IZOLACIJA BAKTERIJA IZ PRIMARNO STERILNIH KLINIČKIH UZORAKA

(likvor, hemokultura)

PRETRAGE LIKVORA
Ključne su u dijagnozi infekcija središnjeg živčanog sustava.
Cerebrospinalni likvor dobiva se lumbalnom punkcijom u strogo aseptičnim
uvjetima.
Uzorak treba sakupiti u sterilne epruvete sa čepom na navoj.
Likvor je dragocjen uzorak koji treba dostaviti u laboratorij odmah.
Ako je moguće dobiti više od jedne epruvete (1 ml svaka) na mikrobiološku
analizu treba poslati drugu ili treću, onu koja je manje krvava.
U slučaju da je moguće dobiti samo jednu epruvetu onda se ona prvo
prosljeđuje u mikrobiološki (a zatim u biokemijski ili citološki) laboratorij.
Ukoliko je dostava odgođena uzorak za bakteriološku i/ili mikološku analizu
pohraniti na 37°C.
Pored klasičnih metoda kultivacije likvora, brzim testovima, kao što je lateks
aglutinacija, mogu se detektirati antigeni najčešćih bakterijskih uzročnika
meningitisa: H. influenzae tip B, S. pneumoniae, Escherichia colli K1,
N. meningitidis i S. agalactiae (BHS-B).
Iz uzoraka likvora moguće je utvrditi uzročnika i detekcijom nukleinske kiseline
polimeraznom lančanom reakcijom (PCR postupak).
Uzorak likvora može u nekim slučajevima poslužiti i za neizravnu dijagnostiku tj.
dokaz specifičnih protutijela.
OBRADA KRVI - HEMOKULTURA (HK)
Metoda otkrivanja mikroorganizama u krvi, a podrazumijeva kultivaciju krvi na
bakteriološkim podlogama (bočica s hranjivim bujonom + smola).
Krv se uzima iz periferne vene ili iz i.v. katetera (istodobno s perifernom krvi).
Udio krvi u odnosu na udio hranjivog medija u bočici za HK iznosi 10%.
Uvijek se, isti uzorak krvi, stavlja u dva sustava (dvije bočice) za izolaciju:
aerobni i anaerobni tzv. set hemokultura koji se unosi u aparat kojem su
određeni svi parametri inkubacije (vrijeme, temperatura, i dr.).
Princip rada aparata temelji se da mikroorganizmi pri rastu stvaraju CO2.
Kemijski senzor osjetljiv na CO2 mjeri njegovu prisutnost svakih 10 minuta.
Aparat je spojen na računalo koje daje optički i zvučni signal prikazujući poziciju
pozitivne bočice.
Pozitivnu bočicu vadimo iz aparata i radimo mikroskopski preparat koji bojimo
po Gramu i kultiviramo na različitim hranilištima koja inkubiramo 24h u
aerobnoj i/ili anaerobnoj atmosferi.
Radimo hitni antibiogram izravno iz pozitivne bočice i javljamo preliminarni
nalaz na klinički odjel.
Nakon 24h očitavamo nasađena hranilišta i izrađujemo biokemijski niz za
identifikaciju uzročnika i antibiogram iz porasle kulture.
Nakon 48h završavamo nalaz s identifikacijom i antibiogramom uzročnika.
Optimalno izvođenje ove mikrobiološke pretrage ovisi o vremenu uzimanja krvi,
broju uzetih uzoraka, pridržavanja principa antisepse prilikom uzimanja i
manipulacije uzorcima, količine uzete krvi, osobinama hranilišta, sustavu koji se
koristi za otkrivanje porasta uzročnika i mogućnosti kliničara da protumači
dobivene rezultate.
Pravilno izvođenje i tumačenje rezultata hemokulture zahtijeva poznavanje
kliničkih i mikrobioloških aspekata sepse.
S jedne strane, uzročnici kliničkog sindroma sepse mogu biti i neinfektivni
agensi, a s druge strane, prisustvo živih mikroorganizama u krvi ne mora značiti
sepsu.
 GRAM NEGATIVNI KOKI I KOKOBACILI
Neisseria -Mikroskopski su to gram negativni diplokoki oblika zrna kave koji se
često vide intracelularno unutar polimorfonuklearnih stanica.
Osjetljivi su na vanjske uvjete te uzorke za kultivaciju treba slati u transportnom
mediju i što prije ih treba nasaditi na obogaćene hranjive podloge u vlažnoj
atmosferi s 3-5% CO2.
Uzorci kontamminirani fiziološkom florom nasađuju se na selektivne podloge.
Osnova su identifikacije testovi oksidaze, katalaze i oksidacija šećera.
Patogene najserije N. meningitidis (meningokok) i N. gonorrhoeae (gonokok)
povezane su s jasnim kliničkim slikama, meningokoknom sepsom i
epidemijskim meningitisom, odnosno spolno prenosivom bolešću gonorejom.

Laboratorijska dijagnostika: Iz primarno sterilnih uzoraka priređuju se preparati

koji se boje po Gramu i metilenskim modrilom i odmah mikroskopiraju.
U neutrofilima i izvan njih nađu se tipični gram negativni diolokoki.
Likvor i krv se nasađuju na obogaćena hranilišta (krvni i čokoladni agar) i
kultiviraju u CO2 atmosferi.
Za izolaciju najserija iz uzoraka koji sadrže popratnu normalnu floru (npr.
meningokok iz brisa nazofarinksa) koriste se selektivna hranilišta s dodatkom
antibiotika kolistina i vankomicina – Thayer Martin-ov agar.
Kako su patogene najserije osjetljivi i zahtjevni mikroorganizmi preporuča se
uzorak odmah obraditi, a nikako čuvati u hladnjaku na niskim temperaturama,
Najbolje je uzorke odmah nakon uzimanja saditi na zagrijanu podlogu.
Najserije su katalaza i oksidaza pozitivne, a pojedine se vrste razlikuju na
osnovu razgradnje šećera: gonokok stvara kiselinu iz glukoze, a meningokok iz
glukoze i maltoze.
Prisustvo antigena meningokoka u krvi ili likvoru može se dokazati brzim
testom lateks-aglutinacije.
Na tržištu postoje komencijalni hibridizacijski i amplifikacjiski testovi za dokaz
N. gonorrhoeae.

Moraxella -Najznačajnija vrsta unutar roda je M. catarrhalis.

Komenzal je mukoznih površina i uzročnik oportunističkih infekcija dišnog
sustava.

Laboratorijska dijagnostika: Ova asaharolitična bakterija dobro raste na

uobičajenim hranilištima, kolonije su bez hemolize, blijedo ružičaste boje.
Bakterija producira enzime DNA-zu, oksidazu i katalazu te betalaktamazu.
U mikroskopskom preparatu su vidljivi gram negativni koki.
PRAKTIČNI RAD:

1. Opisati porasle kolonije na krvnom agaru u čistoj kulturi; odrediti vrstu hemolize

Morfologija

Veličina

Oblik

Rub

Uzdignutost

Hemoliza

Pigment

Kolonije suspektne na?

2. Samostalno izradi I mikroskopirati mikroskopski preparat po Gramu i Loeffleru

A B C

Povećanje: _______ Povećanje: ________ Povećanje: _______

Bojenje: _________ Bojenje: __________ Bojenje: _________

Bakterija: ________ Bakterija: _________ Bakterija: ________
A B C

Povećanje: _______ Povećanje: ________ Povećanje: _______

Bojenje: _________ Bojenje: __________ Bojenje: _________
Bakterija: ________ Bakterija: _________ Bakterija: ________
3. Pročitati tekst s početka i prema svojim rezultatima zabilježi očekivane rezultate za
Test oksidaze:
Test/kultura

Oksidaza

4. Pročitati tekst s početka i prema svojim rezultatima zabilježi očekivane rezultate za

Test DNA-ze:

Kultura

DNA-za test

5. Pročitati tekst s početka i prema svojim rezultatima zabilježi očekivane biokemijske

aktivnosti

Biokemijski
test/Kultura

glukoza

maltoza

laktoza

saharoza

PITANJA:
Neisseria meningitidis dobro raste na hranjivom agaru na 37°C/CO2. DA NE
Moraxella catarrhalis je DNA-za pozitivna. DA NE
Saprofitne najserije rastu ukoliko se inkubiraju na sobnoj temperature. DA NE
Neisseria meningitidis fermentira šećere glukozu i maltozu. DA NE
Koja se podloga koristi za izolaciju meningokoka i gonokoka? __________________________
Kod sumnje na meningokokni meningitis ili gonokokni uretritis klinički materijal se za vrijeme
transporta do laboratorija mora pohraniti u frižider (4°C) DA NE