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    Diagnéstico Microbioldgico Elmer W. Koneman PS) cron Paral TITTY etn Paul C. Schreckenberger A VEtsaiie| rk ORn | Lt NEDSi Diagnostico icrobiclogico Texto e Atlas Colorido Quinta Edigéo Eur W. KONEMAN, M.D. CChefe de Segl0 do LaboratGrio de Microbiologia Departamento de Patologia Veterans Affairs Medical Center Professor de Patologia University of Colorado School of Medicine Denver, Colorado STEPHEN D. ALLEN, M. D. Professor de Patologia Indiana University School of Medicine Diretor da Divisio de Microbiologia Clinica Indiana University Hospitals Microbiologista Clinica Wishart Memorial Hospital e Roudebush Veterans Affairs Hospital Indianapolis, Indiana WILLIAM M. JANDA, PH. D. Professor Associala ce Patologia Diretor Associado do Laboratio de Microbiologia Clinica ‘The University of Minois College of Medicine:at Chicago Chicago, Ilinois PAUL C, SCHRECKENBERGER, PH. D., M. S. Professor Associado de Patologia Diretor do Laboratério de Microbiologia Ciinica The University of Tlinois College of Medicine at Chicago Chicago, Mlinois WASHINGTON C. WINN, JR, M.D., M.B.A. Professor de Patologia University of Vermont College of Medicine Diretor do Laboratrio de Microbiologia Clinica Flecher Allen Health Care Burlington, Vermont Tradugio e Supervisio. ARLETE EMILY CURY Livre Docente Faculdade de Citacias Farmactuticns da Universidade de ‘Sto Paulo, Disciplina de Parasitologiae Micologia Cinica Professor Associado de Purasitologia e Micologia Clinica 2001 NEDSi PRANCHA COLORIDA 2-1 AVALIACAO DE ESEREGACOS DE ESCARRO POR COLORACAO DE GRAM [A qualidade das amostras de escarro pode ser avaliada mediante contagem do nimero relativo de células epteiais de descamagio e neutrfilos segmentados por campo de bai- xo poder de resolucio em um esfregago submetido & coloragio de Gram. A presenca de ‘élulas epteiais de descamagao indica contaminagio com secreg¥es orofaringeas. Em ‘contrast, uma pneumonia bacteriana produ. grande quantidade de neutrfils sepmenta- dos no escarro. A seguir, enconiram-se fotomicrografias de esfregagos de amostra de es- «arto corados segundo a técnica de Gram, ilustrando a presenga relativa dos virios com- ponentes celulares Observacio com menor aumento de um esfregago de escarro mostrando um campo com células eptelais de deseamagdo e auséncia de neuttfilos segmentados. Esta amostrare- presenta saliva, pode dar uma contagem de baixa qualidade ¢ no € acetével para cultiv. A céula epitetial de deseamagio observada aqui encontra-se intensamente colonizada com baetérias gram-postvas. sobrecreseimento de eélulas bacterianas em amostras de éscarro em geral indica que a amosrasofreu uma demora no transport ao laboratro ¢ ‘qualquer resultado semiquanttativo ter pouco valor. Est eslregago de escaro corado com Gram mostra uma mistura de células de descamagio « neutr6filos segmentados. A presenga de neutrdfilos segmentados indica que existe um foco de infecgdo em alguma parte do tratorespratrio; entretanto, as célulasepitelais de descamagao indicam contaminago com secregdes do trato respiratério superior. Este tipo de esfregago de escao & de dificil interpreta, porque as infecgBes do tratorespratério superior ndo podem ser dferenciadas das infecgdes do tratorespiratGro inferior. Campo repleto de neutréfilos ¢ virtual auséncia de célulasepiteliais de descamagdo. Esta ua amostra de escaro de alta qualidade, que formece uma boa oportnidade para pro- Auzie resultados relevantes, Observagdo com maior aumento da amostra D, mostrando neutéfilos segmentados dis- persos conra um fundo de fios de mucinacorados em rosa Esfregago de uma amostra de escarro induzido corada com Diff Quick, mostrando vérias «élulasepitelais colunaresciiadas. Estas eélulas tim origem no trato respiatério inferior «quando presentes em um esfregaco de escaro, como se mostra aqui, indicam uma amostra de alta qualidade a partir da qual podem ser obidos resultado potencalment elevates. Observago com maior aumento de um esfregago corado com Gram ilustrando a morfolo- gia de uma eélulaepitlil colunarciliads. Observam-se 0s niidoseflios encimando ;oreio terminal em forma de chama desta célula epitlial colunar de colorago eosin, CColoragio com azul-de-toludina de um amostra de escaroinduzido mostrando étulas mo- ‘nonucleares inflamatéras consistentes com macrfagosalvelares. Como a céulasepiteliais colunares ciliadas, os macrfagos alveolares tm origem em sitios profundos do tratores- Piratrio inferior, e « presenca deles em amosas de escaro aumenta a importincia de qualquer espécie bacteriana isolada F PRANCHA COLORIDA 2-2 Diversas COLORAGOES UTILIZADAS EM MICROBIOLOGIA ‘Visto que muitos dos organismos de importancia médica possuem indices de refragio pré- xximos ao da gua, sio necessérias coloracdes para tornar possiveis a detecgdo e o estudo deles. Ao longo dos anos desenvolveu-se uma variedade de coloragdes, cada uma das quais planejada para pir em evidéncia organelas intemas ou componentes especiticos da parede cellar. As seguintes si iustrages de coloragdes selecionadas e de algumas de suas api cagies, Coloragéio de Gram. fx mais comaumn das coloragSesuilizadas no Inbocatécio de microbi- logia. Foi planejada para diferenciagdo entre as bactérias que podem reter 0 corante cristal violeta, apresentando cor negro-azulada intensa apes a descoloragdo (gram-positi- vas), €aquelas que nao retém o corante e apresentam cor vermelha (gram-negativas). Aqui 8 encontra ilustrada uma preparagio corada com Gram, que mostra bacilos gram-negati- vos corados em vermelho. Coloragdo para dcido-resisténcia. Esta colorado ¢ tilizada comumente para evidenciar dliversos microrganismos resstentes a0 dcido, incluindo espécies de Nocardia em amos- tras de escaro e oncistos de Crypiosporidium em amostras de fezes. Aqui io mostrados _grupos de bacilos dcido-resistentes,corados em vermelho, em uma amostra de bidpsia de figado de um paciente com AIDS. Estes microrganismos aparecem em vermelho com a coloragdo para dcido-resisténcia, ¢ 0s mostrados aqui foram idemtficados como perten- centes a0 complexo Mycobacterium avivun-intracellulare. Fluorescéncia direta. Os corantes fluorescentes (rodamina e auramina) reagem direta- ‘mente com a parede celular das micobactéras. Também se encontram disponiveis anticor- pos conjugados com fluoresceina para pdr em evidncia uma variedade de agentes micro- bianos mediante o uso da prova de fluorescéncia direta de anticorpos. Aqui sio mostradas ‘icobactérias com fluorescéncia verde-amarelado em uma amostra concentrada de escarro de um paciente com tuberculose pulmonar. Laranja de acridina. Esta coloragdo fluorescente¢ utiliza para evidenciar formas bacte- Fianas em esfregacos diretos e montagens de Iquidos biol6gicos. E particularmente para detectar bactérias gram-negativas em cultivos positivos de sangue em meio liquide, ‘que podem passar despercebidas nas coloragBes com Gram devido ao fundo de restos celulares corado intensamente em vermelho. Aqui € mostrada uma bactéria longa, em forma de bastio, com um brilho alaranjado caractefstco quando observada com um mi- croscepio de fMuorescéncia Acul-de-metileno, Esta coloragdo inespecitica ¢répida ¢utilizada para evidenciarbactérias «© outros microrganismos em esfregagos diretos, Aqui sio mostrados bacilos que incorpo- ram 0 corante. Uma aplicacio importante é a deteccao de bactérias em esfregagos dietos de liquido cefalorraquidiano, em casos suspeitos de meningite aguda, em particular por especies gram-nevativas que poderiam ser obscurecidas pelo fundo de material protéico corado em vermelho. Branco de calcoftior. Este agente branqueador autofluorescente tem a propriedade de acoplar-se a residuos de carboidratos nas paredes celulares dos fungos. Aqui So mostra- das hifas coradas em verde-amarelado brilhante, por coloragio direta de uma montagem com branco de calcoflior, como observadas com um mieroscdpio de fluorescéncia, Wright-Giemsa, Esta coloragdo & comumente uilizada para evidenciar os elementos celu- lares em esfregagos de sangue periférico e medula dssea. Em microbiologia, esta colora- io € empregada com frequéncia para detectar parasitos intra-ritrocitios (plasméios, babesias) e exoeritrocirios (tipanossomas, microfléia),inclusdes de clams e, como ‘se mostra aqui, formas de leveduras intracelulares de Histoplasma capsulatum. Acido periddico de Schiff (PAS). Esta coloragio geral¢ uilizada para evidenciar paredes celularesricas em polissacarideos. E aplicada especificamente para detectar fungos em cortes de tecido ¢ em esfregagos. Aqui € observado o corpo de fratticagdo de uma espécie de Aspergillus rodeado por conidios corados em vermelho, em um esfregaco de aspirado de lesdo pulmonar, EB BR PRANCHA CULUKIDA 2-5 IDENTIFICAGAO PRESUNTIVA DE BACTERIAS COM BASE NA OBSERVAGAO DA MORFOLOGIA As COLONIAS (0s microbiologistas ullizam diversas caractersticas das colOnias bacterianas que ctescem na superficie de meios de cultura de égar para efetuar uma identficagdo presumtiva do {rupo ou genero, e como guia para selecionar provas diferenciais para estabelecer a iden- lifieago final da espécie. Os crtérios comumente empregados so tamanko, forma, con- sistencia, cor, produgio de pigmento presenga de reagtes hemoliticas em gar sangue, Placa de dgar sangue com crescimento de colOnias aredondadas, branco-amarcladas ists, convexas enio-hemlitcas,sugestivas de Staphylococcus. Coldnias em égar sangue rodeadas por ntidas zonas de B-hemélise. A relago entre tama- rho das coldnias e as zonas de hemélise é utilizada para diferenciago entre algumas expécies. Aqui sio mostradas espécies de Streprococcts, que em geral possuets um valor baixo para a relagdo entre tamanho de coldnia € zona hemolitica, em contaste com as expécies de Staphylococcus, nas quais 0 tamanko rlativo das colOnias ¢ geralmente maior. Placa de égar sangue que mostra a descoloracio esverdeada do meio, caracterfstca da auchemélise. Nesta placa so observadas as clGnias diminutas de Streptococcus viridans com grandes zonas de o-hemélise Colénias opacas, acinzentadas e algo tmidas em dgar sangue (esquerda) edgar MacConkey (Gireita),sugestvas de um dos membros da familia Enterobacteriaceae, O crescimento em gar MacConkey ndo mostra pigmentapio vermelha, indicando que 0 microrganisme n20 6 fermentador de lactose. As col6nias mostradas aqui pertencem a uma espécie de Salmo- nella. CCotdnias secas ¢ rugosas de uma espécie de Bacillus. Colnias de aparéncia similar Sio “observadas em Pseudomonas stutzeri. ‘Colénias de pigmentagio amarela em dgar sangue, A produgio de pigmentos € uma carac- teristica importante na idemtficagdo diferencial de muitas espécies de bactrias,partion- larmente as pertencentes a varios grupos de bacilos nio-fermentados. As colGnias obser- vadas aqui sio de Flavobacterium, desenvolvidas apds 48 horas de incubacio, sendo as ‘ikimas 24 horas & temperatura ambiente. A intensidade do pigmento pode acentuar-se ‘ap6s uma incubagéo adicional & temperatura ambiente Colénias nitidamente mucdides em ‘gar sangue. De modo geral, a consisténcia mucGide das colonins € secundéria & produgio de cépsulas, um mecanismo de protegio utilizado por muitas espécies de bactérias para defesa contra a fagocitose. Espécies de Pseudomo- has, Klebsiella pneumoniae, Sirepiococcus pneumoniae © Cryptococcus neoformans es- tio entre as espécies de microrganismos produtores de col6nias mucdides isoladas com mais freqiéncia, As colénias observadas sio de Streptococcus pneumoniae. Coldnias cinzas, semitranshicidas de Eikenella corrodens em égar sangue. Observar © halo que aparece ao redor das col6nias ilusrando o “fossete” caraceristico da espécie. Colénias cinzas, lisas ¢ semitransparentes de Capnocytophaga oclracea. Observar a ex- tensio ncbulosa das eol6nias, que ilustra a motilidade caractrfstica das espécies de Cap- nocytophaga. Colonia branca e seca de espécie de Nocardia. As espécies de Streptomyces produzem colénias de aparéncia similar, Essus idemificagdes presuntivas podem ser confirmadss {quando se detect o odor de “ambiente mofado” caractristicn dessas espécies. PRANCHA COLORIDA 2-4 IDENTIFICAGAO PRESUNTIVA DE BACTERIAS COM BASE NA OBSERVAGAO MICROSCOPICA, DA MORFOLOGIA CELULAR EM ESFREGACOS CORADOS A coloragio de Gram para bactérias, além de outras téenicas de coloragio, € uma das determinagdes mais importantes para a identficagdo presuntiva de microrganismos. A rmorfologia das células bacterianas, sua onganizacao e caracterfstcas tintorais slo, com freqléncia, suficientemente distintivas para permitir uma identificagao presuntiva em um esfregago corado com Gram, Nesta prancha estio inclufdas as caracteristicas microscépi- cas sugestivas de vatios grupos de bactérias. Bacilos gram-negativos relativamente delgados, dispostos em letras chinesas, que suge- rem uma das espécies de bactéras corineformes (diftersides). Bacilos esporulados gram-positivos. Estes hacilosformalores de esporo em aerobiose per- tencem ao género Bacillus; os formadores de esporos em anaerobiose pertencem ao genero Clostridium. Aqui sio mostradas eélulas esporuladas de Bacillus sphaericus. Coloragio de Gram direta de um exsudato purulento que mostra cocos gram-positivos dispostos em eachos pequenos, caraceristicos das especies de Staphylococcus. Esfregago direto de exsudlato de um caso de mionecrose. Os minisculos cocos gram- Positivos observados nesta fotomicrografia so estreptococos. ‘Coloragao direta com Gram de um esfregago de escarro purulento que mostra diplococos _gram-positvos,caractersticos de Streptococcus pneumoniae Exsudato purulento proveniente da parede toricica de um paciente com empiema agudo supurativo, Séo observados numerosos bacilos gram-positivos ramificados contra um fun- do de neutrofilos segmentados. As espécies de Actinomyces e Nocardia podem apresentar aspectos similares a este; entretanto, neste aso, foi isolada uma espécie de Bifidobacte- rium em cutivo puro, em anaerobiose. Preparagio corada com Gram de um esfregago de sedimento urinério em um caso de cistte aguda. Observar a presenga de varios bacilos gram-negativos contra um fundo de neutrofilos segmentados. Neste caso foi isolada Escherichia coli em culivo puro. Coloragio de Gram de um esfiegaco preparado a partir de um exsudato uretal purulento de um homem sexualmente ativo, mostrando diplococos intracelulares gram-negativos, ‘caracteristicos de Neisseria gonorrhoeae. Nesta fotografia, as células bacterianas aparecem mais pélidas do que se observa normalmente através do microsc6pio. Fotomicrografia de um esfregago de escarro mostrando um fundo com poucos neutréfilos segmentados, assim como um infiltragao difusa com muitos bacilos gram-negativos cur- tos, alguns dos quais apareceram rodeados por um halo. No cultivo cresceu Klebsiella pneumoniae. Fotomicrografia de filamentos gram-positivos delicados, ramificados, sugestivos de uma espécie de Actinomyces. No cultivo cresceu Propionibacterium acnes. iF PRANCHA COLORIDA 4-1 IDENTIFICACAO PRESUNTIVA DE ENTEROBACTERIACEAE A identificagao presuntiva de Enterobacteriaceae se baseia no aspecto das colénias que crescem em meios de isolamento primérios e na determinagio de certas caracteristicas bioguimicas. Por definigao, para que um microrganismo possa ser clasificado dentro da familia Enterobacteriaceae, deve fermentar a glicose, para produzir dcido ou dcido e gis, reduzt ntratos @ ntvitos e no apresentaratividade de citocromo oxidase. CColoragio de Gram de um esfregago de escarro que mostra os caracterstcos bacilos gram negativos cutos, oligos, tipcos dos membros da familia Enterobacteriaceae. Tarnbém so observados leucécitos polimorfonucleaes, que sugerem a ocorténcia de um processo in feecioso no paciente. Neste caso, 0 cultivo confirmou a presenga de K, pneumoniae Cultivo misto de um crescimento de 24 horas em far sanzue de dois morfotipos de gran- des bacilos gram-negativos e um terceiro morfotipo correspondente a um microrganismio ‘menor, o qual pode ser suspeitado como uma espécie gram-posiiva, Um dos morfotipas apre- senta colonia grandes, brilhantese brancas, enquanto que 0 outro mostra coldnias grandes, acinzentadas, com bordasiregulares. Amos otipos de coldnas so suspeitos de pertencerem a bacilos gram-negatvos tipicos des memibros de Enterobacteriaceae. Também sao observa das muitas coldnias pequenas, brancas,lsas, tpieas de um dos cocos gram-positves. Col6nias grandes, rosadas, muccides, brilhantes, em Sgar MacConkey, tpicas de espécies, de Klebsiella Enterobacter. Apenas por seu aspecto esas colGnias so suspetas de perten- cerem 2 familia Enterobacteriaceae Aspecto invasor de uma espécie mével de Proteus em uma placa de égar chocolate. ‘Uma sétie de tubos de gar ferro Kligler (KIA) inclinado ou em pico, que apresentavétios tipos de reagdo. O tubo da extrema esquerda mostra um pico écido (amarelo) ¢ um fundo fcido (amarelo), que indica fermentago tanto da glicose como da lactose. Notar também ‘ espaco vazio que existe no fundo do tubo a ruptra do égar no centro dest, que indica ‘produgio de gis (CO,) pelo microrganismo. Grandes quantidades de CO,, como as obser- vvadas aqui, sio prodizidas habitualmente apenas por microrganismos pertencentes & Tribo V (Klebsielleae). 0 segundo tubo da esquerda mostra uma reago écida/écida, mas sem presenca de gas, tipica de E.coli. O terceiro tubo apresenta um pico alealino (vermelho) € um fundo écido, eagio caracterstica de um nao-fermentador da lactose. O quarto tubo tem um pico vermelho/fundo negro que indica produgio de sulfeto de hidrogénio (H,S). ‘Quando se observa este tipo de eagio em um microrganismo oxidase-negativo, presume ‘se que a porgdo profunda do gar seja écida (amarela) o que indica fementagao da glico- ‘se, mesmo que a cor amarelaesteja mascarada pela produgao de H,S. A reagio do quinto tubo (extrema direta) vermelho‘vermelho & tipica dos bacilos gram-negativos nao-fer- ‘mentadores, que nio fermentam glicose nem lactose. ‘Trés tubos de caldo com tubos de Durham para demonstra a produglo de gis. Os dois tubos da dieita mostram formagao de scido a partir da glicose (amarelo) em comparagio com o controle negativo da esquerda. O tbo da extrema dieita mostra a colegao de gs n0 interior do tubo de Durham, caracterstica de um microrganismo que produz.écido € gs @ partir da glicose, Prova da citocromo oxidase apresentando uma reacio positiva decor pirpura (esquerda), ccomparada com uma reagao negativa a direita (ndo aparece cor azul em 10 segundos - ver Protocolo 16). Qualquer microrganismo que reaja positivamente pode ser excluido da fi- rilia Enterobacteriaceae. Meio de provas para nitratos com tubos de Durham para demonstrat a formagio de nitro- sgénio gasoso. O tubo da esquerda mostra uma reagio positiva (vermelho) apés adicio de cnafilamina e fcido sulfanitico, © microrganismo em estudo reduzi os nitratos, contidos no meio, nitrites, que reagiram com os reativos para formar o pigment vermelho p-sulfo- benzeno-270-0cnaftilamina (ver Protocolo 53). © tubo tambxém mostra uma reaedo positiva para nitratos, mas neste caso ap6s redugdo dos nitratos a nitrtos, estes por sua vez foram reduzidos a nitrogénio gasoso, indicado pela colegdo de gés dentro do tubo de Durham, Como neste caso nao existem nitrtos no meio, ndo ocorre desenvolvimento de cor verme= Tha pss adicio dos reativos. O tubo da extrema direita mostra auséncia decor vermelha © de gis, epresentando uma reagdo negativa para redugdo de ntratos PRANCHA COLORIDA 4-2, ASPECTO DE COLONIAS DE ENTEROBACTERIACEAE EM AGAR MACCONKEY & EMB O gar MacConkey e o gar eozina-azul-de-metileno (EMB) sio dois meios seletivos de isolamento primério utilizados habitualmemte para a diferenciagdo presuntiva de ‘membros fermentadotes de lactose da familia Enterobacteriaceae. No digar MacConkey 8s col6nias que fermentam lactose aparecem em vermelho devido & conversio écida do indicador vermelho neutro. Em gar EMB, as espécies que fermentam intensivamente 4 lactose mostram um brilho verde-metélico, com produgio de suficiente écido para evar o pH a aproximadamente 4,5 ou menos. ‘A. Superfcie de égar MacConkey com um erescimento de 24 horas de colOnias verme- Ins, fermentadoras de lactose, A cor vermelha difusa no égar é produzida por micror- ‘ganismos que fermentam com intensidade a lactose, produzindo grande quantidade de ‘cidos mistos e previpitagio dos sais bliares do dgar que euvolve us clOnias (p.eX., Escherichia coi. B, Superfcie de égar MacConkey que mostra coldnias vermelhas de fermentadores de lactose ecolénias menores, ransparentes, de no-fermentadores de lactose Ce D. Superfcie de placas de égar EMB que mostram o brilho verde produzido por membros das Enterobacteriaceae que fermentam intensivamente a lactose (ou a sacarose). A maioria das cepas de E. coli forma coldnias com este aspecto em dar EMB, e como E, oli se encontra entre os isolados mais frequentes de amostras clinica, o aspecto des- sa8coldnias pode servir para a sua identificagdo pesuntiva, Entetanto,outras caracte- ristcas devem ser determinadas além da coloragéo verde em Agar EMB, antes da iden- tiffeagao definitva de um microrganismo como E. coli, porque outras Enterobacteria- eae fermentadoras de lactose podem ter um aspecto similar. Ee F. Superfcie de placas de (gar EMB que ilustram um cultivo misto de E.coli (coldnias com brilho verde) e de espécies de Shigela. A maioria das especies de Shigella ndo fermenta a lactose e, poranto, em dgar EMB produzem coldnias sem pigmentacio, semitransicidas. Outras espécies incapazes de fermentar lactose produzem colénias de aspecto similar aos destasfotografas c EB PRANCHA COLORIDA 4-3 ASPECTO DE ENTEROBACTERIACEAE EM PLACAS DE AGAR XLD E HE Habitualmente em laboratérios de microbiologa clinica sioullizados véros tipos de meios mais seletivos que o égar MacConkey ou oégar EMB para isolar membros seleconados de Enterobacteriaceae. O gar xlose-lisina-desoxicolato (XLD) e gar entrico de Hektoen (HE) sio 0s mais empregacos: os meios altamente seletivos, como o gar sulfato de bismuto, so uilizados apenas para aplicagSes especis. Estes meiosndo s6permitem diferencia mi- crorganismos fermentadores de lactose dos ndo-fermentadores, como também detectar microrganismos produtores de sulfeto de hidrogénio (HS). Superfcie de égar XLD que mostra a viragem do gar por colénias de E. coli produtoras de dcido, ‘Colonia nto-fermentadoras de lactose (noha conversao écida no meio) de uma especie de Salmonella na superticie de égar XLD. Observar a cor negra de algumas coldnias, indicando producio de H,S. Placa de égar XLD semeada com uma mistura 50/50 de Ecol e de espécies de Salmone- 1a. Observar o desenvolvimento preponderante das espécies de Salmonella (colGnias ver- melhas) em comparagio com as poucas colnias amarelas fermentadoras de lactose de E. coli que foram efetivamente inibidas. 0 evidente halo rosado ao redor das coldnias de Salmonella indica descarboxilagio da lisna,caratetstica il para diferenciar as espé- cies de Salmonella (positivas) das espécies de Proteus produtoras de H,S. Placa de égar XLD semeada com uma cepa produtora de H,S de uma espécie de Proteus. Observar a auséncia de halo rosado ao redor das colOnias,o que indica que no hi descar- boxilagio de sina (comparar com as colénias em C). Superfcie de égar HE que iluta a produgo de écido (amarelo) por col6nias de E.coli. Superticie de égar HE que mostra as coldnias esverdeadas (incolores) de uma Enterobac- terlaceae ndo-fermentadora de lactose. CeD. B PRANCHA COLORIDA 4-4 (CARACTERISTICAS DIFERENCIAIS DE ENTEROBACTERIACEAE. A prova de orto-nitrofenil-B-D-galactopiranosfdeo (ONPG) mostra uma reagdo positiva(ama- relo},(@esquenda), em comparagio com um controle negativo (2 direiia). Uma reagao posit Va indica que o microrganismo é capaz de produzir B-galactosidase, enzima necesséria & de- gradacio inicial da lactose, liberando 0 orto-nitrofenol amarelo para o mei ‘Tubo de égar semi-solido de sulfeto-indol-motilidade (SIM) (2 direita)e pico de égar ferro Riigler (KIA), (@ esquerda), os quais mostram as diferengas de sensibilidade para detecga0 de H,S por diferentes meios. O emagrecimento delicado e difuso no tubo SIM € produzido por tum microrganismo mével e fracamente produtor de HS (neste caso 5. typhi), Observar que 0 H,S produzido no tubo KIA, menos sensivel, aparece apenas na porgio média do meio, na interface entre 0 pico 0 fundo, um aspecto tipico de S. typhi neste dar ‘Quatro tubos que mostram as provas de indol (I), vermelho de meta (MR), Voges-Proskauer (VP) ¢ citrato (C). Quando reatizadas simultaneamente, estas quatro provas constituem as clissicas eagdes IMViC. A formagio de indol a partir de triptofano ¢ indicada pelo apareci- ‘mento de uma cor vermelha apés adigdo do reativo de Kovac (‘who da extrema esquerda, C). 0 aparecimento de cor vermelha no tubo MR reflete um decréscimo de pH a 4,4 ou menos, indicative da presenga de fortes fermentadores, produtores de dcidos mistos (segundo tubo da esquerda, C). A cor vermelha no tubo VP indiea presenga de acetofna (acetilmetilearbinol) produzida a partir de piruvato pela via metabslica do butileno glcol(terceiro tubo da esquerda, D), O desewwolvimento no pico do égar citrato de Simmon e a viragem do indicador azul de bromotimol para uma cor azul-alealina indicam que o microrganismo pode utilizar o citrato de séio como tinica fonte de carbono (iltimo tubo da dieita, D). Em C, podem ser observadas as reagdes de E. coli (+ + ~~) ¢, em D, as reagdes de Klebsiella/Enterobacter (~~ + +). (0s dois tubos da esquerda ilustram, respectivamente, reagdes negativa (amarelo-pélido) € positva (verde-escuro) para fenilalanina desaminase. A cor verde & produzida pela reagao nite 0 reativo FeCl, e 0 dcido fenilpiivico presente no meio, resultante da desaminacio da fenilalanina (ver Protocolo 60). Os tés tubos da direita contém gar uréia de Christensen. O terceiro tubo a partir da direita mostra uma reagdo fortemente positiva (cor vermelha em todo 0 meio, indicando a reagioalcalina produzida pela degradagio da uréia), em comparagio com 0 controle negativo (extrema direita) completamente amarelo. A reago no segundo tubo a partir da direita (cor vermelha apenas no pico) é produzida por determinados microrganismos, como espécies de Klebsiella e certas espécies de Enterobacter, que sio fracos produtores de urease. Quatro tubos com meio de Moeller coberto com uma camada de 6leo mineral para proporci- ‘onar um ambiente anaerdbio (ver Protocolo 18). A leitura da esquerda para a direta €: tubo- controle isento de aminoscido (o crescimento & indicado pela conversio & cor amarela pela fermentagao da glicose do meio}, lisina arginina ou omitina. O indicador parpura de bromo- «resol é amarelo em pH Acido e pirpuro em pH alcalino, Portanto, qualquer tubo em que se ‘observa coloragdo ptrpura indica um pH alcalino, reagio producida por microrganismos que podem descarboxilar 0 aminodcido presente no meio, O microrganismo representado aqui € arginina-negativoe lisina e ornitina-positvo, tipica reagdo observada com E. aerogenes. 0 gar ferro-lisina (LIA) € utilizado para diferenciar microrganismos entéricos com base na ‘capacidade para descarboxilar ou desaminar a lisina e formar H,S. Os microrganismos que descarhoxilam a lisina prodhzem uma reacin alealina (pipes) no funda do égar (tubo do ‘meio). As bactérias que desaminam a lisina produzem um pico vermelho sobre um fundo amarelo (tubo a esquena). As bactérias que produzem HLS enegrecem o gar principalmente ‘a porgo média e no fundo do tubo (observar também 0 tubo & esquerda). O tubo & esquerda ‘mostra uma reagio lisina desaminase positiva elisina descarboxilase negativa. No tubo cen- tral, observa-se reagio negativa para lisina desaminase e positva para lisa descarboxilase, & no tubo & diteita, lisina desaminase ¢ lisina descarboxilase negativas. |. Tubos com meio para motilidade. Os microrganismos méveis mostram erescimento difuso ‘para fora da linha de inoculagdo por pungao (tubo da esquerda); os microrganismos imSveis ‘erescem apenas ao longo da linha de inoculacao (tubo da dieita). Pode-se utilizar também 0 meio para motiidade adicionado de cloreto de 2,3,5-trifeniltetraz6lio (TTC). O erescimento «de microrganismos capazes de reduzir o TTC aparece em vermelho a0 longo da pungao, assim ‘como nas éreas para as quais migrou, facilitando a diferenciagio entre bactérias méveis e iméveis. (Fotografia cedida por Health and Education Resources, Inc. Bethesda, MD.) PRANCHA COLORIDA 5-1 ‘CARACTERISTICAS IMPORTANTES PARA DIFERENCIAR BACILOS GRAM-NEGATIVOS NAO-FERMENTADORES, A. O tubo KIA A direita mostra uma reacio pico alcalinaffundo aleafino caracteristica de um ‘mierorganismo nio-fermentador; o tubo da esquerda mostra uma reacio pico fcido/fundo fcido, que indica fermentagio da glicose e lactose, caracteristica de muitas espécies de Enterobacteriaceae. A auséncia de produgao de Scido em gar ferro Kligler (KIA) ou em ‘gar triplice agticar-femro (TSI) indica a incapacidade de as bactérias ndo-fermentadoras Ullizarem a lactose ou a glicose no KIA (ou a sacarose no TSI). Prova de citocromo oxidase, O desenvolvimento de cor dentro de 10 segundos apés exten- so de uma coldnia em estuda sobre uma tira de papel filtro saturada com reativo para oxidase (diidrocloreto de tetrametil-P-fenilenodiamina) indica atividade de citocromo oxi- dase, uma caracteristica iil para a identifieago de muitas espécies de bactérias nio- fermentadoras. Todos os membros de Enterobacteriaceae sio citocromo oxidase-negati- vos. Incapacidade de crescer em gar MacConkey, ou uma inibigo do crescimento em gar MacConkey, é uma indicagdo de que um bacilo gram-negatvo pode ser nfo-fermentador. [Apesar de muita espécies de nio-fermentadores serem eapazes de erescer neste meio, auséncia de crescimento, como ilustrado& dreita, exclui Enterobacteriaceae,cuja ttalida- de dos membros eresce hem em Sgar MacConkey (a esquerda). Uiilizagdo oxidativa de glicose. Aqui podem ser observaclos dois tubos com meio de Hugh- Leifson de oxidagio-fermentacio (OF). O meio a direita encontra-se em contato com @ atmosfera, enguanto que o da esquerda esti coberto com éleo mineral para evitar a expo siglo ao oxigénio atmosférico. A formagio de écido (cor amarela) $6 € observada na porgdo superior do tubo sem 0 dleo, indicando que 0 microrganismo & capaz.de oxidar a slicose, mas nd de fermenté-la ‘Tubos contendo meio Motilidade B, com cloreto de 2,3.5-trifeniltetrazslio (TTC). A mo- tilidade pose ser dificil de ser observada em bactérias ndo-fermentadoras, pois os micror- ‘ganismos tendem a crescer apenas na porgo superior (principalmente aerdbia) do meio. A ‘digo de tetrazslio ajuda a detectar a motilidade, visto que os microrganismos capazes de reduzir TTC aparecem em vermelho ao longo da linha de inoculago, assim como na érea dentro da qual as eélulas migraram, 0 que toma mais fécil diferenciar entre bactérias moveis e iméveis, Placa de égartiticase-soja inoculada com uma bactéria amarela produtora de pigmen- tos. A produgao de pigmentos & uma importante caracteristicadiferencal para idemtficar bacilos gram-negativos ni-fermentadores. O microrganismo mostrado aqui € Brevundi- ‘monas vesicular. “Tubos de égar Flo e Tech inoculados com Pseudomonas aeruginosa, observados sob luz visivel. Estes meios sio tilizados para aumentar a produgio de dois pigmentos: pioverdi- na (fTuoresceina), que aparece como um pigmento amarelo que se difunde no gar Flo, piocianina, que aparece em azul-turquesa em gar Tech, Apesar de és espévies de baci- fos nfo-fermentadores produzirem pioverdina (P. aeruginosa, F fluorescens e P. putida), apenas uma espécie (P. aeruginosa) produz piocianina. TTubos de gar Flo e Tech inoculados com Pseudomonas aeruginosa, observados sob luz ultravioleta (UV) uilizando-se uma lampada de Wood, Observar que tubo de gar Flo (2 ‘esquenda) fluoresce, enquanto que o tubo de égar Tech (i direita) ni fluoresce sob a luz LUV. Apenas 0 pigmento pioverding, cuja producio é intensficada pelo crescimento do ‘njerorganismo em fgar Flo, fluoresce sob a luz UV. PRANCHA COLORIDA 5-2 PROVAS UTILIZADAS Na IDENTIFICAGAO DE BACILOS GRAM-NEGATIVOS NAO-FERMENTADORES Dois tubos de dear uréia de Christensen mostrando a cor vermelho-ficsia de uma prova positiva (direita), compa rados com um controle negativo (esquerda). Uma prova de uréia positiva, ripida (< 4 h), & observada com as seguintes espécies de bacilos nio-fermentadores: Bordetella bronchiseptica, CDC Grupo IVe-2, Oligella ureoly- tica ¢ Bergeyella zookelcum Doi tubos demonstrando a redugio de nitrato (2 esquera) ede nitrto(@direita), Ambos 08 tubos contém tubos de Durham para detectar a formagio de nitrogénio gasoso. © tubo da esquerda mostra a redugio de nitrato a nitrogénio gasoso e 0 da dieita mostra a redugdo de nitrto a nitrogénio gasoso. Observar que hi maior formagio de gis no tubo da direita,indicando a produgdo quanttativamente maior de nitrogénio gasoso a pati de nitito ue de nitrato no mesmo periodo de incubagao. A producio de gis a partir de nitrato, assim como a partir de nitrto,étipica do grupo Stutzerie de Alealigenes xylosoxidans subesp. xylosoxidans. ‘Trés tubos com caldo triptofano que ilustram uma reacio de indol negativa (esquerda), uma reagio de indol positiva (centro) e uma reagao de indol laranja (direita). Os dois tubos da esquerda mosiram o tipo de reagdes de ‘ndol positiva e negativa obtidas utilizando-se 0 método de extragio por xileno, seguida da adigao do reativo de Ehrlich (ver Protocolo 40) A reagio de indol positiva ¢ diferenciada pelo aparecimento de uma faixa vermelha na interface do caldo triptofano e a camada de xileno. Os bacilos ndo-fermentadores indol-positives incluem Baine- trix, Bergeyella, Chryseobacterium, Empedobacter, Weeksella ¢ alguns grupos CDC sem nome, Uma reagio Peculiar de indol laranja (tubo @ extrema direita) € observada quando 0 reativo de Kovac é adicionado ao ealdo triptofano que foi inoculado com Comamonas acidovorans. Esta reagio & observada apenas com 0 reativo de Kovac, ¢ se deve a formagio de dcido antranilic a partir do triptofano. A reagfo pode demorar mais de uma hora para desenvolver-se, apts a adicéo do reativo de Kovac. Quatro tubos com meio descarboxilase de Moeller coberto com uma camada de 6leo mineral. Lendo da esquerda para a direta: sina arginina, omitina, controle sem aminodcido. Com os bacilos nio-fermentadores, nas provas :negativas os meios permanecem com a cor original, enquanto que as eages de descarboxilacdo positivas apare- ccem em cor pirpura mais eseura, produridas por um pH mais alcalino no meio, devido & formagio de aminas alcalinas. A reagio positiva de lisa descarboxilase mostrada aqui ocorre apenas com duas espécies de bacilos nio-fermentadores: Stenotrophomonas maltophitia e Burkholderia cepacia, (Fotografado por Leon J. LeBeau, University of Ulinois, Chicago.) [Imagem dividida, cada uma mostrando dois tubos de dgar esculina observados sob luz visivel (@ esquenda), € 0s ‘mesmos tubos observados sob luz ultavioleta de uma kimpada de Wood (@ diveita). Quando hidrolisado por um microrganismo, 0 glicosideo esculina € convertido a esculitina ¢ glicose. A esculitina reage com um sal de ferro (citrato férrico) do meio para formar um complexo de cor marrom-escura ou negra (segundo tubo a partir da esquerda). Pode ser dificil diferenciar a produgio de um pigmento marrom-escuro ou negro quando o microrga- nismo produz por si mesmo pigmentos marrons ou de cor escura, Visto que a esculina é um composto fTuorescen- te, sua hidrdlise verdadeira pode ser determinada observando-se a auséncia de fluorescéncia. A fluorescéncia brilhante na imagem 2 direta (segundo tubo a partir da extrema direita) representa a reagdo observada em uma reagio negativa para a esculina. O tubo & extrema direta mostra pronunciada redugdo da fluorescéncia, em patti- cular na parte inclinada do meio, indicando que o microrganismo estudado é capaz de hidrolisar a esculina, Tiras de APINFT que mostram reagées de 24 horas (acina) e 48 horas (abaixo). Observar que as primeiras ito Provas (endo da esquenda para a dieita)sio eagées colorimétricas convencionais, enquanto que as 12 restates so reagdes de assimilagio de carbono, as quis so lidas como positivas, quando aparece um erescimento turvo, (ou negativas, na auséncia dessa turvaglo. Os usuétios desse sistema devem considerar que ess tras so incuba. dasa ORC em vex dos usuais 35°C, (Fotografado por Leon J, LeDeau, Univesity of lino, Chicago) Sistema Remel Uni-N/F mostrando a placa circular que contém 11 cavidades periféricas seladas de modo inde- pendente ¢ uma cavidade central com meio para detectar a produgdo de indol esulfeto de hidrogénio. O tubo GNF ue possui um estreitamento (segundo a partir da direta) é utilizado para detectar a fermentacao da glicose e a Produgio de nitrogénio gasoso (abaixo do estreitamento)efluoreseéncia no pico do meio, O tubo 42P sem estei- ‘amento (extrema direita) € utlizado para estudar o crescimento a 42°C e a produgdo do pigmento piocianina, (Fotografado por Leon J. LeBeau, University of Illinois, Chicago.) Sistema Rapid NF Plus mostrando as reagbes tipicas observadas com P. aeruginosa, O sistema consiste em uma bbandeja plistica que contém 10 cavidades de reagdo. Sete dessas cavidades (da 44a 108) sio bifuncionais e incluem,

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