分子生物學 Molecular Biology

M58
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國考《生物化學》複習講義
RNA

上課日期：2018/10/15 (一)

系級 姓名 學號
目錄
A. RNA 修飾(RNA processing) ........................................................................................... 3

B. RNA 干擾(RNAi) .......................................................................................................... 10

C. 轉錄調控蛋白 ............................................................................................................... 12

D. 原核生物基因調控──操縱組(Operon) ....................................................................... 15

E. 真核生物基因調控 ....................................................................................................... 25

F. 轉譯與轉譯後修飾 ....................................................................................................... 33

G. 生物科技 ....................................................................................................................... 48

(和宋仲基有 9487%像的) 李景行歐爸 編授

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A. RNA 修飾(RNA processing)
一、剛轉錄出來還未經過修飾的RNA分子稱為primary transcript，又叫做pre-messenger
RNA，pre-mRNA，或是heterogeneous nuclear RNA (hnRNA)。
※ RNA polymerase II 在 核 漿 (nucleoplasm) 中 合 成 mRNA 的 前 驅 物 hnRNA ，
hnRNA 在內質網修飾成mRNA

二、mRNA修飾──僅真核生物
原核生物因其轉錄與轉譯接近同時發生，沒有對mRNA修飾的情形。（但原核
生物仍會對tRNA與rRNA修飾）
【注意】RNA polymerase II的CTD (carboxyl-terminal domain)：
RNA polymerase II為由多個次單元組成的protein complex，CTD位在最大的次單元
上，此處有一處25至52次重複的-YSPTSPS-保守序列，在轉錄進入延長階段時序列
中的Ser會被TFIIH磷酸化。
 CTD須被磷酸化後才能使轉錄從起始階段進入延長階段。磷酸化前的RNAPII稱
為RNAPIIA；磷酸化後稱為RNAPII0
 磷酸化後的CTD可結合Cap-synthesizing enzyme、Spliceosome或polyadenylation
factor等協助轉錄後修飾的蛋白。
 轉錄終止後，CTD由phosphatase去磷酸化

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1. 在5’端加上cap (5’ capping)
(1) 在5端加帽的用意：是為了mRNA之後要進行轉譯時，可讓ribosome的rRNA
找到轉譯的開始點並結合上去。

(2) 步驟
(A) cap synthesizing enzyme以GTP為原
料，在5’端加上G
※ 【注意】G和mRNA第1核苷是以
5’-5’結合
(B) 以SAM (S-adenosyl methionine)為原
料，在G上甲基化
※ 有些高等生物在第1和第2個核苷
上的核糖(ribose)2’位也會甲基化
(C) enzyme離開，結合至cap

2. 剪掉intron (RNA splicing)──套索狀(lariat)的剪接方式

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(1) 絕大多數intron的5’端為GU，3’端為
AG，中間有branch site（或稱lariat
site）有個A可以讓5’GU被切下之後形
成套索結構。
※ histone gene不含intron
(2) 在人體主要以Spliceosome剪接
(A) Spliceosome是一種ribozyme，含
snRNP (small nuclear
ribonucleoprotein)，有五種
snRNP，分別為U1,2,4,5,6
(B) U1辨識並切割intron的GU site；
U2辨識結合至A(branch site)
(3) 不同種類的intron：

真核mRNA的intron為Group III

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3. 在3’端加上poly-A tail
(1) Poly-A tail 可以保護mRNA 在轉譯完成前不會被分解
※ 但在原核生物，出現Poly-A tail反而會促使mRNA分解
(2) 步驟：
(A) mRNA在3’端會有一個高
度保留序列(highly
conserved sequence)為
AAUAAA，又稱作
polyadenylation signal
sequence，來啟動mRNA
轉錄的終止及3’修飾。
下游則有GU重複序列
(B) 當mRNA轉錄快結束
時，Cleavage and
polyadenylation
specificity factor (CPSF)
結合至mRNA
(C) 由polyadenylate
polymerase 以ATP 當原
料，利用endonuclease的
活性切斷AAUAAA後約
10至30nt處，再加上
80~250 個
A。此時poly-A binding protein結合至tail上，此蛋白可以抑制
mRNA被deadenyltion及decapping，並抑制mRNA分解
(D) 在poly-A tail完成之前，mRNA一直是結合在RNA Pol II上，完成後
修飾好的mRNA離開，剩餘的RNA由5’exonuclease分解。RNA Pol
II 繼續往下去轉錄下一個基因或離開
※ polyadenylation factor、polyadenylate polymerase共同和RNA Pol II
形成complex
(3) Alternative processing of complex transcript
同一條mRNA可藉由不同的剪接位置表現出不同的蛋白
(A) Alternative cleavage & polyadenylation pattern：如免疫球蛋白重鏈C
chain的剪接造成Ab isotype switch

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 (B) Alternative pre-mRNA splicing：如果蠅的三種actin

三、rRNA修飾
原核與真核均需由ribonuclase進行剪切
1. 原核：
(1) 前驅物為30S的pre-rRNA transcript，經過修飾與剪切之後成為
23S, 16S, 5S的rRNA
(2) 有時會依基因不同外加數量不等的tRNA。（tRNA最小，如4S tRNA）

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2. 真核：大部分的rRNA由RNA polymerase I合成，除了5S rRNA
(1) 前驅物為45S pre-rRNA
transcript，經過修飾與剪切之
後成為28S, 18S, 5.8S rRNA
※ 5S rRNA由RNA polymerase
III合成並額外修飾
※ 45S pre-rRNA transcript會
先被包覆成90S
preribosomal complex，在
鹼基修飾與剪切後組裝成
核糖體送出細胞核
(2) 需要snoRNA(small nucleolar
RNA)進行鹼基的修飾。
(A) snoRNA 和 蛋 白 質 組 成
snoRNP，主要負責催化多
種RNA（包含rRNA、tRNA、
snRNA等）的鹼基修飾以及
剪切
(B) 可分為兩大類
(a) Box C/D snoRNPs：負
責鹼基甲基化
(methylation)，甲基由
SAM提供
(b) Box H/ACA
snoRNPs：負責假尿嘧
啶核苷(pseudouridine,
φ)的形成

【複習】核糖體rRNA
原核細胞 30S = 16S rRNA；50S = 5S + 23S rRNA；30S+50S = 70S
真核細胞 40S = 18S rRNA；60S = 5S+ 5.8S + 28S rRNA；40S+60S = 80S

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四、tRNA修飾
不論原核與真核都需要經過以下方法修飾：
1. 切除5’（藉由RNase P）及3’（藉由
RNase D）多餘序列
2. 在3’加上5’-CCA-3’序列：之後用來
和胺基酸鍵結用。
3. 鹼基修飾：藉由snoRNPs
4. 切除tRNA內含子(intron removal)：
某些真核tRNA具內含子；細菌
tRNA皆不具內含子

國考題
1. 真核生物RNA polymerase Ⅱ的carboxy-terminal domain（CTD）被磷酸化時，開始
進行
(A) Initiation
(B) Elongation
(C) Termination
(D) Carboxylation
2. 有關真核細胞之mRNA之轉錄後修飾，下列敘述何者錯誤？
(A) 5’-capping of RNA可以保護mRNA避免5’端被分解
(B) 3’ poly A的修飾可以影響RNA之穩定度
(C) Splicing需要snRNA之參與
(D) 3’ poly A之修飾完成後，mRNA方能進行splicing
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B. RNA干擾(RNAi)
一、概述
1. miRNA為內生性(endogenous) RNA，前驅物pri-miRNA來自部分non-coding
sequence的轉錄。
2. siRNA則為外源性(exogenous) RNA，可能是病毒感染或是實驗室合成的。亦
有可能是細胞內產生的雙股RNA裂解形成。
※ 因此siRNA可協助抵抗RNA病毒感染，在缺乏完善免疫系統的植物尤為重
要

二、miRNA的專一性比較低，序列不必完全互補即可達到沉默作用，siRNA則必須完
全互補(專一性強)
-----------------------------------------【內生miRNA】------------------------------------------
在初級轉錄產物pri-miRNA上會有一些序列可以互補形成hairpin的結構，這時候
會被一種叫做Drosha的RNase把hairpin以外的部分切掉形成pre-miRNA

------------------------------------------【外來siRNA】------------------------------------------
接著會被Dicer蛋白切碎成小片段，形成大約20nt大小的miRNA（小片段雙股RNA）
1. 雙股RNA被分開，接上由一堆阿撒布魯的蛋白質變成RISC (RNA-induced
silencing complex)，或稱miRNP，包含slicer與helicase活性蛋白
2. RISC如果看到和自己序列完全互補的mRNA，就會將mRNA切斷，切斷的
mRNA隨後降解掉
3. （僅限miRNA）RISC如果看到和自己序列大致互補的mRNA，會抑制該段
mRNA轉譯，藉此阻礙轉譯作用和後續的蛋白質表現

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 4. miRNA與目標mRNA的序列不一定要完全互補即可達到基因沈默的效果，而
典型的siRNA 與目標mRNA的序列則必須完全互補，故miRNA 通常可以同時
抑制具有相似序列的mRNA表現，而siRNA僅能對特定的、單一的mRNA有作
用。
5. shRNA, siRNA, miRNA, long ncRNA  post-transcription regulation

三、特殊RNA (由RNA Pol II製造)

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C. 轉錄調控蛋白
一、多種轉錄因子藉由和DNA結合來調控基因表現
許多轉錄因子(transcription factors)具有特殊結構能夠辨識特定調控DNA序列，進
而影響（正調節或負調節）基因的表現；包括改變染色質構造、召集其他轉錄調
節因子、直接或間接影響RNA合成率的改變
※ 大多數轉錄調節蛋白質結合DNA前，需藉由蛋白質-蛋白質相互作用，形成二
聚體(dimer)或多聚體(polymer)。

二、轉錄因子的特殊結構
1. 活化功能區(activation domain)
這些蛋白質通常經由活化功能區和coactivator complex（例如mediator）交互作
用而促進轉錄啟動
2. DNA結合功能區(DNA-binding domain)
可以辨識特定的 DNA 序列，也就是辨識DNA雙螺旋的外側表面的大凹槽與
小凹槽的鹼基對。

三、DNA結合功能區的蛋白特殊結構可以幫助辨識DNA序列，原核、真核細胞皆有
1. Helix-Turn-Helix (HTH)：
(1) 在原核與真核細胞，DNA結合蛋白質最普遍的DNA結合功能區的結構
(2) 通常都是以二聚體（dimer）的型式與DNA結合
(A) 較C端的螺旋會結合在DNA的凹槽，故
稱為辨識螺旋(recognition helix)，可以
幫助DNA序列專一性的辨識
(B) 另一個螺旋則與辨識螺旋間形成疏水
性作用，以穩定此DNA結合結構

(3) lac operon中的lac repressor四聚體即為Helix-Turn-Helix結構

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2. Zinc finger：
Zinc是協調(coordinated)的功能，不用來直接跟DNA結合。注意這邊的Zn也可
能被Fe所取代掉
(1) C2H2：
(A) 在此結構中，Zn會與兩個Cys及兩個His形成鍵結，將α-helix及β-strand
抓在一起，Zinc finger protein的長度通常很短，這種鋅指常常叢集，幾
個鋅指的α-helix一起結合在 DNA 的大凹槽中
(B) 如TFIIIA，它包含了連續九個鋅指結構域，每個鋅指結構域由約 30 個
胺基酸所組成。
(2) C4：
(A) 在此結構中，Zn會與四個
Cys形成鍵結，將α-helix及
β-strand 抓在一起
(B) 如細胞的固醇類激素受體
(steroid hormone receptor)，
其本身就是轉錄因子，具有
2個C4結構區。此受體亦以
雙聚體形式與DNA結合，
辨 識 的 DNA 包 含 2 個
palindromic half sites

3. basic region-leucine zipper (bZIP)

(1) 其特性為每七個胺基酸有一個 Leu
(2) 這類蛋白質通常以雙聚體型式 (dimer)，
由兩條α-helix組成coiled coil的結構。可
利用側面成排的 Leu 間之疏水性作用，
像拉鏈般與DNA 相結合，形狀像「X」
(3) 其雙聚體可以是來自相同的蛋白質，稱
為同聚體(homodimer)；也可能是具有兩
種相異的 DNA 結合功能區一起辨識一
段 DNA，稱為異聚體(heterodimer)
(4) 【舉例】Fos, Jun, CREB
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4. Helix-loop-helix (HLH)
(1) 和bZIP一樣先形成homo-或hetero-dimer才能結合到DNA上。單體的兩個α-
helix不連續，中間以loop連結。
(2) 有些 HLH 蛋白質缺乏可提供鍵結DNA的extended α-helix，即缺少 DNA
結 合 功 能 區 ； 當 這 些 蛋 白 質 與 含 全 長 的 HLH 蛋 白 質 形 成 異 聚 體
(heterodimer)，則不能與 DNA結合
(3) 【舉例】myoD、myc、max等肌肉表皮相關的基因

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D. 原核生物基因調控──操縱組(Operon)
【總論】
 E. coli已被定序出4300個基因，也就有能力產生4300種蛋白，但並不是同時產生
的，故何時需要表現哪一種蛋白就需要嚴密的調控。
 σ 因子決定RNA聚合酶辨識基因的特異性
 基因結構主要為操縱組模型，即相關功能的基因會群聚在一起，例如Trp
operon，即為與Trp合成相關的基因群聚在一起。有助於協調性的調節
一、介紹
1. 操縱子由一群功能相關的基因組成，為一個轉錄的調節單位(regulatory
unit)。
2. 主要包含有三種構造

(1) 結構基因(structure gene)：可產生蛋白質或RNA產物（rRNA, tRNA）。

(2) 控制元素(control element)：結構基因上游，為轉錄的開關，如啟動子
(promoter)與操縱子(operator)。
(3) 調節基因(regulatory gene)：常位在結構基因上游（但也可能出現在下游，
或是很遠的地方），可製造出抑制子(repressor)，來控制Operon的開關。

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二、乳糖操縱組(Lactose operon)──正調控
E. coli有葡萄糖時會優先使用葡萄糖；而無葡萄糖僅有乳糖時，才使用乳糖進行
代謝，故代謝乳糖的酶只要在無葡萄糖有乳糖時表現即可。

1. 操縱組內容

(1) 結構基因
LacZ：β-galactosidase / LacY：Permease / LacA：Transacetylase
※ β-galactosidase可將由permease帶進來的乳糖代謝成allolactose，作為
inducer。同時，其亦可將乳糖代謝成葡萄糖與半乳糖。
(2) 控制元素(調控功能的DNA序列)
(A) LacO：即Operator，供repressor結合之用
(B) LacP：即Promoter。在Lactose operon上，調控轉錄起始的序列，可分為
以下兩部分：
(a) RNA polymerase interaction site：供RNA聚合酶轉錄之用。
(b) CAP site (catabolite activator protein binding site)：CAP蛋白和cAMP
結合之後，其複合體可結合到CAP site上，促進mRNA的轉錄。
(3) 調節基因
LacI：可表現出repressor，4個repressor形成四聚體(tetramer)，可與Operator
結合。

2. CAP (catabolite activator protein)：

(1) 是一種能與cAMP結合的蛋白，結合後的複合體可與CAP binding site（位於
promoter，RNA polymerase interaction site上游）結合，促進mRNA合成。
(2) CAP-cAMP能增加轉錄效率的原因是因為其會造成DNA彎曲，促進CAP與
RNA Pol交互作用，使RNA Pol更能結合到promoter上
(3) Catabolite repression
就算細胞裡有足夠的乳糖，但只要葡萄糖還有，乳糖的代謝速率還是很慢。
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 因為葡萄糖會抑制胞內的adenylyl cyclase，進而抑制CAP-cAMP合成，故只
有當葡萄糖量不足時，才會大量轉錄代謝乳糖的酵素

(4) CAP-cAMP也參與其他許多操控組的調控，因而可以藉由此共通轉錄調控
因子達到偕同調控(coordinated regulation)一群相關操控組。一群操控組受
到同一共通轉錄調控因子可稱為Regulon。

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3. 環境中缺乏乳糖

(1) LacI可順利的表現出Repressor，並形成四聚體與Operator結合
(2) 由 於 Operator 和 RNA polymerase interaction site 有 重 複 的 地 方 ， 所 以
Repressor的結合會造成RNA聚合酶無法結合上來，導致轉錄無法進行
(3) 如果環境中有葡萄糖，此時出現catabolite repression使得RNA Pol更無法結
合到DNA上

4. 環境中僅有乳糖

(1) 少量的乳糖(lactose)會變成乳糖異構物(allolactose)，在這裡是當作促進子
(inducer)的角色。
※ 【注意】inducer是allolactose，不是lactose
※ 實驗室常用的inducer是IPTG，可藉由permease帶進細胞，不會被β-
galactosidase代謝
(2) Inducer會與Repressor四聚體結合，並使Repressor失去活性，不能結合到
Operator
(3) 由 於 Operator 並 沒 有 被 Repressor 四 聚 體 所 結 合 ， Promoter 才 能 與 RNA
polymerase結合，故轉錄才有機會進行。但仍需活化因子(Activator) cAMP-
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 CAP參與，表現出可代謝乳糖的酶。

5. 【總結】當只有乳糖存在時，細菌用乳糖做碳源；當沒有乳糖或葡萄糖與乳
糖共同存在時，細菌用葡萄糖做碳源

【小補充】
1. 操縱組的 Dyad symmetry
Dyad symmetry 是一串回文序列，又稱作 palindrome，常會使單股核酸出現
hairpin loop，如 ρ-independent termination pathway 中的 RNA hairpin loop 即包含
此類序列。在乳糖操縱組中 dyad symmetry 出現於 CAP 與 repressor 接合處，可
供辨識並接合。想一想：那為什麼 RNAP
接合處沒有 dyad symmetry 呢？ 提示：
還記得轉錄是單向的嗎？

2. 假操縱子
Lac operon 有兩個 repressor 的第二
結合部位，O2 位在+410，O3 位在-90，作
為 repressor 的四聚體結合至這些位置後
可以形成更穩定的 complex

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三、色胺酸操縱組(Tryptophan operon)──負調控
E. coli在無法從外界取得Trp的情況下，會啟動基因的表現，製造出生合成Trp的
酵素。
1. 操縱組內容

(1) 結構基因：
為trpA到trpE，這些基因可以表現出合成Trp所需的5個酵素。
※ trpB, trpC這兩段mRNA含有會轉譯出Trp的密碼子(codon)，至於其箇中
滋味留待後面慢慢體會
(2) 控制元素
(A) trpP：為啟動子，可讓RNA聚合酶附著，轉錄出trpA到trpE的mRNA，
會受到操縱子的調節。
(B) trpP2：亦為啟動子，但僅能轉錄出trpA到trpC的mRNA，然而卻不會受
到操縱子的調節。
(C) trpO：為操縱子，可與Trp-repressor complex結合，使轉錄中止。
(Trp本身當作corepressor的角色)
(D) leader peptide：又稱trpL，在trpE之前，具有調節基因的功能
(3) 調節基因
trpR位置在控制元素的上游，可轉譯出repressor
※ Repressor為homodimer的結構，所以每個repressor要和2個Trp結合才會
產生作用

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2. Attenuator region(trp a)和其所轉譯出的Leader peptide會調控基因的表現

(1) 在trpE的上游有四段基因，會表現出Leader peptide基因的位置在domain 1，

而Poly-U片段上游處為domain 4。Leader peptide中含有連續兩個Trp codon
(2) Attenuation：若環境中有Trp時，則核糖體可以快速通過會轉譯出Leader
peptide的domain 1而來到domain 2，但此時domain 3與4
會以ρ-independent的方式使轉譯提前中止（GC rich→
髮夾，後有多U片段，形成3-4 stem-loop結構）
(3) 若環境中缺乏Trp，則核糖體會卡在能轉譯出Leader
peptide的domain 1，使得domain 2與3反而形成髮夾（2-
3 stem-loop），如此便可順利進行轉譯。
(4) 其他如His與Thr操縱組也有類似的情形。

3. 環境中缺乏Trp
(1) 由於並沒有複合體與啟動子結合，故trpA到trpE都可以被轉錄出mRNA。
(2) 要注意的是，即使mRNA可以被轉錄出來，在要轉譯出蛋白質的過程中，
僅有trpA, trpD, trpE可以被轉譯，因這三段mRNA中並不包含會轉譯出Trp
的密碼子
(3) trpB, trpC這兩段mRNA含有會轉譯出Trp的密碼子，故此時因環境中缺乏
Trp，trpB, trpC是無法被轉譯的。因此在trpD基因內會有第二個Promoter
(trpP2)，不受Operator與Repressor的調控，其目的即是讓環境中有Trp時，
事先將trpB, trpC所表現的蛋白質先轉錄出來，當極度缺乏Trp時即可被拿
來利用（做出來放的意思）。
(4) 最後，Trp生合成時所需的酵素還是都會被製造出來，以解決環境中缺乏
Trp的處境。

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4. 當環境中有Trp時

(1) Trp是一種corepressor，可與repressor結合，這個Trp-repressor complex便

能與trpO結合
(2) 由於trpO是位在啟動子裡面，故這個複合體會阻擋RNA聚合酶的結合位，
同時，attenuation作用發生，使trpE和trpD無法被表現。
然而，trpA到trpC是可以被表現的，因trpP2不會受到操縱子的調節（讓trpB,
trpC可被轉譯）。

5. 總結：Trp operon可以完美的調控其基因的表現與否，其方法有：
(1) Trp可和repressor結合，並與操縱子結合  防止基因過度表現（反應慢，
長效）。
(2) 由於有trpP2，即使環境中有Trp，仍可轉譯出trpB, trpC的蛋白質，等到環
境中缺乏Trp時再來利用，但若這些蛋白被利用完了也不能再被製造
 防止基因過度表現。
(3) Trp和repressor結合，抑制trpR的轉錄  防止基因過度不表現
(4) Trp合成酵素的負回饋抑制： trpE, trpD之產物anthranilate synthase上有
allosteric site供Trp結合（反應快，短效）

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四、組胺酸操控組(Histidine operon)──負調控
1. Histidine operon也有leading peptide (histidine比例高)。
2. 細胞內histidine多則leading peptide轉譯較快(核糖體跑比較遠，幫助Loop形成)
→mRNA形成hairpin loop→轉錄被抑制，構造基因表現減少。
3. 細胞內histidine少則leading peptide轉譯較慢(核糖體在His codon附近，阻礙Loop
形成)→mRNA不形成hairpin loop→轉錄進行，構造基因表現增加。

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五、SOS應急反應
1. SOS反應廣泛存在於原核生物
和真核生物中，為一種誘導
DNA修復和應急的反應，在
細胞DNA受到嚴重損傷或
DNA複製系統受到抑制的緊
急情況下表現的一系列修復作
用。
2. SOS系統平時不開放是因為系
統中的基因群受LexA蛋白抑
制，在有單股DNA和ATP存在
時，RecA蛋白質被啟動而表
現水解能力，它能分解λ噬菌
體的抑制蛋白和LexA蛋白
※ RecA蛋白不僅在同源重組中
起重要作用；它也是SOS反應
的最初啟動因子。注意RecA
不是蛋白酶(protease)，而是
藉由加速Lex A的自我分解來
抑制LexA，因此可說RecA是
一種co-protease
3. 當LexA蛋白被RecA蛋白水解後可以使一系列修復基因表現，並使SOS系統啟
動。表現的基因包括修復基因UvrA、UvrB、UvrC以及RecA和LexA基因本身；
還有單股結合蛋白基因SSB、與λ噬菌體DNA整合有關的基因HimA、可轉譯
出DNA聚合酶的UmuDC、DinAB、與細胞分裂有關的基因SulA等

國考題
RecA是救命反應(SOS response)的主要調控蛋白質,導致受LexA repressor調控的基因
表現增加,其作用機制為何?
(A) RecA協同DNA聚合酶,將LexA repressor從操縱基因(operator)上移除
(B) RecA直接結合到LexA操縱基因(operator)的位置上,使LexA repressor從操縱基因
(operator)上分離
(C) RecA與LexA repressor結合而弱化LexA repressor與操縱基因(operator)結合的親和
力(binding affinity)
(D) RecA與LexA repressor結合,引發LexA repressor的自體裂解(self-cleavage)
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E. 真核生物基因調控
一、調控層級

其中○
1 轉錄起始步驟是控管整個基因表現最重要的一環

二、轉錄起始(initiation of transcription)之調控

※ Housekeeping gene：由於是維持細胞正常生理而持續表現的基因(例如 APC

gene)，其上常有 GC box 的序列。
1. 調節序列與調節蛋白質
(A) cis-acting element：調控結構基因的 DNA 序列
啟動子區（包含 TATA box、GC box、CAA box 等）、增強子(enhancer)、沉
默子(silencer)
(B) trans-acting element：基因的調節蛋白質
如真核細胞的轉錄調節因子(transcription factors)可分成
(a) 通用型轉錄因子(general transcription factors)：是 RNA 聚合酶結合啟
動子所必需的一組蛋白因子
(b) 特異型轉錄因子(special transcription factors)：為個別基因轉錄所必需
(a) 轉錄活化因子(transcription activators)、共活化因子
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 (b) 轉錄抑制因子(transcription repressors)、共抑制因子

2. 將組蛋白(histone)乙醯化可活化轉錄
組蛋白為帶正電的蛋白質，可和帶負電的 DNA 緊密結合。一旦組蛋白被乙
醯化，它與 DNA 的結合就會鬆開，就能活化基因的表現。
(A) 乙醯化的位置在組蛋白中 Lys 的側鏈（ε 碳）上，由 HAT(histone acetylase)
催化，一旦被乙醯化，造成正電荷的屏蔽效應(masking effect)，與 DNA 之
間的靜電作用力會下降。

(B) DNA 與組蛋白若纏繞疏鬆就可以進行轉錄，這個狀態稱為 euchromatin。

※ 處於此狀態的 DNA 對核酸酶（如 DNase I）的敏感度提高，更容易被
核酸酶切割。實驗中可使用 DNase I 加入染色質溶液，切出約 200 nt 或
其倍數的片段，可證明 DNA 有規律的包覆結構（核小體結構）
(C) 相反的，將組蛋白去乙醯化，使 DNA 與組蛋白纏繞緊密就不能進行轉錄，
這個狀態稱為 heterochromatin

3. DNA 的甲基化可以抑制基因的表現
透過抑制蛋白(repressor)或 DNA 甲基化(methylation)，能阻斷啟動轉錄所必需
的前起始複合體(preinitiation complex)組成的過程
(A) 甲基化發生在 5’-CpG-3’，也就是所謂的 CpG island。位置在 Cytosine 鹼
基的 C5 上
(B) CpG island 常位於基因的啟動子附近
(C) 一旦 Cytosine 被甲基化，就會吸引 methylcytosine binding protein 來結合，
導致基因轉錄被抑制。可能包括下列方式
(a) 干擾轉錄因子對 DNA 的識別
(b) 將轉錄因子所識別的 DNA 序列轉化為轉錄抑制蛋白(repressor)的結合
位點
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 (c) 吸 引 Corepressor 複 合 體 （ 包 含 histone deacetylase 和 histone
methyltransferase）結合，致組蛋白去乙醯化，染色質壓縮成緊密構造

(D) 在人體中，70% CpG island 是被甲基化的，癌細胞可藉由過度甲基化使抑

癌基因不活化
(E) 基因組印記 (genomic imprinting)
(a) 某些特定基因是活化型還是失活型，乃根據它們是被精子或卵子帶入
受精卵，因被認為是按照其親本來源所帶的印記(imprinting)
(b) 相 關 現 象 ： X-chromosome inactivation, Prader-Willi syndrome,
Angelman’s syndrome
(F) 一般 C to U 的自然脫胺反應會觸發 DNA 的 base excision repair；但 C 被
甲基化之後脫胺會產生 T，由於 T 仍是 DNA 正常組成，此時對應股的 G
可能被 mismatch repair 修改成 A，因此在長期不表現的基因其 C 上會被
加上許多甲基，序列中的 C 和 G 也會變得愈來愈少。

27
4. 真核細胞 DNA 除了有啟動子 TATA box 和 Transcription start site，還有 CAAT
box，以及 GC box 等 control elements，這些 box（或 control elements）可以提
供許多不同的轉錄因子做結合用，影響轉錄。
(A) Enhancer：
(a) 是指與表現基因在同一條染色體上的 DNA 序列，並且能增強促進基
因的表現，其通常距離表現基因很遠且通常不在基因內，可以在基因
轉錄起始位置的上游（往 5’端）或下游（往 3’端）。
(b) 透過 DNA 摺疊，接近表現基因並影響基因表現，且其沒有方向性
(c) 結合 Enhancer 而影響轉錄的蛋白為 Activator，屬於 trans-acting element
(B) Silencer 或 attenuator
作用與 enhancer 相反，具有減弱基因表現功能的稱之
※ 和 Trp operon 的 attenuation 功能相似，機轉不同
(C) Insulator：絕緣子又稱 boundary element，位在某些真核基因及其調控區的
周圍，可用以減輕異質染色質 (heterochromatin)的壓縮效應傳佈，區隔
(compartmentalize)基因之間的表現。若是絕緣子位在某個（可受強化子影
響的）基因的強化子與啟動子之間，則會阻礙強化

5. 每 個 RNA Pol II 轉 錄 的 啟 動 子 都 需 要 有 通 用 型 轉 錄 因 子 (General

transcription factors )、Activator、Coactivator 參與，Repressor 則會抑制轉
錄
(A) Activator：會結合 enhancer 或上游激活子序列(upstream activator sequences,
UAS 在酵母菌中) ，並促進轉錄
(B) Coactivator：
(a) Mediator：activator 和 RNA 聚合酶 II 與通用型轉錄因子之間所必需
的聯繫者，由數十個次單元組成的 protein complex，具高保守性，會
結合至 RNA Pol II 的 CTD，但不直接與 DNA 結合
(b) HAT、HMG 蛋白、Chromatin remodeling complex（如 SWI/SWF、
NURF 等）：可改變染色質結構，提高聚合酶的轉錄效率
(c) TBP (TATA-box binding protein)

28
在強化子與啟動子之間 DNA 會形成
外圈環 (DNA looping)，使得結合
在強化子的轉錄活化子(activator)能
夠與在遠處結合在啟動子序列上的
蛋白質增加基因的轉錄，這個機制
也會發生在細菌只是較罕見，且強
化子與啟動子距離較短。上述 DNA
looping 是由一個 architectural
protein（例如 HMG）先將 DNA 彎
曲某個角度後，其他蛋白質再陸續
結合。
※ HMG：高泳動率(high mobility group)蛋白質，為非組染色體蛋白質 (nonhistone
proteins) 的成員。大多數 HMG 蛋白大量存在於細胞核。HMG 結合在 DNA 的小
凹槽而彎曲該 DNA。
(C) Repressor：已知有些抑制子會跟活化子競爭 DNA 調控序列，或可能會
結合在活化子的活化功能區，或是比活化子早一步先結合在調控序列，或
者是引入染色質重建複體或組蛋白去乙醯酶使染色質緊密無法轉錄。
(D) Basal transcription factors：包括, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH
※ 在原核生物則只有 σ subunit

29
6. 組合調控 (combinatorial control of gene expression)
單一基因有多個轉錄因子與其個別DNA 調控位結合，一起決定啟動子的轉錄
起始程度

7. 真核基因的表現也受胜肽激素(peptide hormones)和其他激素、代謝物所調節

30
三、轉錄後調控
RNA processing、RNAi、轉譯層次的調控

四、癌症的基因調控
1. 影響癌症發生與否的基因主要分為 2 種：（以下兩種均存在於正常細胞）
(A) Proto-oncogene ：在正 常細胞中的某 些基因 ，當發生突變 時就會 產生
oncogene (不存在正常細胞)，1 shot (只要同源染色體的其中一股突變即可)
代表基因：
(a) Myc：轉錄因子相關
(b) Akt：和訊息傳遞相關，腫瘤惡性指標
(c) Bax：細胞凋亡相關
(d) Ras：訊息傳遞相關
(e) Cyclin D：負責控管細胞週期
(f) beta-catenin(正常時由 APC 基因抑制)

(B) Tumor suppressor：即為腫瘤抑制基因，在腫瘤抑制的機轉中扮演煞車的腳

色，2 shot (同源染色體同時突變才會引發癌症)
代表基因：
(a) p53、Rb：抑癌基因
(b) APC：大腸癌相關
(c) Neurofibromin 1/2：Neurofibromatosis 相關
(d) ATM、ATR：負責偵測 DNA 突變
(e) BRCA1：乳癌相關
(f) PTEN：和前列腺癌最有關聯
(g) Bcl2：細胞凋亡

31
 2. 不只細胞本身的突變，許多外來微生物感染也可能造成細胞的癌化，如 DNA
病毒致癌機轉多與抑制 Tumor suppressor genes 有關：
人類乳突病毒(HPV)第 16、18 型 E6 抑制 P53 子宮頸癌
E7 抑制 Rb
腺病毒(Adenovirus) E1A 抑制 Rb 嬰兒腸胃炎、
E1B 抑制 P53 結膜炎
B 型肝炎病毒(HBV) HBx 抑制 P53 肝癌
Simian vacuolating virus 40 (SV40) large T Ag 抑制 P53 及 Rb

國考題
以 RNA干擾（RNA interference）的方法抑制基因表現的可能機制之一為：
A. 抑制基因的轉錄作用（transcription）
B. 抑制基因的轉譯後修飾作用（posttranslational modification）
C. 抑制 mRNA 的剪接作用（splicing）
D. 促進 mRNA 的降解（degradation）

32
F. 轉譯與轉譯後修飾
一、核糖體：包含RNA與蛋白質
原核細胞 真核細胞
70S 80S
30S + 50S 40S + 60S
直徑18 nm 直徑23 nm

二、tRNA在RNA中具最多的修飾核苷酸
1. 5’端有一鳥糞嘌呤核苷酸鹼基(pG)殘基
2. 3’端 有一段CCA的三核苷酸序列
3. 反密碼臂含有反密碼；D arm此臂內含有不尋常的核苷酸二氫尿嘧啶

三、鹼基配對
1. 密碼子(codon)
(1) 每一個密碼是由編錄有一特定胺基酸的三個核苷酸(triplets)所構成的
(2) 64種密碼子中：
(A) 起始密碼：AUG（在真核生物對應胺基酸Met，原核生物中對應為f-Met）
(B) 終止密碼：UAA、UAG、UGA，並不編錄任何的胺基酸
(C) Met、Trp僅對應一組密碼子
(3) 退化性(Degeneracy)：胺基酸可對應兩種以上的codon稱之

2. 反密碼(anticodon)
(1) tRNA利用它上面一個由三個鹼基所構成的序列來和mRNA的密碼形成鹼
基配對
(2) 在mRNA密碼中的5’鹼基（由5’→3’方向讀起）會和反密碼的3’鹼基配對

33
3. 搖擺假說(Wobble hypothesis)：重要！
大多數密碼子3’鹼基和其相對應反密碼5’鹼基間配對較為鬆散
(1) mRNA密碼的前兩個鹼基會和相對應的反密碼間形成強的Watson-Crick鹼
基配對關係，且此為密碼專一性的主要來源
(2) 反密碼的5’鹼基決定了可被此tRNA認知的密碼數
(A) 當反密碼的5’鹼基是C或A時，鹼基配對是具專一性的，且僅有一個密
碼可以被此種tRNA所認知
(B) 但當為U或G時，則較不具專一性，而又當為I (hypoxanthine)時，可讀出
3種
(3) 由於wobble phenomenon，需要32種tRNA即可來轉譯mRNA的61種密碼

34
四、蛋白質的合成
合成可分成起始、延長及終止三個階段。合成作用開始前，反應前驅物必須要先
活化，以及完整聚合物合成後須有修飾作用。

1. 胺基酸的活化(activation of amino acid)

amino acid + tRNA + ATP → aminocayl-tRNA + AMP + PPi
(1) 20種不同的胺基酸在細胞質中藉由胺醯-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA
synthetase)的催化而酯化於相對應的tRNA分子上
※ 由於核糖體不會檢驗tRNA接上的a.a.正確與否，因此aminoacyl-tRNA
合成酶具校正功能，可以水解連結錯誤的a.a.與tRNA之間的ester bond
(2) 此反應在細胞質中進行而不是發生在核糖體上
(3) 20種胺基酸各自消耗ATP能量而與特定tRNA的3’端共價鍵結，此反應需
Mg2+以及依賴性活化酵素胺醯tRNA合成酶的催化
※ 有兩種類型的酵素可以進行此反應，分別將a.a.轉移至tRNA的2'或3'-
OH上，但無論如何最後a.a.都會接在tRNA的3' CCA處

35
 (4) 同功受體tRNA (Iso-acceptor tRNA)
由於degeneracy，一種胺基酸會對應到至少一種以上的tRNA（辨識不同的
anticodon），這些會接上相同胺基酸的tRNA便稱為同功受體tRNA

2. 起始(Initiation)
(1) AUG：起始密碼指定胺基端的甲硫胺酸
細菌  fMet；真核細胞  Met
(A) 在細菌，對甲硫胺酸具專一性的兩種tRNA分別以tRNAfMet及tRNAMet表
示。在真核細胞，所有的多胜肽都是細胞質核糖體以Met殘基不是fMet
開始進行合成
(B) 細菌fMet-tRNAfMet的合成
(a) Met + tRNAfMet + ATP  Met-tRNAfMet + AMP + PPi PPi  2 Pi
(b) N-甲醯四氫葉酸 + Met-tRNAfMet 四氫葉酸 + fMet-tRNAfMet

(2) 在細菌內，多胜肽鏈合成的起始需要：（依序）
30S核糖體次單元、mRNA、起始的fMet-tRNAfMet、三種起始因子蛋白質
（細菌為IF-1、IF-2及IF-3）、GTP、50S核糖體次單元、Mg2+
(A) 核糖體可和胺醯-tRNA結合的位置有三個，分別為胺醯位(A site)、胜肽
位(P site)、出口位(E site)
(a) 胺醯位(A位)：所有其他進入的aminoacyl-tRNA首先會先結合到A
位上
(b) 胜肽位(P位)：起始的(5')AUG可以定位在P位
(c) 出口位(E位)：未負載有胺基酸的tRNA離開核糖體的位置
(B) IF-1佔據了A位，阻止tRNA在轉譯起始時，進入該位。（起始tRNA應
結合在P位）
(C) IF-2和GTP結合形成GTP-IF2，再與30S核糖體結合。
(D) IF-3結合在E位，防止50S和30S連結形成70S核糖體。

36
 IF-1 結合至30S的A位，以防止tRNA過早結合A位
GTPase
IF-2
促進initiator tRNA (fMet-tRNAfMet)結合至30S
結合至30S的E位，以防止50S過早結合30S
IF-3 協助mRNA結合至30S
提高P位結合fMet-tRNAfMet的特異性

(3) 30S核糖體次單元與IF-l及IF-3兩個起始因子結合，mRNA再結合到30S次單
元 。 而 30S 次 單 元 結 合 是 由 mRNA 位 於 AUG 上 游 purine rich 的 Shine-
Dalgarno序列引導，與16S rRNA互補配對。

(4) 包含有30S核糖體次單元、IF-3及mRNA的複合體，接著再加入有GTP結合
的IF-2及起始的fMet-tRNAfMet
(5) 這一個複合體會和50S核糖體次單元結合，同時，結合在IF-2的GTP會水解
成GDP及Pi，而從複合體中釋放出去。所有的三個起始因子在此時都會從
核糖體離開
(6) 所有步驟完成後，會產生一個稱為70S起始複合體

 真核細胞
 核糖體從mRNA的5’ cap開始，直到遇到第一個AUG
 PABP (Poly-A binding protein)結合mRNA 3’端的Poly-A tail
 真核細胞共有13個起始因子(如下表)

eIF1 在eIF2之前，先接上40S的E位
促進eIF2-tRNA-GTP ternary complex和40S的結合
eIF1A 在eIF2之前，先接上A位以避免tRNA過早結合A位
eIF2 GTPase
促進Met-tRNAMet結合至40S的P位
eIF2B* 和40S次單元結合，促進後續步驟進行
eIF3 和40S次單元結合，促進後續步驟進行

37
 和eIF6、60S次單元結合，防止60S和40S過早結合（eIF3和eIF6
合稱anti-association factor）
eIF4F 為eIFA+eIFG+eIFE
eIF4A 為RNA helicase
移除mRNA二級結構以和40S結合
eIF4B 和mRNA結合，協助40S Scan第一個AUG位點
eIF4E 為Cap binding protein (CAP)，結合至5’ cap of mRNA
eIF4G 與eIF4E、PABP結合
eIF5 促進其他IFs離開40S，讓40S得以和60S結合形成80S核糖體
eIF5B* GTPase homolog，協助eIF5做事
eIF6 anti-association factor之一

原核轉譯(Initiation) 真核轉譯(Initiation)

43S PIC = 40S + eIF1/eIF1A/eIF3 +

eIF2-Met-tRNAiMet-GTP ternary complex (eIF2-TC)

38
 ※在真核細胞的轉譯起始階段，43S preinitiaiton
complex接上mRNA成為48S initiation complex。
此時40S核糖體接上的eIF4E結合至mRNA的5’
cap，PAB則結合上3’ tail，eIF4A利用helicase活
性解開二級結構並找到起始AUG。轉譯起始點
原則上是第一個AUG出現的位置，但更精確則
是由Kozak consensus所包圍的AUG作為起始。

3. 延長(Elongation)
(1) 延長作用的進行需要
上述的起始複合體、aminoacyl-tRNA、一組由三個細胞質中的可溶性蛋白
質所構成，稱為延長因子的蛋白質(在細菌內為EF-Tu、EF-Ts及EF-G)、
GTP
(2) 欲加入aminoacyl -tRNA的結合：第二個進入核糖體A位的aminoacyl -tRNA
結合有EF-Tu，此因子也含有GTP，結合後，GTP水解，EF-Tu-GDP複體自
70S核糖體被釋出。EF-Tu-GTP複體可由EF-Ts及GTP的作用而再次產生

(3) 胜肽鏈的形成：藉由與tRNA相接，而仍然結合在核糖體A、P位上的兩個
胺基酸間形成胜肽鍵，於A位上胺基酸的-amino group為一親核基與P位上
的peptidyl-tRNA carbonyl carbon作用，取代了P位上的tRNA而形成胜肽
鍵

39
4. 移位作用

(1) 核糖體會向mRNA的3’端移動一個密碼的距離
(2) 核糖體的tRNA由A拉至P位，而使得原來在P位上空的tRNA釋放至細胞質
(3) 核糖體沿著mRNA移動需要EF-G，以及由另一GTP水解所提供的能量

40
 延長(Elongation) 終止(Termination)

5. 終止(Termination)
(1) 在mRNA上最後一個胺基酸密碼後緊接著的三個終止密碼(UAA、UAG、
UGA)，任一個密碼出現時即為終止訊號
(2) 在細菌內，一旦終止密碼佔據了核糖體的A位，三個終止因子(Releasing
factors)，RF1、RF2及RF3即可造成末端胜肽鍵水解
※ 在真核，則是只有一個RF，稱eRF
(3) 游離的多胜肽鏈及最後一個空的tRNA，從P位釋放出來
(4) 70S核糖體解離成30S及50S次單元

41
※原核與真核生物轉譯整理★★★

42
五、做好的蛋白質運往目標胞器
在真核細胞內，蛋白質被製造出來之後，不論是會被分泌出去，插在膜上或送入溶
糖體(lysosomes)，在這些運往標的位的途徑中，最重要的組成是一段短的胺基酸序
列，這個序列稱為訊號序列(signal sequence)
1. 內膜系統：部分的溶酶體蛋白質、細胞膜蛋白、分泌性蛋白質、內質網(ER)及
高基氏體的蛋白質，其訊號序列能指引它們移位至內質網內膜。在轉譯過程中
即會透過信號識別顆粒(Signal recognition particle, SRP)結合直接進入ER，稱
作Cotranslational translocation
(1) 在合成這些帶有這些訊號序列的蛋白質時，當訊號序列由核糖體上露出來
時，訊號序列與核糖體即會被SRP結合，之後SRP即與ER上的SRP receptor
結合幫助蛋白質進入ER，此時訊號序列會被移除。胜肽鏈繼續在ER中合
成。

(2) 內質網腔內，新合成的蛋白質會以數種方式進行更進一步的修飾。許多蛋
白質會被糖化(glycosylation)，再移往高基氏體進一步的修飾進行分類與糖
化，最後送至細胞膜上或分泌至胞外。若胜肽鏈上的Mannose被高基氏體
的Phosphotranferase磷酸化，則會送至Lysosome分解。

2. Protein targeting：屬於葉綠體、粒線體、細胞核與部分ER的蛋白被合成後不會
被送至內質網而是直接送往該胞器中。此類蛋白須等轉譯完成後才會被送進目
標胞器，稱作Post-translational translocation

43
 ※ 注意細胞膜的膜蛋白也是經
由此途徑，但沒有訊號序列
※ 運往細胞核的訊號序列(NLS)
不會被切割，透過Importin
(NIR)協助送入細胞核

六、蛋白質的分解
1. 在大腸菌內，許多蛋白質都是以稱為Lon的ATP-依賴性蛋白質分解酶來分解
2. 在真核細胞內，蛋白質的分解主要有兩種途徑
(1) 和泛素(Ubiquitin)這一個存在於所有真核生物界的蛋白質有關，被泛素共
價標記的蛋白質之後由稱為Proteasome的蛋白質複合體代謝。此過程需要
消耗ATP
(2) 胞外的蛋白質透過溶酶體進行分解。此外在細胞自噬(autophagy)過程中，
老舊的蛋白質或用於緊急提供能量的蛋白質也是經由此路徑分解。

44
七、蛋白質合成作用可被許多抗生素及毒素所抑制★★
原核細胞
抑制50S核糖體 抑制30S核糖體 其他機轉
氯黴素(Chloramphenicol) 四環黴素(Tetracycline) 嘌呤黴素(Puromycin)
紅黴素(Erythromycin) Aminoglycoside類抗生素 鏈黴素(Streptomycin)
真核細胞
抑制60S核糖體 抑制40S核糖體 其他機轉
篦麻蛋白(Ricin) 四環黴素(Tetracycline) 嘌呤黴素(Puromycin)
環己亞胺(Cycloheximide)
志賀毒素(Shiga toxin) 白喉毒素(Diphtheria toxin)
類志賀毒素(Verotoxin)

1. 嘌呤黴素(Puromycin)
它的結構非常類似胺醯-tRNA的3’端，因此使得它可以和核糖體的A位結合，並
參與胜肽鍵的形成而產生胜肽基。可同時抑制原核與真核生物的蛋白質合成
2. 四環黴素(Tetracycline)
由堵住30S或40S核糖體A位，使其無法和胺醯-tRNA結合，而抑制蛋白質的合
成。可同時抑制原核與真核生物的蛋白質合成，但哺乳類動物較不受影響
3. 鏈黴素(Streptomycin)
作用在原核，在低濃度時導致mRNA misreading，在高濃度時則抑制initiation
4. 氯黴素(Chloramphenicol)
藉由抑制50S核糖體胜肽轉移酶的作用阻礙了胜肽的轉移，而抑制原核生物核
糖體進行蛋白質的合成
5. 環己亞胺(Cycloheximide)
會抑制真核細胞80S核糖體的胜肽轉移酶並抑制translocation
6. 篦麻蛋白(Ricin)
移除23S rRNA腺嘌呤，抑制真核的核糖體60S次單元作用
7. 白喉毒素(Diphtheria toxin)
由白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)產生，基因位於菌內的β噬菌體基因中。
使EF-2失去功能，抑制真核細胞轉譯的elongation phase，使細胞死亡造成發炎
8. 志賀毒素(Shiga toxin)
由志賀氏菌(Shigella dysenteriae)產生，藉由改變rRNA結構使真核60S核糖體失
去功能

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9. 類志賀毒素(Shiga-like toxin/Verotoxin)
由腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E. coli, EHEC)產生，機轉同志賀毒素，
造成溶血性尿毒性症候群(hemorrhagic uremia syndrome, HUS)

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八、其它重點
1. 原核生物轉錄、轉譯可同時發生；真核生物轉錄在核質（rRNA轉錄在核仁）
，
轉譯在細胞質
2. 新合成的多胜肽鏈所進行的摺疊及修飾
(1) 胺基端及羧基端的修飾作用
(2) 喪失訊號序列
(3) 個別胺基酸的修飾作用
(4) 輔基(prosthetic group)的加入
3. 蛋白質醣基化★
N-linked glycosylation O-linked glycosylation
只發生在Asn-X-Ser/Thr的序列， 沒有特定序列，在Ser/Thr的O上
序列
Asn的N上
位置 ER及高基氏體 主要在高基氏體
N-acetylglucosamine N-acetylgalactosamine
常見醣基 Mannose
Glucose
ER的Dolichol phosphate作為醣基
其他
合成的模板

國考題
1. 真核細胞蛋白質合成的啟始階段(initiation stage)需要轉譯起始因子 4F(eIF4F)複合
物的參與,下列那一種轉譯起始因子不包含於此複合物中?
A. eIF4A
B. eIF4B
C. eIF4E
D. eIF4G
2. 有關真核細胞之蛋白質分解，下列敘述何者錯誤？
A. 均不須 ATP 之參與
B. Trypsin 可水解 lysine 後之胜肽鍵
C. 泛素化（Ubiquitination）參與蛋白質分解機制
D. Lysosome 具 proteases 可以分解胞內蛋白質

47
G. 生物科技
一、PCR (Polymerase Chain Reaction)
1. 要進行PCR時需要：
(1) 當 模 板 (template) 的 DNA （ 若 樣 本 為 RNA ， 需 先 經 由 逆 轉 錄 (reverse
transcription)PCR生成cDNA）
※ RT(reverse transcriptase)-PCR：需要反轉錄酶（RNA-dependent DNA
pol） 、RNaseH、DNA polymerase、oligo dT（作為反轉錄酶的primer，
可以直接接在mRNA的poly-A tail上，其他種類的primer，如random
oligonucleotide也常被使用）

(2) 4種核苷酸dNTPs (ATCG)

(3) 聚合酶(thermal stable DNA polymerase)，例如：Taq DNA polymerase
(4) DNA引子(primer)

2. PCR進行時基本上分三個步驟：
(1) denature：在高溫(95℃)時雙股DNA會打開
(2) annealing：降溫(60℃)，降到此低溫的時候引子會黏到模版上。且引子量
多，模版量少，所以模版與模版之間要黏回去機率較小，而引子會優先
與模版黏合
(3) extension：72℃左右進行DNA聚合反應，會從引子的3’端開始延長做出
產物來
3. 影響PCR成功與否的關鍵就在於引子的設計

48
二、DNA定序(DNA sequencing)
1. 中間是一段未知序列的DNA，而兩端是已知的，可用來做引子（定序時只需
用一個primer）
2. 定序時需加入DNA polymerase、dNTP之外，還要加入雙去氧核苷酸(2’,3’-
ddNTP)，一共要做四管，每管都加入四種dNTP（dGTP、dCTP、dATP、dTTP）
以及一種ddNTP
3. 以加ddGTP這管舉例：一旦開始合成。直到模版股出現C時，複製股對應的
為G，這時如果進來的是dGTP，則會繼續延長；但如果是ddGTP的話，合成
便會中斷（因為ddGTP 3’碳上沒有OH）
4. 複製股每次碰到有G的點時都有可能停下來，而形成不同的長度。當四個管
的反應都完成以後，接下來就跑膠體電泳。

5. 跑完之後膠體下部是較短的合成片段，而上部是較長的合成片段
6. 讀取的方法是由下往上讀(5’往3’讀)，所以這片的互補序列是
GCCACAGTTCTGGAC
7. 現在已經很少用這種方法，多採用螢光標記的ddNTP，或是高通量DNA定
序(next generation sequencing)

49
三、DNA cloning
1. 要做DNA cloning時一般都用質體(plasmid)來做，但當DNA片段很大時，就
要考慮用別的載體，最大的可用yeast artificial chromosomes (YACs)，可以接
200~500kb。
DNA載體種類 可接入的DNA片段
Plasmid <5kb
Bacteriophage λ DNA 15~25kb
Cosmid vector 45kb
Bacterial artificial chromosomes (BACs) 100~200kb
Yeast artificial chromosomes (YACs) 200~500kb

2. pBR322 plasmid
(1) 質 體 上 有 兩 個 基 因 ， 一 個 是 ampicillin resistance 的 基 因 ， 另 一 個 是
tetracycline resistance 的 基 因 。 若 把 帶 有 這 兩 個 基 因 的 質 體 ， 轉 殖
(transform)到細菌裡，細菌就會表現這兩個基因，如此一來細菌就可以
生長在有這兩個抗生素存在的環境裡。
(2) 質體上有很多限制酶作用切割的位置(enzyme site)，用以接入適當DNA
片段。這都是獨一無二的，只有一個點。如果用限制酶切只會切一刀，
就會變成線型(linear)的質體。如PstI, BamHI, SalI, EcoRI都是很常用來切
割的地方。

50
3. DNA重組指的是一段DNA接入其他的序列：
(1) 右邊是質體DNA，左邊的
一段外來DNA片段。
(2) EcoRI限制酶切開右邊質體
和外來DNA，切開後把質
體和DNA片段混在一起。
(3) 這DNA fragment的兩側會跟
切開的質體兩側互補，因為
切開的部份會有一個黏性端
(sticky/cohesive end)。
(4) 質體中間切開的部份可用來
插入(insert) DNA 片段，再
用DNA ligase接起來。
(5) 這樣形成的DNA叫做重組
DNA (recombinant DNA)，
就是包含外來的DNA。但
DNA片段也有可能沒接進
來，質體又重新黏合
(reanneal)回去。

(6) 需經過篩選才能得到重組的DNA：
(A) 質體用限制酶切開，位置是tetracycline抗藥性的部份。接著genomic
DNA也用相同的限制酶切開，得到DNA片段。
(B) 把兩者混在一起做接合，有些片段會接合進來，有些沒有接合進來，
於是會有兩種產物
(C) 把這兩種產物隨機送到E. coli裡，E. coli可能吃進第一種或第二種
質體，甚至沒有吃進質體。
(D) 把E. coli塗到有ampicillin的培養皿上，若沒有質體的E. coli會死亡，
而有質體的E. coli因為ampicillin resistance的基因故可以存活，而長
51
 出菌落(colony)。
(E) 可剪一個與培養基(plate)相同大小的膜(membrane)蓋在培養基上，蓋
上後讓所有菌落沾到膜上面，再把膜放到有tetracycline的培養基上，
使膜上的菌落黏在上頭，觀察哪些菌落會生長。
(F) 如果細菌有著沒接合外源基因的質體就會生長出來，如果細菌僅有
著接合外源基因的質體則無法生長（因為外源基因破壞了
tetracycline resistance基因）。
(G) 前後對照兩個培養基，就可以知道哪個菌落有重組過的質體了。因
為插入的基因在tetracycline基因上，使基因失去活性，此現象稱作
insertional inactivation。

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四、南方墨點法(Southern blot)
南方墨點法是將agarose gel電泳上的DNA 片段轉到nitrocellulose filter 上的技術，
目的是將特定的DNA分離（偵測）出來。
1. 首先將DNA用限制酶局部水解，再經DNA電泳(agarose gel electrophoresis)延
展。
2. DNA片段轉到nitrocellulose filter 上的技術是：最底層為衛生紙（濾紙和擦
手紙），放上gel，再放上NC membrane (nitrocellulose filter)，最上層放濾紙
或衛生紙，把gel上的DNA片段轉到NC membrane。
3. 最後用放射線標記或螢光標記的探針(probe)進行雜交，再壓片即完成。

墨點法 分析物 probe 目的

南方墨點法 DNA 32
P-DNA 測定哪一段DNA和某基因有關
北方墨點法 RNA 32
P-DNA 測定mRNA的大小及數量
西方墨點法 Protein 125
I-enzyme linked Ab 測定抗原（蛋白質）的量

國考題
PCR 反應並不需要下列何種物質？
A. DNA 雙股模板（template）
B. 引子（primer）
C. 去氧核糖核酸聚合酶（DNA polymerase）
D. 反轉錄酶（reverse transcriptase）

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Take-home Message

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Appendix

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※ M58 分生兩本國考複習講義參考資料：
1. Lehninger Principles of Biochemistry, 6th Edition
2. First Choice 生化
3. 張凱銘學長生化講義
4. M55 生化講義
5. M57 生化講義
6. Google/Wiki/PubMed 老師們

《編後語》
站在台上才知道，心裡想的和嘴巴說的真的會不一樣，人就是口是心非的一種生物
吧哈哈哈。趙俊彥學長也會口誤，但比例這麼低，真的不簡單！分生只要觀念通了，
記好重點表格，十之八九就沒問題了。最後謝謝我的朋友們和你們每一位的支持與
包容，因為願意笑就是最大的鼓勵 XD。送君千里，終須一別，廢話就到此。

預祝大家國考生化滿分全拿！金榜題名！

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