Materijali i metode za određivanje aktivnosti nitrat reduktaze:

Materijali: reagensi, spektroftometar.

Reagensi:
A. 25 mM kalijev fosfat s 10 mM kalijevog nitrata i 0.05 mM Etilenediaminetetr octena kis., pH 7.3 pri
30°C.
B. 2.0 mM ß-Nikotinamid adenin dinukleotid, reducirana otopina (ß-NADH9
C. 3 M HCl
D. 58 mM sulfonilamid otopina
E. 0.77 mM N-(1-Naftil)etilendiamin Dihidroklorid (NED)
F. 1.45 mM Standardna otopina nitrata (pripremi 50 ml u reagensu A)
G. Enzimatska otopina nitrat reduktaze (pripremi otopinu s 0.2-0.6 /ml nitrat reduktaze u hladnom
reagesu A).

Metoda:
Pipetiraj (ml) sljedeće reagense u prikladne posudice:
Test Blank Std1 Std2 Std3 Std4 Std5
Reages (pufer) 1.80 1.90 1.89 1.87 1.85 1.83 1.80
Reages B (ß-NADH) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
Reages F (Std Otop) ---- ---- 0.01 0.03 0.05 0.07 0.10
Mješaj protresanjem na 30°C.
Zatim dodaj:
Reages G (Enz otopina) 0.10 ---- ---- ---- ---- ---- ----
Odmah promiješaj i inkubiraj pri 30°C tijekom točno 2 min.
Stopiraj reakciju dodavanjem:
Reagens D (Sulf) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Mućkaj otopine tijekom 10 min. pri 25°C. Prenesi otopine u prikladne kivete i očitaj apsorbanciju pri
valnoj duljini 540 nm.

Izračun:
Standardna krivulja:
A540nm Standard = A540nm Std - A540nm Std Blank.