Professional Documents
Culture Documents
Opsta Biohemija Uszbenik PDF
Opsta Biohemija Uszbenik PDF
Slavica Spasić
Zorana Jelić-lvanović
Vesna Spasojević-Kalimanovska
OPŠTA BIOHEMIJA
Beograd, 2002.
Slavica Spasić
Zorana Jelić-lvanović
Vesna Spasojević-Kalimanovska
OPŠTA BIOHEMIJA
Recenzenti:
prof. dr Bosiljka Plećaš-Solarović
Farmaceutski fakultet, Beograd
doc. dr Ljuba Mandić
Hemijski fakultet, Beograd
Izdavač:
Autori
Tiraž:
500 primeraka
Štampa:
Foto Futura, Beograd
Poglavlje 7. Nukleotidi
Poglavlje 8. Enzimi
A. Klasifikacija enzima 8-2
B. Kinetika enzimskih reakcija 8-2
C. Mehanizam enzimske reagulacije 8-8
Poglavlje 9. Koenzimi
Poglavlje 10. Biološke membrane
A. Hemijski sastav membrane 10-1
B. Struktura bioloških membrana 10-4
C. Specijalne membranske strukture u ćeliji 10-6
D. Transport molekula i jona kroz membranu 10-7
E. Neposredovan transport (difuzija) 10-8
F. Kanali i pore 10-9
G. Posredovan transport 10-9
Poglavlje 11. Organizacija metabolizma i bioenergetika
A. Metabolički putevi 11-1
B. Osnovni principi bioenergetike 11-6
Poglavlje 12. Katabolizam ugljenih hidrata
A. Glikoliza 12-1
B. Fosfoglukonatni put 12-4
C. Katabolizam drugih heksoza 12-16
D. Katabolizam glikogena 12-19
Poglavlje 13. Ciklus limunske kiseline
A. Pregled reakcija ciklusa limunske kiseline 13-1
B. Stvaranje acetil-koenzima A 13-2
C. Reakcije ciklusa limunske kiseline 13-6
D. Regulacija ciklusa limunske kiseline 13-9
E. Amfibolička priroda ciklusa limunske kiseline 13-11
Poglavlje 14. Respiratorni lanac i oksidativna fosforilacija
A. Izvori NADH i FADH2 14-1
B. Šatl-sistemi unutrašnje membrane mitohondrija 14-3
C. Komponente respiratornog lanca 14-5
D. Transport elektrona 14-10
E. Oksidativna fosforilacija 14-12
F. Transportni sistemi povezani sa stvaranjem ATP-a 14-16
G. Energetski bilans aerobnog metabolizma glukoze 14-17
H. Regulacija stvaranja ATP-a 14-17
1
III
A. BIOELEMENT!
Od svih elemenata u periodnom sistemu dokazano je da je 24 neophodno za žive organizme.
Ovi elementi se dele^na nemetajei.metale. Nemetalij»e vezuju u molekule koji su odgovorni za iz
gradnju i meiaJaoJiza^
način stabilizuju ili utiču na njihovu funkciju.
Nemetali
Vodonjk, ugljenik, kiseonik i azot imaju elementarni značaj i mnogo su više zastupljeni u živoj ma
teriji nego u zemljinoj kori. Iz ovog podatka možemo da zaključimo da kod njih postoji posebno mole-
Tčulamo"slaganje za procese kojima se održava stanje života, a za ovu pojavu postoji i hemijska os
nova. Ovi elementi mogu da obrazuju kovalentne veze formiranjem elektronskih parova a da bi se
popunile spoljašnje elektronske putanje vodoniku je potreban jedan, kiseoniku dva, azotu tri a uglje-
niku četiri elektrona. Svi ovi elementi mogu da reaguju jedan sa drugim i da pri tome obrazuju jedan
ih^vji^zajednjjokajeJektronska para, odnosno jednostruke ili dvostruke vez&JLJgljenik i azot mogu,
mada vrlo retko, da imaju i tri zajednička elektronska para, odnosno da obrazuju trostruku vezu.
1-2 Opšta biohemija
Druga važna karakteristika organskih supstanci u živoj materiji je da je u tim jedinjenjima ugljenik
uglavnom redukovan ili hidrogenizovan, za razliku od jedinjenja u zemljinoj kori u kojima je ugljenik
najčešće u oksidovanom obliku kao bikarbonat ili karbonat. Zbog prisustva kiseonika u atmosferi, vo-
đorTik i ugljenik normalno teže da se oksiduju u ugljendioksid i vodu, stabilna jedinjenja sa malo
energije. Organska jedinjenja nađena u živoj materiji su bogata energijom, zbog toga što živi organi
zmi moraju da utroše energiju da bi ih sintetisali iz C 0 2 i vode, odnosno da bi redukovali neorganski
ugljenik iz litosfere i atmosfere.
Metali
elektrone uglavnom na kiseonik. Prevođenje atmosferskog azota u amonijak je redoks proces koji
zahteva prisustvo molibdena. Gvožđe je najzastupljeniji teški metal u živim organizmima i ulazi u
sastav mnogih proteina koji služe kao prenosioci elektrona, kao i u sastav hemoglobina koji prenosi
kiseonik u krvi. Najpoznatija prirodna supstanca koja sadrži kobalt je vitamin B 12 koji ima ulogu bioka-
talizatora za prenošenje metil grupe. Cink ima u enzimima dve funkcije: jedna je da se koordinativno
vezuje za proteine i time održava njihovu strukturu u takvom prostornom položaju koji je pogodan za
hemijske reakcije, a druga je da i sam učestvuje u procesima katalize. Kao i većina metala cink delu-
je kao kiseli katalizator.
B. BIOMOLEKULI
Životinjske i biljne ćelije sadrže približno 10 000 različitih vrsta molekula, koji se nazivaju biomo-
lekulima. Jedan od biomolekula je voda koja može da čini 50 - 95% težine ćelije. Većina drugih bio-
molekula su organski molekuli sagrađeni od šest osnovih elemenata: ugljenika, vodonika, azota, ki-
seonika, sumpora i forsfora.
Za stabilnost, kao i za raznovrsnost organskih molekula u živim organizmima posebno je značaj
na sposobnost ugljenika da gradi kovalentne veze sa drugim ugljenikovim atomom, pa kako ugljenik
može da primi ili preda četiri elektrona da bi popunio spoljašnju elektronsku putanju, svaki ugljenikov
atom može da se veže sa još četiri ugljenika. Ugljenik, pored toga što gradi kovalentne veze sa vo-
donikom, kiseonikom i azotom, može da se kovalentno vezuje i sa sumporom, što sve zajedno dop
rinosi tome da postoji mogućnost za obrazovanjem vrlo velikog broja funkcionalnih grupa koje ulaze
u sastav organskih molekula. Pored toga, zajednički elektronski parovi oko ugljenika imaju tetrae-
darsku konfiguraciju, što uslovljava da organska jedinjenja ugljenika mogu imati i različitu trodimenzi
onalnu strukturu.
Hemijske osobine organskih molekula određene su specifičnim uređivanjem atoma u tzv. funkci
onalne grupe. Različite vrste organskih molekula nastaju kada se vodonikov atom u molekulu zameni
različitim funkcionalnim grupama. Većina biomolekula sadrži više od jedne funkcionalne grupe, a
hemijske osobine svake funkcionalne grupe određuju hemijske osobine molekula u kome se nalaze.
ni) i polinukleotidi (nukleinske kiseline). Ova biosinteza, nasuprot hidrogenizirajućoj, naziva se poli-
merna biosinteza.
Energija za ove biosinteze obezbeđuje se u životinjskim ćelijama dehidrogenizacijom glukoze (i
time indirektno iz sunčeve energije). I neka druga jedinjenja (aminokiseline i masne kiseline) mogu
da se dehidrogenizuju i dekarboksiluju, pri čemu se nastali vodonik vezuje sa kiseonikom uz osloba
đanje energije (u obliku ATP).
U procesu čuvanja i prenošenja energije u ćelijama najvažniju ulogu ima adenozin-trifosfat (ATP)
koji predstavlja zajedničku supstancu u prenosu energije u svim živim organizmima. Energija koja se
čuva u vezi između pojedinih fosfatnih grupa ima veliki značaj za biološke sisteme i zbog toga je ATP
najvažnija biohemijska supstanca za celokupan život na zemlji.
ATP je nukleotid koji je sagrađen od adenina, riboze i i tri fosfatna ostatka, u kojima je prvi fosfat-
ni ostatak vezan za ribozu estarskom vezom, a dva terminalna ostatka su vezana fosfoanhidridnim
vezama. Mada se većina anhidrida lako hidrolizuje, fosfoanhidridne veze u molekulu ATP su realtiv-
no stabilne pod uslovima koji su u ćeliji.
ATP + H 2 0 AG°=-7,3kcal/mol(-30,5kJ/mol) , A D p + p>
ATP +
H20 AG°=-7.7kcal/mol(-32,2kJ/m0l) ^ m p + pp>
pp H
AG°=-8kcal/mol(-33,5kJ/mol)
Hidrolizu ATP katalizuju specifični enzimi, a tendencija ATP da podleže hidrolizi označava se kao
transferni potencijal za fosfatnu grupu. I drugi molekuli imaju sposobnost da prenose fosfatnu grupu,
među kojima one sa visokom AG° vrednošću hidrolize imaju viši transferni potencijal za fosfatnu gru
pu nego supstance sa nižom vrednošću AG°. Karakteristično za ATP je da ima srednji transferni po
tencijal što omogućava da ATP bude intermedijemi prenosilac fosfatne grupe sa visoko energetskih
jedinjenja, kakav je npr. fosfoenolpiruvat na nisko energetska jedinjenja.
om u molekulskoj logici živog stanja: živi organizmi stvaraju i održavaju svoju esencijalnu uređenost
na račun svoje okoline, čime čine da ona postane više neuređena i slučajna.
Spoljašnja okolina je apsolutno esencijalna za žive organizme, ne samo zato što oni iz nje uzima
ju slobodnu energiju nego i zato što iz nje uzimaju i druge materije. Jezikom termodinamike rečeno,
živi organizmi su "otvoreni" sistemi zato što sa spoljašnjom okolinom izmenjuju i energiju i materiju i u
tom procesu ih transformišu. Karakteristika otvorenih sistema je da oni nisu u ravnoteži sa svojom
okolinom, lako živi organizmi mogu da izgledaju da su u ravnoteži sa svojom okolinom, zato što ne
ma vidljive promene u jednom periodu vremena, oni su ustvari u stanju koje se naziva steady state \
Ovo stanje se karakteriše time da je brzina transfera materije i energije iz okoline u sistem u potpunoj
ravnoteži sa brzinom transfera materije i energije iz sistema u okolinu. Dakle, deo molekulske logike
živog stanja je da je ćelija neuravnoteženi otvoreni sistem, koji se ponaša kao mašina koja uzima
energiju iz svoje okoline težeći da poveća njenu entropiju. Osim toga, žive ćelije su visoko efikasne u
prometu energije i materije, posebno u pretvaranju energije u rad, u čemu prevazilaze većinu mašina
koje je stvorio čovek.
Mehanizam žive ćelije koji omogućava transformisanje energije zasnovan je na relativno nesta
bilnim i razgradljivim organskim molekulima koji ne mogu da izdrže visoke temperature, jake električ
ne napone ili izuzetne kiselo-bazne uslove. Žive ćelije su esencijalno izotermne, odnosno u datom
vremenu svi delovi ćelije imaju istu temperaturu. Osim toga, nema značajne razlike u pritiscima iz
među pojedinih delova ćelije. Zbog toga ćelije nisu u stanju da koriste toplotu kao izvor energije, jer
toplota može da vrši rad pri konstantnom pritisku samo ako prelazi iz prostora sa višom temperatu
rom u prostor sa nižom temperaturom. Žive ćelije se prema tome ne ponašaju kao toplotni ili elektri
čni motori, odnosno motori na koje smo mi navikli. Iz ovoga može da se izvede drugi važan aksiom u
molekulskoj logici živog stanja, a to je da je živa ćelija izotermalni hemijski motor. Ćelije apsorbuju
energiju iz svoje okoline i pretvaraju je u hemijsku energiju, koja se tada transformiše u: a) hemijski
rad uključen u biosintezu ćelijskih komponenata, b) osmotski rad koji je potreban za transport materi
ja u ćeliju i c) mehanički rad potreban za kontrakcije i kretanje.
1
steadv state - stanje stabilne ravnoteže, stanje bez kontinuiranih promena
1-6 Opšta biohemija
va se feed-back* inhibicija. Neki enzimi u ćeliji, naročito oni na početku reakcione sekvence ili na
mestima gde se reakcije granaju imaju ulogu regulatornih enzima, jer inhibiraju reakcije preko krajnjih
njenih proizvoda.
Osim toga, žive ćelije imaju sposobnost da regulišu sintezu sopstvenih katalizatora; ćelije mogu
da prekinu sintezu enzima koji su potrebni za stvaranje nekog proizvoda uvek kada je taj proizvod
moguće dobiti iz spoljašnje okoline. Ova sposobnost samo-doterivanja i samo-regulacije reakcija je
fundamentalna u održavanju steady state uslova žive ćelije i esencijalna je za efikasno transformisa-
nje energije.
Reakcije koje se odigravaju u ćelijama imaju sledeće karakteristike:
- iako je broj reakcija vrlo veliki, broj reakcionih tipova je relativno mali;
- mehanizmi koji su zastupljeni u biohemijskim reakcijama (tj. način na koji se dešavaju promene
u reakcijama) su relativno jednostavni;
- relativno je mali broj reakcija koje imaju centralnu važnost, a to su reakcije u kojima se stvara
energija i reakcije sinteze i degradacije glavnih ćelijskih komponenata.
X:
U opštem primeru koji je ovde prikazan jedinjenje A je nukleofil, a u biohemijskim reakcijama nu-
kleofili su najčešće anjoni. Nukleofili mogu da budu i neutralna jedinjenja. Atomi ili grupe koje se pre
nose sa jednog nukleofila na drugi nazivaju se elektrofili, a u ovom primeru je to B. Stvaranjem nove
veze između A i B , raskida se stara veza između B i X. Ostatak koji nastaje vezivanjem elektrofila je
takođe nukleofil (u ovom slučaju je to X).
Reakcije eliminacije
U reakcijama eliminacije stvara se dvostruka veza kada se uklone atomi iz nekog molekula:
H H H H
II II
H — C — C — H »> H — C = C — H + A—B
A B
Uklanjanje vode iz molekula koji sadrže alkoholnu funkcionalnu grupu spada u reakcije eliminaci
je, a primer za ovu reakciju je dehidratacija 2-fosfoglicerata, pri čemu nastaje fosfoenolpiruvat (reak
cija koja je vrlo važna u metabolizmu ugljenih hidrata). U reakcije eliminacije spadaju i reakcije u ko
jima nastaju amonijak (NH3), amini (R-NH2) i alkoholi (R-OH).
2
feed-back mehanizam - mehanizam povratne sprege
1-8 Opšta biohemija
Reakcije izomerizacije
U reakcijama izomerizacije dolazi do premeštanja atoma ili grupa unutar molekula. Najčešća bio-
hemijska izomerizacija je interkonverzija aldoze u ketozu.
H H
R —C —C —H - "^ R- -c-—c—-H
I II II 0
o o o I
I H
H
aldoza ketoza
Oksido-redukcione reakcije
U reakcijama oksido-redukcije (nazivaju se i redoks reakcijama) dolazi do transfera elektrona sa
donora (redukujući agens) na akceptor (oksidujuci agens). U tom procesu se redukujući agens oksi-
duje, a oksidujuću agens se redukuje. Kod biomolekula nije uvek lako da se ustanovi da li gube ili
primaju elektrone, a da bi se to utvrdilo postoje dva jednostavna pravila:
Oksidacija se dešava ako molekul prima kiseonik ili gubi vodonik:
OLCH9—OH • CH3C — O H
II
O
etil alkohol sirćetna kiselina
Redukcija se dešava ako molekul gubi kiseonik ili prima vodonik:
CHX — OH • CH 3 CH 2 — OH
II
O
sirćetna kiselina etil alkohol
Reakcije hidrolize
U reakcijama hidrolize dolazi do cepanja kovalentne veze u prisustvu vode:
R—C — O — R' + H20 • R — C —OH + R'OH
Hidrolitičke reakcije mogu da katalizuju kiseline i baze. Digestija supstanci iz hrane se odvija pro
cesom hidrolize, kisele ili bazne, zavisi od dela digestivnog trakta u kome se dešava. Drugi primer je
razgradnja fosfatne veze u ATP-u, a energija koja se tom prilikom dobija koristi se u mnogim proce
sima u ćeliji.
c>
Poglavlje 2.
Voda
Raspored elektrona u molekulu vode uslovljava njegovu električnu asimetriju. Zbog stvaranja
elektronskih parova, dajući svoj elektron, vodonikovi atomi u molekulu vode delimično su pozitivno
naelektrisani, a iz istih razloga atom kiseonika je delimično negativno naelektrisan. Zbog toga je mo-
lekul vode električni dipol, mada u osnovi nema neto naelektrisanje. Stepen razdvajanja pozitivnog i
negativnog naelektrisanja u dipolarnim molekulima dat je dipolnim momentom, koji predstavlja meru
za tendenciju molekula da se orijentiše u električnom polju. Dipolna priroda molekula vode u velikoj
2-2 Opšta biohemija
meri je odgovorna za sile atrakcije između molekula vode, jer postoji jako elektrostatičko privlačenje
između negativnog naelektrisanja na atomu kiseonika jednog molekula vode i pozitivnog naelektrisa-
nja atoma vodonika u drugom molekulu vode. Ovaj tip elektrostatičke interakcije naziva se vodonična
veza, pri čemu treba imati na umu da ovaj izraz označava više jaku elektrostatičku interakciju nego
pravu vezu. lako su značajno slabije nego jonske i kovalentne veze, vodonične veze su jače nego
većina drugih tipova nekovalentnih veza.
*S? H
Slika 2-2. Vodonična veza između dva molekula vode.
Zbog skoro tetraedarske organizacije elektrona oko atoma kiseonika, svaki molekul vode teži da
ostvari vodonične veze sa još četiri molekula vode, a nastala intermolekulska "veza" deluje kao most
između susednih molekula.
Nekovalentne veze
Biohemijski procesi mogu da se razumeju samo u odnosu na fizičke i hemijske osobine vode, a u
određivanju ovih osobina vitalnu ulogu imaju nekovalentne interakcije. Nekovalentno vezivanje igra
važnu ulogu u određivanju prostornog oblika (a time i funkcije) biomolekula, što je posebno izraženo
u strukturi proteina, lipida i nukleinskih kiselina.
Pored vodonične veze, tri druga tipa nekovalentnih interakcija igraju važnu ulogu u određivanju
sposobnosti vode da reaguje sa drugim molekulima. To su elektrostatičke interakcije, van der VVaals-
ove sile i hidrofobne interakcije*.
Elektrostatičke interakcije se pojavljuju između suprotno naelektrisanih atoma ili grupa, a kao i
drugi tipovi nekovalentnih veza imaju veliki značaj u određivanju prostornog položaja i funkcije bio
molekula. Na primer, atrakcija između COO" i NH 3 + je faktor koji određuje trodimenzionalnu strukturu
proteina. Važan aspekt u svim elektrostatičkim interakcijama koje se dešavaju u vodenim rastvorima
je dipolarnost molekula vode, jer između dipolarnih jona i naelektrisanih molekula postoje sile atrakci
je. Molekuli vode se raspoređuju oko pozitivnih i negativnih jona sa kojima dolaze u dodir i kako ti joni
postaju više hidratisani, slabe sile atrakcije među njima, odnosno naelektrisana jedinjenja se rastva
raju u vodi. Dielektrična konstanta rastvarača je mera njegove sposobnosti da smanjuje sile atrakcije
između jona. Voda se ponekad naziva i univerzalnim rastvaračem jer ima veliku dieiektričnu konstan
tu za veliki broj jonskih i polarnih supstanci.
Van der Waals-ove sile su grupa relativno slabih, prolazno elektrostatičkih interakcija koje se po
javljuju između stalnih i/ili indukovanih dipola. One mogu biti atraktivne ili repulsivne, zavisno od ras-
tojanja između atoma ili grupa. Atrakcija između molekula je najveća na rastojanju koje se zove van
der Waals-ov radijus, a ako molekuli priđu bliže jedan drugom razvijaju se repulsivne sile. Veličina
van der Waals-ovih sila zavisi od toga koliko lako se jedan atom polarizuje, a najlakše se polarizuju
elektronegativni atomi sa slobodnim parom elektrona.
Hidrofobne interakcije. Kada se mala količina nepolarne supstance (npr. ugljovodonika) pomeša
sa vodom, dolazi do njenog razbijanja u male kapljice, što je posledica hidrofobnih interakcija. Ovo
razbijanje u kapljice ili razdvajanje u slojeve kada je količina nepolarne supstance velika posledica je
rastvaračkih osobina vode a ne slabe atrakcije između molekula nepolamog jedinjenja. Interakcije
voda-voda jače su nego interakcija voda-ugljovodonik, zbog čega molekuli vode formiraju strukturu
sličnu kavezu oko molekula ugljovodonika, a to dovodi do njegovog razbijanja u kapljice.
Hidrofobne interakcije imaju važan uticaj za funkcionisanje živih ćelija i primarno su odgovorne za
strukturu membrane i stabilnost proteina.
If
Organski molekuli sa jonizovanim grupama i mnogi neutralni organski molekuli sa polarnim funk
cionalnim grupama takođe su rastvorni u vodi, a njihova rastvorljivost je određena kapacitetom vode
da gradi vodonične veze. Takvo vezivanje postoji npr. između vode i karbonilne grupe aldehida i k £ » — ^
tona ili hidroksilne grupe u alkoholima. Kao stoje već ranije pomenuto nepolarne supstance nisu^jeS^**^
tvorljive u vodi jer nemaju polarnu funkcionalnu grupu koja bi mogla da gradi vodonične veze. ff > S J 7 %i
2-4 Opšta biohemija
Veliki broj molekula koji se označavaju kao amfipatični sadrže i polarnu i nepolarnu grupu, što se
odražava na njihovo ponašanje u vodi. Na primer, soli masnih kiselina su amfipatični molekuli jer sa
drže jonizovanu karboksilnu grupu i nepolamu ugljovodoničnu grupu. Kao posledica toga što imaju i
polarnu i nepolarnu grupu, soli masnih kiselina u prisustvu vode formiraju strukture koje se nazivaju
micele. U micelama su naelektrisane grupe (koje se nazivaju i polarne glave) raspoređene tako da su
u kontaktu sa spoljašnjom vodenom sredinom, a nepolarni ugljovodonični repovi su okrenuti ka hidro-
fobnoj unutrašnjosti. Tendencija amfipatičnih molekula da se spontano raspoređuju u vodenoj sredini
odgovorna je za strukturne karakteristike brojnih ćelijskih komponenata. Na primer, fosfolipidni mole
kuli koji mogu da grade micele glavni su konstituent ćelijske membrane.
Jonizacija vode
Molekuli tečne vode imaju ograničeni kapacitet da se jonizuju do vodoničnog (H+) i hidroksilnog
jona (OH"). U vodenim rastvorima ne postoji slobodan vodonični jon, već se on kombinuje sa moleku-
lima vode u hidratizovani vodonični jon H30", koji se naziva hidronijum jon. U čistoj vodi je koncentra
cija H+ i OH" ista pa je voda neutralna.
Poglavlje 3.
Aminokiseline
Aminokiseline su osnovna strukturna jedinica proteina i čine više od 20% suve mase organskih
molekula koji se nalaze u ćelijama, tkivima i organima. Enormna strukturna i funkcionalna složenost
proteina proizilazi iz različitih kombinacija 20 proteinogenih aminokiselina koje se vezuju u polimere i
asocijate sa različitim neproteinskim supstancama. Sekvenca aminokiselina određuje i prostorni
položaj odnosno konformaciju proteina, koji tako postaju fleksibilni i mogu da se prilagode promeni
situacije ili uslova.
Aminokiseline su takođe energetski metaboliti, a mnoge od njih su i esencijalne komponente
ishrane. Pored toga, mnoge aminokiseline i njihovi derivati imaju same po sebi biohemijski značaj.
pKR
aminokiselina simbol struktura pK1 pK2
grupe
CHs-CH-COO"
alanin Ala-A I • 2.4 9.9 -
NH 3
H3Cv
^CH—CH—COO"
valin Val-V 2.2 9.7 -
HaCT I «.
NH 3
H3Cv
H3c/CH—CHz—CH—COO"
U
leucin Leu-L 2.3 9.7 -
H3C\
CH?
izoleucin lle-l \ H — C H — COO" 2.3 9.8 -
H3C/ | +
NH 3
CHJJ—CH2—CH—COO"
metionin Met-M 1
S 1NH* 3 2.1 9.3 -
CH 3
^^-CHT-CH—COO"
fenilalanin Phe-F 2.2 9.2 -
^ " ^ f
r*1 • ^U-
NH 3
.r*riri~
2.4 9.4 -
pKR
aminokiselina simbol struktura pK1 pK2
grupe
HO—CH^-CH—COO"
serin Ser-S 1 + 2.2 9.2 -13
NH3
H3Cv
treonin Thr-T >CH—CH—COO 2.1 9.1 -13
HO—(~~\— CH2-CH—COO"
tirozin Tyr-Y 2.2 9.1 10.1
NH3
H2 N—C—Chfe-CH—COO"
asparagin Asn - N
i IH; 2.1 8.8 -
H2N—C—CHz-CHr-CH—COCT
glutamin Gln-Q + 2.2 9.1 -
O L3
HS—CH2—CH—COO"
ciste i n Cys-C 1.9 10.8 8.3
NH3
NH
I I
H—C —CH,—SH HS —CH 2 —C—H
I I
NH c=o
I
ostatak
cisteina
roi ostatak
cisteina
H.,0
C=0 NH
I I
H—C—CH 2 — S — S — C H 2 - •C—H
I I
NH c=o
I
ostatak čistina
Kisele aminokiseline
U ovu grupu spadaju asparaginska i glutaminska kiselina, za koje je karakteristično da imaju još
po jednu karbonilnu grupu koja takođe disosuje, pa pri pH 6,0-7,0 imaju neto negativno
naelektrisanje. Zbog jake polarne prirode ove aminokiseline se često nalaze na površini globulamih
proteina i reaguju sa molekulima rastvarača. Takođe mogu da učestvuju u elektrostatičkim
reakcijama sa pozitivno naelektrisanim baznim aminokiselinama. Odgovarajuće soli asparaginske i
glutaminske kiseline su aspartat i glutamat.
pKR
aminokiselina simbol struktura pK1 pK2
grupe
asparaginska "OOC—CH2—CH—COO"
Asp-D 2.0 9.9 3.9
kiselina lW
glutaminska "OOC— CHT-CHZ-CH—COO"
Glu-E 2.1 9.5 4.1
kiselina
Bazne aminokiseline
Bazne a-aminokiseline imaju neto pozitivno naelektrisanje pri pH 7,0 a u tu grupu spadaju
lizin, sa sekundarnom amino grupom u položaju £ na alifatičnom lancu i arginin, sa pozitivno
naelektrisanom gvanidino grupom. U ovu grupu se ubraja i histidin koji ima slabo baznu imidazolnu
grupu, pa je na samoj granici karakteristika ove grupe aminokiselina. Kod pH 6,0 više od 50%
molekula histidina ima pozitivno naelektrisanu R grupu, dok kod pH 7,0 samo 10% molekula ima
pozitivno naelektrisanje. Kod fiziološkog pH histidin je praktično neutralan.
pKR
aminokiselina simbol struktura pK1 pK2
grupe
H N—CH2-CH2-CH2-CH—COO"
arginin Arg-R 1.8 9.0 12.5
H2N
H3N—CH2-(CH2)3—CH—COO"
lizin Lys-K 2.2 9.2 10.8
i
HN 1—CH2—CH—COO"
N:
histidin His-H
~ u 1.8 9.2 6.0
pKR
aminokiselina simbol struktura PK1 pK2
grupe
H—CH—COO"
glicin Gly-G 2.4 9.8 -
Prolin (pirolidin-2-karbonska kiselina) sadrži jedan heterociklični prsten i u svojoj strukturi ima
sekundarnu amino grupu, jer su unutar samog molekula povezane amino i karbonilna grupa. Ipak se
ubraja u aminokiseline, jer se nalazi u hidrolizatima proteina sa ostalim aminokiselinama. Zbog toga
što mu je bočni lanac povezan sa azotom u glavnom lancu prolin je najrigidnija aminokiselina.
Derivat prolina je hidroksiprolin koji ima polarni karakter jer u polažaju 4 u pirolidonskom prstenu ima
alkoholnu grupu.
Veličina
Proteini imaju specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja se formira presavijanjem polipeptidnog
lanca na različite načine. Unutrašnjost takve strukture ima veliku gustinu jer je prostor potpuno
popunjen, a eventualne šupljine u prostornoj strukturi mogu biti popunjene molekulima rastvarača.
Tako gusto "spakovan" polipeptidni lanac ne dozvoljava promene u sastavu i zahteva prisustvo
aminokiselina tačno određene veličine. Dakle, ako mutacija dovede do toga da aminokiselina sa
malim bočnim lancem bude zamenjena aminokiselinom koja ima veliki bočni lanac, pojaviće se
problem u formiranju trodimenzionalne strukture, jer neće biti prostora da se smesti veća
aminokiselina. S druge strane, kada se velika aminokiselina zameni manjom, pojaviće se prazan
prostor u trodimenzionalnoj strukturi, što može da destabilizuje ceo molekul proteina.
Naelektrisanje
Pod fiziološkim uslovima su aspartat i glutamat negativno a lizin i arginin pozitivno naelektrisani,
dok histidin može biti neutralan ili pozitivno naelektrisan, zavisno od lokalnog okruženja. Između dve
grupe sa suprotnim naelektrisanjem mogu da se jave specifični tipovi interakcija koje se nazivaju soni
mostovi ili jonski parovi. U prošeku se u polipeptidnom lancu nalazi jedan jonski par na 30 ostataka
aminokiselina. Pored toga, proteini imaju i neto naelektrisanje.
Polarnost
Naelektrisani i neutralni polarni bočni lanci aminokiselina grade vodonične veze jedni sa drugima,
sa polarnim atomima glavnog lanca, kao i sa rastvaračem.
- serin i treonin imaju hidroksilne grupe koje mogu da budu donor u jednoj i akceptor u dve veze;
- tirozin ima hidroksilnu grupu (veza C-OH ima delimično karakter dvostruke veze) koja može da
bude donor u jednoj, odnosno akceptor u drugoj vezi;
- aspartat i glutamat imaju po dva karbonilna kiseonika, a svaki od njih može da bude akceptor
vodonika u dve vodonične veze;
- asparagin i glutamin imaju karbonilni kiseonik (C=0) koji može da bude akceptor u dve
vodonične veze, dok amidni azot može da bude donor takođe u dve veze.
- histidin ima dva imidazolska azota, od kojih su ili jedan ili oba protonizovana: ako su
protonizovani ponašaju se kao donori, a ako su neprotonizovani onda su akceptori u vodoničnoj vezi;
- arginin ima gvanidino grupu koja je obično protonizovana i planarna: svaka od dve -NH2 grupe
može da bude donor dva vodonika, dok je -NH grupa donor jednog vodonika za vodoničnu vezu;
- lizin može da bude donor tri protona u vodoničnim vezama;
- triptofan je donor jednog vodonika.
Hidrofobnost
Alifatični bočni lanci alanina, valina, leucina i izoleucina (kao i glicina) ne sadrže polarne atome i
slabije reaguju sa vodom, tako da je opšta osobina globularnih proteina da se ostaci ovih hidrofobnih
aminokiselina uglavnom nalaze u unutrašnjosti proteina, dok se ostaci polarnih aminokiselina nalaze
na površini. Iz tog razloga presavijanje polipeptidnog lanca u trodimenzionalnu strukturu može da se
uporedi sa stvaranjem lipidnih micela u vodenom rastvoru kod kojih su nepolarne grupe sakrivene a
polarne grupe otkrivene. Međutim ovo pravilo ne može da se u potpunosti primeni na polipeptidni
lanac jer u njemu sve aminokiseline imaju polarne atome u glavnom lancu (N i karbonilni O), a
njihova sposobnost građenja vodoničnih veza je odgovorna za više nivoe organizacije proteina. S
druge strane, neki naelektrisani i neutralni polarni bočni lanci imaju u svom sastavu i nepolarne
delove. Sve u svemu, hidrofobnost je vrlo važan faktor u održavanju stabilnosti proteina, čak se
veruje da "hidrofobni efekat" aminokiselina igra osnovnu ulogu u spontanom presavijanju proteinskog
lanca.
3-8 Opšta biohemija
Aromatičnost
Aromatični bočni lanci učestvuju u relativno slabim elektrostatičkim interakcijama zbog
mogućnosti delokalizacije elektrona. Pored toga, oni pokazuju slabu tendenciju da primaju protone
od amidnih i amino grupa.
Poglavlje 4.
Proteini
Proteini su najhitniji sastojak žive materije i zahvaljujući njihovim osobinama živa bića su mnogo
brojna, raznolika i specifično organizovana. Broj proteina u živim bićima je ogroman; npr. bakterija E.
coli sadrži oko 3000 različitih proteina, a čovek, pretpostavlja se oko 5 miliona. Proteini su vrlo speci
fični, tako da svaka životinjska i biljna vrsta imaju svoje proteine, a kod viših organizama i svaka indi
vidua ima svoje specifične proteine.
Proteini imaju osobinu da grade kompleksna jedinjenja sa raznim supstancama na principu struk
turne komplementarnosti i to im omogućava da obavljaju različite funkcije. Druga važna osobina pro
teina je da su vrlo osetljivi na različite agense, koji ih denaturišu, odnosno izazivaju promene u njiho
voj strukturi i time menjaju njihovo fiziološko dejstvo. Do denaturacije može da dođe pod dejstvom vi
soke temperature, visokog pritiska, mehaničkim tretiranjem, dejstvom kiselina, baza, organskih
rastvarača, raznih zračenja itd.
Proteini su biološki najaktivniji molekuli i imaju veliki broj esencijalnih funkcija koje mogu da se
podele u dve klase: dinamičke i strukturne funkcije.
Dinamičke funkcije proteina su različite i brojne, a najvažnije su:
- Obavljaju transportnu funkciju jer prenose različite molekule (kiseonik, gvožđe, bakar, lipide, le-
kove itd.), kao i hormone od mesta sinteze do mesta delovanja. U ove proteine spadaju i nosači koji
omogućavaju transport različitih molekula kroz ćelijsku membranu.
- Imaju biološku aktivnost, odnosno učestvuju u regulaciji metaboličkih procesa u ćeliji (ovu grupu
spadaju hormoni), a učestvuju i u kontroli i regulaciji transkripcije gena i translacije.
- Imaju ulogu bioloških katalizatora (enzimi), a oni omogućavaju da se odigravaju hemijski proce
si u ćeliji. Povećavaju brzinu reakcija od 106 do 10 12 puta.
- Imaju zaštitnu ulogu; ovde spada keratin, protein koji se nalazi u koži i štiti organizam od meha
ničkih i hemijskih povreda. U ovu grupu spadaju i proteini koji učestvuju u koagulaciji krvi, jer spreča
vaju gubitak krvi kod oštećenja krvnih sudova. Imunoglobulini ili antitela se stvaraju u limfocitima kao
odgovor na invaziju stranih organizama kakve su bakterije.
- Održavaju zapreminu tečnosti u organizmu tako što zadržavaju vodu u krvnim sudovima; među
ovim proteinima najvažniji je albumin.
U okviru strukturne funkcije proteini obezbeđuju matriks za kosti i vezivna tkiva, održavaju čvrsti
nu i elastičnost organa i uopšte daju oblik organizmima:
- Izgrađuju strukturne elemente ćelije a često imaju vrlo specijalizovane funkcije. Na primer, kola-
gen (glavna komponenta različitih vezivnih tkiva) i fibroin (protein svile) imaju značajnu mehaničku
ulogu. Elastin je protein sličan gumi, a nađen je u elastičnim vlaknima različitih tkiva (krvnih sudova i
kože).
4-2 Opšta biohemija
- Bitni su elementi kontraktilnih i pokretnih sistema organizma i uključeni su u sve oblike kretanja
ćelije (ćelijska deoba, endocitoza, egzocitoza i ameboidno kretanje leukocita).
Da bi se potpuno razumele sve te različite i složene funkcije proteina, potrebno je pre svega ra-
zumeti strukturu i osobine proteina.
A. PEPTIDI
Peptidna veza
Peptidi i proteini se sastoje iz lanca aminokiselina koje su povezane peptidnom vezom, pa se
stoga ova jedinjenja smatraju biopolimerima aminokiselina. Peptidna veza nastaje reakcijom o>
karbonilne grupe jedne aminokiseline sa a-amino grupom druge aminokiseline uz izdvajanje vode
(Slika 4-1). Pri tome se gube slobodna a-amino i a-karbonilna grupa i pojavljuju se u slobodnom obli
ku samo na krajevima polipeptidnog lanca. U tom vezivanju se pojavljuje niz koji se naziva kičma po-
lipeptidnog lanca i koji čine C-atom iz karbonilne grupe, N-atom iz amino grupe i a-C-atom (~N-Ca-C-
N- Ca-C--). Ovaj osnovni lanac je isti kod svih proteina, a individualnost proteina je određena bočnim
lancima aminokiselina. Zbog visokog sadržaja vode u biosistemima ravnoteža peptidne reakcije je
pomerena ka hidrolizi; osim toga za biosintezu peptidne veze potrebna je i energija.
R. o H R2 o
+ l / +i i //
H3N-C-C. + H-N-C-C
I \ ! I \
H O H H O"
^ H20
Ri O R2 p
+ I II I /
H3N—C—C—N—C—C
1
I I \ _
H H H O
Slika 4-1. Kondenzacija dve a-aminokiseline u dipeptid.
Na osnovu difrakcije X-zraka dokazano je da je peptidna veza rigidna i planarna. Pošto je C-N
veza između dve aminokiseline kraća nego drugi tipovi C-N veze dokazano je da peptidna veza ima
delimično karakter dvostruke veze (što ukazuje na to da su peptidne veze rezonantni hibridi), zbog
čega ne može slobodno da rotira. Četiri atoma oko peptidne veze i dva a-ugljenjkova atoma leže u
jednoj ravni; kiseonik iz karbonilne grupe i vodonik iz -NH- grupe su u položaju trans jedan prema
drugom. Stoga lanac polipeptida može da se prikaže kao serija relativno nepokretnih površina koje
su razdvojene supstituisanim metilenskim grupama (-CHR-) (Slika 4-2).
Rigidnost peptidne veze ima nekoliko posledica. Jedna trećina peptidnih veza u polipeptidnoj ki
čmi ne može slobodno da rotira, što ograničava broj mogućih konformacija, odnosno prostornih polo
žaja. Primera radi u lancu polipeptida od 100 aminokiselina ima oko 300 jednostrukih veza, a od njih
$
je oko 200 sa potencijalno potpunom slobodom rotacije. Broj mogućih konformacija određen je mo
gućnošću rotacije oko veza Ca-C2 i CC-ML čiji se uglovi obeležavaju sa ^ i O. Druga posledica rigi-
dne prirode peptidne veze je da se sukcesivne R-grupe pojavljuju na suprotnoj strani polipeptidnog
lanca.
Nomenklatura peptida
Prema broju aminokiselina koje sadrže peptidi se dele na oligopeptide i polipeptide. Oligopeptidi
imaju najviše 10 aminokiselina i tu spadaju dipeptidi, tripeptidi itd. Polipeptidi sadrže do 100 aminoki
selina, a jedinjenja sa više od 100 aminokiselina spadaju u proteine.
Kao početak polipeptidnog lanca uzima se onaj kraj na kome je aminokiselina sa slobodnom
amino grupom i od njega se označava sekvenca (redosled) aminokiselina u tom polipeptidu. Imena
peptida se grade tako da se jedno za drugim navode imena ostataka aminokiselina sa nastavkom -il,
i na kraju se doda nepromenjeno ime aminokiseline sa slobodnom karbonilnom grupom. Na primer,
tripeptidu koji je sastavljen od alanina, glicina i triptofana ime glasi: alanil-glicil-triptofan, jer je alanin
aminokiselina sa slobodnom amino, a triptofan sa slobodnom karbonilnom grupom.
Prirodni peptidi
U prirodi je poznat veliki broj peptida, a jedan od najrasprostranjenijih je glutation, koji je po stru
kturi y -L-giutamil-L-cisteinil-glicin (skraćeno se piše G-SH). Glutamin ima neuobičajenu v-amidnu
vezu, jer peptidnu vezu gradi vkarbonilna, a ne a-karbonilna grupa.
~OOC-CH(NH3+)-CH2-CH2-CO-NH-CH(CH2SH)-CO-NH-CH2-COO"
Glutamin učestvuje u mnogim biološki važnim procesima: sintezi proteina i DNK, metabolizmu le-
kova i toksina, transportu aminokiselina. Važna uioga glutationa je da može da deluje kao redukujući
agens, čime štiti ćeliju od različitih oksidujućih supstanci (kakve su peroksidi).
4-4 Opšta biohemija
U prirodne polipeptide spadaju i neki hormoni. Hormoni zadnjeg režnja hipofize oksitocin i vazop-
resin su ciklični peptidi sagrađeni od devet aminokiselina, a nastaju razgradnjom polipeptidnih pre-
kursora u ćelijama hipotalamusa. Oksitocin stimuliše kontrakcije mišića uterusa tokom porođaja i
pražnjenje mlečnih žljezda tokom laktacije. Vazopresin ili antidiuretični hormon stimuliše tubule u bu
brezima da resorbuju vodu, pa je odgovoran za održavanje zapremine ekstracelularne tečnosti.
Polipeptidi lančaste strukture su i adrenokortikotropin i melanotropin, hormoni prednjeg odnosno
srednjeg režnja hipofize. Insulin, hormon pankreasa je polipeptid sastavljen od 51 aminokiseline, a
polipeptid je i drugi hormon pankreasa, glukagon koji je sagrađen od 29 aminokiselina.
B. STRUKTURA PROTEINA
U molekulima proteina postoji hijerarhijska strukturna organizacija u četiri nivoa: primarna, se
kundarna, tercijarna i kvaternama. Primarna struktura obuhvata samo kovalentnu kičmu peptidnog
lanca i karakterističan redosled aminokiselina. Sekundarna struktura podrazumeva način uvijanja po
lipeptidnih lanaca, koji se u tom obliku održavaju uz pomoć vodoničnih veza. U sekundarnu strukturu
spadaju i super-sekundarna struktura (ili motiv), koja predstavlja asocijaciju sekundarnih strukturnih
elemenata uz pomoć interakcija bočnih lanaca, kao i domeni, koji su takodje asocijacije nižih nivoa
strukture. Tercijarna struktura podrazumeva trodimenzionalnu organizaciju svih atoma u jednom po-
lipeptidnom lancu. Kvaternama struktura podrazumeva agregaciju više polipeptidnih lanaca u funkci
onalni protein.
Q obeležavanje
fenil
^ izotiocijanat
HN-CH-C-|Lys JHisWha>4eu)^Ara>COOH
CH 3
obeleženi peptid
n odvajanje
* * derivata
aminokiseline
kiselom
hidrolizom
H 2 N- Lys i H i s ^ h e j H b e u ) rg>COOH
skraćeni peptid
+
N-C v
A NH
0' CH
CH 3
PTH-alanin
2. Polipeptidni lanci koji sadrže više od 100 aminokiselina ne mogu da se sekvencioniraju direkt
no, već prvo moraju da se razlože na manje fragmente. Hidroliza polipeptidnog lanca obavlja se uz
pomoć enzima ili hemijskih reagenasa, koji su visoko specifični i njhovim delovanjem se dobija manji
broj fragmenata. Enzimi koji se koriste su tripsin (čepa lanac kod karbonilne grupe lizina i arginina) ili
himotripsin (čepa lanac kod karbonilne grupe ostataka aromatičnih i nepolarnih aminokiselina). Od
hemijskih reagenasa koriste se cijanogen-bromid (čepa lanac kod karbonilne grupe metionina), hid-
roksilamin (čepa vezu asparagin-lizin), 2-nitro-5-tiocijanobenzoat (deluje kod amino grupe ostatka ci-
steina), proteaza iz stafilokoka (deluje kod karbonilne grupe ostataka aspartata i glutamata) itd.
3. Obično se prva hidroliza obavlja uz pomoć tripsina, a fragmenti peptida koji se tako dobiju raz
dvajaju se elektroforetski ili hromatografski. U svakom od ovako dobijenih fragmenata odredi se sa
držaj i sekvenca aminokiselina uz pomoć Edman-ovog reagensa (Slika 4-5). Međutim, posle ove
analize nije poznat redosled kojim su fragmenti vezani u polipetidnom lancu.
4-6 Opšta biohemija
tripsin tripsin
ŠSSSSLi "^SG^^^&^^G
(nepoznata
I
1. Razgradnja sa tripsinom kod lizina i arginina
2. Određivanje sekvence dobijenih peptida
Edman-ovom metodom
jlVHHlsKPheHl-eu = peptid A
(§>©©?
®©0?
novi peptidi ^-**w^^*-^H = peptid B koji redosled Q®©?
je tačan? ©©@?
©<§>©?
= peptid C
©©®?
Slika 4-5. Razgradnja polipeptidnog lanca na manje fragmente uz pomoć tripsina.
cijanogen-bromid
?lyHHisKPheMLeuKAraHAIaHGI = peptid X
novi peptidi koji redosled ®®?
je tačan? ®®?
Lys ^jyJ<Vaj>^u) = peptid Y
peptid X peptid Y
a-Heliks •
Heliksi su tip sekundarne strukture kod koga se polipeptidni lanac spiralno uvrće, a karakteriše se
brojem peptidnih jedinica po jednom okretu (u proteinima je broj peptidnih jedinica po jednom okretu
retko kad ceo broj) i rastojanjem (duž ose heliksa) između dva okreta. Heliksi se obrazuju spontano,
jer su energetski najsiromašnije, a time i najstabilnije konformacije proteina. Heliks mogu da obrazuju
i L- i D-aminokiseline, ali samo jedne ili druge jer heliks ne može da se obrazuje od peptidnog lanca
koji sadrži smešu ostataka L- i D-aminokiselina. Mogu biti desnostrani i levostrani, zavisno od toga
na koju stranu se uvrće proteinski lanac; desnostrani heliks je određen pravcem u kome se okreću
prsti desne ruke kada se palac postavi na osu heliksa u pravcu u kome se heliks uvećava. Na slici
4.8 prikazan je desnostrani a-heliks (vodonične veze između N-H grupa i C=0 prikazane su ispreki
danim linijama). L-aminokiseline su češće u prirodi i one mogu da obrazuju i levostrani i desnostrani
heliks, ali svi poznati heliksi u prirodi su desnostrani.
a-Heliks je rigidna struktura koja nastaje kada se polipeptidni lanac sastavljen od L-a-
aminokiselina uvrne desnostrano, a vodonične veze se obrazuju između N-H grupe jedne i karbonil
ne grupe četvrte aminokiseline u nizu. Zbog toga a-heliks ima 3,6 ostataka aminokiselina po jednom
okretu, rastojanje između dva okreta mereno duž ose heliksa je 0,54 nm, a rastojanje između dve
4-8 Opšta biohemija
aminokiseline je 0,15 nm. Vodonične veze u a-heliksu su skoro paralelne sa osom heliksa. Za raski
danje vodoničnih veza potrebna je mala energija (svega 21 - 42 kJ/mol, skoro deset puta manje nego
za raskidanje kovalentne veze), ali a-heliks predstavlja stabilnu strukturu jer u formiranju vodoničnih
veza učestvuje svaka peptidna veza, što bi ukupno zahtevalo značajnu energiju za destabilizaciju
ove strukture.
Neke aminokiseline mogu da ometaju stvaranje strukture a-heliksa; R grupa kod glicina je vodo-
nikov atom, a zbog tako malog R ostatka polipeptidni lanac postaje suviše fleksibilan. S druge strane
prolin sadrži rigidni prsten koji ometa rotaciju N-C veze, a nema ni N-H vezu koja bi učestvovala u
formiranju vodonične veze unutar polipeptidnog lanca.
Kod p-strukture su bočne grupe raspoređene naizmenično sa jedne i druge strane površine, što
celoj strukturi daje presavijen odnosno cik-cak izgled. Ova struktura je vrlo česta kod proteina i sas
tavljena je od 2 do 15 polipeptidnih lanaca, u prošeku od 6 lanaca. %
Postoje dva tipa 3-strukture: paralelni i antiparalelni. Kod paralelnog tipa (3-sfrukture polipeptidni
lanci su postavljeni u istom smeru (sa jednog kraja su slobodne amino, a sa drugog kraja slobodne
karbonilne grupe), dok su kod antiparalelnog tipa p-strukture polipeptidni lanci su postavljeni naizme
nično.
N— C - - N —C
Slika 4-10. Paralelna i antiparalelna p-struktura; vodonične veze su prikazane isprekidanim linijama.
Paralelne strukture sa manje od 5 polipeptidnih lanaca su retke, zbog toga što je paralelna struk
tura manje stabilna od antiparalelne. Ova razlika u stabilnosti potiče od toga što su kod paralelne
strukture vodonične veze uvijene u poređenju sa vodoničnim vezama kod antiparalelne strukture.
30
p-Okret i
Na mestima gde se polipeptidni lanci presavijaju, odnosno menjaju pravac prostiranja, nalaze se
delovi strukture koji se nazivaju p-okret i oni pomažu da se obrazuju kompaktni gio- p-okret
bularni oblici. Ime su dobili po tome što često povezuju susedne lance u antiparalel-
nim p-pločama. Obično se nalaze na površini proteina i u sebi često sadrže naelek-
/\ A n
trisane ostatke. Uglavnom se sastoje od četiri ostatka aminokiselina, od kojih jedna
može da bude prolin, jer njegova struktura omogućava oštro presavijanje polipepti
dnog lanca. U sastav (3-okreta ulazi često i glicin, jer njegova mala R-grupa takođe
omogućava promenu pravca polipeptidnog lanca. Struktura (3-okreta je stabilizova-
na vodoničnim i jonskinivezama.
Super-sekundarna struktura
Mnogi globularni proteini, uglavnom u svom središtu, imaju konformaciju koja nastaje kombinaci
jom sekundarnih strukturnih elemenata, kao što su a-heliks, p-presavijena ploča i strukture koje se
ne ponavljaju. Ovakve strukture se nazivaju super-sekundarne strukture ili motivi, a poznate su sle-
deće kombinacije:
- pap struktura u kojoj su dve paralelne p-presavijene ploče povezane sa jednim a-heliksom;
- p-meander struktura u kojoj su dve antiparalelne p-presavijene ploče povezane aminokiselina-
ma kao što je prolin. Prolin prouzrokuje strukturu koja se obeležava kao reverzni okret, jer menja
pravac polipeptidnih lanaca, a to je posledica vodonične veze koja se gradi između N-H grupe prve
aminokiseline u jednom lancu i karbonilne grupe treće aminokiseline u drugom lancu (u tom slučaju
je obično prva aminokiselina prolin a druga glicin);
- aa-struktura koja se sastoji od dva sukcesivna antiparalelna a-heliksa koji mogu biti samo po
vezani, ili ta veza gradi petlju, pa se u tom slučaju struktura obeležava kao a-petlja-a struktura;
- p-barel struktura koja nastaje kada se više p-presavijenih ploča presaviju jedna preko druge.
broj vodoničnih veza u unutrašnjosti molekula, kako bi sprečili da se molekuli vode vežu za hidrofilne
grupe i time naruše integritet proteina.
Veliki globularni proteini (uglavnom oni sa više od 200 ostataka aminokiselina) često sadrže ne
koliko kompaktnih jedinica koje se zovu domeni, a koji su izgrađeni kombinacijom supersekundarnih
strukturnih elemenata. Domeni su strukturno nezavisni segmenti sa karakteristikama malih globular-
nih proteina i često imaju specifičnu funkciju, kao što je vezivanje za jone ili male molekule.
Na slici 4-12 je prikazano nekoliko karakterističnih domena koji se sreću u proteinima.
- Domen koji se označava kao EF-ruka sastoji se od a-petlja-a konfiguracije, a vezuje se specifi
čno za kalcijumov jon;
- Leucin-rajsferšlus (Leucin zipper) oblik je domen koji se sreće u proteinima koji se vezuju za
DNK. Dugmeta na rajsferšlusu su ostaci leucina;
- Cink-prst (Zink finger) oblik je drugi tip domena koji se sreće u proteinima koji se vezuju za
DNK. Proteini za vezivanje sa DNK često imaju nekoliko ovakvih domena, a svaki od njih omogućava
vezivanje proteina sa DNK.
EFruka Leucin-rajsferšlus
I \ ( \
oo oo
Cys
Cys
His
His
Cys
Cys
His
His
Tyr/Phe Tyr/Phe
cink-prst
Slika 4-12. Shematski prikaz tri domena koji su nađeni u nekim proteinima.
terakcija. To je stoga što je za uklanjanje molekula vode od jonskih grupa potrebna energija. Među
tim, soni mostovi učestvuju u interakcijama između susednih jedinica u kompleksnim proteinima. Na
površini proteina koji su rastvorni u vodi pojavljuju se interakcije jon-dipol i to između naelektrisanih
grupa i molekula vode. Stabilnost a-heliksa i (3-presavijene ploče u značajnoj meri potiče od toga što
su dipolarne grupe (karbonilna i amino) u polipeptidnoj kičmi okrenute u istom pravcu.
Na stabilnost strukture proteina utiču i van der VVaals-ove sile koje, iako su slabe, ne mogu da se
zanemare jer ih ima mnogo.
3. Vodonične veze se u najvećem broju pojavljuju između unutrašnjosti i površine proteina i to
između bočnih lanaca aminokiselina koji sadrže vodonik vezan za kiseonik (kao stoje alkoholna gru
pa serina ili treonina) ili azot i atoma kiseonika u karbonilnoj grupi ili karbonilnoj grupi peptidne veze.
Pored toga polarni bočni lanci aminokiselina na površini proteina mogu da reaguju sa vodom i time
povećavaju rastvorljivost proteina.
4. Kovalenetne veze. Među kovalentnim vezama u tercijarnoj strukturi najnačajniji su disulfidni
mostovi koji se sreću u ekstracelularnim proteinima. U ekstracelularnom okruženju ove jake veze šti
te protein od različitih uticaja, kao što je promena pH ili koncentracije soli. Intracelularni proteini ne
sadrže disulfidne mostove zbog velikog sadržaja redukujućih agenasa u citoplazmi.
(1) a-Keratin
Keratin je hemijski nereaktivan protein koji se pojavljuje kod svih viših kičmenjaka. Nalazi se u
kosi, vuni, koži, noktima i rogovima. Keratini se dele na a-keratine koji se sreću kod sisara i (3-
keratine koji se pojavljuju kod ptica i reptila. Sisari imaju oko 30 varijanti keratina koje su tkivno speci
fične, a pripadaju ili grupi relativno kiselih (tip I) ili grupi relativno baznih (tip II) polipeptida.
Osnovna strukturna jedinica a-keratina, proteina koji se nalazi u kosi, je polipeptid u obliku a-
heliksa. Tri a-heliksa obrazuju levostranu superuvijenu strukturu koja se zove protofibril, a ovu struk
turu stabilizuju vodonične veze i disulfidni mostovi. Devet protofibrila vezani su zajedno u obliku cilin
dra u čijoj se sredini nalaze još dva protofibrila i ova struktura od 11 protofibrila naziva se mikrofibril.
Stotine mikrofibrila SQ pakuju zajedno u strukturu koja se zove makrofibril. Nekoliko makrofibrila čini
fiber, koji je omotan zaštitnim slojem mrtvih ćelija i čini deo vlasi kose (slika 4-14). ^
Mnoge osobine a-keratina potiču od sastava aminokiselina u polipeptidnom lancu. a-Keratin ima
visok sadržaj hidrofobnih aminokiselina, a kako su R-grupe aminokiselina sa spoljašnje strane helik-
sa, ovaj protein je neratsvoran u vodi. Ovaj protein je relativno otporan na istezanje, što je posledica
prisustva ostataka cisteina u polipeptidnom lancu, koji gradi disulfidne mostove. Keratini nađeni u
noktima i rogovima (tzv. "tvrdi" keratini) imaju značajno više disulfidnih mostova nego keratini iz kože.
Disulfidni mostovi mogu da se raskinu delovanjem nekog redukujećeg agensa (merkaptani) i da
se vlas kose ili vune potom rastegne na polovinu svoje prethodne dužine delovanjem vlažne toplote.
Ako se posle raskidanja disulfidnih veza kosa ukovrdža, a zatim primeni neki oksidujući agens, disul
fidne veze će se ponovo uspostaviti i kosa će trajno ostati u ukovrdžanom stanju. Ovaj proces se
primenjuje kod obrade kose.
Životinje ne mogu da vare vlakna keratina jer je nerastvorljiv, ali larve moljaca imaju mnogo mer-
kaptana u digestivnom traktu što im omogućava da svare vunena vlakna.
S. Spasić: Proteini 4-13
(2) Kolagen
Kolagen se nalazi kod svih višećelijskih organizama, a najčešći je protein kod kičmenjaka jer se
nalazi u skoro svim tkivima. Sam naziv kolagen podrazumeva grupu sličnih proteina koji imaju različi
te funkcije. Sisari imaju najmanje 30 genetski različitih polipeptidnih lanaca koji grade 16 varijanti ko-
lagena, a one ulaze u sastav različitih tkiva iste individue. Tipovi i organizacija molekula kolagena
zavise od uloge koju kolagen ima u pojedinim organima. U nekim tkivima je kolagen dispergovan u
obliku gela i ima ulogu da spreči pramenu strukture, kao što je to slučaj sa ekstracelulamim matrik-
som ili očnom vodicom. U hrskavici je kolagen u obliku paralelnih vlakana, koja daju veliku jačinu tki
vu. U rožnjaći oka kolagen je tako raspoređen da omogućava propuštanje svetlosti sa minimalnim
rasipanjem. U kostima su vlakna kolagena ukrštena i daju otpornost kostima na mehaničke udare.
Sekvenca aminokiselina u kolagenu je od velikog broja ponovljenih tripleta rasporeda Gly-X-Y,
gde su X i Y često prolin i hidroksiprolin, a u poziciji Y nađen je i hidroksilizin. Heliks kolagena je le-
vostrani, a tri levostrana heliksa su postavljena paralelno i uvijena jedan oko drugog tako da grade
desnostrani superheliks. Zbog takvog uvrtanja svaki treći ostatak svakog lanca prolazi kroz centar
trostrukog heliksa u kome ima tako malo prostora da u njega može da stane samo bočni lanac gliči
na. To je razlog što se glicin nalazi u svakom trećem položaju polipeptidnog lanca kolagena, kao i što
se glicin, X i Y ostaci iz tri polipeptidna lanca nalaze u istoj ravni. Polipeptidni lanci su povezani vo-
doničnim vezama koje grade između N-H grupe svakog ostatka glicina i kiseonika iz karbonilne gru
pe u X-ostatku susednog lanca. Trostruki heliks predstavlja molekulsku jedinicu kolagena i naziva se
tropokolagen.
Slika 4-15. Trostruki heliks kolagena Slika 4-16. Poprečni presek trostrukog heliksa kolagena
(vodonične veze su prikazane isprekidanim linijama)
Glicin je najzastupljenija aminokiselina u kolagenu i čini oko jednu trećinu ukupnog aminokiselin-
skog sastava. Pored glicina u kolagenu ima mnogo prolina i 4-hidroksiprolina i na njih otpada 15 do
30% od svih aminokiselina u molekulu kolagena, a u manjoj količini se nalaze i 5-hidroksiprolin i 5-
hidroksilizin. Ove nestandardne hidroksilovane aminokiseline se ne inkorporiraju u polipeptidni lanac
u toku sinteze već nastaju posle toga u enzimski katalizovanim reakcijama. Pretvaranje prolina u 4-
hidroksiprolin katalizuje enzim prolil-hidroksilaza koja se aktivira vitaminom C. U nedostatku vitamina
C sintetiše se kolagen koji ima manje 4-hidroksiprolina i nije u stanju da stvara odgovarajuća vlakna,
što kao posledicu ima nastajanje lezija u koži, pucanje krvnih sudova i pojavu rana. Kolagen sinteti-
san u prisustvu neaktivne prolil-hidroksilaze denaturiše se već na 24°C, dok se normalan kolagen
denaturiše na 39°C (denaturisani kolagen je poznat pod imenom želatin).
Za ostatke hidroksilizina u kolagenu kovalentno su vezani prosti ugljeni hidrati (glukoza, galakto-
za i njihovi disaharidi), a količina ugljenih hidrata u kolagenu ide od 0,4 do 12% težine, zavisno od
4-14 Opšta biohemija
toga iz kog tkiva je kolagen. Funkcija ugljenih hidrata u kolagenu nije poznata, ali se pretpostavlja da
su oni potrebni za fibrilogenezu, odnosno formiranje vlakana kolagena u ekstracelularnoj lokaciji.
Kolagen je nerastvorljiv u rastvaračima koji raskidaju vodonične veze i jonske interakcije, što
ukazuje na to da u vlaknima kolagena postoje pored intramolekulskih i intermolekulske kovalentne
unakrsne veze. Ove unakrsne veze nisu disulfidne veze kakve postoje u keratinu, jer u kolagenu
nema ostataka cisteina, već u njihovom stvaranju učestvuju bočni lanci lizina i histidina. Prvi korak u
stvaranju unakrsnih veza je reakcija oksidativne deaminacije lizina u aldehid al-lizin, koju katalizuje
lizil-oksidaza i to jedina enzimski katalizovana reakcija u procesu stvaranja unakrsnih veza. Dva mo
lekula al-lizina daju al-lizin-aldol u reakciji aldolne kondenzacije, a ovaj aldol reaguje sa histidinom pri
čemu nastaje aldol histidin. Aldol histidin može da reaguje sa 5-hidroksilizinom dajući Schiff-ovu ba
zu, a ova reakcija može da se odvija ili unutar trostrukog heliksa ili sa susednim molekulom kolagena
u fibrilu. Ukoliko se zbog nedostatka lizil-oksidaze ne stvaraju unakrsne veze, nastaće vlakna kola
gena koja se Iako disosuju i brzo degradiraju.
Broj unakrsnih veza u kolagenu jednog tkiva povećava se sa godinama života, tako da je meso
starijih životinja čvršće nego meso mlađih životinja. Individualni molekuli kolagena mogu da se izdvo
je samo iz mesa vrlo mladih životinja.
Neki insekti i pauci stvaraju svilu koju koriste za obrazovanje različitih struktura, kao što su čaure,
mreže, gnezda itd. Svila se deponuje u vodenoj sredini u ćelijama koje je sintetišu, a tokom sekreci-
jese pretvara u oblik koji je nerastvoran u vodi. Većina svila se sastoji od fibroznog proteina fibroina i
amorfnog proteina sericina, čija je funkcija da cementira vlakna fibroina. Leptiri koji se razviju u čauri
luče jednu proteazu koja razlaže sericin, što omogućava insektu da razdvoji vlakna fibroina i izađe iz
čaure. U pripremi svilenog vlakna koje se koristi za odeću sericin se uklanja uz pomoć ključalog ras
tvora sapuna.
Fibroin je tip (3-keratina, kod koga polipeptidni lanci imaju konformaciju antiparalelne p-
presavijene ploče i istegnuti su paralelno osi vlakna. Larva svilene bube proizvodi fibroin koji ima vi
sok sadržaj glicina, alanina i serina i polipeptidni laci su u p-presavijenoj ploči postavljeni tako da su
bočne grupe glicina sa jedne strane, a alanina i serina sa druge strane ploče. Svileno vlakno je vrlo
jako jer su polipeptidni lanci istegnuti, ali ne može da se isteže, jer bi za to bilo potrebno da se prvo
raskinu jake kovalentne veze u polipeptidnoj kičmi. Presavijene ploče su vezane između sebe slabim
van der VVaals-ovim silama, što omogućava da klize jedna preko druge, a to uslovljava da je svileno
vlakno fleksibilno. Svila koju proizvode različite vrste insekata ima različit sastav aminokiselina u po-
lipeptidnom lancu, a to određuje i njene mehaničke osobine.
U svilenom vlaknu se smenjuju kristalni (fibroin) i amorfni (sericin) regioni. Amorfni region je od
govoran u velikoj meri za sposobnost svilenog vlakna da se isteže.
(4) Elastin
Elastin je protein sa elastičnim osobinama čija vlakna mogu da se rastegnu na dužinu koja je ne
koliko puta veća od normalne dužine. Ovaj protein je glavna komponenta žutog elastičnog vezivnog
tkiva koje se pojavljuje u plućima, zidovima velikih krvnih sudova kao što je aorta ili u elastičnim li
gamentima kakvi su oni na vratu. Belo neelastično vezivno tkivo koje se javlja u tetivama ima malu
količinu elastina.
Elastin, kao i drugi fibrozni proteini, ima specifičan sastav aminokiselina i sastoji se uglavnom od
malih nepolarnih ostataka aminokiselina: jedna trećina je glicin, više od jedne trećine alanin + valin, a
bogat je i u prolinu. Sadrži malo hidroksiprolina, nema hidroksilizina i vrlo malo ostataka polarnih
aminokiselina. Kovalentne unakrsne veze u elastinu grade al-lizin-aldol (koji se takođe pojavljuje u
kolagenu) i lizino-norleucin koji nastaje redukcijom Schiff-ove baze stvorene kondenzacijom bočnog
lanca lizina sa allizinon. Dezmozin i izodezmozin su karakteristični za elastin i od njih potiče žuta boja
elastina; oni nastaju kondenzacijom tri molekula al-lizina i bočnog lanca lizina. Primarna struktura
O O"
Ci
3->T
D. GLOBULARNI PROTEINI
Globularni proteini obuhvataju vrlo različite grupe supstanci, koje u nativnom stanju imaju oblik
kompaktnih sferoidnih molekula. U ovu gupu spadaju enzimi, transportni i receptorski proteini. Za
funkciju globularnih proteina je neophodno da se njihovi molekuli precizno vezuju za druge molekule,
a za ovo je vrlo važna vrsta i raspored aminokiselina na površini proteina. Ostaci aminokiselina su
tako raspoređeni da obrazuju udubljenje ili šupljinu na površini proteina koja je komplementarna sa
strukturom specifičnog molekula za koji se vezuju, a koji se naziva ligand. Ostali deo molekula globu-
larnog proteina se obično vezuje za regulatorne molekule ili je zadužen za održavanje trodimenzio
nalne strukture.
Hemproteini
Hemproteini su posebna grupa globularnih proteina koji kao prostetičnu grupu sadrže hem. Uloga
hema u proteinima je različita: u citohromima hem ima ulogu prenosioca elektrona i naizmenično se
oksiduje i redukuju, u enzimu katalazi koja razlaže vodonik-peroksid hem je deo aktivnog centra, a u
mioglobinu i hemoglobinu funkcija hema je da reverzibilno vezuje kiseonik. U hemoglobinu i mioglo-
binu Fe(ll) ne menja oksidaciono stanje bez obzira da li je hem oksigenovan ili ne.
o
-OOC-CH 2 -CHj l CHJ-CHJ-COCT
HN—\
CH4
H I
Hem je protoporfirin IX (derivat porfirina sagrađen od četiri pirolova prstena vezana metenskim
mostovima i sa četiri metil, dva propionil i dva vinil supstituenta) sa centralno vezanim gvožđem. Jon
Fe(ll) je vezan za četiri azota u pirolovim prstenovima, a može da formira još dve veze i to po jednu
sa svake strane ravni porfirinskog prstena. Na primer, u oksigenovanom hemoglobinu i mioglobinu
jon Fe(ll) obrazuje petu vezu sa azotom u ostatku histidina u proteinskom lancu, a šestu vezu sa ki-
seonikom sa suprotne strane porfirinskog prstena u odnosu na histidin
Neki mali molekuli, kao što su CO, NO i H2S imaju mnogo veći afinitet od kiseonika za vezivanje
za šestu koordinativnu vezu gvožđa, čime se objašnjava toksičnost ovih jedinjenja. Fe(ll) u
hemoglobinu i mioglobinu može da se oksidiše u Fe(lll) i tada nastaju methemoglobin i
metmioglobin; ova dva oblika nisu u stanju da vezuju kiseonik. Osušena krv i staro meso imaju
tamno smeđu boju od methemoglobina i metmioglobina.
(1) Mioglobin
Mioglobin je monomemi hem protein koji se nalazi uglavnom u mišićnom tkivu gde služi kao in-
tracelularni depo kiseonika i daje im karakterističnu crvenu boju. Vodeni sisari, koji mogu dugo da se
zadrže pod vodom imaju vrlo visok sadržaj mioglobina u mišićima, koji su zbog toga smeđe boje. U
vreme kada nema priliva kiseonika oksimioglobin oslobađa kiseonik koji može da se koristi u meta
boličkim procesima.
4-16 Opšta biohemija
Tercijarna struktura mioglobina je tipična za globularne proteine rastvorljive u vodi, dok mu je se
kundarna struktura neuobičajena jer ima oko 75% a-heliksa. Polipeptidni lanac u mioglobinu je sas
tavljen od 8 posebnih a-heliksa, označenih slovima od A do H, koji su povezani kratkim neheliksnim
regionima. Aminokiseline koje se nalaze u unutrašnjosti molekula su uglavnom hidrofobne, dok su
one na površini hidrofilne, što čini da je molekul mioglobina rastvorljiv u vodi.
Slika 4-18. Shematski prikaz molekula Slika 4-19. Shematski prikaz mesta za vezivanje
mioglobina. kiseonika u mioglobinu
Molekul mioglobina sadrži kao prostetičnu grupu jedan hem inkorporiran u hidrofobnu unutraš
njost proteina, a aminokiseline u blizini hema stvaraju okruženje koje dozvoljava reverzibilno veziva
nje kiseonika, a sprečava oksidaciju gvožđa. Ovakvo okruženje je posledica nekovalentnih interakcija
između bočnih grupa u aminokiselinama i nepolamog porfirinskog prstena. Sve aminokiseline koje
reaguju sa hemom su nepolarne, sa izuzetkom dva ostatka histidina od kojih se jedan (označava se
kao proksimalni histidin) vezuje direktno sa jonom gvožđa u hemu. Drugi ostatak histidina označava
se kao distalni i ima ulogu da stabilizuje mesto za vezivanje kiseonika (Slika 4-19).
(2) Hemoglobin
Hemoglobin se nalazi u eritrocitima, a osnovna uloga mu je da transportuje kiseonik od pluća do
svih tkiva u organizmu i da otklanja ugljen dioksid iz njih. Hemoglobin je sagrađen od četiri globinska
lanca, koji se razlikuju zavisno od vrste hemoglobina. Najzastupljeniji oblik hemoglobina kod odraslih
osoba je HbA koji ima dva a- i dva (3-lanca. Odrasle osoba imaju oko 2% HbA2 koji sadrži 2 5-ianca
umesto p-lanaca. U periodu pre rođenja sintetišu se £-lanci i to u embrionalnom periodu, a u fetalno
doba vlanci, koji ulaze u sastav hemoglobina umesto p-lanaca. Oba ova oblika hemoglobina (a2£2 i
a2Y2) imaju veći afinitet za kiseonik što omogućava fetusu da uzima kiseonik iz krvi majke.
Četiri proteinska lanca u hemoglobinu su organizovana u dve identične jedinice koje se označa
vaju kao aiPi i a2p2, a povezane su nekovalentnim interakcijama. Subjedinice su primarno povezane
hidrofobnim vezama, ali postoje i jonske veze i i vodonične veze. Svaki proteinski lanac ima hem kao
prostetičnu grupu, vezanu na sličan način kako je opisano kod mioglobina, ali je vezivanje kiseonika
u hemoglobinu nešto kompleksnije nego stoje to slučaj kod mioglobina.
Molekul hemoglobina ima dve konformacije: deoksigenovani hemoglobin (deokis-Hb) i oksigeno-
vani hemoglobin (oksi-Hb). U deokis-Hb, koji se nalazi u tzv. T (nategnutom) stanju postoje interakci
je između subjedinica ai $^ i a2 p2 koje sprečavaju kretanje polipeptidnih lanaca. U prisustvu velikih
količina kiseonika dolazi do vezivanja gasa za gvožđe u hemu uz istovremeno raskidanje nekih jon
skih mostova i vodoničnih veza između subjedinica, što dovodi do pomeranja polipeptidnih lanaca i
promene konformacije proteina. Ovaj oblik hemoglobina se naziva oksi-hemoglobin i njegova karak
teristika je da su polipeptidni lanci mnogo labavije vezani međusobom, a sam protein se nalazi u R
(relaksiranom) stanju. T-oblik hemoglobina ima nizak afinitet za vezivanje kiseonika, za razliku od R-
oblika hemoglobina koji ima vrlo visok afinitet za kiseonik.
3$
po2 u po2 u
tkivima plućima
Kriva zasićenja kiseonikom za mioglobin ima oblik hiperbole i pomerena je ka manjim parcijalnim
pritiscima kiseonika u odnosu na hemoglobin. Vezivanje kiseonika za mioglobin je jednostavno zbog
njegove proste strukture, a to objašnjava i ulogu miogiobina u deponovanju kiseonika u tkivima. Poš
to mu je kriva disocijacije pomerena ka manjim parcijalnim pritiscima kiseonika, mioglobin će otpušta
ti kiseonik samo kada je koncentracija kiseonika u mišićnim ćelijama vrlo niska, što se dešava kod
velikog fizičkog napora. S druge strane, pošto mioglobin ima veći afinitet za kiseonik nego hemoglo
bin, kiseonik se lako prenosi iz krvi u mišiće.
Kriva zasićenja kiseonikom za hemoglobin ima sigmoidalni oblik, što ukazuje na to da subjedinice
u molekulu hemoglobina kooperativno vezuju kiseonik. To znači da vezivanje prvog molekula kiseo
nika za hemoglobin olakšava vezivanje novih molekula kiseonika, a posledica je promene u trodi
menzionalnoj strukturi hemoglobina, koja započinje vezivanjem prvog molekula kiseonika. Drugim
recima, vezivanje prvog molekula kiseonika olakšava vezivanje drugog, vezivanje drugog olakšava
vezivanje trećeg a vezivanje trećeg olakšava vezivanje četvrtog molekula kiseonika. Neto efekat ove
interakcije je da je afinitet hemoglobina za poslednji molekul kiseonika približno 300 puta veći od afi
niteta za prvi molekul kiseonika.
U plućima je parcijalni pritisak kiseonika veliki i hemoglobin je potpuno zasićen kiseonikom, a ka
ko krv prolazi kroz tkivo hemoglobin otpušta kiseonik i u kapilarima je zasićenje svedeno na polovinu.
Kooperativno vezivanje kiseonika omogućava hemoglobinu da u tkivima otpusti veliku količinu kiseo
nika kao odgovor na relativno malo smanjenje parcijalnog pritiska.
Smanjenje pH povećava disocijaciju kiseonika iz hemoglobina i taj fenomen se naziva Bohr-ov
efekat, a to je mehanizam koji omogućava da se ćelijama predaje onoliko kiseonika koliko im je pot
rebno. Naime, metabolički aktivne ćelije koje troše velike količine kiseonika za stvaranje energije is
tovremeno stvaraju i velike količine kiselih proizvoda kao što su H+ i C0 2 . C0 2 difunduje u krv, reagu-
je sa vodom i daje HC03" i H+ , a H+ se vezuje za deoksi-hemoglobin. Svako povećanje u koncentra
ciji H+ stabilizuje deoksi-oblik hemoglobina, pa prema tome povećava brzinu njegovog stvaranja.
Važan regulator vezivanja kiseonika za hemoglobin je i 2,3-difosfoglicerat (2,3-DPG), koji se sin-
tetiše kao intermedijer u procesu glikolize. 2,3-DPG se vezuje za deoksihemoglobin i to tako što se
inkorporira u prazninu izmedju p-lanaca; u ovom prostoru se nalazi nekoliko pozitivno naelektrisanih
4-18 Opšta biohemija
aminokiselina koje stvaraju jonske veze sa negativno naelektrisanom fosfatnom grupom u 2,3-DPG.
Hemoglobin za koji je vezan 2,3-DPG ima izrazito smanjen afinitet za kiseonik, što omogućava da se
sav kiseonik oslobodi iz hemoglobina i preda tkivu. U plućima, gde je parcijalni pritisak kiseonika ve
liki, dolazi do odvajanja 2,3-DPG od hemoglobina, što povećava afinitet hemoglobina za kiseonik i
omogućava njegovo vezivanje.
suprotno naelektrisanih grupa u molekulu proteina, što zatim omogućava molekulima vode da se ra
sporede oko ovih grupa. Ovaj efekat ne zavisi od prirode soli, već samo od broja naelektrisanja poje
dinih jona u rastvoru, tako da soli koje sadrže dvovalentne jone, kao što su MgCI2 ili MgS0 4 imaju
veći efekat na rastvorIjivost nego, npr. NaCI, KCI ili NH4CI.
Dodavanjem velikih količina soli u rastvor proteina stvaraju se precipitati, jer veliki broj jona soli
počinje da se takmiči sa proteinom za molekule vode, koji se potom raspoređuju oko jona soli. Ovo
kao posledicu ima agregaciju molekula proteina i stvaranje precipitata. Ovaj proces se naziva isolja-
vanje proteina i takođe je iskorišćen za razdvajanje proteina u procesu prečišćavanja, jer koncentra
cija soli pri kojoj počinje taloženje nije ista za sve proteine.
6. Teški metali kao što su živa i olovo narušavaju strukturu proteina na nekoliko načina. Oni mo
gu da raskinu sone mostove stvaranjem jonskih veza sa negativno naelektrisanim jonima. Teški me
tali se takođe vezuju sa sulfhidrilnim grupama, što može da dovede do značajne promene u strukturi
i funkciji proteina. Na primer, olovo može da se veže za sulfhidrilne grupe u dva enzima koji učestvu
ju u sintezi nema, što dovodi do teških anemija zbog smanjene količine hemoglobina.
7. Temperatura utiče na rastvorljivost proteina i to tako da se rastvorljivost povećava kada se po
većava temperatura počev od 0°C pa do 40°C. Iznad 40°C većina proteina postaje nestabilna i poči
nje da se denaturiše. Povećanje temperature dovodi do povećanja brzine vibracije molekula, zbog
čega se raskidaju vodonične veze u proteinu. Zagrevanjem rastvora proteina u kiseloj sredini stvara
ugrušak ili koagulum, koji ne može ponovo da se rastvori jer je denaturacija ireverzibilna.
8. Mešanjem i mućkanjem rastvora proteina može da se naruši osetljiva ravnoteža sila koje su
potrebne za održavanje strukture proteina. Na primer, pena koja se stvara kada se belance jajeta
snažno mućka sadrži denaturisane proteine.
^
Poglavlje 5.
Ugljeni hidrati
Ugljeni hidrati ili šećeri su najčešći organski molekuli u prirodi i više od polovine celokupnog or
ganski vezanog ugljenika nalazi se u ugljenim hidratima. Većina ovih jedinjenja sadrži ugljenik, vodo-
nik i kiseonik u odnosu Cn(H20)n, zbog čega su i dobili ime ugljeni hidrati. Kod fotosintetskih organi
zama ugljeni hidrati se obrazuju iz C 0 2 i vode a kod heterotrofnih organizama iz velikog broja različi
tih jedinjenja. Iz tog razloga im je i funkcija u organizmu različita: mogu da služe kao brzo metaboli-
šući supstrati ili kao visoko energetska rezervna jedinjenja. Takođe mogu da imaju ulogu skeletne
supstance, da budu sastavni deo ekstracelularnog matriksa ili da ulaze u sastav proteina.
Prema broju prostih šećera koje sadrže ugljeni hidrati se dele na monosaharide, disaharide, oli-
gosaharide i polisaharide.
A. MONOSAHARID!
Monosaharidi ili prosti šećeri su aldehidni ili ketonski derivati polihidroksilnih alkohola sa najma
nje tri ugljenikova atoma, a klasifikuju se prema broju ugljenikovih atoma i hemijskoj prirodi karbonil-
ne grupe. Ako šećer ima aldehidnu grupu onda se svrstava u grupu aldoza, a ako je karbonilna gru
pa keton, šećer pripada grupi ketoza. Najmanji monosaharid je trioza, koja sadrži tri ugljenikova ato
ma, dok tetroze, pentoze, heksoze, heptoze sadrže četiri, pet, šest odnosno sedam ugljenikovih
atoma. Često se za neke klase monosaharida koriste nazivi koji u sebi sadrže informaciju o broju ug
ljenikovih atoma i prirodi karbonilne grupe; npr. naziv aldoheksoze govori da se radi o monosahari-
dima iz grupe aldoza sa šest ugljenikovih atoma ili naziv ketoheksoze koji govori da se radi o mono-
saharidima iz grupe ketoza sa šest ugljenikovih atoma.
Gliceraldehid je najprostiji monosaharid i njegova osobina je da se pojavljuje u dva steroizomerna
oblika koji rotiraju ravan polarizovane svetiosti u suprotnim pravcima. Molekuli koji imaju ove osobine
nazivaju se optičkim izomerima i obeležavaju se sa D (desnorotirajući ili +), odnosno L (levorotirajući
ili -); D izomeri okreću ravan polarizovane svetiosti u pravcu kretanja kazaljke na satu, dok L izomeri
okreću ravan polarizovane svetiosti u suprotnom pravcu. Pošto većina monosaharida ima više hiral-
nih centara, oznake D i L se odnose na organizaciju atoma oko drugog ugljenikovog atoma i to u po-
ređenju sa gliceraldehidom (koji je referentno jedinjenje za optičke izomere), a ne na stvarni pravac
okretanja polarizovane svetiosti.
Stereoizomeri koji nisu enatiomeri (ponašaju se kao predmet i njegov lik u ogledalu) nazivaju se
diastereomeri. Na primer, aldopentoze D-riboza i L-riboza su enantiomeri, kao i D-arabinoza i L-
arabinoza, dok su D-riboza i D-arabinoza diastereomeri. Diastereomeri koji se razlikuju u konfiguraciji
na jednom ugljenikovom atomu (ali ne i na referentnom ugljeniku) nazivaju se epimeri. Na primer, D-
glukoza i D-galaktoza su epimeri jer se razlikuju samo po konfiguraciji OH grupe na četvrtom ugljeni-
5-2 Opšta biohemija
kovom atomu, dok D-manoza i D-galaktoza nisu epimeri jer imaju različitu konfiguraciju na više od
jednog atoma ugljenika.
Ciklična struktura monosaharida. Alkoholi mogu da reaguju sa karbonilnom grupom aldehida i
ketona i tom prilikom nastaju hemiacetali odnosno hemiketali. Na sličan način se odvija intramolekul-
ska reakcija u monosaharidima između hidroksilne grupe i aldehidne, odnosno keto-funkcionalne
grupe, iz čega nastaju ciklični hemiacetali i hemiketali (Slika 5-1). Šećeri koji sadrže četiri ili više ug-
Ijenikovih atoma primarno postoje u cikličnom obliku, ali kako su ovi oblici nestabilni lako se vraćaju u
aldehidni ili ketonski oblik. Šećeri sa šestočlanim prstenom poznati su kao piranoze, a ime su dobili
po analogiji sa piranom koji je najprostije jedinjenje koje sadrži ovaj prsten. Na sličan način šećeri koji
sadrže petočlani prsten označavaju se kao furanoze po analogiji sa furanom. Ciklični oblici glukoze i
fruktoze se prema tome označavaju kao glukopiranoza, odnosno fruktofuranoza.
(a)
D-glukoza a-D-giukopiranoza
(b)
l
r-
C!»2OH
HOHjC 'CH.OH
*c= O
H01ČC OH CH..OII
,l
I*
HO—C—H H OH/f*
H OH
H—C—OH .c—c*
4
II—'C—OH I 3i OH II
OH II
8
CH,OH
a-D-fniktofuranoza
D-fruktoza
Slika 5-1. Prevođenje linearnog oblika (a) D-glukoze u ciklični hemiacetal a-
D-glukopiranozu i (b) D-fruktoze u ciklični hemiketal a-D-fruktofuranozu. Ci
klične strukture su prikazane kao Haworth-ova projekcija.
Posle ciklizacije karbonilni ugljenik postaje novi hiralni centar i naziva se anomerni ugljenikov
atom a dva diastereomera koja mogu da nastanu u toku reakcije ciklizacije nazivaju se anomeri. Kod
hemiacetala se na C-1 javlja hidroksilna grupa koja leži ili iznad ili ispod prstena. Kada je hidroksilna
grupa ispod prstena, odgovarajuća struktura se označava kao a-anomerni oblik, a ako je hidroksilna
grupa iznad prstena struktura je (3-anomerni oblik.
Reakcije monosaharida
Oksido-redukcione reakcije. U prisustvu oksidujućih agenasa, metalnih jona i nekih enzima
monosaharidi mogu da se oksiduju na različite načine. Oksidacijom aldehidne grupe dobija se aldon-
ska kiselina, oksidacijom terminalne CH2OH grupe, ali ne i aldehidne grupe nastaje uronska kiselina
a oksidacijom i aldehidne i terminalne CH2OH grupe nastaje aldarna kiselina (Slika 5-2).
Najvažniji predstavnici ove grupe su D-glukuronska kiselina i njen epimer L-iduronska kiselina.
Glukuronska kiselina se vezuje u ćelijama jetre sa različitim molekulima, kao što su steroidi, neki le-
kovi i bilirubin (degradacioni proizvod hemoglobina), čime se povećava njihova rastvorljivost u vodi.
Zahvaljući tome moguće je izlučivanje ovih jedinjenja iz organizma. Uronske kiseline takođe ulaze u
sastav važnih polisaharida. Karbonilna grupa u aldonskim i uronskim kiselinama može da reaguje sa
hidroksilnom grupom u istom molekulu, pri čemu nastaje ciklični estar, (Slika 5-3).
3
S. Spasić: Ugljeni hidrati 5-3
OH
OH I
I
c=o c=o
I I
c=o H-C-OH H—C—OH
I H O - C - •H
I HO- - C - H
H—C—OH I I
I H- -C—OH II—C—OH
HO-C—H I I
I -C—OH H- •C—OH
H—C—OH I I c-o
I
H—C—OH c=o c=o
I l i H OH
CllfiH OH H H
D-glukonska D-glukuronska OH
D-glukarna
kiselina kiselina kiselina D-glukono-8-lakton D-glukurono-8-lakton
Slika 5-2. Jedinjenja nastala oksidacijom glukoze. Slika 5-3. Laktoni glukonske i glukuronske
kiseline.
Redukcija. Redukcijom aldehidne i keto grupe u monosaharidima nastaju šećerni alkoholi (aldi-
toli); redukcijom D-glukoze, na primer, nastaje D-glucitol koji je poznat kao D-sorbitol. Ribitol je kom
ponenta flavin koenzima, a glicerol i ciklični alkohol mio-inozitol su važne komponente lipida (Slika 5-
4).
CHTOH
I
H—C—OH CHpH
HO—C—H H—C—OH HO OH
I
H—C—OH H—C—OH CHpH
I
H—C OH H—C—OH H—C—OH
I I I
CHpH CHpH CHpH H OH
a ketali fruktoze fruktozidi. Relativno jednostavan primer prikazan na Slici 5-5 ilustruje reakciju gluko
ze sa metanolom pri čemu nastaju dva tipa metil-glukozida.
glikozidne
veze
Glikozidne veze između monosaharida se označavaju prema poziciji ugljenikovih atoma koji u
njoj učestvuju, kao i prema položaju anomerne hidroksilne grupe u monosaharidu. Ako je anomerna
hidroksilna grupa u položaju a, onda se glikozidna veza označava kao a-veza, a ako je u položaju p,
veza se označava kao (3-veza. Na primer, laktoza se sintetiše stvaranjem glikozidne veze između C-
1 u p-galaktozi i C-4 u glukozi, pa se ta glikozidna veza označava kao (3(1—>4)veza.
Glikozidi se dele na O- i N-glikozide, zavisno od toga sa kojom grupom u aglikonu monosaharid
gradi glikozidnu vezu. Ako se glikozidna veza gradi sa -OH grupom u aglikonu nastaju O-glikozidi, a
ako reaguje -NH 2 grupa, nastali glikozidi se označavaju kao N-glikozidi. Treba imati na umu da su
glikozidi koji nastaju iz monosaharidnih jedinica uvek O-glikozidi.
Veliki broj glikozida koji se nalaze u biljkama i životinjama imaju biološki značaj, a neki se koriste
i kao lekovi (glikozidi digitalisa, streptomicin i dr.). Tipični aglikoni za ove glikozide su purini i pirimidi-
ni (nukleotidi i polinukleotidi), jedinjenja sa aromatičnim prstenom u strukturi, proteini (glikoproteini i
glikozaminoglikani) i lipidi (glikolipidi).
Važni monosaharidi
Glukoza, poznata i kao dekstroza nalazi se u velikoj količini u ćelom živom svetu. Ona predstav
lja osnovno gorivo za žive ćelije, a kod životinja je posebno važan izvor energije za ćelije mozga i eri
trocite. Ćelije koje imaju ograničeno snabdevanje kiseonikom, kao što su ćelije u očnoj jabučici, troše
velike količine glukoze kao izvor energije. Čovek unosi glukozu u obliku biljnog polisaharida škroba i
disaharida laktoze, maltoze i saharoze.
Fruktoza ili levuloza se naziva i voćnim šećerom jer se nalazi u velikim količinama u voću; ima je
i u drugim biljkama, kao i u medu. Važnu ulogu kao izvor energije fruktoza ima u muškom reprodukti
vnom sistemu, jer spermatozoidi koriste velike količine ovog šećera kao izvor energije.
Galaktoza je neophodna za sintezu različitih biomolekuia: laktoze, glikolipida, nekih fosfolipida,
proteoglikana i glikoproteina. Sinteza ovih jedinjenja ne zavisi od ishrane jer se galaktoza sintetiše iz
glukoza-1-fosfata. Galaktoza i glukoza su epimeri na C-4 a interkonverziju ova dva šećera katalizuje
enzim koji se naziva epimeraza.
Derivati monosaharida
Deoksišećeri su monosaharidi kod kojih je -OH grupa zamenjena sa -H. Važni deoksišećeri koji
su nađeni u ćelijama su L-fukoza i L-ramnoza, koje ulaze u sastav nekih polisaharida i glikoproteina,
kao i 2-deoksi-D-riboza, koja je komponenta DNK.
Aminošećeri su monosaharidi kod kojih je -OH grupa (najčešće na C-2) zamenjena amino gru
pom (Slika 5-6). Najčešći aminošećeri u ćelijama su D-glukozamin i D-galaktozamin, koji ulaze u sas
tav kompleksnih ugljenih hidrata, vezanih za različite ćelijske proteine i lipide. Aminošećeri su često
acetilovani i jedno od takvih jedinjenja je N-acetil-glukozamin. Kada se N-acetil-glukozamin veže sa
laktatom nastaje N-acetilmuraminska kiselina, koja je važan sastojak bakterijskog zida. N-acetil-
S. Spasić: Ugljeni hidrati 5-5
<>, COOH
CH..OH
OH
HO
OH H\ NH-C-CH,
H—C—OH
O
H NH-, H NH-, i ostatak
ostatak R= H — C - O H piruvata
laktata I
a-D-glukozamln a-D-galaktozamin CH2OH
N-acetil-muramlnska N-acetil-neuraminska
kiselina (NAM) kiselina
Slika 5-6. Struktura nekih aminošećera i njihovih derivata.
B. DISAHARIDI I OLIGOSAHARIDI
Ako se glikozidna veza formira između hemiacetalne grupe jednog monosaharida i hidroksilne
grupe drugog monosaharida, nastali glikozid se naziva disaharid, a molekuli koji sadrže veliki broj
monosaharidnih jedinica povezanih glikozidnom vezom su polisaharidi. Nomenklatura ovih jedinjenja
je prilično komplikovana: prvo se u nazivu navodi monosaharid čija poluacetalna hidroksilna grupa
učestvuje u reakciji, zatim se u zagradi navodi pravac glikozidnog vezivanja od poluacetalne grupe
ka alkoholnoj ili drugoj poluacetalnoj grupi, i na kraju se navodi ime drugog monosaharida.
Reakcijom dve hidroksilne grupe na anomernim C-atomima nastaju disaharidi trehaloznog tipa, a
naziv su dobili po tome što im struktura odgovara trehalozi [a-glukozil (1->1) a-glukozidj. Drugi bio-
hemijski važan disaharid trehaloznog tipa je saharoza [a-glukozil (1->2) (3-fruktozid], kod koje se gli
kozidna veza formira između C-1 u ostatku glukoze i C-2 u ostatku fruktoze (Slika 5-7). Kako su ova
dva ugljenikova atoma povezana acetalnom vezom, saharoza nije redukujući šećer. Saharoza se
stvara u biljkama i predstavlja transportni oblik energije za ćelu biljku.
D
CH*OH CHpH
CHjOH
H OH OH H
glukoza fruktoza
saharoza laktoza
CH.pH CH..OH
H OH H OH
glukoza glukoza
maltoza celobioza
Slika 5-7. Struktura biohemijski važnih disaharida.
Disaharidi tipa maltoze nastaju reakcijom poluacetalne hidroksilne grupe jednog monosaharida
sa alkoholnom grupom na C-4 drugog monosaharida, tako da imaju slobodnu hidroksilnu grupu koja
može dalje da reaguje sa novim molekulom monosaharida. U ovu grupu disaharida spadaju maltoza,
laktoza i celobioza (Slika 5-7).
5-6 Opšta biohemija
C. POLISAHARIDI
Polisaharidi su molekuli koji u organizmu imaju ulogu ili depoa energije ili strukturnog materijala.
Sagrađeni su od monosaharidnih jedinica povezanih glikozidnom vezom, a broj monosaharida se
kreće od nekoliko stotina do nekoliko hiljada. Struktura polisaharida može biti linearna ili račvasta, a
molekulska masa nekih polisaharida nije konstantna, već zavisi od metaboličkog stanja organizma.
Polisaharidi mogu da se podele u dve velike grupe: homopolisaharidi koji su sagrađeni samo
od jedne vrste monosaharida, i heferopolisaharidi koji sadrže dve ili tri vrste monosaharida.
(1) Homopolisaharidi
Homopolisaharidi koji se nalaze u prirodi su škrob, glikogen i celuloza, čija je zajednička osobina
da se njihovom hidrolizom dobija glukoza, kao i hitin sagrađen od ostataka N-acetil-glukozamina. Po
red ovih polisaharida koji se nalaze u prirodi biohemijski su važni još dekstran, sagrađen takođe od
ostataka glukoze i inulin, u čiji sastav ulaze samo molekuli fruktoze.
Škrob je najvažniji biljni homopolisaharid i predstavlja giavnu rezervu energije u biljkama. Depo-
novanje glukoze u obliku škroba sprečava povećanje intracelulamog osmotskog pritiska, što bi se
inače desilo kad bi se glukoza deponovala kao monomer. Škrob se nalazi u citoplazmi biljnih ćelija u
obliku nerastvorljivih granula koje se sastoje od dve gradivne jedinice: amiloze i amilopektina.
H OH H OH
glukoza glukoza _ n
a-amiloza
Amiloza je sagrađena od nekoliko hiljada ostataka D-glukoze koji su povezani a(1->4) glikozid-
nom vezom u dugi nerazgranati lanac (Slika 5-8). Molekulska masa amiloze ide od 150 000 do 600
000. Iz sternih razloga lanac amiloze je uvrnut u obliku heliksa sa 6 ostataka glukoze po jednom
okretu, što joj daje kompaktnu strukturu koja je vrlo pogodna za deponovanje. Amiloza, kao i neki
drugi polisaharidi, ima na jednom svom kraju slobodnu aldehidnu grupu koja ima redukujuća svojs
tva.
Amilopektin je izgrađen na sličan način kao i amiloza, ali ima dodatna mesta grananja na kojima
hidroksilna grupa u položaju C-6 gradi glikozidnu vezu [a(1->6) veza] sa drugim molekulom glukoze
(Slika 5-9). Mesta grananja su na svakih 24 - 30 ostataka glukoze i to sprečava stvaranje heliksa.
Molekul amilopektina sadrži oko 106 ostataka glukoze, zbog čega je najveći molekul koji se pojavljuje
u prirodi. ^
CH.pH CHpH
grana O
amilopektin
Glikogen je polisaharid koji predstavlja depo energije kod kičmenjaka; u naročito visokoj koncen
traciji nalazi se u jetri (oko 10 g/100 g svežeg tkiva) i mišićima (oko 1 g/100 g svežeg tkiva). Primarna
struktura glikogena je kao kod amilopektina, ali je glikogen više razgranat. Mesta grananja kod gliko-
gena su na svakih 6 - 1 0 ostataka glukoze u spoljašnjem delu molekula, a u središtu molekula su če
sto i kod svakog četvrtog ostatka"glukoze. Zbog toga je molekul glikogena kompaktniji nego molekuli
drugih polisaharida, pa zauzima vrlo malo prostora. Molekulska masa glikogena je od 106 do 1,6 x
107daltona.
Celuloza je najrasprostranjenije organsko jedinjenje na zemlji, jer čini jednu trećinu biljne mase
\lma strukturu linearnog polimera koji sadrži do 150JD0 ostataka glukoze povezanih (3(1-^-4) glikozid-
nim vezama (Slika 5-10). Zbog ovog tipa veze molekul celuloze ima oblik vlakana; viakna su ispresa-
vijana i povezana vodoničnim vezama koje stabilizuju čitavu strukturu. Iz tog razloga celuloza ima
strukturnu ulogu u biljkama.
H OH H OH
glukoza glukoza
celuloza
Hitin je glavna strukturna komponena spoljašnjeg skeleta kod beskičmenjaka (insekti, pauci), a
prisutan je i u ćelijskom zidu većine gljiva i mnogih algi. Hitin je polimer sagrađen od ostataka N-
acetil-glukozamina povezanih p(1—>4) vezama. Od celuloze se razlikuje samo po tome što mu je -OH
grupa na C-2 zamenjena acetamidnom grupom.
5-8 Opšta biohemija
Dekstrani su polisaharidi sagrađeni od ostataka glukoze, a nalaze se pre svega u membrani ba
kterija. Ostaci glukoze su povezani (1->6) vezama, a mesta grananja su na položaju C-2, C-3 ili C-4.
Molekulska masa dekstrana je oko 4 x 106 daltona. Dekstrani se koriste kao zamena za krvnu plaz
mu kod velikih gubitaka krvi.
Od posebnog medicinskog interesa je polisaharid inulin, koji je sagrađen od ostataka fruktoze
povezanih 1(3-glikozidnim vezama. Koristu se za određivanje zapremine ekstracelularnog prostora,
kao i brzine glomerularne filtracije.
CH..OH CH 2 OH
cocr
CH,OH CH 2 OH CH2OSOs
H OH
D-glukuronat N-acetil-D-galaktozamin- D-iduronat-2-sulfat N-sulfo-D-glukozamin-
-6-sulfat -6-sulfat
hondroitin-6-sulfat heparin
ranih ugljenohidratnih lanaca koji su sastavljeni od preko 100 monosaharida, a oko proteinskog jez
gra su raspoređeni tako da idu u stranu i jedan od drugog su razdvojeni zbog naelektrisanja koje
imaju. Zbog ovakvog rasporeda ugljenohidratnih lanaca monomeri proteoglikana imaju izgled četke
za pranje boca (Slika 5-12). Veza između glikozaminoglikana i proteina ide preko trisaharidne jedini
ce (koja ima sastav galaktoza-galaktoza-ksiloza) u ugljenohidratnom lancu i serina u proteinu. Gliko-
zidna veza se formira između ksiloze i hidroksilne grupe serina.
H2C-OH 0 NH H 2 C-0H
M II I OHJ—0.
N-C-CH 2 -CH
I
c=o
Protein
Slika 5-14. Tipično kovalentno vezivanje između peptidnog i oligosaharidnog lanaca u glikoprote-
inu: a) N-glikozidna veza između ostatka asparagina u peptidnom lancu i N-acetilglukozamina:
b) O-glikozidna veza između ostatka serina u peptidnom lancu i N-acetilgalaktozamina
Peptidoglikani su glavna komponenta ćelijskog zida bakterija, a među njima je najvažniji murein.
Murein je makromolekul velike dužine sagrađen od disaharidnih jedinica koje su sastavljene od N-
acetilglukozamina i N-acetilmuraminske kiseline. Muraminsku kiselinu razlaže enzim muraminidaza
koja je poznata i po imenom Iizozim, a nalazi se u suzama i nosnom sekretu, što omogućava razla
ganje bakterija koje u disajne puteve i oči dospevaju iz vazduha.
Glikolipidi su kompleksi oligosaharida i lipida, a nalaze se prvenstveno u membranama. Najvaž
niji predstavnici ove grupe jedinjenja su sfingolipidi, gliceroglikolipidi i izoprenol-glikolipidi.
& Q
Poglavlje 6.
Lipidi
Lipidi su vrlo raznovrsna grupa biomolekula koji se između sebe razlikuju i po strukturi i po funkci
ji. Zbog toga naziv lipidi ima uglavnom operativni karakter i njime se generalno definišu supstance
koje se rastvaraju u nepolarnim rastvaračima kao što su etar, hloroform i aceton a ne rastvaraju se
značajno u vodi.
Funkcija lipida u organizmu je vrlo raznovrsna i bez njih ne bi mogao da postoji nikakav oblik ži
vota. Amfifilni lipidi kakvi su fosfolipidi i sfingolipidi sastavni su deo membrane svih ćelija (sa izuzet
kom nekih mikroorganizama); trigliceridi su energetska rezerva i kod kičmenjaka su smešteni u po
sebnom tkivu koje se naziva masno tkivo i iz koga po potrebi mogu da se mobilišu; u lipide spadaju u
neki liposolubilni vitamini, kao i holesterol koji je esencijelni sastojak membrane, ali i polazno jedinje-
nje za sintezu steroidnih hormona i žučnih kiselina koje su neophodne za digestiju masti u intestinal-
nom traktu.
A. KLASIFIKACIJA LIPIDA
Podela lipida može da se izvrši na više načina, obzirom na to da im je hemijska priroda vrlo razli
čita. Jedan od načina da se lipidi klasifikuju jeste i podela u dve grupe: jednostavni lipidi, koji ne mo
gu da se saponifikuju bazama i složeni lipidi, koji imaju u sebi estarsku vezu, pa prema tome mogu
da se saponifikuju. U prvu grupu spadaju masne kiseline i izoprenski derivati, čiji su najvažniji pred
stavnici terpeni i steroidi. U grupu složenih lipida spadaju oni koji obavezno imaju 1 - 3 acil-ostatka
esterifikovana sa alkoholom, najšešće glicerolom, glicerol-3-fosfatom i sfingozinom. I izoprenski deri
vati mogu da budu u esterifikovanom obliku, kao što je to slučaj sa estrima holesteroia i masnih kise
lina.
Izuzetan značaj imaju fosfolipidi, sfingolipidi i holesterol kao strukturni element svih ćelija, jer
učestvuju u izgradnji i plazma membrane i intracelulamih membrana (mitohondrije, lizozomi i endo-
plazmatski retikulum). Steroidni hormoni su po svojoj prirodi lipidi, tako da lipidi imaju ulogu i u reagu-
laciji metbolizma, rasta i diferenciranja. To isto važi i za prostaglandine i leukotriene koji u mnogim
tkivima ispoljavaju hormonsko dejstvo.
B. Nezasićene masne kiseline: sumarna formula C n H 2 n -iCOOH (sve dvostruke veze su cis)
CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7-
palmitoleinska kiselina A9-heksadecenska kiselina 16 : 1 (9)
COOH
CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-
oleinska kiselina A9-oktadecenska kiselina 18 : 1 (9)
COOH
CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)13-
nervonska kiselina A15-tetrakozenska kiselina 2 4 : 1 (15)
COOH
Aa ^-oktadekadienska ki CH3-(CH2)4-(CH=CH-CH2)2-
linolna kiselina 18:2(9,12)
selina (CH2)6-COOH
A aiA10 -oktadekatrienska CH3-CH2-(CH=CH-CH2)3-
a-linolenska kiselina 18:3(9,12,15)
kiselina (CH2)6-COOH
Aby'^-oktadekatrienska ki CH3-(CH2)4-(CH=CH-CH2)3-
v-linolenska kiselina 18:3(6,9,12)
selina (CH2)3-COOH
A 0 0 1 '^-eikozatetraenska CH3-(CH2)4-(CH=CH-CH2)4-
arahidonska kiselina 20:4(5,8,11,14)
kiselina (CH2)2-COOH
S. Spasić: Lipidi 6-3
(2) Acilgliceroli
Masne kiseline se u organizmu nalaze prvenstveno u obliku estara glicerola i u tom obliku se de-
ponuju za kasnije korišćenje. Estri trihidroksilnog alkohola sa jednom (monoacilgliceroli) i dve (diacil-
gliceroli) masne kiseline pojavljuju se uglavnom kao intermedijeri u sintezi i razgradnji jedinjenja koja
sadrže glicerol. Najveća količina masnih kiselina u humanom organizmu nalazi se u obliku triacilgli
cerola, u kojima su sve tri hidroksilne grupe u glicerolu esterifikovane sa masnim kiselinama. Triacil-
gliceroli se nazivaju još i neutralne masti ili trigliceridi. Međutim, ovaj naziv nije ispravan jer u organi
zmu postoje i drugi tipovi neutralnih masti
Vrsta masnih kisleina koje ulaze u sastav triacilglicerola zavisi od ishrane i anatomske lokacije
triacilglicerola. Kada su sve tri hidroksilne grupe u triacilglicerolu esterifikovane jednom istom mas
nom kiselinom, za takve triacilglicerole kažemo da su jednostavni. Mnogo su češći oni triacilgliceroli
u kojima se nalaze različite masne kiseline i takve triacilglicerole nazivamo mešovitim.
0
0 II
0 II H,C5 — 0 — C — R
II H,C—OH H,C;—o—c—R
0
H2C—0—C—R 0 0 II
I II II HC:—o—c—R'
HC—OH HC—0—C—R H( :—o—c—R'
|I
H,C—OH
I
H C—OH
t H,C—OH H,C—0—C—R"
0
II
Važna osobina masnih kiselina i triacilglicerola je odsustvo afiniteta za vodu. Dugi ugljovodonični
lanci masnih kiselina nemaju sposobnost građenja vodoničnih veza, pa stoga pokazuju mnogo veću
tendenciju za vezivanje jedan sa drugim ili sa drugim hidrofobnim jedinjenjima, nego sa vodom ili ne
kim polarnim supstancama. Ovaj hidrofobni karakter masnih kiselina i triacilglicerola je esencijelan za
stvaranje kompleksnih bioloških struktura i razdvajanje prostora u organizmu.
Triacilgliceroli su visoko efikasna jedinjenja za čuvanje energije i to iz tri razloga. Prvo, razgrad
njom triacilglicerola dobija se 2,5 puta više ATP nego što se dobija razgradnjom iste (težinske) količi
ne glikogena. Drugo, triacilgliceroli mogu da se čuvaju kao čisti lipidi bez asocijacije sa vodom (za
hvaljujući svojoj hidrofobnoj prirodi) za razliku od glikogena koji je hidrofilan i deponovan u tkivima
vezuje dvostruko veću količinu vode od svoje težine. To znači da će ekvivalentna količina energije
koja se čuva u obliku hidratizovanog glikogena imati oko četiri puta veću masu nego ako se čuva u
obliku čistih triacilglicerola. Treće, humani organizam ima deponovan glikogen u jetri i mišićima u ko
ličini koja je dovoljna da podmiri potrebe u energiji za oko 24 sata gladovanja, dok količina depono-
vanih triacilglicerola može da podmiri potrebe za energijom u toku nekoliko nedelja gladovanja.
6-4 Opšta biohemija
0 0
II II
0 C H 2 — 0 — C — R l, 0 C H2o — 0 — C — Rl,
II 1 II 1
Ra—C—0—C—H 0 Ra-- C — 0 — C — H 0
1 II 1 II
CH2—O—P —0~ CH 2 — 0 — P — 0 - R 3
i
1
0~ 0"
Fosfogliceridi su amfifilna jedinjenja jer imaju hidrofobni i hidrofilni deo. Hidrofobni deo čine ostaci
masnih kiselina, a hidrofilni deo fosfatna kiselina sa bazom koja je za nju vezana. Nalaze se u teles-
nim tečnostima, kao što su plazma i žuč, ali se u najvećoj koncentraciji sreću u membranama. U će-
lijskoj membrani imaju različite funkcije, a služe i kao strukturna komponenta membrane. Skoro polo
vina mase eritrocitne membrane otpada na fosfolipide. Fosfolipidi imaju ulogu i u aktivaciji nekih en
zima.
Najčešći fosfogliceridi u humanim tkivima su fosfatidilholin (Hi lecitin), fosfatidiletanolamin i fosfa-
tidilserin. Pri fiziološkom pH fosfatidilholin i fosfatidiletanolamin nemaju neto naelektrisanje i nalaze
se u obliku cviter jona, za razliku od fosfatidilserina koji ima negativno naelektrisanje, što znači da je
^kiseli fosfoglicerid.
o 0
« II
0 CHz-O-C—Rx O CH2-0-C
!l
' II I
R 2 - C - 0 - CCHH - 0 - PO- 0 - C H C H N ( C H ) ^ R c _ 0 - CC
HH - 0 - PO- 0 - C H C H N H ;
2 2 2 3 2 2 2
°~ o"
fosfatidilholin fosfatidiletanolamin
O
II
O CHo—O—C—R,
II I
R 22 — C — O — C H O
I II
CH2— O—P—O—CH-—CH—COO"
O" NH+
fosfatidilserin
Većina fosfolipida ima u svom sastavu dve različite masne kiseline. Fosfatidilholin sadrži većinom
palmitinsku ili stearinsku kiselinu na C1 u glicerolu, a oleinsku, linolnu ili linoleinsku kiselinu u položa
ju C2. Fosfatidilietanolamin ima iste zasićene masne kiseline kao i fosfatidilholin, ali u položaju C2
ima nezasićene masne kiseline dužeg lanca: 18:2, 20:4 ili 22:6.
Fosfoglicerid koji se nalazi u ćelijskim membranama je fosfatidilinozitol koji za fosfatnu kiselinu
ima vezan ciklični alkohol inozitol. Ovaj fosfoglicerid u membrani ima ulogu sidra, odnosno za njega
se vezuju različiti proteini koji se nalaze sa spoljašnje strane membrane. U ćelijskoj membrani se po-
S. Spasić: Lipidi 6-5
javljuje i fosfatidilglicerol, koji je, kao i fosfatidilinozitol, negativno naelektrisan pri fiziološkom pH,
odnosno spada u kisele fosfolipide.
O
CHj—o—c—Rt B
CH-—O—C—R,
Ra—C—O—C—H
R»—C—O—C—H 0
I
CHa—O—P—O—CHa
0~ CHOH
I
CHaOH
fosfatidilinozitol fosfatidilglicerol
Vrlo kiseli fosfoglicerid je kardiolipin, odnosno difosfatidilglicerol. I ovaj fosfoglicerid ima u osnov-
^ noj strukturi glicerol, kod koga su za hidroksilne grupe u položaju 1 i 3 vezane dve fosfatidilne kiseli
ne. Kardiolipin se takođe nalazi u ćelijskoj membrani.
o CH2—O— C—Rt
H
CH 2 — O— C—Rj
R2—C—O—CH
Ro—C—O—C—H 0 I
CH 2 — O— P— OCH 2 CHCH.j—O — P — O — C H 2
I I l_
O OH O
kardiolipin
H H
I I
O CH2—O—C=C—R
8 I
R'—C—O—C—H O
I II .
CH 2 — O— P — O — C H 2 — C H 2 — N H £
o-
etanolamin-plazmalogen
Više od 10% fosfolipida mozga i mišića spada u grupu plazmalogena, koji se sastoji od fosfatidil-
holina, ili češće fosfatidiletanolamina, kod koga je na C-1 atomu u glicerolu umesto masne kiseline
vezan aldehid masne kiseline. Osim toga, u plazmalogenima je na C-2 uvek vezana nezasićena ma
sna kiselina.
(4) Sfingolipidi
Sfingolipidi su kompleksni lipidi koji u svojoj osnovnoj strukturi imaju dugolančani aminoalkohol
sfingozin. -Sfingozin se ne nalazi slobodan u humanom organizmu. Kada se na amino grupu u sfin-
gozinu amidnom vezom veže masna kiselina nastaje ceramid. Ceramid je najjednostavniji sfingolipid
i predstavlja gradivni blok za ostale sfingolipide.
OH H OH
i l l
H2C — C — C — H
I I
H 3 N + CH OH H
II
HC I I
I O CH—C=C—(CH2),2—CH3
(CH 2 ) 1 2
R — C — N H —C—H H
CHj I
CH2OH
Sfingomijelini su grupa sfingolipida koji na krajnjoj hidroksilnoj grupi ceramida imaju ostatak fosfo-
rilholina ili fosforiletanolamina. Ime su dobili po tome što su tipičan fosfolipid koji se nalazi u mijelin-
skom omotaču nervnog tkiva. Masna kiselina koja se najčešće nalazi u sfingomijelinima je lignocerin-
ska ili nervonska. Sfingomijelini se hemijski razlikuju od fosfatidilholina i fosfatidiletanolamina, ali imaju
njima vrlo sličnu konformaciju i raspodelu naelektrisanja.
OH H H
I I I
O CH—C=C—(CH2)12—CH3
II I
R—C —NH—C—H O
I II
CH2—O—P—O — CH2—CH2—N(CH3)3
O"
sfingomijelin
(5) Sfingoglikolipidi
Sfingoglikolipidi (alternativni naziv je i glikosfingolipidi) su grupa sfingolipida kod kojih je krajnja
hidroksilna grupa glikozidno vezana za ostatak monosaharida. Glavne klase sfingoglikolipida su: ce
rebrozidi (ceramid-monosaharidi), sulfatidi (ceramid-monosaharid-sulfati), globozidi (neutralni cera-
mid-oligosaharidi) i gangliozidi (kiseli ceramid-oligosaharidi sa sijalinskom kiselinom).
Najprostiji sfingoglikolipidi su cerebrozidi, kod kojih je za ceramid vezan monosaharid. Monosa-
harid može biti galaktoza ili glukoza, pa nastaju jedinjenja galaktocerebrozid, odnosno glukocerebro-
zid. Jedinjenja iz grupe galaktocerebrozida i glukocerebrozida između sebe se razlikuju po vrsti mas
ne kiseline koja je vezana za sfingozin. Cerebrozidi se prvenstveno nalaze u mozgu (po tome su i
dobili ime) i perifernom nervnom tkivu i to u vrlo visokoj koncentraciji u mijelinskom omotaču.
OH H OH H
I I I I
O C H — C = C — (CH 2 ) 1 2 —CH, O C H — C = C — (CH 2 ) 1 2 —CH,
II I I II I I
R—C—NH —C—H H R — C — N H —C—H H
I CH 2 0
CH 2 0
CH,OH CHoOH
HO
glukocerebrozid galaktocerebrozid
OH H
I I
O CH—C=C—(CH2)12—CH3
R— C— N H — C — H H
I
CH 2 —O
CH2OH
sulfatid (galaktocerebrozid-3-sulfat)
9MI
r ^
r -te • ^
N-acetil-
D-galaktoza -D-galaktozamin D-galaktoza D-glukoza
CHLOH CH./)H CM,/)H CH.,OH
HO HO <X
N-acetilneuraminska kiselina
(sijalinska kiselina) stearinska sfingozin
kiselina
gangliozidi
3 jedinice izoprena su seskviterpeni, a oni koji su nastali polimerizacijom 4, 6 ili 8 izoprenski jedinica
nazivaju se di-, tri- i tetraterpeni. Terpeni koji imaju značaja za životinjske organizme su liposolubilni
vitamini retinol, tokoferol, kao i filohinon.
Slični terpenima su steroidni derivati izoprena, koji nastaju ciklizacijom triterpena skvalena, koji je
izgrađen od 6 izoprenskih jedinica.
Holesterol
Holesterol se sintetiše u svim humanim tkivima, ali su za sintezu najznačajniji jetra, tanko crevo,
kora nadbubrega i reproduktivni organi. On je najznačajniji sterol u humanom organizmu i obavlja
"brojne esencijalne funkcije. Na primer, ulazi u sastav svih membrana, a i prekursor je za sintezu veli
kog broja jedinjenja koja spadaju u grupu steroidnih hormona, zatim žučnih kiselina i vitamina D.
Zbog toga je važno da se ćelije većine tkiva kontinuirano snabdevaju holesterol, što se obezbeđuje
brojnim kompleksnim biosintetskim, transportnim i regulatornim mehanizmima.
Centralnu ulogu u održavanju ravnoteže holesterola u organizmu igra jetra. Holesterol koji se na
lazi u jetri poreklom je iz različitih izvora: iz hrane, de novo sintetisan u ekstrahepatičnim tkivima, kao
i de novo sintetisan u samoj jetri. Iz jetre se holesterol eliminiše nepromenjen kao sastojak žuči ili u
obliku lipoproteina plazme koji prenose holesterol do perifernih tkiva, ali i u obliku žučnih soli koje se
sekretiraju u lumen creva.
Holesterol je ciklično jedinjenje čija se struktura sastoji od: a) perhidrociklopentano-fenantrenskog
jezgra od četiri prstena; b) jedne hidroksilne grupe na C-3 u p-položaju; c) dvostruke veze između C-
5 i C-6 atoma; d) osmočlanog račvastog ugljovodoničnog lanca koji je vezan u položaju C-17 u D
prstenu i e) metil grupe (označene sa C-19) vezane u položaju 10 i druge metil grupe (označene sa
C-18) vezane u položaju 13. Na hidroksilnu grupu u položaju C-3 estarski može da bude vezana ma
sna kiselina.
i/iio ^ris
i /
2°CH_2?CH2_23CH2J4CH2_25CH
^CH,
HO
(7) Eikozanoidi
Eikozanoidi su raznovrsna grupa molekula sličnih hormonima koji se stvaraju u skoro svim tkivi
ma sisara. Pošto su aktivni u organima koji ih stvaraju eikozanoidi se nazivaju autokrinim regulatori
ma a ne hormonima. Većina eikozanoida nastaje iz arahidonske kiseline (hemijski naziv 5,8,11,14-
eikozatetraenoinska kiselina) i to pošto se arahidonska kiselina odvoji od fosfolipida iz membrane po
delovanjem fosfolipaze A2. U eikozanoide spadaju tri grupe jedinjenja: prostaglandini, tromboksani i
leukotrieni.
Prostaglandini su derivati arahidonske kiseline koji u osnovi imaju prostanoičnu kiselinu sa 20 C
atoma, u kojoj ugljenikovi atomi C8 - C12 obrazuju ciklopentanski prsten. Prostaglandini imaju tri
glavne klase: A, E i F, a za sve je karakteristično da imaju više funkcionalnih grupa. Tri klase prosta-
glandina se razlikuju prema funkcionalnim grupama koje se nalaze oko ciklopentanskog prstena:
S. Spasić: Lipidi 6-9
prostaglandini E-tipa imaju p-hidroksiketon, F-tipa su 1,3-dioli a oni u A- seriji su a,(3-nezasićeni ke-
toni.
(b)
O HO
prostanoična kiselina XX O
o o
R R
COOH B
Ri /S- i ?'/^-' i
E ( G+H|
1
>R 2 V"^R2 O-'
HO
HO
--Ri
HO HO
Slika 6-1. Struktura prostaglandina: (a) prostanoična kiselina, ishodno jedinjenje za prostaglandine;
(b) struktura prostaglandina A do I; (c) struktura prostaglandina E-i, E2 i F2a koji su prvi otkriveni.
COOH
OH HO OH
Leukotrieni su hidroksi derivati arahidonske kiseline. Ime su dobili po tome što su prvo otkriveni
u leukocitima, a sufiks -trieni je od prisustva tri "konjugovane" dvostruke veze (dvostruke veze koje
su razdvojene sa jednom -C-C- vezom). Leukotrieni se sintetišu i u mast ćelijama, plućima, slezini,
srcu i mozgu. Peptidoleukotrieni LTC4, LTD4 i LTE4 (sufuks-označava broj dvostrukih veza, kao i seri
ju kojoj leukotrieni pripadaju) su komponente sporo reagujućih supstanci anafilakse. Ove supstance
u vrlo malim koncentracijama izazivaju kontrakciju vaskularnih, respiratornih i intestinalnih glatkih mi
šića.
OH
COOH
COOH
CH — C — NH — CHj— COOH
l o
N H — C — CH 2 — CH 2 — CH— COOH CH —C—NH—CH 2 —COOH
NH 2 NH 2
CH—COOH
i
NH2
leukotrien E4 (LTE4)
(8) Lipoproteini
Hidrofobna priroda lipida otežava njihov transport kroz vodenu sredinu kakva je plazma. Neeste-
rifikovane, odnosno slobodne masne kiseline transportuju se vezane na albumin, a svi ostali lipidi
vezani na specifične transportne proteine (nazivaju se apolipoproteini ili apoproteini) u obliku čestica
koje se nazivaju lipoproteini. Lipoproteini su dinamičke čestice koje se nalaze u konstantnom stanju
sinteze, degradacije i izmene lipida i apolipoproteina između sebe.
Proučavanja strukture lipoproteina su pokazala da se unutar čestice nalaze neutralni lipidi, kakvi
su estri hoiesterola i triacilgliceroli, a u spoljašnjem omotaču (koji je debljine oko 20 A) nalaze se
proteini i naelektrisani lipidi, odnosno neesterifikovani holesterol i fosfolipidi. Amfoterni lipidi i proteini
u spoljašnjem omotaču su tako raspoređeni da su im hidrofobni krajevi okrenuti ka unutrašnjosti
čestice, a naelektrisane grupe su im na samoj površini čestice i reaguju jedna sa drugom ili sa
molekulima vode. Ovakvu strukturu imaju svi lipoproteini, bez obzira na njihovu veličinu, s tim što
manje čestice imaju u spoljašnjem omotaču veći procenat proteina i amfoternih lipida, dok veće
čestice imaju u spoljašnjem omotaču manje proteina, a u jezgru mnogo više neutralnih lipida.
U serumu zdravih osoba, u postapsorpcionom periodu postoji pet klasa lipoproteina, koji su klasi-
fikovani na osnovu relativne gustine.Svaki tip lipoproteina ima karakterističnu molekulsku masu. veli
činu, hemijski sastav, gustinu i fiziološku ulogu. Hilomikroni su najveće lipoproteinske čestice sa naj
većim sadržajem lipida, zbog čega imaju najmanju gustinu i najmanjim sdarzajem proteina. Njihova
uloga je da transportuju triacilglicerole i estre holesterola od intestinuma do tkiva, u prvom redu miši
ća i masnog tkiva. Lipoproteini vrlo male gustine (VLDL) sintetišu se u jetri i odgovorni su transport
endogenih lipida od jetre do tkiva. Prolaskom kroz organizam VLDL čestice se menjaju, smanjuje im
se sadržaj triacilglicerola, a menja im se sastav i sadržaj apoproteina i pretvaraju se u lipoproteine in-
termedijerne gustine (IDL). Ove čestice se i same vrlo brzo menjaju i iz njih nastaju lipoproteini male
gustine (LDL) koji se uklanjaju iz krvi vezivanjem za specifične receptore. LDL čestice imaju veću gu
stinu, veći sadržaj apoproteina i manji i drugačiji sastav lipida u odnosu na VLDL. Lipoproteini velike
gustine (HDL) sintetišu se u jetri i imaju ulogu da transportuju estre holesterola iz perifernih tkiva do
jetre, koja, ih eliminiše uglavnom prevođenjem u žučne soli. HDL čestice imaju najveću gustinu zbog
najvećeg sadržaja proteina i najmanjeg sadržaja lipida.
Svaki tip lipoproteina ima karakterističan sastav apolipoproteina, koji imaju različite funkcije: služe
kao strukturne komponente čestica, deluju kao aktivatori ili inhibitori enzima koji učestvuju u metabo
lizmu lipoproteina i omogućavaju vezivanje čestica za specifične ćelijske receptore. Međutim, funkci
ja većine apolipoproteina nije još uvek u potpunosti razjašnjena. Prema strukturi i funkciji apolipopro-
teini se dele u klase koje su obeležene slovima od A do H, a većina od ovih klasa ima nekoliko sub-
klasa.
Poglavlje 7.
Nukleotidi
Nukleotidi su kompleksni molekuli koji sadrže azot, a neophodni su za rast i razvoj ćelije. U obliku
nukleozid-trifosfata učestvuju u transformaciji energije, sastavni su deo koenzima, a služe i kao regu
latori za mnoge metaboličke puteve. Nukleinske kiseline, koje su polimeri mono-nukleotida, imaju
ulogu prenosioca genetskih informacija, gradivni su element ribozoma, prenosioci su aktiviranih ami-
nokiselina u procesu biosinteze proteina itd.
Svi nukleotidi su sagradjeni od tri dela: azotne baze, pentoze i jedne ili više fosfatnih grupa
Nukleozidi i nukleotidi
Nukleozidi i nukleotidi su sastavljeni od jedne baze i jedne pentoze, odnosno jedne baze, jedne
pentoze i ostatka fosfatne kiseline. Pentoza je isključivo D-riboza ili 2-dezoksi-D-riboza (na Ć-2 ato
mu redukovana pentoza). Tako mono-ribonukleotidi sadrže ribozu, a mono-dezoksiribonukieotidi sa
drže dezoksiribozu. Za odgovarajuće polimere koriste se se sinonimi poliribonukleotidi (ribonuklein-
ska kiselina, RNK), odnosno polidezoksiribonukleotidi (dezoksiribonukleinska kiselina, DNK). Važno
je napomenuti da se u jednom polinukleotidu nikada ne nalaze zajedno riboza i dezoksiriboza.
baza
0 \ /
II N
P-0 -CH2^0
!
0"
H0 (0)H
—nukleozid
0H 0H OH H
—mononukleotid—
(nukleozidmonofosfat) D-riboza 2-dezoksi-D-riboza
Baze koje ulaze u sastav nukleotida dele sa na pirimidinske i purinske. Supstitucijom H-atoma sa
hidroksilnom, amino ili metil grupom dobijaju se pirimidinske i purinske baze koje ulaze u sastav nu
kleotida i nukleinskih kiselina.
Najčešće pirimidinske baze su citozin, timin i uracil. Citozin (2-hidroksi-4-aminopirimidin) nalazi
se u svim nukleinskim kiselinama. Timin (2,4-dihidroksi-5-metilpirimidin) nalazi se uglavnom u DNK,
a u neznatnoj količini i u transfernoj-RNA. Uracil (2,4-dihidroksipiri-midin) nalazi se isključivo u RNK.
7-2 Opšta biohemija
Aj H
JU H
citozin timin uracil
Najvažnije purinske baze su adenin i guanin, koje se nalaze ne samo u mononukleotidima, nego i
u DNK i RNK. Dezaminacijom iz adenina nastaje hipoksantin (6-hidroksipurin), a iz guanina nastaje
ksantin (2,6-dihidroksipurin).
Između C-1' atoma u pentozi i NH-grupe u bazi moguća je C-N-glikozidna veza, čime nastaju nu-
kleozidi. Ova veza je tipična za nukleozide a ostvaruje se na N-1 atomu u pirimidinskom prstenu, od
nosno N-9 atomu u purinskom prstenu. Nukleozidi nastali iz pirimidinskih baza imaju u svom imenu
nastavak -idin (citidin, timidin, uridin), a oni koji su nastali iz purinskih baza imaju nastavak -ozin
(adenozin, guanozin, inozin, ksantozin).
+ H,0
OH OH OH OH OH OH
adenin + riboza -> adenozin + H2O adenozin-5-monofosfat (AMP)
Kada se u nukleozidu hidroksilna grupa u pentozi esterifikuje fosfatom iz nukleozida nastaje nu
kleotid. Esterifikacija se odvija na C-3' atomu ili na C-5' atomu u pentozi. Nukleotid koji sadrži adenin
i kome je esterifikovana hidroksilna grupa na C-3' atomu u ribozi imaće nazim adenozin-3'-
monofosfat, a ako je esterifikacija na hidroksilnoj grupi u dezoksiribozi njegov naziv će biti dezoksia-
denozin-3'-monofosfat.
kleozid-di- i trifosfati koji nastaju i iz inozina, guanozina, uridina i citidina (ITP, IDP, GTP, GDP, UTP,
UDP, CTP, CDP).
Između a- i p-, odnosno između p- i y-fosfata u nukleotid-difosfatu, odnosno -trifosfatu je anhidri-
dna veza koja spada u klasu energetski bogatih veza. Pošto je reaktivna sposobnost grupa u nukleo-
zid-di- i -trifosfatu jednaka, v-fosfatni ostaci iz nukleozid-trifosfata mogu da se prenesu na nukleozid-
difosfat prema sledećim jednačinama:
UDP + ATP = UTP + ADP
IDP + ATP = ITP + ADP
GDP + ATP = GTP + ADP
Fosfotransferaze koje su neophodne za katalizovanje ovih reakcija nalaze se u svim ćelijama.
NH, NH,
0 0 0
0"-P-0-P-0-P-0-CH2
I ! I
0" 0" 0"
0 0H
Y P a 0H 0H
adenozin-trifosfat (ATP) ciklični adenozin-monofosfat (cAMP)
Enzimi su proteini koji u ćelijama živih organizama obavljaju specifičnu funkciju katalize hemijskih
reakcija. Od običnih hemijskih katalizatora razlikuju se u sledećem:
1. Brzinu hemijskih reakcija povećavaju za 106 do 10 12 puta u odnosu na nekatalizovanu reakciju,
što je za nekoliko redova veličine veća brzina od odgovarajućih hemijski katalizovanih reakcija.
2. Enzimski katalizovane reakcije se odvijaju pod relativno blagim uslovima: temperatura ispod
100°C, atmosferski pritisak i pH oko neutralnog, za razliku od hemijski katalizovanih reakcija koje za-
htevaju povišene temperature i pritisak, kao i ekstremne pH vrednosti.
3. Enzimi imaju veći stepen specifičnosti u odnosu na supstrate i proizvode reakcije nego što je
to slučaj sa hemijskim katalizatorima.
4. Katalitička aktivnost mnogih enzima se menja kao odgovor na koncentracije supstanci koje ni
su njihovi supstrati. Mehanizmi ovih regulatornih procesa su alosterna kontrola, kovalentna modifika
cija i promena količine sintetizovanog enzima.
Apoenzim je proteinski deo enzimskog molekula, bez kofaktora ili prostetične grupe koju enzim
eventualno zahteva da bi bio funkcionalno aktivan, pa je apoenzim katalitički neaktivan. Treba na
pomenuti da svi enzimi ne zahtevaju kofaktore i prostetične grupe da bi bili katalitički aktivni. Kofak-
tori su mali organski ili neorganski molekuli koje enzim zahteva da bi bio aktivan. Prostetična grupa
je slična kofaktoru, ali je čvrsto vezana na apoenzim. Povezivanjem kofaktora ili prostetične grupe sa
apoenzimom nastaje hoioenzim, koji predstavlja aktivni enzim. Molekuli na koje enzimi deluju nazi
vaju se supstrati, a oni molekuli koji nastaju u enzimski katalizovanoj reakciji su proizvodi.
Enzimi pokazuju veliku specifičnost u pogledu supstrata na koje deluju, a tu specifičnost određuje
poseban region na površini enzima koji se naziva mesto za vezivanje supstrata, a to su posebno
uređene hemijske grupe koje mogu da se vezuju za specifičan supstrat. Na površini enzima postoji i
aktivni centar, koji takođe predstavlja posebno uređene hemijske grupe koje učestvuju u katalizova-
nju hemijske reakcije. Mesto za vezivanje supstrata može biti integrisano u aktivnom centru, ali i ne
mora. U nekim slučajevima je u primarnoj sekvenci aktivni centar u blizini mesta za vezivanje sups
trata, ali u tercijernoj strukturi se, zbog presavijanja polipeptidnog lanca udalje jedan od drugog. I
obrnuto, u primarnoj strukturi udaljeni aktivni centri i mesto za vezivanje supstrata mogu da se pribli
že jedan drugom posle presavijanja polipeptidnog lanca. Hemijske grupe koje učestvuju u vezivanju
supstrata i katalizi hemijske reakcije su bočni lanci aminokiselina iz apoenzima.
U nekim enzimima postoji još jedan region koji se zove alosterni centar, a predstavlja mesto na
kome se vezuju mali molekuli. Vezivanjem malih molekula za alosterni centar enzim menja konfor-
maciju, što dovodi do toga da aktivni centri postaju manje ili više aktivni, ili mesta za vezivanje sups
trata postaju manje ili više specifična za supstrat.
8-2 Opšta biohemija
A. KLASIFIKACIJA ENZIMA
Internacionalna unija za biohemiju ustanovila je sistem klasifikacije enzima po kome su svi enzimi
podeljeni u šest klasa. Svaka klasa je podeljena u podklase, a ove su dalje podeljene u pod-podklase
u kojima se nalaze pojedinačni enzimi, tako da je svaki enzim označen šifrom od četiri cifre (prva cif
ra je klasa, druga cifra je podklasa, treća cifra je pod-podklasa i četvrta cifra je individualni broj enzi
ma). Glavne klase enzima su sledeće:
1. Oksidoreduktaze su enzimi koji katalizuju različite vrste reakcija oksido-redukcije, a dele se
na sledeće podklase: dehidrogenaze, oksidaze, oksigenaze, reduktaze, peroksidaze, katalaze i hid-
roksilaze.
2. Transferaze su enzimi koji katalizuju prenošenje grupa sa jednog molekula na drugi; najvažni
je grupe koje se prenose su amino, acil, karboksilna, karbonilna, fosfatna i glikozil grupa. Uobičajena
imena za ove enzime imaju prefiks "trans". Primeri ovih enzima su: transaldolaze i transketolaze,
acil-, metil-, glukozi!- i fosforiltransferaze, kinaze i fosfomutaze.
3. Hidrolaze katalizuju reakcije u kojima je raskidanje veza praćeno adicijom vode. U ovu grupu
spadaju: esteraze, glikozidaze, fosfataze, peptidaze, tiolaze, fosfolipaze, amidaze, dezaminaze i ri-
bonukleaze.
4. Lijaze su enzimi koji katalizuju uklanjanje ili dodavanje grupa, kao što su voda, ugljendioksid ili
amonijak, pri čemu nastaju ili se uklanjaju dvostruke veze. U ovu klasu spadaju:dekarboksilaze, aldo-
laze, hidrataze, dehidrataze, sintaze i lijaze.
5. Izomeraze su heterogena grupa enzima koji katalizuju nekoliko tipova intramolekularnih preu
ređivanja, odnosno izomerizacija (inverzija na asimetričnom ugljenikovom atomu ili intramolekulami
transfer funkcionalnih grupa. Ovde spadaju: racemaze, epimeraze, izomeraze i mutaze (ne sve).
6. Ligaze katalizuju formiranje veza između dva molekula supstrata, a energija za ove reakcije se
dobija hidrolizom ATP. U ovu klasu spadaju sintetaze i karboksilaze.
Ts (tranziciono stanje)
nekatalizovana
reakcija
energija aktivacije
nekatalizovane
reakcije
enzimski katalizovana
reakcija
reaktanti •*
proizvodi
koordinate reakcije
Brzina biohemijskih reakcija se definiše kao promena u koncentraciji reaktanata ili proizvoda u
jedinici vremena. Inicijalna brzina (v) reakcije A —> B može da se iskaže izrazom
-d[A]^d[p]
dt dt
gde su:
[A] = koncentracija supstrata
[P ] = koncentracija proizvoda
t = vreme
Određivanje brzine reakcije ne daje uvid u stehiometriju reaktanata i proizvoda ili u mehanizam
reakcije. Odnos između eksperimentalno određene brzine i koncentracije reaktanata daje jednačina
brzine koja glasi:
-d[A}_
dt
*w
Iz ove jednačine sledi da će dobijena inicijalna brzina zavisiti od početne koncentracije A do n-tog
stepena, koja je pomnožena sa konstantom brzine k.
Drugi izraz koji se koristi u opisivanju reakcija je red reakcije, a određivanje reda reakcije omogu
ćava da se izvedu izvesni zaključci u odnosu na mehanizam reakcije. Reakcija sledi kinetiku prvog
reda ako njena brzina zavisi od koncentracije jednog reaktanta, a sledi kinetiku drugog reda ako joj
brzina zavisi od koncentracije dva reaktanta.
Kinetika zasićenja
Aktivnost enzima se obično izražava u jedinicama mikromola (umol) supstrata koji se, pod defini-
sanim uslovima, razloži u jedinici vremena. Jedna standardna jedinica enzimske aktivnosti je količina
aktivnosti koja katalizuje transformisanje 1 umol/min. Katal (kat) je količina aktivnosti koja katalizuje
konverziju 1 mola supstrata u sekundi (1 mol/s). Katalitička konstanta enzima je broj jedinica (ili kata-
la) po jednom molu enzima, a omogućava direktno poređenje relativne katalitičke sposobnosti više
enzima. Na primer, katalitičke konstante za katalazu i alfa-amilazu su 5 x 106 i 1,9 x 104, pokazuju da
je katalaza oko 2500 puta aktivnija od amilaze.
Inicijalna brzina enzimski katalizovanih reakcija zavisi od koncentracije supstrata, što znači da
ako se povećava koncetracija supstrata povecavaće se i inicijalna brzina reakcije sve dok se enzim
8-4 Opšta biohemija
potpuno ne zasiti supstratom. Kriva na slici 8-2 predstavlja krivu zasićenja supstratom i ukazuje na
činjenicu da enzim ima specifična mesta za vezivanje sa supstratom.
max
o
'N 2
.o o.
n$ oo
JE c
.55, 2
koncentracija supstrata
Slika 8-2. Kriva koja prikazuje zavisnost brzine enzimski
katalizovane reakcije od koncentracije supstrata.
Takođe je očigledno da između enzima i supstrata mora da postoji određena interakcija, pre ne
go što se supstrat konvertuje u proizvod, a ta interakcija predstavlja inicijalno stvaranje kompleksa
enzim-supstrat:
E + S — ES
Konstanta stvaranja kompleksa ES definisana je kao k1t a konstanta reverzibilne reakcije kao /c2
U kompleksu ES odigrava se stvarna hemijska reakcija u kojoj se stvaraju ili kidaju hemijske veze i
dolazi do konverzije supstrata u proizvod (P) sa konstantom brzine k3. Prethodna jednačina se pre
vodi u oblik
k, k,
E + S — L ES — - E + P
k2
Ova jednačina predstavlja opšti iskaz za mehanizam delovanja enzima. Ravnoteža između E i S
može da se izrazi konstantom afiniteta Ka samo ako je brzina hemijske faze reakcije k3 mala u pore-
đenju sa k2\ tada je Ka=k1/k2.
Inicijalna brzina enzimski katalizovanih reakcija zavisi od količine prisutnog supstrata i koncentra
cije enzima. Inicijalna brzina se povećava i kada se povećava koncentracija enzima, pod uslovom da
je prisutno dovoljno supstrata da zasiti sav enzim. Iz svega može da se zaključi da brzina enzimskih
reakcija zavisi i od koncentracije supstrata i od koncentracije enzima.
- ako je sav enzim u kompleksu ES, onda je brzina kojom se proizvod stvara maksimalna i može
da se izrazi jednačinom:
V m a x =/c 3 [ES]
Pošto se pošlo od pretpostavke da je brzina stvaranja kompleksa ES u ravnoteži sa brzinom nje
gove razgradnje (steady-state), možemo da napišemo da je:
stvaranja = *i [S][E] \ \/ r a z g r a d n j e = *2 [ES] + k3 [ES] = [ES](/C 2 + k3 )
odnosno
•*1[SlE] = [ES](*2+*,)
Deljenjem obe strane jednačine sa k-,, dobijamo:
k
l<2+ 3
[S][E]=[ES]
*1
Ako odnos konstanti brzina (k2 + k3)/k1 označimo sa Km, a to je Mlchaelis-ova konstanta, i izvrši
mo zamenu u prethodnoj jednačini, dobićemo
[s][E]=[ES]Km
Kako [E] predstavlja količinu slobodnog enzima, njegovu koncentraciju možemo da izrazimo kao
razliku ukupnog enzima Et i enzima u kompleksu ES, odnosno:
[E]=([E,]-[ES])
Zamenom ovog izraza u prethodnoj jednačini dobijamo:
[S]([E,HES])=[ESK,
Deljem obe strane sa [S] dobijamo:
([E,HES])=£|^
a daljim deljenjem sa [ES] dobijamo izraze:
[£,] Km [E,] Km K +[S]
IEŠ]- -M ]
"' liš]-M HsT
Pošto [ES] ne može lako da se meri potrebno je da se nađe odgovarajući izraz za [Et] /[ES]. Ka
da je sav enzim zasićen supstratom, sva količina enzima će biti u kompleksu ES, odnosno nema ga
u slobodnom obliku pa je [EJ = [ES], a brzina će biti maksimalna; dakle Vmax - k3 [EJ. Kada [EJ nije
jednako [ES], onda je v = fo[ES]. Iz ova dva izraza može da se dobije izraz [EJ /[ES], koji giasi:
[Ef j _ Knax ^ ^3 _ ^max
JEŠ] v/k3 v
Zamenom ovog izraza u prethodnoj jednačini dobijamo Michaelis-Menten jednačinu:
Vmax K• +[S] \/m3x[s]
v [S\ Km+[S\
U ovoj jednačini brzine reakcije nalaze se dve konstante Vmax i Km koje su uvek iste za jedan en
zim pod određenim uslovima sredine u kojoj reakcija teče (pH i temperatura).
Ako je inicijalna brzina v0 jednaka polovini Vmax, onda će konstanta Km biti jednaka koncentraciji
supstrata S.
y
i«/ = ™» I S I
8-6 Opšta biohemija
K,
r i 2V
max
[s] *m = [S]
[s]= V.
Drugim recima Km je jednaka onoj koncentraciji supstrata pri kojoj je brzina enzimske reakcije je
dnaka polovini maksimalne brzine. Iz krive zasićenja supstratom vrednost Km može da dobije grafič
kom analizom, kao što je pokazano na slici 8-3.
U praksi je određivanje Km iz krive zasićenja supstratom prilično netačno, jer se kriva asimptotski
približava Vmax. Ako se Michaelis-Menten jednačina napiše u recipročnom obliku i njeni članovi razd
voje tako da joj format bude konzistentan sa jednačinom prave linije (y = bx + a), dobićemo izraz:
1 Kr
+•
V„ \S\ v„
To znači da ako se grafički prikaže recipročna vrednost koncentracije supstrata (1/[S] na x-osi)
prema recipročnoj vrednosti inicijalne brzine (1/v0 na y-osi) dobija se prava čiji je nagib Km/Vmax, a
odsečak MVmax. Vrednost Km dobija se iz odsečka na x-osi koji je -MKm, što se vidi i sa slike 8-4.
Linearni oblik Michaelis-Menten jednačine označava se kao dvostruki..recipročni grafik ili
Lineweaver-Burk grafik
Michaelis-ova konstanta Km ima i fiziološki i analitički značaj, jer su sva određivanja aktivnosti en
zima koja se izvode u biohemijskim laboratorijama zasnovana na poznavanju Km za svaki supstrat.
Uopšte uzev, vrednosti Km koje su određene blizu su koncentracija supstrata koje su nađene u ćeliji.
U nekim slučajevima je moguće da dođe do promene u mestu za vezivanje supstrata ili da su jače iz-
? r
raženi drugi oblici enzima (izoenzimi) koji imaju drugačiju Km , što može da dovede do promene u fi
ziologiji, odnosno do bolesti.
Većina enzima može da deluje na jedan ili više supstrata ili da stvara jedan ili više proizvoda. U
svakom slučaju, neophodno je da se odredi Km za svaki supstrat i koenzim kada se postavlja metoda
za određivanje aktivnosti enzima. U odnosu na mehanizam ove enzimske reakcije mogu da se pode-
le u dve glavne kategorije: ping-pong ili sekvencijelne.
Ping-pong mehanizam može da se prikaže u obliku dijagrama na sledeći način:
Py B
i i
E + A -> EA -> E -> E'B -» P2+E
Iz dijagrama se vidi da supstrat A reaguje sa enzimom E i stvara proizvod P1t koji se oslobađa
pre nego što se drugi supstrat B veže za modifikovani enzim E'. Posle konverzije supstrata B u proiz
vod P2 enzim se regeneriše u prvobitni oblik. Primer za ovaj mehanizam su reakcije koju katalizuju
transaminaze, a u kojima se amino grupa sa jedna aminokiseline prenosi na ketokiselinu, pri čemu iz
aminokiseline nastaje nova ketokiselina a iz ketokiseline nova aminokiselina. Reakcija teče tako da
se amino grupa sa aminokiseline! (supstrat A) prenosi na enzim, a oslobađa se nova ketokiselina!
(prozvod Pi), a zatim se ketokiselina2 (supstrat B) vezuje za enzim, prima amino grupu i oslobađa se
nova aminokiselina2 (proizvod P2).
U sekvencijelnom mehanizmu reakcija je bimolekulama i dva supstrata A i 8 moraju da se ve
žu pre nego što reakcija počne. Vezivanje supstrata za enzim može da bude slučajnim mehaniz
mom, odnosno nije važno koji se supstrat prvo vezuje, ili može biti uređenim mehanizmom, koji pod-
razumeva da prvo mora da se veže supstrat A, pa zatim supstrat B. Oslobađanje proizvoda može, ali
i ne mora da bude nekim određenim redom. Primer za ovaj mehanizam su reakcije koje katalizuju
dehidrogenaze koje kao drugi supstrat zahtevaju koenzim.
Inhibicija enzima
Enzimi katalizuju reakcije ne samo u željenom pravcu, nego i reverzibilne, a tok reakcije zavisi od
koncentracije supstrata u odnosu na koncentraciju proizvoda, kao i od konstante ravnoteže te reakci
je:
S^-P
Problem može da se pojavi ako nastali proizvod ima sličan afinitet za enzim kao i supstrat, pa
može da se vezuje za aktivna mesta na enzimu, odnosno da se takmiči sa supstratom za ova mesta.
U takvim slučajevima proizvod inhibira reakciju i inhibicija se povećava kako se koncentracija proiz
voda povećava. Ako u metaboličkom putu postoje enzimi koji će dalje preuzeti proizvod kao svoj
supstrat i konvertovati ga u novo jedinjenje, inhibicija prve reakcije se neće pojaviti. U takvim slučaje
vima brzina reverzibilne reakcije zavisi od brzine kojom se uklanja proizvod. S druge strane, proizvo
di koji nastaju u drugim enzimskim reakcijama mogu da se ponašaju kao inhibitori enzimske aktivno
sti. Na inhibiciji enzimske aktivnosti zasnovano je delovanje mnogih lekova.
U osnovi postoje tri osnovna tipa inhibitora enzimske aktivnosti: kompetitivni, nekompetitivni i
akompetitivni inhibitori.
Kompetitivni inhibitori se vezuju za enzim za mesta koja su predviđena za vezivanje supstrata,
tako da se takmiče sa supstratom za enzim. Vezivanjem inhibitora za enzim reakcija se inhibira jer
enzim nije u stanju da inhibitor prevede u proizvod. Reakcija inhibicije postaje reverzibilna u prisustvu
viška supstrata jer u tom slučaju supstrat istiskuje inhibitor iz kompleksa sa enzimom. Kompetitivni
inhibitori mogu ali ne moraju po strukturi da budu slični supstratom.
Pošto se supstrat i inhibitor takmiče za isto mesto na enzimu, Km za supstrat se povećava u pri
sustvu inhibitora, što se na dvostruko recipročnom grafiku vidi kao pomeranje odsečka na x osi (-
MKm) i povećanje nagiba prave (KJV^. Ovo može da se utvrdi tako što se odredi brzina enzimske
reakcije sa nekoliko koncetracija supstrata, a zatim se ceo eksperiment ponovi sa konstantnom koli-
8-8 Opšta biohemija
činom inhibitora; grafičkim prikazivanjem rezultata dobiće se dve prave linije, koje se seku u istoj tač-
ki na y-osi (MVmax), što znači da Vmax nije promenjeno u prisustvu kompetitivnog inhibitora (Slika 8-5).
sa kompetitivnim
inhibitorom
-1/K- 1/[S1
Slika 8-5. Dvostruko recipročna kriva zavisnosti brzine enzimski katali-
zovane reakcije od koncentracije supstrata za kompetitivni inhibitor.
Akompetitivni inhibitori vezuju se za već stvoreni kompleks ES, čime ometaju dalji tok reakcije.
Krajnji rezultat je smanjenje i Km i Vmax, što se vidi na dvostruko recipročnom grafiku (Slika 8-6).
sa akompetitivnim sa nekompetitivnim
inhibitorom inhibitorom
1/App. V,
Slika 8-6. Dvostruko recipročna kriva zavisnosti Slika 8-7. Dvostruko recipročna kriva zavis
brzine enzimski katalizovane reakcije od koncen nosti brzine enzimski katalizovane reakcije
tracije supstrata za akompetitivni inhibitor. od koncentracije supstrata za nekompetitivni
inhibitor.
Nekompetitivni inhibitor se ne vezuje za enzim na istom mestu gde se vezuje supstrat, tako da
reakcija inhibicije nije reverzna u prisustvu viška supstrata. Kod ovog tipa inhibicije stvaraju se kom
pleksi enzim-inhibitor (El) ili enzim-inhibitor-supstrat (EIS) čija je karakteristika da su katalitički inakti-
vni. U prisustvu nekompetitivnog inhibitora enzimska reakcija teče tako da izgleda kao da je smanje
na količina enzima ili da ga uopšte nema, što na kraju rezultuje u smanjenju Vmax, bez promene Km.
Grafičkim prikazivanjem (u obliku dvostrukog recipročnog grafika) podataka koji se dobijaju bez i u
prisustvu nekompetitivnog inhibitora dobijaju se dve prave koje imaju isti odsečak na x-osi (ista vred-
nost Km) ali različite odsečke na y-osi (različite Vmax) (Slika 8-7).
ima tačnu molekulsku dimenziju, odgovarajuću topologiju i optimalno slaganje jonskih i hidrofobnih
grupa sa specifičnim supstratom. Tolerancija aktivnog centra za vezivanje supstrata je uglavnom vrlo
mala, a ima i enzima koji pokazuju apsolutnu specifičnost u odnosu na supstrat, na primer, D-
aminooksidaza se vezuje samo za D-aminokiseline, a ne i za L-aminokiseline. Međutim, neki enzimi
pokazuju široku specifičnost i mogu da se vežu za veći broj različitih jedinjenja koja su analogna
supstratu. Primer za ovu vrstu enzima su heksokinaze koje katalizuju fosforilaciju glukoze, manoze,
fruktoze, glukzamina i 2-deoksiglukoze, ali ne istom brzinom.
Specifičnost enzima prema supstratu objašnjena je pomoću različitih modela. Prvi takav model je
model "ključa-i-brave" po kome se supstrat slaže sa mestom za vezivanje kao ključ sa bravom ili ruka
sa rukavicom (Slika 8-8) Ovaj model daje prilično rigidno objašnjenje za supstratnu specifičnost jer^
ne uzima u obzir efekat alostemih liganda.
Mnogo fleksibilniji model mesta za vezivanje je model indukovanog slaganja. U ovom modelu ak
tivno mesto za vezivanje supstrata ima sve potrebne elemente za pozicioniranje supstrata, ali nije
potpuno formirano. Interakcijom supstrata sa enzimom indukuje se konformaciona pramena u enzi
mu koja dovodi do repozicioniranja aminokiselina i formiranja aktivnog mesta. indukovana konforma
ciona pramena enzima može da dovede naknadno do promene u supstratu, odnosno do "napreza
nja" ili "istezanja" supstrata, što uslovljava još bolje slaganje između supstrata i mesta za vezivanje
na enzimu (Slika 8-9). Ovaj poslednji model najbolje objašnjava eksperimentalna zapažanja koja se
odnose na delovanje enzima.
Slika 8-9. Model indukovanog slaganja: a) vezivanje enzima za supstrat indukuje for
miranje aktivnog mesta; b) "(stezanje" supstrata indukovano vezivanjem za enzim.
uslovljava promenu afiniteta za supstrat ili neki drugi ligand. Pozitivni alosterni efektori povećavaju
afinitet enzima za supstrat ili drugi ligand, a negativni alosterni efektori smanjuju afinitet za supstrat.
Alosterno mesto za koje se vezuje pozitivni alosterni efektor označava se kao mesto aktivacije, a
alosterno mesto za koje se vezuje negativni alosterni efektor označava se kao mesto inhibicije.
Alosterni enzimi se dele u dve klase na osnovu toga kako alosterni efektori deluju na Km i Vmax. U
K klasi efektori menjaju Km, ali ne deluju na Vmax, dok efektori u V klasi menjaju V m a x , ali ne deluju na
Km. Dvostruka recipročna kriva koja se dobija za Km za enzime K klase slična je onoj koja se dobija
za kompetitivne inhibitore, dok je dvostruka recipročna kriva koja se dobija za enzime V klase slična
onoj koja se dobija za nekompetitivne inhibitore. Mehanizam kojim alosterni inhibitori deluju na enzi
me V i K klase je potpuno drugačiji od mehanizma kojim deluju obični kompetitivni i nekompetitivni
inhibitori. Na primer, alosterni inhibitor deluje na enzime K klase tako što se vezuje za alosterno mes
to, što za posledicu ima da se na mestu za koje se vezuje supstrat smanjuje afinitet za sam supstrat,
dok se kompetitivni inhibitor takmiči sa supstratom za isto mesto na enzimu (mesto za vezivanje
supstrata). Pozitivni i negativni alosterni modifikatori deluju na enzime V klase tako što povećavaju,
odnosno smanjuju brzinu razlaganja kompleksa enzim-supstrat u proizvod.
Kao posledica interakcije između mesta za koja se vezuju supstrat, aktivator i inhibitor dobija se
karakteristična sigmoidalna ili S-kriva. Negativni alosterni efektor pomera krivu prema višim koncen
tracijama supstrata i pojačava sigmoidnost krive, a 1/2 V max postiže se sa višim koncentracijama
supstrata. U prisustvu pozitivnog efektora, 1/2Vmax postiže se sa nižim koncentracijama supstrata od
onih koje su potrebne bez prisustva efektora (Slika 8-10).
inicijalna
brzina
v
max bez
S ^ — " ~ efektora
+ pozitivni
efektor y/ s^ A ,*'' + negativni
' ,'•' efektor
^m«
[S]
Većina alosternih enzima su oligomeri koji se sastoje iz više subjedinica. Identične subjedinice se
nazivaju protomeri, a svaki protomer može da se sastoji iz jednog ili više polipeptidnih lanaca. Vezi
vanje liganda za jedan protomer može da utiče na vezivanje liganda za druge protomere u oligomer-
nom enzimu. Takav efekat se naziva homotropna interakcija, a može da se ispolji tako da supstrat
utiče ne vezivanje supstrata, inhibitor na vezivanje inhibitora ili aktivator na vezivanje aktivatora za
druge protomere. Homotropne interakcije su skoro uvek pozitivne. Heterotropne interakcije se defini-
šu kao efekat jednog liganda na vezivanje različitog liganda, a mogu de se ispolje kao efekat aloster-
nog inhibitora na vezivanje supstrata ili efekat alosternog inhibitora na vezivanje alosternog aktivato
ra. Heterotropne interakcije mogu da budu pozitivne ili negativne a pojavljuju se i u monomernim alo-
sternim enzimima.
Kooperativnost
Koncept kooperativnosti objašnjava interakciju između mesta za vezivanje liganda u oligomernim
enzimima. Kooperativnost se definiše kao uticaj koji ima vezivanje liganda za jedan protomer na ve
zivanje liganda za drugi protomer u oligomeru. Zbog sličnosti efekata često se brkaju pojmovi aloste-
rizam i kooperativnost. Alosterni efekat je konformaciona promena u protomeru koja se pojavljuje kao
S. Spasić: Enzimi 8-11
m ©
terni inhibitori pomeraju ravnotežu ka T-stanju.
T stanje R stanje
(nizak afinitet za supstrat) (visok afinitet za supstrat)
Slika 8-10. Shematski prikaz T (napetog) i R (relaksiranog) stanja enzima
U odsustvu supstrata skoro svi molekuli enzima su u T obliku, a dodatkom supstrata pomera se
konformaciona ravnoteža u pravcu R oblika, jer se supstrat vezuje samo za enzim koji je u R stanju.
Osnovni koncept koncertiranog modela enzimske aktivnosti je da konformaciona pramena u jednom
protomeru izaziva odgovarajuću pramenu u svim protomerima, a takođe nema ni hibridnih stanja. To
znači da kada se supstrat veže za jedno aktivno mestu na enzimu, sva druga aktivna mesta na en
zimu moraju biti takodje u R obliku (Slika 8-11). Drugim recima, prelazak T oblika u R oblik, i obrnuto,
je koncertiran, odnosno skladan. Pošto se broj enzimskih molekula u R obliku progresivno povećava
sa dodatkom supstrata, kažemo da je vezivanje supstrata kooperativno. Kada su sva aktivna mesta
na enzimu zasićena, svi molekuii enzima su u R obliku.
TT RR RR
operativnost. Pozitivni efektor indukuje promenu konformacije u protomeru, tako da se povećava afi
nitet za supstrat, a negativni efektor indukuje takvu promenu konformacije da se smanjuje afinitet za
supstrat. Oba efekta se kooperativno prenose na susedne protomere.
7 1
RT RR
Slika 8-12. Sekvencijelni model kooperativnog vezivanja supstrata za alosterni enzim. Praz
na aktivna mesta u RT-obliku imaju viši afinitet za supstrat nego prazna mesta u TT-obliku
Enzimi katalizuju veliki broj hemijskih reakcija i njihove funkcionalne grupe mogu da učestvuju u
nekim reakcijama vrlo lako. Međutim, ima reakcija (kao što su reakcije oksido-redukcije ili reakcije u
kojima se prenose grupe) koje su manje pogodne za katalizu i koje enzimi katalizuju samo ako deluju
zajedno sa kofaktorima. Kofaktori su mali molekuli koji su neophodni za katalitičku aktivnost enzima.
Kofaktori mogu biti metalni joni ili organski molekuli poznati kao koenzimi. Neki kofaktori se prolazno
vezuju sa enzimom, a drugi, poznati kao prostetične grupe, stalno su vezani za enzim.
Koenzimi se hemijski menjaju u enzimskoj reakciji u kojoj učestvuju, a zatim, da bi se završio ka-
talitički ciklus, moraju da se vrate u početno stanje. Kod prostetičnih grupa ovo može da se dešava u
odvojenoj fazi enzimske reakcije, a kod koenzima koji se prolazno vezuju za enzim, reakciju regene-
racije može da katalizuje drugi enzim.
Katalitički aktivan kompleks enzim-kofaktor naziva se holoenzim, a enzimski neaktivan protein
koji nastaje odvajanjem kofaktora od holoenzima, naziva se apoenzim.
Najvažniji koenzimi
vitamin koenzim ili aktivni oblik reakcija u kojoj učestvuju
tiamin tiamin-pirofosfat (TPP) prenošenje aldehidne grupe
flavin-mononukleotid (FMN)
riboflavin prenošenje elektrona
flavin-adenin-dinukleotid (FAD)
nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD)
nikotinska kiselina prenošenje elektrona
nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADP)
pantotenska kiselina koenzim A (CoA) prenošenje acil grupe
piridoksin piridoksal-fosfat prenošenje amino grupe
biotin biocitin prenošenje CO2
folna kiselina tetrahidrofolna kiselina prenošenje grupe sa 1C-atomom
vitamin B12 koenzim B12 prenošenje alkil grupe
lipoinska kiselina lipoil-lizin prenošenje acil grupe
9-2 Opšta biohemija
r
NH
H H I
I
o
2
I C—S !
c—s
X — C H — N .••* I OH /•* j I
N C—CH,, N.
II
2
\ II o=p—o-
H C—C C=C—CH —CH
H C—C ^ ~ \,CH
o „ ™ M^ ' I O
2 2
3
^,N % 3
CH, C = C — CH,—CH,
tiamin-pirofosfat (TPP)
Riboflavin (vitamin B2) i flavin-nukleotidi
Flavin-nukleotidi funkcionišu kao prostetične grupe oksido-redukcionih enzima koji su poznati i
kao flavoenzimi ili flavoproteini. Ovi enzimi katalizuju oksidativnu degradaciju piruvata, masnih kiseli
na i aminokiselina, a učestvuju takođe i u procesu transporta elektrona. U većini flavoenzima flavin-
nukleotid je čvrsto, ali nekovalentno vezan za protein; metaloflavoproteini sadrže jedan ili više metala
kao dodatni kofaktor.
H H H O
H H H I l i l
ribitol H£ X - C - C - C - C H - O - P - O H
H2C-C-C-C-CH2OH \ I i i i
OHOHOH OH
dimetilizo-
aloksazin
II
O o
riboflavin flavin-mononukleotid (FMN)
NH,
H H H
HC
,CH
2—0—P—O—P—O—QH2
OHOHOH OH OH O,
N.
x>=o H»\JJ
C —S/J
C H
I I I
H3C ^NH HO OH
flavin-adenindinukleotid (FAD)
pravi nukleotid jer nema u svojoj strukturi pentozu, a na 5'-OH grupi u ribitolu ima vezan fosfat. FAD
ima adenozin vezan preko pirofosfata za heterociklični prsten.
Flavin-nukleotidi učestvuju u reakcijama oksido-redukcije, a 2e" se vezuju u izoaloksazinskom pr
stenu; nastali redukovani nukleotidi se obelezavaju kao FMNH2 i FADH2. Redukcija flavin-nukleotida
ima za posledicu karakterističnu promenu apsorpcionog spektra, što je iskorišćeno za određivanje
aktivnosti flavoenzima.
Acetil-koenzim A (acetil-KoA) se obrazuje u toku enzimske oksidacije piruvata ili masnih kiselina,
a može da se generiše i iz slobodnog acetata u prisustvu enzima acetil-KoA-sintetaze:
ATP + koenzim A + acetat < > AMP + acetil-KoA-pirofosfat
Acetil-koenzim A može da reaguje sa akceptorima acil grupe, kakav je na primer holin i tom prili
kom nastaje acetilholin; acetil-koenzim A može da reaguje i sa oksalacetatom pri čemu nastaje li-
munska kiselina.
9-4 Opsta biohemija
Piridoksin, piridoksamin i piridoksal su prirodni oblici vitamina B6, a sva tri jedinjenja se u organi
zmu lako prevode u piridoksal- fosfat, koji je potreban za sintezu, katabolizam i interkonverziju ami-
nokiselina. Piridoksin koenzimi učestvuju u velikom broju različitih enzimskih reakcija, od kojih su ve
ćina reakcije transaminacije u kojima se a-amino grupa sa jedne aminokiseline prenosi na a-
oksokiselinu; pri tome iz aminokiseline nastaje oksokiselina, a iz oksokiseline nova aminokiselina.
Hemizam reakcije je sledeći: aldehidna grupa iz koenzima reaguje sa amino grupom iz aminokiseline
pri čemu nastaje Šifova baza između piridoksal fosfata vezanog za enzim i aminokiseline. Amino
grupa se odvaja od aminokiseline, što kao posledicu ima nastajanje oksokiseline; pirodoksal fosfat
potom reaguje sa drugom oksokiselinom, koja sada ima ulogu akceptora amino grupe u reakciji koja
je reverzna u odnosu na prethodnu. Na kraju se dobija nova aminokiselina i ostaje kompleks piridok
sal fosfat-enzim.
CHO CH,OH CH 2 NH, CHO
Biotin i biocitin
Biotin je prostetična grupa za brojne reakcije karboksilacije, od kojih većinu katalizuju piruvat kar-
boksilaza i acetil-koenzim A karboksilaza. Molekul biotina može da se vezuje amidnom vezom sa e-
amino grupom u specifičnom ostatku lizina iz enzima i nastaje biotinillizin ili biocitin. Ovako vezan bi
otin služi kao intermedijerni prenosilac C 0 2 u reakciji karboksilacije.
COOH
I
CH,
CH,
I
CH,
i H
CH—C- -NH
/
c=o
CH 2 —C- -NH
H
biotin
OH
,N S
N' *C—CH,—N C—N—CH—CH,—CH,—COOH
H,N-C^ / C v ^CH m>J H |
COOH
N NT
pteroinska kiselina
pteroilglutaminska kiselina (folna kiselina)
F
OH
i O
C^
,^ —C—CH,—N—^\ />-C—N—CH—CH,—CH,—COOH
ir\ i
H
H
HSN-C^i/CXH-CH COOH
N Ne
H
tetrahidrofolna kiselina
Liponska kiselina
Postoje dva oblika ovog retkog vitamina sa 8C-atoma: liponska kiselina koja je po strukturi ciklični
disulfid, i njen redukovani oblik dihidroliponska kiselina, koja ima dve sulfhidrilne grupe. Ova dva ob
lika se brzo konvertuju jedan u drugi u reakciji oksido-redukcije.
Liponska kiselina funkcioniše kao jedan od koenzima u reakciji oksidativne dekarboksilacije piru-
vata i drugih a-ketokiselina; ovo su kompleksne reakcije u kojima učestvuje nekoliko koenzima. Li
ponska kiselina je kovalentno vezana u obliku amida za e-amino grupu u ostatku lizina u enzimu.
H,
A?
H,C
!
CH2 liponska
i kiselina
CH,
CH,
CH,
1
c=o
1
NH
i
CH,
N
CH,
°v /°" / ^Tr^vcH3
1
CH,
1
lizin
O O \J^LcH,
OH
CH,
1
COOH HOCHj O H
Ćelijske membrane su od životne važnosti za ćeliju. Plazma membrana zatvara ćeliju, definiše
njene granice i održava esencijelnu razliku u sastavu citozola i spoljašnjeg okruženja. Unutar ćelije
membrane endoplazmatskog retikuluma, Goldži aparata, mitohondrija i drugih organela održavaju
karakterističnu razliku izmedju sastava svake organele i citozola. Zahvaljujući svojoj dinamičnosti
membrana održava oblik ćelije, ali i kontroliše sastav prostora koji okružuje. Selektivni transportni sis
temi koji se nalaze u membrani omogućavaju kretanje specifičnih molekula sa jedne strane membra
ne na drugu. Specifični proteini u membrani omogućavaju stvaranje i prenošenje električnih signala
(u nervnim i mišićnim ćelijama, na primer). Pored toga, membrana ima ulogu u prepoznavanju ćelija.
a na njoj se nalaze i specifični receptori za hormone i metaboličke regulatore i informacija koju oni
nose prenosi se kroz membranu do odgovarajućih metaboličkih puteva.
Karakteristika svih bioloških membrana je da imaju sličnu strukturnu organizaciju, u svojoj struk
turi imaju iste klase hemijskih supstanci, čije se fizičko-hemijske interakcije ne razlikuju, kao i veliki
broj drugih zajedničkih osobina. Pod elektronskim mikroskopom ćelijske membrane se vide kao tros-
lojne strukture sa dve tamne spoljašnje i jednom svetlom unutrašnjom trakom. Često je unutrašnji
svetliji sloj deblji od spoljašnjih tamnih slojeva, što je posledica hemijske asimetrije, odnosno neka
jedinjenja se nalaze samo u jednom ili u više slojeva. Prosečna debljina membrana je 7 - 10 nm, s
tim što su intracelularne membrane obično tanje od plazma membrane.
Lipidi u membrani
Glavna lipidna jedinjenja koja ulaze u sastav membrane su fosfogliceridi, sfingolipidi i holesterol,
a u malim količinama se nalaze i glikolipidi i kardiolipin. Različite membrane sadrže različite količine
pojedinih klasa lipida. Kod plazma membrana postoji najveća varijacija u sastavu lipida, jer količina
holesterola u njoj zavisi od ishrane. Plazma membrana ima najveću koncentraciju neutralnih lipida i
sfingolipida, mijelinske membrane nervnog tkiva sadrže dosta sfingolipida i to uglavnom glikosfingoli-
pida, a intracelularne membrane prvenstveno sadrže fosfogliceride i vrlo malo sfingolipida i holeste
rola. Lipidni sastav membrana mitohondrija, jedra i zrnastog endoplazmatskog retikuluma je sličan,
10-2 Opšta biohemija
Na formiranje micela utiče veličina i oblik molekula lipida. Molekuli sa jednim hidrofobnim repom
formiraju sferoidne ili elipsoidne micele, jer su njihove polarne glave veće od repova. U micelama
obično ima nekoliko stotina molekula, ali i taj broj zavisi od vrste i veličine molekula lipida koji ulaze u
njihov sastav. Uopšte uzev, micele su stabilne strukture zahvaljujući interakciji polarnih grupa sa vo
dom i silama atrakcije između ugljovodoničnih lanaca u unutrašnjosti micela.
Molekuli sa dva ugljovodnična hidrofobna lanca, kakvi su fosfolipidi i sfingolipidi formiraju micele
samo do određene koncentracije. Razlog za to je veličina njihovih molekula koja onemogućava stva
ranje sferoidnih struktura. Zbog toga se veliki molekuli lipida u vodenim rastvorima organizuju u dvos
lojne strukture u kojima su polarne glave okrenute spolja, a hidrofobni repovi ka unutrašnjosti. Karak
teristika ovih dvoslojnih struktura je da pokazuju tendenciju da stvaraju zatvorene sferne strukture,
koje potpuno razdvajaju spoljašnji od unutrašnjeg prostora. Ovakve čestice se nazivaju lipozomi.
Lipidne dvoslojne strukture su izuzetno stabilne, a održavaju se nekovalentnim interakcijama iz
među ugljovodoničnih lanaca u acil ostacima i jonskim interakcijama između naelektrisanih grupa i
vode. Hidrofobne interakcije u unutrašnjosti dvoslojne strukture uslovljavaju da je najmanja moguća
površina vode u kontaktu sa hidrofobnim lancima, a takođe i potpuno eliminišu molekule vode iz unu
trašnjosti strukture. Pošto individualna interakcija lipid-lipid ima vrlo malu energiju aktivacije, lipidi u
dvoslojnoj strukturi mogu da se kreću, reorganizuju i reaguju sa molekulima koji okružuju ovu struktu-
S. Spasić: Biološke membrane 10-3
ru. Individualni molekuli lipida u jednom sloju mogu da izmenjuju mesta, ali teško mogu da prelaze iz
jednog sloja u drugi. Kretanje molekula lipida u monosloju dovodi do brze lateralne difuzije po površi
ni membrane. Raspodela lipida kroz membranu je asimetrična, odnosno sastav lipida u dva monos-
loja je različit. Obično su sfingolipidi raspoređeni u spoljašnjem sloju, a fosfatidiletanolamin je u unut
rašnjem sloju, dok je holesterol ravnomerno raspoređen i u unutrašnjem i u spoljašnjem sloju.
Proteini u membrani
lako osnovnu strukturu membrane čini lipidni dvosloj, većinu funkcija membrane obavljaju protei
ni. Mnogi proteini koji ulaze u sastav membrane su enzimi lokalizovani na površini ili u samoj mem
brani, neki proteini imaju ulogu u prenošenju molekula kroz membranu, specifični proteini imaju
strukturnu ulogu u održavanju integriteta ćelije, a drugi imaju ulogu u prepoznavanju. Sadržaj protei
na u membrani je u korelaciji sa tim koliko je funkcija membrane kompleksna i raznovrsna, ali u pro
šeku 50% (25% - 75%) mase membrane čine proteini. Pošto su molekuli lipida mali u poredjenju sa
molekulima proteina, u membrani je uvek više molekula lipida nego proteina i obično na 50 molekula
lipida dolazi jedan molekui proteina.
Proteini koji ulaze u sastav membrane su kompleksni, raznovrsni, a osobine im dobrim delom za
vise i od njihove interakcije sa lipidima u membrani. Kao i lipidi, i j>roteini koji ulaze u sastav mem
brane imaju u svom sastavu oligosaharidne ostatke.
Membranski proteini se klasifikuju u dve grupe prema prirodi veze sa lipidnim slojem, što se pro-
cenjuje na osnovu toga da li mogu ili ne da se izdvoje iz izolovane membrane. Te dve grupe proteina
su periferni (ili spoljašnji) i integralni (ili unutrašnji) proteini.
Periferni proteini su locirani na površini membrane a vezani su za druge proteine membrane
kovalentnim vezama. Mnogi od njih mogu da se odvoje od membrane relativno jednostavnim postu
pcima ekstrakcije, kao što je izlaganje rastvorima vrlo velike ili vrlo male jonske jačine ili rastvorima
ekstremnog pH, pri čemu dolazi do raskidanja veze protein-protein i oslobadjanja proteina. Periferni
proteini najčešće imaju specifičnu enzimsku aktivnost.
Integralni proteini mogu da se ekstrahuju iz membrane samo uz pomoć deterdženata ili organ
skih rastvarača. U svom sastavu obično sadrže čvrsto vezan lipid, čije uklanjanje dovodi do denatu-
racije proteina i gubitka biološke funkcije. Uklanjanje integralnih proteina iz membrane dovodi do de
gradacije membrane, za razliku od perifernih proteina čije uklanjanje izaziva vrlo male ili čak uopšte
ne izaziva promene u integritetu membrane.
Integralni proteini imaju u svojoj strukturi sekvencu hidrofobnih aminokiselina, koje formiraju hid-
rofobni region u tercijernoj strukturi. Ovaj hidrofobni region proteina reaguje sa hidrofobnim ugljovo-
doničnim lancime u lipidima, što stabilizuje strukturu kompleksa protein-lipid. Specijalna grupa inte
gralnih membranskih proteina su proteolipidi, koji su po svojoj prirodi hidrofobni lipoproteini rastvorlji-
vi u organskim rastvaračima. Proteolipidi su prisutni u mnogim membranama, posebno u mijelinskoj
membrani gde na njih otpada oko polovina količine ukupnih proteina u membrani. Druga grupa inte
gralnih proteina su glikoproteini; ćelijske plazma membrane sadrže veliki broj različitih glikoproteina,
koji imaju specifičan sadržaj oligosaharida.
Proteini se obično vezuju za membranu preko segmenata od oko 20 aminokiselina, a način na
koji su proteini vezani zavisi od njihove funkcije. Tipovi interakcija proteina sa lipidima u membrani su
različiti i prikazani su na Slici 10-2: (a) hidrofilna subjedinica može da bude vezana direktno za inte
gralni membranski polipeptid preko interakcije protein-protein (primer za to je sukcinat-
dehidrogenaza na unutrašnjoj membrani mitohondrija); (b) periferni protein može da bude vezan
elektrostatičkim silama za polarne glave u fosfolipidima (npr. citohrom c); (c) rastvorljivi proteini mogu
da se vežu za lipidni sloj preko masne kiseline koja je kovalentno vezana za protein i uronjena u lipi
dni sloj, pa predstavlja tzv. Iipid.no "sidro"; (d)transmembranski proteini mogu imati samo jedan se
gment koji prolazi kroz lipidno sloj, ostatak proteina se nalazi sa obe strane membrane (npr. glikofo-
rin u eritrocitima); (e) integralni proteini mogu imati i više segmenata kojima su povezani sa membra
nom, i u tom slučaju čitav molekui proteina je hidrofobniji nego obično; (f) proteini mogu da se pove
zu sa dvoslojem preko kratkog hidrofiinog segmenta na N- ili C-kraju (npr. aminopeptidaza u epitelu
creva).
10-4 Opšta biohemija
(•> (b)
(c) (d)
*B$
(e) (0
unutar ćelije
Slika 10-3. Shematski prikaz oligosaharidnih ostata
ka vezanih za specifične proteine u membrani.
mogao da objasni interakciju proteina u membrani sa lipidnim dvoslojem. Ranih 70-tih godina S. J.
Singer i G. L. Nicholson su predložili mozaični model strukture membrane u kome se proteini nalaze
ili kao integralni deo lipidnog sloja ili kao labavo vezani za površinu lipidnog sloja. Kasnijim prouča
vanjima je dokazano da ovako organizovani lipidi i proteini mogu da se kreću kroz dvoslojnu struktu
ru, pa je ovaj model strukture membrane nazvan fluidno-mozaični model (Slika 10-4).
Karakteristike lipidnog dvosloja objašnjavaju mnoge osobine ćelijske membrane, koje uključuju
fluidnost, fleksibilnost koja dozvoljava promenu oblika ćelije, kao i sposobnost da propušta ili ne pro
pušta neke molekule.
Fluidnost membrane
Interakcija između različitih lipida i između lipida i proteina je vrlo kompleksna i dinamična, što
omogućava fluidnost u lipidnom delu membrane: kreću se i lipidi i proteini. Stepen fluidnosti mem
brane zavisi od temperature i sastava membrane. Na niskim temperaturama lipidi su u gel-kristalnom
stanju, a kako temperatura raste lipidi prelaze u tečno-kristalno stanje i povećava im se mobilnost.
Specifičan sastav pojedinih bioloških membrana uslovljava i razliku u fluidnosti između tih mem
brana. Fleksibilnost nepolarnih repova lipida u membrani je veća kad su bočni lanci masnih kiselina
kraći i nezasićeni. Osim toga, holesterol smanjuje fluidnost membrane, zbog planarnog steroidnog
jezgra sa hidroksilnom grupom na jednom kraju i fleksibilnim alifatičnim lancem na drugom kraju.
Holesterol je važan moderator fluidnosti membrane i odgovoran je za održavanje lipidnog dvosloja u
odgovarajućem stanju.
Fluidnost nije ista na različitim nivoima unutar membrane. Unutrašnjost membrane je mnogo flui-
dnija zbog krajeva ugljovodoničnih lanaca koji su tu locirani, a površine membrane su manje pokret
ljive, delom i zbog holesterola koji je lociran bliže površini.
Individulani proteini i lipidi kreću se duž površine membrane i kroz nju, a različite interakcije ogra
ničavaju ovo kretanje. Tu spadaju elektrostatičke interakcije polarnih grupa, hidrofobne interakcije
holesterola sa pojedinim fosfolipidima ili glikolipidima i interakcije lipid-protein. Zbog toga se u mem
brani stvaraju lipidni regioni koji se kreću zajedno, kao ostrva.
Lipidi se kreću kroz membranu na dva načina: lateralnom i transverzalnom (flip-flop) difuzijom
(Slika 10-5). Lateralna difuzija je kretanje lipida sa jednog dela monosloja u drugi brzinom koja iznosi
10-6 Opšta biohemija
1 -2 um/s, što znači da jedan molekul lipida vrlo brzo pređe sa jednog kraja ćelije na drugi. Transver
zalna ili flip-flop difuzija je kretanje molekula lipida iz jednog monosloja u drugi. Ovaj tip kretanja se
retko dešava i brzina mu se meri danima ili nedeljama, iz prostog razloga što za prelazak lipida iz je
dnog sloja u drugi polarne grupe sa površine membrane moraju da prođu kroz hidrofobnu unutraš
njost membrane.
transverzalna difuzija (flip-flop)
lateralna difuzija
Pored lipida kroz membranu se kreću i proteini, ali je njihova pokretljivost ograničena time što su
vezani za lipidni sloj. Iz tog razloga su integralni proteini manje pokretljivi od perifernih, a neki proteini
ne mogu uopšte da se kreću. Međutim, mobilnost proteina unutar membrane je esencijelna za funk
ciju mnogih membranskih proteina.
Treba naglasiti da se pokretljivost membrane menja kod promene ishrane ili fiziološkog stanja,
kao i kod davanja nekih lekova. Kada je ishrana u pitanju, poznato je da dolazi do promene sastava
membrane u pogledu sadržaja zasićenih masnih kiselina i holesterola, koji se povećavaju ako se sa
držaj ovih supstanci poveća u hrani. S druge strane, efekat nekih lekova, kao što su anestetici koji
indukuju spavanje i mišićnu relaksaciju zasnovan je na promeni fluidnosti membrana specifičnih ćeli
ja.
crtosol, ćelija A
citosol, ćelija B
Nuklearne pore
Ćelijsko jedro je ograničeno omotačem koji ima karakterističnu ultrastrukturu. Sastoji se od dve
membrane debljine 2 nm i sadrži velike pore prečnika 9 nm. Ove pore su važne u regulaciji ulaska i
izlaska makromolekula, jona i metabolita u nukleoplazmu. Nuklearne pore imaju kompleksnu struktu
ru koja omogućava izlazak ribozoma i RNK u citoplazmu i ulazak u jedro proteina sintetisanih na ri-
bozomima citoplazme.
3. Posredovan transport koji se odvija uz pomoć proteina nosača koji se nazivaju transporteri ili
translokatori. Ova vrsta transporta može da se odvija na sledeće načine:
a. Pasivno posredovan transport ili olakšana difuzija koji se odvija u pravcu koncentracionog gra
dijenta, gde spadaju pasivan transport glukoze, anjonski transportni sistem u eritrocitima i pasivan
transportni sistemi u mitohondrijama.
b. Aktivan transport koji se odvija nasuprot koncentracionom gradijentu i uz utrošak energije, gde
spadaju:
- primaran aktivan transport: transport Na+ i K+ i transport Ca 2+ ,
- sekundaran aktivan transport: transport glukoze i Na+, transport aminokiselina i transport
hlorida i Na u tankom crevu,
- translokacija grupa: transport aminokiselina.
Kretanje supstanci difuzijom uvek ide u pravcu koncentracionog gradijenta, odnosno na onu stra
nu membrane na kojoj je koncentracija niža. Što je veća razlika u koncentracijama na obe strane
membrane, to je veća inicijalna brzina difuzija. Kretanje supstance sa jedne strane membrane na
drugu odvija se sve dok se ne uspostavi koncentraciona ravnoteža, a posie toga se molekuli kreću u
oba pravca, što ne remeti uspostavljenu ravnotežu. Ako je S! supstanca na strani 1 a S2 supstanca
na strani 2 membrane (S m je supstanca u membrani), onda posle završene difuzije uspostavljena ra
vnoteža može da se izrazi jednačinom [Si] <—> [S 2 ] (Slika 10-7).
S. Spasić: Biološke membrane 10-9
F. KANALI I PORE
Integralni proteini mogu da imaju takvu tercijemu strukturu da pojedini domeni proteinskih subje-
dinica obrazuju otvore u membrani, koji su ustvari centralni vodeni prostori. Kanali su visoko selektk
vni za specifične neorganske katjone i anjone, dok pore nisu selektivne i dozvoljavaju prolazak i ne-
organskim i organskim molekulima. Ova razlika između kanala i pora je posledica razlike između vo
denih prostora koji su nastali u proteinskoj strukturi, kao i od ostataka aminokiselina koje se nalaze
na površini kanala.
Kretanje molekula i jona kroz kanale i pore ide u oba pravca, ali uvek u pravcu koncentracionog
gradijenta, a kontroliše se otvaranjem i zatvaranjem kanala. Otvaranje i zatvaranje kanala se postiže
konformacionom promenom u proteinu koji obrazuje kanal. Impuls za promenu konformacije koja
omogućava otvaranje ili zatvaranje kanala može biti:
1. Promena transmembranskog potencijala, kao što je to slučaj kod kanala za natrijum. Ulazak
jona natrijuma u ćeliju praćen je depolarizacijom plazma membrane u nervim i mišićnim ćelijama.
2. Vezivanje specifičnog molekula za protein, što se dešava kod kanala nikotinska kiselina-
acetilhoiin (nazivaju se još acetilholinski receptori). Vezivanje acetilholina za protein otvara kanal i
dozvoljava selektivni prolazak katjona kroz membranu, a promena transmembranskog potencijala
izaziva seriju događaja koji se završavaju mišićnom kontrakcijom.
G. POSREDOVAN TRANSPORT
Plazma membrane, kao i membrane subcelularnih organela sadrže transportne sisteme koji igra
ju važnu ulogu u preuzimanju hranljivih sastojaka, održavanju koncentracije jona i kontroli metaboli
zma. Ovi transportni sistemi se razlikuju među sobom po specifičnosti u odnosu na supstance koje
prenose, kao i po načinu na koji se taj proces obavlja. Osim toga, aktivnost transportnih sistema mo
že da se menja, što omogućava ćelijama i tkivima da kontrolišu kretanje supstanci kroz membranu.
Ovi sistemi se kiasifikuju na osnovu mehanizma translokacije, odnosno prenošenja molekula i ener
getike tog procesa, a među njima se razlikuju transporteri i translokatori grupa.
Transporteri su membranski proteini koji za sebe vezuju molekule ili jone i fizički ih prenose kroz
membranu. Neki transporteri prenose molekule u pravcu koncentracionog gradijenta (označavaju se
kao pasivni), a drugi prenose molekule nasuprot koncentracionom gradijentu (aktivni transporteri) uz
utrošak energije. Transporteri se ponašaju kao enzimi, odnosno pokazuju specifičnost prema sup-
stancama koje prenose, imaju određenu reakcionu kinetiku i mogu da se inhibiraju kom petiti vn im i
nekompetitivnim inhibitorima. i kanali i transporteri prenose molekule nepromenjene kroz membranu.
Translokatori grupa su transportni mehanizmi kojima se ne obavlja samo prenošenje molekula
kroz membranu, nego se oni u tom procesu menjaju i tako hemijski promenjeni prelaze na drugu
stranu membrane.
sno vraćanje transportera u početne uslove da bi mogao da primi novi molekul za prenošenje (Slika
10-8).
strana 1 strana 2
2. transport
3. odvajanje
4. obnavljanje
A (spolja) A (unutra)
sim
B (spolja) B (unutra) P°^
A (spolja) A (unutra)
antiport
B (spolja) B (unutra)
Drugi stepen u transportu kroz membranu, odnosno translokacija nije u potpunosti razjašnjen.
Jedno od mogućih objašnjenja je da protein transporter obrazuje kanal u membrani, čime se povezu
ju dve strane membrane. Ovaj kanal ima sistem za otvaranje i zatvaranje kojim se kontroliše koja
supstanca može da prođe. Osim toga, transporter ima receptorsko mesto za koje se vezuje molekul
koji se prenosi. Posle vezivanja molekula za transporter dolazi do konformacione promene transpor
tera, što uslovljava da molekul koji se prenosi pređe kratko rastojanje kroz membranu do suprotne
strane.
Treći stepen, odnosno oslobađanje supstance od transportera ide vrlo brzo. Kod transportera koji
prenose supstance u pravcu koncentracionog gradijenta odvajanje supstance od transportera deša
va se zbog toga što je koncentracija sa druge strane membrane niža. Kada se molekuli prenose na
suprot koncentracionog gradijenta, odvajanje molekula od transportera dešava se zbog toga što je
smanjen afinitet transportera za vezivanje sa molekulom sa one strane membrane gde je koncentra
cija viša. Promena u konformaciji transportera smanjuje afinitet za vezivanje.
Poslednji stepen je obnavljanje, odnosno vraćanje transportera u početni oblik da bi mogao da
veže i prenese novi molekul. Obnavljanje transportera nije ništa drugo nego promena konformacije u
početni oblik.
Sve ovo što je rečeno o prenošenju molekula odnosi se na prenošenje jednog molekula u jednom
pravcu i ovaj mehanizam se označava kao uniport mehanizam. Transporteri imaju mogućnost da is
tovremeno prenose dva molekula i to u istom pravcu (simport mehanizam) ili u suprotnim pravcima
(antiport mehanizam) (Slika 10-9).
glukoza
strana 1 strana 2
obnavljanje
HCO HCO,
Slika 10-10. Pasivno posredovan transport Slika 10-11. Pasivan anjonski antiport mehanizam
glukoze u ćeliju. za transport Cl' i HC0 3 " kroz membranu eritrocita.
strana 1 strana 2
:«5z5-
transport S
1~-Jj s2
uz ATP
V\DP+Pi
i' ^^^^J^^^^JMT^V-
-ATP
^ S
transport 2
uz Na
+
N a + " - " ^ ^ ^ ^ C T ^ ^ ^ ^ ; ~~--Na
+
.- aspartat" gradijent Na Na ^J k-~" N a +
se održava uz
pomoć ATP X
ATP
glutamat glutamat
| *- ADP+Pi
£&$.[!£. ^^**i^^S-*.''
Slika 10-12. Anjonski antiport transportni Slika 10-13. Učešće metaboličke energije (ATP) u
sistemi u mitohondrijama. aktivnim posredovanim transportnim sistemima.
S. Spasić: Biološke membrane 10-13
Enzim Na+-K+-ATP-aza je tipičan integralni membranski protein, sagrađen od dve veće a-jedinice
i dve manje p-jedinice, na koje su vezana dva polisaharidna lanca (Slika 10-14). ATP se vezuje za a-
subjedinice sa unutrašnje strane membrane, a na tim istim subjedinicama sa spoljašnje strane mem-
10-14 Opšta biohemija
brane nalaze se mesta za vezivanje kardiotoničnih glikozida koji su inhibitori ovog enzima, a time i
transporta natrijuma i kalijuma.
Transport Na* i K+ se odvija antiport mehanizmom uz naizmeničnu fosforilaciju i defosforilaciju a-
subjedinica, stoje praćeno konformacionim promenama enzima. Hipotetički mehanizam transporta je
prikazan shematski na slici 10-15, a može da se opiše na sledeći način:
- u inicijalnom stanju enzim je defosforilisan i ima veliki afinitet za vezivanje Na+; prisustvo Na+ sa
unutrašnje strane membrane izaziva otvaranje pumpe i enzim preuzima 3Na + iz citoplazme,
- vezivanje Na+ omogućava fosforilaciju enzima, odnosno vezivanje ATP za a-subjedinice; za
fosforilaciju enzima neophodno je i prisustvo Mg 2 + sa unutrašnje strane membrane,
- posle hidrolize ATP-a ostaje enzim u obliku visokoenergetskog fosfatnog intermedijera koji ima
promenjenu konformaciju u odnosu na nefosforilisani enzim,
- konformaciona promena enzima uslovljava da se smanjuje afinitet enzima za Na+ i 3Na+ bivaju
izbačeni iz ćelije,
- izbacivanje Na+ iz ćelije i prisustvo K+ u spoljašnjoj sredini dovodi do otvaranja pumpe sa spo-
Ijašnje strane i preuzimanje 2K+, jer fosforilisani enzim ima veliki afinitet za vezivanje K+,
- vezivanjem K+ otpočinje defosforilacija, odnosno odvajanje fosfata od enzima,
- defosforilisani enzim opet menja konformaciju i u tako promenjenom konformacionom obliku
ima manji afinitet za K+, što izaziva izbacivanje 2K+ iz pumpe u unutrašnjost ćelije,
- pumpa se vraća u inicijalno defosforilisano stanje, odnosno otvara se sa unutrašnje strane, ve
zuje Na+ i ceo proces ponovo otpočinje.
Rezime ovog procesa bi bio da se u toku hidrolize jednog molekula-ATP iz ćelije izbace 3Na+, a u
ćeliju ubaci 2K+ i u toku tog procesa enzim naizmenično prelazi iz jednog konformacionog stanja u
drugo, koja se karakterišu različitim afinitetima za Na+ i K+.
ATP ADP
V Mg2+ . Mg2* )
l1. 3Na* ^- »- E j - ATP • 3Na + -^ «~ EX~P- 3SNa*
1. vezivanje ATP 2. formiranje "visoko-energetskog"
3Na+(£n> fosfatnog intermedijera
2K + (»/»>••
unutra
Slika 10-15. Hipotetički model transporta Na* i K* uz pomoć Na*-K*-ATP-aze (Na + -K + -pumpa).
Transport Ca 2+
Ca.2+ često ima ulogu drugog glasnika na sličan način kao i cAMP. Prolazno povećanje koncen-
tracije Ca.2+ u citoplazmi predstavlja impuls za otpočinjanje brojnih procesa, u koje spadaju kontrakci
ja mišića, oslobađanje neurotransmitera i razgradnja glikogena. Pored toga, Ca 2+ je važan aktivator
oksidativnog metabolizma.
Korišćenje fosfata kao osnovnog izvora energije zahteva da se u ćeliji održava niska koncentraci
ja Ca2+ (zbog slabe rastvorljivosti soli kalcijuma). Stoga je koncentracija Ca 2+ u citoplazmi oko 104 pu-
S. Spasić: Biološke membrane 10-15
ta niža nego u ekstracelularnoj tečnosti, a ovaj veliki koncentracioni gradijent se održava aktivnim
.2+
transportom Ca kroz plazma membranu, kao i kroz membranu endoplazmatskog retikuluma i mito-
hondrija. Plazma membrana i membrana endoplazmatskog retikuluma sadrže Ca.2+ -ATP-azu (Ca 2+
pumpu) koja aktivno prenosi Ca 2+ kroz membranu uz utrošak ATP. Prema tome, Ca2+-pumpa spada
u primarne aktivne transportne sisteme.
ATP ADP
+•E~P'2Ca *
2 + 2
E'2Ca —^ -^
" i. vezivanje ATP
s
2Ca
unutra
\. * / . ' , \ •
) y < X
4. obnavljanje 2. transport Ca2*
;w-. ~. JU ^ \xo*o •
spolja
3. hidroliza V
- * - 2Ca a *
fosfata
E •*- •E-P
Pi H20
Regulacija procesa transporta Ca 2+ kroz membranu obavlja se uz pomoć proteina koji vezuje
Ca , a naziva se kalmodulin. Kada se koncentracija Ca 2+ u citoplazmi poveća stvara se kompleks
2+
2+ 2+ 2+
Ca kalmodulin koji aktivira Ca -ATP-azu i otpočinje proces prenošenja Ca kroz membranu u spo-
ljašnju sredinu Kada se koncentracija Ca 2+ vrati na normalu, razgrađuje se kompleks Ca2+-
kalmodulin, inhibira se Ga2+-ATP-aza i prestaje izlazak Ca 2+ iz ćelije (Slika 10-16).
- kako se uz svaki Na+ transportuje jedan molekul druge supstance, to znači da se za transport
tog molekula potroši 1/3 molekula ATP, ali ne kao direktan izvor energije, nego kao energija za rege
neraciju, odnosno održavanje elektrohemijskog gradijenta Na+ (Slika 10-17).
Glukoza
Na +
(Na+~K+)-ATPaza
ćelije četkaste prevlake
Simport transport glukoze i Na+, odnosno simultano kretanje glukoze i Na + u istom pravcu, nalazi
se u membranama bubrežnih tubula i intestinalnog epitela, mada i druge ćelije mogu imati slične
transportne sisteme. Mehanizam ovog transporta je prikazan na slici i vidi se da se transport glukoze
obavlja zahvaljujući transportu jona Na+ koji se kreću u pravcu koncentracionog gradijenta. Za funk-
cionisanje Na+-K+-pumpe troši se ATP, i kao što smo već videli ranije za transport 3Na+ potreban je
jedan molekul ATP. Kako se uz svaki Na+ transportuje jedan molekul glukoze, to znači da se za tran
sport jednog molekula glukoze potroši 1/3 molekula ATP, ali ne kao direktan izvor energije, nego kao
energija za regeneraciju, odnosno održavanje elektrohemijskog gradijenta Na+.
Supstance, kao što je na primer uabain, koje inhibiraju sintezu ATP, smanjiće koncentraciju ATP
u ćeliji, što će kao posledicu imati smanjen transport glukoze jer nema energije za regeneraciju elek
trohemijskog gradijenta Na+.
Aminokiseline se u luminalnim epitelnim ćelijama intestinuma transportuju na sličan način kao i
glukoza, odnosno transportnim sistemom koji zavisi od Na+. Za transport aminokiselina su identifiko-
vana najmanje četiri različita transportera: 1. za neutralne aminokiseline, kao što su alanin, valin i le-
ucin; 2. za bazne aminokiseline, uključujući lizin i arginin; 3. za kisele aminokiseline aspartat i gluta-
mat i 4. za aminokiseline prolin i glicin.
Simport mehanizmom se transportuju hloridi u tankom crevu zajedno sa natrijumom, a antiport
mehanizmom se transportuje Ca 2+ iz ćelije
4. Translokacija grupa
Glavni problem kod aktivnih transportnih sistema je oslobađanje transportovanog molekula od
nosača i uglavnom se obavlja tako što se zbog konformacione promene proteina menja afinitet za li-
gand. Dugi mehanizam za oslobađanje supstrata od proteina je hemijska promena molekula posle
translokacije a pre oslobađanja od transportera, pri čemu nastaje no
SH
vo jedinjenje sa smanjenim afinitetom za transporter. Primer za ovu
CH,
vrstu transporta je v-glutamil-ciklus za transport aminokiselina kroz
CH N plazma membranu nekih tkiva. U ovaj proces je uključen enzim v-
<£%' CH,
glutamil-transpeptidaza koji je vezan za membranu i katalizuje reakci
COOH ju transpeptidacije. U ovoj reakciji se stvara djpeptid koji učestvuje u u
H —C—NH 2
transportu aminokiselina.
Aminokiselina koja se transportuje je supstrat na koji se prenosi v-
glutation glutamil-ostatak iz glutationa, a novonastali dipeptid nije deo hemij-
S. Spasić: Biološke membrane 10-17
skog gradijenta za aminokisleine. v-Glutamil-derivat se tada hidrolizuje enzimom koji nije vezan za
membranu i u toj reakciji nastaje slobodna aminokiselina i 5-oksiprolin. Ovaj proces prenošenja nazi
va se translokacija grupa (Slika 10-18).
Sve aminokiseline, izuzev prolina, mogu da se prenose na ovaj način, a energija za proces se
dobija hidrolizom peptidne veze u glutationu. Da bi sistem mogao da funkcioniše glutation mora da
se resintetiše, što zahteva utrošak od tri molekula ATP. To znači da se za prenošenje jednog mole
kula aminokiseline ovim procesom potroše 3 molekula ATP, što je u poređenju sa simport transpor
tom aminokiselina uz Na + (za jedan molekul aminokiselina troši se 1/3 ATP) izuzetno energetski skup
proces.
5. Jonofori
Jonofori su relativno mali molekuli (do nekoliko hiljada daltona) koji mogu da podstiču kretanje
monovalentnih i divalentnih neorganskih jona kroz biološke i sintetske lipidne membrane. Po svojoj
prirodi jonofori su antibiotici bakterijskog porekla. Dele se u dve grupe:
1. mobilni prenosioci koji se kreću napred-nazad kroz membranu prenoseći jon sa jedne stane
membrane na drugu i
2. jonofori koji formiraju transverzalne kanale kroz membranu kroz koje difunduju joni.
Kod oba tipa jonofora joni se transportuju pasivno posredovanim mehanizmom (Slika 10-19).
A. METABOLIČKI PUTEVI
Metabolizam bi mogao da se definiše kao zbir svih enzimskih reakcija koje se odvijaju u živoj će
liji. Međutim, ovakva definicija bi bila preterano pojednostavljena i ne bi ukazivala na neke od najhit
nijih karakteristika metabolizma. Zato je bolje reći da je to visoko koordinisana, svrsishodna aktivnost
u kojoj učestvuje veliki broj međusobno povezanih enzimskih sistema i u toku koje dolazi do razmene
i materije i energije između ćelije i njene okoline. Metabolizam ima četiri osnovne funkcije: (1) dobi-
janje hemijske energije iz hranljivih materija ili apsorbovane sunčeve svetlosti, (2) konvertovanje eg-
zogenih hranljivih materija u gradivne blokove, prekursore makromoiekularnih komponenti ćelije, (3)
povezivanje dobijenih gradivnih blokova u proteine, nukleinske kiseline, lipide i druge ćelijske kom
ponente i (4) sinteza i degradacija biomolekula koji su potrebni za određene specijalizovane funkcije
ćelije. Dakle, metabolizam se može definisati i kao proces kojim živi organizmi dobijaju i koriste slo
bodnu energiju, potrebnu za obavljanje različitih funk
cija.
Sunčeva energija
Kako organizmi dobijaju i koriste energiju? Fotot-
rofni organizmi koriste sunčevu energiju da bi u pro
cesu fotosinteze sintetisali ugljene hidrate iz ugljen-
Fotosinteza
dioksida i vode. Hemotrofni organizmi koriste hemij-
sku energiju sadržanu u strukturi hranljivih materija
(ugljenih hidrata i drugih biomolekula): ta hemijska
energija se oslobađa u toku katabolizma (razgradnje) Hemijska energija
hranljivih materija, pri čemu se hranljive materije oksi- (ATP, NADPH, glukoza)
duju, a oslobođena energija koristi za različite potrebe
ćelije. Reakcije oksidacije hranljivih materija u kojima
se oslobađa energija (egzergonske reakcije) spregnu
/ i \
te su sa procesima u kojima se energija troši (ender- Kontrakcija Biosinteza Transport
gonske reakcije) posredstvom visokoenergetskog je-
dinjenja adenozin-trifosfata (ATP): energija oslobođe
na u oksidativnoj razgradnji hranljivih materija koristi
\ I /
se za stvaranje ATP-a, a energija koja je neophodna Rasipanje energije
(toplota)
za odvijanje procesa biosinteze različitih biomolekula,
aktivni transport i kontrakciju mišića obezbeđuje se
razlaganjem ATP-a. Slika 11-1. Tok energije u biosferi.
11-2 Opšta biohemija
Tok energije u biosferi je jednosmeran: fototrofni organizmi sintetišu hranljive materije na račun
sunčeve energije; hemijska energija sadržana u strukturi tih hranljivih materija koristi se za biosinte-
zu, transport i kontrakciju, pri čemu dolazi do rasipanja dela energije u vidu toplote (Slika 11-1).
Pod pojmom metabolički put podrazumeva se serija uzastopnih enzimski katalizovanih reakcija
u kojima se stvaraju određeni proizvodi. Svi reaktanti, intermedijeri i produkti metaboličkih puteva
nazivaju se jednim imenom metaboliti. Kako u živoj ćeliji postoji veliki broj raznovrsnih biomolekula,
ogroman je i broj enzima koji učestvuju u reakcijama njihove degradacije i sinteze (više od 2000 poz
natih enzima). Sve metaboličke puteve možemo podeliti u dve osnovne kategorije:
• Katabolizam - putevi u kojima dolazi do razgradnje složenih metabolita u jednostavnije pro
dukte uz oslobađanje energije
• Anabolizam - putevi biosinteze složenih biomolekula iz jednostavnijih prekursora uz utrošak
energije.
Za odvijanje anaboličkih puteva neophodna je hemijska energija u formi ATP-a koji nastaje u ka-
taboličkim putevima. Pored toga, u toku biosinteze različitih biomolekula dolazi do redukcije određe
nih intermedijera, pa su anaboličkim putevima potrebni i elektroni, odnosno redukcioni ekvivalenti u
formi nekog redukovanog jedinjenja koje može da učestvuje u reakcijama biosinteze. I u ovom sluča
ju, izvor elektrona, odnosno redukcionih ekvivalenata su katabolički putevi, odnosno reakcije oksida
cije koje se odvijaju pri degradaciji hranljivih materija, a jedinjenje koje služi za transfer elektrona od
kataboličkih do anaboličkih puteva je NADP+/NADPH (nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat). Tran
sfer elektrona se vrši tako da se u određenim kataboličkim procesima NADP+ redukuje do NADPH na
račun oksidacije biomolekula koji se degradira, da bi se u anaboličkim procesima NADPH reoksido-
vao do NADP+ uz redukciju odgovarajućeg intermedijera anaboličkog puta (Slika 11-2).
Kompleksni metaboliti
/ ADP + HPO^- \
/ /^ NADP + ^ ^ \ \
Degradacija Biosinteza
Jednostavni proizvodi
dacije, s tim što bi se samo promenio smer reakcija. Takav tok bi bio i termodinamički nemoguć iz
razloga što se u katabolizmu oslobađa, a u anabolizmu troši energija. Zato se put razlaganja biomo-
lekula uvek razlikuje od puta njegove sinteze (Slika 11-3).
- A
© ®
\ /
Y« X
Kako se metabolički putevi obično sastoje od većeg broja uzastopnih enzimskih reakcije, često
se put degradacije i biosinteze nekog biomolekula razlikuje u samo nekoliko reakcija, dok ostale teku
pod dejstvom istih enzima, ali u obrnutom smeru. U pravilu, reakcije po kojima se razlikuje katabolički
od odgovarajućeg anaboličkog puta su one u kojima se oslobađa, odnosno troši energija. Npr., put
katabolizma glukoze glikolizom do piruvata razlikuje se od puta biosinteze glukoze iz piruvata u tri
reakcije, dok je preostalih sedam reakcija identično, ali sa suprotnim smerom.
(2) Svi metabolički putevi su regulisani. Metabolizam u ćeliji je regulisan dejstvom brojnih
mehanizama zavisno od potreba ćelije i organizma za energijom ili za pojedinim biomolekulima. Gla
vno mesto regulacije metaboličkog puta je najčešće prva enzimska reakcija, čime se izbegava stva
ranje nepotrebnih intermedijera. Različiti putevi sinteze i degradacije istih biomolekula omogućuju
nezavisnu regulaciju tih procesa. Tako npr. u uslovima koji zahtevaju aktivaciju katabolizma glikoge-
na da bi se dobila glukoza, dolazi do istovremene inhibicije suprotnog procesa, biosinteze glikogena
iz ostataka glukoze.
(3) Metabolički putevi imaju karakterističnu lokalizaciju u ćeliji. U ćelijama eukariota, svi me
tabolički putevi su lokalizovani u određenim ćelijskim prostorima. Tako se npr. biosinteza masnih ki
selina odvija u citozolu, a njihova degradacija u mitohondrijama. Kako su mitohondrije odvojene od
citozola polupropustljivom membranom, to daje dodatnu mogućnost nezavisne regulacije ova dva
suprotna metabolička puta.
U kataboličkim putevima, veliki broj složenih biomolekula (raznovrsnih proteina, polisaharida, li-
pida, nukleinskih kiselina) razlaže se, uz oslobađanje energije do malog broja jednostavnih produka
ta. Zato se kaže da su katabolički putevi konvergentni. Naprotiv, u procesima biosinteze i uz utrošak
energije, stvara se veliki broj veoma raznovrsnih složenih biomolekula iz ograničenog broja jednosta
vnih prekursora, tj. anabolički putevi su divergentni.
Grubo posmatrano, može se reći da se metabolizam odvija kroz tri faze (Slika 11-4). U prvoj fazi
katabolizma, složeni biomolekuli se razgrađuju do jednostavnijih jedinjenja od kojih su sastavljeni,
gradivnih blokova. U drugoj fazi, ti gradivni blokovi se dalje razlazu do zajedničkog intermedijera,
acetil-koenzima A koji ima centralno mesto u metabolizmu. U trećoj fazi, acetil-koenzim A se oksiduje
do konačnih proizvoda razlaganja, ugljen-dioksida i vode, kroz ciklus limunske kiseline, transport
elektrona respiratornim lancem i oksidativnu fosforilaciju ADP-a do ATP-a. U anabolizmu, najpre
nastaju jednostavniji prekursori: acetil-koenzim A i intermedijeri ciklusa limunske kiseline, od kojih se
zatim sintetišu gradivni blokovi. Konačno, stvoreni gradivni blokovi se povezuju u različite složene
biomolekule.
11-4 Opšta biohemija
Multienzimski sistemi
Sve reakcije koje se odvijaju u okviru metaboličkih puteva su enzimski katalizovane. U svakom
metaboličkom putu postoji tačno definisan redosled reakcija, koje teku tako da proizvod reakcije jed
nog enzima postaje supstrat sledećeg enzima u nizu. Međutim, organizacija enzimskih sistema koji
učestvuju u jednom metaboličkom putu može da bude različita. U nekim slučajevima, enzimi se nala
ze slobodni u rastvoru određenog ćelijskog prostora (npr. glikolitički enzimi u citozolu) i deluju neza
visno (Slika 11-5 A). U takvom rastvorljivom sistemu, prvi enzim, E1 katalizuje reakciju konverzije
početnog supstrata A metaboličkog puta u intermedijer B, koji predstavlja produkt enzima E1 i sups
trat enzima E2. Da bi se odigrala reakcija koju katalizuje enzim E2, intermedijer B mora da difunduje
od enzima E1, pod čijim je dejstvom nastao, do enzima E2 koji će ga konvertovati u sledeći interme
dijer C.
U nekim metaboličkim putevima, veći broj enzima je fizički udružen u multienzimski kompleks
(Slika 11-5 B). I u ovom sistemu, uzastopne reakcije teku tako da proizvod reakcije prvog enzima,
koji predstavlja deo multienzimskog kompleksa, postaje supstrat drugog itd. Kako je grupa enzima u
bliskom kontaktu, nastali intermedijeri se lako i veoma brzo prebacuju sa enzima u čijoj su reakciji
nastali do sledećeg u čijoj reakciji će se konvertovati u drugi intermedijer. Enzimi koji funkcionišu kao
sastavni deo multienzimskog kompleksa gube svoju aktivnost disocijacijom kompleksa na subjedini-
ce. Kao jedaa od karakterističnih primera može se navesti mvrttienzvmsto kompleks sinteze masnih
kiselina.
Konačno, najsloženiji vid organizacije multienzimskih sistema su enzimski sistemi vezani za
membranu (Slika 11-5 C). Enzimi koji funkcionišu kao komponente ovakvih struktura takođe su akti-
Z. Jelić-lvanović: Organizacija metabolizma i bioenergetika 11-5
vni jedino kao deo celine, u koju su uključeni ostali enzimi kao i sama membrana. Primer sistema
vezanog za membranu je respiratorni lanac vezan za unutrašnju membranu mitohondrija, koji tran-
sportuje elektrone oslobođene u oksidativnoj degradaciji raznih biomolekula do kiseonika, pri čemu
se oslobađa velika količina energije.
B. Multienzimski
kompleks
C. Sistem vezan za
membranu
potrebama same ćelije, već pre svega sa potrebama organizma u celini. Oni se sintetišu u dru
gim ćelijama koje, zavisno od vrste signalnog molekula, mogu da budu manje ili više udaljene od
ćelija na čiji metabolizam utiču (ciljnih ćelija). Ekstracelularni faktori mogu da regulišu brzinu me
taboličkih puteva na dva načina: promenom aktivnosti ili koncentracije regulatornih enzima.
• Uticaj na aktivnost enzima. Pod dejstvom određenih ekstracelularnih signalnih molekula, u
ciljnim ćelijama dolazi do fosforilacije, odnosno defosforilacije raznih regulatornih enzima.
Fosforilacija enzima se vrši pod dejstvom protein-kinaza, koje fosforilišu slobodne hidroksilne
grupe ostataka serina, treonina ili tirozina u molekulu enzima uz učešće ATP-a (Slika 11-6).
Defosforilaciju katalizuju enzimi fosfoprotein-fosfataze, koje hidrolizuju estarski vezan fosfat i
vraćaju enzim u defosforilisani oblik. Efekat fosforilacije, odnosno defosforilacije različit je
kod raznih enzima: neki enzimi su aktivni u fosforilisanom, a neaktivni u defosforilisanom ob
liku, dok je kod drugih obrnuto1.
• Uticaj na koncentraciju enzima. Neki ekstracelularni regulatomi faktori ostvaruju svoje dejs-
tvo na nivou jedra, tako što regulišu transkripciju određenih gena. Pod njihovim uticajem mo
že da se znatno ubrza sinteza potrebnih enzima, što ima za posledicu porast njihove koncen
tracije u ćeliji i aktivaciju metaboličkog puta u kojem učestvuju.
1
Treba napomenuti da je fosforilacija/defosforilacija nekih enzima regulisana koncentracijom određenih metabo-
lita u samoj ćeliji. Jedan od primera je fosforilacija i defosforilacija multienzimskog kompleksa piruvat-
dehidrogenaze, opisana detaljnije u Poglavlju 13. Isto tako, kao jedan od intracelularnih regulatora energetskog
metabolizma, funkcioniše i AMP-zavisna protein-kinaza (AMPK), metabolički senzor ćelija eukariota: ona se
aktivira kada je odnos nivoa AMP/ATP u ćeliji visok (odnosno nivo energije nizak). Aktivna AMPK stimuliše ka-
taboličke procese u kojima se stvara ATP, a inhibira anaboličke u kojima se ATP troši.
m
Z Jelić-lvanović: Organizacija metabolizma i bioenergetika 11-7
NH 2
Fosfoestarske
r f>
veze yy
Fosfoanhidridne
r veze ->
0 r—L. 0 r-i-, O N
iriiriTO
O — P O - R r r O - P - 0 — CH
O-
IP ll p i
2
o o o H H
H >—r H
HO OH
Adenozin
AMP
AD?
^_ J
ATP
Opšti principi termodinamike važe i za enzimske reakcije koje se odvijaju u živoj ćeliji u okviru ka-
taboličkih i anaboličkih puteva. Tako se i u biohemijskim reakcijama na osnovu promene standardne
slobodne energije (AG°) može proceniti da li neka enzimska reakcija spontano teče ili ne. Pod sta
ndardnim uslovima podrazumevamo temperaturu od 25°C, atmosferski pritisak i koncentraciju svih
reaktanata od 1 mol/L. Međutim, u biohemijskim reakcijama je kao jedan od standardnih uslova uze
ta i vrednost pH = 7,00 što više odgovara uslovima u ćeliji, pa se promena slobodne energije biohe-
mijske reakcije pod tako definisanim standardnim uslovima obeležava sa AG0'. Promena standardne
slobodne energije može da se izračuna kao razlika između zbira standardnih slobodnih energija svih
proizvoda reakcije i zbira standardnih slobodnih energija svih reaktanata:
=
AG ZAG proizvoda ~ S A G reaktanata
Međutim, u živim ćelijama nikada nisu zadovoljeni standardni uslovi, naročito u pogledu koncen
tracija reaktanata i produkata koje se međusobno razlikuju, a najčešće su daleko od standardnih
vrednosti (1 mol/L). Dakle, promena slobodne energije biohemijske reakcije pod realnim, fiziološkim
uslovima (AG) zavisi od stvarnih koncentracija reaktanata i proizvoda reakcije i razlikuje se od vred
0
nosti promene standardne slobodne energije (AG '). Ako promena slobodne energije ima negativnu
vrednost (AG < 0), reakcija u prisustvu odgovarajućeg enzima spontano teče uz oslobađanje energi
je. Međutim, u slučaju da promena slobodne energije ima pozitivnu vrednost (AG > 0), reakcija ne
može da se odvija ako se ne spregne sa drugom, egzergonskom reakcijom koja će obezbediti potre
bnu energiju. U živoj ćeliji, ATP obezbeđuje takvu spregu, odnosno funkcioniše kao posrednik koji
vrši transfer hemijske energije između reakcija u kojima se oslobađa energija do onih za čije odvija
nje energija mora da se utroši.
Da bi mogao da ostvari svoju ulogu u transferu energije, ATP učestvuje kao zajedničkiTntermedi-
jer u egzergonskim i endergonskim reakcijama, tako da predstavlja jedan od proizvoda prvih, odnos
no jedan od supstrata drugih navedenih reakcija (Slika 11-8). U reakciji (a) prikazana je konverzija
fosfoenolpiruvata, jedinjenja sa visokim sadržajem energije u piruvat. U toku ove konverzije oslobađa
se energija koja se koristi za stvaranje jednog molekula ATP-a za svaki molekul fosfoenol-piruvata
11-8 Opšta biohemija
koji pređe u piruvat. I pored toga što je deo energije iskorišćen za sintezu ATP-a, reakcija je egzer-
gonska, (negativni predznak AG0') i zato spontano teče u prisustvu odgovarajućeg enzima, u ovom
slučaju piruvat-kinaze (PK). Međutim, reakcija fosforilacije glukoze do glukoza-6-fosfata (Slika 11-8b)
ne može da teče ako se ne obezbedi energija, jer je proizvod reakcije (G-6-P) bogatiji hemijskom
energijom od reaktanata (glukoze i neorganskog fosfata).
PK
Fosfoenolpiruvat + ADP • •= Piruvat + ATP
AG0'= -31,4kJ/mol
HK
ATP + Glukoza ^ = t ADP + Glukoza-6-P
AG°' = -16,7kJ/mo!
AG0' = -14,7kJ/mol
U živoj ćeliji glukoza se ipak fosforiliše do G-6-P, ali tako da se kao donor fosfatne grupe ne kori
sti neorganski fosfat već ATP. Tom prilikom od visokoenergetskog jedinjenja, ATP-a nastaje ADP sa
znatno nižim sadržajem energije, pa je suma slobodnih energija produkata niža od sume slobodnih
energija reaktanata. Dakle, fosforilacija glukoze na račun ATP-a je egzergonska reakcija (negativna
vrednost AG0'), koja spontano teče u prisustvu enzima heksokinaze (HK). U ovom primeru ATP je
poslužio kao posrednik koji omogućuje da se energija oslobođena u konverziji fosfoenolpiruvata u
piruvat iskoristi za fosforilaciju glukoze do G-6-P. Šire posmatrano, ovo je princip na kojem ATP fun-
kcioniše u transferu energije sa katabolizma na anaboiizam: on je zajednički intermedijer koji se stva
ra u određenim reakcijama kataboličkih, a troši u reakcijama anaboličkih puteva.
U Tabeli 11-1 prikazane su vrednosti standardnih slobodnih energija hidrolize nekih fosforilisanih
metabolita, koje su merilo njihovog sadržaja energije, tj. energije koja se oslobađa odvajanjem fosfa
tne grupe iz strukture tih jedinjenja. Kako promena slobodne energije svake spontane reakcije mora
da ima negativnu vrednost, fosforil-grupe mogu da se prenose jedino sa jedinjenja bogatijih energi
jom (negativnija vrednost AG0' hidrolize) na akceptor koji u fosforilisanom obliku ima niži sadržaj
energije (manje negativna vrednost AG0' hidrolize). Vrednosti AG0' hidrolize fosfoenolpiruvata, ATP-a
i glukoza-6-fosfata date u ovoj tabeli potvrđuju da su reakcije prikazane u primeru na Slici 11-8 mo
guće: fosfoenolpiruvat sa vrlo visokom negativnom vrednošću AG0' hidrolize može da posluži za
stvaranje ATP-a iz ADP-a. S druge strane, ATP ima negativniju vrednost AG0' hidrolize nego gluko-
za-6-fosfat, pa zato može da bude donor fosforil-grupe u reakciji fosforilacije glukoze. Dakle, tok fos-
foril-grupa je moguć jedino u smeru od visokoenergetskih donora ka niskoenergetskim akceptorima
(Slika 11-9). Pod "visokoenergetskim" vezama, odnosno vezama bogatim energijom obično se pod-
razumevaju veze čija je vrednost AG0' hidrolize negativnija od -25 kJ/mol i obeležavaju se znakom ~.
Z Jelić-lvanović: Organizacija metabolizma i bioenergetika 11-9
Fosfoenolpiruvat -61,9
1,3-Difosfoglicerat -49,4
Fosfokreatin -43,1
Pirofosfat (PP ,) -33,5
A T P ( - » A D P + P ,) -30,5
Glukoza-1-fosfat -20,9
Fruktoza-6-fosfat -13,8
Glukoza-6-fosfat -13,8
Glicerol-3-fosfat -9,2
U većini slučajeva, za odvijanje endergonskih reakcija dovoljna je energija koja se oslobodi hid
rolizom jedne fosfoanhidridne veze, odnosno odvajanjem y-fosforil ostatka. Kako se u ovakvim reak
cijama oslobađa neorganski fosfat (ortofosfat), ovakva hidroliza ATP-a se naziva ortofosfatno ce-
panje:
ATP —• ADP + P| + energija,
gde P, označava neorganski fosfat, odnosno ortofosfat. Međutim, neke reakcije zahtevaju veću koli
činu energije, pa se tada ATP hidrolizuje tako da se dva fosforil ostatka (p i y) odvajaju iz molekula
ATP-a u formi pirofosfata:
AG 0 ' HN—P03z'
H2, N = C
Fosfoenolpiruvat I
N—CH.COO'
I 2
CH3
1,3-Difosfoglicerat \
Fosfokreatin
(rezervoar)
~Ps
?P
ATP
~P
~P
Glukoza-
6-fosfat
Glicerol-3-fosfat
gde PPj označava pirofosfat, a ovakvo razlaganje ATP-a naziva se pirofosfatno cepanje Stvoreni
pirofosfat se razlaže na dva molekula ortofosfata u egzergonskoj reakciji koju katalizuje enzim neor-_
ganska pirofosfataza, što je dodatni izvor energije za reakciju praćenu pirofosfatnim cepanjem:
PPi —• 2 Pj+energija.
Posebno mesto među visokoenergetskim metabolitima zauzima fosfokreatin (ili kreatin-fosfat),
0
koji služi za "skladištenje" energije, i iz kojeg se po potrebi energija vrlo brzo oslobađa. AG ' hidrolize
0
fosfokreatina ima nešto negativniju vrednost od AG ' hidrolize ATP-a. Međutim, pod fiziološkim uslo-
vima (obzirom na realne koncentracije u ćeliji), AG hidrolize ovih dvaju jedinjenja su skoro jednake,
pa je reakcija stvaranja i razgradnje fosfokreatina reverzibilna:
CK
Kreatin + ATP ~" fosfokreatin + ADP
AG°' = +12,6kJ/mol
AG « 0 kJ/mol
Dakle, u uslovima kada je koncentracija ATP-a u ćeliji visoka, favorizovana je reakcija stvaranja fos
fokreatina. Kada energetski nivo ćelije opadne (sniženje koncentracije ATP-a), reakcija teče u supro
tnom smeru, odnosno ADP se fosforiliše do ATP-a. Reakciju katalizuje enzim kreatin-kinaza {CK),
kojom su naročito bogata ona tkiva kod kojih postoje velike razlike u potrebama za energijom u razli
čitim okolnostima. Najbolji primer su ćelije skeletnih mišića i srčanog mišića, čije potrebe za energi
jom znatno rastu za vreme intenzivne fizičke aktivnosti. U ovim ćelijama, fosfokreatin je izvor energije
koja se može najbrže dobiti (u samo jednoj reakciji).
^—II /. \ \\-J
—o—P—o—P—o—
i U* i
W v W ^
HoO
— 0 —P — O — H + H—O—P—O-
iU' " i
-o o-
Slika 11-10. Rezonantna stabilizacija (lukovi sa strelicama) i elektrosta-
tičko odbijanje istoimenih naelektrisanja (cik-cak linija) fosfori I-grupa
fosfoanhidrida u poređenju sa proizvodima hidrolize.
Z. Jelić-lvanović: Organizacija metabolizma i bioenergetika 11-11
A. GLIKOLIZA
Slika 12-1. Pregled glikolize i sudbina piruvata pod različi U glikolizi učestvuje deset enzima,
tim uslovima, odnosno kod različitih organizama. koji su svi lokalizovani u citozolu. Svi
intermedijeri glikolize su fosforilisani i ti
12-2 Opšta biohemija
Glukoza >v
ATP
—t— + ADP + P:
ATP
1- ADP + P;
V I faza
Fruktoza-1,6-difosfat
GAP DHAP
GAP J
2NAD +
J — - 2 NADH
2ADP 1—-2 ATP
i
V II faza
2ADP 2 ATP
Piruvat Piruvat
J
Slika 12-2. Faze glikolize (GAP - gliceraldehid-fosfat; DHAP
dihidroksiaceton-fosfat).
Reakcije glikolize
CH2OP03z
H O H
HK H
+ ATP + ADP
OH H
om r OH
H OH
Glukoza-6-fosfat (G6P)
Z. Jelić-lvanović: Katabolizam ugljenih hidrata 12-3
U većini ćelija, reakciju katalizuje heksokinaza (HK), alostemi enzim čiji je negativni aloster-
ni modulator sam proizvod ove reakcije, glukoza-6-fosfat Heksokinaza nije apsolutno specifična na
glukozu kao supstrat, već fosforiliše i druge heksoze. Međutim u ćelijama jetre ima vrlo malo hekso-
kinaze, pa reakciju fosforilacije glukoze katalizuje drugi enzim, glukokinaza. Heksokinaza i glukoki-
naza se međusobno razlikuju po vrednostima Km za glukozu (Slika 12-3). Km heksokinaze je vrlo nis
ka (HK ima veliki afinitet za glukozu), što znači da će reakcija teći velikom brzinom i pri niskim kon
centracijama glukoze. Kako heksokinaza fosforiliše praktično celokupnu količinu glukoze koja uđe u
ćeliju, održava se veliki koncentracioni gradijent glukoze između krvi i intracelularnog prostora. Time
je omogućeno snabdevanje tkiva glukozom čak i onda kada je koncentracija glukoze u krvi niska.
Naprotiv, glukokinaza ima znatno višu Km, pa fosforilacija glukoze pod dejstvom tog enzima može da
se odvija značajnom brzinom samo onda kada je koncentracija glukoze visoka (kao npr. posle obro
ka bogatog ugljenim hidratima). Pored toga, glukoza-6-fosfat nema sposobnost da inhibira aktivnost
glukokinaze. Ove osobine heksokinaze i glukokinaze utiču na distribuciju glukoze u organizmu pod
različitim uslovima. Kada je koncentracija glukoze u krvi niska, ćelije jetre (u kojima se nalazi gluko
kinaza) neće preuzimati znatniju količinu glukoze, već će ona biti raspoloživa za korišćenje u drugim
tkivima (u kojima se nalazi heksokinaza). Međutim, kada je koncentracija glukoze u krvi visoka, akti
vnost glukokinaze postaje značajna, pa jetra preuzima znatnu količinu glukoze, "koja se u ovom orga
nu koristi za skladištenje ili biosintezu drugih potrebnih jedinjenja.
[Glukoza]
CH 2 OP0 3 CH 2 OP0 3 2
CH 2 OH
PGI
. H 01
OH
OH
OH H
2-
CH 2 OP0 3 CH 2 OPO;
o~ CH 2 OH " CH 2 OP0 3 2 -
PFK-1 0
H OI + ATP H OI + ADP
H OH H OH
OH H OH H
Fruktoza-6-fosfat Fruktoza-1,6-difosfat
(F6P) (FDP)
Reakcija je ireverzibilna, a u njoj se troši i drugi molekul ATP-a. Enzim koji katalizuje ovu reakci
ju obeležava se kao fosfofruktokinaza-1 (PFK-1) za razliku od fosfofruktokinaze-2 (PFK-2) koja delu-
je na isti supstrat, ali se fosforiliše hidroksilna grupa u položaju 2 pa nastaje fruktoza-2,6-difosfat.
Aktivnost PFK-2 je hormonski regulisana, a njen proizvod je važan regulator metabolizma ugljenih
hidrata, što će kasnije biti objašnjeno.
Fosfofruktokinaza-1 je glavni regulatorni enzim glikolitičkog puta, što znači da od brzine ove, po
redosledu treće reakcije glikolize u najvećoj meri zavisi brzina kojom će se glukoza katabolizovati do
piruvata, odnosno brzina glikolize u celini.
Pod dejstvom aldolaze, FDP se razlaže na dve trioze: gliceraldehid-fosfat (GAP) i dihidroksiace-
ton-fosfat (DHAP):
Dihidroksiaceton-fosfat
(DHAP)
CH,OPOf ^H.OPO/-
I c=o
c=o 2
I I
HO—C—H Aldolaza HO—CH.
i *- '
I -
H .0
H—C—OH \ '/
C
i
H—C—OH
H—C —OH
CH 2 OP0 3 |
CH2OP032"
Fruktoza-1,6-difosfat
(FDP) Gliceraldehid-3-fosfat
(GAP)
Ova reakcija predstavlja reverzibilnu aldolnu kondenzaciju (u smeru u kojem teče glikoliza to je
aldolno cepanje ili retroaldolna kondenzacija), a odvija se preko intermedijera tipa Schiff-ove baze.
Od dve trioze stvorene u prethodnoj reakciji, samo se GAP razlaže u drugoj fazi glikolize. Zato je
potrebno da se i druga trioza, DHAP, konvertuje u GAP i na taj način uključi u dalju razgradnju. Rea
kciju interkonverzije trioza preko endiolnog intermedijera katalizuje enzim trioza-fosfat izomeraza
(TPI):
Z Jelić-lvanović: Katabolizam ugljenih hidrata 12-5
H H .0
I H OH \ 4
H — C —OH \ / C
TPI C TPI I
I II H — C —OH
c=o C — OH
CH 2 OP0 3 CH 2 OP0 3 CH 2 OP0 3
Reakcija je reverzibilna, a ravnoteža favorizuje stvaranje DHAP (reakciona smeša u ravnoteži sadrži
oko 90% DHAP). Međutim, kako se GAP neprestano troši u procesu glikolize, postepeno se nove i
nove količine DHAP izomerizuju u GAP. Zahvaljujući tome, ukupna količina obe trioze stvorene u
reakciji aldolaze mogu da se razgrade do piruvata. Reakcijom interkonverzije trioza-fosfata završava
se prva faza glikolize.
% / 0 P °3
.C .C
GAPDH
H—C —OH + NAD + Pj H—C —OH + NADH + H
1
2
3
CH 2 OP0 3 CH.OP0 2
3 2 3
Gliceraldehid- 1,3-Difosfoglicerat
3-fosfat (1,3-DPG)
(GAP)
U ovoj reakciji dolazi do oksidacije aldehidne grupe gliceraldehid-3-fosfata u karboksilnu, pri čemu se
oslobađa energija. Ta energija se koristi za fosforilaciju nastale karboksilne grupe, tako da je proiz
vod reakcije 1,3-difosfoglicerat. Ovaj intermedijer je po svojoj strukturi acil-fosfat (anhidrid karboksil
ne i fosfatne kiseline), pa prema tome spada u grupu visokoenergetskih jedinjenja.
PGK
H—C —OH ADP H—C —OH + ATP
3
CH 2 OP0 3 2 CH,OPO,
3 2 3
1,3-Difosfog lice rat 3-Fosfoglicerat
(1,3-DPG) (3-PG)
Ovo je jedan od primera fosforilacije na nivou supstrata: slobodna energija hidrolize 1,3-DPG kori
sti se za fosforilaciju ADP-a uz stvaranje ATP-a, pri čemu se fosforil-grupa prenosi na ADP direktno
sa samog supstrata (1,3-DPG).
12-6 Opšta biohemija
U osmoj reakciji glikolize, dolazi do transfera fosforil-grupe sa položaja 3 u položaj 2 pod dejs-
tvom enzima fosfoglicerat-mutaze (PGM).
Ov O"
?• PGM T' 2
H —C2 —OH H —C 2—OPO,
I I
H—C—OPO, H—C—
3 3 OH
I I
H H
3-Fosfoglicerat 2-Fosfog lice rat
(3-PG) (2-PG)
G L I K O L I Z A
Gliceraldehid-3-fosfat
GAPDH
NJ Dlf
osfog,ICerat Ov O
1,3-Difosfoglicerat m
utaza c
I
K H —C —OPO,
PGK
N CH2OP03"
cerat
3-Fosfoglicerat 23
-D.fosfog"' 2,3-Difosfoglicerat
l
' fosfata*3 (2,3-DPG)
IPGM
2-Fosfoglicerat
Pod dejstvom enolaze, iz 2-PG se izdvaja molekul vode pri čemu nastaje fosfoenolpiruvat (PEP):
I , Enolaza I 7
H—c—OPO, - c—OPCL + ao
r II 2
-
H—C—OH H—C
I3 I3
H H
2-Fosfoglicerat Fosfoenolpiruvat
(2-PG) (PEP)
Za dejstvo enzima neophodno je prisustvo Mg 2 + jona koji se vezuje sa enzimom pre formiranja
kompleksa enzim-supstrat. Fluoridni jon inhibira enolazu pri čemu se nagomilavaju 2PG i 3PG i za
ustavlja glikoliza. Do inhibicije dolazi u prisustvu neorganskog fosfata i to zbog toga što se fluorid i
fosfat vezuju u stabilan kompleks sa Mg 2 + jonom u aktivnom centru enzima. Ovaj kompleks sprečava
vezivanje supstrata za enzim, a time i samu reakciju.
Proizvod reakcije enolaze, fosfoenolpiruvat spada u grupu jedinjenja sa visokim sadržajem ener
gije, koja će biti iskorišćena u desetoj reakciji glikolize za fosforilaciju drugog molekula ADP-a do
ATP-a.
°v .°" ov O"
c c
I 2 PK \
C —3 OPCT + ADP
+ 2+
.. C=0 + ATP
II K ,Mg I
CH2 CH3
Fosfoenolpiruvat Piruvat
(PEP)
Reakcija teče u prisustvu jednovalentnog (K+) i dvovalentnog (Mg2+) katjona. Ovo je još jedan primer
fosforilacije na nivou supstrata (supstrat PEP je ujedno izvor fosfatne grupe i energije). Piruvat-
12-8 Opšta biohemija
kinaza je treći regulatorni enzim glikolitičkog puta, ali je njen uticaj na brzinu glikolize manji u poređe-
nju sa uticajem fosfofruktokinaze-1.
Kao što je ranije navedeno, u šestoj reakciji glikolize, pod dejstvom enzima glicerldehid-3-fosfat
+
dehidrogenaze, došlo je do redukcije dva molekula NAD do NADH za svaki molekul glukoze koji
+
prođe kroz glikolitički put. Dakle, oksidovani oblik NAD je neophodan za odvijanje glikolize, pa se
mora stalno obnavljati da bi glikoliza dalje tekla. U prisustvu kiseonika, NADH se posredstvom speci-
jalizovanih šatl-sistema prenosi u mitohondrije. Tu se elektroni sa NADH uključuju u sistem transpor
ta elektrona duž respiratornog lanca do molekularnog kiseonika kao konačnog akceptora (Poglavlje
14). Prema tome, u aerobnim uslovima, glikoliza predstavlja samo prvu, anaerobnu fazu razgradnje
glukoze, na koju se nadovezuje aerobna faza katabolizma u kojoj se oslobađa mnogo veća količina
energije.
Za vreme intenzivnog rada mišića, priliv kiseonika često nije dovoljan da bi se velike i trenutne
potrebe za ATP-om mogle obezbediti isključivo aerobnim metabolizmom hranljivih materija. Tada
dolazi do reoksidacije NADH piruvatom, pri čemu nastaje laktat i NAD+. Ova reakcija se često tretira
kao jedanaesta reakcija glikolitičkog puta, a katalizuje je enzim laktat-dehidrogenaza (LDH):
c c
LDH
I + I
+ +
C=0 + NADH + H .. HO —C — H + NAD
I !
CH 3 CH 3
Piruvat L-laktat
Stvoreni NAD+ omogućuje da se glikolizom brzo obezbede dodatne količine ATP-a (iako se aerobnim
katabolizmom glukoze dobija mnogo više ATP-a, stvaranje ATP-a anaerobnom glikolizom je oko 100
puta brže). Reakcija laktat-dehidrogenaze se intenzivno odvija i u eritrocitima koji nemaju mitohondri
je, pa svoje energetske potrebe zadovoljavaju anaerobnim razlaganjem glukoze.
Znatan deo stvorenog laktata transportuje se putem krvi do jetre, gde se koristi za resintezu glu
koze.
Izoenzimi LDH. Laktat-dehidrogenaza u ćelijama sisara ima tetramernu strukturu, a sastoji se iz dva
tipa polipeptidnih lanaca:
• M (mišićni tip, eng. muscle - mišić) i
• H (srčani tip, eng. heart- srce)
Postoji pet mogućih kombinacija dva tipa subjedinica u tetramere u kojima su pojedine subjedini-
ce zastupljene u različitim odnosima. Tako se dobija pet različitih izoenzima LDH sledećeg sastava:
M4, M3H, M2H2, MH 3 i H4. Svi ovi izoenzimi katalizuju isti reakciju, ali se međusobno razlikuju po od
ređenim karakteristikama, kao i po zastupljenosti u različitim tkivima.
Z Jelić-lvanović: Katabolizam ugljenih hidrata 12-9
U ćelijama kvasaca, pod anaerobnim uslovima, reoksidacija NADH se vrši uz učešće dva enzi
ma, pri čemu se dobija etanol kao konačni proizvod (Slika 12-5).
+
C02 NADH NAD
0 0 A O . i OH
II // 1 J // V 2 J I
CH3—C—C —: { ^ CH 3 —C .. >-. ^ > CH 3 —C —H
6 J
\ _ piruvat- \ alkohol- ]
O dekarboksilaza H dehidrogenaza H
Piruvat Acetaldehid Etanol
Pri anaerobnoj degradaciji glukoze, oslobađa se energija čiji se deo koristi za stvaranje dva mo
lekula ATP-a za svaki molekul glukoze (kao što je ranije objašnjeno, dva molekula ATP-a se troše u
prvoj fazi, a četiri nastaju u drugoj fazi glikolize). Sumarna reakcija anaerobne glikolize do laktata
može se predstaviti na sledeći način:
Glukoza + 2ADP + 2P| • 2Laktat + 2ATP + 2H 2 0 + 2H +
Da bi se odredila efikasnost glikolize (procenat iskorišćenja oslobođene energije), ova zbirna re
akcija može da se rastavi na dve komponente, odnosno polureakcije. Egzergonsku polureakciju čini
razlaganje glukoze:
Glukoza • 2Laktat+ 2H +
AG°'(pH7) = -196kJ/mol,
a endergonsku reakcija fosforilacije ADP-a do ATP-a:
Iz vrednosti AG 0 ' egzergonske polureakcije vidi se da se pod standardnim uslovima pri anaerob-
noj glikolizi oslobađa 196 kJ/mol glukoze. Kako je za stvaranje dva mola ATP-a iz ADP-a potrebna
energija od 61 kJ, iz odnosa 61/196 može se izračunati daje pri anaerobnoj glikolizi za sintezu ATP-
a iskorišćeno svega 3 1 % oslobođene energije, dok se ostatak rasipa u vidu toplote. Međutim, pod
fiziološkim uslovima, uzimajući u obzir stvarne koncentracije reaktanata i produkata u živoj ćeliji, efi
kasnost glikolize je znatno veća nego pod standardnim uslovima i obično prelazi 50%.
Kod alkoholnog vrenja, prinos ATP-a je isti, ali je količina oslobođene energije veća u poređenju
sa mlečnokiselinskim vrenjem:
Regulacija glikolize
U svakom metaboličkom putu postoji jedna ili nekoliko reakcija koje regulišu brzinu puta u celini.
Aktivnost i/ili koncentracija enzima koji katalizuju takve reakcije regulisana je zavisno od metaboličkih
potreba organizma: aktivacija ili povećanje koncentracije tih enzima ubrzava reakciju, a time i tok
metaboličkog puta, a inhibicijom se postiže suprotan efekat. Ove reakcije su u pravilu mnogo sporije
od ostalih: njihovi proizvodi se brzo uklanjaju konverzijom u dalje intermedijere puta, pre nego što se
koncentracija proizvoda uravnoteži sa odgovarajućom koncentracijom reaktanta. Zbog toga ove rea
kcije funkcionišu daleko od ravnotežnog stanja (praktično su ireverzibilne) i imaju izrazito negativnu
vrednost promene slobodne energije (AG).
Uloga ostalih reakcija metaboličkog puta u regulaciji njegove brzine je da efikasno i brzo "preno
se" svaku promenu brzine regulatorne reakcije dalje niz metabolički put. Da bi vršile ovu funkciju, te
reakcije treba da budu brze (velika aktivnost enzima) i da su koncentracije supstrata i proizvoda blis
ke ravnotežnim. U tom slučaju, brzina reakcije zavisi od priliva supstrata, pa svako povećanje kon
centracije supstrata dovodi do odgovarajućeg ubrzanja reakcije.
>HK
VPFK-1
o
N
< 0.
>PK
CI 0_
< CD CD
_g CO Q I CL LJJ
CD CD Q CD CN DL
CD
>
E
o.
Ako se posmatraju promene slobodne energije u toku glikolize (Slika 12-6), lako se uočavaju tri
reakcije sa najnegativnijim vrednostima AG: to su reakcije heksokinaze (HK), fosfofruktokinaze-1
(PFK-1) i piruvat-kinaze (PK). Upravo te tri reakcije određuju brzinu glikolize, a aktivnost ova tri en
zima je kontrolisana dejstvom više faktora. Sve ostale reakcije su praćene neznatnom pramenom
slobodne energije (podsetimo se da je vrednost AG reakcije u ravnotežnom stanju ravna nuli). One
"prate" brzinu regulatornih reakcija, tako da se svaka promena brzine regulatornih reakcija odražava
na brzinu glikolitičkog puta u celini.
U tabeli 12-1 prikazani su neki modulatori aktivnosti heksokinaze, fosfofruktokinaze-1- i piruvat-
kinaze. lako sva tri navedena enzima utiču na brzinu glikolize, efekat fosfofruktokinaze-1 je daleko
najveći, pa je reakcija koju katalizuje taj enzim glavno regulatomo mesto u glikolitičkom putu.
Heksokinaza G6P
Na brzinu glikolize najviše utiču alosterni modulatori PFK-1, među kojima posebno mesto zauzi
maju:
(1) ATP (inhibitor) i AMP (aktivator)
(2) Fruktoza-2,6-difosfat (aktivator)
(3) Citrat (inhibitor)
i faktori koji utiču na aktivnost drugih regulatornih enzima:
(4) Regulatori aktivnosti heksokinaze
(5) Regulatori aktivnosti piruvat-kinaze
Bez inhibitora
(niska konc. ATP-a)
ATP je uobičajen alosterni inhibitor enzima koji učestvuju u raznim kataboličkim putevima: visoka
koncentracija ATP-a znači da nema potrebe za kataboličkim putevima u kojima bi se dobilo još ener
gije. U slučaju PFK-1, ATP je i supstrat i alosterni inhibitor: aktivnost ovog enzima se višestruko
smanjuje u prisustvu 1 mmol/L ATP-a i fizioloških koncentracija drugog supstrata, fruktoza-6-fosfata
(Slika 12-7, kriva s desne strane). Naprotiv, AMP potire inhibitomi efekat ATP-a, pa je aktivnost PFK-
1 u prisustvu iste koncentracije ATP-a, ali uz 0,1 mmol/L AMP-a znatno veća nego u prethodnom
slučaju (Slika 12-7, srednja kriva).
Udruženo dejstvo alosternog inhibitora, ATP-a i alosternog aktivatora AMP-a na aktivnost PFK-1,
odnosno brzinu glikolize od posebnog je fiziološkog značaja u mišićnim ćelijama. Fizička aktivnost
smanjuje koncentraciju ATP-a u mišićima svega za oko 10% u odnosu na stanje mirovanja, zbog
toga što se ATP utrošen u kontrakciji nadoknađuje dvema reakcijama:
1. reakcijom kreatin-kinaze (Poglavlje 10) i
2. adenilat-kinaze (AK) koja uravnotežuje ADP stvoren hidrolizom ATP-a pri mišićnoj kontrakciji sa
ATP-om i AMP-om:
AK
2ADP =P ^ ATP + AMP
sa konstantom ravnoteže:
K = [ATP][AMPl
[ADP]2
Tako mali pad nivoa ATP-a sam po sebi nema veliki uticaj na aktivnost PFK-1. Međutim, zahvaljujući
aktivnosti adenilat-kinaze, hidroliza ATP-a dovodi do porasta koncentracije AMP-a. Normalno je u
mišićnim ćelijama vrednost [ATP] oko 50 puta veća od [AMP], a oko 10 puta od [ADP]. Zbog toga,
zahvaljujući reakciji adenilat-kinaze, sniženje koncentracije ATP-a od 10% dovodi do porasta nivoa
AMP-a za više od četiri puta. Udružen efekat smanjenja koncentracije alosternog inhibitora i porasta
koncentracije aktivatora dovodi do znatnijeg povećanja aktivnosti PFK-1 i brzine glikolize, čime se
obezbeđuje energija za dalji rad mišića.
ATP ¥K
!?r/ '\
(defosfoenzim) A01*
-2 ~ 2 O q P— O — H 2 C O-POf
OH 0
H HO.
CH2OH H CH2OH
HO H HO H
Ove dve enzimske aktivnosti, lokalizovane na dva domena istog proteinskog molekula, podležu
alosternoj regulaciji različitim intermedijerima metabolizma, ali je od najvećeg značaja regulacija akti
vnosti fosforilacijom/defosforilacijom enzima do koje dolazi pod dejstvom hormona. Kada koncentra
cija glukoze u krvi opadne, luči se hormon glukagon koji posredstvom specifičnih receptora na pla-
zma-membrani ciljnih ćelija dovodi do porasta koncentracije c-AMP unutar ćelije. c-AMP aktivira c-
AMP-zavrsnu protein kinazu, koja fosforiliše bifunkcionalni enzim jetre (Slika 12-9). U fosforilisanom
enzimu aktivan je domen koji katalizuje razlaganje F2.6P (aktivnost FDP-aze), a inhibiran domen koji
katalizuje sintezu F2.6P (aktivnost PFK-2). Zbog toga koncentracija F2.6P opada, što smanjuje akti
vnost PFK-1, a time i brzinu glikolize. Obrnuto, kada ima puno raspoložive glukoze, prestaje lučenje
glukagona. Nivo cAMP u ćeliji opada, a time i aktivnost protein-kinaze. Pod dejstvom specifične pro-
tein-fosfataze defosforiliše se bifunkcionalni enzim, čime se aktivira njegova aktivnost PFK-2, a inhi-
bira aktivnost FDP-aze. Raste koncentracija F2.6P, koji alosternom aktivacijom PFK-1 ubrzava gliko-
lizu.
Glukagon i Glukagon t
-a *
cAMP i cAMPT
[F2.6P] t [F2.6P] i
lako aktivnost PFK-1 u najvećoj meri određuje brzinu glikolize, aktivnost druga dva regulatorna
enzima takođe ima određeni uticaj.
smanjena koncentracija glukokinaze u hepatocitima, pa jetra tih pacijenata ima slabu sposobnost
uklanjanja glukoze, bez obzira na njenu visoku koncentraciju u krvi.
B. FOSFOGLUKONATNI PUT
Fosfoglukonatni put (ili: pentoza-fosfatni put, ili: heksoza-monofosfatni odvojak) je alternativni
metabolički put kojim može da se oksiduje glukoza. On zapravo predstavlja odvojak glikolize, a za
počinje od glukoza-6-fosfata.
Osnovna je uloga katabolizma da obezbedi hemijsku energiju u obliku ATP-a, koji je ćeliji neop
hodan za vršenje sinteze različitih biomolekula, aktivni transport ili kontrakciju mišića. Za razliku od
ostalih kataboličkih puteva, u fosfoglukonatnom putu se ne stvara ATP. Međutim, on je ipak izuzetno
značajan za ćelije, posebno ćelije određenih tkiva kako će kasnije biti objašnjeno.
NADPH + CO5,
CHoOH
I
c—o
H—Ć—OH
glukoza- 6-fosfo- 6-fosfo- i
HO
6-fosfat glukono- glukonat H—C—OH
dehidrogenaza laktonaza CH?OPOf dehidro CHaOPOf"
Glukoza-6- 6-Fosfoglukono- genaza Ribuloza-5-
6-Fosfoglukonat
fosfat 5-lakton fosfat (Ru5P)
^O
1 CH2OH
I ^=0 6 H- •f—OH
• 'H2OPOf~
H —'.;—OH
•OH Riboza-5-
H — Ć—OH fosfat (R5P)
CH 2 OPO|"
t'H2OPOJj~
Gliceraldehid- Sedoheptuloza- H.OH
3-fosfat (GAP) 7-fosfat (S7P) 5
—O
HO- H ribuloza-5-fosfat
- OH epimeraza
transaldolaza • H 2 OPOr-
Ksliuioza~5-
fosfat (Xu5P*
CHJJOH . HvOH
č=o ,H
•~ O
HO—C— H HO—C— H
,H
H™ C — O H H—• -OH 8 H—C—OH
H—C—OH H —« -OH transketolaza H—'•—OH H — C - -OH
CH2OPOT CHaOPOf : H.OPOf" CHaOPOf
Slika 12-10. Fosfoglukonatni put. Broj linija sa strelicama označava broj molekula koji reaguje u
jednom prolasku kroz ovaj metabolički put, tako da se 3G6P konvertuju u 3C0 2 , 2F6P i jedan
GAP. Da bi se jasnije uočile promene do kojih dolazi u toku reakcija, šećeri su od reakcije 3 pa
nadalje prikazani u linearnoj formi.
Kao što se vidi iz navedene reakcije i sa slike, upravo u ovoj fazi stvara se NADPH. Pri konverziji
jednog molekula glukoza-6-fosfata u ribuloza-5-fosfat, redukuju se dva molekula NADP+ do
NADPH, i to u reakcijama koje katalizuju dve NADP-specifične dehidrogenaze: glukoza-6-fosfat
dehidrogenaza (Slika 12-10, reakcija 1) i 6-fosfoglukonat dehidrogenaza (Slika 12-10, reakcija 3).
(2) Reakcije izomerizacije i epimerizacije (Slika 12-10, reakcije 4 i 5), kojima se Ru5P transformiše u
riboza-5-fosfat (R5P) ili u ksiluloza-5-fosfat (Xu5P).
(3) Serija enzimskih reakcija u kojima se raskidaju i stvaraju C-C veze, pri čemu kao intermedijeri
nastaju šećeri sa brojem C-atoma od 3 do 7. Ove reakcije katalizuju dva enzima: transaldolaza i
transketolaza. Transaldolaza prenosi jedinice od 3 C-atoma sa ketoze na aldozu. Slično tome,
transketolaza katalizuje transfer jedinica od 2 C-atoma, u prisustvu tiamin-pirofosfata kao koen-
zima. Proizvodi ove faze su intermedijeri glikolitičkog puta fruktoza-6-fosfat (F6P) i gliceraldehid-
3-fosfat (GAP):
R5P + 2Xu5P • F6P + GAP
Enzimske reakcije druge i treće faze su potpuno reverzibilne tako da se smer njihovog odvijanja
može prilagoditi trenutnim potrebama ćelije, pa se fosfoglukonatni put zbog toga odlikuje izuzetnom
metaboličkom fleksibilnošću.
Katabolizam fruktoze
Postoje dva različita metabolička puta kojima se fruktoza uključuje u glikolitički put. Jedan od njih
se odvija u mišićnim ćelijama, a drugi u ćelijama jetre; u njima učestvuju različiti enzimi i nastaju raz
ličiti intermedijeri glikolize.
HOCH., CHoOH
0-
OH
HO H
Fruktoza
Fruktoza-1-fosfat Fruktoza-1-fosfat
HO H
fruktoza-1 -fosfat 2
Fruktoza-6-fosfat
aldolaza
CH2OH
w,
NADH NAD+ I
H— C = 0 H—C —OH
. I I
ATP H-C—OH CH2OH
ADP I alkohol-
3, CH2OH
-C=0 glicer- dehidrogenaza Gliceroi ^
I aldehid Gliceraldehid
-C—OH ATP
kinaza
CH2OPO|- glicerol
5
kinaza
GliceraIdehid-3-
fosfat ADP
glicerol-fosfat
dehidrogenaza
CH2OH
I
+
NADH NAD H—C—OH
Dihidroksi- CH2OPO|-
aceton
fosfat GHcerol-3-fosfat t/
Katabolizam galaktoze
Po svojoj strukturi, galaktoza i glukoza su epimeri, koji se međusobno razlikuju samo po konfigu
raciji na C4 atomu. Kako su glikolitički enzimi specifični za konfiguraciju glukoze, galaktoza može da
se uključi u glikolizu tek posle epimerizacije u položaju 4. Za konverziju galaktoze u glikolitički inter
medijer (glukoza-6-fosfat, G6P), potrebno je dejstvo četiri enzima (Slika 12-12):
12-18 Opšta biohemija
H OH CH2OH
CHjpH ATP ADP 9 2
HO Jr— O v H , .. 4 HO yi Ov H H /H-Ov H
VJZ_ IX H \ j o o
IV OH B.A 8 «
OH Galakto- H OPOI" H O \ _ - / O —P—O—P- -o—Uridin.
kinaza I I !
H OH O"
H OH H OH
Galaktoza Galaktoza-1 -fosfat UDP-Glukoza
„ I galaktoza-1-fosfat UDP-galaktoza- 3
CH*OH
HO A Ov H
o o
. II II
HO ^i i^ OP05 o—P—o—P—o - Uridin
l
H OH H 011 0~ O-
Glukoza-1-fosfat(G1P) UDP-Galaktoza
V
fosfoglukomutaza
CH2OPOf~
HO ^ ^ OH
H OH
Glukoza-6-fosfat
(G6P)
(1) Galaktoza se najpre fosforiliše u položaju 1 pod dejstvom galaktokinaze, uz utrošak ATP-a.
(2) Stvoreni galaktoza-1-fosfat reaguje sa UDP-glukozom. Pod dejstvom enzima galaktoza-1-
fosfat uridil-transferaze, uridil-grupa UDP-glukoze prenosi se na galaktoza-1-fosfat, pri čemu
nastaje UDP-galaktoza i glukoza-1-fosfat (G1P). Urođeni nedostatak ovog enzima dovodi do
nagomilavanja galaktoza-1-fosfata i drugih metabolita koji su toksični i izazivaju teško nasledno
oboljenje, galaktozemiju.
(3) Regeneracija UDP-glukoze koja omogućuje dalje funkcionisanje ovog metaboličkog puta obez-
beđuje se dejstvom enzima UDP-galaktoza-4-epimeraze, koja katalizuje epimerizaciju UDP-
+
galaktoze na C4 atomu. Za ovu reakciju je potrebno prisustvo NAD (najpre dolazi do oksidacije,
+
a zatim do redukcija na C4 atomu), ali se NAD ne troši u toku reakcije.
(4) Produkt reakcije (2), G1P, konvertuje se u prisustvu fosfoglukomutaze u'intermedijer glikolize,
G6P.
Katabolizam manoze
Manoza je uobičajena komponenta glikoproteina, a po strukturi je C2-epimer glukoze. Pos
redstvom dva enzima, heksokinaze i fosfomanoza-izomeraze, manoza se konvertuje u fruktoza-6-
fosfat (F6P) i uključuje u glikolizu (Slika 12-13).
Z. Jelić-lvanović: Katabolizam ugljenih hidrata 12-19
CH 2 OH CHoOPOŠ"
ATP ADP
H A—— Ox H
W ,
heksokinaza fosforna noza-
-2,O
3 P0CH 2 0
H HO.
CH2OH
D. KATABOLIZAM GLIKOGENA
Kako je glukoza glavni izvor energije svake ćelije, a u normalnim uslovima praktično jedini izvor
energije ćelija mozga, organizam čoveka i viših životinja štiti se od nedostatka te hranljive materije
skladištenjem u formi polisaharida glikogena. Stvoreni glikogen se po potrebi razlaže metaboličkim
putem koji se naziva glikogenoliza. Naravno, skladištenje slobodne glukoze u ćelijama nije moguće,
jer bi glukoza, kao osmotski aktivna supstanca dovela do bubrenja ćelije i rupture plazma-membrane.
Glikogen se skladišti pretežno u jetri i mišićima, u vidu citoplazmatičnih granula. Svaka granula sadr
ži po jedan veliki molekul polisaharida koji u svojoj strukturi sadrži i do 120000 ostataka glukoze. U
mišićnim ćelijama može da se uskladišti maksimalno 1 - 2% glikogena (u odnosu na masu tkiva), a u
nedostatku glukoze njegovim razlaganjem se obezbeđuje energija za potrebe samog mišićnog tkiva.
Maksimalan sadržaj glikogena u jetri je veći (do oko 10%), a jetreni glikogen služi za dobijanje gluko
ze, odnosno energije za potrebe celog organizma: glikogenoliza u jetri može da zadovolji energetske
potrebe organizma za period od oko 12 sati. Granule glikogena takođe sadrže i enzime koji učestvuju
u njegovom metabolizmu, kao i neke enzime koji regulišu te procese.
Glikogenoliza se odvija na taj način što se sa neredukcionih krajeva polimera odvaja jedan po je
dan ostatak glukoze. Kako molekul glikogena ima razgranatu strukturu (Slika 12-14), sa samo jednim
jedinim redukcionim krajem (u unutrašnjosti granule) i mnogo neredukcionih krajeva (po jedan na
kraju svake grane), iz svakog molekula se za kratko vreme može dobiti veliki broj ostataka glukoze.
Neredukcioni
kraj
Redukcioni
kraj
Reakcije glikogenolize
Razlaganje glikogena do glukoza-6-fosfata (G6P) odvija se kroz tri reakcije uz učešće odgovara
jućih enzima: glikogen-fosforilaze (fosforilaze), fosfoglu kom utaže i enzima razgranjavanja glikogena.
Pod dejstvom enzima glikogen-fosforilaze (ili skraćeno fosforilaze), dolazi do fosforolize a(1 •4)
glikozidne veze na neredukcionom kraju glikogena, tako da nastaje glukoza-1-fosfat (G1P):
Na ovaj način fosforilaza skraćuje linearne lance glikogena za jedan po jedan ostatak glukoze, ali
može da deluje samo do mesta udaljenog od račve za četiri ostatka. Fosforilaza sadrži i kovalentno
vezan piridoksal-fosfat, koji je neophodan kofaktor u ovoj reakciji.
(2) Fosfoglukomutaza
Pod dejstvom fosfoglukomutaze, dolazi do konverzije produkta fosforilaze, G1P, u glikolitički in-
termedijer, glukoza-6-fosfat (GJ6P):
CH2OPC>3
OPO: OH
OH
Glukoza-1-fosfat Glukoza-1,6-difosfat Glukoza-6-fosfat
(G1P) (G1.6P) (G6P)
Mehanizam reakcije ovog enzima analogan je ranije opisanom mehanizmu glikolitičkog enzima
fosfoglicerat-mutaze (8. reakcija glikolize). Zato je za odvijanje reakcije neophodno prisustvo kataliti-
čke koncentracije glukoza-1,6-difosfata (G1.6P). G1.6P se ne troši u ovoj reakciji, a malu potrebnu
količinu obezbeđuje enzim fosfoglukokinaza, koji fosforiliše G1P na C6 atomu uz utrošak ATP-a.
Kako fosforilaza ne može da razloži linearne lance glikogena sve do mesta račvanja, enzim raz
granjavanja glikogena vrši transfer tri ostatka glukoze vezana a(1->4) glikozidnim vezama na drugi
neredukcioni kraj dužeg linearnog lanca (Slika 12-15). Na taj način se omogućuje dalja hidroliza
a(1->4) veza. Opisana aktivnost u transferu trisaharidnog ostatka na kraj drugog lanca odgovara ak
tivnosti a(1->4) glikozil-transfemze i za nju je odgovoran jedan aktivni centar enzima. Međutim, en
zim razgranjavanja glikogena ima u svom molekulu i drugi aktivni centar sa aktivnošću a(1->6) glu-
kozidaze, tako da isti enzim katalizuje i hidrolizu a(1->6) glikozidne veze, čime se odvaja i poslednji
ostatak glukoze te grane glikogena.
Z Jelić-lvanović: Katabolizam ugljenih hidrata 12-21
* M>,
Spoljašnji lanci glikogena
/*""
enzim razgranjavanja
glikogena
raspoloživo za
dalju fosforolizu
Slika 12-15. Dve reakcije koje katalizuje enzim razgranjavanja glikogena: transfer tri-
saharidne jedinice koja se više ne može hidrolizovati pod dejstvom fosforilaze na
neredukcioni kraj drugog lanca (aktivnost cc(1-»4) glikozil-transferaze) i odvajanje
preostalog ostatka glukoze hidrolizom <x(1->6) glikozidne veze (aktivnost a(1->6) gli-
kozidaze).
G6Paza °x H
+ H20 + H 3 PQ 4
opn f OH om r OH
H OH H OH
Glukoza-6-fosfat (G6P) Glukoza
Regulacija glikogenolize
Brzina glikogenolize zavisi od aktivnosti fosforilaze, koja je regulisana putem kompleksnog sis
tema u kojem dolazi do interakcije efekta alostemih modulatora i hormonski regulisane kovalentne
modifikacije enzima fosforilacijom, odnosno defosforilacijom. Najpre ćemo videti na koji način alos-
12-22 Opšta biohemija
temi modulatori i kovalentna modifikacija enzima regulišu aktivnost glikogen-fosforilaze, a potom ob
jasniti kaskadni mehanizam hormonske kontrole fosforilacije/defosforilacije enzima.
2ATP 2ADP
T forma
(neaktivna)
R forma
(aktivna)
Fosforilaza b Fosforilaza a
Pod uobičajenim fiziološkim uslovima, koncentracije navedenih alosternih inhibitora (ATP, G6P,
glukoza) i aktivatora (AMP) su takve da aktivnost fosforilaze u najvećoj meri zavisi od brzine fosfori
lacije/defosforilacije enzima, pa se fosforilaza b obično smatra neaktivnim, a fosforilaza a aktivnim
oblikom enzima. Zbog toga je potrebno da aktivnost enzima koji katalizuju fosforilaciju i defosforilaci-
ju bude regulisana u zavisnosti od potreba organizma, što je ostvareno posredstvom složenog kas-
kadnog sistema koji funkcioniše pod dejstvom hormona.
Z. Jelić-lvanović: Katabolizam ugljenih hidrata 12-23
PP:
M
OH OH
ATP cAMP
cAMP
Neaktivna
cAMP-zavisna
protein-kinaza
k.
Glikogen Glukoza-
1-fosfat
Glukoza-
6-fosfat
Aktivacija glikogenolize pod dejstvom glukagona i adrenalina je jedan od primera kaskadnih sis
tema hormonske regulacije metabolizma, koji funkcionišu tako da produkt svake reakcije aktivira sle-
deću reakciju u kaskadi. Kako su produkti reakcija kaskadnog sistema uglavnom enzimi, svaki aktivi
rani molekul enzima katalizuje aktivaciju velikog broja molekula enzima u sledećoj reakciji kaskade.
Na taj način dolazi do mnogostrukog "pojačanja signala": jedan jedini molekul hormona prouzrokova-
će oslobađanje ogromnog broja ostataka glukoze iz strukture glikogena. Pored toga, složeni kaskad-
ni putevi omogućuju finu regulaciju metaboličkog puta, jer je svaki enzim kaskade podložan aktivaciji
ili inhibiciji pod dejstvom različitih faktora.
Pored opisanog mehanizma aktivacije fosforilaze pod dejstvom hormona, postoje i hormonski
regulisani inhibitorni mehanizmi koji sprečavaju glikogenolizu onda kada ima dovoljno glukoze, od-
. nosno energije. Jednom aktivirana glikogen fosforilaza ne ostaje trajno u obliku fosforilaze a, već se
l može konvertovati u neaktivnu fosforilazu b pod dejstvom enzima fosfoprotein-fosfataze-1, koja
* hidrolizuje fosfoestarsku vezu u molekulu fosforilaze a. Aktivnost ove fosfoprotein-fosfataze regulisa-
na je pod dejstvom glukagona i adrenalina s jedne, i insulina s druge strane.
Z. Jelić-lvanović: Katabolizam ugljenih hidrata 12-25
ATP ? ADP
Ca»2+
ATP T ADP
Ser 14— CH2OH Serl4-~CH 2 ~0-
Glikogen- V - < Gllko8en .
fosforilaza b fosfor! laza a
•*M»~vfei«w^q&H»«>%wfe(j^>"
Pi f H20 f m
:
Slika 12-19. Šematski prikaz interakcija mehanizama aktivacije i inhibicije mišićne glikogen-
fosforilaze kovalentnom modifikacijom (fosforilacijom/defosforilacijom) enzima.
Poglavlje 13.
Ciklus limunske kiseline
U prethodnom poglavlju je opisano kako se, u toku glikolize, glukoza anaerobno katabolizuje do
piruvata, pri čemu se oslobađa energija. Međutim, katabolizam glukoze se time ne završava, jer do-
bijeni piruvat u svojoj strukturi sadrži veliku količinu hemijske energije. U aerobnim uslovima i u aero-
bnim ćelijama, piruvat se konvertuje u acetil-koenzim A i uključuje u drugu, aerobnu fazu katabolizma
u kojoj se oksiduje do krajnjih produkata, ugljen-dioksida i vode. Ova oksidacija se vrši u mitohondri-
jama i to kroz sledeće procese:
1. Oksidacija acetil-koenzima A (acetil-KoA) u ciklusu limunske kiseline (CLK) uz stvaranje jed
nog od krajnjih proizvoda katabolizma, ugljen-dioksida. Elektroni dobijeni oksidacijom acetil-
koenzima A redukuju koenzime NAD+ i FAD do NADH i FADH2.
2. NADH i FADH2 reoksiduju se tako što predaju elektrone respiratornom lancu, složenom siste
mu koji se sastoji iz više komponenti, a lokalizovan je u unutrašnjoj membrani mitohondrija. Res
piratorni lanac vrši transport elektrona sa NADH, odnosno FADH2 do molekularnog kiseonika
kao finalnog akceptora, pri čemu nastaje voda, kao drugi krajnji produkt aerobnog katabolizma.
Transport elektrona duž respiratornog lanca praćen je oslobađanjem velike količine energije, koja
se u procesu oksidativne fosforilacije koristi za stvaranje ATP-a.
Treba odmah napomenuti da ciklus limunske kiseline i transport elektrona uz oksidativnu fosfori-
laciju ne služe samo za aerobno razlaganje glukoze i drugih ugljenih hidrata po njihovom uključivanju
u glikolizu. Naprotiv, ovi procesi predstavljaju zajedničke puteve katabolizma svih hranljivih materi
ja: proteina, ugljenih hidrata i lipida (Slika 12-1). Način uključivanja lipida i proteina u ove procese,
biće detaljnije opisan u odgovarajućim poglavljima (Katabolizam lipida - Poglavlje 16 i Katabolizam
azotnih jedinjenja - Poglavlje 17).
Ciklus limunske kiseline (ciklus trikarboksilnih kiselina ili Krebs-ov ciklus), odvija se uz učešće
osam različitih enzima, od kojih se sedam nalaze u matriksu mitohondrija, dok je samo jedan (sukci-
nat-dehidrogenaza) vezan za unutrašnju mitohondrijalnu membranu. Iz samog naziva ovog metabo
ličkog puta uočava se njegova ciklična priroda, koji proizilazi iz činjenica da je produkt poslednje en-
zimske reakcije CLK, oksalacetat, ujedno i jedan od supstrata enzima koji katalizuje prvu reakciju
(Slika 13-1). Za normalno odvijanje ciklusa limunske kiseline, neophodno je prisustvo katalitičkih
koncentracija oksalacetata, jer bez njega ne može da teče prva reakcija CLK; ovaj intermedijer se ne
troši, već se ista količina regeneriše na kraju svakog ciklusa.
13-2 Opšta biohemija
U okviru dve reakcije CLK dolazi do dekarboksilacije odgovarajućih intermedijera, što znači da se
pri jednom "okretu" CLK oba C-atoma acetil-grupe acetil-koenzima A izdvajaju kao C 0 2 Pored toga,
u četiri reakcije dolazi do oksidacije odgovarajućih intermedijera CLK pod dejstvom odgovarajućih
dehidrogenaza, pri čemu se dobijaju četiri para elektrona. Kao akceptor elektrona u tri od ove četiri
reakcije služi NAD + , a u jednoj FAD, pa se zato u svakom ciklusu tri molekula NAD + redukuju do
NADH, a jedan molekul FAD do FADH 2 .
Acetil-KoA
H,0
KoA-SH
Oksalacetat Citrat
NADH + H +
NAD +
L-Malat NAD +
+
NADH + H
KO
a-Ketoglutarat
Fumarat (oA-SH /
KoA
A\J^~ NAD
FADH, ~~~\f NADH + H +
KoA-SH
FAD Sukcinat Sukcinil-KoA
GTP GDP
Slika 13-1. Pregled reakcija ciklusa limunške kiseline. Osam enzima CLK obeleženo
je brojevima: 1 - citrat-sintaza, 2 - akonitaza, 3 - izocitrat-dehidrogenaza, 4 - a-
ketoglutarat dehidrogenaza, 5 - sukcinil-KoA sintetaza, 6 - sukcinat-dehidrogenaza,
7 - fumaraza i 8 - malat-dehidrogenaza.
B. STVARANJE ACETIL-KOENZIMA A
Struktura i metabolički izvori acetil-koenzima A
Kao što smo videli, u ciklusu limunške kiseline vrši se oksidacija acetil-grupe do ugljen-dioksida
uz redukciju odgovarajućih koenzima. Ova acetil-grupa mora da bude vezana za koenzim A koji služi
kao visokoenergetski nosač acetil- i drugih acil-grupa. Drugim recima, vezivanjem za koenzim A,
acetil grupa se obogaćuje energijom, "aktivira" se, čime se omogućuje njeno uključivanje u reakcije
CLK. Iz strukture acetil-KoA prikazane na Slici 13-2, vidi se da je acetil-ostatak vezan za koenzim A
visokoenergetskom tioestarskom vezom (AG°'hjciroiize = -31,5 kJ/mol).
Z. Jelić-lvanović: Ciklus limunske kiseline 13-3
Acetil-grupa
-C~~CH3
CH 2
Ostatak I *
|}-merkaptoetilamina CH 22
I
NH
;
l
C«0
I
CH 2 Adenozin-3'-
I fosfat
CH 2
I
Ostatak NH
pantotenske •< I
kiseline C =0
I
HO— C—H
I
HgC C CH3
CH 2 -
NAD"1
NADH + H"
O
II
C H 3 — C — S—KoA
Piru vat
Acetil-KoA
KoASH
Acetil-dihidrolipoamid
Slika 13-3. Konverzija piruvata u acetil-koenzim A pod dejstvom multienzimskog kompleksa pi
ruvat-dehidrogenaze. Piruvat-dehidrogenaza (E1) katalizuje reakciju 1 i 2, dihidrolipoil-
transacetilaza (E2) reakciju 3, a dihidrolipoil-dehidrogenaza (E3) reakcije 4 i 5.
Fizička povezanost tri enzima u multienzimski kompleks povećava efikasnost katalize, jer se
produkt jedne reakcije usmerava direktno na aktivni centar sledećeg enzima, pa nema potrebe da
difunduje do njega kao u slučaju rastvorljivih enzimskih sistema.
(aktivan) ATP
piruvat piruvat
dehidrogenaza dehidrogenaza-
fosfataza kinaza
^ m
HoO (neaktivan) ADP
U Tabeli 13-1 prikazan je pregled faktora koji regulišu aktivnost multienzimskog kompleksa piru
vat-dehidrogenaze i time određuju brzinu oksidativne dekarboksilacije piruvata u acetil-KoA.
Tabela 13-1. Pregled glavnih faktora koji regulišu aktivnost multienzimskog kompleksa pi
ruvat-dehidrogenaze.
Ciklus limunske kiseline odvija se u matriksu mitohondrija uz učešće ukupno osam različitih en
zima.
Acetil-KoA
S—KoA
I
c=o cocr
I H,0 KoA
CH3 I
+ V A CH,2
I
HO —C —COO"
coo- I
CH.2
I I
COO"
c=o
I Citrat
CH,
2
I
coo-
Oksalacetat
U reakciji dolazi do aldolne kondenzacije metil-grupe acetil-KoA i karbonilne grupe oksalacetata
(C-atomi koji potiču iz acetil-koenzima A prikazani su u reakciji masnim slovima). Reakcija citrat-
sintaze je praktično ireverzibilna i praćena je velikim padom slobodne energije (AG°'= -31,5 kJ/mol).
I c=o C o
HO—C —H I
I I
coo- coo- coo
Izocitrat Oksalsukcinat a-Ketoglutarat
COO-
I
CH,
! 2
CH,
2
I
C=0 KoASH CO, c=o
I I
COO- S—KoA
a-Ketoglutarat Sukcinil-KoA
Sadržaj energije GTP-a ekvivalentan je sadržaju energije ATP-a, pa GTP može da se konvertuje
u ATP pod dejstvom nukleozid-difosfat kinaze
Stvaranje GTP u ovoj reakciji predstavlja još jedan od primera fosforilacije na nivou supstrata,
kod koje se potrebna energija obezbeđuje oksidacijom supstrata.
COO- FAD
FADH2 I 9°°-
CH, V J C—H
,"2 ^ < » ||
CH, H—C
M I
COO- COO-
Sukcinat Fumarat
Ovu reakciju ne bi mogla da katalizuje NAD+-zavisna dehidrogenaza, zato što je redukcioni po
tencijal sukcinata nedovoljan za redukciju NAD+ do NADH1. Sukcinat-dehidrogenaza je jedini enzim
ciklusa limunske kiseline koji je vezan za unutrašnju membranu mitohondrija. To olakšava direktno
uključivanje elektrona sa FADH2 u transport elektrona respiratornim lancem (takođe u mitohondrijal-
noj membrani), pri čemu se regeneriše FAD i omogućuje oksidacija novih molekula supstrata.
coo- coo-
CI — H H O — CI — H
II + H2U -=— I
H—C CH 9
|
coo-
2
i
COO-
Fumarat L-Malat
(8) Oksidacija malata
COO- COO-
I I
HO—C—H C—O
| + NAD+ ^ | + NADH + H+
CH, CH,
I I
COO- coo-
L-Malat Oksalacetat
1
Kako se za redukciju FAD troši manje energije nego za redukciju NAD+, FADH2 je, posmatrano sa energetskog
aspekta "manje vredan". Zato se njegovom reoksidacijom, koja se vrši transportom elektrona do molekularnog
kiseonika, oslobađa manja količina energije nego pri reoksidaciji NADH (Poglavlje 14).
2 Jelić-lvanović: Ciklus limunske kiseline 13-9
U ovoj reakciji regeneriše se oksalacetat, koji će poslužiti kao jedan od supstrata u prvoj reakciji
sledećeg kruga CLK.. Pored toga, dolazi do transfera trećeg para elektrona sa supstrata, L-malata,
na NAD+.
U ćelijama postoje dva izoenzima malat-dehidrogenaze: mitohondrijalni i citoplazmatični. Oba
izoenzima katalizuju istu reakciju, ali imaju različite uloge. Citoplazmatični izoenzim naravno ne učes
tvuje u ciklusu limunske kiseline koji se odvija u mitohondrijama, već je sastavni deo šatl-sistema koji
vrši transport redukcionih ekvivalenata (NADH) kroz mitohondrijalnu membranu (Poglavlje 14).
Na Slici 13-5 dat je šematski prikaz celokupnog CLK, na kojem se mogu bolje uočiti mesta dejs-
tva pojedinih metabolita koji regulišu brzinu ovog puta. Bez obzira na veliki broj regulatornih faktora,
može se reći da brzina ciklusa limunske kiseline najviše zavisi od koncentracije acetil-KoA, oksalace-
tatajsupstrati CLK) i NADH (produkt CLK).
Videli smo da je ciklus limunske kiseline deo aerobne faze katabolizma u kojoj se dobija velika
količina energije. U samom CLK se dobija samo jedan molekul ATP (kao GTP), ali nastaje i NADH
koji se reoksiduje u respiratornom lancu uz oslobađanje velike količine energije. Ta energija se koristi
u procesu oksidativne fosforilacije za stvaranje velikog broja molekula ATP-a (Poglavlje 14). Zato je
logično da se ciklus limunske kiseline uspori ako je koncentracija NADH i ATP-a u ćeliji visoka, što
objašnjava fiziološki značaj inhibitornog dejstva ovih jedinjenja na CLK.
Fiziološki značaj regulatornih efekata jona Ca 2+ u metabolizmu već je objašnjen na primeru nje
govog uticaja na metabolizam glikogena (Poglavlje 12). U aerobnoj fazi katabolizma, Ca 2+ deluje kao
aktivator kompleksa piruvat-dehidrogenaze i samog ciklusa limunske kiseline. I u ovom primeru evi
dentan je značaj ovog regulatornog efekta u mišićnim ćelijama: isti jon koji dovodi do kontrakcije mi
šića, ujedno obezbeđuje energiju potrebnu za kontrakciju aktivacijom aerobnog metabolizma.
Pir u vat
2+
Ca'
\ jfcgttHCoA
Oksaiacetat
Fumarat
GTP Sukcinil-KoA
11- ;'
ATP v
Slika 13-5. Regulacija ciklusa limunske kiseline (inhibitorni efekti su prikazani isprekidanim
linijama i znakom -, a aktivacioni znakom +). Na slici je prikazan i uticaj metabolita i regula
tora CLK na reakciju piruvat-dehidrogenaze.
Z Jelić-lvanović: Ciklus limunske kiseline 13-11
Videli smo da ciklus limunske kiseline predstavlja značajan deo aerobnog katabolizma svih bio-
molekula. Pored ove primarne funkcije, on ima važnu ulogu i u mnogim anaboličkim putevima: neki
intermedijeri koji se stvaraju u CLK koriste se kao supstrati u određenim biosintezama. Tako se npr.
citrat koristi za sintezu masnih kiselina i holesterola2, a-ketoglutarat i oksalacetat za stvaranje nekih
aminokiselina, sukcinil-KoA za biosintezu porfirina, a malat za sintezu glukoze3 (Slika 13-6). Zbog
toga se ciklus limunske kiseline često naziva amfiboličkim putem.
C0 2 Piruvat
Glukoza Oksal;
Oksalacetat Holesterol
Aspartat M a i a t Citrat
Fenilalanin
Tirozin v
Fumarat Izocitrat
Sukcinat
Sukcinil-KoA a-Ketoglutarat
Portiri ni
Aminokiseline
Izoleucin
Metionin
Valin
Masne kiseline
sa neparnim brojem
ugljenikovih atoma
Slika 13-6. Šematski prikaz CLK na kojem je prikazana uloga nekih intermedi-
jera kao supstrata u sintezi određenih biomolekula (strelice usmerene od CLK
napolje). Anaplerotske reakcije nadoknađuju metabolite utrošene za anaboli-
zam (strelice usmerene ka ciklusu).
Korišćenjem intermedijera ciklusa limunske kiseline u biosintetskim putevima dovodi do pada nji
hove koncentracije u ćeliji, koji bi mogao da bude toliki da onemogući dalji tok CLK. Međutim, ćelija
ma je energija potrebna za normalno obavljanje vitalnih funkcija, a i same biosinteze koje polaze od
intermedijera CLK zahtevaju utrošak energije. Zbog toga, katabolička funkcija ciklusa ne srne da bu-
Masne kiseline i holesterol sintetišu se u citozolu iz acetil-KoA. Acetil-KoA nastaje u mitohondrijama, ali ne
prolazi kroz mitohondrijalnu membranu. Citrat sintetisan u reakciji citrat-sintaze (prva reakcija CLK) prelazi u
citozol, gde se razlaže do acetil-KoA i oksalacetata (detaljnije u Poglavlju 18).
3
Biosinteza glukoze se odvija u citozolu i polazi od oksalacetata kao supstrata. Međutim, oksalacetat ne prolazi
kroz membranu mitohondrija, ali malat prolazi u citozol, gde se vrši njegova konverzija u oksalacetat (detaljnije u
Poglavlju 17).
13-12 Opšta biohemija
Piruvat-karboksilaza je alostemi enzim čiji je glavni aktivator acetil-koenzim A. Kada se zbog ne
dostatka oksalacetata, CLK uspori, acetil-KoA se ne razlaže normalnom brzinom, pa njegova kon
centracija u mitohondrijama raste. To aktivira piruvat-karboksilazu koja stvara oksalacetat i time
omogućuje normalan tok ciklusa.
Sem u reakciji piruvat-karboksilaze, intermedijeri ciklusa limunske kiseline nastaju i kao produkti
katabolizma nekih biomolekula:
1. a-Ketoglutarat i oksalacetat nastaju iz nekih aminokiselina u reverzibilnim reakcijama. Smer tih
reakcija zavisi od metaboličkih potreba: iste reakcije mogu da troše navedene intermedijere za
biosintezu aminokiselina ili da ih nadoknađuju degradacijom aminokiselina.
2. Oksidacijom masnih kiselina sa neparnim brojem ugljenikovih atoma nastaje sukcinil-KoA (Po
glavlje 15).
3. Sukcinil-KoA je takođe produkt katabolizma aminokiselina izoleucina, metionina i valina.
154
Poglavlje 14.
Respiratorni lanac i oksidativna fosforilacija
Još u osamnaestom veku bilo je poznato da životinje troše kiseonik i stvaraju C0 2 . Međutim, tek
u dvadesetom veku je utvrđeno da se to dešava u toku oksidacije intermedijera metabolizma uz uče
šće ćelijskih enzima lokalizovanih u mitohondrijama. Zbirna reakcija potpune oksidacije glukoze u
prisustvu molekularnog kiseonika može se predstaviti na sledeći način:
C 6 H 1 2 0 6 + 6 0 2 -> 6C0 2 + 6H 2 0
Ovu reakciju možemo rastaviti na dve komponente, odnosno polureakcije: (a) - polureakciju oksidaci
je glukoze i (b) - polureakciju redukcije molekularnog kiseonika:
(a) C 6 H 1 2 0 6 + 6H 2 0 -> 6C0 2 + 24H + + 24e"
(b) 6 0 2 + 24H + + 24e -> 12H 2 0
U toku glikolize i ciklusa limunske kiseline, glukoza je oksidovana do ugljen-dioksida, što bi od
govaralo događajima prikazanim u polureakciji (a). Elektroni preuzeti sa odgovarajućih intermedijera
ovih kataboličkih puteva transportuju se do molekularnog kiseonika uz stvaranje vode, što odgovara
polureakciji (b). Transport elektrona se vrši posredstvom respiratornog lanca, složenog sistema loka-
lizovanog u unutrašnjoj membrani mitohondrija. Energija koja se oslobađa pri transportu elektrona
koristi se za stvaranje ATP-a u procesu oksidativne fosforilacije.
U polureakcijama (a) i (b) prikazani su slobodni elektroni, koji su u prvom slučaju proizvod reakci
je, a u drugom reaktant. Naravno, elektroni se ne javljaju u živoj ćeliji u slobodnoj formi, već ih u od
govarajućim redoks-reakcijama preuzimaju NAD+ ili FAD. Dakle, redukovani oblici ovih koenzima,
NADH i FADH2 sadrže u svojoj strukturi elektrone koji će se uključiti u respiratorni lanac, pri čemu će
doći do reoksidacije koenzima1.
1
Kako FADH2 ima manju negativnu vrednost redukcionog potencijala od NADH, odnosno manji sadržaj ener
gije, pri reoksidaciji FADH2 transportom elektrona respiratornim lancem oslobađa se manja količina energije
nego pri reoksidaciji NADH. Energija oslobođena reoksidacijom molekula NADH koristi se u procesu oksidativne
fosforilacije za sintezu tri molekula ATP-a, dok se oksidacijom FADH2 dobijaju samo dva.
14-2 Opšta biohemija
panja heksoze na dve trioze, to znači da se od svakog molekula glukoze koji prođe glikolizu do piru
vata stvara po dva molekula NADH (Slika 14-1).
Sledeća reakcija u kojoj se stvara NADH je reakcija konverzije piruvata u acetil-KoA, koju katali-
zuje multienzimski kompleks piruvat-dehidrogenaze. Kako se iz svakog molekula glukoze dobijaju
dva molekula piruvata, u ovoj reakciji nastaju dva molekula NADH. U samom ciklusu limunske kiseli
ne učestvuju tri NAD-zavisne dehidrogenaze i jedna koja sadrži FAD kao prostetičnu grupu (Poglav
lje 13). Dakle, u tri reakcije CLK stvara se NADH, a u jednoj FADH2, što znači da se u ciklusu limun
ske kiseline dobija 6 molekula NADH i dva molekula FADH2 za svaki molekul glukoze.
Glikoliza
Glukoza
I
Glukoza-6-fosfat
I
2 Gliceraldehid-3-fosfat
gliceraldehid 2NAD+
-3-fosfat (
dehidrogenaza ^ 2 N A D H
2 1,3-Difosfoglicerat
2 Piruvat
piruvat-
dehidrogenaza
2NADH
^ \2 Oksalacetat
2NAD+ \ ^
\ y w 2Citrat
7 dehidrogenaza
f
2Malat
2Fumarat CLK
\
2lzocitrat
izocitrat- 1
dehidrogenaza v
+
2FADH 2 ^ T sukdnat-
sukd 2NAD
2FAIT
y\ '\ dehi
dehiddrogenaza
2Sukcinat a-ketoglutarat- 0 , 2
A-
F N A D H
X dehidrogenaza 2a-Ketoglutarat
2Sukcinil-KbA
2NAD+
2NADH
Glicerol-fosfatni šatl-sistem
Glicerol-fosfatni šatl-sistem zasniva se na funkciji dva izoenzima 3-fosfoglicerol dehidrogena
ze. Citoplazmatični izoenzim je NAD+-zavisna dehidrogenaza i katalizuje reakciju NADH sa interme-
dijerom glikolize, dihidroksiaceton-fosfatom, pri čemu nastaje NAD+ i 3-fosfoglicerol (Slika 14-2, reak
cija 1). Mitohondrijalni izoenzim 3-fosfoglicerol dehidrogenaze lokalizovan je u unutrašnjoj membrani
mitohondrija. On ne koristi NAD kao koenzim, već sadrži FAD kao prostetičnu grupu. Pod dejstvom
ovog izoenzima, 3-fosfoglicerol stvoren u prvoj reakciji reoksiduje se do dihidroksiaceton-fosfata, a
FAD se redukuje do FADH2 (Slika 14-2, reakcija 2). Elektroni sa FADH2 sada mogu lako da se pre
daju respiratornom lancu, koji se naiazi u istoj membrani. Iz reakcija prikazanih na slici vidi se da se
pri funkcionisanju ovog šatl-sistema ne troše niti stvaraju, ni dihidroksiaceton-fosfat, ni 3-fosfoglicerol.
Takođe se vidi da ne dolazi do transporta samih molekula NADH iz jednog ćelijskog odeljka u drugi.
Prenose se samo elektroni sa NADH na FAD, a odatle u respiratorni lanac (citoplazmatični NADH se
oksiduje do NAD+ već u toku prve reakcije)2.
2
Kako se reoksidacijom FADH2 posredstvom respiratornog lanca dobijaju samo dva molekula ATP, ta količina
ATP-a se dobija i pri reoksidaciji citoplazmatičnog NADH čiji se elektroni transportuju u mitohondrije pos
redstvom glicerol-fosfatnog šatl-sistema.
14-4 Opšta biohemija
Unutrašnja
mitohondrijalna
_.. . ^ „membrana
Crtozol , .....
^ Matnks
Dihidroksiaceton-
fosfat
Respiratorni;
H 2 C—OH lanac -"S
I
C=0
2e~ H
+ CH2OPOf~
H + NADH
* FADHa^
3-Fosfoglicerol- OsfogKcer
dehidrogenaza idrogenažpj
avoproteni|
FAD
NAD+ H 2 C—OH
I
HO—C—H
I
CH 2 —OPOf
3-Fosfoglicerol
Malat-aspartatni šatl-sistem
Malat Malat
1
NAD+
NAD" -^
malat-dehidrogenaza 3 malat-dehidrogenaza
+ ^ NADH + H+
H + NADH
a-Ketoglutarat
Oksalacetat Oksalacetat
aspartat- aspartat-
aminotransferaza aminotransferaza
Aspartat Aspartat
Vidi se da i pri funkcionisanju ovog šatl-sistema ne dolazi do promene koncentracije bilo kog in-
termedijera u dva ćelijska odeljka, već se jedina promena sastoji u tome da se u svakom krugu po
jedan molekul NADH u citozolu oksiduje do NAD+, a po jedan molekul NAD+ u matriksu mitohondrija
redukuje do NADH3.
Kako su sve reakcije koje se odvijaju u okviru ovog šatl-sistema reverzibilne i kako oba transpor
tna sistema mogu da funkcionišu u oba smera, sistem može da funkcioniše i u obrnutom smeru, što
se koristi u procesu biosinteze glukoze (Poglavlje 17).
Videli smo da se u glicerol-fosfatnom šatl-sistemu elektroni preuzeti sa NADH prenose u mitohondrije pos
redstvom FADH2, zbog čega se pri njegovoj reoksidaciji respiratornim lancem stvaraju samo dva molekula ATP-
a. U slučaju malat-aspartatnog šatla, elektroni dobijeni iz citoplazmatičnog NADH koriste se za stvaranje NADH
u mitohondrijama. Dakle, ako se NADH nastao u mitohondrijama uključuje u respiratorni lanac posredstvom
ovog šatl-sistema, u procesu oksidativne fosforilacije će se dobiti po tri molekula ATP-a za svaki molekul reoksi-
dovanog NADH.
14-6 Opšta biohemija
Ubihinon (koenzim Q) je jedina komponenta respiratornog lanca koja po svojoj strukturi nije pro
tein. To je liposolubilno jedinjenje, supstituisani hinon sa jednim karakterističnim hidrofobnim lancem
sastavljenim od većeg broja izoprenskih jedinica (Slika 14-5b). Broj izoprenskih jedinica u ovom boč
nom lancu različit je kod raznih organizama. Kod sisara, bočni lanac ubihinona se sastoji od deset
izoprenskih jedinica, pa se takav koenzim Q obeležava kao Qi 0 .
Slično flavin-mononukleotidu, i ubihinon u redoks reakcijama prolazi kroz tri oksidaciona stanja:
hinonski (oksidovan), semihinonski (radikal) i hidrohinonski (redukovan) oblik (Slika 14-5). Zato, kao i
FMN, i koenzim Q prenosi po dva elektrona, ali zahvaljujući postojanju tri oksidacione forme, ima
sposobnost da reaguje i sa akceptorom koji može da primi samo jedan elektron. To je bitno za nje
govu funkciju u respiratornom lancu, u kojem predaje elektrone određenom citohromu.
Z Jelić-lvanović: Respiratorni lanac i oksidativna fosforilacija 14-7
!
[**•] 1 [H*J
a^
R
H3CV,
CH3
I
(CH 2 —CH=C —CH 2 ) n H
H3C'
i "
H © Koenzim QH», ubisemihinon
FMNH« (radikal, semihinonski oblik) (radikal, semihinonski oblik)
[H>]
|[H.]
m
R H
1 I
H3CV CH3
I
i .Nf. H3CO (CH 2 —CH=C — CH2)n H
H3C-J^S?^Y-N H
O OH
H
Koenzim QH2, ubihinol
FMNH2 (redukovan, hidrohinonski oblik) (redukovan, hidrohinonski oblik)
Proteini sa nehemskim gvožđem imaju u svojoj strukturi skupove atoma gvožđa i sumpora, koji
imaju ulogu prostetične grupe u redoks-reakcijama. Atomi gvožđa i sumpora organizovani su na ka
rakterističan način, tako da se najčešće nalaze skupovi koji sadrže po dva [2Fe-2S], ili po četiri ato
ma svakog od ova dva elementa [4Fe-4S]. Na Slici 14-6 prikazana je struktura feredoksina, sa dva
[4Fe-4S] centra. Vidi se da je svaki atom gvožđa koordinativno vezan za četiri atoma sumpora, od
kojih jedan pripada -SH grupi cisteinskog ostatka polipeptidnog lanca. Dakle, svaki [4Fe-4S] centar je
koordinativno vezan za proteinski deo molekula preko četiri ostatka cisteina.
14-8 Opšta biohemija
Pri redoks-reakcijama dolazi do promene oksidacionog stanja gvožđa iz +2 u +3 ili obrnuto. Me
đutim, atomi gvožđa u [Fe-S] centrima ne učestvuju u redoks-reakcijama pojedinačno, već ceo cen
tar deluje kao konjugovan sistem koji daje ili otpušta po jedan elektron: [4Fe-4S] centar u oksidova-
nom stanju sadrži jedan Fe(ll) i tri Fe(lll), a u redukovanom stanju dva Fe(ll) i dva Fe(lll) atoma.
Sem što služe kao prostetične grupe proteinima sa nehemskim gvožđem, [Fe-S]-centri se javljaju
i u drugim proteinima, npr. nekim flavoproteinima.
Citohromi
Citohromi su redoks-aktivni hemoproteini koji kao prostetičnu grupu imaju jedan od različitih tipo
va hema. Za razliku od hemoglobina, kod koga se pri vršenju funkcije (transporta kiseonika) ne me-
nja oksidaciono stanje gvožđa u hemu, gvožđe u prostetičnoj strukturi citohroma učestvuje u redoks-
reakcijama prelazeći iz Fe(ll) u Fe(lll) oblik ili obrnuto. Prema tome, svaki molekul citohroma može
da primi ili otpusti po jedan elektron u jednoj redoks-reakciji.
Svaki tip hema ima istu osnovnu strukturu: sadrži četiri pirolova prstena međusobno povezana
metenskim mostovima i atom gvožđa u centru, koordinativno vezan za atome azota pirolovih prste-
nova. Različiti supstituenti, karakteristični su za pojedine tipove hema, a time i grupe citohroma. Tako
citohromi b sadrže hem b koji je po strukturi gvožđe-protoporfirin IX, dakle ima istu prostetičnu grupu
kao hemoglobin. Protoporfirin IX kao supstituente ima metil-, vinil- i propionil ostatke u odgovarajućim
položajima (Slika 14-7). Hem a, prostetična grupa citohroma a razlikuje se od hema b po dugom hid-
rofobnom lancu koji se sastoji od izoprenskih jedinica u položaju 2 porfirina, kao i po vrsti supstituen-
ta u položaju 8. U citohromima c nalazi se hem c, koji se od protoporfirina IX razlikuje po karakteris
tičnoj tioetarskoj vezi koja povezuje proteinski deo citohroma sa supstituentima u položaju 2 i 4 he
ma.
Z. Jelić-lvanović: Respiratorni lanac i oksidativna fosforilacija 14.9
CH 3
CH2-f-CH2—CH = C — CH2 H
H,C- GH = C H 2
-N N
\ /
Fe3+
/ \
•CH3 H:1C
rf
CH 2 CH 2 CH, CH 2
CH 2 CH2 CH 2 CH 2
COO~ GOO" ćoo" COO~
Hem a Hem b
(gvožđe-protoporfirin IX)
CH~CH;j
CH2 CH 2
CH2 CH 2
COO COO
Hem c
H->a ^ « _
f
CH.
N - » -N
HN^/ I ^.NH
Hi« His
Hem a i hem b
H2C
H2C | /=55s^CH2
;s-f-Nv
7 N H
H3C 1 V-
Met His
Hem c
Slika 14-8. Koordinativne veze koje se formiraju između atoma gvožđa hema i
odgovarajućih aminokiselina proteinskog dela molekula citohroma a, b i c (sivo
osenčena površina predstavlja prostetičnu grupu sa atomom gvožđa u sredini).
D. TRANSPORT ELEKTRONA
Većina proteinskih komponenti respiratornog lanca organizovana je u četiri respiratorna komple
ksa koja učestvuju u transportu elektrona, a obeležavaju se rimskim brojevima od I do IV. Svaki
kompleks se sastoji od nekoliko proteina sa različitim redoks-aktivnim prostetičnim grupama i sa raz
ličitim redukcionim potencijalima. Jedino dve komponente, kne>m\m n i ritnhmm n fnn^mo/ftu ••
transportu^ipktrpna ^ m p ^ 3 ^ V an kompleksa. Respiratorni kompleksi, kao i koenzim Q i citohrom
c, mogu da se kreću lateralno unutar unutrašnje membrane mitohondrija.
Kao i u ostalim redoks-reakcijama, elektroni se i duž respiratornog lanca uvek prenose sa jedi-
njenja koje ima negativniju vrednost redukcionog potencijala (E), na jedinjenje sa pozitivnijom (ili ma
nje negativnom) vrednošću E. Razlika redukcionog potencijala reakcije može se predstaviti na slede-
ći način:
Što je veća razlika između redukcionih potencijala akceptora i donora elektrona, utoliko se pri re-
doks-reakciji oslobađa veća količina energije, pa se promena standardne slobodne energije redoks-
reakcije može prikazati izrazom:
AG0' = -nFAE 0 '
gde je n - broj elektrona koji se prenose u reakciji, a F - Faradejeva konstanta.
Kompleks I se sastoji od 26 subjedinica [Fe-S]-proteina i flavoproteina sa FMN kao prostetičnom
grupom. Ovaj kompleks prima elektrone od NADH i predaje ih koenzimu Q (Slika 14-9), odnosno
pokazuje aktivnost NADH-KoQ reduktaze:
4
Prostetične grupe citohroma u redukovanom stanju apsorbuju svetlost određenih talasnih dužina. Na ap-
sorpcionim spektrima svih citohroma uočavaju se tri karakteristična maksimuma apsorbancije koji se
Z. Jelić-lvanović: Respiratorni lanac i oksidativna fosfonlacija 14-11
Citohrom c
NADH FADH2 02
Koenzim Q zauzima posebno mesto u respiratornom lancu: on služi kao akceptor elektrona sa
NADH (preko kompleksa I) i sa FADH2 (preko kompleksa II). Dalji transport elektrona, od ubihinona
do molekularnog kiseonika kao konačnog akceptora, zajednički je za sve elektrone, bez obzira na
njihovo metaboličko poreklo (Slika 14-9).
Kompleks III sadrži deset subjedinica među kojima su zastupljene četiri vrste proteina: citohrom
jb562, citohrom 6566, protein sa nehemskim gvožđem i citohrom ci. Ovaj kompleks prima elektrone od
koenzima Q, a predaje ih sledećem proteinu respiratornog lanca, citohromu c, odnosno ima aktivnost
koenzim Q-citohrom c reduktaze:
KoQH2 + 2 citohrom c (oksidovan) • KoQ + 2 citohrom c (redukovan)
0
AE°' = 0,190 V AG ' = -36,7 kJ/mol
Citohrom c je periferni membranski protein, koji učestvuje* u respiratornom lancu tako što se re-
dukuje pod dejstvom kompleksa III, a reoksiduje posredstvom kompleksa IV.
Kompleks IV se sastoji od više subjedinica, a sadrži citohrom a, redoks-aktivne atome bakra
različitih redukcionih potencijala (koji prelaze iz Cu(l) u Cu(ll) oblik i obrnuto) i citohrom a3. Kompleks
pokazuje enzimsku aktivnost citohrom c-oksidaze, odnosno katalizuje oksidaciju citohroma c mole
kularnim kiseonikom:
Citohrom c (redukovan) + j 0 2 • citohrom c (oksidovan) + H 2 0
0
A£°' = 0,580 V AG ' =-112 kJ/mo!
obeležavaju sa a, p i X. Talasna dužina koja odgovara a-maksimumu karakteristična je za svaki pojedini ci
tohrom, pa se koristi za njihovo međusobno razlikovanje. Broj u indeksu pored oznake tipa citohroma označava
talasnu dužinu u nm koja odgovara a-maksimumu datog citohroma, što bi u navedenom primeru bilo 560 nm.
14-12 Opšta biohemija
Cijanidni jon inhibira aktivnost citohrom c-oksidaze i time koči proces transporta elektrona u celi-
ni. Nedostatak energije koju obezbeđuje respiracija u mitohondrijama dovodi do smrti ćelije, a najo-
setljivija su ona tkiva, koja zavise od aerobnog metabolizma, pre svega mozak.
E. OKSIDATIVNA FOSFORILACIJA
Pod pojmom oksidativna fosforilacija podrazumeva se stvaranje ATP-a uz korišćenje energije os
lobođene u toku transporta elektrona respiratornim lancem. Reakciju fosforilacije ADP-a do ATP-a
katalizuje enzim ATP-sintaza.
Videli smo da se transport elektrona od NADH i FADH2 do kiseonika odvija postepeno, posreds
tvom respiratornih kompleksa. Elektroni uvek prelaze sa komponente koja ima negativniju vrednost
standardnog redukcionog potencijala na komponentu sa manje negativnom, odnosno pozitivnijom
vrednošću, pri čemu se oslobađa energija. Količina oslobođene energije u svakoj fazi transporta sra-
zmerna je razlici redukcionih potencijala akceptora i donora elektrona.
-0,4- 200
Redukcioni
potencijal, AG0'
E
o' (kJ/mol)
(V)
0
100
+0,4
+0,8 ^2H20 - 0
Na slici 14-10, šematski su prikazane promene redukcionog potencijala i pad slobodne energije
pri transportu elektrona duž respiratornog lanca koje odgovaraju vrednostima AE0' i AG0' datih za
svaki od četiri respiratorna kompleksa u odeljku D ovog poglavlja. Kako vrednost AG0' hidrolize ATP-
a do ADP-a i neorganskog fosfata iznosi -30,5 kJ/mol (Poglavlje 11, Tabela 11-1), ista količina slo
bodne energije mora da se utroši za obrnutu reakciju stvaranja ATP-a iz ADP-a i neorganskog fosfa
ta:
ADP + P/ • ATP
AG 0 '= +30,5kJ/mol
U toku transporta elektrona od NADH do kiseonika, postoje tri redoks-reakcije u kojima se oslo
bađa dovoljna količina energije za fosforilaciju ADP-a do ATP-a i to: reakcija kompleksa I (AG0' = -
69,5 kJ/mol), kompleksa III (AG0' = -36,7 kJ/mol) i kompleksa IV (AG0' = -112 kJ/mol). Međutim, tran
sportom elektrona preuzetih sa FADH2 stvaraju se svega dva molekula ATP-a: kako FADH2 ima ma
nju negativnu vrednost redukcionog potencijala od NADH, a time i manji sadržaj slobodne energije,
Z. Jelić-lvanović: Respiratorni lanac i oksidativna fosforilacija 14-13
P-hidroksiacil-KoA.
,0-hidroksibutirat
išelina
fosforilacija
5
Ranije je objašnjeno da je mehanizam sličan ovom odgovoran za stvaranje ATP-a procesom fosforilacije na
nivou supstrata u glikolizi (Poglavlje 12).
14-14 Opšta biohemija
osnovnu konformaciju praćeno stvaranjem ATP-a. Međutim, ni ova hipoteza nije bila eksperimental
no potvrđena.
Hemiosmotska h i poteza, koju je izneo P. Mitchell 1961. godine, danas se smatra najboljim mo
delom koji objašnjava povezanost ova dva procesa, jer je potvrđena brojnim eksperimentalnim doka
zima. Prema ovoj hipotezi, za spregu nije odgovoran ni visokoenergetski intermedijer, ni konformaci-
ja, već jedno određeno visokoenergetsko stanje: elektrohemijski gradijent H+-jona koji se stvara iz
među dve strane unutrašnje membrane mitohondrija. Prema ovoj hipotezi, respiratorni lanac "ispum-
pava" H+-jone iz matriksa mitohondrija u međumembranski prostor, stvarajući elektrohemijski gradi
jent6 kroz unutrašnju membranu. Ova aktivnost respiratornog lanca prouzrokuje porast pH u matriksu
i pad pH u prostoru između unutrašnje i spoljašnje membrane. Elektrohemijski potencijal gradijenta
omogućuje sintezu ATP-a, koja je praćena "rušenjem" gradijenta, tj. izjednačavanjem koncentracija
H+-jona sa obe strane membrane. Postavljaju se dva pitanja:
1. Kako respiratorni lanac stvara elektrohemijski gradijent?
2. Kako se elektrohemijski potencijal gradijenta koristi za sintezu ATP-a?
(1) Stvaranje elektrohemijskog gradijenta
lako postoji više hipoteza, mehanizam "ispumpavanja" H+-jona kroz unutrašnju membranu mito
hondrija još uvek nije u potpunosti rasvetljen. Zna se da transport elektrona kroz komplekse I, III i IV
prouzrokuje transfer protona iz matriksa u međumembranski prostor (Slika 14-12). Kako ovaj transfer
teče iz oblasti niže u oblast više koncentracije vodonikovog jona i pozitivnog naeiektrisanja, za stva
ranje gradijenta se troši energija dobijena transportom elektrona posredstvom svakog od tri navede
na kompleksa.
Elektrohemijski gradijent čini gradijent koncentracije H+-jona povezan sa gradijentom pozitivnog naeiektrisanja
koje nose ti joni.
Z. Jelić-lvanović: Respiratorni lanac i oksidativna fosforilacija 14-15
ban transmembranski protein, sastavljen od više subjedinica različitih tipova koje formiraju kanal za
translokaciju H+-jona kroz membranu. F r jedinica je isturena ka matriksu, a sastoji se od devet globu-
larnih subjedinica, među kojima je zastupljeno pet različitih polipeptidnih lanaca, obeleženih grčkim
slovima a, P, y, 5 i e. Aktivni centar ATP-sintaze lokalizovan je na F r jedinici enzima.
Dakle, mehanizam fosforilacije ADP-a do ATP-a pod dejstvom ATP-sintaze mogao bi se up-
rošćeno predstaviti kroz tri procesa:
1. Translokacija H+-jona iz međumembranskog prostora u matriks mitohondrija, kroz kanal koji for
mira Fo-jedinica. U toku ovog transfera dolazi do narušavanja elektrohemijskog gradijenta H+-
jona.
2. Kataliza stvaranja fosfoanhidridne veze ATP-a pod dejstvom Frjedinice.
3. Sprega translokacije H+-jona kroz F0-jedinicu sa stvaranjem ATP-a pod dejstvom F^ čvrsta spre
ga između F0 i F r jedinica omogućuje ulazak H+-jona u matriks samo pod uslovom da se istov
remeno stvara ATP. Smatra se da pri prolasku H+-jona kroz kanal F0 dolazi do promene konfor-
macije F1( što omogućuje fosforilaciju ADP-a.
Kako kanal ATP-sintaze u mitohondrijama sa očuvanom strukturom i funkcijom membrane pred
stavlja jedini put kojim H+-joni mogu da uđu u matriks, procesi transporta elektrona i oksidativne fos
forilacije su čvrsto povezani. U slučaju oštećenja membrane, ili pod dejstvom nekih agenasa koji je
čine propusnom za H+-jone7, ovi joni prolaze kroz membranu mimo ATP-sintaze. U tom slučaju, tran
sport elektrona može da teče, ali se oslobođena energija ne može iskoristiti za sintezu ATP-a, već se
gubi u vidu toplote.
Poznato je da neki hemijski agensi, kao što je nrp. 2,4-dinitrofenol, dovode do raskidanja sprege transporta
elektrona sa oksidativnom fosforilacijom. Takvi agensi deluju kao jonofori koji transportuju H+-jone kroz mem
branu, pa dolazi do narušavanja gradijenta bez korisćenja njegovog elektrohemijskog potencijala za sintezu
ATP-a.
14-16 Opšta biohemija
Respiratorni
ATP-sintaza kompleksi
H+ H+
ADP ulazi u mitohondrije posredstvom ATP-ADP transportera, u zamenu za ATP, tako da ovaj
sistem antiporta istovremeno omogućava i izlazak ATP-a (Slika 14-14).
Neorganski fosfat ulazi u mitohondrije posredstvom fosfatnog transportera, koji funkcioniše kao
simport fosfata i H + -jona. Ulazak H + -jona smanjuje gradijent tog jona, stvoren aktivnošću respirator
nog lanca, što znači da ovaj transport praktično troši energiju oslobođenu transportom elektrona res
piratornim lancem. Fosfatni transporter nije jedini primer transporta ove vrste u unutrašnjoj membrani
mitohondrija, već postoje i drugi sistemi (npr. transport Ca 2 + -jona) koji vrše svoju funkciju na račun
energije respiratornog lanca.
Z. Jelić-lvanović: Respiratorni lanac i oksidativna fosforilacija 14-17
• Reoksidacija 10 niolekulaJJ£y|j^
Glikoliza u aerobnim uslovima: 2 NADH 8 6
Reakcija piruvat-dehidrogenaze: 2 x 1 NADH O 6
Ciklus limunske kiseline: 3 x 2 NADH ? J 18
• Reoksidacija 2 molekula££Qhfe 0 4
• ATP stvoren u glikolizi 2
• GTP stvoren u ciklusu limunske kiseline (GTP-»ATP) 2
Ukupno: 38
Kako oksidativna fosforilacija u potpunosti zavisi od energije koju obezbeđuje transport elektrona
respiratornim lancem, svaka promena aktivnosti respiratornog lanca će uticati na brzinu stvaranja
ATP-a. Kao i kod drugih metaboličkih puteva, i kod transporta elektrona glavno regulatorno mesto
predstavlja jedna ireverzibilna reakcija. U ovom slučaju, to je reakcija koju katalizuje citohrom c-
oksidaza (kompleUmt>^. Brzina ove reakcije u najvećoj meri zavisi od raspoloživosti jednog od njego
vih supstrata, redukovanog oblika citohroma c. Ako posmatramo transport elektrona i oksidativnu
fosforilaciju kao spregnute procese, onda stvaranje redukovanog oblika citohroma c na račun elek
trona sa NADH možemo prikazati sledećom reakcijom:
Ovaj broj molekula ATP-a podrazumeva da su elektroni sa citoplazmatičnog NADH stvorenog u glikolizi trans-
portovani u mitohondrije posredstvom malat-aspartatnog šatl-sistema,. Ako se elektroni prenose glicerol-
fosfatnim šatl-sistemom, ne dobijaju se po tri ATP-a po molekulu NADH, već dva, pa će ukupan prinos reoksi-
dacije NADH nastalog u glikolizi biti 4, što odgovara zbiru od ukupno 36, umesto 38 molekula ATP-a.
14-18 Opšta biohemija
Prema zakonu o dejstvu aktivnih masa, povećanje vrednosti odnosa [NADH]/[NAD+] i [ADP][P/]/
[ATP] pomera ravnotežu reakcije udesno, odnosno favorizuje stvaranje redukovanog citohroma c.
Time se ubrzava transport elektrona, a time i oksidativna fosforilacija. Pošto ADP ima ulogu akcepto-
ra fosforil-grupe u oksidativnoj fosforilaciji, brzina tog procesa raste sa porastom koncentracije ADP-
a; ovaj regulatorni efekat ADP-a naziva se akceptorska kontrola^
Masne kiseline i triacilgliceroli kao forma njihovog skladištenja, predstavljaju važan izvor energije
u organizmu. Dugolančane masne kiseline oksiduju se do ugljen-dioksida i vode u skoro svim tkivima
kičmenjaka, osim mozga. Međutim, pod određenim uslovima, mozak može da oksiduje p-
hidroksibutirat, intermedijer katabolizma masnih kiselina. Neka tkiva, kao što je npr. srčani mišić obe-
zbeđuju najveći deo energije oksidacijom masnih kiselina.
Hemijska energija sadržana u strukturi masnih kiselina oslobađa se u procesu tzv. p-oksidacije
masnih kiselina do acetil-KoA, koji se zatim oksiduje do ugljen-dioksida i vode u zajedničkim putevi-
ma katabolizma: CLK i transportu elektrona respiratornim lancem.
o O O O
// II II II
R—C + O — P — O — P — O — P—O—adenozin
\ I I I
~0 0~ O" 0~
Masna
ATP
kiselina
neorganska
pirofosfataza
pp . ^ 2 P,
KoASH
H20
O O
il _ II
R—C—SKoA + O — P — O—adenozin
l_
Acil-KoA °
AMP
Masne kiseline se aktiviraju tako, što na račun energije ATP-a reaguju sa koenzimom A, pri če
mu nastaje odgovarajući acil-KoA (Slika 15-1). Reakciju katalizuje grupa od najmanje tri enzima,
acil-KoA sintetaza (ili tiokinaza), koje se međusobno razlikuju prema specifičnosti u odnosu na du
žinu lanca masne kiseline koju aktiviraju. Tako npr. sintetaza acil-KoA dugolančanih masnih kiselina
katalizuje reakciju sinteze palmitoil-KoA. Acil-KoA sintetaze su vezane za endoplazmatični retikulum
ili spoljašnju membranu mitohondrija.
Za stvaranje tioestarske veze acil-koenzima A potrebna je veća količina energije od one koju
može da obezbedi odvajanje samo jednog (y) fosforil-ostatka ATP-a. Ovu energiju obezbeđuje piro-
fosfatno cepanje ATP-a (odvajanje p i y fosforil-ostataka, v. Poglavlje 11), a nastali pirofosfat razlaže
se dejstvom neorganske pirofosfataze, čime se ravnoteža reakcije pomera u korist sinteze acil-KoA.
Unutrašnja membrana mitohondrija nije permeabilna za acil-koenzime A većine masnih kiselina
(C12 do Cis), već se acil-grupa acil-KoA transportuje u mitohondrije posredstvom karnitinskog šatl-
sistema. U ovom sistemu učestvuju dva izoenzima karnitin-palmitoil transferaze, koji katalizuju
reverzibilnu reakciju transfera acil-grupe sa acil-KoA na karnitin, ili sa acil-karnitina na KoA:
OH O
I II
(CH 3 ) 3 N — CH 2 —CH—CH 2 —COO~ R—C—SKoa
Karnitin (4-trimetilamino-
3-hidroksibutirat)
karnitin-palmitoil transferaza
O
I!
R—C—O
+ I
(CH 3 ) 3 N — CH 2 —CH—CH 2 —COO" H —SKoA
Acil-karnitin
0 O
II
R — C—SKoA- Karnitin Karnitin R — C—SKoA
M Y karnitin-palmitoi skf-\; karnitin-palmitoil ^3
1 transferaza I transporter transferaza II 1
H—SKoA R — C— Karnitin -r*~ R — C—Karnitin H—SKoA
II
O O
Pregled p-oksidacije
H20-^
Respiratorni lanac
(kompleks I):
3 mola ATP/moi NADH
R-C-KoA + AcetH-KoA ^
II
O
• Aceti!-KoA
-• Acetil-KoA
Ciklus
•> Acetil-KoA
limunske
kiseline
-> Acetil-KoA
-*• AcetiS-KoA
• Acetil-KoA
Acetil-KoA j
Slika 15-3. (3-Oksidacija palmitoil-KoA. Pri svakom prolazu kroz niz od četiri reakcije, odvaja
se po jedan molekul acetil-KoA. Jedan molekul palmitinske kiseline (C16), posle aktivacije
sedam puta prolazi kroz taj niz reakcija, pri čemu nastaje ukupno osam molekula acetil-KoA.
Reakcije p-oksidacije
(1) Prva oksidacija. Pod dejstvom enzima acil-KoA dehidrogenaze, u prvoj reakciji dolazi do oksi
dacije na a- i p- ugljenikovim atomima acil-koenzima A:
FAD FADH,
R - C H 2 - C H 2 - C O - S -KoA - ^ ^ • R
R_-C
C==CC--CCOO--SS- -Klo A
I
H
Acil-KoA trans-A2 -enoil-Ko A
ATP ATP
e- e- 6 Kompleks e- Kompleks e-
FADH2 • ETF • KoQ • • • 02 |
III IV
(2) Hidratacija. Enzim enoil-KoA hidrataza katalizuje reakciju adicije vode na dvogubu vezu trans-
A2-enoil-KoA. Reakcija je stereospecifična, pa u njoj nastaje 3-L-hidroksiacil-KoA:
H
OIP
l p a
V 3 2 1
R-C = C - C O - S - K o A CO-S-KoA
I -^ • R-CH-CH,-(
I
H OH
2
frans-A -enoil-KoA 3-L-Hidroksiacil-KoA
Z Jelić-lvanović: Katabolizam lipida 15-5
(3) Druga oksidacija. U trećoj reakciji dolazi do oksidacije hidroksilne grupe L-hidroksiacil-KoA do
keto-grupe, uz redukciju NAD+ do NADH. Reakciju katalizuje 3-L-hidroksiacil-KoA dehidroge-
naza, koja je specifična isključivo za L-stereoizomer supstrata:
NADH
NAD4 + H+
3 a
R-CH-CH2-CO-S-KoA -^-^ • RR--CC- -C H 2 - C O - S - K o A
I II
OH O
3-L-Hidroksiacil-KoA p-Ketoacil-KoA
NADH se reoksiduje posredstvom respiratornog lanca, tako što predaje par elektrona respirator
nom kompleksu I:
(4) Odvajanje acetil-KoA. U poslednjoj reakciji svakog kruga p-oksidacije, p-ketoacil-KoA reaguje
sa molekulom slobodnog KoA i pri tome se čepa (na mestu obeleženom strelicom) na acetil-KoA
i acil-KoA skraćen za dva ugljenikova atoma. Reakciju katalizuje enzim p-ketoacil-KoA tiolaza,
ili kraće tiolaza:
KoA-SH
•C-
II
•CH 2 -C-S-KoA
II
1 R-C-S-KoA
II
+ CH C-S
" II
KoA
o O O o
P-Ketoacil-KoA Acil-KoA Acetil-KoA
(kraći za 2 C-atoma)
SKoA
Problem 1;
P,Y-dvoguba veza
SKoA
enoil-KoA izomeraza
SKoA
0
jedan krug p-oksidacije
NAD + + FAD + KoASH
+ prva oksidacija
NADH + FADH2 + Acetil-KoA sledećeg kruga
Problem 2;
A4-dvoguba veza
NADPH + IV 2,4-dienoil-KoA
NADP"1 A reduktaza
O
II
SKoA
3,2-enoil-KoA
izomeraza
O
II
G,
SKoA
Nastavak p-oksidacije
Skoro sve prirodne nezasićene masne kiseline sadrže samo c/s-dvogube veze, najčešće između
C9 i C10 (A9-dvoguba veza). Ako se u molekulu nalazi dve ili više dvogubih veza, one su raspoređe
ne u intervalima od po tri C-atoma, dakle nikada nisu konjugovane. Zbog prisustva ovih dvogubih
Z Jelić-lvanović: Katabolizam lipida 15-7
veza, u određenim fazama p-oksidacije nezasićenih masnih kiselina stvaraju se intermedijeri koji ne
mogu da budu supstrati ni jednog od četiri enzima tog metaboličkog puta. Ovakvi intermedijeri se
posredstvom tri dodatna enzima konvertuju u intermedijere p-oksidacije.
Dejstvo ova tri enzima ilustrovano je na Slici 15-4, na kojoj je prikazan katabolizam linoleinske ki
seline (sa A9 i A12-dvogubim vezama). Proces započinje na isti način kao kod zasićenih masnih kise
lina, pa se u tri kruga p-oksidacije lanac linoleil-KoA skraćuje za 6 C-atoma. Proizvod trećeg kruga p-
oksidacije ove masne kiseline je enoil-KoA sa c/s-dvogubom vezom između p- i X- ugljenikovih ato
ma, tj. c/s-A3-enoil-KoA. Intermedijer ovakve strukture nije supstrat enoil-KoA hidrataze (druga reak
cija p-oksidacije). Ovaj problem se rešava dejstvom enoil-KoA izomeraze, enzima koji katalizuje
konverziju c/'s-A3-enoil-KoA u fra/7S-A2-enoil-KoA, koji je normalan supstrat enoil-KoA hidrataze. To
omogućuje nastavak četvrtog kruga p-oksidacije uz odvajanje još jednog molekula acetil-KoA:
enoil-KoA izomeraza
c/'s-A3-enoil-KoA *- frans-A2-enoil-KoA
U prvoj reakciji petog kruga p-oksidacije linoleinske kiseline, nastaje 2,4-dienoil-KoA, dakle in
termedijer sa A4-dvogubom vezom1, koji je loš supstrat za enoil-KoA hidratazu. NADPhf-zavisna 2,4-
dienoil-KoA reduktaza katalizuje redukciju A4-dvogube veze, pri čemu se kod sisara stvara trans-
A3-enoil-KoA. Konačno, enzim 3,2-enoil-KoA izomeraza katalizuje konverziju fraA?s-A3-enoil-KoA u
trans-A2 enoil-KoA:
2,4-dienoil-KoA reduktaza
2,4-dienoil-KoA + NADPH + H+ - fra/?s-A3-enoil-KoA + NADP+
Videli smo da se masne kiseline sa parnim brojem C-atoma razlazu u potpunosti do acetil-KoA.
Međutim, u hrani može naći i izvesna količina masnih kiselina sa neparnim brojem C-atoma (sintetišu
ih neke biljke i morski organizmi). Jedina razlika između katabolizma masnih kiselina sa parnim i ne
parnim brojem C-atoma je ta da se kao produkti poslednjeg kruga p-oksidacije masnih kiselina sa
neparnim brojem C-atoma dobijaju po jedan molekul acetil-KoA i jedan molekul propionil-KoA. Zbog
toga se razmatranje puta oksidacije ovakvih masnih kiselina svodi na razmatranje puta katabolizma
propionil-KoA.
Pored toga što je proizvod p-oksidacije masnih kiselina sa neparnim brojem ugljenikovih atoma,
propionil-KoA se takođe stvara u katabolizmu nekih aminokiselina, i to: izoleucina, valina i metionina.
Njegov katabolizam se može podeliti u tri faze. U prvoj fazi, kroz tri enzimske reakcije, propionil-KoA
se karboksiliše uz utrošak energije ATP-a i konvertuje u sukcinil-KoA (Slika 15-5).
coo-
ADP
^ "ATP + P, ^ ^
CH,2 V 1y / 2 3 CH,
I > * » " I "
c=o f c=o
I co2 • i
SKoA SKoA
Propionil-KoA Sukcinil-KoA
1
Intermedijeri ovog tipa se javljaju zbog prisustva dvogube veze na parnom ugljenikovom, atomu, u ovom slu
čaju na C12.
15-8 Opšta biohemija
U drugoj fazi, sukcinil-KoA se konvertuje u L-malat pod dejstvom tri enzima ciklusa limunske ki
seline: sukcinil-KoA sintaze, sukcinat-dehidrogenaze i fumaraze (metilmalonil-KoA se stvara kao
međuproizvod ovih reakcija):
Enzimi CLK
Sukcinil-KoA > *- • L-Malat
Dalja konverzija L-malata ciklusom limunske kiseline u oksalacetat, ne bi vodila njegovom razla
ganju, zbog toga što se oksalacetat ne katabolizuje u toku CLK, već se u svakom krugu obnavlja.
Zato u trećoj fazi katabolizma propionil-KoA, L-malat postaje supstrat jedne drugačije malat-
dehidrogenaze, matičnog enzima, koji ga dekarboksiliše i oksiduje do piruvata:
NADPH
coo- NAPP+ + H" coo-
I
VJ .
s
CI — H c=o
I I
ChL CH 3
| 2
coo- •CXt:'.
L-Malat Piruvat
2
Nasledno oboljenje, X-adrenoleukodistrofija, prouzrokovano je urođenim deficitom peroksizomalne acil-KoA
sintetaze, zbog čega je blokiran proces p-oksidacije u peroksizomima, a nagomilane masne kiseline vrlo dugog
lanca dovode do propadanja mijelina.
Z Jelić-lvanović: Katabolizam lipida 15-9
stva respiratornog lanca). Zbog toga se u svakom krugu peroksizomalne (3-oksidacije dobija po dva
molekula ATP-a manje nego u mitohondrijama. Vodonik-peroksid stvoren u ovoj reakciji razlaže se
pod dejstvom kata laže, enzima čija je aktivnost u peroksizomima vrlo visoka:
.. ~ Katalaza ,, ^ ., ^
H202 • H20 + V202
Istovremeno dolazi do inhibicije sinteze enzima koji katalizuju suprotan proces, biosintezu masnih kiselina
(Poglavlje 18).
15-10 Opšta biohemija
sastavni deo hilomikrona Hilomikroni su klasa lipoproteina koja nastaje u ćelijama tankog creva, a
sadrže veliku količinu triacilglicerola sintetisanih iz masnih kiselina koje su apsorbovane u digestiv-
nom traktu. Endogeni triacilgliceroli stvaraju se u jetri, pretežno iz masnih kiselina sintetisanih ta-
kođe u hepatocitima. Ovi triacilgliceroli se u jetri ugrađuju u lipoproteine vrlo niske gustine, VLDL-
čestice, koji se sekretuju iz hepatocita i putem krvi takođe dospevaju do ćelija masnog tkiva.
Preuzimanje masnih kiselina iz triacilglicerola sadržanih u hilomikronima i VLDL-česticama omo
gućuje enzim lipoproteinska lipaza. Ovaj enzim se nalazi na endotelu kapilara, a najviše u onima
koji prolaze kroz masno i mišićno4 tkivo. Lipoproteinska lipaza katalizuje hidrolizu triacilglicerola u
navedenim klasama lipoproteina, a slobodne (neesterifikovane) masne kiseline koje nastaju u toj re
akciji ulaze u ćelije. U ćelijama masnog tkiva, preuzete masne kiseline služe kao supstrati za sintezu
triacilglicerola i u toj formi se čuvaju sve dok se ne ukaže potreba za njihovim oslobađanjem i oksida
cijom (Slika 15-6). Insulin povećava aktivnost lipoproteinske lipaze i na taj način favorizuje stvaranje
rezervi u masnom tkivu.
Transport Transport
triacilglicerola masnih kiselina
(krv) (krv)
Masne kiseline
Hilomikroni, VLDL vezane za albumin
Deponovanje Mobilizacija
masti masnih kiselina
ft Aktivacija cAMP-
zavisnom fosforilacijom
(adrenalin, noradrenalin,
glukagon)
Ćelija
masnog tkiva U Inhibicija insulinom
Slika 15-6. Deponovanje masnih kiselina u formi triacilglicerola u masnom tkivu (le-
va polovina slike) i njihova mobilizacija (desna polovina slike).
U mišićnom tkivu se ne stvaraju rezerve masnih kiselina, već se one oksiduju da bi se obezbedila energija
potrebna za kontrakciju mišića.
Z Jelić-lvanović: Katabolizam lipida 15-11
Insulin ima suprotan efekat na metabolizam u masnom tkivu: on inhibira hormon-senzitivnu lipa-
zu, a time i proces mobilizacije masnih kiselina iz triacilglicerola masnog tkiva.
Sudbina glicerota
Pri hidrolizi triacilglicerola, pored masnih kiselina oslobađa se i glicerol, koji se putem krvi tran-
sportuje u jetru ili bubrege. U tim organima se konvertuje u intermedijer glikolize, dihidroksiaceton-
fosfat, pod dejstvom dva enzima: glicerol-kinaze i glicerol-fosfat-dehidrogenaze
CH,OH
2
CH27OH
I I
HO-C—H HO-C—H C=0
I 2
Glicerol-fosfat-
CH2OP03 dehidrogenaza CH2OP03 '
2
3. HMG-KoA se razlaže na acetoacetat i acetil-KoA, pod dejstvom HMG-KoA lijaze (Slika 15-7,
reakcija 3).
Deo acetoacetata redukuje se do p-hidroksibutirata, pod dejstvom enzima /3-hidroksibutirat-
dehidrogenaze:
I
C=0
I
3
••i HO-C—H
I
I
3
CH.2 CH,2
I $-hidroksibutirat- I
coo- dehidrogenaza COO"
Acetoacetat D-p-Hidroksibutirat
Acetoacetat i p-hidroksibutirat izlaze iz hepatocita i putem krvi dospevaju do perifernih tkiva. Ne-
ka tkiva, kao što su npr. srčani mišić i skeletni mišići, koriste ketonska tela kao važan izvor energije.
Mozak, pod normalnim uslovima, koristi
isključivo glukozu (masne kiseline ne pro
OH
I laze kroz krvno-moždanu barijeru). Među
CHg — C — CII2—CO2 tim, posle dužeg gladovanja, moždane
ćelije razvijaju sposobnost korišćenja ke
H
tonskih tela, pa njihov katabolizam postaje
D-p-Hidroksibutirat
glavni izvor energije.
^~NAD+ Katabolizam ketonskih tela do acetil-
p-hidroksibutirat dehidrogenaza KoA prikazan je na Slici 15-8. Posle oksi
NADH + KT dacije p-hidroksibutirata do acetoacetata
pod dejstvom enzima 0-hidroksibutirat-
0 dehidrogenaze, u reakciji sa sukcinil-KoA
nastaje acetoacetil-KoA i sukcinat. Reakci
CH3 — C — CH2—CO2
ju katalizuje enzim 3-ketoacil-KoA tran
Acetoacetat O
sferaza, a sukcinil-KoA služi kao donor
s- ~0 2 C — C H 2 — C H 2 — C —SKoA koenzima A. Pod dejstvom tiolaze, u reak
' Sukcinil-KoA ciji sa jednim molekulom slobodnog KoA,
acetoacetil-KoA se razlaže na dva moleku
3-ketoacil-KoA transferaza
la acetil-KoA, koji se mogu uključiti u ciklus
limunske kiseline.
02C— CH2—CH2—C02
Sukcinat
O O C. KATABOLIZAM
CH 3 — C — CH2 — C — SKoA FOSFOGLICERIDA
Acetoacetil-KoA
Fosfogliceridi su glavni sastojci biološ
^ H—SKoA kih membrana. Pored strukturne uloge, u
tiolaza novije vreme se sve više ističe njihova ulo
r
ga u regulaciji metabolizma. Naime, oni
O
II predstavljaju rezervoar koji ćelije koriste za
2CH 3 —C —SKoA sintezu različitih intracelularnih i intercelu-
Acetil-KoA larnih signalnih molekula, kao što su npr.
eikozanoidi (prostaglandini, tromboksani i
leukotrieni), neki lizofosfogliceridi, fosfatid-
Slika 15-8. Katabolizam ketonskih tela do acetil-KoA.
na kiselina ili diacilglicerol.
Z. Jelić-lvanović: Katabolizam lipida 15-13
Fosfolipaza A1
i
Fosfoiipaza A2 |
I !"
| H2C — O — C — Rl
O
11 I
I
R2 —C —O—CH
O
II
* li"
C - 0 T P - O T X
Fosfolipaza C Fosfoiipaza D
Fosfogliceridi se razlazu pod dejstvom grupe enzima, fosfolipaza, koje katalizuju hidrolizu odre
đenih veza u strukturi fosfoglicerida (Slika 15-9).
Fosfolipaze Ai i A2 hidrolizuju estarsku vezu između masne kiseline i hidroksilne grupe glicerola
u položaju 1 (fosfolipaza A^ ili 2 (fosfolipaza A2). Produkti reakcije ovih enzima su neesterifikovana
(slobodna) masna kiselina i lizofosfogliceridi (ostatak molekula fosfoglicerida posle odvajanja jedne
masne kiseline). U položaju 2 fosfoglicerida često se nalazi arahidonska kiselina, prekursor za bio-
sintezu eikozanoida, što znači da stvaranje prostaglandina zavisi od dejstva fosfolipaze A2. Antiinfla-
matorno dejstvo glukokortikoida zasniva se na inhibiciji fosfolipaze A2, čime se blokira sinteza ovih
proinflamatornih agenasa.
Fosfolipaza C odvaja polarni deo molekula fosfoglicerida uz stvaranje diacilglicerola. Pri razla
ganju fosfatidil-inozitola, stvaraju se važni signalni molekuli, a aktivnost fosfatidil-inozitol-specifične
fosfolipaze C regulisana je pod dejstvom hormona (Poglavlje 21).
Fosfolipaza D razlaže molekul fosfoglicerida na fosfatidnu kiselinu i alkoholnu grupu X. Nekad
se smatralo da je fosfolipaza D zastupljena uglavnom u biljnim tkivima. Međutim, danas se zna da je
ovaj enzim široko rasprostranjen u tkivima sisara, gde ima važnu regulatornu ulogu. Aktivnost ovog
enzima u ćeliji kontrolisana je pod uticajem različitih hormona, faktora rasta i drugih ekstracelularnih
signala.
D. KATABOLIZAM SFINGOLIPIDA
Većinu sfingolipida čine glikosfingolipidi, kod kojih polarna glava sadrži ostatke ugljenih hidrata
(Poglavlje 6). Pojednostavljene strukture glavnih klasa glikosfingolipida prikazane su na Slici 15-10.
Sfingolipidi se razlazu pod dejstvom lizozomskih hidrolitičkih enzima (Slika 15-11). Na glikosfin-
golipide najpre deluju enzimi koji u nizu uzastopnih reakcija otcepljuju jednu po jednu ugljenohidratnu
jedinicu, sve dok ne nastane ceramid. S druge strane, sfingomijelin se konvertuje u ceramid odvaja
njem fosfoholina. Zajednički proizvod degradacije sfingolipida, ceramid, razlaže se konačno na sfin-
gozin i masnu kiselinu.
Nasledni nedostatak pojedinih enzima koji učestvuju u razlaganju sfingolipida prouzrokuje teška
oboljenja, sfingolipidoze, kod kojih dolazi do nagomilavanja odgovarajućeg sfingolipida. Većina ovih
bolesti je praćena mentalnom retardacijom, a mnoge imaju fatalan ishod.
15-14 Opšta biohemija
Cerebrozidi
Glukocerebrozid
o*=
Galaktocerebrozid
Sulfatid
OSO3-
Globozidi
Laktozil-ceramid P^P
Triheksozilceramid aMP
Globozid
p_^ir\^
Gangliozidi
G
M3 P/np
a
NANK
P*fcP/"AP
'M2
a
NANK
>M1
P^P/-<\P
NANK
=
\ / = glukoza Wm galaktoza ^k = A/-acetilgalaktozamin
NANK
J GMI fi-galaktozidaza
S * Gal
NANK
GalNAc -^ Gal-^ Gle -&• Cer
Gangliozid GR/K
heksozaminidaza A
(Tay-Sachs-ova bolest) IH
h-+- GalNAc
GalNAc -£ Gal—Gal -^ Gle -£- Cer
NANK
Globozid
Gal -£ Gle -&- Cer
Gangliozid GM3 heksozaminidaza A i B
(Sandhoff-ova bolest)
gangliozid- GalNAc
neuraminidaza • NANK Gal
Gal-^Glc-B-Cer Gal--Gal-^Glc-^-Cer
Laktozii-ceramid a-galaktozidaza A Triheksozilceramid
(Fabry-eva bolest)
P-galakiozidaza , .
*~ Gal
Sfingomijelin
sfingomijelinaza
•*• Ceramid -*- i*
galaktocerebrozidaza
Gal-^ Cer
Galaktocerebrozid
(Niemann-Pick-ova (Krabbe-ova bolest)
bolest)
ceramidaza
(Farber-ova lipogranulomatoza)
Sfingozin
Masna kiselina
Slika 15-11. Katabolizam sfingolipida pod dejstvom lizozomskih enzima (Gle - glukoza, Gal
- galaktoza, GalNAc - N-acetilgalaktozamin, NANK - N-acetilneuraminska kiselina, odnos
no sijalinska kiselina, Cer - ceramid). Na slici su u zagradama navedeni nazivi genetskih
oboljenja prouzrokovanih nedostatkom odgovarajućeg enzima.
E. SUDBINA HOLESTEROLA
Steroidna struktura holesterola ne može da se razgradi u organizmu. Time holesterol odstupa od
opšteg pravila da svi biomolekuli koji se sintetisu u organizmu, mogu i da se katabolizuju. Zaštita od
nagomilavanja viška holesterola u tkivima ostvaruje se njegovim uklanjanjem iz organizma.
Holesterol se najpre transportuje iz perifernih tkiva do jetre posredstvom lipoproteina visoke gus-
tine (HDL-čestica) u procesu koji se naziva reverzni transport holesterola. U jetri, deo holesterola
se konvertuje u žučne kiseline, koje se, kao i neizmenjen holesterol, putem žuči izlučuju u tanko
15-16 Opšta biohemija
crevo. Deo žučnih kiselina se iz creva ponovo apsorbuje i putem krvi dospeva u jetru (enterohepatič-
na cirkulacija), a deo se eliminiše iz organizma putem fecesa. Neki lekovi koji se koriste za snižava
nje koncentracije holesterola u krvi, deluju tako što sprečavaju enterohepatičnu cirkulaciju žučnih
kiselina. Oni predstavljaju jonoizmenjivačke smole, koje se ne apsorbuju iz gastrointestinalnog trakta,
već u crevima vezuju žučne kiseline. Žučne kiseline se u tako vezanom obliku ne mogu ponovo ap-
sorbovati, već se zajedno sa lekom eliminišu iz organizma.
I&
Poglavlje 16.
Katabolizam azotnihjedinjenja
A. KATABOLIZAM AMINOKISELINA
Osnovna uloga aminokiselina u organizmu je ta da one služe kao prekursori za sintezu važnih
biomolekula koji sadrže azot. Tu se pre svega misli na sintezu proteina, ali i drugih azotnih jedinjenja
kao što su npr. hem, nukleotidi, fiziološki aktivni amini, ili glutation. Međutim, višak aminokiselina
unetih hranom ne skladišti se u organizmu, već se koristi kao neposredan izvor energije, ili se od njih
sintetišu drugi biomolekuli od kojih se može dobiti energija: glukoza, masne kiseline ili ketonska tela.
Uklanjanje amino-grupe
Prvi korak u katabolizmu aminokiselina je uklanjanje amino-grupe, odnosno dezaminacija. De~
zaminacijom aminokiselina nastaje odgovarajuća a-ketokiselina, a amino-grupa se izdvaja u formi
amonijaka ili se ugrađuje u strukturu aspartata. Dalja sudbina ovih proizvoda je sledeća:
• a-ketokiselina se uključuje u kataboličke puteve koji su specifični za svaku aminokiselinu i razla
že se do različitih zajedničkih intermedijera metabolizma (v. Katabolizam pojedinih aminokiseli
na)
• amonijak i amino-grupa aspartata uključuju se u proces biosinteze uree, i u tom obliku eliminišu
iz organizma putem bubrega.
Uklanjanje amino-grupe iz molekula aminokiseline obavlja se putem dva procesa: transaminacije
i oksidativne dezaminacije. Većina aminokiselina se dezaminiše procesom transaminacije, pod ko
jom se podrazumeva transfer amino-grupe sa aminokiseline na a-ketokiselinu. Aminokiselina koja je
poslužila kao donor amino-grupe prelazi u odgovarajuću a-ketokiselinu, dok od a-ketokiseline koja je
primila amino-grupu, nastaje nova aminokiselina. Reakciju katalizuju enzimi aminotransferaze, a kao
akceptor amino-grupe obično služi a-ketoglutarat:
aminotransferaza
Aminokiselina + a-ketoglutarat ^ a-ketokiselina + glutamat
16-2 Opšta biohemija
Reakcije transaminacije se odvijaju kroz dve faze. U prvoj fazi dolazi do transfera amino-grupe
sa aminokiseline na enzim, pri čemu od aminokiseline nastaje odgovarajuća ketokiselina:
U drugoj fazi, amino-grupa prelazi sa enzima na ketokiselinu koja služi kao akceptor (a-
ketoglutarat), uz stvaranje nove aminokiseline (giutamata):
a-ketoglutarat + enzim-NH- =: glutamat + enzim
H
I
ooc—c—c- •c—cocr " O O C — c — c — c — COO"
H, H, | H 2 H 2 ||
+
NH3
o
Glutamat a-Ketoglutarat
H 2 C—NH 2
"03P — C^s?- OH
N CH,
-"3 N — 3
Piridoksal-fosfat Piridoksamin-fosfat
* H
I
" O O C — C — C—COO" OOC—C—C—COO"
H2 | H 2 ||
NH; o
Aspartat Oksalacetat
centracija amonijaka izuzetno toksična, naročito za centralni nervni sistem, ovo ima veliki fiziološki
značaj, jer pomaže u održavanju niske koncentracije amonijaka: amonijak se oslobađa iz aminokise
lina onolikom brzinom kolikom može da se uključi u biosintezu uree.
Pored glutamat-dehidrogenaze, koja predstavlja glavni mehanizam uklanjanja amino-grupe iz
strukture aminokiselina, postoje i drugi, manje značajni mehanizmi. Tako, oksidaza L-aminokiselina
i oksidaza D-aminokiselina koje sadrže FAD kao prostetičnu grupu, katalizuju oksidaciju L- i D-
aminokiselina. Oksidacija se odvija u dve faze. U prvoj fazi, aminokiselina se oksiduje uz izdvajanje
amonijaka, a akceptor elektrona je FAD:
Aminokiselina + FAD + H 2 0 • a-ketokiselina + NH3 + FADH2
Ciklus uree
Višak azota dobijen katabolizmom aminokiselina, ekskretuje se kod različitih vrsta organizama u
jednoj od tri forme: kao slobodni amonijak, u obliku uree, ili u obliku mokraćne kiseline. Većina životi
nja koje žive u vodi ekskretuju amonijak (amonotelni organizmi). Kod drugih organizama, kod kojih
je raspoloživost vode ograničena, razvili su se metabolički procesi u kojima se amonijak najpre pre
vodi u manje toksične proizvode, pa je za ekskreciju takvih metabolita potrebna manja količina vode.
Većina suvozemnih kičmenjaka, pa tako i sisari, ekskretuju ureu kao krajnji proizvod katabolizma
aminokiselinskog azota (ureotelni organizmi). Neki suvozemni organizmi umesto uree ekskretuju
mokraćnu kiselinu (urikotelni organizmi, kao što su npr. ptice i reptili).
Biosinteza uree se odvija u hepatocitima i to jednim delom u mitohondrijama, a drugim u citozolu.
Kako, slično ciklusu limunske kiseline, ima kružan tok, biosinteza uree se još naziva i ciklus uree, ili
ornitinski ciklus1. U literaturi se ponekad označava i kao Krebs-Hanseleit-ov ciklus, po autorima koji
su ga prvi opisali. Urea stvorena u ćelijama jetre sekretuje se u krv i izlučuje iz organizma putem bu
brega.
1. Ciklus uree se sastoji od pet enzimskih reakcija, od kojih se prve dve odvijaju u mitohondrijama,
a preostale tri u citozolu (Slika 16-2). U ovom putu učestvuju i dva transportna sistema unutraš
nje membrane mitohondrija, koji omogućuju transport određenih intermedijera kroz ovu membra
nu (citrulina iz mitohondrija u citozol i ornitina iz citozola u mitohondrije). U prvoj reakciji biosinte-
ze uree, koju katalizuje enzim karbamoil-fosfat sintetaza, stvara se karbamoil-fosfat iz amoni
jaka i bikarbonatnog jona, uz razlaganje dva molekula ATP-a:
Ornitin potreban za ovu reakciju obezbeđuje se iz citozola (gde se sintetiše) uz pomoć specifič
nog transportnog sistema. Isto tako, stvoreni citrulin se posredstvom drugog transportera prenosi
u citozol, gde se odvija ostatak ciklusa uree.
Uloga ornitina u biosintezi uree analogna je ulozi oksalacetata u ciklusu limunske kiseline: za normalno od
vijanje ciklusa uree, neophodno je prisustvo male količine ornitina, ali se utrošeni molekul ornitina regeneriše na
kraju svakog ciklusa.
16-4 Opšta biohemija
Mitohondrija
2ATP+ UC-
Karbarnoit-f
H-jN—C — NH2
Urea
coo™
Fumarat
5. U petoj, poslednjoj reakciji ciklusa uree, pod dejstvom arginaze, arginin se hidrolizuje uz stvara
nje uree i regeneraciju ornitina:
Dakle, u toku ciklusa uree dolazi do ugrađivanja dve amino-grupe (jedne iz amonijaka i druge iz
aspartata) i ugljenikovog atoma iz bikarbonatnog jona, u strukturu manje toksičnog produkta, uree,
koja se ekskretuje iz organizma putem bubrega. Energija potrebna za biosintezu uree obezbeđuje se
hidrolizom četiri visokoenergetske fosfoanhidridne veze ATP-a (dva molekula ATP-a hidrolizuju se
ortofosfatnim, a jedan pirofosfatnim cepanjem). Zbirna reakcija puta biosinteze uree može se prika
zati na sledeći način:
NH3 + aspartat + HC03" + 3ATP urea + fumarat + 2ADP + 2P, + AMP + PP,
Stvoreni fumarat služi kao supstrat iz koga može da se regeneriše aspartat: pod dejstvom fuma-
raze i malat-dehidrogenaze, fumarat se najpre konvertuje u oksalacetat, koji zatim u prisustvu aspar-
tal-aminotransferazeprirna amino-grupu glutamata i prelazi u aspartat (Slika 16-3). Isto tako, ATP
utrošen za biosintezu uree regeneriše se uz pomoć određenih reakcija koje učestvuju u stvaranju
intermedijera ciklusa uree. Naime, u reakcijama glutamat-dehidrogenaze i malat-dehidrogenaze
(Slika 16-3) nastaje po jedan molekul NADH, odnosno dva molekula za svaki okret ciklusa uree. Pri
likom reoksidacije stvorene količine NADH respiratornim lancem nastaje ukupno šest molekula ATP-
a, dakle više od utrošene količine.
R— CH—COO~
H.jN — C — NH 2
Urea v Ornitin a-Ketoglutarat
~^ Aminokiselina
H 2 N — C — O P O r - " — — N - H C 0J + NH,-<^5^
5 -Glutamat R—C —COO-
H,0 Karbamoil- / 1 \
3
f 3 C
li
fosfat T o
2ADP [2ATP| [NADJPJH] NAI>'P)+ a-Ketokiselina
+ '
P«
Slika 16-3. izvori energije i intermedijera ciklusa uree (1 - karbamoil-fosfat sintetaza, 2 - ar-
gininosukcinat-sintetaza, 3 - glutamat-dehidrogenaza, 4 - malat-dehidrogenaza, 5 - amino-
transferaze, 6 - fumaraza).
Regulacija ciklusa uree. Brzina ciklusa uree mora da bude usklađena sa brzinom katabolizma
aminokiselina. Glavno regulatorno mesto ciklusa ureeje prva reakcija koju katalizuje karbamoil-fosfat
sintetaza. Alostemi aktivator ovog enzima je /v-acetilglutamat, koji se stvara iz glutamata i acetil-
KoA pod dejstvom enzima N-acetilglutamat-sintaze, a razlaže pod dejstvom specifične hidrolaze.
Brzina stvaranja uree dakle zavisi od koncentracije N-acetilglutamata. U uslovima kada je razlaganje
aminokiselina intenzivno, raste koncentracija glutamata, koji se stvara u reakcija transaminacije razli
čitih aminokiselina. Povećanje koncentracije glutamata stimuliše sintezu A/-acetilglutamata, a time i
biosintezu uree i ekskreciju viška azota. Brzina ostalih reakcija ciklusa uree zavisi od priliva odgova
rajućih supstrata, pa se ona prema tome usklađuje sa brzinom prve reakcije.
16-6 Opšta biohemija
Kod osoba sa urođenim nedostatkom nekog od enzima koji učestvuju u ciklusu uree, dolazi do
nagomilavanja amonijaka koji je toksičan, naročito za centralni nervni sistem. U uslovima povećane
koncentracije amonijaka, ravnoteža reakcije glutamat-dehidrogenaze pomera se u korist stvaranja
glutamata, pri čemu se troši a-ketoglutarat i time ometa normalan tok ciklusa limunske kiseline. Glu-
tamat se ubrzano konvertuje u glutamin, pa opada i njegova koncentracija. S obzirom na to da funk
cija mozga zavisi od energije koja se oslobađa u aerobnom katabolizmu glukoze i da je glutamat va
žan neurotransmiter i prekursor za stvaranja drugog neurotransmitera, y-aminobutirata (GABA), lako
je zaključiti da će se nagomilavanje amonijaka drastično odraziti na funkciju centralnog nervnog sis
tema. Zato se kod deficita enzima ciklusa uree javlja mentalna retardacija i letargija, a kod potpunog
deficita bilo kojeg od pet enzima dolazi do smrti ubrzo po rođenju.
Alanin
Cistein
Glicin
Serin
Treonin
Triptofan Izoleucin
I Leucin
Treonin
Acetoacetat
t
Leucin
Lizin
Asparagin Fenilaianin
Aspartat. Triptofan
Tirozin
Oksalacetat Citrat
Aspartat /
Fenilaianin Fumarat CLK Izocitrat
V
Tirozin
CO,
Sukcinil-KoA a-Ketoglutarat
\
Izoleucin CO, A f
9inin *
Metionin Glutamat
Valin Glutamin
Histitim
G lutam at
H
,c—c—coo
I
NH3
Alanin
+
r
a-Ketogiutarat
•
H.C
3
—C —COO
II
o
Piruvat
Glutamat
H
t
OOC—C— C — COO" -?r—^ • O O C — C —C — C O O "
NH 3 + f O
Aspartat a-Ketog!utarat Oksalacetat
NH3+ + H 2 0
H
I
HOCH — C — COO" ^ • H,C —C — C O O -
3
I +
+
II
NH 3 O
Serin Piruvat
lako se acetil-KoA uključuje u ciklus limunske kiseline, od njega se ne može sintetisati glukoza, jer se oba C-
atoma gube u toku CLK u dve reakcije dekarboksilacije, a glukogeni intermedijeri CLK se samo regenerišu
(treba imati u vidu da za početak svakog kruga CLK mora da se utroši po jedan molekul oksalacetata). Naprotiv,
razlaganjem glukogenih aminokiselina dobijaju se novi molekuli intermedijera CLK, koji se mogu iskoristiti za
stvaranje glukoze.
16-8 Opšta biohemija
coo- Transaminacija
- + C—CO-COO"
H,
(Fenilalketonurija)
Fenilalanin Feniipiruvat
Tetrahidro-
biooterin 02
Fenilalanin-hidroksilaza
H20
Normalan metabolizam
fenilalanina Fumarat'+"
acetoacetat
Tirozin
Za hidroksilaciju fenilalanina neophodno je učešće biopterina kao kofaktora. Pterini, kao i flavini,
učestvuju u biološkim oksidacijama, a aktivan oblik biopterina je njegov redukovan oblik, 5,6,7,8-
tetrahidrobiopterin. U reakciji fenilalanin-hidroksilaze, 5,6,7,8-tetrahidrobiopterin se oksidujedo 7,8-
dihidrobiopterina (hinoidni oblik, Slika 16-6). Da bi se regenerisao aktivan kofaktor, stvoreni 7,8-
dihidrobiopterin mora da se redukuje. Redukciju 7,8-dihidrobiopterina do 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina
katalizuje enzim dihidropteridin-reduktaza, koja koristi NADH kao donor elektrona.
Kod osoba sa urođenim nedostatkom fenilalanin-hidroksilaze, ili enzima koji učestvuju u stvara
nju i regeneraciji kofaktora, 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina, katabolizam fenilalanina je blokiran, pa se
povećava njegova koncentracija u krvi. Deficit fenilalanin-hidroksilaze je uzrok teške nasledne bolesti
praćene mentalnom retardacijom, klasične fenilketonurije. Zbog nagomilavanja fenilalanina, aktivira
se alternativni put katabolizma ove aminokiseline transaminacijom u feniipiruvat (fenilketon), koji se
ekskretuje putem urina. Ako se bolest dijagnostikuje neposredno po rođenju, primenom dijete bez
fenilalanina u prvih 5 do 10 godina života, može se sprečiti razvoj simptoma. Zbog toga je potrebno
da se kod svakog novorođenčeta ispita eventualno prisustvo ovog poremećaja metabolizma.
Z Jelić-lvanović: Kataboiizam azotnih jedinjenja 16-9
o2
+
H H
NAD+ HL •
H -c y— CH2—c— coo-
>=\ m
H H
Dihidropteridin- Fenilalanin
reduktaza
H
i
NADH CHo—C—COO"
I
NHJ
7,8-Dihidrobiopterin Tirozin
+ i
cir,—s—CH 2 —CH 2 —c—cocr
H ATP+ P,- +
H20 PP,. j Q Adenin
CH 3 — S—CH 2 —CH 2 — C—COO
I j\H H/1
NB*.
Metionin HO OH
S-Adenozilmetionin (SAM)
akceptor metil-grupe
^ THF 6/os/ntete/ca
metilacija 2 metilovani akceptor
- ]V*-metil-THF
H
H i
S—CH 2 —CH 2 —C —COO-
HS—CHo — CH<>— C — COO" Adenozin H 2 0 f I
3
Homocistein
I
NHt . V. J CH2
Q Adenin
NH£
H H/1
5 HN f H
* 6 HO OH
S-adenozilmetionin ima značajnu ulogu u raznim biološkim metilacijama, u kojima služi kao do-
nor metil-grupe. Tako su npr. metil-grupe koje se nalaze u strukturama fosfatidilholina, kreatin-fosfata
i adrenalina (Slika 16-8), poreklom iz ovog intermedijera metabolizma metionina. Predajom metil-
grupe odgovarajućem akceptoru, S-adenozilmetionin se konvertuje u S-adenozilhomocistein. U sle-
dećoj reakciji dolazi do hidrolitičkog odvajanja adenozina, pri čemu se stvara homocistein. Homocis-
tein dalje može da se uključi u dva alternativna puta: njegovom metilacijom može da se regeneriše
metionin, ili u reakciji homocisteina sa serinom može da nastane cistationin. Cistationin se uključuje
u dalje reakcije razlaganja metionina, pri čemu se stvara cistein, a ostatak molekula cistationina raz
laže do sukcinil-KoA.
o
u
2
HN—P03 - HC —O —C —Rl J
HO^ ^ ^ I J
H2N = C || | C — C — N H 2,
I R2 —C — O — C H H H,
N —CH 2 COO" I O n „
1 jl
I V * HO
HU
CH 3 C—O — P — O — C — C — N — C H 3
H2 I_ H2 H2 y
O *" 3
Slika 16-8. Strukture nekih jedinjenja koja sadrže metil-grupe poreklom iz S-adenozilmefionina.
B. KATABOLIZAM PROTEINA
Proteini imaju ograničen vek i u organizmu se neprestano obnavljaju: u svakom trenutku postoji
određena ravnoteža između procesa degradacije i resinteze pojedinih proteina. Obnavljanje proteina
veoma je značajno za normalnu funkciju ćelije. Pre svega, brzo obnavljanje proteina omogućuje me
taboličku fleksibilnost ćelije: koncentracije proteina kao što su npr. ključni regulatorni enzimi metabo
ličkih puteva, peptidni hormoni ili receptori, moraju da se menjaju zavisno od metaboličkih potreba.
Da bi ćelija mogla da se prilagodi određenoj promeni, ovi proteini se moraju brzo sintetisati, ali je po
djednako važno i da se brzo razlože onda kada je potrebno da se njihova koncentracija smanji. Isto
tako, degradacija proteina štiti ćeliju od eventualnog nagomilavanja proteina izmenjene strukture (ok
sidacija, denaturacija, delimična proteoliza). Konačno, procesi rasta i razvoja zavise ne samo od sin
teze, već i od pravovremene degradacije proteina.
Različiti proteini se između sebe veoma razlikuju po dužini svog životnog veka. Npr. regulatorni
enzimi se obnavljaju veoma brzo, pa se njihov vek obično izražava u minutima, a faktori koagulacije
se obnavljaju kroz nekoliko dana. Proteini koji su izloženiji spoljašnjim uticajima takođe imaju kraći
vek: npr proteini jetre i epitela creva oko 10 dana, a proteini plazme oko 15 dana. U ćelijama drugih
tkiva, proteini se sporije obnavljaju, tako da npr. proteini mišića imaju vek od oko šest meseci, a stru
kturni proteini vezivnog tkiva, kao što je kolagen, nekoliko godina. Proteini očnog sočiva su trajni, tj
uopšte se ne obnavljaju.
Brzina katabolizma proteina u ćelijama zavisi i od uhranjenosti organizma. Ako se unosi nedovo
ljna količina hrane, ubrzava se degradacija proteina da bi se obezbedila energija za važne metaboli
čke procese.
Z. Jelić-lvanović: Katabolizam azotnih jedinjenja 16-11
Degradacija u lizozomima
Među brojnim hidrolitičkim enzimima, lizozomi sadrže i različite proteaze, katepsine. Katepsini
su aktivni samo u kiseloj sredini, kakva normalno postoji u lizozomima (pH oko 5), dok su neaktivni
pri citozolnom pH. Ovo štiti ćelijske proteine od razlaganja u slučaju izlivanja sadržaja lizozoma u
citozol.
Lizozomi razlazu proteine koji dospevaju u ćeliju iz ekstracelulamog prostoru procesom proste
pinocitoze ili receptor-zavisne endocitoze (različiti receptori na plazma-membrani vezuju određene
proteine, posle čega se u ćeliju uvlači deo membrane, zajedno sa receptorom i vezanim proteinom).
Lizozomi u izvesnoj meri učestvuju i u obnavljanju intracelularnih proteina, tako što se stapaju sa
delićima citozola okruženim membranom (autofagne vakuole). Međutim, razlaganje ćelijskih proteina
pod dejstvom proteaza lizozoma nije glavni put njihovog katabolizma.
Proteoliza u lizozomima ćelija, u uslovima kada ćelija raspolaže dovoljnom količinom hranljivih
materija, neselektivan je i spor proces. Posle dužeg gladovanja, kada je potrebno da se kataboliz-
mom proteina obezbedi energija, aktivira se selektivni put razlaganja ćelijskih proteina u lizozomi
ma, koji štiti važne enzime i regulatorne proteine od degradacije. U okviru selektivnog puta prvens
tveno se razlazu proteini koji u svojoj strukturi sadrže pentapeptid Lys-Phe-Glu-Arg-Gln (KFERQ) ili
sličnu sekvencu. Ova degradacija se odvija u tkivima koja atrofiraju za vreme gladovanja (npr. jetra,
bubrezi), ali ne i u mozgu. Jedan specifičan protein, relativne molekulske mase 73000, prp73 (eng.
peptide recognition protein - protein koji prepoznaje peptid) vezuje se za KFERQ proteine u citozolu
i prenosi ih u lizozome, gde se katabolizuju.
Mnogi fiziološki i patofiziološki procesi praćeni su povećanjem proteolitičke aktivnosti lizozoma.
Jedan od najdrastičnijih primera je regresija uterusa posle porođaja, kada u periodu od 9 dana dolazi
do smanjenja mase ovog organa sa 2 kg na 50 g.
Proces razlaganja proteina u citozolu zavisi od raspoloživosti energije u formi ATP-a, kao i od
prisustva proteina ubikvitina. S obzirom na to da je hidroliza peptidne veze egzergonska reakcija, sa
termodinamičkog aspekta izgleda nelogično da se za taj proces troši ATP. Danas se smatra da se
ATP troši za pripremu određenih proteina za hidrolizu, čime se obezbeđuje specifičnost procesa (ne
razlazu se svi proteini, već samo oni koji su "markirani" za proteolizu).
Markiranje proteina za proteolizu vrši se vezivanjem ubikvitina, a odvija se kroz tri reakcije i uz
učešće tri vrste enzima (Slika 16-9a). U prvoj reakciji, ubikvitin se aktivira uz hidrolizu ATP-a do AMP
i pirofosfata. Terminalna karboksilna grupa ubikvitina u ovoj reakciji gradi tioestarsku vezu sa -SH
grupom cisteinskog ostatka u strukturi enzima E1. Ubikvitin se u drugoj reakciji prenosi na enzim E2:
nastali tioestar ubikvitina sa E2 služi kao supstrat u trećoj reakciji, u kojoj se ubikvitin vezuje za prote
in koji je određen za degradaciju. Reakciju katalizuje enzim E3 (ubikvitin-protein ligaza), a protein koji
se markira, vezuje se za ubikvitin izopeptidnom vezom koju gradi C-terminalna karboksilna grupa
ubikvitina sa e-amino-grupom lizinskog ostatka proteina.
Smatra se da je E3 enzim najodgovorniji za specifičnost procesa, tj za odabir proteina koji će se
razložiti. Međutim, kako u ćelijama postoji veći broj različitih formi enzima E2, smatra se da i E2 uče
stvuje u odabiru proteina.
16-12 Opšta biohemija
(a) o 7 (b)
Ubikvitin COO + E l — SH
-ATP
AMP + PP,
O
Ubikvitin f— C — S — E l
- E2—SH
^ • - PE
' .li—
—SH
Ubikvitin — C — S—E2
Protein za
degradaciju
E3
^-*- V.9.—
E2—SH
O
Protein za
Ubikvitin — C—NH—Lys-
degradaciju
^
Izopeptidna
Slika 16-9. Degradacija proteina u citozolu. (a) - ATP-zavisne reakcije u kojima se protein
markira za degradaciju vezivanjem ubikvitina. (b) - Izgled 26S proteazoma pod elektron
skim mikroskopom.
Najčešće se pri markfranju proteina za jedan molekul proteina vezuje veći broj molekula ubikviti
na, tako što su oni međusobno takođe povezani izopeptidnim vezama stvorenim između amino-
grupe određenog ostatka lizina jednog molekula ubikvitina sa C-terminalnom karboksilnom grupom
sledećeg (Slika 16-10). Takvi multiubikvitinski lanci mogu da sadrže i po 50 ili više molekula ubikviti
na.
Proteini za koje je vezan ubikvitin razlazu se pod dejstvom velikih multiproteinskih kompleksa,
26S proteazoma (Slika 16-9b). 26S proteazomi se nalaze u citozolu, ali i u jedru, a sastoje se od
najmanje 20 različitih subjedinica. Sadrže pet vrsta peptidaza različite specifičnosti (za peptidne veze
koje grade bazne, hidrofobne ili kisele aminokiseline). Degradacija markiranih proteina se vrši u unut
rašnjosti kompleksa, čime se obezbeđuje efikasna proteoliza i istovremeno štite nemarkirani ćelijski
proteini. Sam ubikvitin se pri tome ne razlaže, već se vraća ćeliji na ponovno korišćenje. Smatra se
da je ATP-zavisna hidroliza proteina markiranih ubikvitinom u 26S proteazomu glavni put degradacije
proteina u ćelijama eukariota.
Poluživot proteina zavisi od njihove primarne strukture. Tako je npr. ispitivanjem velikog broja ci-
toplazmatskih proteina utvrđeno da njihov poluživot zavisi od vrste aminokiseline na N-terminusu
(Tabela 16-1). Pored toga, pojedine kraće sekvence aminokiselina u polipeptidnom lancu mogu da
utiču na vek proteina. Naprimer, veoma brzo se razlazu proteini koji u svojoj strukturi sadrže seg
mente bogate prolinom (P), glutamatom (E), serinom (S) i treoninom (T), PEST proteini.
Arg ~2 min
C. KATABOLIZAM NUKLEOTIDA
Međutim, stvaranjem mokraćne kiseline ne završava se razlaganje purina kod svih organizama.
Kod drugih sisara (izuzev primata), ona se oksiduje do alantoina i u toj formi eliminiše. Alantoin se
kod određenih vrsta dalje razlaže do uree, a kod nekih se urea pod dejstvom ureaze konačno razlaže
do najjednostavnijeg mogućeg produkta katabolizma, amonijum-jona.
•Ov 7 T ^XN>
*}
x
; II ^\ dezaminaza if \\
1
~ H20 NHt
4
Rib—(?) Rib—(P) H Rib-® Rib—(?)
AMP IMP XMP GMP
ksantin-oksidaza gvanin-dezaminaza
Hipoksantin *- Ksantin -* Gvanin
0 2 + H 2 0 ~-v
ksantin-
oksidaza
H202-^
U li
H H
Mokraćna kiselina
Razlaganje pirimidina (Slika 16-12) odvija se sličnim redosledom kao i katabolizam purina. Naj-
pre se, pod dejstvom nukleotidaze, uklanja fosfatni ostatak, a zatim ostatak šećera pod dejstvom
uridin-fosforilaze (citidin se prethodno dezaminiše pod dejstvom citidin-dezaminaze). Pirimidinske
baze, uracil i timin, dalje se razlazu uz učešće nekoliko enzima do krajnjih produkata metabolizma
pirimidina, p-alanina i p-aminoizobutirata Ovi produkti su po svojoj prirodi aminokiseline, pa se da
lje katabolizuju transaminacijom, a zatim aktivacijom u reakciji sa KoA do malonil-KoA (intermedijer
biosinteze masnih kiselina), odnosno metilmalonil-KoA (intermedijer katabolizma masnih kiselina sa
neparnim brojem C-atoma).
Z. Jetić-lvanović: Katabolizam azotnih jedinjenja 16-15
NH, O
H > V X ( C H )
N >^ »
O ^N 0*N^ H
I ^
Rib—(g) (d)Rib—(?)
CMP UMP (dTMP)
H,0- H20-
nukleotidaza nukleotidaza
**s citiđm-
^
Citidln dezaminaza., Uridin (Dezoksltimldln)
H^ A ^(CH3)
A..
NH? p
»->uridin- N C—H
H20
>fosforilaza JC—H
O' " N " ^H
(d)Riboza-1 -p —^ dihidrouracil-
H
Uracil(Tlmin) dehidrogenaza , Dihidrouracil
(Dihidrotimin)
NADPH+ H + NADP+
H 2 o —Uhidropirimidin-
jhidrataza
o
H
OOC^ ^(CH 3 )
COO" CH
i HM f
CH—(CH 3 ) .CH, ^ / C H
2
HoN' p-ureido-
CH=0 H
aminotransferaza p-Alanin propionaza
7"V
Malon-semialdehid p-Ureidopropionat
(MeJiTmal^-semTaldelild) ' f ^ (p-Aminoizobutirat) - (p-Ureidoizobutirat)
Glutamat NH? + C 0 2 H20
KoA + NAIT a-Ketoglutarat
NADH + H"
COO"
I
CH—(CH 3 )
c=o
i
S—KoA
Malonil-KoA
(Metilmalonil-KoA)
Glikogen J
Glikogeneza Glikogenoliza
Glukoza-1-fosfat
Glukoneogeneza Glikoliza
Piruvat
Laktat Acetil-KoA
A. GLUKONEOGENEZA
Glukoneogeneza je proces sinteze novih molekula glukoze iz neugljenohidratnih prekursora.
Sposobnost organizma da sintetiše glukozu je od presudnog značaja za preživljavanje organizma.
Organizam zahteva održavanje konstantnog nivoa glukoze u krvi jer postoje ćelije koje ne mogu da
sintetišu glukozu i kojima je potreban stalni dotok glukoze (ćelije mozga i eritrociti). Glikogen u jetri
17-2 Opšta biohemija
Glukoza
i,', --. / \ /-ATP
glukoza-6 / 4
A-
I heksokmaza
-fosfataza A
IM) ADP
Glukoza-6-fosfat
fosfoglukoza-izomeraza
Fruktoza-6-fosfat
fruktoza-difosfataza J 3 V fosfofruktokinaza
H20-" \ /^ADP
Fruktoza-1,6-difosfat
aldolaza
trioza-fosfat-
Dihidroksiaceton- izomeraza ^ Gliceraldehid-3-
fosfat * fosfat
P, + NADH ^ - N A D + + Pt
' gliceraldehid-3-fosfat-
v. dehidrogenaza
NADH + HH ^*» NADH + H+
1,3-Difosfoglicerat
ADP ADP
fosfoglicerat-
kinaza
ATP ATP
3-Fosfoglicerat
fosfoglicerat-mutaza
2-Fosfoglicerat
enolaza
CO, + GDI \ Fosfoenolpiruvat
PEPCK V
CiTI
Oksalacetat
P + ADP «*-
piruvat-
karboksilaza
t
2
) y
Plruvat
ADP
piruvat-kinaza
ATP
ATP + C O .
zadovoljava ove potrebe u toku 10 do 18 sati ukoliko se ne unose ugljeni hidrati. U toku dužeg glado
vanja, jetrene zalihe se prazne i onda se glukoza dobija iz prekursora: jedinjenja sa tri ili četiri uglje-
nikova atoma, poput laktata, piruvata, glicerola (koji potiče iz triacilglicerola) i a-ketokiselina koje nas
taju u procesu katabolizma aminokiselina. Najvažniji intermedijer katabolizma aminokiselina koji je
prekursor u glukoneogenezi je oksalacetat. Ketogene aminokiseline kao i acetil-KoA, nisu prekursori
V.Spasojević-Kalimanovska:Anabolizam ugljenih hidrata 17-3
Proces glukoneogeneze se odvija iz piruvata ili drugih prekursora, nizom reakcija koje su delimi-
čno reverzibilne reakcije procesu glikolize (Slika 17-2). Poređenjem glikolize i glukoneogeneze mo
žemo videti da je 7 reverzibilnih reakcija, a samo tri su ireverzibilne reakcije. Ireverzibilne reakcije su
katalizovane sa drugim enzimima odnosno reakcijama koje su termodinamski povoljnije. Prva irever
zibilna reakcija je konverzija fosfoenolpiruvata u piruvat sa piruvat-kinazom koja se u ciklusu gluko
neogeneze odvija u dve faze: (1) prevođenje piruvata u oksalacetat i u drugoj fazi reakcija (2) kon
verzije oksalacetata u fosfoenolpiruvat. Sledeća ireverzibilna reakcija koja je u glikolizi katalizovana
sa fosfofruktokinazom-1 je prevođenje fruktoza-1,6-difosfata u fruktoza-6-fosfat (3). Reakcija defosfo-
rilacije glukoze-6-fosfata je takođe ireverzibilna u odnosu na reakciju katalizovanu sa heksokinazom
(4).
n o piruvat- o n o o n
PEPCK
\\ \\ _ karboksilaza <f II II _ I II
CH 3 —C—C—O yr—^—s~ *" O—C—CH2—C—C—O /" 2
X *" C H 2 = C — C — O "
Oksalacetat Jp p^aTfPEP)
P i r u v a t
HCOI/ATP ADP + D GDp
\ ^
zolu. Sve ostale reakcije glukoneogeneze se odvijaju u citozolu, tako da se fosfoenolpiruvat ili oksal
acetat moraju transportovati iz mitohondrija u citozol. Stvoreni oksalacetat se može dejstvom mito-
hondrijalne fosfoenolpiruvat-karboksikinaze (PEP-karboksikinaze) prevesti u fosfoenolpiruvat koji on
da može da pređe u citozol (Slika 17-4). Za razliku od fosfoenolpiruvata, oksalacetat ne prolazi kroz
mitohondrijalnu membranu, već se transport vrši pomoću dva šatl sistema:
Unutrašnja
ćocr
Citozol membrana Mitohondrija coo-
mitohondrija
HO—C—H HO—C—H
!•
CH 2 CHn
i
cooi Malat Malat coo;
r
u
1
NAD" -^ NAD*
malat- '
malat-
dehidrogenaza . L dehidrogenaza
+
^- NADH + H
+
NADH + H "^
c<xr coo-
•' i
Giukoneogeneza*— c=o Oksalacetat Oksalacetat
H
: 9 2
: COO" ,'cocr.
Amino kiselina "*"\ —Amino kiselina
/
aspartat- aspartat-
aminotransferaza aminotransferaza
a -keto kiselina "+~a- keto kiselina
£•*' coo" Aspartat •^ Aspartat COO~
+r I l
HgN—C—H HgN" H
c-
j
ĆH2 CH2
I
cocr COO-
PEP PEP
Slika 17-4. Transport oksalacetata iz mitohondrija u citozol (1) aspartatni šatl sistem; (2)
malatni šatl sistem.
U procesu glukoneogeneze za sintezu molekula glukoze iz dva molekula piruvata potrebna je hi
droliza 6 molekula energetski bogatih jedinjenja : (4 ATP i 2 GTP) i prisustvo 2 molekula NADH.
2Piruvata + 2NADH + 2H + + 4ATP + 2GTP + 6H 2 0 > glukoza + 2NAD + + 4ADP + 2GDP + 6Pj
\KRV MIŠIĆ \
JETRA
Glukoza •> Glukoza Glikogen
KRV MIŠIĆ
JETRA
Urea Mišićni proteini
Glukoza ^Glukoza
Ciklus
uree
A
t \
Aminokiseline
Gluko
NH. neogeneza Glikoliza +
NH.
ulazi u ciklus uree. Ovaj proces transaminacije piruvata u alanin i obrnuto naziva se glukoza-
alaninski ciklus. Njegova uloga je reciklizacija ugljenikovih atoma između mišića i jetre i dostavljanje
aminskog dela katabolizovanih aminokiselina u jetru za ekskreciju u vidu uree.
17-8 Opšta biohemija
(3) Glicerol se oslobađa u toku hidrolize triacilglicerola u masnom tkivu i putem krvi dospeva u jetru
gde se uključuje u proces glukoneogeneze. Glicerol se u jetri dejstvom glicerol-kinaze fosforiliše u
glicerol-3-fosfat, koji se potom oksiduje u dihidroksiaceton-fosfat, intermedijer glikolize dejstvom gli-
cerol-3-fosfat-dehidrogenaze (vidi Poglavlje 15).
Regulacija glukoneogeneze
Piruvat-karboksilaza Acetil-KoA
ze-2 (PFK-2) i fruktoza-difosfataze-2 (FDP-2). Kontrola aktivnosti ova dva enzima (PFK-2 i FDP-2) je
važan aspekt regulacije glukoneogeneze iako ovi enzimi ne učestvuju u samom procesu glukoneo-
geneze. Fosfofruktokinaza-2 i fruktoza-difosfataza-2 odgovaraju ustvari aktivnosti jednog bifunkcio-
nalnog enzima koje se nalaze na različitim domenima jednog proteina. Ove dve enzimske aktivnosti
su pod alosternom regulacijom i kovalentnom modifikacijom (vidi poglavlje 12).
Drugi važan alosterni modulator procesa glukoneogeneze je acetil-KoA. Alosterna aktivacija he-
patične piruvat-karboksilaze sa acetil-KoA javlja se u toku gladovanja. Kao rezultat intenzivne lipolize
u adipoznom tkivu, jetra je opterećena masnim kiselinama. Količina stvorenog acetil-KoA p-
oksidacijom ovih masnih kiselina prevazilazi kapacitet jetre da se on oksidiše u C 0 2 i H 2 0. Kao rezul
tat ovoga, akumulacija acetil-KoA dovodi do aktivacije piruvat-karboksilaze.
B. BIOSINTEZA GLIKOGENA
Glikogeneza je proces sinteze glikogena koji se odvija u citoplazmi ćelija jetre i mišića gde su
ujedno i najveći depoi ovog jedinjenja.
Reakcije glikogeneze
Glikogen se sintetiše od molekula a-D-glukoze. Ovaj proces se dešava u citozolu i zahteva ener
giju koju obezbeđuje ATP (za fosforilaciju glukoze) i uridin-trifosfat (UTP). Anabolički put sinteze gli
kogena se odvija reakcijama koje nisu reverzibilne procesu razlaganja glikogena, dejstvom različitih
enzima. Sinteza glikogena se odvija iz glukoza-6-fosfata u tri faze sa odgovarajućim enzimima:
(1) UDP-glukoza-pirofosforilaza \/
O
HN
O 0 ^ x 0 ,, ^ /
U
liy li p M H « N
O—P—O—P—O—P—0H 2 C 0
"0 "0 H H
H ^ - f H
CH 2 OH
4
O, HO OH
Hi
O UTP
II
HO OH O — P — O "
I
G1P 0"
Neorganska
pirofosfataza
pp. ^ 2P,
CH2OH HN
O,
HO
O O O »N
HO OH 0 — P — 0 — P — OH C
2 n
L L I/ \
0 0 KH Hv
H^f—^H
HO OH
UDP-glukoza
Slika 17-9. Sinteza UDP-glukoze iz glukoza-1-fosfata i UTP dejstvom UDP-
glukoza-pirofosforilaze. U reakciji dolazi do razmene fosfoanhidrida između G-1-
P i UTP. Kiseonik fosforil-ostatka deluje na fosfatni atom UTP i gradi se UDPG uz
oslobađanje PPj.
za stvaranje glikozidne veze. Pirofosfat (PPj) je drugi proizvod ove reakcije i hidrolizuje se u dva ne-
organska fosfata (PO pomoću neorganske pirofosfataze, koja usmerava sintezu ka UDP-glukozi. Sin
tezi UDP-glukoze prethodi reakcija konverzije glukoza-6-fosfata u glukoza-1-fosfat pomoću fosfoglu-
\j komutaze (Vidi 12-20J. Glukoza-1,6-difosfat je intermedijer koji u maloj koncentraciji katalizuje ovu
reakciju.
(2) Glikogen-sintaza
Sinteza glikogena iz glukoze odvija se najvećim delom pomoću enzima glikogen-sintaze. Gliko
gen-sintaza je enzim koji omogućava stvaranje a(1->4) glikozidne veze u glikogenu i elongaciju la
naca glikogena. Ovaj enzim koristi UDP-glukozu kao jedan supstrat i neredukujući kraj glikogena kao
drugi. Elongacija glikogen lanaca obuhvata transfer glukoze od UDP-glukoze na neredukujući kraj
rastućeg lanca, stvaranje nove glikozidne veze između hidroksilne grupe ugljenika na položaju 1 ak
tivirane glukoze i ugljenika 4 nadolazećeg glikozil-ostatka rastućeg lanca glikogena (Slika 17-10).
CH 2 OH HN
O.
HO
*
0 0
(T\XT/
N'
HO OH ^ » I' UDP-glukoza
0 — P — 0 — P — OH 2 C 0
o o" .H H
Intermedijarni H >i r H
oksonijum jon HO OH
CH 2 OH UDP
CH 2 OH
HO O,
HO
OH O R \ CH 2 OH Glikogen (n ostataka)
HO H 0
Q
CH 2 OH CHoOH n
O, HO
HO +
HO OH *
CH22OH ^
\ ^O. J— H HO OH
O—-
CH2 2OH ^
HO OH Q ._ \ ^.O.
CHoOH ^
HO 0 H v
6- -°-
Glikogen (n+1 ostataka) HO OH
o-
Glikogen-sintaza omogućava elongaciju već postojećeg lanca glikogena. Ovaj enzim ne može da
inicira sintezu lanca koristeći slobodnu glukozu kao akceptor molekula glukoze iz UDP-glukoza. Za
započinjanje sinteze glikogena neophodan je prajmer (začetnik ovog procesa). Fragmenti glikogena
služe kao prajmeri u ćeliji čiji depoi glikogena nisu potpuno ispražnjeni. U odsustvu fragmenata gliko
gena, specifični protein, koji se zove glikogenin služi kao akceptor ostataka glukoze. Hidroksilna \y
17-12 Opšta biohemija
grupa specifičnog tirozinskog bočnog lanca ovog proteina služi kao mesto vezivanja molekula gluko
ze iz UDP-glukoze na glikogenin, a reakcija je katalizovana sa tirozin-glikoziltransferazom. Glikoge-
nin zatim autokatalitički produžava lanac do sedam ostataka UDP-glukoze i gradi prajmer za inicijaci-
ju sinteze glikogena. Na ovom stupnju počinje dejstvo glikogen-sintaze koja dalje nastavlja elongaciju ^
lanca. Kada granula glikogena dostigne odgovarajuću veličinu ovaj molekul glikogenina se odvaja.
(3) Enzim grananja glikogena
Ukoliko ne bi delovao neki drugi enzim na lanac glikogena on bi ostao linearan, nerazgranat mo- -*•*
lekul sa a(1->4) glikozidnim vezama. Takvo jedinjenje se nalazi u biljnim tkivima i naziva se amiloza.
Suprotno ovome, glikogen je razgranat sa povećanom rastvorljivošcu u odnosu na amilozu. Grananje
isto tako povećava broj neredukujućih krajeva na koje se novi glikozil-ostaci mogu pridodati, i na taj
način se ubrzava sinteza glikogena, a samim tim i veličina molekula. Grananje glikogena katalizuje
enzim grananja glikogena ili amilo-(1,4->1,6)-transglikozilaza (Slika 17-11). Ovaj enzim prenosi ter-
minalne segmente lanca od 5 do 8 glikozil-ostataka sa neredukujućeg kraja lanca glikogena (kidajući
pri tome a(1->4) glikozidnu vezu) na hidroksilnu grupu C-6 atoma glikozil-ostatka drugog segmenta
istog lanca i stvara se nova a(1->6) glikozidna veza. Enzim grananja u stvari katalizuje istovremeno
dve reakcije: raskidanje a(1->4) glikozidne veze i stvaranje a(1->6) veze. Energija hidrolize a(1->4)
Enzim grananja
glikozidne veze koristi se za sintezu a(1->6) glikozidne veze. Svaki segment koji se na ovaj način
prenosi dolazi sa lanca koji ima najmanje 11 ostataka i nova tačka grananja mora biti odvojena od
druge tačke minimalno sa 4 ostatka glukoze. Rezultirajući novi, neredukujući kraj, kao i stari neredu-
V. Spasojević-Kalimanovska:Anabolizam ugljenih hidrata 17-13
kujući krajevi sa kojih je uklonjeno 5 do 8 ostataka, sada mogu da se produže delovanjem glikogen-
sintaze.
Regulacija glikogeneze
Održavanje nivoa glukoze u krvi je od izuzetnog značaja, tako da je i sinteza i degradacija depo
forme glukoze, glikogena, strogo regulisana. U jetri se sinteza glikogena ubrzava u fazi dobre uhra
njenosti, dok se degradacija glikogena pojačava u toku gladovanja. U skeletnim mišićima, degradaci
ja glikogena se odvija u toku intenzivnog vežbanja, a akumulacija započinje u stanju odmora mišića.
Reakcije glikogeneze i glikogenolize su odvojeno kontrolisane jer se odvijaju pod dejstvom različitih
enzima. I pored ovih odvojenih metaboličkih puteva, regulatorni mehanizmi ova dva procesa pokazu
ju dosta sličnosti jer isti alosterni modulatori i hormoni regulišu ove procese. Regulatorni enzim pro
cesa glikogeneze je glikogen-sintaza. Glikogen-sintaza je regulisana alosterno i enzimski katalizova-
nom kovalentnom modifikacijom koja je pod hormonskom kontrolom.
K2C2
cAMP- zavisna
protein kinaza
(inaktivna) (aktivna)
Adrenalin Glukagon
a -adrenergični
receptor
Veliki deo organizmu potrebnih masnih kiselina se unosi putem hrane. U organizmu se odvijaju i
procesi sinteze masnih kiselina ukoliko hrana sadrži malo masti, a bogata je ugljenim hidratima i pro
teinima. Višak unetih ugljenih hidrata i proteina iz hrane može se metaboiisati u masne kiseline koje
se potom deponuju kao triacilgliceroli. U humanom organizmu biosinteza masnih kiselina primarno
se odvija u jetri i u manjim količinama u mlečnim žlezdama, masnom tkivu i bubrezima. Biosinteza
masnih kiselina odvija se kondenzacijom jedinica sa dva C-atoma reakcijama koje su uglavnom re
verzibilne p—oksidaciji, uz korišćenje ATP-a i redukovanog NADPH. Prekursor u sintezi masnih kise
lina je acetil-KoA, ali samo za prva dva C-atoma. Ostali C-atomi u palmitinskoj kiselini potiču od ma-
lonil-KoA. Razlike između (3-oksidacije i biosinteze masnih kiselina omogućavaju nezavisnu regula
ciju ova dva procesa u sličnim fiziološkim uslovima i izbor energetski povoljnijeg procesa. Ova dva
procesa su lokalizovana u različitim delovima ćelije. Dok se (3-oksidacija odvija u mitohondrijama, bi
osinteza masnih kiselina se dešava u citozolu. Nosilac acil-ostatka u biosintezi masnih kiselina nije
KoA, već acil-prenosni protein (ACP). ACP sadrži fosfopantotensku grupu poput KoA, koja gradi tio-
estre sa acil-grupama (Slika 18-1). Fosfatna grupa fosfopantotenske prostetične grupe je
H H OHCH3 0
I I II
HS—CH 2 —CH 2 — N— C — C H 2 — C H 2 — N- c- - CI — CI — C H 0 -- P — 0 - - C H 2 - -Ser- -ACP
v i, :—f u IIII I I i
1
o 0 H CH 3 0
Cisteamin
Fosfopantotenska grupa ACP
H H
I
OHCH3
I I
O o
N — C —•C-
H S — C H 2 — C H 2 — N — C — C H 2 — C H 2 —•N- C — C — C H 2 — O — P — O — P — O - •CH2 . 0 Adenin
j
" II II I I l_ l_
O O H CH 3 0 0 JH H
Cisteamin
Fosfopantotenska grupa KoA H H
X)3PO OH
esterifikovana sa OH-grupom serina dok je kod KoA ona vezana za AMP. Kod sisara ACP je deo ve
likog multifunkcionalnog proteina.
Biosintetski procesi u metabolizmu masnih kiselina mogu se podeliti na: mehanizme sinteze zasi
ćene masne kiseline i to palmitinske, mehanizme elongacije ove kiseline i desaturaciju masnih kiseli
na. Biosinteza palmitinske kiseline odvija se u dva supnja: (1) ATP karboksilacija acetil-KoA sa acetil-
KoA-karboksilazom u malonil-KoA; (2) dekarboksilacija malonil-grupe u reakcijama kondenzacije ko
je katalizuje multienzimski kompleks sintaza masnih kiselina.
Sinteza malonil-KoA
Malonil-KoA se dobija iz acetil-KoA reakcijom karboksilacije koju katalizuje enzim acetil-KoA-
karboksilaza. Ovaj stupanj u biosintezi masnih kiselina, a samim tim i ovaj enzim je opredeljujući tj.
ključni enzim. Acetil-KoA-karboksilaza je regulisana alosterno i hormonski. Reakcija karboksilacije je
slična reakcijama koje katalizuje propionil-KoA-karboksilaza (Slika 15-5) i piruvat-karboksilaza (Slika
17-3). Reakcija zahteva energiju u vidu ATP-a i koristi rastvoran bikarbonat kao izvor C0 2 . Kao i dru
gi enzimi koji katalizuju transfer C 0 2 na supstrat, i acetil-KoA-karboksilaza zahteva biotin kao proste-
tičnu grupu. Reakcija se odvija karboksilacijom biotina, prosteticne grupe enzima u prisustvu ATP-a
pri čemu nastaje intermedijarni karboksibiotinil-enzim, a u sledećem stupnju dolazi do prenosa kar-
boksilne grupe na acetil-KoA i nastanka malonil-KoA (Slika 18-2). lako je C 0 2 neophodan za ovu re
akciju, njegovi atomi ne ulaze u sastav palmitinske kiseline.
COo
_ i * Acetil-KoA- Q
^ V karboksilaza ~Q M
U biosintezi masnih kiselina koristi se acetil-KoA iz mitohondrija koji potiče iz dva izvora: reakcije
piruvat-dehidrogenaze i 0-oksidacije masnih kiselina. Acetil-KoA prelazi iz mitohondrija u citozol tri-
karboksilatnim-citratnim šatl sistemom jer koenzim A ne može da prođe kroz mitohondrijalnu mem
branu (Slika 18-3). Ovaj pomak od oksidacije masnih kiselina i glikolize ka biosintezi masnih kiselina
se dešava kada su potrebe za energijom smanjene. Rezultat ovoga je smanjena oksidacija acetil-
KoA u CLK i oksidativnoj fosforilaciji. Na ovaj način mitohondrijalne acetil-jedinice se mogu sačuvati
u vidu triacilglicerola za energetske potrebe u budućnosti. Citrat nastaje kondenzacijom oksalacetata
i acetil-KoA u prisustvu citrat-sintaze. Nakon prolaska kroz membranu citrat se u citoplazmi razlaže
na oksalacetat i acetil-KoA pomoću reakcije katalizovane sa ATP-citrat-liazom u prisustvu ATP-a.
Ova reakcija je reverzibilna reakciji katalizovanoj sa enzimom ciklusa limunske kiseline citrat-
sintazom, ali za razliku od nje zahteva energiju hidrolize ATP-a. U ovoj reakciji pored acetil-KoA nas
taje oksalacetat koji se redukuje u malat dejstvom malat-dehidrogenaze i u prisustvu NADH. Produkt
reakcije malat se oksidativno dekarboksiliše u piruvat pomoću maličnog enzima (NADP-malat-
dehidrogenaza). Koenzim ove reakcije je NADP+ koji se redukuje u NADPH. On predstavlja redukci-
oni ekvivalent koji se koristi u reakciji sinteze masne kiseline. Rezultat svih ovih reakcija je pored
konverzije mitohondrijalnog acetil-KoA u citozolni acetil-KoA i produkcija redukcionih kofaktora neop
hodnih za aktivnost sintaze masnih kiselina.
HO — C—H
ADP + Pi i
I
piruvat-karboksilaza
coi
HCO3 + ATP NADP +
matični enzim
NADPH + C 0 2
COo
I i
c=o Piru vat Piruvat
c=o
i I
CH 3
su pokazala da je kod prokariota sintaza masnih kiselina multienzimski kompleks koji se sastoji iz 7
različitih enzima. Acetil-KoA i malonil-KoA se prenose na ACP dejstvom acetil-KoA-ACP- transacila-
ze (reakcija 1) i malonil-KoA-ACP-transacilaze (reakcija 2b) (Slika 18-4). Acetil-grupa vezana kao ti-
oestar u acetil-KoA se prenosi najpre na ACP, a potom na cisteinski ostatak (3-ketoacil-ACP-sintaze
(enzim kondenzacije) (reakcija 2a). Vezivanjem ovih jedinjenja nosilaca C-atoma za ACP i cisteinski
ostatak enzima omogućen je njihov ulazak u ciklus sintaze masnih kiselina. U reakciji 3 dolazi do
kondenzacije, malonil-ACP se dekarboksiliše i stvoreni karbanjon napada acetil-tioestar i gradi se
acetoacetil-ACP. U ovoj reakciji koju katalizuje p-ketoacil-ACP-sintaza izdvaja se C 0 2 koji je ugrađen
u prvoj fazi karboksilacije acetil-KoA. Dekarboksilacija omogućava da se reakcija završi i energetski
usmerava proces ka sledećim reakcijama. Sledeći niz od tri reakcija su reverzibilne reakcije u odno
su na B-oksidaciju. U reakciji 4 dolazi do redukcije keto-grupe acetoacetil-ACP, uz oksidaciju NADPH
18-4 Opšta biohemija
o COJ O
li
C H 2 — C — S K 0 A + H—SACP
C H 3 — C — S K o A + H—SACP
Malonil-KoA
Acetil-KoA
l |—- acetil-KoA-ACP 2b malonil-KoA-A CP
H S Ko A "* l - transacZ/aza H—SKoA -transacilaza
C0Z2 O
I II
CH3—C—SACP CH 2 —C—SACP
Acetil-ACP Malonil-ACP
H—S—E
H—SACP
p- ketoacil-A CP-sintaza
(enzim kondenzacije)
C0 2 + H—S—E
H+ + NADPH -
enoil-ACP-reduktaza
NADP+
CH3—CH2—CH2—C—SACP
Butiril-ACP
l Reciklizacija reakcija od 2 do 6
r šest puta
!
O
II
CH3CH2 —(CH2)13— C — SACP
Palmitoil-ACP
H 2 00 —>J
— J palmitoih
palmitoihtioesteraza
* O
CH 3 CH 2 —(CH 2 ) 1 3 —C—O" H—SACP
Palmitat
N*~
f>-Ketoacil-ACP-
sintaza
o o &-Ketoacil-ACP-
Acetil-KoA-ACP Pantotenska kiselina reduktaza
transacilaza
$-Hidroksiacil-ACP-
dehidrataza
p -Hidroksiacil-ACP-
dehidrataza
Acetil-KoA-ACP-
transacilaza
Malonil-KoA-ACP-
kiselina transacilaza
V-Ketoacil-ACP-
sintaza
Slika 18-5. Šematski prikaz strukture dimernog enzima sintaza masne kiseline.
Biosinteza masnih kiselina kod eukariota još uvek nije detaljno ispitana, ali se zna da se ona od
vija pomoću enzima sintaze masne kiseline. Ovaj enzim je dimer, a svaki monomer sadrži 7 domena
sa različitim enzimskim aktivnostima i sa osmim domenom koji kovalentno vezuje 4-fosfopantotein
proteina nosača acil-grupe (ACP) (Slika 18-5). Struktura ovog enzima omogućava da se biosinteza
masnih kiselina odvija kontinuirano na relativno malom prostoru pri čemu fosfopantotenski lanac
zbog svoje dužine i fleksibilnosti ima ulogu da kao ruka prenosi intermedijere biosinteze sa jednog
katalitičkog domena enzima na drugi. Pored SH-grupe fosfopantotenskog ostatka ACP-a za biosinte-
zu masnih kiselina je važna i SH-grupa cisteinskog ostatka (3-ketoacil-ACP-sintaze. Reakcija kon
denzacije zahteva bliskost SH-fosfopantotenske grupe ACP i cisteinskog ostatka enzima i ona je re
zultat interakcije dva monomera sintaze masne kiseline u odnosu glava-rep. Sjedinjavanje svih en
zima jednog posebnog metaboličkog puta u jednu multienzimsku funkcionalnu jedinicu omogućava
veliku brzinu, efikasnost i smanjuje mogućnost interferencije drugih kompetitivnih procesa.
18-6 Opšta biohemija
Slika 18-6. Mehanizam dejstva dimernog enzima sintaze masne kiseline u procesu biosin-
teze palmitinske kiseline.
Na Slici 18-6 data je pretpostavka mehanizma sinteze palmitinske kiseline pomoću sintaze mas
nih kiselina. Enzim je predstavljen kao muitifunkcionalni dimer, a svaki pored aktivne SH-grupe ciste-
ina (3-ketoacil-ACP-sintaze i SH-pantotenske grupe ACP, ima još 6 drugih katalitičkih domena. U re
akciji 1 prekursor acetil-KoA se vezuje za cisteinski ostatak p-ketoacil-ACP-sintaze i na taj način je
izvršeno prajmiranje (započinjanje) procesa. Malonil-ostatak se vezuje za ACP dejstvom malonil-
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam lipida 18-7
KoA-ACP-transacilaze. Ove dve reakcije se odvijaju na obe subjedinice sintaze masne kiseline tako
da se u stvari vežu dva acetil- i dva malonil-ostatka. U ovoj fazi dolazi do kuplovanja acetil-grupe sa
P-C-atomom malonil-grupe druge subjedinice uz istovremenu dekarboksilaciju. Ovom dekarboksilaci-
jom izdvaja se C 0 2 koji je ušao u malonil-grupu u toku karboksilacije acetil-KoA tako da se u kraj
njem proizvodu palmitinskoj kiselini on ne nalazi. Stvoreni acetoacetil-ACP podleže reakcijama redu
kcije, dehidratacije i opet redukciji i nastaje butiril-ACP. Butiril-ACP se prenosi na SH grupu cisteina
prve subjedinice i sistem je spreman za ugradnju još jednog C2-fragmenta. Ugradnja C2-fragmenata
vrši se preko malonil-KoA i reakcije 2-7 se ponavljaju još šest puta. Tioestarska veza palmitoil-ACP
se dejstvom palmitoil-tioesteraze hidrolizuje na palmitat i enzim se regeneriše za novi ciklus sinteze.
Poređenjem (3-oksidacije masnih kiselina i biosinteze masnih kiselina možemo videti sličnost u
reakcijama skraćivanja odnosno produžavanja lanaca masnih kiselina za C2-fragmente. Pored slič
nosti postoje i razlike koje su sumirane na Slici 18-7. Ova dva procesa, kao što je već rečeno, razli
kuju se po mestu odigravanja. p-oksidacija masnih kiselina se odvija u mitohondrijama, a sinteza u
citoplazmi (1). Nosilac acil-grupe kod (3-oksidacije masnih kiselina je KoA, a u sintezi ACP (2). Re-
dukcioni koenzimi kod p-oksidacije masnih kiselina su NAD+ i FAD, a u sintezi masnih kiselina ne
ophodan je NADPH (3). Razlike između ova dva procesa se ogledaju i u stereohemiji reakcije hidra-
tacije/dehidratacije (4). U p—oksidaciji masnih kiselina nastaju C2-fragmenti u vidu acetil-KoA, dok je
u procesu biosinteze donor C2-fragmenata malonil-KoA (5).
p-oksidacija Biosinteza
t - »P
H,0->
3-L-hidroksiacil-KoA L
-p-hidroksiacil- D-P-hidroksiacil- 3-|_-hidroksiacil -ACP
grupa grupa
NAD+- NADP*
NAD je akceptor NADPH je donor
NADH+ H * * elektrona elektrona NADPH + H
8Acetil-KoA + 14NADPH + 7ATP > palmitat + 14NADP+ + 7ADP + 7Pj + 8K0A + 6H20
Za sintezu palmitinske kiseline potrebno je ukupno 14 molekula NADPH koji se stvaraju u dva
različita ciklusa. Prvi izvor NADPH je ciklus reakcija vezanih za transport acetil-KoA iz mitohondrija u
citozol. Konverzija malata u piruvat koja se dešava u citozolu i pri kome se malat oksidiše i dekarbo-
ksiliše pomoću citoplazmatskog NADP+-zavisnog malatnog enzima (matični enzim) produkuje zna
čajnu količinu citozolnog NADPH (Slika 18-3). Fosfoglukonatni put je drugi izvor redukcionih ekviva-
lenata NADPH za sintezu masne kiseline. Tkiva u kojima je fosfoglukonatni put jako aktivan su speci-
jalizovana za aktivnu lipogenezu: jetra, masno tkivo i mlečne žlezde u toku laktacije. Takođe, oba
metabolička puta se nalaze van mitohondrija, tako da ne postoje membranska barijera za prenos
NADPH/NADP" iz jednog puta u drugi.
Regulacija procesa biosinteze masnih kiselina, kao i u slučaju (3-oksidacije ostvaruje se dejstvom
kratkoročnih i dugoročnih regulatornih faktora.
Kratkoročna regulacija se ostvaruje regulacijom aktivnosti glavnog regulatornog i ujedno opre-
deljujućeg enzima acetil-KoA-karboksilaze. Aktivnost enzima se reguliše alosterno i hormonski. Ispi
tivanja su pokazala da je acetil-KoA-karboksilaza multimerni enzim koji je aktivan u polimerizovanom
obliku. Brzina sinteze masnih kiselina kontrolisana je ravnotežom između protomerne (inaktivne) i
polimerne (aktivne) forme ovog enzima. Alosterna regulacija acetil-KoA-karboksilaze zasniva se na
efektu pojedinih metabolita na ovu ravnotežu (Slika 18-8). Citrat je pozitivni alosterni modulator koji
ravnotežu pomera prema polimernoj (aktivnoj) formi. Koncentracija citozolnog citrata se povećava
kada se akumulira acetil-KoA u mitohondrijama što se onda odražava i na sintezu masnih kiselina.
Palmitoil-KoA i malonil-KoA su inhibitori ove polimerizacije i oni mehanizmom povratne sprege inhibi-
raju acetil-KoA-karboksilazu.
Citrat
tt <
n —H»»»
Protomer j Qf) Polimer
(inaktivan) [ (aktivan)
Maioriil-KoA
Palmitoil-KoA
Dugoročna regulacija je zasnovana pre svega na uticaju načina ishrane na sintezu enzima koji
učestvuju u biosintezi masnih kiselina. Dugotrajno unošenje hrane koja je bogata ugljenim hidratima,
a bez masti dovodi do povećane sinteze enzima acetil-KoA-karboksilaze i sintaze masnih kiselina.
Ishrana bogata mastima ili gladovanje dovodi do snižene sinteze enzima sintaze masnih kiselina i
acetil-KoA-karboksilaze. Prisustvo polinezasićenih masnih kiselina smanjuje koncentraciju ovih en
zima.
i
Insulin [ -:
Protein-fosfataza
P
Acetil-KoA- Acetil-KoA-
karboksilaza p karboksilaza
(inaktivna) (aktivna)
Glukagon
Adrenalin
Palmitinska kiselina je prekursor u sintezi dužih zasićenih masnih kiselina dejstvom određenih
elongaza. Elongaze se nalaze u mitohondrijama i endoplazmatičnom retikulumu. Elongacija u mito-
hondrijama se odvija uzastopnim dodavanjem i redukcijom acetil-jedinica u reakcijama reversnim u
odnosu na p-oksidaciju masnih kiselina. Ova dva puta se međusobno razlikuju samo u finalnoj reak
ciji gde je donor vodonikovih jona NADPH u reakcijama elongacije (Slika 18-10). Elongacija u endo
plazmatičnom retikulumu podrazumeva kondenzaciju malonil-KoA i acil-KoA. Nakon toga se odvija
NADPH-zavisna redukcija slična onoj kod sintaze masnih kiselina, samo što je nosač acil-grupe KoA
umesto ACP.
O O
l! II
R— C H 2 — C — SKoA + C H 3 — C — SKoA
Acil-KoA(C n ) Acetil-KoA
H—SKoA tiolaza
O O
R — C H 2 — C — C H 2 — C — SKoA
p -Ketoacil - KoA
H++ NADH-
3-L-Hidroksiacil- KoA-
dehidrogenaza
NAD"1"-*-
H O
i II
R — C H > — C — C H o — C — SKoA
" i
OH
L-P- Hidroksiacil-KoA
HoO Enoil-KoA-hidrataza
H O
I II
R — C H 2 — C = C —C —SKoA
I
H
a,p-*rans- Enoil-KoA
H + + NADPH
Enoil-KoA-reduktaza
NADP ^
o
R — C H 2 — C H 2 — C H 2 — C — SKoA
Acil-KoA (Cn+2)
U humanom organizmu ne postoji mogućnost stvaranja dvogube veze A12 i A15, tako da se mas
ne kiseline poput linolne i linolenske moraju da unose putem hrane i spadaju u grupu esencijalnih
masnih kiselina. Linolenska kiselina je od posebnog značaja jer je neophodna za sintezu arahidon-
ske kiseline. Arahidonska kiselina (eikozatetraenska kiselina) je prekursor grupe jedinjenja, eikoza-
noida - prostaglandina, leukotriena i tromboksana. Desaturaze humanog organizma su komponente
elektronskog transfernog sistema koji sadrži tri proteina; desaturazu, citohrom b5 i NADH-citohrom
b5-reduktazu (Slika 18-11). Elektroni oslobođeni u oksidaciji masnih kiselina u toku desaturacije pre
nose se na citohrom b5, a zatim na NADH-citohrom b5-reduktazu. Reakcije ovog kompleksa se deša
vaju na unutrašnjoj površini membrane endoplazmatičnog retikuluma i nisu vezane za oksidativnu
fosforilaciju u mitohondrijama.
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam lipida 18-11
(18:0-KoA) Fe 2+ red
NADH-citohrom
bg reduktaza
9
(A -18:l-KoA) Fe* °*
Slika 18-11. Transfer elektrona u reakciji koju katalizuje A -acil-KoA desaturazni kompleks.
Linoleil-KoA(18:2 A 9 ' 1 2 )
NADP
6-desaturaza
NADPH + H
y-Linoleil-KoA(18:3 A 6 - 9 - 1 2 )
Malonil-KoA
Elongacija u ER
Dihimo-y-Linoleil-KoA (20:3 A 8 1 1 U )
NADP + — ^
) 5-desaturaza
NADPH + H+ <<
Y
Arahidonil-KoA (20:4 ASAH.HJ
Fosfolipidi
(iz membrane ćelije)
Kortikosteroidi- -^ (—) Fosfolipaza A2
- ^ Lizofosfolipid
Arahidonska kiselina — Nesteroidni
Ciklooksigenaza
antiinflamatorni
5-lipooksigenaza
0 <• lekovi:
Acetilsalicilna
Indometacin
PGG,
1
5-HPETE Fenilbutazon
(5-Hidroperoksi
eikozatetraenska) Peroksidaza
PGH
Tromboksan-sintaza
Leukotrieni A4 (LTA4) ( 3 ) «*(• Dipiridamol
PGI2<-
—> Tromboksan A 2 (TxA2)
Arahidonska kiselina
•2 0 2
Ciklo-
oksigenaza
COO"
COO"
Na Slici 18-15 su dati glavni putevi sinteze prostaglandina iz PGH2 intermedijernog prekursora
serije-2 prostaglandina, prostaciklina i tromboksana. Prostaglandini serije-2 imaju još dve dvogube
veze van strukture prstena. Sinteza primarnih prostaglandina serije D,E i F kao i tromboksana ili pro
staciklina je katalizovana različitim enzimima koji su specifični u zavisnosti o kom tkivu ili organu se
radi. Iz ovoga proističe tkivna specifičnost tipa i količine sintetisanog prostaglandina. Trombociti sa
drže tromboksan-sintazu koja katalizuje sintezu tromboksana A2 (TxA2), snažnog vazokonstriktora i
stimulatora agregacije trombocita (inicijalne faze u koagulaciji). Vaskularne endotelijalne ćelije sadrže
prostaciklin-sintazu koja katalizuje sintezu prostaciklina l2 (PGI2), vazodilatatora i inhibitora agregaci
je trombocita. Ove dve supstance deluju suprotno i održavaju ravnotežu u kardiovaskularnom siste
mu.
.COOH
COOH
Arahidonska kiselina
COOH
o^/
PGH2 sinteza
prostaciklin - COOH
HO OH sinteza OH
tromboksan-
PGI2 (nestabilan) sinteza TxA2 (nestabilan)
I COOH
COOH
HO O.
Prostaciklin P G H
2 Tromboksan
HO ^0
HO OH
6-oksoPGF10t
Prostaglandini
Slika 18-15. Ciklični put metabolizma arahidonske kiseline: sinteza prostaglandina, prosta-
ciklina i tromboksana.
COOH O HO—CH2
O—C—CH3 Ser530
^ ^
Acetilsalicilna kiselina PGH-Sinteza
(aktivna)
O
COOH i!
CHa—C—O—CH5
OH
Ser530
Salicilna PGHrSintaza
kiselina (inaktivna)
Drugi metabolički put arahidonske kiseline vodi ka sintezi linearnog eikozanoida, leukotriena. U
ovom metaboličkom putu ne dolazi do ciklizacije već se dejstvom lipooksigenaze koja je dioksigena-
za stvaraju hidroperoksidna4edinjenja. Postoje razne vrste lipooksigenaza koje se razlikuju po mestu
napada kiseonika na dvogubu vezu, tako da nastaju različite monohidroperoksi-eikozatetraenske
kiseline (HPETE). Na Slici 18-17 prikazana je konverzija arahidonske kiseline u tri osnovne HPETE.
Za razliku od ciklooksigenaze u sintezi prostaglandina koja katalizuje bis-dioksigenaciju nezasićene
masne kiseline u endoperokside, lipooksigenaza katalizuje monodioksigenaciju nezasićene masne
kiseline pri čemu nastaje alil-hidroperoksid. Hidroperoksid se može pomoću lipooksigenaze vezati na
položaju 5, 12 i 15 arahidonske kiseline. Proizvodi ove oksigenacije su 5-HPETE, 12-HPETE i 15-
HPETE, koji su različito raspodeljeni u pojedinim tkivima.
Arahidonska kiselina
COOH
lipooksigenaza
OOH
/ COOH
5-Hidroperoksieikozatetraenska kiselina
(5-HPETE)
HOO. ''
COOH
12-Hidroperoksieikozatetraenska kiselina
(12-HPETE)
lh
HOO.
.COOH
15-Hidroperoksieikozatetraenska kiselina
(15-HPETE)
Sintetisani HPETE-hidroperoksidi nemaju hormonsko dejstvo, ali su vrlo reaktivni, nestabilni in-
termedijeri koji se redukuju u stabilne alkohole (HETE) ili se konvertuju u leukotriene. Leukotrieni se
sintetišu iz nestabilnog prekursora 5-HPETE. Prvo se sintetiše nestabilan epoksid, leukotrien A4
(LTA4) pomoću LTA4-sintaze, a zatim se metabolizam odvija u dva pravca: (a) sinteza 5,12^
dihidroksieikozatrienske kiseline (LTB4) ili (b) sinteza peptidoleukotriena LTC4| LTD4 i LTE4 (Slika 18-
18).
Konverzija 5-HPETE u diol LTB4 je katalizovana sa citozolnim enzimom LTB4-sintazom (LTA4-
hidrolaza) uz adiciju vode na dvogubu vezu. Sinteza peptidoleukotriena zahteva učešće redukova-
nog glutationa koji otvara epoksidni prsten u L T ^ dejstvom enzima glutation-S-transferaze pri čemu
nastaje LTC4. Sekvencionim uklanjanjem glutaminske kiseline i glicina dejstvom specifičnih peptida-
za nastaju leukotrieni LTD4 i LTE4.
18-16 Opšta biohemija
Lo-H
o
COOH
HC/TS
5-HPETE
H,0
COOH COOH
leukotrien A4-
hidrolaza
Leukotrien B4 (LTB4)
glutation-S-transferaza
COOH
CH — C — N H — C H 2 — COOH
O
y- glutamihtransferaza
HOOC—CH 2 — CH 2 — CH—COOH
NH 2
Glutaminska kiselina
COOH
*S—CH 2 O
I II
CH — C - N H — C Hz2 — COOH
I
NH 2
Leukotrien D 4 (LTD 4 )
Glicin '
OH
^COOH
S—CH2
I
CH —COOH
I
NH 2
Leukotrien E 4 (LTE 4 )
Slika 18-18. Sinteza leukotriena iz prekursora 5-HPETE preko nestabilnog leukotriena A4.
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam lipida 18-17
C. BIOSINTEZA TRIACILGLICEROLA
Giukoza / Glukoza
t
Dihidroksiaceton-fosfat
cofiza y Giikofiza
Dihidroksiaceton-fosfat
NADH -v.
NADH - > J Gliceroi-P-
} Glicerol-P- j. )\ dehidrogenaza
HAD+4r dehidrogenaza
Glicerol-
kinaza f G l i c e r o l - 3
Gliceroi-3-fosfat
Glicerol ^ - ^ | f o s f a t
ATP ADP
Sledeća faza u sintezi triacilglicerola je sinteza fosfatidne kiseline, acilacijom hidroksilnih grupa
glicerol-3-fosfata ili dihidroksiaceton-fosfata (Slika18-20). Masna kiselina se mora aktivirati pre ugra
dnje u triacilglicerol, vezivanjem za koenzim A. Reakcija aktivacije masne kiseline odvija se sa enzi
mom acil-KoA-sintetazom (tiokinazom) (Slika 15-1). Inicijalna reakcija je acilacija sa glicerol-3-fosfat-
aciltransferazom u mitohondrijama i endoplazmatskom retikulumu ili dihidroksiaceton-fosfat- aciltran-
sferazom i acil-dihidroksiaceton-fosfat-reduktazom {NADPH-zavisna reduktaza) u endoplazmatičnom
retikulumu ili peroksizomima. Stvorena lizofosfatidna kiselina se u sledećem stupnju aciluje sa acil-
KoA uz enzim L-acilglicerol-3-fosfat-aciltransferazom i nastaje 1,2-diacilglicerolfosfat (fosfatidna kise
lina).
18-18 Opšta biohemija
Hidrolizom fosfatidne kiseline dejstvom fosfataze fosfatidne kiseline nastaje 1,2-diacilglicerol (Sli
ka 18-21). Acilacijom ovog jedinjenja pomoću diacilglicerol-aciltransferaze nastaje triacilglicerol. U
enterocitima apsorbovani 2-monoacilgliceroli esterifikuju se u diacilglicerole u reakciji koju katalizuje
odgovarajuća 2-monoacilglicerol-transacilaza. Intermedijeri fosfatidna kiselina i diacilgliceroli se ko
riste i u sintezi fosfolipida. «
U adipoznom tkivu triacilgliceroli su deponovani u citozolu ćelije u anhidrovanom obliku. Oni slu
že kao depoi masti, koji su spremni za mobilizaciju kada je organizmu neophodna energija. U jetri se
malo triacilglicerola deponuje, već se oni prenose u plazmu, sa ostalim lipidima i apolipoproteinima
uz izgradnju lipoproteinskih VLDL čestica. Ovi de novo sintetisani triacilgliceroli se dostavljaju peri
fernom tkivu.
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam lipida 18-19
O
O C H2 o — O — C — R
II I
R—C—O—C—H
I
CH2—O—PO§~
Fosfatidna kiselina
Fosfataza
fosfatidne kiseline
O
II
O CHo—OH 2-monoacilglicerol- O C H o2 - O — C — R
II I
2
aciltransferaza II I
R—C—O—C—H
I
CH2—OH
T~r
u
R—C- -O—C—H
CH2—OH
H—SKoA
R—C—SKoA
2-monoacilglicerol Diacilglicerol
(intestinalnom digestijom) 0
II
-R"— C—SKoA
diacilglicerol"
\ aciltransferaza
-^H—SKoA
O
II
O C H 22 — O — C — R
II I
R- - C — O — C — H 0
I II
C H 2 — O — C—R"
Triacilglicerol
D. BIOSINTEZA FOSFOGLICERIDA
Sve ćelije izuzev zrelih eritrocita mogu da sintetišu glicerofosfolipide. Sinteza fosfolipida se odvija
na citozolnoj strani endoplazmatičnog retikuluma, iz koga se transportuju do Goldžijevog aparata, a
zatim do membrane organela ili plazmatske membrane gde predstavljaju glavne komponente u
strukturi. Drugi fosfolipidi se sekretuju egzocitozom u ekstracelularni prostor. U sintezi glicerofosfoli-
pida učestvuju brojni enzimi čija je specifičnost određena i asimetričnošću vezanih acil-grupa za C-1 i
C-2 atom glicerola. C-1 supstituenti su uglavnom zasićene masne kiseline, a C-2 su nezasićene du-
golančane masne kiseline.
Prekursori u sintezi diacilglicerofosfolipida su fosfatidna kiselina ili 1,2-diacilglicerol i odgovarajući
a[kphol. Sinteza fosfolipida u organizmu se odvija sa dva mehanizma: (1) putem aktiviranog 1,2-
diacilglicerola ili (2) putem aktiviranog alkohola (Slika18-22). Ključno mesto u sintezi glicerofosfolipi-
da je aktivacija koja se u oba slučaja odvija vezivanjem za citidin-difosfat (CDP) pri čemu nastaju
CDP-diacilglicerol ili CDP-alkohol. U drugoj fazi ove sinteze fosfatidna kiselina iz CDP-aktiviranog di-
acilglicerola reaguje sa inaktivnom polarnom glavom alkohola ili fosfomonoestar iz aktivirane polarne
glave CDP-alkohola deluje na 1,2-diacilglicerol.
18-20 Opšta biohemija
o
HgC-O-C-R, Alkohol
R2-C-0-C-H +
6 H2Ć-0-CDP
CĐP- Diacilglicerol
CDP- Diacitglkeroi
Karđiotiptn
CMP
Fbsfatidii Fosfatidil
holSn etanolamin
O HaC-O-C-R, CDP-AJkohol
R2-C-0-C-H + CDP-Holbi
H 2 C-OH CDP-Bartoiamtai
1,2- Diacilglicerol
Primarni put sinteze fosfatidNetanolamina i fosfatidilholina, dva najvažnija fosfolipida kod eukario-
ta, koristi holin i etanolamin iz hrane ili iz već postojećih fosfolipida u organizmu. Holin može da se
sintetiše i iz fosfatidilserina koji se nalazi u plazma-membrani. Ponovno korišćenje holina je važno jer
sinteza holina zahteva tri metil-grupe koje obezbeđuje metionin u aktiviranoj formi kao S-
adenozilmetionin. Metionin je esencijalna aminokiselina, tako da se deficijencija u ishrani ove amino-
kiseline odražava i na holin.
Metabolički put sinteze fosfatidiletanolamina i fosfatidilholina iz postojećeg etanolamina i holina
odvija se u tri faze (Slika 18-23 ). Prva reakcija je fosforilacija OH grupe polarne glave (etanolamina
ili holina) sa ATP-om, dejstvom odgovarajuće kinaze. U drugoj reakciji dolazi do reakcije fosfatne
grupe fosfoetanolamina ili fosfoholina sa CTP pri čemu nastaju CDP aktivirani intermedijeri, CDP-
etanolamin ili CDP-holin, dejstvom fosfoetanolamin-citidil-transferaze ili fosfoholin-citidil-transferaze.
U ovoj reakciji oslobađa se pirofosfat. U poslednjoj reakciji nestabilna, ali vrlo reaktivna pirofosfatna
veza CDP-etanolamina ili CDP-holina je izložena nukleofilnom napadu C-3 OH-grupe 1,2-diacil-
glicerola pri čemu se oslobađa CMP i nastaje odgovarajući glicerofosfolipid.
Drugi put sinteze fosfatidilholina je konverzija fosfatidilserina ili fosfatidiletanolamina u fosfatidil-
holin. Konverzija fosfatidilserina u fosfatidilholin najpre zahteva dekarboksilaciju fosfatidilserina u fos-
fatidiletanolamin, a zatim sledi serija od tri reakcije metilacije pri čemu se koristi S-adenozil-metionin
kao donor metil-grupe.
Put koji je ovde opisan je glavni put za sintezu dipalmitoilfosfatidilholina u pneumocitima tipa II
pluća. U ovom jedinjenju na poziciji jedan i dva glicerola nalazi se palmitat. Ovaj fosfolipid je glavna
lipidna komponenta surfaktanta pluća-ekstracelularnog tečnog sloja koji oblaže alveole. Surfaktant
ima ulogu da snižava površinski napon ovog tečnog sloja, sprečavajući kolaps alveola, kada je vaz-
duh izbačen. Respiratorni distres sindrom (bolest hijaline membrane) kod nedonoščadi je vezan za
nedovoljnu produkciju surfaktanta i odgovoran je za približno 15 % smrtnih slučajeva novorođenčadi
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam lipida 18-21
u zapadnim zemljama. Ovaj sindrom se može javiti i kod odraslih u slučajevima kada se ovi pneumo-
citi unište, recimo kao sporedni efekat kod primene imunosupresivne terapije ili hemoterapije.
+
HO— CH 2 —CH 2 —NR 3
R' = H Etanolamin
R* = CH 3 Holin
— ATP
etanolaminkinaza
ili holinkinaza ADP
O
+
-O — P—O—CH 2 —CH 2 —NR' 3
R' = H Fosfoetanolamin
R' =s CH 3 Fosfoholi n
0 0
II li
-NR'3+
Citidin—P—0- - P — 0 — C H 2 — C H 2 -
l I
o- o-
R' = H CDP-etanolamin
R' = CH3 CDP-holin
CDP-etanolamin:1,2-diacilglicerol.
fosfoetanolamin-transferaza 1,2-Diacilglicerol
ili CDP-holin:1,2-diacilglicerol- yg n\MX3
fosfoholin-transferaza
\
O
II
O CH 2 — O- c- R i
II I 2
R2—C — 0 — C — H o
* I II
•p- 0—CH 9 —CHo—NR'^
CH 2 —0- I
o
R' = H Fosfatidiletanolamin
R' = CH 3 Fosfatidilholin (lecitin)
Fosfatidilinozitol je važan membranski fosfolipid koji ima ključnu ulogu u ćelijskoj signalizaciji pu
tem fosfoinozitolskog puta (vidi poglavlje 21) i vezivanju glikoproteina za plazmatsku membranu.
Fosfatidilinozitol je neuobičajen fosfolipid zato što sadrži stearinsku kiselinu na poziciji 1 i arahidon-
sku kiselinu na poziciji 2 glicerola. Fosfatidilinozitol služi kao rezervoar arahidonske kiseline u mem- \J
brani i obezbeđuje supstrat za sintezu prostaglandina kada su potrebni. Fosfatidilglicerol se nalazi u
velikim količinama u membrani mitohondrija, kao komponenta surfaktnanta pluća i kao prekursor
kardiolipina (Slika 18-22).
Sinteza fosfatidilinozitola i fosfatidilglicerola odvija se aktivacijom hidrofobnog repa fosfatidne ki
seline. Prekursor u sintezi, fosfatidna kiselina, aktivira se pomoću CTP prelaskom u CDP-
diacilglicerol (Slika 18-24). U sledećoj fazi sa CDP-diacilglicerolom reaguje inozitol iz mioinozitola i
o
u
O cHa-O-C-Ri
Ra—C—0—C—H O
I II
CH2—O— P — 0 ~
I
0"
Fosfatidna kiselina
CTP ->|
J-— PP,
o
li
O cj^-o-C-Ri
Ra—C—0—C—H O O
I II I
CH2-o-p-o-p-o-Citidin •
l i
O" o~
CDP-diacilglicerol
Glicerol-3-fosfat—N / \ ^ - inozitol
—^CMP
o
U
0 C H2 2 — O — C — RX,
II I
Ra—C—0—C—H 0
I I!
C H 2 — O — P — O — CHo
1
« ,/
O" CHOH V
I
CH2—O—POf"
H H
Fosfatidilglicerol-fosfat Fosfatidilinozitol
H o
p,
II
O C H2 2 — 0 — C — R1,
II I
Ro—C—0—C—H 0
^ I II
CH2—O—P—O—CH2
I I
0~ CHOH
I
CH 2 OH
Fosfatidilglicerol
Biosinteza fosfatidilserina
0
II
0 CH 2 —0—C—Ri o
II 1 II
R 2 - C -- 0 — C H O
1 II II I
l
E. BIOSINTEZA SFINGOLIPIDA
Sfingolipidi sadrže ceramid, derivat aminoalkohola sfingozina, kao osnovnu strukturu. Polazni
putevi sinteze za ova jedinjenja, bilo da se radi o sfingomijelinu ili o glikosfingolipidima su isti. Cera
mid se sintetiše iz prekursora palmitoil-KoA i sejina u reakciji kondenzacije koju katalizuje 3-
ketosfinganin-sintaza ("reakcija 1). Ovaj enzim ima prostetičnu grupu piridoksal-5'-fosfat kao i drugi
enzimi u metabolizmu aminokiselina (Slika 18-26). Proizvod ove reakcije 3-ketosfinganin redukcijom
sa 3-ketosfinganin-reduktazom u prisustvu NADPH gradi sfinganin (reakcija 2). Konverzija sfingani
na u ceramid odvija se u dve faze. Najpre dolazi do acilacije sfinganina sa acil-KoA pri čemu nastaje
amidna veza između acil-grupe i 2-amino-grupe sfinganina. Reakciju katalizuje enzim acil-KoA-
transferaza pri čemu nastaje N-acilsfinganin (reakcija 3). U drugoj fazi ceramid nastaje oksidacijom
N-acilsfinganina u prisustvu FAD i enzima dihidroceramid-reduktaze (reakcija 4).
18-24 Opšta biohemija
0 C02"
KoA—S—C—CH 2 —CH 2 —(CH 2 ) 1 2 —CH 3 + H2N—C—H
i
CH2OH
Palmitoil-KoA Serin
3-ketosfinganin-sintaza
- > - COŽ + KoASH
O
C-CH2-CH2-(CH2)i2--CHs
H2N—C—H
I
CH2OH
3-Ketosfinganin
(3-ketodihidrosfingozJn)
NADPH + H +
3-ketosfinganin-reduktaza
NADP +
OH
I
CH—CH 2 —CH 2 —(CH 2 )i 2 —CH 3
H2N—C—H
I
CH2OH
Sflnganin OC/
(dihidrosfingozin) \$J
O
II
^R—C—SKoA
acil-KoA-transferaza
KoASH
OH
O CH — CH 2 —CH 2 —(CH 2 ) 1 2 — CH 3
R—C—NH—C—H
I
CH2OH
Dihidroceramid
(N-Acilsfinganin)
FAD
đrocei
dihidroceramid-raduktaza
FADH2
OH H
I I
O C H — C = C — (CH 2 ) 1 2 —CH 3
II l I
R—C—NH—C—H H
I
CH2OH
Ky
Ceramid
(N-Acilsfingozin)
Biosinteza sfingomijelina
O
II
OH H O CH2—O—C—R,
I I II I
O C H — C = C —(CHo)io—CH 3 Ro—C—O —C—H O
II I I I II
R—C—NH —C—H H C H 2 — O — P — O —CH 2 —N(CH 3 ) 3
I -
CH2OH O
Ceramid (N-Acilsfingozin)
Fosfatidilholin
Diacilglicerol
OH H H
O CH—C —C—(CH2/12— CH3
II I
R — C — N H —C—H O
I II
C H 2 — O — P — O — C H 2 — CH 2 — N(CH 3 ) 3
O"
Sfingomijelin
Biosinteza glikosfingolipida
Glukocerebrozid Galaktocerebrozid
x
Ceramid
(glikozilceramid) s^ (galaktozilceramid)
UDP UDP-glukoza UDP-galaktoza galaktoza
GlcPd—H.') ceramid
Glukocerebrozid
- UDP-Gal
•-UDP
Gal p (1—>-4) Gle p (1—-V) ceramid Gal a (1—^4) Gal p (1—^4) Gle p (1—*-l') ceramid
i» G
MS Triheksozil-ceramid
<x2
I <x2 - UDP-GalNAc
NANK - UDP-GalNAc
-UDP +-UDP
GalNAcpd- -4)Gaip(l— -4)Glcp(l- 1) ceramid GalNAcpd- -3) Gal a (1—»-4) Gal P (1—*- 4) Gle P (1—*-1*) ceramid
13 G]yi2 Globozid
I a2
NANK - UDP-Gal
-UDP
Gal p (1—^3) GalNAc p ( 1 — - 4 ) Gal P (1—^4) Gle P (1—*-l') ceramid
GMI t3
I a2
NANK
o o
I! II
o=s-o—P—o—CH2 0 Adenin
OH H
I I
O CH — C = C — ( C H 2 ) 1 2 — C H 3
~ 2 0 3 PO OH R—C—NH—C—H H
3'-Fosfoadenozin-5" I
3'-Fosfoadenozin-5'- CH 2 —O
fosfosulfat fosfat
CH 2 OH
Galaktocerebrozid-
H OH
Sulfatid (galaktocerebrozid-3-sulfat)
F. BIOSINTEZA HOLESTEROLA
Holesterol se sintetiše u skoro svim tkivima humanog organizma, ali u nekim organima se sinteti-
še u većim količinama i to su: jetra, creva, kora nadbubrežne žlezde i reproduktivni organi (ovarijumi i
testisi). Od ukupne količine holesterola u organizmu polovina je de novo sintetisana. Obzirom na ve
liki biološki značaj holesterola u organizmu kao sastavne komponente ćelijske membrane i kao pre-
kursora u sintezi steroidnih hormona, žučnih kiselina i vitamina D, izuzetno je važno za neka tkiva
organizma da su kontinuirano snabdevena sa holesterolom. Kako bi se koncentracija holesterola
održala na stalnom nivou, uključeni su brojni procesi transporta, biosinteze i regulacionih mehaniza
ma. Sinteza i korišćenje holesterola su međusobno regulisani da bi se sprečila prekomerna akumu
lacija holesterola u organizmu. Abnormalno deponovanje holesterola kao i višak lipoproteina bogatih
holesterolom ima poseban značaj u pojavi ateroskleroze i vodeći je faktor u nastanku koronarne arte
rijske bolesti.
Jetra ima ključnu ulogu u regulisanju nivoa holesterola. Holesterol u jetri potiče od: unetog holes
terola putem hrane, holesterola sintetisanog ekstrahepatično i endogeno sintetisanog u jetri. Sinteza
holesterola odvija se u citoplazmi i na endoplazmatičnom retikulumu.
V Svi atomi holesterola potiču od acetil-KoA. Pored acetil-KoA koji je prekursor u sintezi neopho
dan je i veliki broj redukcionih ekvivalenata u vidu NADPH. Redukcioni ekvivalenti u vidu NADPH se
uglavnom obezbeđuju u fosfoglukonatnom putu. Acetil-KoA potiče iz reakcija u mitohondrijama po
put: p-oksidacije dugolančanih masnih kiselina, oksidacije piruvata i oksidacije ketogenih amino-
kiselina leucina i izoleucina. Acetil-KoA se prenosi iz mitohondrija u citoplazmu trikarboksilatnim
transportnim sistemom koji je opisan kod sinteze masnih kiselina. Sinteza holesterola se odvija za
hvaljujući energiji koja se oslobađa hidrolizom visoko energetskih veza: tioestarske veze acetil-KoA i
fosfoanhidridne veze ATP-a. Najvažniji intermedijeri su izoprenske jedinice sa pet ugljenikovih ato
ma, poput izopentil-pirofosfata, farnezila i geranila. Holesterol se sintetiše u više faza (Slika 18-31):
1
3 Acetil-KoA -» Hidroksimetilglutaril-KoA
2 i \HMG-KoA-reduktaza\
Mevalonat
i 3
Izopentil-pirofosfat
i 4
Farnezil-pirofosfat
i 4
Skvalen
•i- Ciklizacija
•l Intermedijarni steroli
Holesterol
1. Sinteza P-hidroksi-p-metilglutaril-KoA
Ovaj proces se odvija u citoplazmi iz tri molekula acetil-KoA reakcijama koje odgovaraju počet
nim reakcijama sinteze ketonskih tela (Slika 18-32). Enzimi koji učestvuju u sintezi HMG-KoA nalaze
se u citoplazmi za razliku od enzima zasintezui ketonskih tela koji se nalaze u mitohondrijama. Naj-
pre dolazi do kondenzacije dva molekula acetil-KoA u acetoacetil-KoA dejstvom acetil-KoA-acetil-
KoA-tiolaze (reakcija 1). U ovoj reakciji stvara se nova C-C veza zahvaljujući energiji oslobođenoj hi
drolizom tioestarske veze i oslobađa se KoA. Acetoacetil-KoA i treći molekul acetil-KoA se konden-
zuju u p-hidroksi-p-metilglutaril-KoA dejstvom enzima HMG-KoA-sintaze. Parenhimske ćelije sadrže
dva izoenzima HMG-KoA-sintaze. Citoplazmatični deluje u sintezi holesterola, a mitohondrijalni učes
tvuje u sintezi ketonskih tela. U reakciji HMG-KoA-sintaze dolazi do aldolne kondenzacije između C-
atoma metil-grupe acetil-KoA i p-karbonil-grupe acetoacetil-KoA sa istovremenom hidroli-zom tioes
tarske veze acetil-KoA.
o o
II II
CH3—C—SKoA + CH3—C—SKoA
Acetil-KoA Acetil-KoA
1 tiolaza
JJ — 5KoA** ' (acetil'KoA-acetiltransferaza)
O O
I! II
CH3— C— CH2— C— SKoA
Acetoacetil-KoA
O
II
hidroksimetiigiutarii.KoA<iintaza
H20+ CH3—C—SKoA—->
2 (HMG-KoA sintaza)
H-SKoA*
OH O
i/ 0 2 C—CH 2 —C—CH 2 —C—SKoA
CH3
ft-Hidroksi-ft-metilglutaril-KoA (HMG-KoA)
2. Redukcija p-hidroksi-p-metilglutaril-KoA
Reakcija redukcije HMG-KoA u mevalonat dejstvom HMG-KoA-reduktaze je opredeljujuća u sin
tezi holesterola i regulisana je kompleksnim regulatornim mehanizmima. HMG-KoA-reduktaza je gla
vni regulatorni enzim u sintezi holesterola i to je membranski enzim endoplazmatičnog retikuluma. U
ovoj reakciji se tioestarska veza HMG-KoA redukuje u alkohol u prisustvu dva molekula NADPH i
H
\ /CH* HMO.KoA.r^taza HO CH3
. / C
^ O 2NADPH 2NADP KoA C
0 ^O "O ^O
HMG-KoA Mevalonat
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam lipida 18-29
hidrolizom tioestarske veze HMG-KoA oslobađa se KoA. Ova reakcija je ireverzibilna, a proizvod re
akcije je mevalonat koji ima šest C-atoma.
3. Konverzija mevalonata u izopentil-pirofosfat
Sinteza izoprenskih jedinica odvija se kroz dve uzastopne reakcije aktivacije mevalonata fosfori
lacijom. Fosforilacijom mevalonata povećava se i rastvorljivost ovog jedinjenja. Fosforilacija se odvija
u prisustvu ATP-a i enzima mevalonat-5-fosfotransferaze pri čemu nastaje fosfomevaionat (reakcija
1). Sledeći stupanj fosforilacije je opet u prisustvu ATP-a i enzima fosfomevalonat-kinaze (reakcija
2), a proizvod reakcije je 5-pirofosfomevalonat.
O — P —O—ADP
*P, + ADP +
pirofosfat.
O V OH O O mevatonaf- O O
s*—"V^| || || dekarbokstlaza || ||
"0—C — C H 2 — C — C H 2 — C H 2 — O — P — O — P —0~ ^ *- C H 2 = C — C H 2 — C H 2 — 0 — P — O — P —0~
\J i i_ i_ T
13 u u ' CH3 O 0
CH3 0 0 C*0 2
5-Pirofosfomevalonat Izopentil-pirofosfat
H,C izopentenil- H c
3
1 H 0 0 pirofosfat- I H O 0
H A. | || || izomeraza H / ^ J || ||
Cl { C — C H o — O — P — O — P — 0 ~ v
- JC ^ C — C H 2 — O — P — O — P —O"
jT\ {H H 0 0 H 0 0
B^H S Bf H
> SfiSSEl
pirofosfat V ?2+ pirofosfat
čiju dva molekula farnezil-pirofosfata po sistemu glava-glava (1-1'). Za ovu reakciju neophodan je
NADPH pri čemu se oslobađa NADP+ i pirofosfat (reakcija 3). Proizvod je skvalen, linearni poliugljo-
vodonični lanac sa 30 C-atoma. Farnezil-pirofosfat je prekursor i drugih biološki važnih jedinjenja po
put: dolihola, prenilnih proteina i ubihinona. Poslednja reakcija kondenzacije dva molekula farnezil-
pirofosfata dejstvom skvalen-sintaze se odvija u endoplazmatičnom retikulumu.
O-(P)-(P) o-©-©
Dimetilalil-pirofosfat Izope ntil-pirofosfai
prenil-transferaza
(glava-rep)
O-®-®
Geranil-pirofosfat
prenil-transferaza o-®-®
(glava-rep)
o-®-®
Farnezil-pirofosfat
NADPH
skvalen-sintaza^
®-®-o
(glava-glava)
Farnezil-pirofosfat
NADP + 2 PF ^
+
Skvalen
NADPH NADP
Skvalen 2,3-Oksidoskvalen
.C\
Enz—H
2,3-Oksidoskvalen
li
H—0
Protosterol katjon
+
2J— H
Konverzija lanosterola u holesterol je višestepeni proces, koji dovodi do: skraćenja bočnog ugljo-
vodoničnog lanca, uklanjanja tri metil-grupe, pomeranja dvogube veze sa C-8 na C-5 i redukcije dvo
gube veze između C-24 i C-25. Ovaj proces uključuje 19 različitih enzimskih reakcija u kojima je ne-
18-32 Opšta biohemija
Endogeno sintetisani holesterol služi kao prekursor u sintezi drugih biološki važnih jedinjenja kao
što su steroidni hormoni, vitamin D i žučne kiseline. Dalja sudbina holesteroia zavisi od organa gde
se on sintetiše. U ćelijama endokrinog sistema holesterol je prekursor u sintezi svih steroidnih hor
mona. Holesterol se konvertuje u pregnenolon iz koga se onda sintetišu pet klasa steroidnih hormo
na: glukokortikoidi (npr. kortizol), mineralokortikoidi (npr. aldosteron) i seksualni hormoni-androgeni,
estrogeni i progestini. U ćelijama jetre holesterol se može: (1) metabolisati u žučne kiseline i na taj
način višak holesteroia izlučiti putem žuči; (2) deponovati u ćelijama jetre u vidu holesterol-estara ili
(3) transportovati putem .krvi u periferne organe u vidu lipoproteinskih čestica. Holesterol se iz jetre
najvećim delom transportuje u periferno tkivo u okviru lipoproteinskih čestica (VLDL i LDL). Naj
važnija čestica koja transportuje holesterol je LDL, jer dostavlja holesterol perifernim organima čije
ćelije preuzimaju taj holesterol putem LDL-receptora. Holesterol se uklanja iz perifernog tkiva u jetru
pomoću HDL čestica u reversnom transportu holesteroia čime se smanjuje deponovanje holesteroia
u organizmu. Na Slici 18-34 su dati glavni izvori hoiesterola u jetri kao i putevi kojima holesterol na
pušta jetru.
Holesterol sintetisan
Holesterol unet hranom ekstrahepatično
De novo sintetisan u jetri g
HDL
Hilomikronski ostaci
Konverzija u
Slobodan holesterol žučne kiseline
LDL
sekretovan u žuč
Holesterol se u ćeliji, ali i u plazmi nalazi kao slobodan ili kao esterifikovan. Esterifikacija holeste-
rola se vrši na dva načina: intracelularno pomoću enzima acil-KoA-holesterol-aciltransferaza, ACAT
ili intravaskularno sa enzimom lecitin: holesterol-aciltransferaze, LCAT. Esterifikacija holesterola u
ćeliji pomoću enzima ACAT zasniva se na transferu aktivirane masne kiseline acil-KoA na hidroksilnu
grupu holesterola u položaju 3:
Endozom
LDL-
receptori
LDL Holesterol
Masne \
1
kiseline k
Amino-
Sinteza LDL-j HMG-KoA- i kiseline
receptora #•
reduktaza
Holesterol- * % *
estri Recirkulacija
Endoplazmatični LDL.receptora
retikulum
Relativno konstantan nivo holesterola u organizumu se održava primarno kontrolom de novo sin
tetisanog holesterola. Brzina sinteze holesterola se reguliše delimično i kroz unetu količinu hole
sterola hranom. Holesterol unet hranom i de novo sintetisan se koristi za stvaranje membrana i sin
tezu steroidnih hormona i žučnih kiselina. Najveći deo holesterola se ipak koristi u sintezi žučnih ki
selina i na taj način se holesterol izlučuje putem žuči.
Nivo holesterola u ćeliji se reguliše sa tri različita mehanizma (Slika 18-35):
(1) Regulacijom aktivnosti i koncentracije HMG-KoA-reduktaze.
2) Regulacijom viška intracelularnog holesterola kroz aktivnost acil-KoA:holesterol- _
aciltransferaze, AC AT. Ovaj enzim je regulisan reverzibilnom fosfori lacijom ili dugoročnom kontrolom
njegove sinteze.
(3) Regulacija sinteze LDL-receptora. U receptorskom putu metabolizma LDL čestica reguliše
se koncentracija holesterola u cirkulaciji. Intracelularna koncentracija holesterola reguliše se i sinte
zom LDL-receptora koji vezuju LDL čestice i na taj način preuzimaju holesterol iz sistemske cirkulaci
je. U slučaju povećanja nivoa holesterola u ćeliji to indukuje smanjenu sintezu LDL-receptora na ri-
bozomima granuliranog endoplazmatičnog retikuluma, a to znači manje vezivanje LDL čestica veza
nih za receptore i smanjeni ulazak holesterola u ćeliju.
HMG-KoA-reduktaza je glavni regulatorni enzim sinteze holesterola i podložan je različitim me
hanizama metaboličke kontrole. HMG-KoA-reduktaza je protein membrane endoplazmatičnog retiku
luma. Aktivno mesto enzima je okrenuto ka citozolu. Kontrola na nivou ovog enzima se ostvaruje re
gulacijom aktivnosti (kratkoročno) i koncentracije (dugoročno). Regulacijom ovog enzima reguliše se
koncentracija holesterola u ćeliji, ali i održava nivo holesterola u plazmi.
Kratkoročna regulacija aktivnosti HMG-KoA-reduktaze ostvaruje se: (a) alosternim efektima,
zapravo kompetitivnom inhibicijom mevalonatom i krajnim proizvodom, holesterolom i (b) kovalent-
nom modifikacijom procesom reverzibilne fosforilacije. Kovalentna modifikacija enzima (fosforilaci-
ja/defosforilacija) je pod dejstvom određenih hormona, HMG-KoA-reduktaza se hormonski kontroliše
kroz kompleksnu kaskadu aktivacije i inhibicije enzima, slično mehanizmu kontrole glikogen-sintaze.
HMG-KoA-reduktaza se fosforiliše (inaktivira) na ostatku serina sa kovalentno modifikovanim enzi
mom HMG-KoA-reduktaza-kinazom. Ova kontrola vodi ka konzervisanju energije kada nivo ATP-a
opadne, a nivo AMP se poveća. Krajnji efekat je da glukagon stimuliše stvaranje inaktivnog (fosforili-
sanog) oblika HMG-KoA-reduktaze, a time snižava količinu sintetisanog holesterola. Suprotni efekat
ima insulin koji stimuliše stvaranje aktivne (nefosforiiisane) forme HMG-KoA-reduktaze i dovodi do
povećane sinteze holesterola. Osobina insulina da stimuliše i glukagona da inhibira aktivnost HMG-
KoA-reduktaze je u skladu sa funkcijom ovih hormona u metaboličkim putevima. Bazična funkcija
ova dva hormona je da kontrolišu raspodelu i dostavu energije ćelijama u organizmu.
Dugoročna kontrola aktivnosti HMG-KoA-reduktaze se ostvaruje kroz kontrolu sinteze i degra
dacije ovog enzima mehanizmom povratne sprege (Slika 18-36) i to je najvažniji način kontrole. Ho
lesterol pomoću transkripcionih faktora koji reaguju na nivo holesterola u ćeliji, utiče na proces trans
kripcije i inhibira ekspresiju gena koji kodiraju enzim HMG-KoA-reduktazu. To znači da u slučajevima
visokog nivoa LDL-hoiesterola ili mevaionata, smanjuje se transkripcija gena za HMG-KoA-
reduktazu. Redukovani nivo holesterola aktivira ekspresiju gena i povećava sintezu holesterola. insu
lin isto tako utiče na dugoročnu kontrolu metabolizma holesterola povećavajući brzinu sinteze HMG-
KoA-reduktaze.
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam lipida 18-35
l Transkripcija
^ r^ HMG-KoA r\'Z"'"-.
Insulin ^i^J-reduktaza U < ' V GI"kagon
HMG-KoA Mevalonat
Hoiesterol •y
HC H(X
V^coo- Q^ COO"
H,C
O X.0H ,OH
Mevalonat
CH
R = H Kompaktin
R = CHa Lovastatin (mevinolin)
A. BIOSINTEZA AMINOKISELINA
Normalna ishrana obezbeđuje većinu aminokiselina potrebnih za biosintezu proteina i za produk
ciju azotnih jedinjenja male molekulske mase (Slika 19-1). Održavanje neophodne rezerve aminoki
selina u našem organizmu omogućeno je unosom hrane, razgradnjom telesnih proteina i biosintezom
nesencijalnih aminokiselina. Upravo biosinteza neesencijalnih aminokiselina najviše varira u organi
zmu i ključna je u regulaciji te ravnoteže. Procesi biosinteze aminokiselina međusobno se razlikuju
100 g/dan
Sinteza
Telesni proteini neesencijalnih
amino kiselina
^H^
400 g/dan
Varira
Rezerva aminokiselina
(100 g)
300-400 g 30gdnevno
dnevno
Sinteza:
Telesni proteini •Porfirina
•Kreatina
•Neurotransmitera
•Purina
•Pirimidina
•Drugih azotnih
jedinjenja
tako da postoji 20 različitih anaboličkih procesa. U našim ćelijama prisutni su svi potrebni enzimi za
sintezu otprilike polovine aminokiselina, koje čine grupu neesencijalnih aminokiselina. Esencijalne
aminokiseline se moraju unositi hranom jer naš organizam ne sadrži potrebne enzime za njihovu sin
tezu.
Tabela 19-1. Esencijalne i neesencijalne aminokiseline: broj enzima u biosintezi ovih aminokiselina.
Arginin 7 Alanin 1
Histidin 7 Asparagin 1
Izoleucin 8(+6) Aspartat 1
Leucin 3(+7) Ciste i n 2
Lizin 8 Glutamat 1
Metionin 5(44) Glutamin 1
Fenilalanin 10 Glicin 1
Treonin 6 Prolin 3
Triptofan 5(+8) Serin 3
Valin 1(+7) Tirozin 1
Ukupno enzima 59 15
Biosinteza alanina
Aminokiselina alanin sintetiše se iz prekursora piruvata reakcijom transaminacije. U ovoj reakciji
dolazi do transfera amino-grupe sa druge aminokiseline (glutamata) na keto kiselinu, piruvat pri če
mu se iz piruvata dobija alanin, a druga aminokiselina prelazi u a-ketokiselinu (a-ketoglutarat). Reak
ciju katalizuje alanin-aminotransferaza (Slika 19-2).
Alanin- H
O aminotransferaza I
H 3 C — C — COO"
H 3 C — C — COO"
NHJ
Piruvat Glutamat a-keto Alanin
glutarat
Aspartat-
O. H
o aminotransferaza
W II C- CH, COO"
C- ^-~ *-^ •
/ 1
/ CH 2 —C — COO"
"O a-keto-
Glutamat
glutarat Aspartat
Oksalacetat
o.^ H Asparagin- O
\
H
sintetaza C — C H 2 — C — COO"
C — C H 2 — C — COO"
~J
0 NHj
> / I
H2N NIlJ
Aspartat Asparagin
Glutamin Glutamat
O O aminotransferaza O. H
W W
C — C H 2 — C H 2 — C — COO" C — C H 2 — C H 2 — C — COO"
/ /
"0 "0 NHt
a- Ketoglutarat Amino- oketo-
kiseiina kiselina
Glutamat
Glutamin- NK
O H
sintetaza \\ I Ov H
W I
T
C — C H 2 — CH 2 — C — COO'
/ I C—CH2—CH2—C—COO"
/
OPOf NHt HoN NHt
Y-Glutamiifosfat Glutamin
ATP ADP+Pi •••" "
intermedijer
Pi
Glutamin je donor amino-grupe u mnogim biosintetskim procesima, a ujedno služi i kao depo
amonijaka. Zbog toga glutamin-sintetaza ima kontrolnu ulogu u metabolizmu amonijaka. Glutamin-
sintetaza kod sisara je aktivirana o-ketogiutaratom koji je produkt oksidativne dezaminacije glutama
ta. Ovaj način kontrole sprečava akumulaciju amonijaka.
Biosinteza prolina
Glutamat se konvertuje u prolin preko intermedijera glutamat-Y-semialdehida, koji se spontano
ciklizira i gradi A1-pirolin-5-karboksilat (Slika 19-5). Biosinteza prolina uključuje redukciju v-karboksi-
grupe glutamata u aldehidnu grupu stvaranjem interne Schiff-ove baze sa daljom redukcijom u prolin.
Redukcija v-karboksilne grupe glutamata u aldehid je endergonska reakcija i zahteva obogaćivanje
fosfatnom grupom iz ATP. Zato se najpre vrši fosforilacija sa Y-glutamil-kinazom pri čemu nastaje
glutamat-5-fosfat (reakcija 1). Redukcijom glutamat-5-fosfata u prisustvu NADPH-zavisne dehidroge-
naze nastaje glutamat-5-semialdehid (reakcija 2). Glutamat-5-semialdehid je u ravnoteži sa cikličnim
produktom A1-pirolin-5-karboksilatom koji se spontano formira, a ravnoteža je pomerena u smeru na
stanka cikličnog produkta jer je on stabilniji (reakcija 3). Sledeća reakcija je redukcija A1-pirolin-5-
karboksilata tj. zasićenje prstena pomoću A1-pirolin-5-karboksilat-reduktaze, čiji je koenzim NAD(P)H,
u stabilni proizvod prolin (reakcija 4).
±*u
ATP ADP
O H NADPH NADP* Pi
o H
JU
^ I
C—CH 2 —CH 2 — C — COO C—CH 2 —CH 2 —C—COO
_ / "O a P- 0 NH+
NH;
Glutamat Glutamat-5-fosfat _
H
/
C—CH 2 —CH 2 — C—COO" neenzimska H 2 C
N
I + < > I
CH 2
\
J_J^f^
•> H-
N H
3 3 H-C^. JC —COO 4 a .c—coo
Glutamat-5-semiaIdehid N H
AV Pirolin-5-karboksilat H
Prolin
Biosinteza serina
Serin se sintetiše iz intermedijera glikolize 3-fosfoglicerata, koji se oksidiše u 3-
fosfohidroksipiruvat pomoću 3-fosfoglicerat-NAD-dehidrogenaze (Slika 19-6). (2) Sledeća reakcija je
transaminacija uz glutamat kao donor amino-grupe. U ovoj reakciji transaminacije nastaje 3-
fosfoserin dejstvom piridoksal-zavisne aminotransferaze. (3) Poslednji korak u ovoj sintezi je hidroli
za 3-fosfoserina sa fosfoserin-fosfatazom na serin i fosfat. Glicin i serin su slobodno interkonverzibilni
i mogu preći jedan u drugi, tako da se serin može dobiti alternativno i iz glicina transferom hidroksi-
metil-grupe.
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam azotnih jedinjenja 19-5
s coo~ NAD
+
NADH COO"
I I
H—C—OH
c=o
CH 2 —OPOl" I
3-Fosfoglicerat CH 2 —OPOl"
3-Fosfo-
hidroksipiruvat
COO" H
glutamat a-ketoglutarat
I
HO—CH COO"
•* H 3 N — C — H
I
C H 2 — O P O 2f - NHj
Serin
3-Fosfoserin
Biosinteza glicina
Sinteza glicina odvija se na dva načina (Slika 19-7):
(1) Direktna konverzija serina u glicin pomoću serin-hidroksimetil-transferaze u reakciji gde je akcep-
tor metil-grupe tetrahidrofolat (THF) koji prelazi u N5,N10-metilen-tetrahidrofoiat (N5,N10-metilen-
THF).
(2) Kondenzacija C 0 2 i NH 4 + glicin-sintazom u prisustvu NADH i N5,N10-metilen-THF.
Sinteza glicina iz serina je reverzibilna reakcija. Ovu reakciju katalizuje jedan piridoksal-fosfat
zavisni enzim, serin-hidroksimetil-transferaza, koji kao kosupstrat koristi tetrahidrofolat. N5,N10-
metilen-THF je deo rezerve fragmenata sa jednim ugljenikovim atomom. Pošto je reakcija reverzibil
na, serin i glicin su u ravnoteži.
Glicin
N
H
THF H 9 N ^ ^ \ ^ N H
H
H I
N CH 2
\ 10I
o C—N—R
H 3 N-CH 2 ~~ coo~ CO2+NHJ H2
Glicin + N A D H N*N10- -Metilen-THF
+
NAD +
Biosinteza cisteina
Cistein se sintetiše iz metionina, esencijalne aminokiseline i serina, neesencijalne aminokiseline.
Serin obezbeđuje ugljenikov lanac i a-amino-grupu, a metionin SH-grupu. Obzirom da je metionin
esencijalna aminokiselina, sinteza cisteina se odvija isključivo, ako se hranom unosi dovoljno metio
nina. Metionin se mora prethodno aktivirati u vidu S-adenozilmetionina (SAM) u reakciji sa ATP u ko
joj dolazi do formiranja veze između S-atoma metionina i adenozil-ostatka ATP.
Cistein se sintetiše iz homocisteina koji je nastao iz metionina u dve uzastopne reakcije. Najpre
homocistein u reakciji sa serinom koju katalizuje cistationin-fi-sintaza gradi cistationin. U sledećoj
reakciji cistationin se hidrolizuje do a-ketobutirata i cisteina dejstvom cistationin-y-liaze (Slika 19-8).
L-Metionin
•ATP
Metionin-adenozil- SH
transferaza Mg'
P. + PPi CH 2
CH 2
NH2 HCNH 3 +
^N COO"
N
I II CH L-Homocistein
N
' "s^vCHa-S* L-Serin
Cistationin-
CH 2
p- sintaza
CH 2
^ H
OH OH HCNH 3 + 5
COO"
CH2-S _CH2
S-Adenozilmetionin
CH 2 HCNH 3 +
^ Metil akceptori +
HCNH 3 COO"
Metiltransferaza COO"
r „, V ^ A . Metilirani Cistationin
N
U* C' KS ^ produkti H20
Cistationin-
y- liaza
a-Ketobutirat + NH4 +
CH 2 SH
OH OH H C N H 3 +
HCNH 3 +
COO"
COO"
S-Adenozilhomocistein
L-Cistein
' Ari
Adenozilhomocisteinaza
Adenozi « 4 *
Slika 19- 8. Biosinteza cisteina iz metionina i serina. Intermedijer u ovoj bi osin tezi je S-
adenozilmetionin koji služi kao donor metil-grupe u mnogim metaboličkim procesima.
Biosinteza tirozina
Tirozin nastaje iz fenilalanina pomoću fenilaianin-hidroksilaze. Reakcija zahteva molekularni ki-
seonik i koenzim tetrahidrobiopterin, koji može da se sintetiše u telu (Slika 16-5). Jedan atom mole
kularnog kiseonika postaje hidroksilna grupa tirozina, a drugi se redukuje u vodu. U toku reakcije tet
rahidrobiopterin se oksidiše u dihidrobiopterin. Tetrahidrobiopterin se regeneriše iz dihidrobiopterina
u odvojenoj reakciji koja zahteva NADPH. Tirozin, kao cistein, nastaje iz esencijalne aminokiseline;
tirozin je neesencijalna, ali samo u prisustvu dovoljne količine fenilalanina u hrani.
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam azotnih jedinjenja 19-7
H
OOC — C H 2 — C H 2 — C —COO
* I
l
glutamat-
i -
*- OOC —CH 2 —CH 2 —CHo—NH
t 1 1
TTT +
A3
NH3 dekarboksilaza
Glutamat y -Aminobutema kiselina
(GABA)
CO,
H
C , H2 —C—COO"
CH „—0—coo — l
*- |i y— CH 2 — CH 2 — NHj
I histidin- ^ - M
Ji NH3 dekarboksilaza £
H JU
Histidin Histamin
Biosinteza serotonina
Serotonin ili 5-hidroksitriptamin sintetiše se i deponuje u raznim ćelijama organizma. Najveća ko
ličina serotonina je nađena u ćelijama intestinalne mukoze. Manje količine serotonina nalaze se u
trombocitima i u centralnom nervnom sistemu. Serotonin ima nekoliko fizioloških uloga uključujući
19-8 Opšta biohemija
percepciju bola, regulaciju spavanja, temperature i krvnog pritiska. Serotonin se sintetiše iz triptpfana
u dva stupnja (Slika 19-10): (1) hidroksilacija triptofana se odvija sa triptofan-hidroksilazom koja ima
5,6,7,8-tetrahidrobiopterin kao kofaktor. (2) Produkt 5-hidroksitriptofan se dekarboksiliše u serotonin
dejstvom aromatične aminokiselinske dekarboksilaze .
H triptofan - H
I hidroksilaza HO I
CH2—C—COO"
CH9—C—COO"
NH?
Tetrahidro- Dihidro-
biopterin biopterin
Triptofan + 5-Hidroksitriptofan
02 aromatična
aminokiselinska CO,
dekarboksilaza
HO
CHo—CHo — N H t
Biosinteza kateholamina
Dopamin, noradrenalin i adrenalin su biološki aktivni amini koji imaju zajednički naziv katehola-
mini. Dopamin i noradrenalin imaju funkciju neurotransmitera u mozgu i autonomnom nervnom sis
temu. Noradrenalin i adrenalin se sintetišu i u srži nadbubrega. Van nervnog sistema, noradrenalin i
njegov metilirani derivat adrenalin deluju kao regulatori metabolizma ugljenih hidrata i lipida. Svi ka-
teholamini se sintetišu iz tirozina, nizom međusobno povezanih reakcija (Slika19-11).
Tirozin se hidroksiliše u 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) pomoću tirozin-hidroksilaze, enzima
koji zahteva kofaktor 5,6,7,8-tetrahidrobiopterin (reakcija 1). Reakcija tirozin-hidroksilaze je regula-
torna i ovaj enzim se nalazi u centralnom nervnom sistemu, simpatičnim ganglijama i srži nadbubre
ga. Dekarboksilacijom L-DOPE nastaje dopamin u reakciji koju katalizuje aromatična aminokiselinska
dekarboksilaza (reakcija 2). Druga hidroksilacija pod dejstvom dopamin-/3-hidroksilaze prevodi do
pamin u noradrenalin (reakcija 3). U poslednjoj fazi (reakcija 4) dolazi do N-metilacije noradrenalina
sa S-adenozilmetioninom kao donorom metil-grupe pri čemu se stvara adrenalin. Reakciju katalizuje
enzim feniletanolamin-N-metiltransferaza.
Sinteza kateholamina zavisi od prisustva odgovarajućih enzima u ćeliji, odnosno u tkivu gde se
sinteza odvija. U žlezdi nadbubrega adrenalin je dominantan produkt, a u mozgu (sivoj masi) sinteza
se zaustavlja na nivou dopamina. Intermedijer u sintezi dopamina, L-DOPA koristi se kao lek u sluča
ju teškog oboljenja parkinsonizma gde dolazi do degeneracije sive mase. Dopamin se ne može da
vati jer ne prolazi krvno-moždanu barijeru. Uneta L-DOPA podleže dekarboksilaciji u dopamin. Iz L-
DOPE se sintetiše i pigment melanin.
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam azotnih jedinjenja 19-9
HO CH2—C—COO
NH£
Tirozin
Tetrahidrobiopterin
tirozin" + 0,
hidroksilaza
Dihidrobiopterin
+ H20
HO
H
HO- C H 2 — C— COO" Melanin
NHJ
Dihidroksifenilalanin
(L-DOPA)
aromatična
aminokiselinska CO.,
dekarboksilaza
HO
\
HO ^ r j V CH2- CH2-NH J
Dopamin
0> + Askorbat
dopamin-
$-hidroksilaza
^ ^ H o O + Dehidroaskorbat
HO
HO - / r ^ ) V c-CH2-NHJ
Noradrenalin
s~—S-Adenozilmetionin
feniletanolamin 4
N-metiltransferaza
^S-Adenozilhomocistein
HO
OH
HO C— CH 2 —N — CH : ,
I H
H
Adrenalin
C. BIOSINTEZA GLUTATIONA
Protein I Protein
x
V>S y SH
V ^ 3 ^ /
/R202 2ROH\
2GSH GSSG
4 f * \
NADP+ NADPH
t
Leukotrieni
SH
I
H O H,C O
H 3 N — C — C H 2 — C H 2 — C — N — C — C — N —CH 2 —COO'
H I H Aminokiselina
H (spolja) ;,
Glutation
6_Cys-Gly
H
H 3 N — C — C H 2 — C H 2 — C — N —C —COO" H 3 N —C—CH 2 —CH 2 —C—AK
I H
COO" _ „ H COO"
t- Giu-Cys
ADP + P,
A minokiselina
(unutar ćelije)
ATP HoC CHo
/ \
H 3 N—C—CH 2 —CH 2 —COO
I OOC —CH C=0
COO H
Glutamat 5-Oksoprolin
Slika 19-13. Sinteza i regeneracija glutationa kao dela v-gluiamilskog ciklusa (AK - aminokiselina).
D. BIOSINTEZA NUKLEOTIDA
Značaj salvage puteva je u tome što dolazi do znatne uštede energije za ćeliju, pošto je za put
de novo sinteze purinskih nukleotida potrebna velika količina energije (u obliku ATP). U eritrocitima
nukleotidi se sintetišu reciklizacijom pošto ne sadrže enzim 5-fosforibozil-a-pirofosfat-amidotrans-
ferazu (PRPP-amidotransferazu), koji je ključan u de novo sintezi nukleotida.
Atomi u purinskom jezgru potiču od izvesnog broja jedinjenja: arninokiselina (aspartata, glicina i
glutamina); C0 2 i derivata tetrahidrofolne kiseline. Ispitivanja sa radioizotopima ukazala su na pore
klo pojedinih atoma: N-1 purina potiče od amino-grupe aspartata; C-2 i C-8 potiču od formijata; N-3 i
N-9 od amidne grupe glutamina; C-4, C-5 i C-7 od jednog molekula glicina (zapravo molekul je kom
pletno inkorporiran u purinski prsten) i C-6 od HC0 3 "(C02) (Slika 19-14).
Glicin
Amino-grupa
aspartata *"?! " sV"/ ?\
sC~*— Formijat
Formijat-^cl Jc~ 9 /
3
N'
N
H
Amidna grupa glutamina
Biosinteza inozin-monofosfata
Purinski nukleotidi se sintetišu kao ribonukleotidi, a ne kao slobodne baze. Prvi sintetisani purin
ski nukleotid je inozin-monofosfat (IMP), nukleotid koji sadrži bazu hipoksantin. IMP nema normalno
u ćeliji zato što on odmah prelazi u adenozin-5'-monofosfat (AMP) i gvanozin-5'-monofosfat (GMP).
Sinteza purina kroz nadgradnju na ribozu odvija se pomoću nekoliko amidotransferaznih reakcija i
reakcija transformilacije.
Sinteza inozin-monofosfata se odvija u 11 stupnjeva (Slika 19-15).
(1) Aktivacija riboza-5-fosfata
Pošto se purini sintetišu kao ribonukleotidi (a ne kao slobodne baze) prvi stupanj u sintezi je
stvaranje aktivirane forme riboza-5-fosfata. Polazno jedinjenje za biosintezu purina je a-D-riboza-5-
fosfat, koji je produkt fosfoglukonatnog puta. U ovom prvom stupnju aktivacija ovog jedinjenja se od
vija pomoću ATP i enzima riboza-fosfat-pirofosfokinaze pri čemu se gradi 5-fosforibozil-a-pirofosfat
(PRPP). Ova reakcija se odvija nukleofilnim napadom OH grupe C-1 atoma riboze na p-fosfatni atom
ATP-a. U ovoj neuobičajenoj reakciji pirofosforil-grupa se direktno prenosi sa ATP na C-1 riboze-5-
fosfata i produkt ove reakcije ima a-konfig u raciju na C-1. Reakcija se dešava u mnogim tkivima zato
što PRPP ima više uloga i to: de novo sinteza purinskih i pirimidinskih nukleotida, reciklizacija ovih
nukleotida, stvaranje koenzima NAD i NADP. Enzim riboza-fosfat-pirofosfokinaza je regulisan kon
centracijom proizvoda ovog ciklusa (IMP) kao i jedinjenjima koja se dalje sintetišu (nukleozid-di- i tri-
fosfatima), verovatno kako bi se sinteza PRPP podesila potrebama za ovim jedinjenjima.
(2) Formiranje N-glikozidne veze (N-9 purinskog prstena)
Enzim amidofosforibozil-transferaza katalizuje zamenu pirofosfatne grupe PRPP sa azotom ami
dne grupe glutamina pri čemu nastaje p-5'-fosforibozilamin. Reakcija se dešava uz inverziju konfigu
racije na C-1 atomu riboze pri čemu nastaje p-konfig u racija karakteristična za nukleotide. Oslobađa-
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam azotnih jedinjenja 19-13
nje pirofosfata (PPj) i njegova dalja hidroliza obezbeđuje dodatnu energiju za ovu reakciju. Ovo je
glavni regulatorni i opredeljujući korak de novo sinteze purinskih nukleotida. Brzina ove reakcije je
kontrolisana intracelularnom koncentracijom glutamina i PRPP-a.
(3) Adicija glicina (C-4, C-5 i N-7)
U ovoj reakciji ceo molekul glicina se ugrađuje stvaranjem amida između karboksilne grupe glici
na i amino-grupe fosforibozilamina uz stvaranje 5'-fosforibozil-glicinamida. Enzim fosforibozil-
glicinamid-sintetaza katalizuje ovu reakciju, a hidroliza ATP obezbeđuje energiju za ovu reakciju u
kojoj se ugrađuje više od jednog atoma u purinski prsten.
(4) Uvođenje formil-grupe preko THF (C-8)
Slobodna a-amino-grupa 5'-fosforibozil-glicinamida se formiluje i nastaje 5'-fosforibozil-formil-
glicinamid. Za reakciju je neophodan N10-formil-tetrahidrofolat kao donor jednog C-atoma. N10-formil-
tetrahidrofolat je kofaktor koji prenosi grupe sa jednim C-atomom sa donora (serina, glicina i formija-
ta) na razne akceptore u biosintetskim reakcijama. Ovu reakciju katalizuje enzim fosforibozil-glicin-
amid-formiltransferaza.
(5) Adicija azota iz glutamina (N-3)
Drugi molekul glutamina uvodi još jednu amidnu grupu na rastućem prstenu purina i gradi se 5'-
fosforibozil-formilglicinamidin. Hidroliza ATP obezbeđuje energiju za ovu reakciju, a enzim fosforibo-
zil-formilglicinamidin-sintetaza katalizuje tu reakciju.
(6) Zatvaranje prstena i formiranje imidazola /
Za zatvaranje imidazolovog prstena neophodna je energija koja se dobija hidrolizom ATP. Intra-
molekularna kondenzacija dejstvom enzima fosforibozil-aminoimidazol-sintetaze dovodi do stvaranja
5'-fosforibozil-5-aminoimidazola.
(7) Adicija C0 2 (C-6)
C-6 atom purina se ugrađuje iz bikarbonata tj. C 0 2 dejstvom enzima fosforibozil-amidoimidazol-
karboksilaze uz molekul ATP-a. Proizvod reakcije je 5'-fosforibozil-karboksiaminoimidazol.
(8) Adicija amino-grupe iz as pa rta ta (N-1)
ATP je potreban za formiranje amidne veze između amino-grupe aspartata i karboksilne grupe
imidazolovog derivata. Mehanizam enzimske reakcije fosforibozil-amidoimidazol-sukcinokarboksi-
amid-sintetaze je sličan reakciji 3. Produkt reakcije je 5'-fosforibozil-5-aminoimidazol-4-(N-sukcinil-
karboksiamid).
(9) Eliminacija fumarata kidanjem N-C veze
Adenilsukcinat-liaza raskida N-C vezu aspartata pri čemu dolazi do transfera amino-grupe na de
rivat imidazola i odvajanja fumarata. Razlaganjem 5'-fosforibozil-5-amidoimidazol-4-(N-sukcinil-
karboksiamida) oslobađa se fumarat i nastaje 5'-fosforibozil-5-aminoimidazol-4-karboksiamid. Reak
cije 8 i 9 hemijski su slične reakcijama ciklusa uree u kojima citrulin gubitkom amino-grupe prelazi u
arginin. U oba ova metabolička procesa amino-grupa aspartata se prenosi na akceptor kroz reakciju
koja zahteva ATP i u kojoj se osnovni skelet ugljenikovih atoma aspartata eliminiše kao fumarat.
(10) Uvođenje formil-grupe (stvaranje C-2 atoma)
Finalni atom purinskog jezgra se dobija uvođenjem formil-grupe sa N10-formil-tetrahidrofolatom i
nastaje 5'-fosforibozil-5-formaminoimidazol-4-karboksamid dejstvom enzima fosforibozil-amino-
imidazol-karboksiamid-formiltransferaze. Kod bakterija ova reakcija i reakcija broj 4 indirektno su in-
hibirane sa sulfonamidima, koji sprečavaju sintezu folata kompeticijom sa derivatima p-amino-
benzoata. Humani organizam unosi folat putem hrane jer ne može da je sintetiše. Antibiotična svojs-n
tva sulfonamida su rezultat inhibicije biosinteze purinskih nukleotida, a samim tim i nukleinskih kiseli-;
na kod bakterija.
19-14 Opšta biohemija
« / ~ 2 0 3 P—O—CH, n H »r\ CH
U
H2N ^ ^ N
H > — f OH I
Riboza-5-fosfat
OH OH
O-D- Riboza-5-fosfat 5'-Fosforibozil-5-aminoimidazol
ATP + HCO3 fosforibozil-
ATP riboza-fosfat- aminoimidazohkarboksilaza
pirofosfokinaza
AMP
^03P-0-CH2 Q H
KH H>la ? ? V
H > j — f O—P—O— P—O" ^
OH OH Q - 0 - Riboza-5-fosfat
5-FosforiboziHx-pirofosfat(PRPP) 5'-Fosforibozil-karboksiaminoimidazol
Aspartat + ATP J fosforibozil-aminoimidazof-
Glutamin + H 2 0 amidofosforibozil- 8j sukcinokarboksiamid-
transferaza ADP + P, -^sintetaza
Glutamat + PP,
COO" O
_2 I II
0,P-0-CH NH, /
HC—NH — C - ^ n ^ N
H
H H
u
COO" H2N"L^N
X >
O H OH
P-5- Fosforibozilamin Riboza-5-fosfat
Glicin + ATP fosforibozih
glicinamid-sintetaza 5'-Fosforibozil-5-aminoimidazol-4-(N-sukcinilkarboksiamid)
ADP + P,
9. adenilsukcinat-lijaza
,CH2—NH2 v Fumarat
/
0 = C O
\ II
O3P-0-CH, NH C
n H,N
CH
.H H. /
H >j—f H H 2 N ^ ^ N
I
O H OH Riboza-5-fosfat
5'-Fosforibozikjlicinamid
5'-FosforiboziU5-aminoimidazol-4-karboksiamid
Ar10-Formil-THF fosforibozihglicinamid- AT u -Formil-THF fosforibozil-aminoimidazol-
formiltransferaza 10 karboksiamid-
THF T H F -* ^ formiltransferaza
H2C^ CH H2N^c^-cr^ ^
I II CH
0=C. 0 0=CH--N^C-i /
NH •N
! H
Riboza-5-fosfat Riboza-5-fosfat
5'-FosforiboziKormilglicinamid
5'-FosforiboziM>-formaminoimidazol-4-karboksiamid
ATP + Glutamin + H 2 0 fosforibozih
5 formilglicinamid~ 11, inozinmonofosfat-
HoO ciklohidrolaza
ADP + Glutamat + P, sintetaza
O
C
CH / \
II
HN <T\CH
HN = C. O H C C
NH ^ N / - l /
I
Riboza-5-fosfat ^ P - O - C H ^
5'-Fosforibozil-formilglicinamidin
kH H.
ATP fosforibozil- H ^f—f H
6 aminoimidazohsintetaza
ADP+P; OH OH
Inozin-monofosfat (IMP) (y
Riboza-5-fosfat
IMP
Aspartat + GTP -*. /
\ / 1MATV4* 4- W n — - K IMP-dehidrogenaza
] / adenilosukcinat- W A 1 J + M
2U V
GDP + P , ^ - / ' sintetaza +
NADH + H
"OOC — CHo—CH—COO"
2
I
NH
Riboza-5-fosfat
X Adenilosukcinat K s a n t o z i n - m o n o f o s f a t (XMP) <*
N
H I
Riboza-5-fosfat
AMP GMP
GMP se sintetiše u dva stupnja iz IMP. Konverzija IMP u GMP započinje hidratacijom i oksidaci
jom IMP u prisustvu koenzima NAD+ i enzima inozin-monofosfat-dehidrogenaze. Proizvod reakcije je
yL ksantozin-monofosfat (XMP) koji ima keto-grupu na položaju 2. XMP prelazi u GMP transferom ato
ma azota sa glutamina dejstvom gvanozin-monofosfat-sintetaze i uz ATP kao energetski izvor. Ovim
se završava de novo sinteza purinskih nukleotida.
Kontrola biosinteze purinskih nukleotida ostvaruje se na dva nivoa. Prvi nivo je u skladu sa pot
rebama ćelije za sintezom nukleotida IMP, GTP i ATP. Drugi nivo kontrole je zasnovan na održava
nju ravnoteže između ATP i GTP obzirom da svaki od njih stimuliše sintezu drugog obezbeđujući pot
rebnu energiju (Slika 19-17). GTP favorizuje sintezu AMP od IMP, dok ATP povećava sintezu GMP
v iz IMP. Ovaj reciprocitet balansira produkciju AMP i GMP.
Riboza-5-fosfat
Inhibicija PRPP
^ Aktivacija
5-fosforibozilamin
IMP
^©:
"••jk.
\ \ '.Adenil-sukcinat
\ \ | "AMP
ADP
I
ATP
(1) Sinteza IMP je regulisana prvim dvema reakcijama koje dovode do sinteze fosforibozil-pirofosfata
(PRPP) i sinteze 5-fosforibozilamina. Enzim koji katalizuje prvu reakciju riboza-fosfat-pirofosfokinaza
je inhibiran sa ADP i GDP. Regulatorna i opredeljujuća reakcija je reakcija transfera amidne grupe
glutamina na PRPP u kojoj nastaje fosforibozilamin. Enzim amidofosforibozil-transferaza podleže
alosternoj inhibiciji mehanizmom povratne sprege, nukleotidima i alostemoj stimulaciji sa PRPP.
Amidofosforibozil-transferaza je inhibirana sa AMP, GMP ili IMP. Nukleotidi inhibiraju enzim dovodeći
do toga da se mali aktivni molekuli enzima agregiraju u velike inaktivne molekule (Slika 19-18).
PRPP ima isto tako važnu ulogu u regulaciji. Normalne intracelularne koncentracije PRPP su ispod
Km vrednosti tog enzima za PRPP tako da svaka i mala promena u koncentraciji PRPP dovodi do
proporcionalne promene u brzini ove enzimske reakcije. Vrlo visoke vrednosti PRPP prevazilaze
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam azotnih jedinjenja 19-17
normalnu inhibiciju nukleotidima i dovode do toga da veliki, inaktivni agregati disociraju nazad u male
aktivne molekule.
AMP, GMP.IMP
>
<
PRPP
Amidofosforibozil- Amidofosforibozil-
transferaza transferaza
Aktivan enzim Inaktivan enzim
(2) Drugi nivo regulacije je na nivou račvanja koji vodi ka sintezi AMP i GMP. Regulacija se ostvaruje
u prvoj reakciji (Slika 19-16). AMP i GMP su kompetitivni inhibitori IMP u njegovoj sintezi, ali mehani
zam povratne sprege isto tako kontroliše i puteve razgranavanja jer GMP inhibira konverziju IMP u
XMP i AMP inhibira konverziju IMP u adenilsukcinat u reakciji koju katalizuje adenilsukcinat-liaza. De
novo sinteza purina je kompleksan, energetski zavisan put, tako daje vrlo striktno regulisan.
U većini ćelija odvija se aktivan promet nukleinskih kiselina, što dovodi do kontinuirane razgrad
nje kiselina i oslobađanja adenina, gvanina i hipoksantina. Ove slobodne purinske baze se ponovo
inkorporiraju u odgovarajuće nukleotide kroz procese reciklizacije ili "salvage puteve". Enzimi koji ka-
talizuju ove salvage puteve su fosforibozil-transferaze koje katalizuju adiciju riboza-5-fosfata iz PRPP
na purinsku bazu pri čemu nastaje nukleotid: _
Ovaj enzim nije toliko važan jer se adenin-nukleotidi primarno stvaraju iz IMP, a ne od slobodnog
adenina. Hipoksantin-gvanin-fosforibozil-transferaza (HGPRT) katalizuje analognu reakciju za hipok-
santin i gvanin:
Za razliku od sinteze purinskog prstena gde se on sintetiše na već postojeću ribozu-5-fosfat, pi- J
rimidinski prsten se sintetiše pre vezivanja za ribozu-5-fosfat, koja se dobija od PRPP. Izvor atoma
ugljenika i azota u pirimidinskom prstenu je glutamin (N-3), C 0 2 (C-2) i aspartat (N-1,C-4,C-5 i C-6)
(Slika 19-19). Obzirom daje pirimidinski molekul mnogo jednostavniji od purina, to je i sinteza jedno
stavnija.
A
g.2tnamTnaPa
N
" ^ ^ ^ k Aspartat
HCO
Sinteza uridin-monofosfata
Prvi pirimidinski nukleotid koji se sintetiše je orotidin-5'-monofosfat. On zauzima centralno mesto
u stvaranju pirimidina pošto su nukleotidi uracila, citozina i timina izvedeni iz njega. Reakcije de novo
sinteze su sledeće (Slika 19-20):
(1) Sinteza karbamoil-fosfata (C-2 i N-3 pirimidinskog prstena)
Sinteza karbamoil-fosfata odvija se u citozolu ćelija tkiva gde se sintetišu pirimidini (najviše u sle-
zini, timusu, GIT i testisima) iz prekursora glutamina, HC03" i 2 molekula ATP-a. Ovu reakciju katali
zuje enzim karbamoil-fosfat-sintetaza II koji ne zahteva biotin iako je enzim karboksilaza. Donor azo
ta je amidna grupa glutamina, a enzim zahteva 2 molekula ATP-a, pri čemu jedan samo obezbeđuje
energiju, a drugi je ujedno i donor fosfatne grupe u ovoj reakciji. Ova reakcija je slična reakciji sinteze
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam azotnih jedinjenja 19-19
Y_ arginina u ciklusu uree, ali nju katalizuje drugi enzim karbamoil-fosfat-sintetaza I koja je locirana u
mitohondrijama.
Karbamoil-fosfat-sintetaza II je regulatorni enzim de novo sinteze pirimidinskih nukleotida u hu
manom organizmu. Reakcija karbamoil-fosfat-sintetaze II predstavlja jedini izvor karbamoil-fosfata u
ekstrahepatičnom tkivu. To je citozolni enzim, za razliku od karbamoil-fosfat-sintetaze I. Druga razlika
je u tome što karbamoil-fosfat-sintetaza I, koristi slobodan amonijak, a ne glutamin kao izvor azota. U -c...
stanjima povećane koncentracije amonijaka u krvi, jetra može da iskoristi de novo put biosinteze pi-
rimidina za detoksikaciju amonijaka stvaranjem karbamoil-fosfata u mitohondrijama. Ovaj karbamoil-
fosfat prelazi u citozol i postaje supstrat za aspartat-karbamoil-transferazu, pa se velike količine orot-
ske kiseline izlučuju kao rezultat toksičnih količina amonijaka.
(2) Adicija aspartata (N-1, C-4, C-5 i C-6)
Reakciju kondenzacije karbamoil-fosfata i aspartata u karbamoil-aspartat katalizuje enzim aspar-
tat-transkarbamoilaza koji je glavni regulatorni enzim biosinteze pirimidina kod bakterijskih ćelija.
Reakcija se odvija bez potrošnje ATP zato što je karabamoil-fosfat već aktiviran.
O
II
HO—C
NH 9 *CH,
^sA-'v. -. CH COO"
COO" "OaP-0-CH2
H
Karbamoil-aspartat
HoO dihidroorotaza
OH OH ^ s
Orotidin-monofosfat (OMP) (SLJ
O
CQ2~+-^ OMP-dekarboksilaza
V
HN' CH 2
I•
.CH
0 ^
g COO
Dihidroorotat
NAD +
dihidroorotat
NADH+H+- dehidrogenaza
OH OH
Uridin-monofosfat (UMP)
o
H>
O O O
0 — P — O — P — O — P —O—H2C 0
O 0" O" JH H
H^j—f H
OH OH
UTP
Glutamin + ATP + H 2 0
CTP-sintetaza
Glutamat + ADP + P;
NIL
N
O O O
O—P — O — P —O —P —O—H2C Q
o o o" J{ H
OH OH
CTP
u -*« *«.V
>
Karbamoil-fosfat
"•»3 t
< Karbamoil-fosfat
co »
<£>•
Karbamoil-aspartat Karbamoil-aspartat
1 \
Dihidroorotat
Dihidroorotat
i \
Orotat
\
Orotat
PRPP PRPP-
OMP
I
UMP ' UMP
I \
UDP
UDP
\ \
UTP "UTP
\ \
•CTP " CTP
enzima su UTP i CTP, a aktivator je ATP. Kao i u regulaciji sinteze purina, nivo ATP isto tako reguli-
še biosintezu pirimidina na nivou stvaranja PRPP. Povećanje u PRPP rezultira aktivacijom sinteze pi-
rimidina.
Sledeći regulatorni enzim je OMP-dekarboksilaza, koji je kompetitivno inhibiran sa UMP i u ma
njem stepenu sa CMP. Pri inhibiciji OMP-dekarboksilaze, enzim orotat-fosforibozil-transferaza posta
je takođe nefunkcionalan, zbog toga što su aktivnosti ova dva enzima locirane na istom bifunkcional-
nom proteinu. To je razlog zašto dolazi do akumulacije orotata, a ne OMP. Finalno, CTP-sintetaza je
inhibirana mehanizmom povratne sprege sa CTP i aktivirana sa GTP.
Procesi reciklizacije pirimidinskih baza imaju manji značaj nego kod purinskih. Purinsko jezgro ne
može da se raskida u ćelijama sisara, ali se zato pirimidinski prsten može otvoriti i degradirati u viso
ko solubilne strukture poput 3-alanina i (3-aminoizobutirata, koji pak služe kao prekursori acetil-KoA i
sukcinil-KoA.
Alternativno, pirimidini se mogu osloboditi i konvertovati u nukleotide pomoću enzima pirimidin-
fosforibozil-transferaze, koji kao kod purina, koristi PRPP kao izvor riboza-fosfata. Opšta reakcija je:
Ribonukleotidi su glavni nukleotidi u ćeliji. Svaka ćelija sintetiše i koristi ove nukleotide prema
svojim potrebama, a veličina rezerve različitih nukleotida je pod vrlo preciznom kontrolom. Sinteza
nukleotida koja je do sada opisana, odnosi se na ribonukleotide. Oni se koriste kao gradivne jedinice
u sintezi RNK ili kao nosači nekih drugih komponenti poput šećera u anaboličkim procesima (na pri-
mer UDP-glukoza u sintezi glikogena). Ćelija sadrži 5-10 puta više RNK (iRNK, rRNK i tRNK) nego
DNK. Glavni cilj biosinteze nukleotida jeste stvaranje rNTP (ribonukieotida), ali zbog proliferacije ćeli
ja i potrebe za replikacijom genoma, potrebna je i produkcija dNTP (dezokslribonukleotida). Za sinte
zu DNK potrebni su 2'-dezoksiribonukleotidi, koji se sintetišu iz odgovarajućih ribonukleozid-difosfata
redukcijom pozicije C-2', a ne de novo sintezom iz prekursora koji sadrže dezoksiribozu (Slika 19-
23). Posle redukcije rNDP sledi fosforilacija u dNTP sa istom nukleozid-difosfat-kinazom koja fosfori-
liše rNDP u rNTP, uz ATP kao donor fosfata.
o o o o
II II I Bara | || || rBSial
"O—P —O—P—O—H 2 C , 0 O,
" ~0 —P—O—P—O—H2C
0~ O" PVH H 0~ 0~ rvH H
J|"""j£ H Ribonukleotid- \fmmf
H H H
OH OH reduktaza njT uH
rNDP dNDP
H
y2U
NADPH> FAD SH SH* NDP
NADP+>/ ^FADH
Tioredoksin-reduktaza
A r i ' ^f_f J-
Tioredoksin
A _Q A
Ribonukleotid-
dNDP
reduktaza
Sinteza t i m i d i n - n u k l e o t i d a
Sinteza DNK zahteva prisustvo dTTP. Ovaj nukleotid se sintetiše uglavnom de novo sintezom, a
količina koja nastaje u salvage putevima nije dovoljna za sintezu DNK. Timin je u stvari metii-uracil,
tako da se sinteza dTMP odvija metilacijom dUMP u prisustvu N 5 ,N 1 0 -metilen-tetrahidrofolata kao
O H
W
N N
H N^ \x- ^
»-»- H 2
CH2
H
^ H' CH2
N H
I ^ H,C-
dRib—® R
6 10
dUMP iV ,^ -Metilen-THF
Timidilat-
sintetaza
0
H* CHM H2N
'N
A
O N H
I ^
dRib—(P) HN—R
dTMP DHF
donora metil-grupe. Reakciju katalizuje enzim timidilat-sintetaza u kojoj tetrahidrofolat (THF) obezbe-
đuje ne samo ugljenikove atome već i dva atoma vodonika iz pteridinskog prstena, što rezultira oksi
dacijom THF u dihidrofolat (DHF) (Slika 19-25).
Nakon sinteze dTMP se odmah fosforiliše u dTTP koji je neophodan za sintezu DNK. Ćelija odr
žava nizak nivo dUTP u cilju sprečavanja inkorporiranje uracila u DNK jer enzimski sistem sinteze
DNK iz dNTP ne razlikuje efikasno dUTP od dTTP .
Stvaranje dTMP, pomoću salvage puta zahteva enzim timjn-fosforilazu
FdUMP
dUMP dTMP
CH 2 OH
Serin
Ćelije koje nisu sposobne da regenerišu THF, pokazuju poremećaje u sintezi dTTP. Nedostatak
ovih nukleotida zaustavlja sintezu DNK što vodi umiranju ćelije (ćelijska smrt). Zbog ovoga, obzirom
da se dTTP koristi samo za stvaranje DNK, moguće je u terapeutske svrhe delovati na brzo proliferi-
šuće ćelije, a da se pri tome ne oštete ostale ćelije, kroz inhibiciju timidilat-sintetaze. Mnogi antikan-
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam azotnih jedinjenja 19-25
cerozni lekovi deluju tako što inhibiraju enzim timidilat-sintetazu, ali i enzim dihidrofolat-reduktazu
(Slika 19-25). U ovu grupu jedinjenja koja ireverzibilno inhibiraju enzim timidilat-sintetazu spadaju
analozi timina poput 5-fluorouracila i 5-fluorodezoksiuridina. Oba se konvertuju u metabolit 5-
fluorodezoksiuridilat (FdUMP), koji inhibira timidilat-sintetazu.
U inhibitore dihidrofolat-reduktaze spadaju lekovi: metotreksat, aminopterin i trimetoprim. In-
hibicija dihidrofolat-reduktaze brzo dovodi do ograničenog prevođenja THF u DHF pomoću timidilat-
sintetaze. Inhibicija dihidrofolat-reduktaze ne samo da sprečava sintezu dTMP već isto tako se bloki
raju i sve ostale THF zavisne biološke reakcije kao što je recimo sinteza purina, histidina i metionina.
Ovi lekovi su analozi DHF koji se kompetitivno skoro ireverzibilno vezuju za dihidrofolat-reduktazu sa
približno 1000 puta većim afinitetom nego DHF. Ovi antifolatni lekovi se uspešno koriste kao hemote-
rapeutski lekovi posebno kod leukemije dece. Trimetoprim se vezuje mnogo čvršće za bakterijsku di
hidrofolat-reduktazu nego za humani enzim, tako da je ovaj lek takođe i efikasan antibakterijski
agens.
E. BIOSINTEZA HEMA
1 2 Izomeri porfirina
M V
I III
HC- CH 12 34 56 78 12 34 56 78
N
8M- ij~M 3
Uro APAPAPAP AP AP AP PA
IV ,N— Fe— N. II ,,
7 P v 4
K o p r o MPMPMPMP MP MP MP PM
Slika 19-27. Struktura porfirina: protoporfirin IX i Fe(ll) ulaze u sastav hema. Raspored boč
nih grupa u izomerima I i III porfirina.
Vodonikovi atomi u određenim pozicijama pirolovih prstenova koji čine strukturu porfirina, su
supstituisani odgovarajućim grupama. U zavisnosti od vrste, broja i rasporeda supstituenata postoje
različiti porfirini. Bočne grupe mogu biti: metil- (M), acetil- (A), propionil- (P) i vinil- (V) grupe. Postoji
veliki broj izomera porfirina, ali ne javljaju se svi u prirodi i samo određeni izomeri imaju fiziološki
značaj. Tri osnovne grupe porfirina koji se nalaze u humanom organizmu su: uroporfirini (URO), ko-
proporfirini (KOPRO) i protoporfirini (PROTO). Prisustvo karboksilnih grupa određuje polaritet i ras-
19-26 Opšta biohemija
tvorljivost porfirina. Uroporfirini imaju 4 propionil- i 4 acetil- ostatka, znači ukupno 8 karboksilnih gru
pa čime se tumači njihova najveća rastvorijivost i izlučivanje urinom. Koproporfirini imaju 4 propionil- i
4 metil-grupe, znači sadrže 4 karboksilne grupe i više su lipofilni. Protoporfirini sadrže 2 propionil-, 2
vinil- i 4 metil-grupe. Ovi bočni lanci mogu biti uređeni na različite načine tako da svaki daje po 4
izomera od kojih samo izomer III ima fiziološki značaj (slika 19-27). Izomeri I i III se razlikuju po ras
poredu grupa na prstenu IV gde je došlo do rotacije bočnih lanaca. Protoporfirin III je u stvari izomer
IX (po staroj nomenklaturi) i on ulazi u sastav hema. Znači hem je protoporfirin IX u čijem se jezgru
nalazi vezan Fe(ll) jon. Hem je prostetična grupa za mnoge proteine i enzime koji su uključeni u pre-
nos kiseonika i reakcije transfera elektrona. Ukoliko se za protoporfirin IX veže Fe(lll) nastaje hema-
tin (u vidu hidroksida) ili hemin (u vidu hlorida).
Redukovani oblici porfirina su porfirinogeni i oni se javljaju kao intermedijeri u procesu biosinte-
ze hema. U porfirinogenima pirolovi prstenovi su povezani metilenskim grupama (-CH2-). Oni su bez
bojni, nestabilni i iako se oksiduju u porfirine.
Slobodni porfirini i sporedni produkti mataboličkog puta sinteze hema nemaju biološki ulogu, ali
njihovo određivanje ima klinički značaj u poremećajima metabolizma hema (porfirinopatijama).
Biosinteza hema
Biosinteza hema odvija se u svim ćelijama, ali u nekim tkivima je ona mnogo intenzivnija i to pre
svega u koštanoj srži gde se odvija sinteza prekursora eritrocita i u jetri gde je intenzivna sinteza ci-
tohroma P450. Sinteza hema se odvija delimično u mitohondrijama, a delimično u citoplazmi. Sinteza
započinje u mitohondrijama gde se nalaze i prekursori za ovu sintezu, a i završava se u mitohondri
jama jer je završni proizvod ovog ciklusa, hem, ujedno i alostemi modulator prve enzimske reakcije.
U procesu biosinteze hema učestvuje 8 enzima koji katalizuju 4 reakcije u mitohondrijama i 4 u cito
plazmi. Proces sinteze protoporfirinskog jezgra odvija se u dve faze. Prva faza je stvaranje prstena
ponovljenim kondenzacijama prekursora i druga faza u kojoj se vrši modifikacija bočnih lanaca i in-
korporacija atoma gvožđa.
Svi atomi protoporfirinskog jezgra potiču od jednostavnih prekursora glicina, neesencijalne ami-
nokiseline i sukcinil-KoA koji potiče iz ciklusa limunske kiseline (Slika 19-28). U prvoj reakciji dolazi
do kondenzacije giicina i sukcinil-KoA u 5-aminolevulinsku kiselinu (pravilnije 5-aminolevulinsku kise
linu, ALA) dejstvom enzima aminolevulinat-sintaze (ALA-sintaza). Enzim funkcioniše u mitohondrijai-
nom matriksu u prisustvu Diridoksal-fosfata kao neophodnog koenzima i reakcija je osetljiva na nutri-
cionu deficijenciju piridoksal-fosfata. Reakcija se odvija u dva stupnja: najpre dolazi do kondenzacije
glicina i sukcinil-KoA u a-amino-p-ketoadipat uz prisustvo piridoksai-fosfata pri čemu nastaje Schiff-
ova baza, a u drugom stupnju dekarboksilacijom a-amino-p-ketoadipata nastaje 5-aminolevulinska
kiselina.
Reakcija ALA-sintaze je regulatorna reakcija u neeritrocitnim ćeiijama i strogo je kontrolisana
pomoću više mehanizama: inhibicijom enzima krajnjim proizvodom hemom i hematinom (mehanizam
negativne povratne sprege) i na nivou transkripcije i translacije ovog enzima.
5-Aminolevulinska kiselina prelazi iz mitohondrija u citoplazmu gde se kondenzacijom 2 molekula
ove kiseline stvara derivat pirola, porfobilinogen (PBG). Asimetrična kondenzacija stvara dva različita
bočna lanca na pirolovom prstenu: propionil (P) i acetat (A). Ova reakcija u biosintezi hema katalizo-
vana je sa porfobilinogen-sintazom ili aminolevulinat-dehidratazom (jer se u ovoj reakciji izdvajaju
dva molekula vode).. Enzim zahteva redukovane sulfhidrilne grupe i jon Zn 2 + za svoju aktivnost. Oset-
Ijiv je na inhibiciju teškim metalima, posebno olovom, tako da se prilikom trovanja olovom zbog inhi-
bicije enzima javlja pojačana ekskrecija supstrata 5-aminoievulinske kiseline u urinu. Detekcija 6-
aminolevulinske kiseline u urinu je dobar indikator trovanja olovom. Trovanje olovom pored anemije,
praćeno je i teškim psihičkim simptomima što se objašnjava povećanom akumulacijom 5-
aminolevulinske kiseline u krvi koja ima sličnu strukturu kao neurotransmiter Y-aminobuterna kiselina.
U sledećoj fazi dolazi do formiranja porfirinskog prstena iz četiri molekula porfobilinogena. Konden
zacija 4 molekula PBG dovodi do stvaranja uroporfirinogena III, pomoću dva različita enzima. U prvoj
V. Spasojević-Kalimanovska: Anabolizam azotnih jedinjenja 19-27
Mitohondrija M
Ciklus
lim unske
kiseline HC- -CH
\
M- -M
N
- O O C — C H 2 — C H j — C— KoA
I
Sukcinil-KoA HC= CH
+
feroheiataza
protoporfirinogen-
H3N—CH2—COO- M
Fe
2
oksidaza
Glicin Protoporfirin IX
5-aminolevulinat-
CO, sintaza M M
5- Aminolevulinska kiselina
J!
_ ^ *i /—
L -M M i ^
N
H
I
y = T
rx
!
(ALA) NH HN
••
YLC==/
i
=CH
V -V
< A^.
H,C CHj
P M P M
Protoporfirinogen IX
ALA Hem 1
kopropor-
porfobilinogen- «v« _«__ finnogen-
sintaza **h ^~S oksidaza
coo-
I
"OOC CH,
H2C
I I
CH2 Citozo!
H2C
I /
N
NH.
2 H
Porfobilinogen (PBG) M
-4NH3
H,C- )—CH2 H2C k J CH 2
uropor uropor ^ / I
firinogen- firinogen Uh A- N •A M-
1 N I " -M
sintaza \ H / =
kosintaza uroporfirinogen-
NH HN dekarboksilaza NH HN
-*• P-
HTAV P s - P-
H2C u ji CHj
H*C u vi—CHo 4C02
M
Uroporfirinogen III Kopropofirinogen II!
Linearni molekul se ciklizuje na dva načina: spontano (neenzimski) i gradi uroporfirinogen I, koji ne
ma fiziološku ulogu i enzimski sa uroporfirinogen lll-kosintazom. Ovaj enzim pored zatvaranja tetrapi-
rolske strukture dovodi i do izomerizacije na IV prstenu, zapravo do rotiranja i drugačijeg rasporeda A
i P ostataka. Krajnji fiziološki aktivan proizvod ove reakcije je uroporfirinogen III.
19-28 Opšta biohemija
Sledeći stupnjevi u biosintezi hema svode se na modifikacije bočnih lanaca porfirinskog jezgra
reakcijama dekarboksilacije i oksidacije. Dekarboksilacijom acetatnih grupa uroporfirinogena III nas
taju metil-grupe i stvara se koproporfirinogen III koji je više lipofilan i koji sadrži samo 4 karboksilne
grupe. Ova reakcija se dešava u citoplazmi, a katalizuje je uroporfirinogen-dekarboksilaza. Stvoreni
koproporfirinogen III prelazi u mitohondrije gde se odvijaju preostale reakcije biosinteze hema.
Koproporfirinogen-oksidaza, enzim koji se nalazi u intermembranskom prostoru mitohondrija ok-
sidativno dekarboksiliše dva ostatka propionata koproporfirinogena III u vinil-grupe. Proizvod reakcije
je protoporfirinogen IX. Ukupno se u biosintezi hema dekarboksilacijom oslobađa 6 molekula C0 2 . U
sledećoj reakciji protoporfirinogen-oksida , oksidiše metilenske grupe, koje povezuju pirolove prste-
nove, u metenske grupe uz nastajanje protoporfirina IX. Dobijeno porfirinsko jezgro sadrži konjugo-
vane dvogube veze i ova struktura je stabilnija od porfirinogenske.
Poslednja faza u biosintezi hema je ugradnja Fe(ll) atoma u tetrapirolsko jezgro. Reakcija je ka-
talizovana ferohelatazom koja se nalazi na unutrašnjoj membrani mitohondrija. Ferohelataza je spe
cifična za Fe(ll), ali ne i za Fe(lll). Enzim zahteva askorbinsku kiselinu i cistein kao redukciona sreds
tva. Ferohelataza je još jedan enzim koji je inhibiran olovom, ali ta inhibicija je indirektna jer olovo
sprečava redukciju Fe(lll) u Fe(ll) i na taj način umanjuje raspoloživost Fe(ll) za dejstvo ferohelataze.
Poremećaji u biosintezi hema zbog urođenog nedostatka ili inhibicije nekog od enzima, dovode do određe
nih patoloških promena, praćenih akumulacijom porfirina i prekursora, porfirinogena koje se označavaju kao por
ti rinopatije.
Regulacija biosinteze hema odvija se različito u pojedinim tkivima i novija istraživanja u moleku
larnoj biologiji ukazuju da specifičnosti gena za ALA-sintazu i porfobilinogen-dezaminazu objašnjava
ju varijacije u kontroli sinteze hema.
(1) Regulacija biosinteze hema u jetri
Biosinteza hema u jetri regulisana je na nivou prvog enzima ALA-sintaze. Ćelije jetre sadrže ma
le koncentracije hema koji je uglavnom potreban za sintezu citohroma. Reakcija ALA-sintaze je regu
lisana na dva načina: (a) alosternim mehanizmima inhibicije enzima proizvodom reakcije hemom ili
njegovim derivatom hematinom, zbog čega se i početak i završetak ovog procesa odvijaju u mito-
hondrijama; (b) regulacijom sinteze enzima, pri čemu treba imati u vidu da je poluživot enzima samo
1 sat tj. da se on brzo razlaže u citozolu. Enzim se sintetiše na slobodnim ribozomima u prekursor-
skoj formi, a prilikom translokacije u mitohondrije formira se enzim, cepanjem N-terminalne prekur-
sorske sekvence kao što je to slučaj kod mnogih mitohondrijalnih enzima. Ova sinteza je suprimirana
hemom i hematinom, pri čemu hem u stvari inhibira transfer ALA-sintaze u mitohondrije i ovo je važ
na kontrolna tačka jer ALA-sintaza se brzo razlaže u citozolu. Sinteza enzima je stimulisana, određe
nim lekovima kao što su barbiturati i neki narkotici. Biotransformacija ovih lekova u jetri zahteva veli
ke količine citohroma P450 što onda podrazumeva trošenje velike količine hema, a to je stimulans za
povećanu aktivnost enzima ALA-sintaze. Na sintezu ovog enzima stimulativno deluju i hormoni, kao
što su steroidni hormoni sa 4,5 dvogubom vezom (testosteron) i oralni kontraceptivi.
(2) Regulacija biosinteze hema u eritroblastima
Mehanizmi regulacije biosinteze hema u eritroblastima su drugačiji. Obzirom da zreli eritrociti ne
sadrže ribozome i mitohondrije, to se sinteza hema odvija na ranijem stupnju razvoja eritropoetičnog
tkiva. Za razliku od ostalih ćelija eritroblasti mogu da akumuliraju velike količine hema za stvaranje
hemoglobina tako da aktivnost eritroblastne ALA-sintaze nije inhibirana hemom. Za regulaciju sinteze
hema u eritroblastima važniji su enzimi PBG-dezaminaza i ferohelataza i oni su regulatorni enzimi,
tako da se zato može u tim ćelijama nagomilavati više hema. Utvrđeno je da je sinteza hema stimuli
sana sa viškom hema i zavisna od raspoloživosti gvožđa u ćeliji i globinskog dela hemoglobina. Koli
čina gvožđa koja ulazi u ćeliju je važna za brzinu sinteze hema. Gvožđe se u plazmi nalazi vezano
za protein transferin. Ulazak kompleksa gvožđe-transferin u ćeliju kontroliše se putem receptora. Is
to tako, važna je i koordinacija u sintezi hema i globinskog dela hemoglobina (vidi Poglavlje 20).
Poglavlje 20.
Biosintezaproteina i nukleinskih kiselina
Biosinteza proteina je vrlo složen, genetski dirigovan proces koji se odvija u ćeliji u više faza.
Genetska informacija se čuva u hromozomima i prenosi se na novu ćeliju procesom replikacije Ek
spresija genetske informacije procesom transkripcije na RNK omogućava translaciju te informacije
na polipeptidni lanac. Ovaj protok informacije kroz generacije i kroz ćeliju sa DNK na RNK i na prote
in je "centralna dogma" u molekularnoj biologiji i biosintezi proteina (Slika 20-1). Replikacija je proces
udvajanja genetskog materijala izražen kroz sintezu nove DNK. Transkripcija je proces prepisivanja
genetske informacije sa DNK na drugu nukleinsku kiselinu, pre svega informacionu ribonukleinsku
kiselinu. Translacija je proces prevođenja genetske informacije u odgovarajući redosled aminokise-
lina polipeptidnog lanca.
Replikacija
RNK B ^ p Protein
Transkripcija Translacija
Nukleinske kiseline su polinukleotidi koji se sastoje iz dve osnovne vrste nukleotida ribo- i dezok-
siribonukleotida. Ribonukleotidi su primarni metaboliti, dok nukleotidi dezoksi serije se nalaze u nis
kim koncentracijama i nastaju iz ribonukleotida specijalnim metaboličkim putevima. Dve pentoze ri-
boza i dezoksiriboza definišu dva glavna tipa hemijski različitih nukleinskih kiselina: ribonukleinsku
kiselinu (RNK) i dezoksiribonukleinsku kiselinu (DNK). U sastav nukleinskih kiselina ulaze azotne ba
ze - purini i pirimidini. Osnovne purinske baze su adenin (A) i gvanin (G), a pirimidinske citozin (C),
uracil (U) i timin (T). U sastav DNK ulaze purinske baze adenin i gvanin, a od pirimidinskih citozin i
20-2 Opšta biohemija
timin. Sastav nukleotida RNK se razlikuje u pirimidinskim bazama. U sastav RNK ulaze iste purinske
baze adenin i gvanin, a od pirimidinskih pored citozina nalazi se uracil.
Najvažnije hemijske osobine ovih baza koje su ključne za strukturu i funkciju nukleinskih kiselina
su: lokalizacija atoma azota u prstenu, pozicija i priroda supstituenata i konjugovana priroda dvogu-
bih veza. Važna svojstva baza su i njihove osobine nepolarnosti i planarnosti. Iz ovoga proističe hid-
rofobnost baza i sposobnost da međusobno reaguju. Na bazi ovih osobina stvara se određeni poten
cijal između azota prstena i O- i N- supstituenata; ovo je sigurno najvažnija hemijska osobina ovih bi-
omolekula i to je osnova stvaranja vodoničnih veza između parova baza. Baze apsorbuju ultraviolet
nu svetlost što nalazi primenu u detekciji i merenju nukleotida i polinukleotida, ali je to ujedno i glavni
uzrok oštećenja živog organizma kod izlaganja UV zracima. DNK i RNK su slične po svojoj osnovnoj
polinukleotidnoj strukturi, ali pored hemijskih razlika u sadržaju različitih pentoza i zamene U sa T,
pokazuju niz različitosti koje su u skladu sa različitim funkcijama. Ove dve nukleinske kiseline se raz
likuju po svojoj veličini, prostornoj konformaciji, lokalizaciji u ćeliji, raznolikosti i shodno tome funkciji.
3',5'-Fosfodiestarska veza
Nukleotidi su vezani u nukleinskim kiselinama fosfodiestarskim vezama. Fosfat većine mononu-
kleotida je esterifikovan na S'-poziciji. 3',5'-fosfodiestarska veza se stvara između dva nukleotida u
lancu i DNK i RNK. Fosfodiestarska veza povezuje 5'-hidroksilnu grupu dezoksipentoze (ili pentoze)
jednog nukleotida sa 3'-hidroksilnom grupom dezoksipentoze (ili pentoze) drugog nukleotida preko
fosfatne grupe (Slika 20-2). Osnovna svojstva polinukleotidnog lanca su:
• Prisustvo šećer-fosfatne kičme koja daje polinukleotidu kontinuitet i za koju su vezane purinske i
pirimidinske baze pomoću glikozidnih veza;
• Polarnost dugog nerazgranatog lanca potiče od slobodnih OH-grupa na 5'-kraju i 3'-kraju. Ova
polarnost je analogna onoj koja postoji na C- i N-terminalnom kraju polipeptidnog lanca;
• Kao i kod svih fosfodiestara, fosfat nosi jedno negativno naelektrisanje pri fiziološkim pH vredno-
stima, tako da su nukleinske kiseline polinukleotidi sa negativnim naelektrisanjem
Baze koje se nalaze na lancu DNK konvencionalno se uvek pišu od 5'-kraja ka 3'-kraju. Tako da
se i očitavanje sekvence nukleotida uvek vrši u pravcu 5'->3'. Na primer sekvenca baza u tetranu-
kleotidu prikazanom na Slici 20-2 i 20-3 je ATCG za lanac DNK, odnosno AUCG za RNK.
Fosfodiestarska veza između nukleotida (u DNK ili RNK) se može raskidati hidrolitički sa hemika-
lijama ili enzimski sa određenom nukleazom. Postoji više vrsta nukleaza, a podela je izvršena prema
vrsti nukleinske kiseline koju hidrolizuje na: dezoksiribonukleaze za DNK i ribonukleaze za RNK. Nu-
kleaze koje raskidaju fosfodiestarske veze u unutrašnjosti lanca nazivaju se endonukleaze, a nuklea-
ze koje uklanjaju nukleotide sa kraja lanca nazivaju se egzonukleaze.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-3
5-kraj
3- kraj
3'
\ \
HO-1
\ \ \
5'
Struktura DNK
ban odnos između dve trake u heliksu je takav da stvara naizmenično veliki (široki) žljeb i mali (uski)
žljeb.
Neki lekovi poput antikanceroznih lekova, kao što je daktinomicin (aktinomicin D) svoj antikance-
rozni efekat ispoljava tako što se ugrađuje u veliki žljeb DNK i na taj način ometa sintezu DNK i RNK.
Veliki žljeb
ljenja Tm. Gubitak helikoidne strukture DNK se naziva denaturacija i može se pratiti merenjem ap-
sorbancije na 260 nm zato što pojedinačna DNK jedinica ima veću relativnu apsorbanciju na ovoj ta-
lasnoj dužini nego što ima dupli heliks DNK. Pošto u paru između gvanozina i citozina ima tri veze u
odnosu na dve veze između adenozina i timina, DNK koja sadrži veću koncentraciju parova baza AT,
denaturiše se na nižoj temperaturi nego DNK bogata sa GC. Pod određenim uslovima komplemen
tarni lanci DNK mogu ponovo formirati dupli heliks i ovo se naziva renaturacija.
Struktura duplog heliksa DNK ima brojne važne biološke implikacije. Sposobnost stvaranja paro
va baza omogućava lancima DNK da imaju ulogu kalupa ili matrice u procesu replikacije - sinteze
DNK i u procesu transkripcije - sinteze RNK. Novosintetisani kopirani lanac je antiparalelan i kom
plementaran u odnosu na matricu.
Z-DNK B-DNK
A-forma nastaje dehidratacijom B-forme. To je isto tako desnostrani heliks, sa 11 parova baza po
jednom okretu, a ravni parova baza su za 20° pomereni od normalnog položaja u odnosu na osu he
liksa. Konformacija koja se nalazi u DNK-RNK hibridima ili RNK-RNK duplim lancima je verovatno
A-forma. Z-DNK je levostrani heliks koji sadrži oko 12 parova baza po jednom okretu. Inače taj osno-
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-7
vni skelet dezoksiribozafosfata je cik-cak (ili zig-zag) i zato se naziva Z-DNK (Slika 20-6). Z-forma se
javlja u regionima DNK koji sadrže sekvence sa alternativnim purinima i pirimidinima, na primer poli
GC. Tranzicija između pojedinih polimorfnih formi DNK ima važnu ulogu u ekspresiji gena.
Tipična humana ćelija sadrži 46 hromozoma. Dužina DNK lanca je aproksimativno 1 m. Teško je
zamisliti kako se tako dugačak genetski materijal može efikasno upakovati u zapreminu veličine ćelij-
skog nukleusa, tako da može da se replikuje i da se ta genetska informacija potom transkribuje. Po
red sekundarne strukture DNK, postoje i drugi nivoi strukturne organizacije DNK. U ćeliji je DNK su-
peruvijena, što znači da je dvostruki heliks (sekundarna struktura) još mnogo puta ispresavijan i čvrs
to spakovan u kompaktnu tercijernu strukturu. Za ovo je potrebno da DNK interaguje sa velikim bro
jem proteina, pri čemu svaki od njih ima specifičnu funkciju u određenom redosiedu pakovanja ovog
dugačkog molekula DNK. Eukariotska DNK je čvrsto vezana za bazne proteine hromatina koji se na
zivaju histoni i koji služe kako bi se DNK usmerila u osnovne strukturne jedinice koje se nazivaju nu-
kleozomi i koji podsećaju na niske u ogrlici. Nukleozomi su dalje uređeni u komplikovanije strukture
koje dugačke molekule DNK raspoređuju u hromozome.
Nukleozomi su strukturne jedinice eukariotskih hromozoma koje čine osnovu zrnaste strukture
hromatina. Pakovanjem u nukleozome DNK se prividno skraćuje oko 2,5 do 7 puta, ali to nije dovolj
no za smeštanje DNK u jedro. To ukazuje na postojanje drugih nivoa strukturne organizacije DNK.
Sledeći nivo je solenoidna struktura, koja se sastoji iz gusto pakovanih nukleozoma međusobno po
vezanih sa DNK. Dalje pakovanje nukleozoma stvara viši nivo strukture - vlakna debljine 30 nm. Ova
20-8 Opšta biohemija
vlakna se zatim uvijaju u formu nukleofilamenata debljine 200 nm. Nukleofilamenti grade superspira-
lizovane petlje (Slika 20-8). Sa svakim nivoom strukturne organizacije DNK se pakuje u sve kompak-
DNK
Slika 20-8. Struktura hromatina: od dvostrukog heliksa DNK do hromozoma. (a) parovi baza
u komplementarnim lancima DNK; (b) dupli heliks DNK; (c) solenoidna struktura nukleo-
zoma; (d) nukleofilamenti; (e) hromozom.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-9
tniju partikulu, a realna dužina dvolančanog heliksa se prividno sve više smanjuje da bi se najzad
svela na dimenzije usaglašene sa veličinom jedra.
B. REPLIKACIJA
Genomsko udvajanje je prethodnica svake deobe ćelije tako da svaka ćerka ćelija nosi komplet
nu kopiju genoma roditelja. Hromozomska replikacija tj. udvajanje DNK je kompleksan i zahtevan
proces. Kada se razdvoje dve trake DNK, svaka može da posluži kao nosač ili kalup ili matrica za
sintezu potpuno novog lanca, dajući dva molekula DNK ćerke, od kojih svaki sadrži dva lanca DNK
sa antiparalelnom orijentacijom. Ovaj proces je semikonzervativna replikacija, zato što posle repli-
kacije u DNK dvostrukom heliksu ćerke jedan lanac je novosintetisani, a drugi potiče od roditelja (Sli
ka 20-9). Enzimi polimeraze, uključeni u replikaciju DNK su enzimi dirigovani matricom, koji mogu da
sintetišu komplementarnu sekvencu svakog lanca DNK sa izuzetnom efikasnošću. Mehanizam repli-
kacije je uglavnom izučavan kod bakterije E.coli, dok su kod viših organizama reakcije ovog procesa
manje rastumačene, ali uglavnom uključuju isti tip mehanizama.
Produkcija dve kompletne verzije DNK u toku procesa replikacije, odvija se postepeno i podleže
određenom redosledu postupaka koje možemo da grupišemo u dve faze:
• Odmotavanje duplog heliksa DNK i separacija ova dva lanca
• Kopiranje oba lanca DNK duplog heliksa roditelja do poslednjeg nukleotida dejstvom čitavog
niza enzima i proteina od kojih su najvažnije polimeraze.
20-10 Opšta biohemija
Brojni enzimi i proteini koji učestvuju u procesu replikacije sačinjavaju čitavu mašineriju za repli-
kaciju koja se naziva replizom. Da bi se proces replikacije odvijao normalno bez zastoja, u ćeliji mo
raju biti obezbeđene adekvatne količine sva četiri dezoksinukleozid-trifosfata (dNTP) za sintezu lana
ca DNK u toku replikacije i potrebni molekuli novih proteina histona za pakovanje DNK u nukleozome
tj. hromozome.
r
Separacija dva komplementarna lanca DNK
Procesu replikacije dva lanca duplog heliksa prethodi razdvajanje ova dva lanca u relativno krat
kom regionu, zato što polimeraza koristi samo jedan lanac kao matricu za sintezu nove DNK. Ćelije
bakterija uglavnom imaju jedan molekul DNK tj. jedan hromozom, koji je kružnog oblika. Ispitivanja
su pokazala da se inicijacija a p l i k a c i j e kod E.coli odvija na jednom mestu koje se označava kao me-
sto početka replikacije ili ori C (na engleskom - origin of replication). Specifični proteini, nazvani dnaA
proteini vezuju se mesto početka replikacije i razdvojeni lanci DNK sa ovim proteinima stvaraju repli-
kacioni balon.
Replikacija na eukariotiotskim hromozomima započinje na više mesta. DNK eukariota je mnogo
duža tako da proces replikacije se vrši na više mesta duž DNK, odnosno postoji više mesta početka
replikacije i ova mesta uključuju kratke sekvence koje sadrže isključivo AT parove baza. Multipli broj
početaka je neophodan kako bi se dugački molekuli DNK eukariota brzo replikovali (Slika 20-10).
Početak
replikacije T Y T Y
I I Mi h I i I i h I i ii i MT
!MIMiiMMM
Replikon
okalno otvaranje
dvostrukog
heliksa
I
f ^ j hI Mi I iI n f ^ r
-H^iV- 11 i i i • i ..., u .
Replikativna "Vjy-
Replikativna
viljuška
viljuška
i
XAS 3
Č *.
E3MQWWQI •$=**• ^ T T
4^-^-j-i.
Dvosmerna .
replikacija ^
II i I M l l i I i h M h I! ! M I i I M M i I M i I
Milili M I M i I i i I h l l l
I ! I I i i ! ! S I i I i I i I i i M i I ! I i I i i I l i i i i I I i
M M I I I I I I j U I I I U I | i I I I I I I I I I I I I ! I I I
Slika 20-10. Replikacija DNK: početak replikacije i replikativna viljuška. A. Male prokariot-
ske cirkularne DNK. B. Vrlo duge eukariotske DNK.
Kada se dve trake odvrnu i razdvoje, formiraju specifičnu formu u vidu slova V gde se i odvija ak
tivna sinteza. Ovaj region se naziva replikativna viljuška. On se pomera duž DNK molekule kako
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-11
sinteza napreduje. Replikacija duplog heliksa je dvosmerna tj. replikativna viljuška se pomera u oba
pravca od starta (Slika 20-10). Kod prokariota na mestu početka replikacije dolazi do stvaranja dve
replikativne viljuške koje se kreću bidirekciono od starta. Postoji i terminacioni lokus gde se dve vilju
ške susreću i gde dolazi do separacije dva nova dupleksa DNK ćerki. Proces replikacije kod eukario-
ta je u principu isti kao kod prokariota - bidirekciono pomeranje dve viljuške od starta replikacije. Du
žina DNK između dva početka replikacije se naziva replikon. Replikoni obično odgovaraju veličini
gena.
(2) DNK-helikaza
Ovi enzimi se vezuju za pojedinačne lance DNK u blizini replikativne viljuške i potom se pomera-
ju u obližnji dvolančani region, držeći lance razdvojene - u cilju odvijanja duplog heliksa. Helikaze
zahtevaju energiju u vidu ATP. Jednom kada se lanci razdvoje, SSB proteini se vezuju za jedan la
nac DNK, sprečavajući ponovno stvaranje duplog heliksa (Slika 20 -11).
DNK-helikaza
Pravac kretanja
replikativne
= > viljuške
(3) SSB
SSB je skraćenica od engleskog naziva - single stranded DNA binding proteins (prevod sa en
gleskog - proteini koji se vezuju za jedan lanac DNK). Ovi proteini se još nazivaju i "proteini koji des-
tabilizuju heliks". SSB proteini se vezuju samo za jednolančanu DNK. Njihovo vezivanje je kooperati
vno što znači da vezivanje jedne molekule SSB proteina olakšava vezivanje dodatnih molekula SSB
koji se vezuju čvrsto za lanac DNK, ali ostavljaju slobodne baze tako da se za njih vezuju komple
mentarni nukleotidi i proces replikacije se neometano odvija. Ovi SSB proteini nisu enzimi, ali njihova
uloga je da ravnotežu između duplih i jednolančanih DNK pomere ka jednolančanoj. Uloga ovih pro
teina nije samo da drže razdvojena dva lanca DNK na mestu replikativnog početka već i da zaštite
DNK od nukleaze koja čepa lanac DNK (Slika 20-11).
Postoje dve vrste enzima topoizomeraza koje menjaju topografiju molekula DNK i na taj način
umanjuju tenziju uvrtanja. DNK-topoizomeraza I je enzim koji reverzibilno iseca jedan lanac duplog
heliksa DNK (Slika 20-13). Ona poseduje endonukleaznu aktivnost, znači može da seče lanac i ligja^
znu aktivnost koja spaja isečeni deo lanca. Topoizomeraza I ne zahteva ATP, već u stvari akumulira
energiju oslobođenu raskidanjem fosfodiestarske veze i koristi je ponovo za zatvaranje lanca. Topoi
zomeraza I stvara rascep na lancu DNK kroz koji enzim provlači drugi lanac heliksa DNK i na taj na
čin uklanja stvoreni supernavoj. Ponovnim spajanjem raskinutog lanca uz pomoć akumulirane ener
gije završava se ciklus i enzim se dalje pomera.
Rez
B f\ A3Ć7^A^^
Spojeni rez
B _y^y^^^
5' • 3'
Vodeći lanac
Slika 20-15. Pravac sinteze vodećeg lanca i lanca koji zaostaje na replikativnoj viljušci.
20-14 Opšta biohemija
Lanac koji se kopira u pravcu replikativne viljuške, naziva se vodeći lanac i uglavnom se sinteti
še kontinuirano. Lanac koji se kopira u pravcu od replikativne viljuške se sintetiše diskontinuirano, u
vidu malih fragmenata DNK. Ovi kratki fragmenti diskontinuirane DNK se nazivaju Okazakijevi fra
gmenti. Spajanjem kratkih Okazakijevih fragmenata nastaje jedan kontinuirani lanac koji se naziva
lanac koji zaostaje (Slika 20-16).
Slika 20-16. Kontinuirana sinteza vodećeg lanca i diskontinuirana sinteza lanca koji
zaostaje u oba pravca od mesta početka replikacije.
Proces replikacije je vrlo komplikovan proces koji je uglavnom proučen na prokariotima, a slični
mehanizmi su zastupljeni i kod eukariota, ali neke faze su još uvek nerazjašnjene. Replikacija se od
vija u nekoliko faza: inicijacija, elongacija i terminacija. Razumevanje ovih stupnjeva u replikaciji pod-
razumeva poznavanje strukture i funkcije brojnih proteina i enzima koji sudeluju u replikaciji.
RNK-prajmer
DNK-polimeraza ne može da započne sintezu komplementarnog lanca DNK na potpuno odvoje
nom lancu koji služi kao matrica. Ona zahteva postojanje RNK-prajmera ili začetnika, a to je u stvari
kratak lanac RNK sa slobodnom hidroksilnom grupom na 3'-kraju komplementarno vezan za matricu
DNK. Ova hidroksilna grupa služi kao prvi akceptor nukieotida u reakciji DNK-polimeraze. Sinteza
RNK-prajmera odvija se specifičnim mehanizmom koji uključuje dejstvo enzima primaze (Slika 20-
18). Primaza je specifična RNK-polimeraza koja sintetiše kratke delove RNK (po deset nukieotida u
dužini) koji su komplementarni i antiparalelni u odnosu na matricu DNK. U nastalom hibridnom du-
pleksu RNK-DNK, U je u paru sa A, i G je u paru sa C. Za sintezu RNK-prajmera neophodni su 5j-
ribonukleozid-trifosfati koji se ugrađuju u fragmente RNK uz oslobađanje pirofosfata kod stvaranja
svake fosfodiestarske veze.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-15
Vezivanje proteina
inicijacije za mesto
početka replikacije
Vezivanje DNK-
heiikazeza proteine
inicijacije replikacije
Smeštanie helikaze u
dupli heiiks DNK
Sinteza RNK-prajmera
omogućava uNK-
polimerazi da započne
sintezu DNK lanca
DNK- R N K -
poltmeraza prajmer
5—i
C I 3'
Kao što je dato na slici (Slika 20-19) ove kratke sekvence RNK se konstantno sintetišu na repli-
kativnoj viljušci i to na lancu koji zaostaje tako da on sadrži više ovih prajmera. Za vodeći lanac je po
treban jedan RNK-prajmer koji započinje kontinuiranu sintezu lanca.
I Početak replikacije
DNK-helikaza
Slika 20-19. Elongacija vodećeg lanca i lanca koji zaostaje dejstvom DNK-polimeraza.
Dejstvo DNK-polimeraza
DNK-polimeraze imaju centralnu ulogu u procesu elongacije lanaca DNK, a ujedno to su i najva
žniji enzimi replikacije. Kada jednom započne replikacija DNK na mestu inicijacije ovog procesa, ka
ko se replikativna viljuška pomera dolazi do polimerizacije nukleotida i sinteze novih lanaca DNK.
Enzim koji katalizuje proces polimerizacije nukleotida je DNK-polimeraza. Postoji više vrsta polime
raza, a svaka polimeraza je kompleksna i ima više različitih enzimskih aktivnosti. Za polimeraze je
specifično da su to matricom dirigovane nukleotid-polimeraze. Polimeraza je enzim sposoban da po
limerizuje nukleotide u polinukleotidni lanac na specifičan način tj. novosintetisani lanac komplemen
taran je lancu nukleinske kiseline koja služi kao matrica. Sama sinteza lanca nukleinske kiseline DNK
zahteva prisustvo: dovoljne količine svih nukleotida (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); enzima DNK-
polimeraze, lanca-matrice, jona Mg 2 + i RNK-prajmera.
Reakcija koju katalizuje DNK-polimeraza je:
zid-trifosfata (slika 20-20). Novi lanac se sintetiše na osnovu postojećeg starog, lanca matrice što
znači da će se od 4 moguća nukleotida uvek vezati samo onaj koji je komplementaran odgovaraju
ćem nukleotidu u lancu-matrici. Interakcija DNK-polimeraze sa supstratom dezoksiribonukleozid-
trifosfatom pored ostalih mehanizama, doprinosi tačnosti replikacije. Naime, prvo se novi nukieotid
sparuje sa nukleotidom u lancu-matrici, po pravilima komplementarnosti pri čemu je DNK-polimeraza
u otvorenoj-neaktivnoj konformaciji. Zatim enzim "proverava" da li je nukieotid komplementarno spa
ren i ukoliko jeste dolazi do kojTfcHmajcione promene....enzima. Formira se aktivni centar, DNK-
polimeraza obuhvata dva nukleotida i katalizuje stvaranje fosfodiestarske veze. Sam mehanizam se
svodi na nukleofilni napad 3'-OH grupe rastućeg lanca na a-fosfatnu grupu dolazećeg dezoksinukleo-
tid-5'-trifosfata. Reakciju katalizuje DNK-polimeraza i u njoj dolazi do pirofosfatne hidrolize dNTP. Pi-
rofosfat hidrolizuje neorganska pirofosfataza i u tom procesu se oslobađa energija potrebna za nas
tavak sinteze nove fosfodiestarske veze.
DNK-matrica
3' *- 5'
K K
\ \
B; B^ Bš
•OH
\J
Replikovana DNK
Slika 20-20. Mehanizam sinteze DNK: stvaranje 3',5'-fosfodiestarske veze i dejstvo DNK-
polimeraze III. B^, Đ 2 , B3 su baze na novosintetisanom lancu DNK, a B4 je baza nukleotida
koji se ugrađuje u polinukleotidni lanac dejstvom DNK-polimeraze III. Bi', B 2 ', B 3 ' i B4 ' su
komplementarne baze na lancu-matrici DNK.
III. Označavanje polimeraze je izvršeno prema redosledu otkrića, a osnovni enzim koji vrši ugradnju
najvećeg broja nukleotida je DNK-polimeraza III.
DNK-polimeraza III (Pol III) je glavni enzim u replikaciji odgovoran za elongaciju lanca DNK uz
pomoć drugih enzima i proteina. Pol III se kod bakterija naziva i replikaza i može da polimerizuje vrlo
veliki broj nukleotida, tako da se proces replikacije odvija vrlo brzo. Za razliku od pol I efikasnost
ovog enzima se ogleda u njenoj velikoj brzini sinteze od 1000 nukleotida u jednoj sekundi. Pored po-
limerazne aktivnosti ona ima i 3'->5' egzonukleaznu aktivnost (Slika 20-21). U procesu replikacije i
(a)
Nov
DNK- °-
matrica »littetlsani
lanac
(b)
Slika 20-21. (a) 5' ->3' polimerazna aktivnost DNK-polimeraze III. (b) 3'->5' egzonuklezna ak
tivnost DNK-polimeraze III omogućava proveru tačnosti novosintetisanog lanca DNK.
nukleaznom aktivnošću u pravcu 3'->5' uklanja nepravilno sparene nukleotide i na njihova mesta
ugrađuje komplementarne nukleotide. Zbog ove osobine DNK-polimeraze ne mogu da otpočnu sin
tezu lanca DNK de novo već zahtevaju prisustvo začetnika ili RNK-prajmera. Na ovaj način povećava
se tačnost, odnosno smanjuje broj pogrešno ugrađenih nukleotida u procesu replikacije. Greške su
veoma retke (jedan na 10 10 nukleotida) i najčešće su uzrokovane nastajanjem retkih tautomernih ob
lika baza poput timina u enolnom obliku koji se vezuje za G umesto za A ili adenin prelaskom u imin,
vezuje se za C umesto za T. Izuzetno je važno za preživljavanje organizma da sekvenca nukleotida
DNK bude replikovana sa što je moguće manje grešaka. Greška u očitavanju sekvence matrice do
vodi do možda čak i letalne mutacije.
t Ispitivanja strukture DNK-polimeraze III su pokazala da je to multimerni enzimski kompleks koji
sadrži deset različitih subjedinica. Jezgro polimeraze III sadrži: a, e i 0 subjedinice gde je a subjedini-
ca sa polimeraznom aktivnošću. Egzonukleazna aktivnost 3'->5' DNK-polimeraze III, koja se nalazi
na £ Subjedinici ovog enzima povećava tačnost replikacije 200 puta. Funkcije jezgra DNK-polimeraze
III su koordinisane sa dejstvom preostalih subjedinica ovog holoenzima. Polimerazna aktivnost jez
gra se povećava sa J3 subjedinicom koja se specifično vezuje za lanac DNK. Ispitivanja su pokazala
da (3 subjedinica gradi prsten oko DNK, što na neki način sprečava iskliznuće DNK, pri čemu y sub
jedinica ima ulogu da otvara i zatvara prsten. Ispitivanja X-zracima su pokazala da je holoenzFm po
limeraze III dimer sa p subjedinicom prstenastog oblika i da je heliks DNK postavljen normalno u od
nosu na prstenastu strukturu (3 subjedinice enzima. Dimerna struktura ovog holoenzima omogućava
da on istovremeno deluje na oba lanca heliksa. Ovakva struktura omogućava da enzim slobodno klizi
duž heliksa DNK jer je taj prsten dovoljno širok u odnosu na širinu heliksa (Slika 20-22). Sinteza vo
dećeg i lanca koji zaostaje odvija se istovremeno. Sinteza oba lanca omogućena je savijanjem matri
ce za lanac koji zaostaje u petlju, tako da oba lanca matrice prolaze kroz prstenaste monomere p su-
jedinica DNK-polimeraze III u istom smeru.
Holoenzim DNK-polimeraza Hl
I \\- subjedinica
/ / SSB
, n, L a n a c k o
RNK-prajmer ^ i j zaostaje
Rastući Okazakijevi
fragmenti
Slika 20-22. Struktura i dejstvo DNK-polimeraze III. (3 subjedinica je dimer koji obuhvata oba
lanca duplog heliksa DNK.
Sinteza lanca koji zaostaje je složenija, jer se on sintetiše u kratkim fragmentima čija polimeriza-
cija teče u smeru suprotnom od kretanja replikativne viljuške. Za započinjanje sinteze svakog Oka-
zakijevog fragmenta potrebno je postojanje RNK-prajmera koga sintetiše primazom koji se pomera
duž lanca koji zaostaje u smeru 5'->3'. RNK-prajmeri iniciraju sintezu Okazakijevih fragmenata po
moću DNK-polimeraze III koja nadovezuje dezoksiribonukleotide na prajmere. Pri tome, smer sinteze
prajmera i Okazakijevih fragmenata je suprotan smeru kretanja primazoma. DNK-polimeraza III nas
tavlja sa sintezom DNK sve dok nije blokirana sa RNK-prajmerom. Kada se ovo desi, RNK-prajmer
se iseca i praznina se popunjava pomoću DNK-polimeraze I. Osnovna funkcija DNK-polimeraze I je
uklanjanje RNK-prajmera neophodnih za inicijaciju replikacije posebno na lancu koji zaostaje, 5'->3'
egzonukleaznom aktivnošću i popunjavanje nastale praznine ugradnjom dezoksiribonukleotida kom
plementarnih lancu-matrici pomoću 5'->3' polimerazne aktivnosti. Kao i polimeraza III i polimeraza I
poseduje osobinu provere tačnosti ugrađenog nukleotida zahvaljujući 3'->5' egzonukieaznoj aktivno-
20-20 Opšta biohemija
sti. Ovaj enzim ugrađuje vrlo mali broj nukleotida u lanac DNK (10-20 nukleotida u sekundi). Ovaj
proces uklanjanja/sinteze/provere se stalno vrši dok se RNK potpuno ne razgradi i praznina popuni
sa DNK. Na osnovu gore izloženih osobina DNK-polimeraze I vidimo da je to enzim koji vrši neke za
vršne radnje u toku procesa replikacije DNK.
Polimeraza //je manje proučena i ona verovatno sudeluje u reparaciji DNK.
Replikacija kod eukariota je slična replikaciji kod prokariota. Postoje izvesne razlike poput one da
kod eukariota postoje multipla mesta replikativnog početka dok kod prokariota to je samo jedan po
četak. Kod eukariota isto tako postoji SSB protein kao i ATP zavisna DNK-helikaza, čije su funkcije
analogne onim kod prokariotskih enzima koje su već prodiskutovane. Postoji najmanje 5 klasa euka
riotskih DNK-polimeraza i one su kategorisane prema molekulskoj masi, ćelijskoj lokalizaciji, osetlji-
vosti na inhibitore i prema matrici ili supstratima na koje deluju. Pol a, pol 5 i pol s su članovi a famili
je eukariotskih DNK-polimeraza. Pol a ima primaznu aktivnost i sintetiše RNK-prajmere i za vodeći i
za lanac koji zaostaje. Pol 6 produžava vodeći lanac i pol e lanac koji zaostaje, polimeraznom aktiv
nošću 5'-»3', a obe imaju i sposobnost provere tačnosti zahvaljujući 3'->5' egzonukleaznoj aktivnosti.
Po//5je analogna sa DNK-polimerazom II kod E.coli i ona u asocijaciji sa drugim proteinima, prajme-
rima vrši i reparaciju DNK. Pol y replikuje mitohondrijalnu DNK.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-21
Reparacija DNK
Neoštećena DNK
ACTGA ATGGCCATA
TGACT TACCGGTAT
Depurinacija Dezaminacija
Potencijalno mutiran
lanac Adenin J
NhU^
Gubitak baze
ACTG ATGGCCATA ACTGA ATGGCCATA
TGACT TACCGGTAT TGACT TACUGGTAT
Uracil u D N K
Mutirani lanac
3. Dezaminacija
Tri od ukupno četiri baze u DNK (A,C i G) imaju amino-grupe kao supstituente u prstenu, a njihov
gubitak dovodi do promene u svojstvima parova baza zasnovanim na vodoničnim vezama (Slika 20-
24). Spontana dezaminacija citozina u uracil na DNK dešava se 400 puta u toku 24 sata. I ova pro
mena je potencijalno mutagena zato što ukoliko se ne koriguje stvoreni uracil se ponaša kao timin u
sledećem procesu replikacije.
Pored spontanih promena na lancima duplog heliksa DNK dolazi i do oštećenja dejstvom fizičkih
i hemijskih agenasa. Od fizičkih agenasa na lance DNK deluju UV i X-zraci (rentgenski zraci). UV
20-22 Opšta biohemija
zračenje dovodi do hemijskih promena na molekulu DNK. Izlaganje ćelije UV svetlosti dovodi do ko-
valentnog vezivanja dva pirimidina (obično timina) uz stvaranje dimera. U ovoj reakciji stvara se spe
cifična struktura ciklobutanski prsten što inhibira replikaciju DNK (Slika 20-25). Ovaj timinski dtmer
sprečava DNK-polimerazu da replikuje lanac DNK ispred mesta stvaranja dimera.
Ciklobutanski prsten
Pored UV zraka od fizičkih agenasa DNK oštećuju i X-zraci. Ovi zraci kidaju fosfodiestarsku vezu
što isto tako zaustavlja replikaciju i dovodi do gubitka integriteta genoma. Hemijski agensi dovode do
raznih hemijskih modifikacija odnosno do promena u strukturi baza citozina, adenina i gvanina. Tako
na primer azotna kiselina, koja nastaje u ćelijama od prekursora poput nitrozamina, nitrita i nitrata je
potencijalno agresivna supstanca koja uklanja amino-grupe dovodeći do dezaminacije (C-»U), N-
alkilacijom dolazi do stvaranja N7-metil G ili O-alikacijom do 06-metil G što dovodi do permanentnih
promena u primarnoj strukturi DNK. Brojni su primeri štetnih agenasa iz okoline i industrijskog zaga
đenja koji oštećuju DNK i mnogi od njih su mutageni ili karcinogeni i predstavljaju stalnu potencijalnu
opasnost za zdravlje ljudi. Neki su i teratogeni i dovode do abnormalnosti fetusa. Ukoliko se ošteće
nje ne ispravi, može se pojaviti permanentna mutacija. Uzroci mutacija su: supstutucija para nukleo-
tida, delecije (brisanja), insercije (umetanja), uključujući i gubitak kontrole nad proliferacijom mutira-
nih ćelija, što pak vodi ka kanceroznim promenama. Oštećenja DNK mogu biti i silent (ćutljive) tj. da
se te promene ne odražavaju na funkciju ćelije.
U cilju održavanja svog genoma ćelije su dosta efikasne u reparaciji oštećenja DNK. Ćelija pose-
duje svoj reparativni sistem koji se sastoji iz čitave baterije enzima reparacije, a posebno je važno da
je zadržana komplementarna genetska informacija na neoštećenom lancu DNK koji služi kao matrica
za sintezu novog dela DNK. Mehanizmi reparacije DNK se odvijaju uz veliki utrošak energije. Većina
enzima reparacije su uključeni u proces prepoznavanja lezije, isecanja oštećenog dela trake DNK i
korišćenja sestrinske trake kao matrice za sintezu dela DNK tj. popunjavanje praznine nastale iseca-
njem abnormalne DNK. Postoje dva uopštena mehanizma reparacije DNK:
DNK. Praznina koja se javlja uklanjanjem trake DNK koja sadrži timinski dimer se popunjava, uz ko-
rišćenje sestrinske trake kao matrice, pomoću 5'H>3' polimerazne aktivnosti DNK-polimeraze. Dejs-
tvom DNK-ligaze 3'-hidroksilna grupa novosintetisanog DNK se spaja sa 5'-fosfatom preostalog dela
lanca originalne DNK.
^ UV specifična
Timinski endonukleaza
dimer
\S^
Prekid
DNK-polimeraza 1
>f
11 • h-
5'-»3' Izrezivanje
9^ V Prekid
DNK-ligaza
3'- •5'
5'- 3'
Pirimidinski dimeri se mogu naći u ćelijama kože kod ljudi koji su izloženi UV zracima. U retkom
genetskom oboljenju ksenoderma pigmentosum, ćelije ne mogu da repariraju oštećenu DNK opisa
nim mehanizmom, što rezultira ekstenzivnom akumulacijom ovih mutacija i pojavom kancera kože.
Ova bolest se javlja obično zbog odsustva UV specifične endonukleaze.
tni preostali deo nukleotida. Praznina od jednog nukleotida u lancu DNK se popunjava pomoću DNK-
polimeraze i DNK-ligaze.
Spontana
3- 5
deza mi nacija 3
"' 5'
T G C A G T G T G C A G T G
II III III II 1 II III I i III II x li III
A C G T(C)A C
3' 5'- A C G TttOA C 3'
. Uracil-N-
U -< gfikozidaza
3'- 5'
T G C A G T G
II III 1 II 1 »1
A C G T AC
5'- 3*
Apirimidinska-
endonukleaza
DNK-polimeraza i
V DNK-ligaza 3" 5'
T G C A G T G T G C A G T G
II III III II 1 II Hl II III i 1 II II
A C G T § A C A C G T AC
3' 5'- 3'
PP. dCTP
C. TRANSKRIPCIJA
DNK
T R A N S K R I P C I J A
I i i
5S
55 -\
28S
GPPP AAA ,5 e?s
18S
iRNK
tRNK rRNK
određenih regiona DNK prenosi u narednoj fazi, genetsku informaciju na određenu sekvencu amino-
kiselina - polipeptidnog lanca.
Kao i sve druge faze u metabolizmu nukleinskih kiselina i biosintezi proteina, sinteza RNK mole
kula je vrlo komplikovan proces koji uključuje razne enzime i odgovarajuće proteine. RNK-polimeraza
je enzim dirigovan matricom koji sintetiše RNK. Sintetisana RNK je komplementarna sa lancem-
matricom DNK (antisense lanac) i identična sa drugim lancem koji nije matrica (sense lanac). Lanac
DNK koji nije matrica se naziva kodirajući lanac jer njegova sekvenca je identična sekvenci iRNK,
samo što sadrži timin umesto uracila što se vidi na sledećoj šemi.
DNK
5' - TTTGGACAACGTCCAGCGATC - 3' Lanac koji nije matrica (+); kodirajuća sekvenca
«
"sense" lanac
3' - AAACCTGTTGCAGGTCGCTAG - 5' Lanac-matrica (-)
"antisense" lanac
RNK
5' - UUUGGACAACGUCCAGCGAUC - 3' RNK-transkript
Proces transkripcije je selektivan jer se od jednog određenog regiona DNK mogu sintetisati raz
ni transkripti. Selektivnost procesa transkripcije je odraz signala koji su zapisani u sekvenci nukleoti-
da DNK. Ovi signali utiču na RNK-polimerazu gde da započne transkripciju, koliko često da se zapo
čne transkripcija i gde da se transkripcija zaustavi. Biohemijska raznolikost različitih tkiva jednog or
ganizma je posledica selektivnosti procesa transkripcije. Druga važna osobina transkripcije je da
mnogi RNK transkripti podležu raznim modifikacijama - post-transkripcionim promenama (termi-
nalne adicije, modifikacije baza, interno isecanje) što ima za rezultat prevođenje inaktivnog primar
nog transkripta u funkcionalnu molekulu.
Struktura RNK
Postoje tri glavna tipa RNK koje sudeluju u biosintezi proteina: ribozomska RNK (rRNK), tran
sportna RNK (tRNK) i informaciona (messenger) RNK (iRNK) (Slika 20-28). Sva tri tipa RNK kao i
DNK su nerazgranati polimerni molekuli sastavljeni od nukleotida povezanih fosfodiestarskim veza
ma (Slika 20-2). RNK se razlikuju u odnosu na DNK na osnovu: veličine jer su sve RNK manje od
DNK, šećera - riboze i pirimidinske baze - uracila umesto timina. RNK se međusobno razlikuju po ve
ličini, funkciji i specijalnim strukturnim modifikacijama.
Ribozomska RNK
Ribozomska RNK (rRNK) zajedno sa brojnim različitim proteinima ulazi u sastav ribozoma -
kompleksnih struktura u kojima se odvija sinteza proteina. rRNK se javljaju u tri različite veličine
(23S, 16S i 5S) kod prokariota i u mitohondrijama eukariota. Kod eukariota postoje četiri rRNK (28S,
18S, 5,8S i 5S). S je Svedbergova jedinica ili sedimentaciona jedinica koja zavisi od molekulske ma
se i oblika molekule, tako da ovo nije aditivna veličina. Sve rRNK u ćeliji sačinjavaju oko 80 % od
ukupne RNK. rRNK su stabilni molekuli sa specifičnom trodimenzionalnom strukturom koji imaju od
ređenu ulogu u procesu translacije. Utvrđeno je da neki molekuli rRNK imaju katalitičku aktivnost u
stvaranju peptidne veze1.
1
Do ovog otkrića se verovalo da su svi enzimi po svojoj hemijskoj strukturi proteini.
20-26 Opšta biohemija
Akceptorski krak
T«FC petlja
M* T 64
D petlja Akceptorski
krak
Varijabilna
petlja
Antikodonski
krak
Slika 20-29. Struktura transportne RNK. a) Sekundarna struktura tRNK u vidu trolisne dete-
line; b) Uvijena tercijerna struktura tRNK u vidu slova L.
sekvencu CCA koja gradi kovalentnu vezu sa odgovarajućom aminokiselinom. Druga strukturna ka
rakteristika se ispoljava na antikodonskom kraku koji na svojoj petlji sadrži sekvencu od tri nukleotida
- antikodon koji omogućava vezivanje za specifičan kodon na iRNK. tRNK poseduje još tri druge
strukturne karakteristike: D petlju, T*FC petlju i varijabilnu petlju. D petlja je dobila ime po dihidrouri-
dinu, T^FC petlja sadrži sekvencu timin, pseudouridin i citozin. Funkcije ovih petlji nisu u potpunosti
razjašnjene, ali verovatno imaju značaj u vezivanju za određena mesta u ribozomima. Varijabilna
petlja je dobila ime po tome što broj nukleotida u njoj varira i po tome se pojedine tRNK međusobno
razlikuju. Pored sekundarne strukture i tercijerna struktura je u funkciji tRNK da vezuje za sebe od
govarajuću aminokiselinu reakcijom koju katalizuje određeni enzim (Slika 20-46). Tercijernu strukturu
održavaju vodonične veze između baza koje nisu-sparene u sekundarnoj strukturi, kao i bazni tripleti
u prostoru. Ovakva specifična "L struktura" tRNK omogućava interakciju sa specifičnom aminoacil-
tRNK-sintetazom koja katalizuje reakciju karboksilne grupe aminokiseline sa 3'-OH krajem tRNK.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-27
Informaciona RNK
Informaciona RNK (iRNK) obuhvata samo oko 5 % od ukupne RNK u ćeliji. iRNK je najheteroge-
nija RNK u pogledu veličine. Ona nosi genetsku informaciju sa DNK u citozol, gde se koristi kao mat
rica za sintezu proteina. Prokariotske iRNK i eukariotska iRNK pokazuju više međusobnih razlika:
(1) Prva razlika je u tome što su iRNK prokariota policistronske što znači da jedna iRNK sadrži
kodirajuće informacije za nekoliko polipeptidnih lanaca. Suprotno ovome eukariotska iRNK kodira
samo jedan polipeptidni lanac i označena je kao monocistronska. Cistron je sekvenca DNK ko
ja sadrži kodirajuću informaciju za polipeptid kao i nekoliko signala koji su neophodni za funkciju
ribozoma.
(2) Druga razlika se zasniva na različitim putevima transkripcije iRNK kod eukariota i prokariota. Na
prokariotskoj iRNK odmah nakon transkripcije odvija se translacija na ribozomima. Eukariotska
iRNK nakon transkripcije podleže modifikacijama koje stvaraju funkcionalno aktivni molekul
iRNK. Prokariotske iRNK se transkribuju kao funkcionalni aktivni molekuli (nema obrade trans-
kripta) i imaju kratak poluživot od 1 do 2 minuta.
(3) Prokariotska iRNK na početnom 5'-kraju sadrži nekodirajući, čeoni niz koji ne kodira sintezu pro
teina. U okviru ovog čeonog niza nalazi se tetranukleotid Šajn-Dalgarnov niz (AGGA) koji je
komplementaran nizu nukleotida na 3'-kraju rRNK 16S i ovaj niz omogućava povezivanje iRNK
sa malom subjedinicom ribozoma. Nekodirajući niz se završava start kodonom (AUG, GUG) sa
kojim počinje kodirajući niz. Kodirajući niz se sastoji od tripleta nukleotida (kodona), čiji redosled
određuje redosled aminokiselina u proteinima. Kodirajući niz se završava STOP kodonom (UAA,
UGA, UAG) i za koga se opet nalazi nekodirajući niz. Eukariotske iRNK u citoplazmi se nalaze
slobodne i vezane za poliribozome. Na 5'-kraju nalazi se 5'-kapa koja se sastoji od 7-
metilgvanozina vezanog suprotno od uobičajene 3',5'-fosfodiestarske veze pomoću 5'-5' trifosfa-
tnog mosta (Slika 20-30). Iza 5'-kape sledi nekodirajući niz (čeoni) koji se završava (AUG) - Start
kodonom. Posle njega sledi kodirajući niz, koji se završava stop kodonom (UAA, UAG, UGA). Na
3'-kraju molekule nalazi se duga sekvenca adenin-nukleotida (poli-A rep). Na 5'-kraju iRNK nema
Šajn-Dalgarnovog niza, ali neke iRNK imaju nizove nukleotida (od po 20 nukleotida) koji su kom
plementarni 3'-kraju ribozomske RNK 18S. iRNK sa 5'-kapom vezuje se za malu subjedinicu ri
bozoma. Primarni transkript iRNK podleže obradi putem kovalentnih modifikacija (kada dobija 5'-
kapu i 3'-poliA rep) i isecanjem introna.
Nekodirajući Kodirajući
r e i o n region
5'-kapa 9 Poli-A rep
A
-\ ' ^
Gppp •JJ ^pApApApA-OH
5'-kraj 3'-kraj
Pored ove tri glavne RNK kod eukariota postoje: heterogene RNK (hnRNK) i male nuklearne
RNK (snRNK). Heterogeni RNK molekuli se direktno transkribuju sa DNK i od njih se kasnije formira
iRNK procesima isecanja introna. Mali nuklearni RNK molekuli u kompleksu sa nekoliko proteina
grade male nuklearne ribonukleoproteinske partikule (snRNP) koje sudeluju u procesima isecanja in
trona.
20-28 Opšta biohemija
Sinteza RNK se odvija dejstvom RNK-polimeraze i donekle je slična procesu replikacije DNK.
Sličnosti se ispoljavaju u tome što sinteza RNK zahteva tačnu i efikasnu inicijaciju, elongaciju lanca u
pravcu 5'->3' (pri čemu se polimeraza pomera u pravcu 3'-»5' duž matrice) i određenu terminaciju.
Pored ovih sličnosti postoje i razlike od replikacije:
• Transkripcija započinje istovremeno na više mesta za razliku od replikacije, bez obzira da li se
radi o eukariotima ili prokariotima.
• U ćeliji se nalazi mnogo više molekula RNK-polimeraze nego DNK-polimeraze.
• RNK-polimeraza je mnogo sporija od DNK-polimeraze (efikasnost RNK-polimeraze je 50-100
nukleotida u sekundi).
• Tačnost polimerizacije RNK je mnogo manja nego kod DNK što je i dozvoljeno jer pogrešni RNK
molekul se jednostavno ukloni i sintetiše se novi.
RNK-polimeraza katalizuje sledeću reakciju:
RNK-polimeraza
• Struktura RNK-polimeraze i njene osobine se značajno razlikuju između prokariota i eukariota i te
razlike uslovljavaju posebne mehanizme transkripcije kod njih. Bakterije imaju jednu vrstu RNK-
polimeraze koja sintetiše sva tri oblika RNK (iRNK, tRNK i rRNK). Poseban oblik RNK-polimeraze je
primaza, enzim koji sintetiše RNK-prajmere neophodne za inicijaciju procesa replikacije. Najvažnija
osobina RNK-polimeraze prokariota je da ima sposobnost prepoznavanja mesta početka transkripci
je na lancu DNK. RNK-polimeraza se vezuje za određenu sekvencu nukleotida koja se naziva pro-
motorski region na početku segmenta DNK koja se transkribuje. RNK-polimeraza stvara komple-
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-29
mentarnu kopiju lanca-matrice i prepoznaje sekvencu nukleotida na lancu DNK koji označava kraj
transkripcije (terminacioni region). RNK-polimeraza prokariota je multimerni enzim koji se sastoji iz
jezgra u kome se nalazi pet subjedinica 2a, p, p' i u). Svaka subjedinica ima odgovarajuću ulogu: a
subjedinice iniciraju samu polimeraznu aktivnost, p je katalitička subjedinica koja stvara fosfodiestar-
sku vezu, p' se vezuje za lanac-matricu. Subjedinice jezgra enzima su odgovorne za 5'->3' polimera
znu aktivnost, ali one nemaju sposobnost prepoznavanja promotorskog regiona. Van jezgra enzima,
a u sklopu holoenzima nalazi se 6 subjedinica koja omogućava polimerazi da prepozna promotorski
region na DNK i da se specifično veže za njega (Slika 20-32).
Jezgro enzima
v_ _y
Holoenzim
DNK
3' 5'
Drugi blok je označen kao -36 sekvenca (TTGACA) i lociran je na oko 35 baza uzvodno od transkri-
pcionog početka i isto tako njega prepoznaje RNK-polimeraza. Mutacija na Pribnovljevom bloku ili -
35 sekvenci može da utiče na transkripciju gena. Glavno mesto kontrole procesa transkripcije se od
vija u fazi inicijacije transkripcije i to na nivou prepoznavanja i vezivanja RNK-polimeraze za promo-
torski region. Promotorski region ima dvostruki značaj. Pored vezivanja polimeraze za njega i počet
ka procesa transkripcije on određuje i pravac transkripcije jer se promotor nalazi uzvodno od mesta
početka transkripcije na lancu-matrici DNK, a sinteza transkripta RNK se onda odvija nizvodno.
Transkripciona jedinica obuhvata region od promotora do terminacionog regiona, a proizvod trans
kripcije RNK-polimerazom je primarni transkript.
DNK
5'
RNK-polimeraza \
<LiiT^ Ro faktor3'
DNK
RNK
3' TTTTTT^'
©
5'
5' TTTT
Lanac DNK koji služi kao matrica se može kopirati samo, ako su lanci duplog heliksa DNK razd
vojeni. Vezivanjem enzima za matricu dolazi do lokalnog odvrtanja duplog heliksa DNK i stvaranja
transkripcionog balona. Separacija lanaca se odvija duž molekula DNK u pravcu RNK sinteze, uz
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-31
oslobađanje nascentnog lanca RNK kako se on pomera. Elongacija lanaca RNK zahteva privremenu
razdvojenost lanaca molekula DNK za razliku od replikacije gde je ona trajna. Kako se RNK-
polimeraza pomera između lanaca duplog heliksa, stvaraju se pozitivni supemavoji ispred mesta
transkripcije i negativni supemavoji iza njega (Slika 20-35). Pozitivni supemavoji se neutrališu dejs-
tvom žiraze, a negativni pomoću topoizomeraze I.
RNK-
(b) / N x
N N
I I
N C
(a) G•C A•T /
G •
bogat region C
C • G
5' ••• NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTTTTTNNN ••• 3' D N K
c . G
3> . . . NNTTCGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN •••5' matr
'«» G • C
C • G
R N K
5' ••• NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUU-OH 3" G • C
transkript A • U
A • U
. . . NNNN UUUU-OH 3'
koji sadrži sekvece bogate A nukleotidima. Stvaranje ukosnice na lancu RNK destabiliše vezu izme
đu polimeraze i matrice. Ova veza se dodatno destabiliše sa slabijom vezom između AU parova ba
za iza ukosnice koji su formirani između matrice i RNK. Većina gena u E.coli završa transkripciju
ovim putem. *
20-32 Opšta biohemija
DNK
3' 5'
Ključno mesto u transkripciji eukariotskih gena i kontroli ekspresije gena je inicijacija transkripcije
koja se ostvaruje putem promotora. Aktivacija promotora vrši se pomoću trans-faktora ili transkrip
cionih faktora. Ispitivanja su pokazala da je za punu aktivnost promotora u genomu, potrebno prisu
stvo dodatnih karakterističnih nizova nukleotida, pojačivača ili stimulatora (eng. enhancers). Pro
motori i pojačivači su elementi DNK koji učestvuju u regulaciji transkripcije gena, pa su nasuprot
trans-faktorima, nazvani cis-eiementi. Pojačivači mogu biti locirani uzvodno (prema 5'-kraju) ili niz
vodno (prema 3'-kraju) od mesta starta transkripcije i mogu biti blizu ili na većoj udaljenosti (1000 pa
rova baza) od promotora.
Transkripcioni faktori (TF) prepoznaju karakteristične nizove u okviru promotora, vezuju RNK-
polimeraze i omogućavaju da transkripcija počne od tačno određenog mesta. Transkripcioni faktori
se mogu podeliti u tri grupe.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-33
(1) Opšti ili osnovni TF su neophodni za transkripciju svih strukturnih gena. Oni se vezuju za pro
motor (TATA blok), vezuju se i za RNK-polimerazu i dovode je na mesto formiranja preinicijacionog
kompleksa (Slika 20-38). Transkripcioni faktori se zajedno sa RNK-polimerazom uzastopno vezuju
za promotorski region u blizini mesta inicijacije transkripcije, gradeći preinicijacioni kompleks koji je
odgovoran za bazalnu brzinu inicijacije transkripcije. Do sada ih je otkriveno 7 (TF MA; TFIIB; TFIID;
TFIIE; TFIIF; TFIIH; TFIIJ). Oznaka II se odnosi na TF RNK-polimeraze II, mada se proces odvija sli
čno i kod RNK-polimeraze I i ///. Proces formiranja preinicijacionog kompleksa se odvija u više faza
sa određenim redosledom vezivanja TF. Najpre se TFIID vezuje za TATA blok, zapravo jedna subje-
20-34 Opšta biohemija
dinica od multimernog proteinskog kompleksa TFIID. Subjedinica koja se prva vezuje označena je
kao TBP, od engleskog naziva TATA binding protein. Vezanom kompleksu TFIID pridružuju se po
tom TFIIA i TFIIB. Faktor TFIIF se vezuje za RNK-polimerazu II i sprovodi je do promotora. Ovaj
transkripcioni faktor ima sličnu ulogu kao a-faktor kod prokariota. Posle vezivanja enzima, kompleksu
se pridružuju i ostali faktori (TFIIE, TFIIH i TFIIJ) čime je završeno formiranje preinicijacionog kom
pleksa. Poslednja faza je aktivacija kompleksa sa TFIIH uz energiju koja se oslobađa hidrolizom
ATP. Ovako formirani preinicijacioni kompleks je izuzetno veliki i vrlo složenog sastava jer sadrži
najmanje 20 subjedinica transkripcionih faktora i 10 subjedinica RNK-polimeraze II. Svaka od kom
ponenti ovog kompleksa predstavlja potencijalno regulatorno mesto preko koga se utiče na inicijaciju
transkripcije, a samim tim i na ekspresiju gena.
(2) U drugu grupu TF spadaju faktori koji se vezuju uzvodno od mesta inicijacije transkripcije i
karakteristični su za gene koji su aktivni samo u nekim tkivima. Oni interaguju slabim elektrostatičkim
silama sa opštim transkripcionim faktorima dovodeći do inhibicije ili aktivacije inicijalcionog komplek
sa. Zapravo ovi faktori moduliraju bazalnu brzinu inicijacije transkripcije. Ako je mesto vezivanja ovih
faktora odvojeno od mesta vezivanja opštih transkripcionih faktora DNK se savija u petlju da bi omo
gućila njihovu interakciju (Slika 20-39). Ovi TF specifično prepoznaju samo promotore i pojačivače
onih gena čiju transkripciju regulišu, za razliku od opštih transkripcionih faktora koji se vezuju za
promotore svih gena koji se transkribuju. Vezivanje ovih transkripcionih faktora je kooperativno što is
to tako utiče na različite režime transkripcije u različitim tkivima. Kontrola aktivnosti ovih faktora de
šava se na nivou sinteze koja je tkivno specifična i vremenski uslovljena,
(3) inducibilni TF se vezuju takođe uzvodno od mesta inicijacije i neophodno je da se najpre aktivi
raju (fosforilacijom ili vezivanjem nekog liganda). Aktivnost ovih TF vezana je za dejstvo hormona ili
nekih drugih faktora spoljašnje sredine. Oni se za DNK vezuju, u okviru nizova sličnih pojačivačima,
koji se nazivaju elementi za odgovor na hormone ili druge signale. Inducibilni faktori dovode do se
lektivne aktivacije ili inaktivacije transkripcije gena u nekim tkivima, onda kada je to ćeliji potrebno. U
odsustvu ovih faktora, geni koji su pod njihovom kontrolom ostaju "zaključani".
Transkripcioni faktori se sastoje iz dva funkcionalna domena: domen koji se vezuje za DNK i
domen koji je odgovoran za aktivaciju transkripcije. Prema strukturnoj organizaciji DNK-vezivnog
domena oni se mogu podeliti na više grupa:
• TF sa DNK-vezivnim domenom koji se sastoji od 2 a heliksa povezanih petljom
• TF sa strukturnim motivom "Zn prsti"
• TF sa strukturnim motivom "leucinski rajsferšlus"
• TF sa 3 pločama
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-35
Strukture aktivacionih domena još uvek nisu dobro proučene, ali postoji dosta podataka o stva
ranju interakcije između proteina i DNK. Većina mehanizama koji se koriste u živim ćelijama za regu
laciju ekspresije gena uključuju interakciju DNK-protein. Baze koje se nalaze na ivicama velikog žlje-
ba duplog heliksa B-DNK sudeluju u vezivanju proteina za specifične sekvence. Ovo specifično vezi
vanje proteina za DNK podrazumeva brojne veze poput hidrofobnih interakcija, vodoničnih i jonskih
veza između aminokiselina i baza nukleotida. Na Slici 20-40 prikazane su neke od struktura različitih
transkripcionih faktora. Na primeru transkripcionog faktora sa motivom heliks-petlja-heliks prikazana
je i interakcija sa DNK.
Kl
Dejstvo antibiotika
Neki antibiotici deluju na nivou transkripcije tako što inhibiraju sintezu RNK i na taj način sprečavaju rast
ćelije bakterija. Antibiotik rifampicin inhibira inicijaciju transkripcije vezivanjem za |3 subjedinicu prokariot-
ske RNK-polimeraze i interferira sa stvaranjem prve fosfodiestarske veze. Rifampicin se koristi u tretmanu
tuberkuloze. Daktinomicin (ili aktinomicin D) je prvi antibiotik koji je primenjen u hemoterapiji tumora. On se
vezuje za matricu i interferira sa pomeranjem RNK-polimeraze duž lanca-matrice.
Post-transkripcione promene
1) Adicija 5'-kape
Prva reakcija koja se dešava na hnRNK je adi
cija 7-metilgvanozina na 5'-kraj stvaranjem neuobi
čajene 5'-5' trifosfatne veze (Slika 20-41). Dodava
nje gvanozin-trifosfata je katalizovano nuklearnim
>>7-metil-
gvanozin enzimom gvanilil-transferazom. Metilacija terminal-
nog gvanina se dešava u citozolu i katalizovana je
sa gvanin-7-metiltransferazom. Donor metil-grupe
je S-adenozilmetionin. Ukoliko je baza sledećeg
nukleotida adenin odvija se i dalja N6 metilacija
adenina. Cilj adicije 7-metilgvanozin kape je pove
ćanje stabilnosti iRNK jer je 5'-kraj na taj način zaš
tićen od dejstva nukleaza i olakšana je inicijacija
translacije.
jf N metilacija
Baza 1 ukoliko je baza A
2) Adicija poli-A repa
l\H H, Posle završetka transkripcije, transkript se čepa
O 0(CH3) na specifičnom mestu koje sadrži AAUAAA sekven-
cu. Odmah posle ovoga adira se između 100 i 250
O—P = 0 adenilat ostataka na 3'-kraj pomoću nuklearnog en
I
o zima poli A-polimeraze. Ova polimeraza nije dirigo-
Baza. vana matricom. Smatra se da formirani poli-A rep
CH
ima nekoliko funkcija: zaštita 3'-kraja od egzonu-
H H. kleaza, olakšava transport iRNK u citoplazmu i tran-
H slaciju pomoću ribozoma.
O 0(CH 3 )
O—P=0
I
O
h
3) Isecanje introna
Eukariotske iRNK sadrže introne, nekodirajuće sekvence koje treba ukloniti sa primarnog trans-
kripta, pri čemu ostaju samo egzoni koji su kodirajuće sekvence. Ćelije različitih tkiva međusobno se
razlikuju po broju introna, kao i veličini introna koji se uklanjaju sa primarnog transkripta. Proces ise-
canja introna je dosta složen i uključuje izvestan broj enzima, zahteva energiju i male nuklearne ribo-
nukleoproteinske komplekse (snRNP) (Slika 20-42). Isecanje se dešava u splajzomu koji se sastoji
iz više komponenti pre svega snRNP i nekoliko regulatornih proteina. U toku isecanja introna oni
formiraju specifičnu strukturu - petlju koja se naziva lariat. Reakcija dovodi do oslobađanja introna i
dejstvom Ugaze dolazi do spajanja dva egzona.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-37
Prekurzorska iRNK
Mesta iskrajanja
iRNK
Izdvojeni intron
Post-transkripcione modifikacije kod tRNK i rRNK su iste kod prokariota i eukariota. rRNK se sin-
tetiše u vidu pre-rRNK dugolančanih molekula koji se onda dejstvom endonukleaze isecaju na manje
molekule rRNK (Slika 20-43). Kod eukariota 4_5j^preribozomaina RNK služi kao prekursor za 18S,
28S i 5,8S rRNK, a kod prokariota za 23S, 16S i 5S. Eukariotska 5S rRNK se sintetiše pomoću RNK-
polimeraze III i posebno se modifikuje. Proteini koji ulaze u sastav ribozoma vezuju se za rRNK pre-
kursore pre i u toku post-transkripcionih modifikacija u nukleusu. Produkcija nekoliko molekula iz du
gog prekursorskog molekula je jedan od načina da se razne vrste rRNK stvaraju u ekvimolekularnim
količinama pre prelaska u ribozome.
5' 3'
PPP"
Ribonukleaza
2
5,8S rRNK »S rRNK
koji omogućava vezivanje odgovarajuće aminokiseline. Pored ovoga dolazi i do modifikacija nukleo
tida koji konačno stvaraju funkcionalnu tRNK sa specifičnom trodimenzionalnom strukturom. Modifi
kacija nukleotida dovodi do stvaranja neuobičajenih baza poput inozina, pseudoundina i ribo-timidina
kojih nema u drugim RNK. U ovim kovalentnim modifikacijama dolazi i do metilacije riboze na 2' O
poziciji. Pretpostavka je da se ovom modifikacijom postiže veća stabilnost fosfodiestarske veze na
alkalnu hidrolizu, a samim tim i veća stabilnost tRNK.
D. TRANSLACIJA
Genetski kod
Genetski kod je rečnik koji daje korespondenciju između sekvenci nukleotidnih baza i sekvence
aminokiselina. Dešifriranje genetskog koda je ukazalo da se svaka individualna reč u kodu sastoji iz
tripleta nukleotida. Ove genetske reci se zovu kodoni. Kodoni se nalaze u informacionoj RNK i u sas
tav njihov ulaze četiri baze: adenin (A), gvanin (G), citozin (C) i uracil (U). Ove četiri nukleotidne baze
kodiraju 20 aminokiselina. One daju 64 različite kombinacije koje su date u Tabeli 20-1. Sekvenca
nukleotida u kodonu se uvek piše u pravcu 5'->3'. Tabela 20-1 predstavlja neku vrstu rečnika koji se
koristi za translaciju sekvence kodona. Na osnovu tabele možemo videti da je aminokiselina uvek
kodirana odgovarajućom sekvencom nukleotida na iRNK. Primer za ovo je: kodon 5'-CAU-3' odgova
ra histidinu, a 5'-AUG-3' metioninu. Od ukupno 64 kodona 61 kodira 20 uobičajenih aminokiselina.
Tri preostala kodona (UAA.UAG i UGA) ne kodiraju aminokiseline već predstavljaju stop ili terminaci-
one kodone. Pojava jednog od ovih kodona u iRNK je signal za završetak sinteze polipeptidnog lan
ca. Triplet AUG je kodon za metionin i ujedno start signal tj. mesto od koga započinje očitavanje
iRNK.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosmteza proteina 20-39
5>-kraj 3'-kraj
U C A G
Phe Ser Tyr Cys U
U Phe Ser Tyr Cys C
Leu Ser Stop Stop A
Leu Ser Stop Trp G
Leu Pro His Arg U
C Leu Pro His Arg C
Leu Pro Gln Arg A
Leu Pro Gln Arg G
Me Thr Asn Ser U
A lle Thr Asn Ser C
lle Thr Lys Arg A
Met Thr Lys Arg G
Val Ala Asp Gly U
G Val Ala Asp Gly C
Val Ala Glu Gly A
Val Ala Glu Gly G
Varijacije u sekvenci nukleotida dovode do promene u genetskom kodonu. Promena samo jedne
nukleotidne baze na lancu iRNK može dovesti do sledećih promena (Slika 20-44):
• "Silent" mutacija - kodon koji sadrži promenjenu bazu može da kodira istu aminokiselinu.
Primer za ovo je kodon za serin UCA. Kada se promeni treća baza nastaje UCU što još uvek
kodira serin. Ovakva mutacija je silent ili ćutljiva ili maskirana.
• "Missense" mutacija - zamena baze u kodonu ugrađuje različitu aminokiselinu. Primer za ovo
je ukoliko se u kodonu za serin UCA promeni prva baza CCA to onda odgovara prolinu.
• "Nonsense" mutacija - zamena jedne nukleotidne baze stvara terminacioni kodon. Ako se u
kodonu za serin UCA izvrši zamena druge baze nastaje UAA koja dovodi do terminacije
translacije na tom stupnju.
UAA
Terminacioni kodon
Nonsense mutacija
UCA
Kodon za seriin
Missense Silent mutacija
mutacija
u cm
CCA Kodon za serin
Kodon za prolin
Karakteristike genetskog koda su da više različitih kodona određuje jednu aminokiselinu. Većina
aminokiselina ima više kodona izuzev triptofana i metionina koji imaju po jedan. Zbog ovoga se kaže
da je genetički kod izrođen. Tako na primer serin kodiraju 6 tripleta nukleotida (AGU, AGC, UCU,
UCC.UCG i UCA). Kodoni jedne aminokiseline su vrlo slični i razlikuju se obično samo po jednom
nukleotidu. Ova osobina genetskog koda služi kako bi se minimizirala opasnost od tačkaste mutacije.
Genetski kod je specifičan jer uvek kodira istu aminokiselinu. Ispitivanja procesa translacije na razli
čitim biološkim vrstama pokazala su da je kodirajući signal za aminokiselinu uvek isti što ukazuje na
univerzalnost genetskog koda. Genetski kod se očitava kontinuirano bez preklapanja i zareza. Kodi-
rajuća sekvenca iRNK se očitava pomoću ribozoma startujući od inicijalnog kodona (AUG) kontinui
rano tri po tri baze bez ikakvog zastoja sve do stop kodona. Okvir očitavanja iRNK predstavlja niz
sukcesivnih tripleta nukleotida. Ukoliko se javi mutacija u ovom okviru očitavanja tj. ako se jedan
nukleotid ubaci ili izbaci onda je promenjena i sekvenca aminokiselina (Slika 20-45).
iRNK
ICACCUAUGGCU
5 kra
'" J "s& V IST^ 3'-kraj
Delecija C
c
l^C^UGGCU
Ser Leu Trp
Sinteza polipeptidnog lanca zahteva veliki broj komponenata: aminokiseline, iRNK koja nosi in
formaciju za sintezu polipeptidnog lanca, tRNK, ribozome, izvore energije, enzime i proteinske fakto
re neophodne za inicijaciju, eiongaciju i terminaciju ovog procesa. Sve ove komponente se nalaze u
citozolu gde se ovaj proces sinteze i odvija.
Translacija zahteva prisustvo svih aminokiselina koja se nalaze u novosintetisanom proteinu.
Ukoliko nedostaje neka aminokiselina u ćeliji, ili ukoliko se radi o nedostatku esencijalne aminokiseli
ne, proces translacije se zaustavlja kada dostigne odgovarajući kodon. Važno je imati sve esencijal
ne aminokiseline u dovoljnim količinama u ishrani kako bi sinteza proteina bila kontinuirana.
Svaka aminokiselina ima najmanje jednu specifičnu transportnu RNK (tRNK). U humanom or
ganizmu postoji najmanje 50 vrsta tRNK, dok bakterijske sadrže 30 do 40 vrsta. Pošto postoji dvade
set različitih aminokiselina, proizilazi da neke aminokiseline imaju više od jedne specifične tRNK.
Primer za ovo su sve aminokiseline koje su kodirane sa nekoliko kodona poput arginina koji ima šest
kodona. Kao što je već rečeno struktura tRNK je u funkciji ove kiseline. Dve strukture su od poseb
nog znapaja za adaptersku ulogu koju ima tRNK: (1) akceptorski krak tRNK sa CCA sekvencom za
koju se vezuje aminokiselina; (2) antikodon za prepoznavanje kodona određene aminokiseline na
iRNK (Slika 20-30). Aminokiselina koja je kovalentno vezana za tRNK molekulu je aktivirana i to je
preduslov za ugradnju aminokiseline u polipeptidni lanac.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-41
Sinteza ammoacil-tRNK
Aminokiselina
Vezivanje aminokiseline za odgovarajuću
tRNK katalizuje enzim aminoacil-tRNK-sintetaza. Aminoacil-tRNK S* ATP
Postoji specifičan enzim za svaku tRNK koja pre
poznaje odgovarajuću aminokiselinu. Aminoacil-
tRNK-sintetaza katalizuje kovalentno vezivanje
aminokiseline na 3'-kraj CCA sekvence odgovara
juće tRNK. Reakcija zahteva energiju u vidu ATP
koji se razlaže na AMP i PPJ; reakcija se odvija u
dva stupnja: najpre se enzim putem AMP vezuje
za aminokiselinu, da bi u drugom stupnju došlo do
vezivanja aminokiseline za tRNK i oslobađanja
enzima i AMP. Stvara se aminoacil-tRNK (Slika
20-46). PPj se dalje trenutno razlaže tako da je
reakcija ireverzibilna. Obzirom da nastaje AMP, za
vezivanje jedne aminokiseline za odgovarajuću
tRNK potrebna su dve molekule ATP. Stvorena
estarska veza između 3'-OH grupe nukleotida i
karboksilne grupe aminokiseline je dovoljno
energetski bogata veza da se u procesu translacije
oslobođena energija iskoristi za građenje peptidne
veze. Aminoacil-tRNK-sintetaza je jako specifičan
enzim koji prepoznaje aminokiselinu i
odgovarajuću tRNK i odgovoran je za tačnost Aminoacil-tRNK
procesa translacije genetske poruke.
Slika 20-46. Aktivacija aminokiseline u vi
du aminoacil-tRNK.
5S RNK
Slika 20-47. Struktura ribozom a prokariota i eukariota. Male i velike subjedinice ribo-
zoma. Sadržaj rRNK i proteina.
Ova tRNK nosi lanac aminokiselina koje su već ugrađene u novosintetisani peptidni lanac. Proces
translacije, očitavanja iRNK se odvija u pravcu 5'->3' pri čemu se sintetiše poiipeptidni lanac od ami-
noterminalnog ka karboksiterminalnom kraju (Slika 20-48).
Transportna
RNK
Informaciona RNK
Pravac kretanja
ribozoma na iRNK
Slika 20-48. Proces translacije očitavanjem iRNK u pravcu 5'->3'. Pomeranje ribozoma duž
iRNK i sinteza polipeptidnog lanca
Ribozomi se u citozolu nalaze slobodni ili vezani za endoplazmatični retikulum koji se onda nazi
va zrnasti ili granulirani endoplazmatični retikulum. U ribozomima vezanim za endoplazmatični retiku-
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-43
lum sintetišu se proteini koji se transportuju iz ćelije i odlaze u plazmu, ali i u ER, Goldžijeve organele
i lizozome. Mitohondrije sadrže svoje ribozome.
Interakcija kodon-antikodon
Prepoznavanje određenog kodona u sekvenci iRNK vezano je za odgovarajuću antikodon sek-
vencu tRNK. Neke tRNK mogu da prepoznaju više od jednog kodona za datu aminokiselinu. Veziva
nje antikodona tRNK za kodon iRNK sledi pravila komplementarnog i antiparalelnog vezivanja.
Kodon na iRNK se čita u pravcu 5'->3' uparavanjem sa antikodonom na tRNK u pravcu 3'^5' (Slika
20-49). Bez obzira na ovaj pravac očitavanja kodona i antikodona, sekvenca nukleotida se uvek daje
prema sledećem redosledu 5'->3'. Mehanizam kojim tRNK prepoznaje više od jednog kodona za
specifičnu aminokiselinu zasniva se na kolebljivosti baze na 5'-kraju antikodona (prva baza an
tikodona) koja nije nepromenljiva kao preostale dve baze. Zato se za prvu bazu antikodona kaže da
je "kolebljiva". Promena ove prve baze antikodona, omogućava neuobičajeno uparivanje baza sa 3'-
krajem kodona. Kolebljivost baze na 5'-kraju omogućava da jedna tRNK prepoznaje više od jednog
kodona. Rezultat ovoga je da ne mora da postoji 61 različitih tRNK kako bi se očitali svih 61 kodona
koji kodiraju 20 aminokiselina. Tako na primer tRNK koja sadrži G na 5' poziciji antikodona može se
upariti sa dva različita antikodona (G reaguje sa C ili U, a U reaguje sa A ili G). Ukoliko se na 5' po
ziciji antikodona nalazi neuobičajeni nukleotid inozinat (I), koji nastaje dezaminacijom adenina, onda
uparivanje može biti sa tri različita kodona jer I reaguje sa U ili A ili C (Slika 20-49).
Metionin
A U A
G C C
G U
U A
A
C G U G
C
U
C
A
•5"- kraj
Kodon
Proces translacije genetske informacije u primarnu sekvencu polipeptidnog lanca može se pode-
liti u tri faze: inicijacija, elongacija i terminacija translacije. U svakoj fazi translacije učestvuju odgova
rajući proteinski faktori koji imaju različite uloge. Pojedini faktori imaju katalitičku ulogu dok drugi sta-
bilišu određene strukture koje se formiraju u toku translacije. Translacioni faktori su podeljeni prema
fazi translacije u kojoj sudeluju na inicijacione, elongacione i terminacione faktore. Glavne razlike u
20-44 Opšta biohemija
translaciji kod prokariota i eukariota proističu iz razlika u vrsti i funkcionisanju ovih proteinskih faktora.
Posle translacije neki polipeptidi se savijaju u svoju finalnu formu, ali većina novosintetisanih polipep-
tida podleže post-translacionim modifikacijama. Ova faza se može smatrati četvrtom fazom u biosin-
tezi proteina. U toku post-translacionih modifikacija delovi proteinskih lanaca se proteolitički uklanjaju
ili dolazi do brojnih hemijskih reakcija na bočnim lancima aminokiselina.
Inicijacija translacije
Inicijacija sinteze proteina obuhvata sve faze uključivanja komponenata translacije pre formiranja
peptidne veze. Inicijacija translacije kod prokariota podrazumeva formiranje inicijacionog kompleksa
koji obuhvata dve subjedinice ribozoma, iRNK, aminoacil-tRNK koju određuje prvi kodon u genetskoj
poruci, GTP i faktore inicijacije (IF-1, IF-2 i IF-3) (Slika 20-50). Inicijacija translacije se odigrava u tri
stupnja:
(1) Inicijacija translacije kod prokariota započinje vezivanjem IF-3 za malu subjedinicu 30S ribo
zoma i to dovodi do izdvajanja ove subjedinice iz intaktnog ribozoma. Faktoru IF-3 pomaže drugi fak
tor IF-1 koji je promotor ove reakcije. Ovako vezani IF-3 za malu subjedinicu sprečava ponovno vezi
vanje za veliku subjedinicu.
(2) iRNK se vezuje za 30S subjedinicu uz pomoć IF-3 i ona se locira na tačno određeno mesto u
odnosu na inicijacioni kodon AUG. Vezivanje iRNK je usmereno pomoću specifične sekvence purin-
skih nukleotida koja se naziva Šajn-Dalgarnova sekvenca. Šajn-Dalgarnova sekvenca se nalazi na
oko 10 nukleotida uzvodno od AUG start kodona. Ova sekvenca se vezuje za 16S rRNK male subje
dinice, tačnije za komplementarnu sekvencu bogatu pirimidinskim nukleotidima na 3'-kraju ove rRNK.
Stvaranje parova baza između Šajn-Dalgamove sekvence iRNK i 16S rRNK omogućava ribozomu
da prepozna inicijacioni kodon AUG za metionin. Svaki gen na policistronskoi iRNK poseduje svoju
Šajn-Dalgarnovu sekvencu i inicijacioni kodon. U sledećem stupnju inicijacije IF-2 gradi tercijalni
kompleks sa GTP i sa inicijacionom tRNK i ovaj kompleks se vezuje za inicijacioni kodon na P strani
male subjedinice. Inicijaciona tRNK kod prokariota je N-formil-metionin-tRNK (fMet-tRNKfMet). AUG
je kodon za metionin bez obzira gde se on ugrađuje na lancu, na startu ili u sredini. Metionin se ve
zuje za inicijacioni kodon zahvaljujući specijalnoj inicijacionoj tRNK koja ima određene strukturne
specifičnosti na svom akceptorskom kraku u odnosu na ostale tRNK. Posle vezivanja metionina za
inicijacionu tRNK dolazi do formilacije aminokiseline pomoću enzima transformilaze i donora formil-
grupe N10-formiltetrahidrofolata. Specifično za inicijaciju translacije je da se vezivanje fMet-tRNKfMet
za iRNK ne zasniva na interakciji kodon-antikodon i ona se odigrava direktno na P strani male subje
dinice ribozoma. Proteini E.coli podležu post-translacionim promenama koje sukcesivno uklanjaju sa
novosintetisanog polipeptida prvo formil-grupu, a onda i u najvećem broju slučajeva i početnu amino-
kiselinu metionin.
(3) Faza inicijacije se završava hidrolizom GTP vezanog za IF-2 na GDP i Pj i ona uslovljava kon-
formacione promene na 30S subjedinici. Ova promena dovodi do vezivanja 30S subjedinice za 50S
subjedinicu uz oslobađanje IF-3 i IF-1 Proces inicijacije rezultira stvaranjem fMet-tRNKfMet-iRNK-
ribozomskog kompleksa u kome fMet-tRNKfMet zauzima P stranu ribozoma dok je strana A postavlje
na tako da prihvata dolazeću amino-acil-tRNK.
Eukariotska inicijacija je slična kao kod prokariota, ali se razlikuje u inicijacionim faktorima. Euka-
rioti imaju mnogo veći broj inicijacionih faktora, označeni su kao elF (e je skraćenica za eukariote).
Postoji preko 10 inicijacionih faktora, mnogi od njih su sa više subjedinica i mnogo ih je teže razdvojiti
od ribozomalnih proteina. Inicijaciona tRNK eukariota je Met-tRNK,Met, a za razliku od prokariota ona
nikada nije N-formilovana. Inicijacioni kompleks obuhvata elF-2, GJP, Met-tRNKj Met i iRNK vezane
za 40S ribozomsku subjedinicu. Eukariotska iRNK ne sadrži Šajn-Dalgarnovu sekvencu koja se
komplementarno vezuje za sekvencu na 18S rRNK. iRNK eukariota je monocistronska i proces tran
slacije započinje uvek sa start kodonom AUG. Inicijacija translacije eukariota vezana je za postojanje
5'-kape na iRNK. Inicijacioni faktor elF-4E se vezuje za 5' kapu iRNK, a to znači da se 40S subjedi
nica vezuje blizu 5'-kape i pomera se nizvodno sve do prvog AUG kodona.
o
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-45
3GS Subjedtnica
(Si
IF-3iT^|..
m
Šajn-Dalgarnova
sekvenca
+
IF-2 -GTP • fMet - tRNI^ e t
Reakcije elongacije
Proces elongacije u kome dolazi do ugradnje aminokiselina u rastući polipeptidni lanac sastoji se
iz tri stupnja: (1) pozicioniranje aminoacil-tRNK na A strani ribozoma; (2) stvaranje peptidne veze; (3)
translokacija (Slika 20-51). Brzina ovog ciklusa iznosi 40 aminokiselinskih ostataka u jednoj sekundi i
odvija su u prisustvu elongacionih faktora.
EF - Ts GTP
Slika 20-51. Tri stupnja elongacije. (1) Vezivanje aminoacil-tRNK; (2) transpeptidacija i (3)
translokacija kod prokariota.
(2) Transpeptidacija
Stvaranje peptidne veze je katalizovano peptidil-transferazom. Aktivnost peptidil-transferaze je
vezana za 23S rRNK komponentu velike 50S subjedinice ribozoma. Energiju za ovu reakciju obez-
beđuje visoko energetska estarska veza kojom je na P strani ribozoma, aminokiselina vezana za
svoju tRNK. Transpeptidacija se zasniva na nukleofilnom napadu a-amino-grupe aminokiseline iz A
mesta na karbonilnu grupu aminokiseline P strane (Slika 20-52). Nascentni polipeptid se produžava
na C-terminalnom kraju sa jednim aminokiselinskim ostatkom i kao rezultat stvaranja peptidne veze,
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-47
obe aminokiseline se prenose na tRNK A strane. tRNK na P strani je slobodna, nema vezanu amino-
kiselinu za sebe i ona se oslobađa sa ribozoma.
0 = C
|
NH NH
i
Rn-r-CH R — CH
1 »
i
i
o=c
I
NH ^ - — :NH 2
1
NH
ii
**-CH / R„ + T-CH
(3) Translokacija
U finalnom stupnju elongacije dolazi do pomeranja odnosno translociranja ribozoma duž iRNK.
Pomeranjem duž iRNK novi kodon ulazi na mesto A, a tRNK za koju je vezan rastući peptidni lanac
se pomera na mesto P. Ribozom se pomera duž iRNK za tri nukleotida i time je omogućena nova in
terakcija kodon-antikodon. Proces zahteva energiju koja se oslobađa hidrolizom GTP u GDP i P;.
Translokacija se odvija u prisustvu još jednog elongacionog faktora koji ima osobinu da vezuje GTP i
on se označava EF-G. Hidroliza GTP obezbeđuje energiju potrebnu za konformacionu pramenu ri
bozoma koja je važna za pomeranje peptidil-tRNK sa A strane na P stranu ribozoma. Mesto A ostaje
sada slobodno i može da veže odgovarajuću aminoacil-tRNK za novi kodon na strani A. Nakon oslo
bađanja EF-G ribozom je spreman za sledeći ciklus elongacije.
Elongacija lanaca kod eukariota je slična procesu kod prokariota. Umesto faktora EF-Tu i EF-Ts
postoji jedan faktor eEF-1 koji ima dve subjedinice. Elongacioni faktor eEF-2 je po svojoj funkciji sli
čan faktoru EF-G.
Terminacija translacije
U toku terminacije dolazi do oslobađanja polipeptidnog lanca. Faza terminacije započinje kada
terminacioni kodon (UAA, UAG ili UGA) uđe u A mesto ribozoma (Slika 20-53). Translacija se zavr
šava zato što stop kodon ne prepoznaje nijednu aminoacil-tRNK. Tri terminaciona faktora (RF-1, RF-
2 i RF-3) sudeluju u terminaciji translacije. Faktor RF-1 prepoznaje kodone UAA i UAG dok RF-2
prepoznaje UAA i UGA. Proces prepoznavanja uključuje hidrolizu GTP i dovodi do promena u funkciji
ribozoma. Peptidil-transferaza se privremeno transformiše u esterazu i hidrolizuje vezu između poli
peptidnog lanca i tRNK na P strani ribozoma. Translacija se završava oslobađanjem polipeptidnog
lanca, iRNK i tRNK. Na kraju dolazi do disocijacije ribozoma na malu i veliku subjedinicu.
20-48 Opšta biohemija
Nascentni polipeptid
m+ Peptidil-tRNK
P strana
IRNK 5'
EF-3 • GTP
NH
a Polipeptid
Neaktivna
tRNK
+ GDP + P,
1. Proteoliza
Proteoliza peptidnih veza proteina i uklanjanje pojedinih delova peptida je najučestalija post-
translaciona mofifikacija.
a) Prva takva modifikacija je svakako uklanjanje metionina kao inicijalne aminokiseline sa N-kraja
polipeptidnog lanca.
b) Veliki broj proteina (enzima, hormona I strukturnih proteina) se sintetiše u svojoj inaktivnoj,
prekursorskoj formi pa se proteolitičkom hidrolizom aktiviraju pod određenim uslovima. Primer ovih
zimogenih molekula su pankreasni proteolitički enzimi tripsinogen i himotripsinogen koji se proteo-
lizom prevode u aktivne forme enzima tripsin i himotripsin. Inaktivni proteini se nazivaju proproteinL
a uklonjeni polipeptidni delovi pro peptid i U sintezi kolagena imamo mnoge post-translacione pro-
mene koje dovode do stvaranja funkcionalnog proteina.
c) Uklanjanje signalnih peptida sa nascentnih proteina katalizuje enzim signalna peptidaza
Mnogi transmembranski proteini ili proteini koji se sekretuju sadrže na svom N-kraju signalni peptid
koga sačinjava niz od 13-36 hidrofobnih aminokiselina u vidu ukosnice. Signalni peptid usmerava
sintetisani polipeptid kroz membranu endoplazmatičnog retikuluma vezivanjem za određene recepto-
re (Slika 20-54). U tom procesu prolaska kroz membranu signalna peptidaza koja je vezana za
membranu specifično uklanja signalni peptid. Proteini sa signalnim peptidom se označavaju kao pre-
proteini ili ukoliko sadrže i propeptide kao preproproteini. Insulin i kolagen su primeri sekretornih
proteina koji se sintetišu sa vodećim signalnim peptidom i označeni su kao preproinsulin i preproko-
lagen. Ovi proteini su primeri proteina koji podležu trima proteolitičkim reakcijama: prvo delecija inici-
jacionog metionina, potom uklanjanje signalnog peptida i na kraju uklanjanje propeptida.
Nakon završetka
sinteze, C-kraj
prolazi kroz membranu
i savijeni protein se
oslobađa
U toku prolaska
kroz membranu
Membrana endoplazmatskog retikuluma signalna peptidaza
čepa signalnu
sekvencu
Slika 20-54. Transport proteina kroz membranu nakon sinteze na poliribozomu. Značaj sig
nalnog peptida i njegovo proteolitičko uklanjanje.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-49
Terminacija kod eukariota je slična kao kod prokariota, samo što ovaj proces zahteva samo je
dan faktor eRF koji se vezuje za ribozom zajedno sa GTP. eRF prepoznaje sva tri stop kodona. GTP
se hidrolizuje u GDP i Pj u reakciji koja dovodi do disocijacije eRF sa ribozoma.
Proces translacije započinje na 5'-kraju iRNK, sa ribozomom koji se pomera duž ove RNK. Obzi
rom na dužinu iRNK obično se više ribozoma nalazi na iRNK i oni istovremeno očitavaju genetsku in
formaciju. Kompleks jedne iRNK i više ribozoma je poliribozom ili polizom.
Biosinteza proteina zahteva energiju u svim fazama, ali posebno u procesu translacije gde su iz
vori energije ATP i GTP. Vezivanje jedne aminokiseline za rastući polipeptidni lanac zahteva 4 visoko
energetske veze; dve iz ATP-a u reakciji katalizovanoj aminoacil-tRNK-sintetazom (jedna za veziva
nje aminokiseline za tRNK i jedna u hidrolizi PPj u neorganski fosfat pomoću pirofosfataze) i dve iz
GTP (jedna za vezivanje aminoacil-tRNK za A stranu i jedna za stupanj translokacije). Za procese
inicijacije i terminacije sinteze polipeptidnog lanca potrebna je još po jedan molekui GTP.
Zahvaljujući razlici koja postoji između prokariota i eukariota u biosintezi proteina, omogućena je
terapeutska primena antibiotika u medicini. Antibiotike produkuju bakterije ili gljivice i oni inhibiraju
rast drugih organizama. Antibiotici inhibiraju razne esencijalne biološke procese, poput replikacije
DNK (novobiocin), transkripcije (rifampicin) ili sintezu zida bakterijske ćelije (penicilin). Ipak najveći
broj antibiotika svoje baktericidno dejstvo zasniva na inhibiciji translacije. Primena pojedinih inhibitora
biosinteze proteina u istraživanjima je doprinela upoznavanju složenih mehanizama translacije i u
prokariotskim i u eukariotskim ćelijama. Primer za ovo je puromicin koji je analog 3'-kraja tRNK tako
da ga ribozom ne razlikuje od tRNK i on se ugrađuje na A mesto ribozoma. Rezultat ovoga je prerani
završetak sinteze polipeptida uz oslobađanje peptidii-puromicina.
Mehanizmi inhibicije translacije antibioticima su detaljno objašnjeni kod nekih organizama. Strep-
tomicin pripada grupi aminoglikozida koji inhibiraju prokariotske ribozome na razne načine. Pri nis
kim koncentracijama streptomicin indukuje pogrešno očitavanje iRNK: jedan pirimidin se pogrešno
očitava na prvoj i drugoj poziciji kodona. Ovo inhibira rast ćelije, ali ne ubija ćeliju. Pri visokim kon
centracijama streptomicin sprečava pravilnu inicijaciju lanca i dovodi do smrti ćelije. Hloramfenikol
je prvi antibiotik širokog spektra, koji inhibira aktivnost peptidil-transferaze na velikoj subjedinici pro-
kariotskog ribozoma. ipak njegova primena je ograničena zbog toksičnih sporednih dejstava tj. zbog
osetljivosti mitohondrijalnih ribozoma eukariota. Tetraciklin i njegovi derivati se vezuju za malu sub-
jedinicu prokariotskog ribozoma i inhibiraju vezivanje aminoacIi-tRNK. Eritromicin inhibira transloka-
ciju peptidnog lanca kod prokariota, a cikloheksamid inhibira peptidil-transferazu eukariota.
Post-translacione modifikacije
Novosintetisani polipeptid eukariota podleže velikom broju modifikacija još u toku same translaci
je ili nakon završetka tog procesa. Polipeptidi se savijaju u svoju nativnu konformaciju stvaranjem di-
sulfidnih veza ili u slučaju multimemih proteina dolazi do kombinovanja pojedinih subjedinica tog pro
teina. Mnogi proteini podležu enzimskim reakcijama koje proteolitički uklanjaju određene peptidne
veze proteina ili hemijski modifikuju pojedine aminokiselinske ostatke. Post-translacione modifikacije
imaju dvostruki cilj: (A) stvaranje funkcionalno aktivnog proteina; (B) usmeravanje sintetisanog prote
ina na pravi cilj tj. na određenu organelu u citoplazmi, na plazmatsku membranu ili sekreciju iz ćelije.
20-50 Opšta biohemija
1. Proteoliza
Proteoliza peptidnih veza proteina i uklanjanje pojedinih delova peptida je najučestalija post-
translaciona mofifikacija.
a) Prva takva modifikacija je svakako uklanjanje metionina kao inicijalne aminokiseline sa N-kraja
polipeptidnog lanca.
b) Veliki broj proteina (enzima, hormona I strukturnih proteina) se sintetiše u svojoj inaktivnoj,
prekursorskoj formi pa se proteolitičkom hidrolizom aktiviraju pod određenim uslovima. Primer ovih
zimogenih molekula su pankreasni proteolitički enzimi tripsinogen i himotripsinogen koji se proteo-
lizom prevode u aktivne forme enzima tripsin i himotripsin. Inaktivni proteini se nazivaju proproteini,.
a uklonjeni polipeptidni delovi propeptidi. U sintezi kolagena imamo mnoge post-translacione pro-
mene koje dovode do stvaranja funkcionalnog proteina.
c) Uklanjanje signalnih peptida sa nascentnih proteina katalizuje enzim signalna peptidaza
Mnogi transmembranski proteini ili proteini koji se sekretuju sadrže na svom N-kraju signalni peptid
koga sačinjava niz od 13-36 hidrofobnih aminokiselina u vidu ukosnice. Signalni peptid usmerava
sintetisani polipeptid kroz membranu endoplazmatičnog retikuluma vezivanjem za određene recepto-
re (Slika 20-54). U tom procesu prolaska kroz membranu signalna peptidaza koja je vezana za
membranu specifično uklanja signalni peptid. Proteini sa signalnim peptidom se označavaju kao pre-
proteini ili ukoliko sadrže i propeptide kao preproproteini. Insulin i kolagen su primeri sekretornih
proteina koji se sintetišu sa vodećim signalnim peptidom i označeni su kao preproinsulin i preproko-
lagen. Ovi proteini su primeri proteina koji podležu trima proteolitičkim reakcijama: prvo delecija inici-
jacionog metionina, potom uklanjanje signalnog peptida i na kraju uklanjanje propeptida.
Nakon završetka
sinteze, C-kraj
prolazi kroz membranu
i savijeni protein se
oslobađa
Slika 20-54. Transport proteina kroz membranu nakon sinteze na poliribozomu. Značaj sig
nalnog peptida i njegovo proteolitičko uklanjanje.
V. Spasojević-Kalimanovska: Biosinteza proteina 20-51
2. Kovalentne modifikacije
Sintetisani proteini podležu brojnim specifičnim reakcijama, kako na funkcionalnim grupama boč
nih lanaca tako i na terminalnim amino- i karboksi-grupama.
(a) Glikozilacija
Vezivanje kompleksnih ugljenih hidrata modifikuje strukturu proteina i stvara određene markere
na površini ćelija što omogućava interakcije između ćelija.
(b) Hidroksilacija
Hidroksilacija aminokiselina lizina i prolina je neophodna za integritet proteina vezivnog tkiva po
put kolagena i elastina.
JEnzimi hidroksilacije su prolil-hidroksilaza i Hzil-hidroksHaza i ova hidroksilacija kod kolagena se dešava pre
stvaranja trostrukog heliksa i za nju je neophodan vitamin C. U nedostatku ovog vitamina kolagena vlakna su kr
ta, lomljiva što ima za posledicu slabost krvnih sudova i pojavu krvarenja (vidi stranu 4-13).
(c) Fosforilacija
Fosforilacija proteina ima posebnu ulogu u brojnim primerima metaboličke kontrole i transdukcije
signala (vidi poglavlje 21).
(d) Lipofilne modifikacije
Kovalentno vezivanje lipidnih ostataka na protein omogućava vezivanje za membranu ili izvesne
protein-protein interakcije. Najpoznatije lipofilne modifikacije su acilacija (vezivanje masne kiseline) i
prenilacija.
Najčešća forma acilacije je vezivanje miristoil ostatka za terminalnu glicinsku amino-grupu polipeptida. Pri-
mer ove acilacije je vezivanje miristata za G protein i povećanje afiniteta a subjedinice za membranski vezane
subjedinice. Prenilacija podrazumeva dodavanje farnezil grupe sa 15 C atoma ili geranil grupe sa 20 C atoma na
akceptorske proteine; obe grupe sadrže izoprenske jedinice (tri odnosno četiri) koje se sintetišu u procesu bio-
sinteze holesterola. Izoprenske jedinice se vezuju za cistein na karboksi kraju proteina pomoću tioetarske veze
(C-S-C).
(f) Metilacija
Post-translaciona metilacija se dešava na različitim aminokiselinama. Metilacija lizina dešava se
na različitim proteinima kao što su : kalmodulin i citohrom c. Donor metil-grupe je S-adenozilmetionin.
(g) Suifatacija
Modifikacija sulfatacijom vrši se na ostacima tirozina plazmatskog proteina fibrinogena i nekih sekretornih
proteina poput gastrina. Univerzalni donor sulfatne grupe je 3'-fosfoadenozil-5'-fosfosulfat (PAPS). Suifatacija je
neophodna za biološku aktivnost ovih proteina.
(i) Karboksilacija
Vitamin K je kofaktor u karboksilaciji glutaminske kiseline pri čemu nastaje v-karboksigiutamat
koji se označava kao Gla ostatak.
Sinteza Gla ostataka na nekim faktorima koagulacije je presudna za normalnu funkciju koagulacione kas
kade. Prisustvu Gla ostatka na proteinu omogućava stvaranje helata sa kalcijumovim jonima i vezivanje za ne
gativno naelektrisane fosfogliceride, što je neophodno za proces aktivacije koagulacije. Antikoagulacioni lekovi
bazirani na kumarinu, varfarinu i dikumarolu (analogu vitamina K) deluju tako što inhibiraju reakcije karboksilaci-
je.
Postoje šest nivoa kontrole ekspresije gena koje su prikazane na Slici 20-55.:
5
Kontrola
degradacije
iRNK
Primarni
DNK • R N K
•iRNK- • iRNK
transkripf
1 3
Kontrola 4 6
Kontrola K Kontrola
transkripcije °RnNKla Translaciona
post-trans- transporta kontrola proteinske
kripcionih aktivnosti
modifikacija ^ Inaktivni
Protein protein
Ekspresija gena kod prokariota je uvek regulisana na nivou transkripcije o čemu je bilo red u po
glavlju 20.B. Obzirom da je život prokariotske iRNK vrlo kratak (nekoliko minuta) to je i normalno da
kod prokariota nema mogućnosti kontrole na nivou translacije. Kod eukariota pak postoji kontrola na
nivou translacije i ovi organizmi reaguju na svoje potrebe upravo kroz regulaciju procesa translacije.
Stabilnost iRNK je mnogo duža nego kod prokariota i ona iznosi od oko 20 minuta do 24 sata. Pro
ces translacije je kontrolisan različitim mehanizmima: fosforilacijom inicijacionog faktora, sistemom
negativne kontrole ili kontrolom stabilnosti iRNK.
Sinteza
proteina
*J*3'
se potom vezuje za 5'-kapu iRNK. Nakon stvaranja inicijacionog kompleksa on započinje da klizi duž
iRNK i kada prepozna inicijacioni kodon AUG, vezani GTP se hidrolizuje u GDP pomoću elF-2 prote
ina, uz konformacione promene u proteinu i oslobađanje sa male subjedinice ribozoma. Potom se
vezuje velika subjedinica, stvara se kompletan ribozom i sinteza polipeptida započinje.
Da bi se stvorio aktivan elF-2 inaktivna forma ovog proteina mora da otpusti GDP i veže GTP.
Međutim, elF-2 vezuje čvrsto GDP i zato je potreban drugi protein elF-2B koji se još naziva i gvanin-
nukleotid-rilizing-protein za reciklizaciju elF-2. Ovaj elF-2B je sposoban da oslobodi GDP tako da
se novi molekul GTP može vezati za elF-2 (Slika 20-57a). Ukoliko je faktor elF-2 fosforilisan, veziva
nje elF-2 za elF-2B je vrlo čvrsto i razmena nukleotida nije moguća. Normalno u ćeliji je mnogo više
proteina elF-2 nego elF-2B tako da vrlo mala količina fosforilisanog elF-2 vezuje sav raspoloživ elF-
2B (Slika 20-57b). Stvaranje inaktivnog kompleksa između elF-2 i elF-2B u potpunosti zaustavlja re
ciklizaciju inicijacionog faktora elF-2 i sinteza proteina se zaustavlja.
Inaktivnt aktivni
J>!F-2
elF-2B
inaktfvni
o!F-2
U nedostatku aktivnog
GIF-2B višak elF-2
ostaje u svojoj
inaktivnoj, GDP
Protein-kinaza vezanoj formi
Fosforilteani elF-2 i sinteza proteina se
fosforlllže elF-2 izdvaja sve elF-2B kao značajno usporava
(B) inaktivni kompleks
Primer regulacije brzine sinteze proteina fosforilacijom elF-2 je regulacija sinteze globina he-
mom. Retikulociti sintetišu hemoglobin u izuzetno velikoj količini tako da je kod njih najviše izučavan
mehanizam kontrole translacije. Eksperimenti su ukazali da je sinteza globina regulisana raspoloži-
vošću hema. Inhibicija inicijacije translacije globina je isto tako zavisna od elF-2 i visokog nivoa GTP.
U nedostatku hema, lizati retikulocita akumuliraju protein, hemom kontrolisani represor (HCR) koji
fosforiliše specifičan serinski ostatak, Ser 5 1 , na a subjedinici elF-2 (Slika 20-58). Kao s t o j e već re
čeno za reciklizaciju faktora elF-2 potreban je elF-2B koji sa fosforilisanim elF-2 faktorom gradi čvrst
kompleks koji zaustavlja reciklizaciju elF-2 i samim tim inhibira sintezu globina. Prisustvo hema inhi-
bira aktivaciju HCR iz pro-HCR i samim tim i fosforilaciju elF-2. Fosforilisani elF-2 molekuli se reakti
viraju kroz dejstvo elF-2 fosfataze, koja nije pod uticajem hema.
20-54 Opšta biohemija
Inhibicija sa
hemom grfv*r **>*,»
pro-HCR
(jnaktivan) laktivanM'
Negativna transiaciona.kontrola
Proteini koji se vezuju za 5'-vodeći region na iRNK medijatori su negativne translacione kontrole.
Translacija nekih molekula iRNK je blokirana specifičnim translacionim represorskim proteinima.
Ovaj tip mehanizma se naziva negativna transiaciona kontrola, a to je u stvari sistem negativne pov
ratne sprege. Kod eukariota najbolje je proučen sistem negativne translacione kontrole koja omogu
ćava sintezu feritina - intracelularnog depo oblika gvožđa. U slučaju visokih vrednosti gvožđa u ćeliji,
naglo se ubrzava sinteza feritina. Regulacija nivoa gvožđa zavisi od specifične sekvence oko 30 nu-
kleotida na 5'-vodećem regionu feritinske iRNK (Slika 20-59). Ovaj elemenat odgovoran za nivo
gvožđa (IRE- iron response element) se savija u specifičnu strukturu stabljika-petlja (stem-loop)
koja vezuje translacioni represorski protein koji se naziva akonitaza. Vezivanjem akonitaze bloki
ra se translacija iRNK nizvodno od ovog kompleksa akonitaze i IRE. Sinteza feritina se blokira u slu
čaju deficita gvožđa. Akonitaza je protein koji ima osobinu da vezuje gvožđe. U slučaju povišenih
koncentracija gvožđa u ćeliji, vezivanje gvožđa za akonitazu dovodi do disocijacije sa feritinske
iRNK. Feritinska iRNK je oslobođena blokade sa translacionim represorskim proteinom tako da se u
ćeliji odvija proces translacije i sinteze feritina.
slatuje je nestabilna i dovodi do degradacije iRNK. Sekvenca iRNK bogata AU parovima utiče na de
gradaciju iRNK stimulacijom uklanjanja poli-A repa koji se nalazi na 3' kraju svih eukariotskih iRNK.
Stabilnost iRNK se može promeniti pod uticajem spoljnih signala. Steroidni hormoni na primer
utiču na ekspresiju gena ne samo povećanjem transkripcije gena, već i povećanjem stabilnosti iRNK
kodirane sa nekim genima. Nivo gvožđa u ćeliji se reguliše ne samo negativnom translacionom kon
trolom iRNK za feritin već i putem kontrole stabilnosti iRNK odgovorne za sintezu transferinskih re
ceptora. Ulazak gvožđa u ćeliju snižava stabilnost iRNK koja kodira sintezu transferinskih receptora,
koji vezuju transportni oblik gvožđa - transferin, dovodeći do toga da se manje ovih receptora sinteti-
še. Interesantno je da na stabilnost iRNK transferinskih receptora utiče akonitaza tj protein osetljiv na
gvožđe koji isto tako kontroliše translaciju iRNK feritina. Ovde se akonitaza vezuje za 3'-nekodirajući
kraj iRNK transferinskih receptora i povećava produkciju receptora, verovatno tako što inhibira funk
ciju sekvence koja dovodi do brze degradacije iRNK. Dodavanjem gvožđa akonitaza se otpušta sa
iRNK, smanjuje se stabilnost iRNK i sinteza transferinskih receptora se zaustavlja. Sinteza transfe
rinskih receptora i feritina je regulisana sa dva različita mehanizma, pri čemu nivo njihove sinteze su
protno reaguje na koncentraciju gvožđa u ćeliji iako je isti protein odgovoran za nivo gvožđa.
Deficijencija gvožđa
citozolna akonitaza cttozolna akonitaza
Opterećenje gvožđem
Fe
Poglavlje 21.
Međućelijska signalizacija
lako su se jednoćelijski organizmi slični današnjim bakterijama pojavili na Zemlji pre 3,5 milijarde
godina, bilo je potrebno još najmanje 2,5 milijarde godina da se razviju prvi višećelijski organizmi.
Metabolizam jednoćelijskog organizma regulisan je zavisno od potrebe same ćelije od koje se sasto
ji. Međutim, regulacija metabolizma višecelijskog organizma mora da bude koncipirana tako da se
zadovolje i potrebe pojedinih ćelija i organizma u celini. Stoga je u evoluciji višećelijskih organizama
bilo neophodno da se razviju složeni signalni mehanizmi koji omogućuju međusobnu komunikaciju i
koordinaciju između ćelija. Smatra se da je to jedan od razloga tako dugotrajnog evolutivnog puta od
jednoćelijskih do višećelijskih organizama.
lako jednoćelijski organizmi normalno žive nezavisno jedan od drugog, treba napomenuti da i
kod njih postoje izvesni mehanizmi međusobne komunikacije, naravno mnogo jednostavniji od onih
koji funkcionišu kod složenijih živih bića.
Signalizirajuća, _ _ _ , w ^__ _„ _ .
$T Cil
ćelija l^B«* 1 •* "' ) Jna ćelija
%££i
molekul *****
(b) Signalizacija posredstvom molekula vezanih za plazma-membranu
Signalizirajuća fj ____
ćelija \Wm§ IfJf H j Ciljna ćelija
y
Signalni
molekul Receptor
Postoje tri osnovna tipa sekretovanih signalnih molekula, koja se međusobno razlikuju po odre
đenim karakteristikama: udaljenosti između signalizirajuće i ciljne ćelije, koncentraciji, poluživotu i
brzini ostvarivanja efekta. To su: endokrini hormoni, lokalni medijatori i neurotransmiteri.
Endokrini hormoni
Endokrini hormoni se sintetišu u specijalizovanim signalizirajućim ćelijama, koje kontrolišu funkci
ju organizma kao celine, endokrinim ćelijama. Ove ćelije sekretuju hormone u krv, koja ih transpor-
tuje do ciljnih ćelija, lokalizovanih na mnogim mestima u telu. lako su dostupni svim tipovima ćelija,
na njihovo prisustvo u krvi reaguju samo one ćelije koje poseduju odgovarajuću vrstu receptora (Sli
ka 21-2). Kako su u cirkulaciji razblaženi velikom količinom krvi, hormoni moraju da budu efikasni u
vrlo niskim koncentracijama. Endokrina signalizacija zavisi od cirkulacije krvi, pa je zbog toga efekat
Z Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-3
endokrinih hormona sporiji, a njihov vek u cirkulaciji obično duži u poređenju sa drugim vrstama eks
tracelularnih signalnih molekula.
ćelije
Slika 21-2. Endokrina signalizacija (A, B i C - endokrine ćelije koje sintetišu i sekretuju
različite vrste hormona; A', B' i C - ciljne ćelije koje imaju odgovarajuće receptore za
hormone A, B i C ćelija).
Parakrini i autokrini hormoni se međusobno razlikuju prema tipu ciljnih ćelija na koje deluju. Pa
rakrini hormoni (Slika 21-3) ostvaruju svoje dejstvo na bilo koju vrstu okolnih ćelija, pod uslovom da
one imaju odgovarajuće receptore. Kod autokrina signalizacije, signalizirajuća ćelija šalje signal (au
tokrini hormon) isključivo susednim ćelijama istog tipa, pa prema tome i samoj sebi. Autokrini hor
moni su posebno značajni za pravilnu diferencijaciju ćelija u procesu razvoja. Usamljena signalizira
juća ćelija prima vrlo slab autokrini signal, koji je sama sekretovala (Slika 21-4a). Međutim, u grupi
identičnih signalizirajućih ćelija, svaka ćelija je izložena dejstvu jakog autokrinog signala (Slika 21-
4b). Ovo je jedan od mogućih mehanizama koji objašnjavaju pojavu da je, u ranoj fazi razvoja, grupa
identičnih ćelija sposobna da reaguje na signal koji indukuje diferencijaciju, dok izolovane ćelije istog
tipa nemaju takvu sposobnost.
21-4 Opšta biohemija
Neurotransmiteri
Neurotransmiteri su vrsta signalnih molekula koja se stvara i sekretuje iz završetaka aksona ner-
vnih ćelija. Kada se neuron aktivira pod dejstvom signala iz okoline ili drugih neurona, on šalje elek
trične impulse (akcione potencijale) duž aksona. Kada impuls stigne do nervnog završetka na kraju
aksona, on stimuliše sekreciju neurotransmitera. Krajevi aksona su u kontaktu sa ciljnim ćelijama
preko karakteristične tvorevine, koja se naziva hemijska sinapsa, a koja obezbeđuje efikasnu i brzu
isporuku neurotransmitera postsinaptičkoj ciljnoj ćeliji (Slika 21-5). Dakle, kod sinaptičke signaliza
cije, komuniciraju ćelije koje su često veoma udaljene jedna od druge, ali je dejstvo samog hemij-
različiti neuroni skog signala lokalno (u sinapsi). Ovaj tip signalizacije
deluje veoma brzo, jer električni impulsi putuju brzinom i do
100 m/s, a sekretovani neutotransmiter treba da difunduje
do receptora na ciljnoj ćeliji, koji je udaljen manje od 100
nm. Koncentracija neurotransmitera u sinapsi je obično
visoka, pa receptori obično imaju nizak afinitet prema
njima. To znači da neurotransmiteri brzo disosuju od
receptora, čime se odgovor završava. Neurotransmiteri se
neuro-
transmiter brzo uklanjaju iz sinaptičke šupljine pod dejstvom
hidrolitičkih enzima ili membranskih transportnih proteina
koji ih vraćaju natrag u nervni završetak, ili u okolne glija-
ćelije. Kratak poluživot neurotransmitera omogućuje da se
sinapsa pripremi za odgovor na novi nervni impuls. Dakle,
kao i kod endokrine signalizacije, i u ovom slučaju se radi o
signalizaciji između međusobno udaljenih ćelija. Međutim,
mehanizmi kojima se obezbeđuje specifičnost signalizacije
su različiti: za razliku od endokrine signalizacije, gde je
specifičnost obezbeđena postojanjem odgovarajućih
različite ciljne ćelije receptora, specifično dejstvo neurotransmitera na
odgovarajuće ciljne ćelije obezbeđeno je zahvaljujući
Slika 21-5. Sinaptička signalizacija. sinaptičkom kontaktu nervnog završetka sa ciljnom ćelijom.
Tako npr. neurotransmiter acetilholin ispoljava suprotne efekte na ćelije srčanog i skeletnog miši
ća, zahvaljujući različitoj vrsti acetilholinskih receptora na ovim ćelijama. Aktivacija nikotinskog re-
ceptora skeletnog mišića dovodi do njegove kontrakcije (Slika 21-6a), dok aktivacija muskarinskog
receptora ćelija srčanog mišića izaziva relaksaciju (Slika 21-6b).
acetilholin
acetilholin
Kontrakcija Relaksacija
skeletnih srčanog
mišića mišića
Razliku u efektima koje isti signal ima na različite tipove ćelija zbog različitih puteva intracelular-
ne transdukcije signala u njima, mogu se takođe ilustrovati na primeru acetiiholina. Ćelije srčanog
mišića i određene sekretorne ćelije imaju isti tip acetilholinskih receptora (muskarinski). Međutim,
zbog bitnih razlika u vrsti intracelularne mašinerije koja sprovodi signal i izaziva konačan odgovor,
vrsta odgovora se razlikuje: kod ćelije srčanog mišića dolazi do relaksacije, a kod sekretorne ćelije
do sekrecije materijala sadržanog u sekretornim granulama (Slika 21-7).
\ Wwv
Sekrecija
acetilholin
Relaksacija
Slika 21-7. Različit odgovor na isti signalni molekul prouzrokovan različitim putevi-
ma intracelularne transdukcije signala: (a) relaksacija srčanog mišića pod dejstvom
acetiiholina, (b) egzocitoza sekretornih granula iz sekretorne ćelije (npr. sekrecija
salivarnih, želudačnih i pankreasnih digestivnih enzima i elektrolita).
Svaka ćelija višećelijskog organizma izložena je dejstvu veoma velikog broja različitih ekstracelu-
larnih signalnih molekula, poreklom iz bliže ili dalje okoline. Svaka ćelija je programirana da odgovara
21-6 Opšta biohemija
na specifične kombinacije signalnih molekula na sebi svojstven način. Preživljavanje većine ćelija
viših životinja i čoveka zavisi od određene kombinacije signala: u nedostatku odgovarajućih signala
(npr. u kulturi ćelija istog tipa), ćelije aktiviraju samoubilački proces programirane ćelijske smrti
(apoptoze). Naravno, različite vrste ćelija zahtevaju prisustvo različitih kombinacija signala za preživ
ljavanje, pa je njihov život moguć samo na određenim mestima u telu. Ako se signalima koji omogu
ćavaju preživljavanje ćelije dodaju drugi signali, dobijaju se nove kombinacije, koje indukuju prolife-
raciju ćelija (Slika 21-8). Zahvaljujući ogromnom broju mogućih kombinacija, ograničen broj vrsta ek-
stracelularnih signalnih molekula može da nosi ogroman broj različitih poruka ciljnim ćelijama.
Površinski receptori
Površinski receptori su transmembranski proteini plazma-membrane ciljnih ćelija. Kada svojim
ekstracelularnim domenor^ vežu signalni molekul (ligand), oni se aktiviraju i pokreću kaskadu intra
celularne transdukcije signala (signalni put), što konačno dovodi do određene promene ponašanja
ćelije. Hidrofilni signalni molekuli, koji zbog svoje prirode ne mogu da prođu kroz plazma-membranu
ciljne ćelije, po pravilu ostvaruju svoje dejstvo posredstvom površinskih receptora (Slika 21-9a). Akti
virani površinski receptori ostvaruju direktne metaboličke efekte u ćeliji (tj. bez uticaja na transkripciju
gena), ali pored toga mnogi imaju i efekte koji se ostvaruju na nivou jedra (kroz aktivaciju transkripci
je određenih gena). Površinski receptori se mogu podeliti u tri klase: (1) receptore povezane sa G-
proteinima, (2) enzimske receptore i (3) receptore-jonske kanale (Slika 21-10):
Z Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-7
Hidrofilni signalni
molekul Intracelularni receptor
(1) Receptori povezani sa G-proteinima. Aktivirani receptori ovog tipa ostvaruju svoje efekte na
ćeliju posredstvom specifičnih trimernih regulatornih proteina koji vezuju GTP (G-proteina). Po
vezivanju ekstracelularnog signalnog molekula za receptor, aktivira se G-protein, koji može da
dovede do aktivacije određenog ciljnog proteina: enzima vezanog za membranu ili jonskog kana
la. Ako je ciljni protein enzim, njegova aktivacija dovodi do promene koncentracije jednog ili više
medijatora intracelularne transdukcije signala; ako je ciljni protein jonski kanal, aktivacija utiče na
permeabilnost membrane za određene jone.
neaktivni aktivni
katalitički katalitički
domen domen
(2) Enzimski receptori. Aktivirani enzimski receptori mogu sami da funkcionišu kao enzimi, sa akti
vnim centrima u intracelularnom domenu receptora, ili aktiviraju enzime koji funkcionišu kao po
sebni molekuli (tj. ne kao aktivni centri u strukturi samog receptora). Većina receptora ove klase
su protein-kinaze ili aktiviraju posebne protein-kinaze.
(3) Jonski kanali. Funkcija receptora ove klase je relativno jednostavna: receptor je ujedno i jonski
kanal, pa vezivanje liganda direktno dovodi do otvaranja ili zatvaranja jonskog kanala i time me-
nja permeabilnost membrane. Receptori ovog tipa imaju važnu ulogu u brzoj sinaptičkoj signali
zaciji između električno ekscitabilnih ćelija.
Za razliku od jonskih kanala, aktivirani receptori povezani sa G-proteinima, kao i enzimski recep
tori, deluju posredstvom mnogo složenijih mehanizama transdukcije signala (signalnih puteva) unutar
ćelije. U ovim signalnim putevima učestvuje veliki broj različitih molekula, pre svega proteina, zatim
jedinjenja male molekulske mase (kao što su npr. nukleotidi: ciklični AMP ili ciklični GMP), pa čak i
jona (npr. jon Ca2+). Ovi mali molekuli ili joni nazivaju se intracelularni medijatori, intracelularni gla
snici ili "drugi glasnici" (signalni molekul je "prvi glasnik"). Oni učestvuju u daljoj transdukciji signala
tako što utiču na aktivnost određenih proteina signalnog puta kao alostemi modulatori.
Aktivacija većine proteina koji funkcionišu u transdukciji signala odvija se na jedan od sledećih
načina:
• fosforilacijom proteina pod dejstvom protein-kinaza i
• vezivanjem GTP-a.
Signal
V
Slika 21-11. Dva osnovna mehanizma aktivacije proteina koji učestvuju u intracelularnoj
transdukciji signala: (a) fosforilacija pod dejstvom protein-kinaza, (b) vezivanje GTP-a u
zamenu za GDP.
Oba navedena mehanizma aktivacije prikazana su šematski na Slici 21-11. U prvom slučaju, pro
tein u prisustvu odgovarajućeg signala prelazi iz neaktivnog (defosforilisanog) oblika u aktivan (fosfo-
rilisan) oblik pod dejstvom specifične protein-kinaze, uz utrošak ATP-a i stvaranje ADP-a. Protein koji
je na taj način aktiviran, po uklanjanju signala se defosforiliše pod dejstvom fosfoprotein-fosfataze i
time vraća u neaktivnu formu (Slika 21-11a). Fosforilaciju proteina vrše dve vrste protein-kinaza, koji
se međusobno razlikuju po svojoj specifičnosti prema vrsti aminokiselinskih ostataka u proteinu-
Z. Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-9
(a) (b)
Aktivacija daljih faza signalnog puta Aktivacija daljih faza signalnog puta
Slika 21-12. Dva primera mehanizama ntegracije signalnih puteva: (a) - protein Y se akti
vira fosforilacijom u dva položaja, što se ostvaruje jedino pod dejstvom dva različita si
gnala, A i B; (b) - signali A i B fosforilišu dva proteina, a i b, koji se potom vezuju u akti
van dimer.
Kao što je ranije navedeno, svaka vrsta ćelije je programirana da odgovara na specifičan način
na različite kombinacije ekstracelularnih signalnih molekula. Ovo je moguće samo pod uslovom da
ćelija raspolaže mehanizmom koji na neki način integriše informacije koje dolaze od različitih si
gnalnih molekula. U signalnim putevima zasnovanim na fosforilaciji proteina i/ili vezivanju GTP-a,
ovu integraciju ostvaruju posebni signalni proteini, za čiju je aktivaciju neophodno dejstvo dva različi
ta signalna molekula. Dva primera mehanizama integracije signala uz pomoć ovakvih proteina še-
matski su prikazana na Slici 21-12. U prvom slučaju (Slika 21-12a), dva signalna molekula (A i B)
aktiviraju različite kaskade fosforilacije proteina, od kojih svaki vodi do fosforilacije integrišućeg prote
ina (Y), ali na različitim mestima u molekulu. Takav protein je aktivan samo ako je fosforilisan u oba
položaja, što se dešava samo onda kada su prisutna oba signala. U drugom primeru (Slika 21-12b),
signali A i B dovode do fosforilacije dva različita proteina (a i b), koji se potom međusobno vezuju u
21-10 Opšta biohemija
aktivan dimer ab. lako se u oba opisana primera integrišući proteini fosforilišu, njihova aktivacija u
drugim slučajevima može da se vrši i vezivanjem GTP-a u zamenu za GDP, opet pod dejstvom dva
različita signalna puta.
Intracelularni receptori
Kako su ovi receptori lokalizovani unutar ćelije, ekstracelularni signalni molekuli moraju da uđu u
ćeliju da bi ih aktivirali. Prema tome, signali koji deluju posredstvom takvih receptora moraju da budu
dovoljno mali i hidrofobni da bi mogli da difunduju kroz plazma-membranu ciljne ćelije. Pošto su
obično nerastvomi u vodi, signali ovog tipa se transportuju krvlju ili drugim ekstracelularnim tečnosti-
ma vezani za specifične transportne proteine, od kojih se odvajaju pre ulaska u ćeliju (Slika 21-9b).
Efekti aktiviranih intracelularnih receptora ostvaruju se na nivou jedra, tj. oni utiču na brzinu transkri
pcije određenih gena i time na koncentraciju odgovarajućih proteina: kada se aktiviraju vezivanjem
liganda, oni deluju kao transkripcioni faktori.
Struktura i mehanizam aktivacije intracelularnih receptora prikazani su na Slici 21-13. Receptor
se sastoji od nekoliko bitnih domena:
• domena na kojem se nalazi mesto vezivanja hormona,
• zglobne regije,
• domena na kojem se nalazi mesto vezivanja za DNK i
• domena koji aktivira transkripciju.
U neaktivnom stanju (u odsustvu odgovarajućeg liganda), receptor je vezan za inhibitorni prote
inski kompleks koji maskira mesto vezivanja za DNK, pa receptor zbog toga ne može da utiče na
transkripciju. Kada se ligand (signalni molekul) veže za odgovarajuće mesto na receptoru, dolazi do
promene konformacije zglobnog dela i do disocijacije inhibitornog kompleksa. Ovim se demaskira
mesto vezivanja za DNK, što omogućuje aktiviranom receptoru da pokrene trankripciju određenih
gena. Model aktivacije prikazan na Slici 21-13 zasniva se na primeru receptora za kortizol, ali i ostali
ligandi koji deluju posredstvom intracelularnih receptora (drugi steroidni hormoni, tireoidni hormoni,
retinoidi i vitamin D) deluju na sličan način.
H2N
Steroidni
hormon
COOH
Struktura receptora
G-proteini (puni naziv: trimerni proteini koji vezuju GTP) predstavljaju grupu proteina koji prenose
signal sa odgovarajućeg receptora na ciljni enzim ili jonski kanal. Oni se po svojoj strukturi i funkciji
razlikuju od drugih monomernih proteina koji se takođe aktiviraju vezivanjem GTP-a, a učestvuju u
intracelularnoj transdukciji signala. Sastoje se od tri različite subjedinice koje se obeležavaju kao a, B
i y. Subjedinice B i y su vezane u čvrst kompleks, a na y-lancu se nalazi kovalentno vezan hidrofobni
lanac (ostatak masne kiseline ili prenil-grupa), koji je uronjen u lipidni dvosloj plazma-membrane i
preko kojeg je G-protein vezan za citoplazmatsku stranu membrane. U stanju mirovanja (bez prisus
tva odgovarajućeg signala), za a subjedinicu je vezan GDP, a sama subjedinica je povezana sa B i y-
lancem.
Kada se receptor aktivira vezivanjem ekstracelularnog signala, to prouzrokuje zamenu GDP-a za
GTP na cc-subjedinici G-proteina (aktivacija a-subjedinice) i disocijaciju te subjedinice od By-
kompleksa (a-subjedinica nije učvršćena za membranu). Oslobođena aktivna a-subjedinica potom se
vezuje za ciljni protein (enzim ili jonski kanal), gde ostvaruje svoj efekat. Trajanje uticaja aktivirane a-
subjedinice G-proteina na ciljni protein je ograničeno GTP-aznom aktivnošću te subjedinice: posle
određenog vremena ona sama katalizuje hidrolizu vezanog GTP-a do GDP-a, ponovo se vezuje za
By-kompleks i vraća u stanje mirovanja.
Najvažniji ciljni enzimi G-proteina su adenilat-ciklaza i fosfolipaza C. U signalnim putevima u ko
jima učestvuju ovi enzimi, dolazi do promene koncentracije odgovarajućih drugih glasnika unutar ćeli-
Z Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-13
je. Pored enzima, ciljni protein može da bude i jonski kanal: npr. određeni G-proteini stimulišu otva
ranje K+-kanala u ćelijama srčanog mišića.
Oligosaharidi
NH:
Ekstracelularna
površina
Citoplazma
OOC
NH, NH,
PP;
or— P — o — p — o — P — o — c
M
OH OH
ATP cAMP
21-14 Opšta biohemija
Visoka koncentracija cAMP-a u ćeliji može da se održava samo njegovom ubrzanom sintezom
pod dejstvom signala, zato što se sintetisani cAMP brzo razlaže pod dejstvom cAMP fosfodiestera-
ze:
NH, NH
O—P — O—C
T
H20
°" HJA
OH OH
cAMP AMP
Aktivacija/inhibicija adenilat-ciklaze
Mnogi ekstracelularni
signalni molekuli deluju na Stimulatorni
signal
ciljne ćelije na taj način što
utiču na koncentraciju
cAMP-a u ćeliji. Ovaj efekat
se ostvaruje kontrolom akti
vnosti (aktivacijom ili inhibi-
cijom) adenilat-ciklaze.
Aktivacija adenilat-
ciklaze pod dejstvom stimu-
latornog signalnog moleku
la ostvaruje se posreds
tvom specifičnih receptora
povezanih sa stimulator-
nim G-proteinom (Gs).
Proces aktivacije prikazan
je na Slici 21-17 i odvija se
kroz sledeće faze: Toksin
Vezivanje stimulatornog Vibrio cholerae
cAMP
ekstracelularnog signalnog Slika 21-17. Aktivacija adenilat-ciklaze (AC).
molekula za specifični re-
ceptor, Rs uz aktivaciju re
ceptora (oznaka s pokazuje da receptor pokreće transdukciju stimulatornog signala).
1. Vezivanje Gs proteina, aktivacija razmenom GDP-a na njegovoj sa-subjedinici za GTP (oznaka s
ima isto značenje kao i u slučaju receptora).
2. Disocijacija aktivirane sa-subjedinice od (3y-kompleksa.
3. Aktivacija adenilat-ciklaze (AC) pod dejstvom sa dovodi do porasta koncentracije cAMP u ćeli
ji
Jedan od najbolje proučenih primera aktivacije adenilat-ciklaze je aktivacija pod dejstvom adre
nalina posredovana p-adrenergičnim receptorom i stimulatornim G-proteinom. Kao što je ranije na
vedeno, efekat signalnog molekula ne traje dugo: G-protein se vraća u neaktivno stanje hidrolizom
Z. Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-15
GTP-a do GDP-a i neorganskog fosfata, a već stvoreni cAMP se razlaže pod dejstvom specifične
fosfodiesteraze.
Toksin uzročnika kolere (Vibrio cholerae), katalizuje reakciju u kojoj dolazi do hemijske modifika
cije sa-subjedinice G-proteina. Modifikovana subjedinica gubi GTP-aznu aktivnost, pa ostaje fiksira
na u aktivnom obliku. Zbog toga se u ćelijama creva, izloženim dejstvu toksina, stalno održava viso
+
ka koncentracija cAMP, koji dovodi do sekrecije velike količine vode i jona Na u lumen creva i izazi
va tešku dijareju karakterističnu za ovu bolest.
Kofein i teofilin takođe potpomažu održavanje povišenih koncentracija cAMP u ćeliji, tako što in-
hibiraju fosfodiesterazu i time usporavaju razlaganje stvorenog cAMP.
Inhibicija adenilat-ciklaze pod dejstvom inhibitomog signalnog molekula odvija se analognim
mehanizmom kao i aktivacija, ali u prenošenju signala učestvuje inhibitorni receptor (npr. a 2 -
adrenergični receptor) i inhibitorni G-protein (Gj). Aktivirana inhibitorna a-subjedinica (ia) usporava
sintezu cAMP-a i tako snižava njegovu koncentraciju. Efekat signala se i u ovom slučaju gasi hidroli
zom GTP-a pod uticajem ia-subjedinice.
cAMP
Neaktivna
cAMP-zavisna
protein-kinaza
*A1'/,
k- +
Regulatorna Neaktivna Kompleks cAMP
subjedinica katalitička i regulatornih
subjedinica subjedinica
Aktivne katalitičke
subjedinice
l
Fosforilacija fosforilaza-kinaze
(stimuliše glikogenolizu) i
glikogen-sintaze (inhibira
glikogenezu).
Prvi i najbolje ispitani metabolički efekat cAMP-zavisne fosforilacije pod dejstvom PKA je uticaj
cAMP-a na sintezu i degradaciju glikogena u ćelijama skeletnih mišića (Slika 21-17). U prisustvu ad
renalina, posredstvom p-adrenergičnog receptora i G s proteina, aktivira se adenilat-ciklaza i nivo
cAMP u ćeliji raste. Kao posledica toga, oslobađa se aktivna PKA, koja fosforiliše fosfohlaza-kinazu
(enzim koji učestvuje u regulaciji katabolizma glikogena) i glikogen-sintazu (ključni enzim puta bio-
sinteze glikogena). Fosforilaza-kinaza se ovim prevodi u aktivan oblik, koji fosforiliše sledeći enzim u
kaskadi, glikogen-fosforilazu. Glikogen-fosforilaza, aktivirana fosforilacijom, razlaže glikogen, kao
što je ranije detaljno objašnjeno (Poglavlje 12). S druge strane, fosforilisan oblik glikogen-sintaze je
neaktivan, pa je zbog toga sinteza glikogena inhibirana dejstvom adrenalina.
PKA
Svaki molekul PKA fosforiliše i time / / \ \
AMPLIFIKACIJA
/ I \ \
aktivira mnogo molekula enzima X
Produkti
enzima X
Slika 21-18. Mehanizam amplifikacije signala u kaskadnom signalnom putu koji funkcio-
niše posredstvom cAMP-a kao drugog glasnika.
jer svaki aktivan enzim aktivira veći broj molekula enzima koji je sledeći po redosledu u kaskadi. Me
hanizam amplifikacije signala za hormone koji deluju preko cAMP-a kao drugog glasnika prikazan je
šematski na Slici 21-18, iz koje se vidi u kojim fazama signalnog puta dolazi do pojačanja signala.
Mnogi hormoni deluju na svoje ciljne ćelije preko cAMP-a kao drugog glasnika, pokrećući u njima
veoma raznolike odgovore, specifične za određene vrste ćelija (Tabela 21-1). Kao što je već objaš
njeno, ove razlike su posledica različitih receptora i različitih intracelularnih medijatora (u ovom sluča
ju različitih supstrata protein-kinaze A). Međutim, svi hormoni koji deluju na jedan određeni tip ćelija
tako što povećavaju koncentraciju cAMP u njoj, proizvode isti metabolički efekat. Tako npr. nekoliko
hormona koji stimulišu sintezu cAMP u adipocitima (adrenalin, glukagon, ACTH i TSH) imaju isti me
tabolički efekat, razlaganje deponovanih triacilglicerola. Ovo se može objasniti time da PKA aktivira
na povišenom koncentracijom cAMP-a fosforiliše iste ciljne proteine, bez obzira na vrstu ekstracelu-
larnog signala koji je doveo do aktivacije adenilat-cilkaze i ubrzane sinteze cAMP-a.
cAMPt
Pored toga što deluje na aktivnost različitih ciljnih proteina
u ćeliji njihovom fosforilacijom pod dejstvom PKA, cAMP u ne
kim ćelijama ispoljava i efekte na nivou jedra, aktivirajući trans Aktivacija PKA
kripciju određenih gena i time povećava koncentraciju odgo
varajućih proteina. U procesu aktivacije transkripcije gena pod
uticajem cAMP-a učestvuju: Fosforilacija (aktivacija)
• Kratak segment DNK karakteristične strukture, lociran u transkripcionog faktora
promotoru ciljnog gena, koji se obeležava skraćenicom CREB
CRE (prema engleskom nazivu: cAMP responsive ele
ment, tj. element DNK koji odgovara na prisustvo cAMP-a)
Aktivacija transkripcije dejstvom
• Transkripcioni faktor CREB, protein koji prepoznaje sek- CREB na CRE segment u
vencu nukleotida CRE (skraćenica CREB potiče od engle promotoru ciljnog gena
skog naziva CRE-binding protein, tj. protein koji se vezuje
za CRE)
Slika 21-19. Uticaj cAMP na eks
presiju gena.
21-18 Opšta biohemija
11 Signal
Ovaj signalni put aktivira izoformu PLC-p, dok se izoforma PLC-y aktivira pod dejstvom enzimskih receptora.
21-20 Opšta biohemija
do sada ispitanim ćelijama eukariota. Kalmodulin se sastoji od jednog polipeptidnog lanca na kojem
se nalaze četiri mesta za vezivanje kalcijumovog jona. Vezivanje Ca2+-jona dovodi do alosterne akti
vacije kalmodulina, slično aktivaciji protein-kinaze A pod dejstvom cAMP-a. Međutim, sam kalmodu
lin nema nikakvu enzimsku aktivnost, već deluje tako što menja aktivnost različitih ciljnih proteina
(enzima i transportnih proteina). U nekim slučajevima, kalmodulin može da bude stalna regulatorna
subjedinica u sastavu molekula oligomernog enzima (npr. kalmodulin je 8-subjedinica fosforilaza-
kinaze, v. Poglavlje 12). Međutim, češći je slučaj da se kalmodulin tek po vezivanju Ca2+-jona veže
za ciljni protein i deluje na njega. Dakle, može se reći da kalmodulin ustvari predstavlja intracelular-
ni Ca2+-receptor, a kompleks Ca2+/kalmodulin je njegova aktivna forma. U svakom slučaju, efekti
kalcijumovog jona u ćeliji mogu da budu veoma različiti zavisno od tipa ćelije, jer se različite ćelije
međusobno razlikuju po vrsti ciljnih proteina koji se u njima nalaze.
Ciljni proteini kompleksa Ca2+/kalmodulin su brojni, ali se većina efekata kalcijumovog jona u ćeli
ji ostvaruje posredstvom Ca2*/kalmodulin-zavisnih protein-kinaza (CaM-kinaza). Ove kinaze fosfo-
rilišu ostatke serina ili treonina u ciljnim proteinima i menjaju njihovu aktivnost. Neke od njih specifič
no fosforilišu samo određeni protein (npr. kinaza lakog lanca miozina koja aktivira kontrakciju mišića),
dok druge imaju širu specifičnost i mogu da fosforilišu veći broj ciljnih proteina (npr. CaM-kinaza II:
nalazi se u skoro svim ćelijama, a najviše u nervnom tkivu; izaziva sekreciju i resintezu kateholamina
u neuronima). Međutim, ne zavise svi efekti kompleksa Ca2+/kalmodulin od CaM-kinaza: npr., ovaj
kompleks se vezuje i time direktno aktivira Ca2+-ATP-azu u plazma-membrani ćelije, koja izbacuje
kalcijumov jon iz ćelije i tako deluje u pravcu vraćanja koncentracije jona Ca 2+ na vrednosti koje se
nalaze u citozolu u stanju mirovanja.
Opisani put ulaska Ca 2+ u citozol iz endoplazmatskog retikuluma, aktivacijom fosfatidilinozitol-
skog signalnog puta (Slika 21-22b), odvija se u svim ćelijama eukariota. Međutim, kalcijumov jon
može da uđe u ćeliju i iz ekstracelularne tečnosti kroz Ca2+-kanale koji mogu da se otvaraju na dva
načina: pod dejstvom signala koji deluju posredstvom G-proteina, ili, u neuronima, gde se pod dejs
tvom nervnog impulsa otvaraju voltažni Ca2+-kanali (Slika 21-22a), a jon kalcijuma potom dovodi do
sekrecije neurotransmitera.
Povećanje koncentracije kalcijumovog jona u citozolu ne traje dugo, jer ćelije raspolažu sa neko
liko mehanizama koji snižavaju njegov nivo. Ovi mehanizmi se mogu podeliti u dve grupe:
a. Mehanizmi koji izbacuju Ca2+-jon iz citozola u ekstracelularnu tečnost. Ovu funkciju ostvaruju
dva transportna sistema:
• Ca2+-ATP-aza, uniport Ca2+-jona uz utrošak ATP-a (ranije je pomenuto da se aktivira
kompleksom Ca2+/kalmodulin),
• Na+/Ca2+-antiport, sistem sekundarnog aktivnog transporta koji izbacuje kalcijumov jon
koristeći energiju koncentracionog gradijenta Na+-jona.
b. Mehanizmi koji snižavaju koncentraciju Ca2+-jona u citozolu bez njegovog uklanjanja iz ćelije:
• Ca2+-ATP-aza u membrani endoplazmatskog retikuluma transportuje kalcijumove jone iz
citozola u lumen ER nasuprot koncentracionom gradijentu (uniport Ca2+-jona uz utrošak
ATP-a),
• Aktivni transport Ca 2+ u matriks mitohondrija, koji koristi energiju respiratornog lanca.
Ovaj mehanizam se aktivira tek pri izrazito visokim koncentracijama Ca 2+ u citozolu
• Vezivanje slobodnog Ca 2+ jona za različite molekule u ćeliji.
(3) Efekti DG: aktivacija protein-kinaze C i njena uloga u modulaciji ekspresije gena
Plazma-membrana
Slika 21-23. Dva mehanizma aktivacije transkripcije gena pod uticajem aktivirane prote
in-kinaze C (PKC). Fragment DNK gena 1 za koji je vezan Elk-1 obeležen je kao SRE {se
rum response element), a za njega je vezan još jedan protein, SRF (serum response factor).
Značenje ostalih skraćenica i objašnjenje mehanizama dato je u tekstu.
21-22 Opšta biohemija
Drugi produkt hidrolize PIP2) diacilglicerol (DG), u položaju 1 najčešće sadrži estarski vezan osta
tak stearinske, a u položaju 2 arahidonske kiseline2. Kao nepolarna supstanca vezan je za membra
nu i tu deluje kao drugi glasnik koji aktivira protein-kinazu C (PKC). Oznaka "C" u nazivu ove prote-
in-kinaze potiče od činjenice da njena aktivacija zavisi od jona Ca 2+ : Porast koncentracije Ca 2+ pod
dejstvom IP3, dovodi do translokacije PKC iz citozola na unutrašnji sloj plazma-membrane. Ovo
omogućuje aktivaciju PKC udruženim dejstvom DG, Ca 2+ i negativno naelektrisanog membranskog
fosfolipida, fosfatidilserina. PKC fosforiliše ostatke serina i treonina različitih ciljnih proteina, zavisno
od vrste ćelije. Ovim mehanizmom se aktivira nekoliko različitih izoformi PKC. Fosforilacija ciljnih pro
teina pod dejstvom PKC ima za posledicu aktivaciju transkripcije određenih gena.
Dva puta kojima PKC utiče na ekspresiju gena prikazana su šematski na Slici 21-23:
1. U prvom putu (aktivacija transkripcije gena 1 na Slici 21-23), PKC najpre fosforiliše i time aktivira
MAP-kinazu (MAPK, mitogenom aktivirana protein-kinaza). MAP-kinaza zatim fosforiliše trans-
kripcioni faktor Elk-1, koji se nalazi u jedru, vezan za određeni fragment DNK u regulatornom re-
gionu gena. Regulatomi protein aktiviran ovom fosforilacijom pokreće transkripciju gena.
2. U drugom putu (aktivacija transkripcije gena 2 na Slici 21-23), PKC fosforiliše inhibitorni protein
IK-B, koji po fosforilaciji disosuje iz kompleksa sa transkripcionim faktorom NFK-B (nuklearni fak
tor K-B). Slobodan NFK-B sada može da uđe u jedro, gde aktivira transkripciju određenih gena.
Ovaj ostatak arahidonske kiseline u nekim ćelijama može da se oslobodi hidrolizom pod dejstvom enzima dia-
cilglicerol-lipaze i da posluži za sintezu prostaglandina, prostaciklina, tromboksana i leukotriena.
Z Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-23
receptora lokalizovano na spoljašnjoj strani membrane. Intracelularni domen receptora sadrži jedan
ili više aktivnih centara sa enzimskom aktivnošću. U zavisnosti od tipa enzimske aktivnosti, enzimski
receptori se mogu podeliti na sledeće grupe:
• Receptori sa aktivnošću tirozin-specifičnih protein-kinaza,
• Receptori tirozin-specifične fosfoprotein-fosfataze,
• Receptori serin/treonin-specifične protein-kinaze i
• Receptori gvanilat-ciklaze.
Pored toga, postoje i receptori koji funkcionišu na sličan način kao i enzimski receptori, ali sami
nemaju enzimsku aktivnost, već aktiviraju enzim koji funkcioniše kao poseban molekul, a obično ima
ju aktivnost tirozin-kinaze. Ovakvi receptori se nazivaju receptori povezani sa enzimima. U ovu
grupu spadaju npr. receptori hormona rasta, citokina, interferona i receptori T-limfocita.
Receptori tirozin-kinaze
Mnogi faktori rasta stimulišu proliferaciju i diferencijaciju ciljnih ćelija posredstvom receptora tiro-
zin-kinaza (RTK), koji specifično fosforilišu tirozinske ostatke određenih proteina. Na Slici 21-24, še-
matski su prikazane strukture receptora nekih faktora rasta i insulina. Ekstracelularni segmenti recep
tora se međusobno razlikuju po strukturi: neki imaju domene bogate cisteinom, dok ovi domeni kod
drugih receptora imaju strukturu srodnu strukturi koja se nalazi u molekulima imunoglobulina.
Domen sa strukturom
_- tipa imunoglobulina
Domen bogat
cisteinom
s-s- -s-sH
Ekstraceluiarna
ss strana
@5C
Plazma membrana
Citozol
Domen -—_
sa aktivnošću
tirozin-kinaze
Slika 21-24. Struktura nekih RTK (EGF - epidermalni faktor rasta; PDGF - faktor rasta iz
trombocita; NGF - nervni faktor rasta).
Vezivanje liganda za receptor indukuje dimerizaciju receptora: time dolazi do međusobnog pribli
žavanja njihovih intracelulamih domena, što omogućuje uzajamnu fosforilaciju tirozinskih ostataka
ovih domena. Ova autofosforilacija aktivira receptor: za njegove fosfotirozinske ostatke vežu se
ciljni proteini koji se i sami fosforilišu na tirozinskim ostacima (pod dejstvom receptora) i time se akti
viraju. Mnogi od tih proteina su i sami protein-kinaze.
21-24 Opšta biohemija
Insulinski receptor, kao i receptor faktora rasta sličnog insulinu-1 (IGF-1, po engleskom nazivu in-
sulin-like growth factor-1) su specifični po tome što i bez prisustva liganda imaju strukturu tetramera
a2(32 (a-lanci predstavljaju ekstracelularne domene sa mestom za vezivanje liganda, dok p-lanci čine
transmembranske i intracelularne domene. Vezivanje liganda izaziva alosternu interakciju dve polo
vine receptora i fosforilaciju katalitičkih domena. Najvažniji ciljni protein aktiviranog receptora je IRS-
1 (supstrat insulinskog receptora, po engleskom terminu insulin receptor substrate). Fosforilisani ti-
rozinski ostaci IRS-1 služe kao mesta za vezivanje i aktivaciju različitih proteina koji učestvuju u da
ljoj transdukciji signala.
Faktor rasta
Ekstracelularni
medijum
Kaskada
protein-kinaza
Drugi
efektori
Slika 21-25. Intracelularna transdukcija signala faktora rasta pomoću Ras-proteina (RTK
- receptor tirozin-kinaza; MAPK - mitogenom aktivirana protein-kinaza; MAPKK -
MAPK-kinaza; MAPKKK - MAPKK-kinaza).
Z Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-25
Aktivirani receptori tirozin-kinaze prepoznaju svoje ciljne proteine koje će fosforilisati zahvaljujući
specifičnim domenima koji ti ciljni proteini sadrže u svojoj strukturi. Ovi domeni se sastoje od oko 100
ostataka aminokiselina, a obeležavaju se kao SH2-domeni SH2-domeni ciljnih proteina specifično
se vežu za fosfotirozinske ostatke aktiviranih receptora.
U intracelularnoj transdukciji signala faktora rasta, važnu ulogu ima Ras-protein, koji se u ćeliji na
lazi vezan za unutrašnju stranu plazma-membrane pomoću prenil-lanca uronjenog u lipidni sloj (Slika
21-25). Po aktivaciji receptora, Ras se aktivira zamenom vezanog GDP-a za GTP. Aktivan Ras
(RasGTP), koji pokazuje enzimsku aktivnost serin/treonin-kinaze, fosforiliše različite ciljne proteine,
od kojih su mnogi i sami serin/treonin-kinaze. Kaskada fosforilacije dovodi do aktivacije MAP-kinaze.
Kao što je ranije navedeno, MAP-kinaza u jedru fosforiliše i time aktivira određene transkripcione
faktore. Ovaj put je ključan za ostvarivanje uticaja faktora rasta na proliferaciju i diferencijaciju ćelija.
Ako se funkcija Ras-a inhibira, ne dolazi do proliferacije i diferencijacije pod dejstvom aktiviranog re
ceptora tirozin-kinaze. Obrnuto, ako dođe do mutacije Ras-gena tako da njegov produkt, Ras-protein
ima nenormalno veliku aktivnost (Ras je aktivan i bez prisustva odgovarajućeg signala), proliferacija
je nekontrolisana i neadekvatna potrebama organizma: u oko 30% karcinoma čoveka postoji ovakva
mutacija Ras-gena.
Aktivirana kaskada se vraća u stanje mirovanja hidrolizom GTP-a vezanog za Ras do GDP-a i
defosforilacijom fosforilisanih proteina.
I u slučaju receptora tirozin-kinaza, putevi transdukcije signala se ukrštaju sa drugim signalnim
putevima na više mesta. Tako se npr. fosfolipaza C (PLC) aktivira takođe i pod uticajem ovog tipa
receptora3. Isto tako, MAP-kinaza učestvuje u transdukciji signala putem receptora tirozin-kinaza, ali
se takođe aktivira pod dejstvom protein-kinaze C (PKC), aktivira se pod dejstvom DG i Ca2+-jona u
fosfatidilinozitolskom putu).
Receptori tirozin-fosfataze
Receptori serin/treonin-kinaze
Ova klasa receptora takođe predstavlja transmembranske proteine sa jednim transmembranskim
segmentom. Intracelularni domen receptora aktiviranog vezivanjem određenog liganda ima aktivnost
serin/treonin-specifične protein-kinaze. Primer su receptori lokalnih medijatora familije transformišu-
ćeg faktora rasta-p (TGF-p), koji regulišu proliferaciju i funkciju većine ćelija kičmenjaka.
Pored receptora serin/treonin-kinaza, u ćelijama postoje i intracelularne serin/treonin-kinaze. One
ne funkcionišu kao neposredni receptori ekstracelularnih signala, ali su njima ipak regulisane, tako
što predstavljaju sastavni deo intracelularnih signalnih puteva. Ranije je već objašnjena funkcija više
proteina ovog tipa (npr. u serin/treonin-kinaze spadaju protein-kinaza A, protein-kinaza C, CaM-
kinaza i MAP-kinaza).
Izoforma PLC koja se aktivira posredstvom receptora tirozin-kinaza obeležava se kao PLC-y i sadrži SH2 do
men u svojoj strukturi. Ranije je opisana aktivacija PLC-p, pokreće se preko receptora povezanih sa G-
proteinima. Obe izoforme PLC imaju isto dejstvo, tj. vode aktivaciji fosfatidilinozitolskog signalnog puta.
21-26 Opšta biohemija
Receptori gvanilat-ciklaze
.4
Receptori ove klase, kao što je npr. receptor atrijalnih natriuretičnih peptida , po svojoj strukturi
su transmembranski proteini. Sastoje se od ekstracelularnog domena sa mestom vezivanja liganda,
jednog transmembranskog segmenta i intracelularnog domena sa katalitičkom aktivnošću gvanilat-
ciklaze. Vezivanje liganda za ekstracelularni domen indukuje promenu konformacije celog receptora
čime se aktivira katalitički centar. Aktivan receptor katalizuje reakciju stvaranja cikličnog GMP-a
(cGMP) iz GTP-a, koja je potpuno analogna ranije prikazanoj reakciji stvaranja cAMP-a pod dejs-
tvom adenilat-ciklaze. Nastali cGMP deluje u ćeliji tako što se vezuje na cGMP-zavisnu protein-
kinazu (protein-kinaza G, PKG, ili G-kinaza) i aktivira je. PKG takođe spada u grupu serin/treonin
specifičnih protein-kinaza, koje fosforilišu određene ciljne proteine na njihovim serinskim i treonin-
skim ostacima i time menja njihovu aktivnost. Dakle, receptori gvanilat-ciklaze koriste cGMP kao
drugi glasnik na isti način na koji neki receptori povezani sa G-proteinima koriste cAMP5. Receptori
klase gvanilat-ciklaza nisu tako brojni kao klasa receptora tirozin-kinaza.
Specifičnost dejstva NO kao signalnog molekula bez posredstva receptora: direktna aktivacija
intracelularne gvanilat-ciklaze
Azot-monoksid (NO) je značajan signalni molekul koji dovodi do dilatacije glatkih mišića krvnih
sudova, služi kao neurotransmiter i učestvuje u imunom odgovoru. Stvara se iz arginina pod dejs-
tvom NO-sintaze (NOS, Slika 21-26), koja je zastupljena u više izoformi različitih osobina. Lako di-
funduje iz ćelije u kojoj je stvoren i ulazi direktno u okolne ćelije.
OH
I
H2N NH2 H2N N H2N C)
Specifičnost dejstva NO na ciljne ćelije sastoji se u tome što se njegov efekat na te ćelije ostva
ruje bez učešća bilo kakvih receptora. NO se u nekim ciljnim ćelijama (npr. ćelijama glatkih mišića
krvnih sudova) direktno vezuje na gvožđe u aktivnom centru gvanilat-ciklaze, što aktivira enzim i
dovodi do porasta intracelularne koncentracije cGMP. Dobro je poznat vazodilatatorni efekat NO na
krvne sudove srca: NO stvoren i otpušten iz endotelnih ćelija6 izaziva relaksaciju ćelija glatkih mišića.
Atrijalni natriuretični peptidi (ANP) su grupa srodnih peptida koji se stvaraju u atrijalnim mišićnim ćelijama srca
kao odgovor na porast krvnog pritiska. ANP stimulišu ekskreciju Na+ putem bubrega i dovode do relaksacije
ćelija glatkih mišića krvnih sudova, čime se pritisak snižava.
5
Naravno, postoji razlika u mehanizmu aktivacije enzima koji katalizuju stvaranje cAMP i cGMP: kao što je ra
nije objašnjeno, adenilat-ciklaza se aktivira posredstvom trimernih G-proteina, dok se gvanilat-ciklaza kao
sastavni deo receptora direktno aktivira vezivanjem signala.
Sinteza NO u endotelnim ćelijama stimulisana je pod dejstvom acetilholina, oslobođenog u zid krvnog suda iz
autonomnih nerava. Acetilholin u endotelnim ćelijama aktivira fosfatidilinozitolski signalni put, a posledični porast
Ca2+-jona stimuliše NO-sintazu u tim ćelijama. Dakle, relaksantno dejstvo acetilholina na glatke mišiće krvnih
sudova nije direktno, već je posredovano azot-monoksidom. NO takođe dovodi do vazodilatacije krvnih sudova
u mozgu i drugim organima endotel-nezavisnim mehanizmom: nervni impulsi dovode do porasta koncentracije
Z Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-27
Mehanizam dejstva nitroglicerina i srodnih lekova koji se koriste u terapiji akutnog napada angine
pectoris (bol zbog slabog snabdevanja srčanog mišića krvlju), sastoji se upravo u konverziji ovog
leka u NO, koji širi krvne sudove srca.
NO deluje kao lokalni medijator, jer ima vrlo kratak poluživot (svega 5-10 s) i veoma brzo se kon-
vertuje u nitrit i nitrat. Isto tako, stvoreni cGMP se vrlo brzo razlaže pod dejstvom fosfodiesteraza.
Dejstvo sildenafila (leka koji se koristi u terapiji impotencije muškaraca), zasniva se na inhibiciji fos-
fodiesteraze, čime se produžava vazodilatacija odgovarajućih krvnih sudova polnog organa, izazva
na dejstvom NO.
Pored NO, i ugljen-monoksid ima funkciju signalnog molekula koji deluje na ćelije analognim me
hanizmom koji dovodi do porasta cGMP u ćeliji. CO se u organizmu stvara razlaganjem hema pod
dejstvo/n enzima hem-oksigenaze. Smatra se da CO ima ulogu neurotransmitera.
Acetil-KoA Holin
Holin-
acetiltransferaza
O
H3C—C—O—C—C—N(CH3)3 + KoA — SH
Acetilholin KoA
Stvoreni acetilholin se skladišti u sinaptičkim vezikulama. Nervni impuls (akcioni potencijal) izazi-
Dtvaranje voitažno-regulisanih Ca2+2+-kanala na
va otvaranje na presinaptičkom
presinap kraju neurona i ulazak Ca2+-jona iz
2 2+
1
tracelularne tečnosti u ćeliju. Porast
ekstracelularne Porast koncentracije
koncentracije Ca
Ca" stimuliše egzocitozu sekretornih granula i
otpuštanje acetilholina u sinaptičku šupljinu (Slika 21-27)7.
Ca2+-jona u nervnim završecima, što stimuliše neuronsku NO-sintazu. Nastali NO difunduje u susedne glatko-
mišićne ćelije, gde na ranije opisan način izaziva vazodilataciju.
7
Neurotoksični protein pauka "crna udovica", a-latrotoksin, izaziva masivno otpuštanje acetilholina na neuro
muskularnom spoju. Smatra se da ovaj toksin deluje kao Ca2+-jonofor, pa i bez prisustva nervnog impulsa dolazi
do porasta kalcijumovog jona u presinaptičkom kraju neurona i egzocitoze sekretornih granula. Nasuprot tome,
otpuštanje acetilholina inhibirano je pod dejstvom toksičnog proteina anaerobne bakterije Clostridium botulinum,
uzročnika smrtonosnog trovanja hranom - botulizma.
21-28 Opšta biohemija
Slika 21-27. Uloga acetiiholina u prenosu nervnog impulsa kroz sinaptičku šupljinu.
Nikotinski acetiiholinski receptor je meta smrtonosnih neurotoksina: d-tubokurarin (aktivna komponenta ama
zonskog otrova kurare i paralitičkog agensa koji se koristi u medicini), deiuje kao antagonist acetiiholina. Zmijski
otrov kobre vezuje se za određene subjedinice receptora i sprečava otvaranje katjonskog kanala.
Z Jelić-lvanović: Međućelijska signalizacija 21-29
o
H3 C - -c-- o — C —C—N(CH 3
)3
rL H 2
Acetilholin
Acetilholinesteraza
0
II
3 c — c — 0" + Ho—c—c—i
H 2 H~
Acetat Holin
Time je sinapsa osposobljena da reaguje na sledeći nervni impuls, a stvoreni holin se transportu-
je natrag u presinaptički kraj neurona, gde se koristi za sintezu novih molekula acetilholina.
Ovakvu adaptaciju p-adrenergičnog receptora izaziva povećana koncentracija cAMP-a u ćeliji, bez obzira na to
da li je cAMP stvoren pod dejstvom adrenalina ili nekog drugog hormona koji deluje posredstvom istog drugog
glasnika.
Zbog toga, drugi signalni molekuli ne mogu da dovedu do adaptacije ovog tipa.
\
21-30 Opšta biohemija
smanjuje aktivnost protein-kinaze A, a time i fosforilaciju nekoliko vrsta jonskih kanala, što dovodi do
smanjenja električne aktivnosti neurona. Ako su ćelije duže vreme izložene visokim koncentracijama
morfina, dolazi do kompenzatorne aktivacije ekspresije gena za protein-kinazu A i adenilat-ciklazu,
čime se nivo cAMP-a u ćeliji vraća na normalu, čak i u prisustvu morfina. To povećava i potrebnu
dozu supstance kojom se postiže isti inhibitomi efekat. Ovaj mehanizam adaptacije objašnjava i po
javu apstinencijalnih simptoma. Ako naviknuta osoba naglo prestane sa unošenjem morfina, gubi se
njegov inhibitomi efekat na adenilat-ciklazu i protein-kinazu A, pa zbog visokih koncentracija ovih
enzima dolazi do velikog porasta nivoa cAMP u neuronima. To povećava električnu aktivnost neuro
na i prouzrokuje pojavu vrlo neprijatnih simptoma, kao što su nemir, znojenje, drhtanje, halucinacije
itd.
Literatura
1. Alberts O, Bray D, Levvis J, Raff M, Roberts K, VVatson J. Molecular Biology of the Cell, Garland
Publishing, NewYork, 1994.
2. Baynes J, Dominiczak MK. Medical Biochemistrv, Mosby, London, 1999.
3. Budecke E. Grundriss der Biochemie, VValter de Gruvter, Berlin, 1989.
4. Champe PC, Harvey RA. Lipincott's llustrated Revievvs: Biochemistry, Lipincott-Raven, Phila-
delphia, 1994.
5. Devlin TM. Textbook of Biochemistry, Wiley-Liss, New York, 1997.
6. Dow J, Lindsay G, Morrison J. Biochemistry, Molecules, Cells and the Body, Addison-Wesley,
VVakingham, England, 1996.
7. Elliott WH, Elliott DC. Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, Oxford,
1997.
8. Frayn KN. Metabolic Regulation, A Human Perspective, Portland Press, London, 1996.
9. Loeffler G, Petrides PE. Biochemie und Pathobiochemie, Springer Veriag, Berlin, 1997.
10. Martin DW, Mayes PA, Rodwell VW, Granner DK. Harperov pregled biohemije, Savremena ad
ministracija, Beograd, 1989.
11. Matić G. Osnovi molekularne biologije, Zavet, Beograd, 1997.
12. McKee T, McKee JR. Biochemistry, An Introduction, VVm. C. Brovvn Publishers, , Boston, 1996.
13. Motulsky V. Human genetics, Problems and Approaches, Springer Veriag, Berlin, 1997.
14. RiggsT, ChandlerAM, Biochemistry, Springer Veriag, Berlin, 1995.
15. Roskoski, R. Biochemistry, W. B. Saunders, Philadelphia, 1996.
16. Voet D, Voet JG. Biochemustrv, J. Wiley and Sons, New York, 1995.