamiento quirúrgico y otra 8 semanas después,
APCs como tratamiento coadyuvante de la reparación por lo que no se descarta que los signos radiológicos de
quirúrgica de la RLCA en este caso. Las razones que hacen OA pudieron haberse presentado antes de la octava semana
de este reporte un hecho relevante en clínica ortopédica (Hurley y col 2007). Según la experiencia clínica de los
canina son las siguientes: autores con la técnica de reparación artroscópica (Muzzi y
1) Es poco habitual encontrar una articulación de col 2009), es normal encontrar cambios osteoartríticos en
rodilla canina reparada de RLCA sin ninguna evidencia las rodillas operadas a las 2 semanas posoperatorias. Por
radiológica de OA a los 150 días del posoperatorio. tal motivo, los autores consideran que en la paciente de
Estudios realizados en perros con RLCA que fueron tra- este reporte la inyección intraarticular de APCs evitó (o al
tados mediante técnicas intracapsulares han reportado de menos retrasó) la aparición de cambios osteoartríticos, al
manera homogénea evidencia radiológica de OA a partir menos hasta los 150 días del posoperatorio. Sin embargo,
de las 4 semanas posoperatorias (Heffron y Campbell este solo es un caso clínico aislado, por lo que no se puede
1979, Elkins y col 1991, Vasseur y Berry 1992). Hurley generalizar a partir de estos resultados particulares.
y col (2007) encontraron evidencia radiológica de OA de 2) Tanto las evaluaciones clínica (subjetiva) como ciné-
rodilla 8 semanas después de haber realizado TPLO para tica (objetiva) del grado de cojera mostraron una mejoría

315
RF silva y col
gradual de la marcha (locomoción) de la paciente al cabo
de los 15 días posoperatorios y una mejoría completa (au-
sencia de cojera) después del primer mes posoperatorio.
Esta mejoría se mantuvo hasta la última evaluación cinética
a los 90 días posoperatorios. Los resultados observados
en esta perra son esperanzadores puesto que en animales
con RLCA tratados con TPLO, independientemente de
recibir o no fisioterapia posoperatoria, pueden presentar
cojera hasta 6 semanas posoperatorias (Monk y col 2006).
Lee y col (1999) afirman que bajo condiciones normales
los miembros delanteros soportan el 60% de la masa cor-
poral. También se ha reportado que en perros con marcha
normal el porcentaje de distribución para cada miembro
del Pfz es en promedio 58,9% para los miembros ante-
riores y 41,1% para los miembros posteriores (Budsberg
y col 1987), condición que la paciente de este reporte
alcanzó de manera acelerada a los 15 días posoperatorios
(cuadro 1). Trumble y col (2005) reportaron disminución
drástica del Pfz dos semanas después del tratamiento
quirúrgico extracapsular para RLCA. Estos resultados son
totalmente opuestos a los encontrados en este reporte. Otro
indicio importante que justifica el fuerte papel analgésico
que cumplieron los APCs empleados como tratamiento
coadyuvante intraarticular en la paciente de este reporte
radica en el hecho de que pacientes operados con la misma
técnica (con o sin fisioterapia posoperatoria) no lograron
mejorar sus parámetros cinemáticos al cabo de 4 meses
posoperatorios (Muzzi y col 2009).
3) Los resultados obtenidos en esta paciente indican
el posible uso potencial de los APCs como un biofármaco
con acción modificadora de la OA. Esta misma observa-
ción fue propuesta para caballos con AO que recibieron
tratamiento intraarticular con APCs (Carmona y col 2009).
Sin embargo, para confirmar o disuadir el uso de APCs
como coayuvantes en la reparación de la RLCA en perros
es necesario realizar estudios doble ciego aleatorizados y
controlados para demostrar el potencial terapéutico de esta
sustancia como coadyuvante en esta enfermedad.
RESUMEN
La ruptura del ligamento cruzado anterior (RLCA) es uno de
los principales problemas ortopédicos que producen cojera de los
miembros posteriores en perros. A pesar de que este problema sea tratado
quirúrgicamente  el desarrollo y  progresión  de  la osteoartritis  son
típicamente característicos. Se describe un caso de un perro que recibió
inyecciones intraarticulares de concentrados autólogos de plaquetas
(APCs) durante el posoperatorio después de la reparación quirúrgica
de una RLCA. Los resultados clínicos y radiográficos y el análisis de la
marcha mediante plataforma de fuerza podrían potencialmente soportar
la utilización posoperatoria de inyecciones intraarticulares de APCs como
terapia coadyuvante en el tratamiento quirúrgico de la RLCA en perros.
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 Instrucciones para los autores

ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Fundada en 1969 ISSN 0301-732x

Revista seleccionada por los siguientes repertorios científicos internacionales:

Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES),
Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts,
Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A.,
Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Archivos de Medicina Veterinaria publica, en español o Forma y preparación del artículo

inglés, contribuciones científicas originales en la forma de ar-
tículos científicos, revisiones bibliográficas y comunicaciones
cortas que pueden incluir observaciones clínicas, descripciones
de técnicas o métodos, y avances en todos los aspectos de las
ciencias veterinarias y bienestar animal.
Envío de la publicación
Los artículos deben ser enviados al Editor en forma electrónica
a través de www.equipu.cl, e incluir:
• Una versión electrónica del texto, cuadros (preferentemente
en formato MS Word), figuras (en formato Excel, JPG o TIFF,
300 dpi) y una declaración de la responsabilidad de autoría,
con la firma de todos los autores.
• Los trabajos deben ser originales, inéditos y no deben estar
en proceso de arbitraje en otra revista.
• Los artículos que se presenten sin considerar las normas de
estilo serán devueltos sin ser sometidos a revisión.
• Para experimentos con animales o humanos, el Comité
Editor podrá solicitar que se adjunte la autorización de un
Comité de Bioética o instancia similar.
• Se deberá incluir una carta dirigida al Editor solicitando la
publicación de su trabajo y señalando a uno de los autores
como responsable de la revisión de las pruebas de imprenta
y de la correspondencia.
• Los revisores de Archivos de Medicina Veterinaria asesoran al
Comité Editor para decidir si el trabajo puede ser publicado.
Los autores podrán sugerir revisores. Todos los artículos
enviados para publicación serán enviados a dos revisores
seleccionados por el Comité Editor y pueden incluir, o no, los
sugeridos por los autores. En caso de existir controversia en
los informes, se recurrirá a un tercero en carácter de árbitro-
arbitrador, que asesorará al Comité Editor para decidir el
destino del trabajo. Los revisores están obligados a mantener
el carácter confidencial de toda la información de los trabajos,
aun cuando no sean publicados.
• Previo a la publicación de un trabajo aceptado se
debe pagar un valor cuyo monto se señala en la Web
www.veterinaria.uach.cl
Tipos de artículos
Artículos de revisión: son realizados por expertos que re-
sumen y proyectan el conocimiento actualizado en un campo
particular en las Ciencias Veterinarias, y no necesariamente
se ajustan a un formato definido de presentación. Los autores
deberían previamente consultar a los editores antes de iniciar el
trabajo de revisión. El Comité Editor podrá solicitar a expertos el
envío de artículos de revisión, los que también serán sometidos
al proceso de arbitraje y edición. No deben exceder de 30 pági-
nas, incluidos cuadros, figuras y referencias. Sólo se aceptarán
revisiones escritas en inglés.
Artículos científicos: éstos informan un nuevo avance en
Ciencias Veterinarias basados en una investigación original. El
formato de ellos deberá incluir summary, introducción, material
y métodos, resultados, discusión, resumen, agradecimientos
(cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 20
páginas, incluidos cuadros, figuras y referencias.
Comunicaciones cortas: informan de manera breve un
avance, resultado de un experimento, observaciones clínicas o
nueva metodología, ajustándose al siguiente formato: summary,
introducción, material y métodos, resultados y discusión (sección
conjunta), resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y
referencias. No deben exceder de 12 páginas, incluidos cuadros,
figuras y referencias.
Estilo y formato de la revista
Presentación general: la revista publica artículos en español
o inglés.
Los artículos deberán ser escritos con letras Times New
Roman 12, por un solo lado de las hojas, a interlineado y medio,
en tamaño carta (21,5 x 27,9 cm), dejando un margen de 2 cm
en los cuatro bordes.
Todas las páginas deben ser numeradas de manera conse-
cutiva en el ángulo superior derecho, y las líneas deberán ser
numeradas en cada página, iniciándose con el número 1, junto
al margen izquierdo, en todo el trabajo.
Los títulos de capítulos deben ser escritos en mayúscula,
justificados al lado izquierdo, en líneas separadas y sin punto
final. Ejemplo: MATERIAL Y MÉTODOS. En los subtítulos
sólo la primera letra es mayúscula (Ejemplo: Diseño experi-
mental) y deberá ser justificado al lado izquierdo. Subtítulo
secundario debe ser justificado al lado izquierdo y en letra
cursiva. No deberán usarse subrayado ni numeración de sub-
títulos o lista de ítems.
 Las cifras deben ser escritas en números. Cuando están al
inicio de una frase, o cuando la claridad del texto lo requiera,
deben ser expresadas en palabras. Un decimal deberá ser pre-
cedido de un numeral usando punto cuando el artículo es en
inglés o coma cuando el artículo es en español (Ejemplo: 0,5
no, 5). Múltiplos de mil deben escribirse separados por punto
(Ejemplo: 1.000). Las medidas de cantidad deberán ajustarse
al Sistema Internacional de Unidades, a menos que la práctica
en una disciplina use derivados de ellos (Ejemplo: la unidad
internacional de Curie). Las fechas deben ser expresadas como
“07 de septiembre de 1954” en el texto, pero pueden presentarse
abreviadas en los cuadros y figuras. El tiempo diario se debe
expresar según las 24 horas cronológicas (Ejemplo: 13:00 h).
Para la nomenclatura química se deben utilizar las normas
de la Sociedad de Bioquímica (Biochem J 209, 1-27, 1983),
los fármacos o drogas deben ser mencionados por sus nombres
genéricos (en minúsculas), si es necesario colocar marcas y sus
fuentes deberán ir a pie de página. Las enzimas deben ser identi-
ficadas, cuando se mencionan por primera vez, según la Enzyme
Commission of the International Union of Biochemistry.
Los términos en latín y sus abreviaciones que son de uso
común en la literatura científica, tales como: in vitro, in vivo,
ad libitum deberán ir en cursiva. Los valores de probabilidad
deben ser dados en la forma de P  <  0,05 o P  <  0,01. Des-
viación estándar, error estándar de la media e intervalos de
confianza, se abreviarán en la forma siguiente: DE, EE y IC,
respectivamente.
Título
El título del trabajo debe ser conciso, específico e informa-
tivo. Sólo la primera letra será mayúscula, en negritas, centrado,
iniciándose en la línea 10, sin usar marcas comerciales o abre-
viaciones. Se deberá señalar, con superíndice (#) la fuente de
financiamiento, si lo hubiese, que se detallará a pie de página.
Separado por el espacio de una línea se deberá escribir el título
en inglés.
Autores y direcciones
Los nombres de los autores se escribirán bajo el título
separados por un espacio. Use iniciales (sin puntos) y apellido
separando por comas entre los autores, ajustándose al siguiente
ejemplo: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Al término de cada
nombre de autor debe identificarse con una letra en superíndice,
el nombre de la sección, departamento, servicio o institución a la
que pertenece o perteneció dicho autor, durante la ejecución del
trabajo. La letra con un asterisco indica el autor responsable de la
correspondencia, debiéndose señalar a pie de página el número
de fax, correo electrónico y casilla de correo.
Pie de página
Serán usados para elaborar abreviaciones citadas en el título
de cuadros, marcas comerciales, nombre y dirección de empresas.
Deben ser indicados con números.
Summary
La segunda página debe contener un summary, de no más de 250
palabras y que describa los propósitos del estudio o investigación,
el material y métodos empleados, los resultados principales y las
conclusiones más importantes. No se deben emplear abreviaturas
no estandarizadas. En línea aparte, separado por un espacio y
justificadas a la izquierda se deben incluir key words (palabras
clave) en minúsculas, las que no deben ser más de 4.
Introducción
En la tercera página en la línea 1 se escribirá el título del
capítulo. En la línea siguiente, con sangría, predeterminada de
un tabulador en 5 espacios, se plantearán los antecedentes que
sustentan el propósito del artículo, sin un despliegue extensivo
del tema y utilizando sólo las referencias más pertinentes. Se
deben indicar, cuando corresponda, la hipótesis que se postula
y los objetivos de la investigación.
Entre párrafos debe conservar el interlineado y medio.
Material y Métodos
Separado por un espacio de la sección anterior, se deberá
describir el capítulo con suficientes detalles para permitir a otros
repetir el estudio. Después de la primera referencia en el texto a
drogas o reactivos, se deben señalar el nombre genérico, dosis y
vía de administración. Para el caso de equipo especializado se
indicarán la marca, el modelo y el nombre del fabricante.
Los métodos estadísticos utilizados deben ser señalados como
subtítulos: “Análisis estadístico” y deben incluir un adecuado
detalle, que permita a los lectores establecer con precisión cómo
han sido analizados y presentados los datos y las unidades de
medidas en que están expresadas (medias aritméticas, desvia-
ciones estándares, errores estándares de la media, medianas,
rangos o límites de confianza, etc.). Si las pruebas usadas fueron
paramétricas (Chi cuadrado, prueba “t” de Student, Anova, etc.)
o no paramétricas (Wilcoxon, Kruskal-Wallis, etc.). Se deberán
identificar el nombre, la versión y el proveedor del programa
computacional utilizado, ejemplo: SPSS versión 9.0 para Win-
dows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).
Resultados
Separado por el espacio de una línea de la sección anterior,
se deberá describir el capítulo de resultados, presentado en forma
concisa y lógica, sin discusión o referencia a otro trabajo. Los
cuadros y figuras deben ser los mínimos necesarios y los datos no
deben ser repetidos en el texto y tampoco deberán ser mostrados
simultáneamente o reiterados.
Discusión
Esta sección, separada por una línea de la anterior, debe
evaluar e interpretar los resultados, relacionándolos a los de otros
estudios relevantes. No debe repetir resultados o presentar nuevos.
Debe ser diligentemente tratada en su desarrollo, haciéndola de
manera lógica y concisa, estableciendo conclusiones, relevancias
y proyecciones del trabajo. Debe evitarse formular conclusiones
que no estén respaldadas con sus hallazgos ni sustentadas en
trabajos aún no publicados.
Resumen
El resumen en español deberá ser escrito en hoja aparte, y
deberá ajustarse a las mismas normas señaladas para el summary.
Separadas por el espacio de una línea se deberán escribir las
palabras clave en letras minúsculas, no debiendo ser más de
cuatro y justificadas en el lado izquierdo.
Agradecimientos
Deben ser breves y sólo incluir personas o instituciones que
han hecho una contribución directa, han provisto material necesario
o dado las facilidades para la realización del estudio.
Referencias
La precisión con la que son señaladas las referencias es de
responsabilidad de los autores y deben corresponder al artículo
original; asegúrese que todos los artículos citados en el texto
estén incluidos en el listado de referencias y viceversa. En el
texto, las citas se deben indicar entre paréntesis y en orden
cronológico, citando el apellido del autor y la expresión “y
col” después del apellido del primer autor, cuando son más
de dos, Ej.: (Pérez 1994, Castro y Martínez 1996, Cifuentes
y col 2002).
El listado de referencias debe ir en orden alfabético de acuerdo
al apellido del primer autor y debe incluir el apellido e iniciales de
todos los autores. Cuando no se dispone del nombre del autor, use
el término anónimo entre comillas, tanto en el texto como en el
listado de referencias. Las referencias, cuando son del mismo autor,
solo o con más autores, deben ser escritas en orden cronoló­gico.
Las letras a, b, c, etc., deberían ser agregadas como superíndice
cuando un autor escribe más de un trabajo en el mismo año. Los
nombres de los autores deben escribirse en minúsculas, sin punto
entre las iniciales. Los nombres de las revistas y de los libros deben
ser en letra cursiva, usando la abreviatura estandarizada. Use los
siguientes ejemplos como guía.
Para artículos en revista:
Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-
dad diagnóstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34,
167-182.
Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of
pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.
Para capítulos en libros o publicaciones ocasionales:
Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total nitrogen
in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference
Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington
DC, USA, Pp 75-83.
Flórez J. 1992. Fármacos analgésicos opiáceos. En: Flórez J (ed).
Farmacología Humana. 2ª ed. Masson-Salvat, Barcelona,
España, Pp 25-28.
WHO, World Health Organization. 1972. International Drug
Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser
WHO Nº 48.
SAG, Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 1996. Resolución
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Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-
ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA
(eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB
Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.
Para artículos y resúmenes publicados en series regulares:
Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998.
Valores sanguíneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4)
en vacas lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X Con-
greso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile,
Pp 135-136.
Para memoria de título:
Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del
factor activante plaquetario en membranas de neutrófilos de
bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Para tesis:
Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-
CSF en espermatozoides bovinos y su relación con la motilidad
espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Minimice el uso de resúmenes como referencias. Evite usar
“datos no publicados” o “comunicación personal” al menos que
de ello exista una forma escrita. Si esto ocurriera, debe hacerse
referencia en el texto como pie de página, pero no debe aparecer
en el listado de referencias. Las referencias a trabajos que han
sido aceptados para publicación deben ser citados como “en
prensa”; sin embargo, trabajos que han sido sometidos a publi-
cación, pero no han sido aceptados todavía, deben ser referidos
como “datos no publicados”.
Direcciones de páginas Web no deben ser incluidas en las
referencias; si su uso es imprescindible, la dirección debe ser
señalada en el texto como pie de página, incluyendo fecha de
consulta.
Instrucciones complementarias
Cuadros
Las leyendas de los cuadros y figuras deben ser autoexpli-
cativos y presentarse en español e inglés.
Los cuadros deben ser el menor número posible, presentados
en hoja aparte, con sus respectivos títulos en español e inglés en
la parte superior. La información de los cuadros no debe repetir
lo del texto. Los cuadros deben ser numerados consecutivamente
con números arábigos, en el orden en que aparecen en el texto,
asignándoseles un título breve y autoexplicativo que indique su
contenido. Sobre cada columna del cuadro debe colocarse un
encabezamiento corto o abreviado. Sólo los encabezamientos de
las columnas y los títulos generales se separan con líneas hori-
zontales. Las columnas de datos deben separarse por espacios y
no por líneas verticales. Cuando se requieran notas aclaratorias,
deben agregarse al pie del cuadro. Las notas aclaratorias para
todas las abreviaturas no estándar y las unidades de medidas
deben ser agregadas entre paréntesis. Si se usan superíndices para
señalar diferencias entre valores use a, b, c, minimice el número
de dígitos en cada columna. Informe el valor de cero como 0. El
ancho máximo de los cuadros no debe exceder los 80 mm para
una columna, o los 170 mm para dos columnas.
Figuras
Las figuras deben ser presentadas en hojas separadas con
sus respectivos títulos en español e inglés en la parte inferior y
numeradas consecutivamente usando números arábigos, según
el orden en que aparecen en el texto. Ej.: Figura 1, no Fig. 1.
Denomine figura a cualquier ilustración que no sea cuadro,
Ej.: gráficos, radiografías, ecografías, electrocardiogramas,
fotografías, etc. Las figuras deben ser orientadas verticalmente
y acompañadas de una corta descripción que contenga la expli-
cación de todos los marcadores, líneas y símbolos usados. Si la
figura tiene secciones, éstas deben ser identificadas como a, b,
c, etc., en la esquina superior derecha y deberán ser descritas
en la leyenda.
Para el caso de fotografías, en el reverso y con lápiz a carbón,
deben señalarse con flecha la orientación espacial, el número de
la figura y el nombre del autor principal. Los símbolos, flechas
o letras, empleados en las fotografías, deben tener un tamaño y
contraste suficientes para distinguirlos de su entorno. Envíe las
figuras protegidas en un sobre grueso y de tamaño apropiado.
Las figuras pueden diseñarse a una o dos columnas de ancho (80
y 170 mm, respectivamente). Las reproducciones en colores de
las figuras deben ser financiadas por los autores.
Cuando las figuras no son originales debe señalarse la autoría,
y cuando corresponda, se debe adjuntar la autorización del autor
para ser reproducidas.
Pruebas de imprenta
Una prueba de imprenta será enviada al autor encargado de
la correspondencia, para su lectura y corrección puntual, y debe
ser devuelta al editor dentro del plazo que se especifique. Por
otra parte, el editor se reserva el derecho a corregir la prueba de
imprenta cuidadosamente, pero sin asumir responsabilidad de
tal, y de esta manera agilizar el proceso de publicación.
La decisión final para la publicación del trabajo será en el
momento en que el Comité Editor acepte las correcciones, que
a sugerencia de los árbitros han realizado los autores. Modifica-
ciones a las pruebas de imprenta que no sean de errores menores
no serán aceptadas. Ni los editores ni la imprenta aceptarán
responsabilidad por la impresión de errores de los ar­­tículos que
los autores no hayan corregido en la prueba de imprenta.

DIRECCIÓN
Comité Editor Archivos de Medicina Veterinaria
Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile
e-mail: archmv@uach.cl - Fono-Fax: (56-63) 221459
www.veterinaria.uach.cl
www.scielo.cl
Casilla 567, Valdivia, CHILE

Representante Legal:
Víctor Cubillos Godoy
Rector de la Universidad Austral de Chile
 INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

JOURNAL ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Founded in 1969 ISSN 0301-732x

Journal indexed by the following international scientific repertoires: Current Contents

Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth
Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary
Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological
Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Archivos de Medicina Veterinaria publishes, in Spanish Preparation and Form of Manuscripts

or English, original scientific contributions such as scientific
articles, reviews and short communications which can include
clinical observations, descriptions of methods or techniques
and advances in all aspects of veterinary science and animal
welfare.
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Manuscripts should be submitted to the Editor via the on
line platform www.equipu.cl and it must include:
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Word format), figures (in Excel format, JPG or TIFF, with
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be considered for publication in another journal.
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will be returned without review.
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Committee Certification for manuscripts describing studies
involving animals or humans.
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author who will also revise the proof of the article, should it
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Editorial Committee to determine whether the manuscript
fulfills publication requirements. The authors may suggest
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be assessed by two referees. The referees will be selected by
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nominated by the authors. In the case of a disagreement
between the referee’s reports, a third referee will aid the
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JOURNAL STYLE AND LAYOUT
General presentation: The journal publishes articles in
English or Spanish. Manuscripts must be written using 12 point
Times New Roman font with one and a half-line spacing, on one
side only of letter paper (21.5 x 27.9 cm) using 2 cm margins
on all sides. Pages must be numbered consecutively in the top
right corner, and lines must be numbered on the left, starting
with number one, on all pages.
Headings must be in upper case, left-justified on a separate line
with no full stop following, eg. MATERIAL AND METHODS.
Only the first letter of sub-headings is capitalized. Primary
sub-headings (eg. Experimental design) should be left-justified;
secondary sub-headings are left-justified and italicized. Do not use
underlining and do not number sub-headings or itemized lists.
In the text, numbers must be written in numerals. When a
sentence begins with a number or when necessary for clarity, this
should be written in words. A decimal point must be preceded
by a number (eg. 0.5 not .5) and a point is used to denote the
decimal in English and a comma in Spanish. All measurements
should be reported in IS units unless it is normal practice in a
discipline to use derivatives (eg. the Curie international unit).
Dates must be formatted as 07 September, 1954 in the text, but
they may be abbreviated in tables and figures. Use the 24-hour
clock for times of day (e. g. 13:00 h).
Chemical nomenclature must be expressed using the
Biochemical Society Standards (Biochem J 209, 1-27, 1983),
generic names (in lower caps) must be used for medications.
If brands and sources of medications need to be included, this
should be included as a foot-note. Enzymes must be identified
at first mention, in accordance with the Enzyme Commission
of the International Union of Biochemistry.
Latin terminology and abbreviations commonly used in
scientific literature, such as in vitro, in vivo, ad libitum must
be italicized. Probability values must be presented as P<0.05
or P<0.01. Standard deviation, standard error of the mean and
confidence intervals are abbreviated as follows: SD, SEM and
CI, respectively.
Title
Titles should be short, specific and informative. The title is
centred in bold, starting at line 10 without using trade names or
abbreviations. Only the first letter is capitalised. The superscript
symbol # should be used to indicate the source of funding, with
details given as a footnote, if appropriate.
Author’s names and addresses
Author’s names are written underneath the title, separated by
a space. Use initials (without stops) and surnames only, separated
by comas, as in the example: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean.
Superscript letters should be used after each author’s name to
identify the section, department, service or institute of the author
where the work was conducted. The corresponding author is
indicated using the superscript letter followed by an asterisk,
with the full contact details, including fax number and email
address indicated in the footnote.
Footnotes
These are used to define abbreviations used in table titles,
commercial brands, the name and address of companies. They
must be indicated with numbers.
Resumen
The second page must contain a summary in Spanish (Resumen),
of no more than 250 words, that describes the objectives of the
study or research, the material and methods used, the principal
results and the most important conclusions. Non-standard
abbreviations must not be used. On a separate line, left-justified
and separated by a space, up to four palabras clave (key words)
should be identified.
Introduction
The subheading “Introduction” is written on the third page
on line 1. In the following line, indented by 5 spaces, the context
of the study is briefly presented without an extensive revision of
the theme, and only citing the most relevant references. When
appropriate, the hypothesis and objectives of the study must be
clearly and concisely presented. The one and a half-line spacing
between paragraphs must be kept.
Material and methods
Separated by one space from the previous section, this section
should contain sufficient detail to allow others to repeat the study.
When the first reference in the text is made to medications or
chemicals, the generic name, dose and route of administration
should be indicated. For specialized equipment, the brand, model
and manufacturer’s name must be indicated.
Details of all statistical methods used must be given at the
end of this section under the sub-heading “Statistical analysis”
and should include adequate detail to allow readers to determine
precisely how data have been analysed and the units that are used
to express the results (mathematical mean, standard deviation,
standard error of the mean, mediums, ranges or confidence limits,
etc.). The use of parametric (Chi-square, student’s T-test, ANOVA,
etc.) or non-parametric (Wilcoxon, Kruskal-Wallis etc.) analyses
must be indicated. The name, version and sources of computational
statistical analysis programs must be identified, eg. SPSS version
9.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).
Results
Separated by one space from the previous section, this section
should contain a concise and logical description of the results
obtained without discussion or reference to other work. The
minimum number of tables and figures should be included to
present the pertinent data without repetition, and data presented
in tables and figures should not be repeated in the text.
Discussion
This section, separated by one space from the previous
section, should evaluate and interpret the results and relate these
to other relevant results. The results should not be repeated and
new results must not be presented in this section. Care should
be taken to ensure that the discussion is developed in a logical
and concise manner, and conclusions are reached, as well as a
discussion of their relevance. Conclusions that are not directly
supported by the data of the study or other unpublished studies
should not be presented.
Summary
The summary is written in English, and must be presented on
a separate page. The summary should contain the same elements
as the “Resumen”. On a separate line, following the summary,
left-justified in small caps and separated by a space, up to four
key words should be identified.
Acknowledgements
This section should be brief, and should only include people
or institutions that have made a direct contribution, provided
necessary material or have provided the facilities for the study’s
development.
References
The accuracy of the reference section is the responsibility of
the authors and references must be verified against the original
article. Please ensure that all articles cited in the text are included
in the reference list and vice versa. In the text, citations should
be listed in parentheses in chronological order, citing authors’
names, and using et al after the first author’s name where there
are more than two (e.g. Pérez 1994, Castro and Martínez 1996,
Cifuentes et al 2002).
The reference list must be ordered alphabetically according
to the first author’s name, and all authors’ names and initials
must be included. When no author is given, use the term
“Anonymous” in both text and reference list. References with
the same author, single or with coauthors, should be listed in
chronological order. The letters a, b, c, etc. should be appended
as a superscript when more than one work is cited from the
same author within the same year. Authors names should
appear with the initials and first letter of the surname in upper
caps and the remainder of the surname in lower caps, with no
dots between initials. Journal titles and names of books should
be in italics using standard abbreviations. Use the following
examples as a guide:
For journal articles:
Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-
dad diagnóstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34,
167-182.
Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of
pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.
For chapters in books or occasional publications:
Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total nitrogen
in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference
Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington
DC, USA, Pp 75-83.
Flórez J. 1992. Fármacos analgésicos opiáceos. En: Flórez J (ed).
Farmacología Humana. 2ª ed. Masson-Salvat, Barcelona,
España, Pp 25-28.
WHO, World Health Organization. 1972. International Drug
Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser
WHO Nº 48.
SAG, Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 1996. Resolución
Exenta Nº 3599 del 29 de noviembre de 2006.
Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-
ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA
(eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB
Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.
For articles and proceedings published in regular series:
Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998. Valores
sanguíneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas
lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X Congreso Chileno
de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.
For dissertations:
Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del
factor activante plaquetario en membranas de neutrófilos de
bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
For Theses:
Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-
CSF en espermatozoides bovinos y su relación con la motilidad
espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Minimise the citation of abstracts as references. Authors
are specifically discouraged from citing “unpublished data” or
“personal communication”, unless this information exists in written
form, in which case the text should be referred to as a footnote,
but this should not appear in the list of references. References
to papers which have been accepted but not published should
be cited as “in press”, whereas manuscripts which have been
submitted for publication but not accepted should be referred
to as “unpublished data”.
Web pages should not be included as references. If so required,
web page addresses should be written as footnotes, including
date of consultation.
Complementary instructions
Tables
The titles to tables and figures should be self-explanatory
and must be presented in both Spanish and English.
The number of tables should be kept to a minimum and
presented on separate pages with their respective titles in
English and Spanish at the top. Information in tables must not
be repeated in the text. Tables must be numbered consecutively
with Arabic numbers in the order in which they are referred to in
the text. The brief title to the table should indicate the contents
of the table and should be understandable without reference
to the text. Each column of each table must have a short or
abbreviated heading. Only column headings and general titles
should be separated with horizontal lines. Data columns should
be separated by spaces and not vertical lines. When additional
explanatory information is required, this should appear at the
foot of the table. Explanatory information for non-standard
abbreviations and units should appear within parentheses. If
superscripts are used to indicate significant differences between
values, use a, b, c. Minimise the number of digits in each column.
Indicate a zero value as 0. Table widths should not exceed 80
mm for one column or 170 mm for two columns.
Figures
Figures should be submitted on separate pages, with their
respective titles in English and Spanish at the bottom and
numbered consecutively using Arabic numerals in the order they
are referred to in the text. Eg. Figure 1, not Fig. 1. Figures include
all illustrations that are not Tables, eg. graphs, radiographies,
ecographies, electrocardiograms, photographs, etc. Figures must
be vertically oriented and be accompanied by a short descriptive
caption that contains an explanation for all markers, lines and
symbols used but no abbreviations. If the figure contains sections,
these should be labelled as a, b, c, etc. in the top right corner and
must be described in the caption.
The reverse of photographs must be marked using graphite
pencil with the number of the figure, the first author and an arrow
showing the orientation of the photograph. Symbols, arrows or
letters used should be of an adequate size and contrast to be
easily visible. Photographs should be submitted in a protective,
adequately sized envelope. Figures may be one or two column-
widths (80 or 170 mm, respectively). The cost of printing coloured
figures must be met by the authors.
The authorship of non-original figures must be acknowledged,
and when appropriate, authorization to reproduce these figures
must be provided.
Proofs
A proof will be sent to the corresponding author for proof-
reading, and must be returned within the specified time. Otherwise
the Editor reserves the right to carefully proof-read the article
but without assuming responsibility for errors, to continue with
the publication process.
The final decision regarding acceptance of the manuscript will
be taken when the Editorial Committee accepts the manuscript
following correction according to the referees’ comments.
Alterations to the proof that do not correspond to minor errors
will not be accepted. Neither the Editor nor the Publisher accept
any responsibility for printed errors which were not noted by the
authors at the time of proof-reading the proof.
 ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

El Comité Editor agradece a los revisores del volumen 43, 2011

ACOSTA, Gerardo GOYCOECHEA, Óscar NORO, Mirela

AGUIRRE, Isabel GREEN, Martin NOVALES, Manuel
AHUMADA, Frederik GREER, Andrew NÚÑEZ, Luis
ALBERIO, Ricardo GROOMS, Daniel NÚÑEZ, María José
ALVARADO, Ricardo GUGLIEMONE, Alberto NÚÑEZ, Iván
ALVAREZ-CLARE, Silvia GUTIÉRREZ, Luis OJEDA, Javier
ARANCIBIA, Richard HERMOSILLA, Carlos ORTEGA, Marcela
ARAYA, Oscar HERMOSILLA, Ricardo PAREDES, Enrique
BAHUAUD, Diane HERVÉ, Marcelo PARRAGUEZ, Víctor
BALOCCHI, Daniel HIDALGO, María Angélica PERALTA, Óscar
BEERDA, Bonne HINCKLE, Nancy PEREIRA-DOPAZO, Carlos
BIANCHI, Gianni HOROHOV, David PÉREZ, Patricio
BORIE, Consuelo HUAQUÍN, Laura POMROY, Bill
BRIZUELA, Miguel ISLAS, Armando PULIDO, Rubén
BURGOS, Rafael JARAMILLO, Roberto RAMÍREZ, Alfredo
BUSTOS, Patricio JOHANSEN, Lill-Heide RAMÍREZ, Ana María
CALVINHO, Luis JUNQUEIRA, Ricardo RATTO, Marcelo
CANO, María José KENNEDY, Mark REARTE, Daniel
CARDONA, Leonel KRUZE, Juan RECABARREN, Sergio
CARDONA, Nora KUZNAR, Juan REINHARDT, Germán
CARMONA, Jorge LAGGER, José Rodolfo REINHOLD, Petra
CATTAN, Pedro LANUZA, Francisco RETAMAL, Patricio
CEBALLOS, Alejandro LARRAIN, Rafael RIET-CORREA, Franklin
CELEDÓN, Orfelia LATORRE, Etel RIJNKELS, Monique
CERRI, Ronaldo LATRILLE, Luis RIOFRÍO, Andrés
CHIHUAILAF, Ricardo LECCOQ, Claudio ROMERO, Alex
COLAZO, Marcos LEESON, Steve ROVERE, Roberto
CONCHA, Ilona LEEVER, David RUBILAR, Luis
CUELLO, Sandra LETELIER, Claudia RUIZ, Álvaro
COUETIL, Laurent LÜDERS, Carlos SCHUDEL, Alejandro
CUBILLOS, Guillermo LUZBEL DE LA SOTA, Rodolfo SCHOEBITZ, Renate
DALL’ACQUA, Selene MAINAR, Raúl SEMIGLIA, Gabriel
DIAZ, Nelson MANDUJANO, Salvador SHOEMAKER, Craig
DONOSO, Sergio MANTECA, Xavier SILVA, Mauricio
DUPRÉ, Enrique MARTINAUR, Roger SISÓ, Silvo
ELKIN, Robert MARTÍNEZ, Mario SMITH, Pedro
ERICKSON, Peter MARTÍNEZ, Juan SMULDERS, Juan Pablo
ERNST, Santiago MARTÍNEZ, Andrés SPEARS, Jerry
ESCOBAR, Arturo MELÉNDEZ, Pedro STEHR, Wolfgang
EYESTONE, Willard MENARIM, Bruno TAMAYO, Rafael
FERREIRA, Adelina MENDOZA, Jorge TARABLA, Héctor
FIGUEROA, Carlos MERINO, Victoria TARDÓN, Rodrigo
FLANDERS, James MEZZADRA, Juan Carlos TAYEBI, Mourad
FORERO, Jorge MIERES, Marcelo THIBAUT, Julio
FRANJOLA, René MONTI, Gustavo TORO, Haroldo
FREDES, Fernando MORALES, Sol ULLOA, Jorge
FUENTEALBA, Carmen MORALES, María Angélica UZAL, Francisco
GÄDICKE, Paula MOREIRA, Marcos VALDEBENITO, Iván
GALLARDO, Carlos MOREIRA, Rubén VALDERRAMA, Ximena
GALLEGUILLOS, Marcos MUJICA, Fernando VALENZUELA, Gáston
GALLO, Carmen MUÑOZ, Lisandro WARAN, Natalie
GODOY, Adolfo MUÑOZ, Loreto WERNER, Marianne
GODOY, Rodrigo MUÑOZ, Pamela WITTWER, Fernando
GÓMEZ, Marcelo MUÑOZ-ZANZI, Claudia YÁÑEZ, Alejandro
GÓMEZ, Nélida NADER, María Elena ZAROR, Luis
GONZÁLEZ- ACUÑA, Daniel NEIRA, Patricia
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ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

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Editor, adjuntando el presente cupón.

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Valdivia - Chile

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