Chemie-Potravin VFU PDF

VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO
FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE

Ústav hygieny a technologie mléka
CHEMIE POTRAVIN
Praktická cvičení
Prof. MVDr. Lenka Vorlová, Ph.D.

MVDr. Michaela Králová, Ph.D.
RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D.
Doc. MVDr. Bohumíra Janštová, Ph.D.
MVDr. Pavlína Navrátilová, Ph.D.
Ing. Klára Bartáková, Ph.D.
BRNO 2012
OBSAH
OBSAH ...................................................................................................................................... 1
1 ZÁSADY PRÁCE V LABORATOŘI .................................................................................. 4

1.1 BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI............................................................................................. 4
2 VEDENÍ LABORATORNÍCH ZÁZNAMŮ ........................................................................ 6

2.1 PROTOKOL ..................................................................................................................................................... 6
3 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MASA .............................. 7

3.1 STANOVENÍ DUSÍKU V MASE - KLASICKÝ POSTUP PODLE KJELDAHLA (ROZHODČÍ METODA) ......................... 7
3.2 STANOVENÍ HYDROXYPROLINU V MASE ...................................................................................................... 10
3.3 STANOVENÍ OBSAHU VOLNÉHO TUTKU V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH (ČSN ISO 1444) ........................ 13
3.4 ENZYMOVÉ STANOVENÍ GLYKOGENU A GLUKOSY V MASE .......................................................................... 15
3.5 STANOVENÍ POPELA V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH................................................................................. 19
3.6 STANOVENÍ AMONIAKU (CONWAYOVA METODA)........................................................................................ 20
3.7 STANOVENÍ AMONIAKU IONTOVĚ SELEKTIVNÍ ELEKTRODOU (ISE)............................................................... 22
3.8 STANOVENÍ AMONIAKU V MASE SPEKTROFOTOMETRICKY .......................................................................... 24
3.9 STANOVENÍ KONCENTRACE KYSELINY MLÉČNÉ V MASE .............................................................................. 26
3.10 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY POUŽÍVANÉ K ODLIŠENÍ JAKOSTNÍCH ODCHYLEK MASA ..................... 29

3.10.1 Stanovení pH elektrometricky.............................................................................................................. 29
3.10.1.1 Měření pH ve výluhu masa ................................................................................................................ 30
3.10.1.2 Měření pH vpichem ........................................................................................................................... 30
3.10.2 Stanovení volné vody ........................................................................................................................... 31
3.10.3 Stanovení ztráty masné šťávy odkapáním ............................................................................................ 32
3.10.4 Stanovení barvy masa remisní kolorimetrií ......................................................................................... 33
3.11 STANOVENÍ HISTAMINU V RYBÁCH .............................................................................................................. 35
4 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MASNÝCH VÝROBKŮ 37

4.1 STANOVENÍ OBSAHU VOLNÉHO TUKU (ČSN ISO 1444) ............................................................................... 37
4.2 STANOVENÍ OBSAHU SUŠINY ........................................................................................................................ 39

4.2.1 Stanovení vody v mase a masných výrobcích – referenční metoda (ČSN 57 6021) ............................ 39
4.2.2 Stanovení obsahu vody v mase a masných výrobcích – zkrácená metoda (ČSN 57 0185).................. 41
4.3 STANOVENÍ DUSITANŮ................................................................................................................................. 43
4.3.1 Stanovení dusitanů v mase a masných výrobcích - referenční metoda (ISO 2918) ............................. 43
4.3.2 Stanovení dusitanů spektrofotometricky .............................................................................................. 46
4.4 STANOVENÍ OBSAHU CHLORIDŮ .................................................................................................................. 48
4.4.1 Stanovení obsahu chloridů v mase a masných výrobcích – Volhardova metoda (ČSN ISO 1841-1) .. 48
4.4.2 Stanovení obsahu chloridů v mase a masných výrobcích
– Potenciometrická metoda (ČSN ISO 1841-2) ................................................................................... 50
4.4.3 Potenciometrické stanovení chloridů v masných výrobcích (z popela) ............................................... 52
4.5 PRŮKAZ POLYFOSFÁTŮ V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH (ISO 5553) ......................................................... 54
4.6 STANOVENÍ ŠKROBU V MASNÝCH VÝROBCÍCH – ENZYMOVÁ METODA ......................................................... 57
1
5 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MLÉKA .......................... 60
5.1 STANOVENÍ BÍLKOVIN ................................................................................................................................. 60
5.1.1 Stanovení obsahu celkového dusíku a bílkovin podle Kjeldahla – rozhodčí metoda
(ČSN EN ISO 8968-1) ......................................................................................................................... 60
5.1.2 Stanovení bílkovin roztokem amidočerni 10 B (provozní metoda podle ČSN 57 0530) ..................... 64
5.1.3 Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza
na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) ................................................... 66
5.2 STANOVENÍ MLÉČNÉHO TUKU ..................................................................................................................... 70
5.2.1 Stanovení tuku podle Röse-Gottlieba (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530) .................................... 70
5.2.2 Stanovení tuku acidobutyrometrickou metodou (provozní metoda podle ČSN 57 0530) .................... 73
5.2.3 Stanovení látkového obsahu volných mastných kyselin (podle ČSN 57 0533) ................................... 75
5.2.4 Stanovení mastných kyselin metodou plynové chromatografie ........................................................... 77
5.3 STANOVENÍ CHOLESTEROLU V MLÉCE A MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH METODOU HPLC .................................... 81
5.4 STANOVENÍ SACHARIDŮ .............................................................................................................................. 84
5.4.1 Stanovení mléčného cukru polarimetricky (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530) ............................ 84
5.4.2 Stanovení laktulosy enzymovou metodu.............................................................................................. 86
5.5 STANOVENÍ BODU MRZNUTÍ ........................................................................................................................ 92
5.5.1 Sstanovení bodu mrznutí mléka pomocí mléčných kryoskopů (ČSN 57 0538)................................... 92
5.6 STANOVENÍ SUŠINY ..................................................................................................................................... 95
5.6.1 Stanovení obsahu celkové sušiny (rozhodčí metoda podle ČSN ISO 6731) ........................................ 95
5.6.2 Stanovení sušina vážkově s použitím písku (ČSN 57 0530) ................................................................ 97
5.6.3 Stanovení sušiny mléka výpočtem z hustoty a obsahu tuku (provozní metoda podle ČSN 57 0530) .. 99
5.7 STANOVENÍ MINERÁLNÍCH LÁTEK ............................................................................................................. 100
5.7.1 Stanovení vápníku v mléce – titrační metoda (rozhodčí metoda podle ISO 12081) .......................... 100
5.7.2 Stanovení vápníku komplexonem (provozní metoda podle ČSN 57 0530) ....................................... 103
5.7.3 Stanovení chloridových iontů (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530) .............................................. 105
6 STANOVENÍ CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MLÉČNÝCH VÝROBKŮ................... 106

6.1 STANOVENÍ MĚDI V MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH (SUŠENÉ MLÉKO) .................................................................. 106
6.2 STANOVENÍ OBSAHU SACHARÓZY VE SLAZENÉM ZAHUŠTĚNÉM MLÉCE – POLARIMETRICKÁ METODA
PODLE ČSN ISO 2911 ............................................................................................................................... 108
6.3 STANOVENÍ OBSAHU VODY, SUŠINY TUKUPROSTÉ A TUKKU V MÁSLE Z JEDNOHO ZKUŠEBNÍHO VZORKU
– PODLE ČSN EN ISO 3727....................................................................................................................... 111
6.4 STANOVENÍ CHLORIDU SODNÉHO V SÝRECH – ROZHODČÍ METODA PODLE ČSN 57 0107 .......................... 114
6.5 STANOVENÍ SUŠINY V MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH – ROZHODČÍ METODA........................................................ 116
7 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ VAJEC ......................... 118

7.1 STANOVENÍ CHOLESTEROLU ...................................................................................................................... 118
7.1.1 Stanovení cholesterolu ve vejcích metodou HPLC ............................................................................ 118
7.1.2 Stanovení cholesterolu ve vejcích enzymovou metodou.................................................................... 121
7.2 STANOVENÍ KYSELINY MLÉČNÉ, JANTAROVÉ A D-3-HYDROXYMÁSELNÉ VE VEJCÍCH
A VAJEČNÝCH VÝROBCÍCH ......................................................................................................................... 123
7.2.1 Stanovení kyseliny mléčné ................................................................................................................. 123
7.2.2 Stanovení kyseliny jantarové ............................................................................................................. 126
7.2.3 Stanovení kyseliny D-3-hydroxymáselné .......................................................................................... 130
8 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MEDU .......................... 134

8.1 STANOVENÍ OBSAHU VODY V MEDU REFRAKTOMETRICKY ........................................................................ 135
8.2 STANOVENÍ ELEKTRICKÉ VODIVOSTI MEDU ............................................................................................... 137
2
8.3 STANOVENÍ TITRAČNÍ KYSELOSTI MEDU .................................................................................................... 138
8.4 DŮKAZ PORUŠENÍ MEDU ŠKROBOVÝM SIRUPEM, ŠKROBOVÝM CUKREM A SLADOVÝMI VÝTAŽKY
(FIEHEHO REAKCE II)................................................................................................................................. 139
8.5 STANOVENÍ HYDROXYMETHYLFURFURALU PODLE WINKLERA ................................................................. 140
8.6 STANOVENÍ HYDROXYMETHYLFURFURALU .............................................................................................. 143
8.6.1 Stanovení hydroxymethylfurfuralu podle Whita ................................................................................ 143
8.6.2 Stanovení hydroxymethylfurfuralu metodou HPLC .......................................................................... 146
8.7 STANOVENÍ DIASTATICKÉ AKTIVITY PODLE SCHADEHO ............................................................................ 148
8.8 STANOVENÍ INVERTÁZOVÉ AKTIVITY ........................................................................................................ 151
8.9 STANOVENÍ REDUKUJÍCÍCH CUKRŮ PODLE LANA A EYNONA UPRAVENÉ SOXHLETEM
- ROZHODČÍ METODA ................................................................................................................................. 154
8.10 STANOVENÍ SACHAROSY DLE LANA A EYNONA - ROZHODČÍ METODA ....................................................... 158
8.11 STANOVENÍ OBSAHU POPELA ..................................................................................................................... 160
8.12 STANOVENÍ OBSAHU PEVNÝCH LÁTEK VE VODĚ NEROZPUSTNÝCH ............................................................ 162
9 LITERATURA .................................................................................................................. 163
3
1 ZÁSADY PRÁCE V LABORATOŘI
Nezbytnou podmínkou úspěšné práce v laboratoři je dobrá teoretická příprava posluchače.

Proto je nezbytné, aby posluchači při příchodu do praktických cvičení měli prostudovány
kapitoly vztahující se k experimentální práci a to jak z návodů na cvičení, tak popřípadě
i z další literatury. Jedině tak je možno zvládnout, v řadě případů náročné metodiky analýzy
potravin.
Vzhledem k bezpečné práci v chemické laboratoři, ale i podmínkou úspěchu je pořádek
a čistota v laboratoři. Použité chemické sklo se po předběžném vypláchnutí ukládá
do určených košů. Papírový a tuhý odpad, zrovna tak jako rozbité sklo je nutno třídit
do předem označených nádob. Je třeba udržovat v čistotě výlevky (neodhazovat tuhý odpad),
digestoře, váhové stoly a pracovní stoly. Zvláštní pozornost je třeba věnovat udržování čistoty
analytických vah, torzních vah a předvážek. V čistotě je potřeba udržovat i přípravnu
pro vzorky a další společné prostory.
Po skončení práce si každý uklidí své pracovní místo a přesvědčí se, zda jsou vypnuta
elektrická zařízení, případně přívod vody a plynu.
Před odchodem z laboratoře si studenti umyjí pečlivě ruce. Ochranný oděv (plášť) odloží
až po opuštění laboratoře.
1.1 BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI
Bezpečná práce v chemické laboratoři předpokládá dodržování následujících zásad:

• Vstup do laboratoře je zakázán osobám, které v ní nepracují.
• Povolené je vykonávat jen přikázané práce a ty, ke kterým dal povolení odpovědný
vedoucí laboratorního cvičení.
• V laboratoři je třeba používat ochranný plášť (je potřeba jej obléci před vstupem
do laboratoře) a podle potřeby i jiné ochranné pomůcky (brýle, štíty, rukavice).
• V laboratoři se nesmí jíst, pít ani kouřit.
• Chemikálie a roztoky se nesmí zkoušet ochutnáváním.
• Při zkoušce čichem je třeba postupovat opatrně - přivanout si výpary rukou.
• Tuhé chemikálie se nabírají jen laboratorními lžičkami, nepoužité se nevracejí
do původních obalů.
4
• Označení nádob s chemikáliemi je třeba chránit před poškozením.
• Žíraviny (silné kyseliny, silné zásady a koncentrovaná kyselina octová) i zředěné mohou
způsobit poškození kůže, sliznic a očí. Účinek se zvyšuje s teplotou. Pro práci s nimi platí:
o přelévají se vždy pouze pomocí nálevky
o při ředění kyselin se přilévá kyselina do vody
o nikdy se nepipetují ústy (pipetují bezpečnostními pipetami, pomocí balónku nebo
se odměřují dávkovačem)
o s koncentrovanými pracujeme v digestoři
• Tuhé hydroxidy se při rozpouštění sypou do připravené vody.
• Rozlité kyseliny a zásady se nejprve spláchnou vodou a zředěné se neutralizují.
• Spalování, žíhání a jakákoliv manipulace s látkami dýmavými, dráždivými
a zapáchajícími se provádí v digestoři s dobrým odtahem.
• Jedovaté kapaliny se pipetují bezpečnostními pipetami, pomocí balónku nebo se odměřují
dávkovačem.
• Při zahřívání hořlavin používáme vodní lázeň a digestoř s dobrým odtahem.
• Při rozlití hořlaviny je třeba zhasnout kahany a vypnout elektrické spotřebiče (páry těžší
než vzduch, držící se při zemi mohou vzplanout i na dálku).
• Odpadní chemikálie (hořlaviny, látky jedovaté, silné kyseliny a zásady) se nesmí vylévat
do komunálního odpadu, ale do určených označených sběrných nádob.
• Tlakové nádoby s plyny musí být zajištěné proti pádu řemeny, řetězy nebo v pojízdných
stojanech, jejich vzdálenost od hořícího plamene smí být nejméně 3 m.
• Při manipulaci se sklem a při jeho umývání je třeba dávat pozor na poškozené okraje.
• Je zakázáno svévolně zasahovat do elektrického rozvodu. Zjištěné poruchy je třeba
okamžitě hlásit vedoucímu cvičení a elektrické zařízení okamžitě vypnout.
• Měřicí přístroje, destilační a jiné aparatury nesmí být zapnuté bez dozoru.
• O všech úrazech a nehodách je třeba okamžitě informovat vedoucího cvičení.
5
2 VEDENÍ LABORATORNÍCH ZÁZNAMŮ
Dosažení spolehlivých výsledků vyžaduje nejen pečlivé dodržování všeobecných zásad

analytické práce, ale i pečlivé vedení laboratorních záznamů. Naprosto není vhodné psát
záznamy na volné listy nebo útržky papíru. Do laboratorních záznamů (nejlepší je sešit) je
třeba poznačit zejména: název úkolu, datum provedení, navážky vzorků, všechny případné
odchylky od popisu v návodu, hmotnost navážky, spotřebovaný objem titračního činidla,
hodnoty veličin získaných pomocí instrumentální techniky (absorbance, potenciál, index
lomu, úhel otočení atd.).
Na základě laboratorních záznamů je pro každou úlohu vypracován protokol.
2.1 PROTOKOL
Naměřené výsledky je nezbytné pečlivě zapisovat, vypočítat a zhodnotit v protokolech, které

jsou vedeny na volných listech nebo v nelinkovaném sešitě A4.
Pro každou úlohu je vypracován protokol, který musí obsahovat níže uvedené údaje.
Protokol o laboratorním vyšetření

Název úlohy:
Jméno a příjmení:
Datum:
V této části je třeba uvést následující údaje:
• charakteristika vzorků
• navážky vzorků
• popis odchylek od postupu v návodu
• naměřené údaje (optimální je zpracování do tabulky): spotřebovaný objem titračního
činidla, hodnoty naměřených veličin získaných pomocí instrumentální techniky,
např. absorbance, potenciál, index lomu atd.
Výpočty: (včetně grafů)
Závěr: (stručné shrnutí a interpretace výsledků)
6
3 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ
MASA
3.1 STANOVENÍ DUSÍKU V MASE - KLASICKÝ POSTUP PODLE KJELDAHLA

(ROZHODČÍ METODA)
Princip:
Dusík organických látek masa je převeden pomocí kyseliny sírové na síran amonný.
Při této mineralizaci (kjeldahlizaci) vzniká z vodíku a uhlíku voda a oxid uhličitý. Kyselina
sírová se přitom redukuje na oxid siřičitý. Mineralizace se urychluje přídavkem síranu
draselného (zvýší se teplota varu reakční směsi) a některých katalyzátorů (CuSO4, HgO, Se,
SeO2).
Dusík ve vzniklém síranu amonném se stanovuje destilační metodou, přídavkem nadbytku
NaOH se uvolní amoniak podle reakce:
(1) (NH4)2SO4 + 2 NaOH = 2 NH3 + 2 H2O + Na2SO4
Reakce při teplotách okolo bodu varu probíhá kvantitativně. Uvolněný amoniak
se předestiluje s vodní parou do předlohy se známým nadbytečným množstvím standardního
roztoku kyseliny, se kterou reaguje podle rovnice:
(2) 2 NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4
Nespotřebované množství kyseliny v předloze se zjistí zpětnou titrací standartním roztokem

NaOH.
Chemikálie a roztoky:
• kyselina sírová, H2SO4 p.a. konc.
• kyselina sírová, H2SO4 c = 0,05 mol/l
• hydroxid sodný, NaOH 33% roztok
• hydroxid sodný, NaOH c = 0,1 mol/l
7
• katalyzátor: 32 g síranu draselného K2SO4 se rozetře s 5 g síranu měďnatého CuSO4 . H2O
a 1 g selenu.
• kyselina sírová, H2SO4 c = 0,1 mol/l
• kyselina boritá, H3BO3 c = 40 g/l
• indikátor Tashiro – 1g methylénové modři a 2 g methylčerveně se doplní 96 % roztokem
ethanolu na 1000 ml.
Přístroje a pomůcky:
• Kjeldahlova baňka
• destilační přístroj podle Parnas - Wagnera
• odměrné sklo, skleněné kuličky
• kahan nebo vařič
Postup:
Do Kjeldahlovy spalovací baňky (o objemu 250 - 500 ml) se diferenčně naváží cca 1 g
zhomogenizovaného vzorku masa, přidá se 25 ml koncentrované kyseliny sírové, na špičku
nože katalyzátoru a zamíchá. Směs se nejprve zahřívá v digestoři nad mírným plamenem
do odstranění základního množství vody a potom při teplotě 360 ± 20 °C tak dlouho,
až se roztok vyjasní a odbarví se do čistého tónu. Po vychladnutí na pokojovou teplotu
se obsah baňky mírně zředí a kvantitativně převede do destilačního přístroje pro stanovení
amoniaku. K zalkalizování se použije přídavek 40 ml roztoku hydroxidu sodného.
Poté se provede destilace uvolněného amoniaku v Parnas - Wagnerově přístroji. Do kuželové
baňky, v níž je ponořena spodní část chladiče se odpipetuje 25 ml kyseliny borité
s 2 až 3 kapkami indikátoru Tashiro. Destilace je ukončena, po 15 minutách od objevení
se první kapky v chladiči (od počátku varu). Několik minut (5 minut) před koncem destilace
se destilační baňka sníží a konec chladiče se opláchne do předlohy destilovanou vodou.
Obsah baňky se titruje odměrným roztokem kyseliny sírové c = 0,1 mol/l do zeleného
zbarvení.
Slepý pokus se provede stejným způsobem, avšak místo navážky vzorku se použije
destilovaná voda.
Provádějí se dvě souběžná stanovení.
Výpočet:
8
Obsah dusíku v % se vypočítá:
−
= . 0,28
V objem kyseliny sírové (nebo kyseliny chlorovodíkové) spotřebované při titraci

[ml]
V1 objem kyseliny sírové (nebo kyseliny chlorovodíkové) spotřebované při titraci

slepého pokusu [ml]
hmotnost navážky [g]
m
Obsah bílkovin % se vypočítá:
ℎ í % ∙ 6,25
obsah dusíku v % obsah dusíku vypočítaný viz výše

6,25 přepočítávací faktor
9
3.2 STANOVENÍ HYDROXYPROLINU V MASE
Princip:
Vzorek masa je rozložen varem s HCl. Hydrolýzou bílkovin uvolněný hydroxyprolin
se zoxiduje Chloraminem T na kyselinu 3-hydroxy-4-amino-1,3 dienvalerovou, která dává
s p-dimetylaminobenzaldehydem červené zbarvení. Absorbance je měřena při 558 nm.
• kyselina chlorovodíková, HCl koncentrovaná
• pufr pH 6,8:
• 26,0 g kys. citronové (monohydrátu), 14,0 g NaOH peciček a 78,0 g octanu sodného
bezvodého se rozpustí v 500 ml destilované vody.
• Přidá se 100 mg Na-etylmercurythiosalycylátu a kvantitativně se převede do 1000ml
odměrné baňky. Po přídavku 250 ml 1-propanolu se doplní vodou po rysku. Skladovat
ve tmě při 4 °C (stálý 2 měsíce).
• II. Oxidační roztok:
• 1,4 g Chloraminu T (trihydrát) je naředěn do pufru pH 6,8 do 100 ml. Při skladování
v lednici je stálý 1 týden.
• III. Barvící roztok:
• 10,0 g dimethylaminobenzaldehydu bude rozpuštěn v 35 ml HClO4 (w = 60 %). Nakonec
se opatrně přidá 65 ml 2- Propanolu. Tento roztok musí být každý den čerstvý.
• IV. 1) Standard hydroxyprolinu: 600mg/l
120 ml L-hydroxyprolinu je naředěno vodou do 200 ml odměrné baňky
2) Standard hydroxyprolinu : 6mg/l
5 ml roztoku 1 se napipetuje do 500 ml odměrné baňky a doplní po rysku
3) Z roztoku 2) dávkujeme:10; 20; 30; 40 ml do 100 ml odměrných baňek a doplníme
dest. vodou po rysku.
Koncentrace těchto standartních roztoků jsou 60; 120; 180; 240 µg/100 ml.
Přístroje a potřeby:
• analytické váhy
• mlýnek na maso
• vodní lázeň
10
• varné hnízdo
• laboratorní sklo, filtrační papír
Postup:
Příprava hydrolyzátu:
Vzorek masa se nakrájí na 1 cm kousky a pomele. 4 g dobře zhomogenizovaného vzorku
masa naváží s přesností na 1 mg do 100 ml varné baňky. Přidá se 30 ml koncentrované HCl
a varné kamínky. Pomocí topného zařízení je roztok při mírném varu zahříván 8 h
pod zpětným chladičem. Hydrolyzát se kvantitativně převede do 500 ml odměrné baňky,
přidá se 5 ml petroletheru a doplní se vodou po rysku. Po důkladném promíchání
je odstraněna vrstva petroleteru s tukem (odsátím) a vodná fáze přefiltrována přes skládaný
filtr do 500 ml odměrné baňky. Hydrolyzát je stálý 4 týdny při 4 °C.
Dále je hydrolyzát naředěn tak, aby se očekávaná hladina hydroxyprolinu pohybovala
v rozmezí 0,6 - 2,4 µg/ml. Tak dostaneme ředěním odpovídající objem (V). V našem případě
odměříme 30 a 40 ml do 250 ml odměrných baněk a destilovanou vodou doplníme po rysku.
Vlastní stanovení - vzorku:

K 4 ml naředěného roztoku hydrolyzátu ve zkumavce se přidá 2 ml oxidačního činidla,
zamíchá a nechá stát 20 min při laboratorní teplotě. Potom se přidá 2 ml barvícího roztoku.
Po důkladném promíchání je zkumavka rychle dána do vodní lázně na 60 °C a ponechána
15 minut. Potom následuje ochlazení zkumavky pod tekoucí vodou 3 minuty a nechá se stát
1/2 h při laboratorní teplotě. Potom změříme absorbanci při 558 nm v 1 cm kyvetě.
Vlastní stanovení - standardů:

Zpracovávájí se stejně jako vzorky jen místo 4 ml hydrolyzátu se dají 4 ml standardu ad 3).
Stejným postupem se zpracuje slepý vzorek: místo 4 ml hydrolyzátu (resp. standardů) se dají
4 ml destilované vody.
Výpočet:
Obsah hydroxyprolinu w (g/100g) vzorku se vypočítá:
12,5 .
=
.
11
x konc. hydroxyprolinu v µg/ml v naředěném hydrolyzátu, vypočítáme
z kalibrační přímky
m navážka vzorku [g]
V objem (V) hydrolyzátu v ml, vzatý k naředění do 250 ml
Poznámka: Výsledek se přepočte na kolagen.
12
3.3 STANOVENÍ OBSAHU VOLNÉHO TUTKU V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH
(ČSN ISO 1444)
Princip:
Tuk se stanoví gravimetricky po extrakci ze vzorku pomocí nepolárních rozpouštědel.
• n-hexan p.a. (nebo extrakční benzin)
Potřeby a chemikálie:
• mlýnek na maso
• extrakční přístroj (Soxhletův nebo Soxtec)
• písková nebo vodní lázeň
• sušárna
• exikátor
Postup:
Do extrakční patrony se kvantitativně převede vzorek po stanovení vody sušením.
Chomáčkem vaty (ovlhčeným rozpouštědlem) se vytře důkladně miska a chomáček vaty
se vloží do extrakční patrony. Do baňky extrakčního přístroje, která byla předtím s několika
varnými kuličkami vysušena 1 h při 103 °C a zvážena s přesností na 0,001 g (m1) se nalije
rozpouštědlo a to tak, aby jeho množství bylo 1,5 krát až dvakrát větší, než odpovídá velikosti
střední části extraktoru. Po sestavení extrakčního přístroje se vzorek extrahuje nejméně 6 h
na pískové nebo vodní lázni (u přístroje Soxtec musí být doba zahřívání nejméně 2 h). Poté
se vyjme extrakční baňka a rozpouštědlo se oddestiluje na pískové nebo vodní lázni. Potom
se extrakční baňka suší v sušárně 1h 103 °C, nechá vychladnout v exikátoru a zváží
s přesností na 0,001 g. Tento postup se opakuje do konstantní hmotnosti vzorku (m2).
13
Výpočet:
Obsah volného tuku v % se vypočítá:
( − )
= .100
m0 hmotnost naváženého vzorku [g]

m1 hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami [g]
m2 hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami a tukem po vysušení [g]
14
3.4 ENZYMOVÉ STANOVENÍ GLYKOGENU A GLUKOSY V MASE
Princip:
Glykogen je štěpen enzymem amyloglukozidasa (AMG) na glukosu (1).
V další reakci (2) se glukosa oxiduje kyslíkem za katalýzy enzymem glukosooxidasou (GOD)
na peroxid vodíku a kyselinu glukonovou.
V následující reakci (3) se hladina peroxidu vodíku stanoví pomocí oxidační kopulace
se substituovaným fenolem a 4-aminofenazonem katalysovanou enzymem peroxidasou
(POD). Intenzita červeného zbarvení reakčního produktu je ekvivalentní množství přítomné
glukosy a je měřena při 490 nm.
Reakce:
AMG
(1) GLYKOGEN + H2O → D – GLUKOSA
GOD
(2) D - GLUKOSA + O → KYS. GLUKONOVÁ + H2O2
POD
(3) H2O2 + bezbarvá forma činidla → zkopulovaná barevná forma činidla
• kyselina chloristá, HClO4 c= 0,6 mol/l
• hydroxid sodný, KOH c = 5,4 mol/l
• amyloglukosidasa, AMG (EC 3.2.1.3) lyophilized 75 U/mg
• octan sodný CH3COONa, tavený
• acetátový pufr pH=4,8
• standard glukosy
• glukosové činidlo (fosfátový pufr pH=8, glukosooxidasa (GOD) 166 kat/l, peroxidasa
(POD) 16 kat/l, 3-methylfenol 10 mmol/l, 4-aminofenazon 1 mmol/l (test Oxochrom
GLUKOSA) Lachema, č.k. 1208001
• glykogen
15
• spektrofotometr
• odstředivka
• pH metr
• skleněná elektroda.
Postup:
Svalovina neznečištěná krví se zbaví tukové a vazivové tkáně a naváží se 900 mg vzorku
s přesností 0,0001 g. Kvantitativně se přenese do třecí misky a přidají se 2,5 ml vychlazené
HClO4 c = 0,6 mol/l. Dobře se zhomogenizuje a přepraví do kalibrované zkumavky. Miska se
vypláchne 1,5 ml HClO4 a přidá se k prvnímu podílu homogenátu. Ve zkumavce se doplní
pomocí HClO4 o stejné koncentraci na objem homogenátu 5 ml. Poté následuje enzymová
reakce. Do suchých zkumavek se pipetuje dle tabulky.
Schema pipetování do zkumavek:
Vzorek Slepý vzorek AMG
Homogenát 0,2 ml -
KOH (c = 5,4 mol/l) 0,02 ml 0,02 ml
AMG (100 U/ml v pufru pH=4,8) 2,0 ml 2,0 ml
Destilovaná voda - 0,2 ml
Zkumavky se řádně promíchájí, uzavřou a nechají se inkubovat 1 h při 45 °C za občasného

promíchání.
Po inkubaci se přidá:
Vzorek Slepý vzorek AMG
HClO4 (c = 0,6 mol/l) 1,0 ml 1,0 ml
KOH (c = 5,4 mol/l) 0,13 ml 0,13 ml
16
Přeleje se do odstředivkovych zkumavek a odstřeďuje 10 minut při 5 000 ot./min. Potom
se odpipetuje do čistých označených zkumavek dle schématu:
Vzorek Slepý vzorek Standard Slepý vzorek

AMG glukosy
Supernatant vzorku 0,3 ml - - -
Supernatant AMG - 0,3 ml - -
Standard glukosy - - 0,3 ml -
Destilovaná voda - - - 0,3 ml
Glukosové činidlo 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml
Zkumavky se zamíchají a při laboratorní teplotě se nechají 30 minut stát tak, aby byly
zkumavky v zástinu. Poté se změří absorbance na spektrofotometru při 490 nm.
Zároveň ve stejném vzorku stanovuje množství přítomné volné glukosy.
Princip:
Používá se stejná enzymatická reakce na stanovení glukozy jako při stanovení glykogenu.
Ke stanovení glukosy byl použit Bio-la test fy Lachema Oxochrom GLUKOSA.
Postup:
Homogenát (viz stanovení glykogenu) z kalibrovaných zkumavek se přeleje
do odstředivkových zkumavek a odstředí 10 min při 5 000 ot./min. Potom se odpipetuje
do suchých označených zkumavek 0,3 ml supernatantu a přidají se 3 ml glukosového činidla.
Slepý vzorek se provede identicky, ale místo supernatantu se použije destilovaná voda.
Zkumavky se zamíchají a inkubují 30 min při laboratorní teplotě v zástinu. Poté se červené
zbarvení proměří na spektrofotometru při 490 nm.
Analýza na spektrofotometru:
Analýza vzorků a standardů a slepých vzorků se provádí na spektrofotometru. Měření
se provádí v kyvetách s dráhou paprsku 10 mm, při vlnové délce 490 nm.
17
Výpočet:
Kvantifikace se provádí pomocí matematického vztahu. Pro získání skutečné absorbance
se odečítá od vzorků jak absorbance slepého vzorku, tak absorbance slepého vzorku AMG
(AMG obsahuje glukosu).
Výpočet koncentrace (c) glykogenu:
"#$ − "%&'()
! = ∙ !%* [ ,/,] /, 0 1 23
"%* − "%&
c = c ∙ 0.18 ∙ ř6 ě8í (!6, ý :6 /8 áž ) ∙ =ř6= čí3 !í ? 3 1 [g/kg]

glykogenu
ředění 93x
přepočítávací faktor 0,9
Výpočet koncentrace (c) glukosy:
"#$ − "%&
! = ∙ ! /, 0 1 23 [ ,/,]
"%* − "%& %*
! = ! ∙ 0,18 ∙ ř6 ě8í (!6, ý :6 /8 áž ) glukosy [g/kg]
AVZ absorbance vzorku

ASL absorbance slepého zkoušky
ASLAMG absorbance slepého zkoušky AMG
AST absorbance vzorku
18
3.5 STANOVENÍ POPELA V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH
Princip:
Popel masa a masných výrobků představuje zbytek po spálení za podmínek definovaných
metodou. Obsah popela se vyjadřuje v g/100 g vzorku.
Potřeby a pomůcky:
• mlýnek
• muflova pec
• exikátor
• sušárna
• sklo, filtrační papír, porcelánové nebo křemenné kelímky
Postup:
10 g dobře zhomogenizovaného vzorku se naváží s přesností na 1 mg do předem vyžíhaného
a zváženého porcelánového kelímku (nebo spalovací miska) a následně se vysuší v sušárně
při 103 ± 2 °C. Poté se obsah v kelímku pomalu zuhelnatí nad kahanem nebo vařiči. Popel
se nechá vychladnout a do misky se přidá asi 10 ml horké vody, rozpustný podíl se odfiltruje
přes bezpopelný filtr a promyje se malým množstvím horké vody. Filtrát obsahující zejména
chloridy se uchová. Filtr se vloží do spalovací misky, vysuší a vyžíhá se v muflové peci
při 600 °C. Po vychladnutí se do misky převede kvantitativně filtrát, který se pak odpaří
při 130 °C a miska krátce přežíhá. Po vychladnutí v exikátoru se miska zváží.
Výpočet:
Obsah popelovin v % se vypočte:
(! − ) ∙ 100
=
a hmotnost navážky [g]

b hmotnost prázdné misky [g]
c hmotnost misky s vyžíhaným popelem [g]
Poznámka:Výsledky se vyjadřují s přesností na jedno desetinné místo.
19
3.6 STANOVENÍ AMONIAKU (CONWAYOVA METODA)
Princip:
Ze vzorku se vytěsní amoniak nasyceným roztokem uhličitanu draselného, absorbuje
se do roztoku kyseliny borité a stanoví se titračně roztokem kyseliny sírové.
• kyselina boritá, H3BO3 roztok 10 g/l (10 g kyseliny borité se rozpustí v 1000 ml odměrné
baňce, přidá se 200 ml ethanolu a 700 ml destilované vody. Po rozpuštění se přidá 10 ml
indikátoru. Poté se roztok doplní na 1000 ml destilovanou vodou.
• indikátor (0,033 g bromkresolové zeleně a 0,066 g methylčerveně se rozpustí ve 100 ml
ethanolu.
• uhličitan draselný, K2CO3 nasycený roztok (52,8 g bezvodého uhličitanu draselného
se rozpustí v 47,2 ml destilované vody).
• kyselina sírová, H2SO4 odměrný roztok c = 0,05 mol/l
• Conwayova nádobka
• odměrné sklo
• vazelína
Postup:
Cca 1 g vzorku se zhomogenizuje s vodou v poměru 1:3. Do centrálního prostoru nádobky
se napipetuje 1 ml roztoku kyseliny borité. Na jednu stranu vnějšího prostoru nádobky
se napipetuje 1 ml vzorku a na protější stranu 1 ml nasyceného uhličitanu draselného.
Po přikrytí nádobky se vzorek se promíchá s roztokem uhličitanu draselného mírným
kruhovým pohybem. Potom se nádobka nechá 3 h při laboratorní teplotě. Po proběhnutí
reakce se nádobka odkryje a k rortoku kyseliny borité se přidá 1 kapka indikátoru a obsah
centrální části se dobře promíchá. Poté se titruje kyselinou sírovou do slabě červeného
zbarvení.
20
Výpočet:
Volný amoniak v mg/kg se vypočte:
∙ 17,3 ∙ 10 ∙ ?
=
8
a spotřeba odměrného roztoku kyseliny sírové [ml]

n hmotnost podílu vzorku v g/ml filtrátu
f faktor kyseliny sírové
21
3.7 STANOVENÍ AMONIAKU IONTOVĚ SELEKTIVNÍ ELEKTRODOU (ISE)
Princip:
Amoniak je vytěsňován z výluhu vzorku silnou zásadou, difunduje skrz pory membrány
elektrody, rozpustí se v roztoku na povrchu skleněné elektrody - tam se vytvoří
jeho rovnovážná koncentrace. Z hodnot potenciálů, změřených skleněnou elektrodou
pak vypočteme koncentraci plynu.
• kyselina chloristá, HClO4 c = 0,1 mol/l
• hydroxid sodný, NaOH c = 10 mol/l
• zásobní standardní roztok chloridu amonného, NH4Cl c = 0,1 mo/l
• mlýnek na maso
• mixér
• váhy
• digitální pH metr
• amoniaková ISE
• sklo; filtrační papír
Postup:
4,0 g pomletého vzorku masa vložíme do mixéru a po přidání 100 ml HClO4 c=0,1 mol/l
homogenizujeme 1 minutu. Potom přelejeme obsah mixéru do 200 ml odměrné baňky a mixér
promýváme HClO4 až baňku doplníme po rysku. Necháme 5 minut stát a potom zfiltrujeme
přes vatu, popř. řídkým filtrem.
Vlastní stanovení:
K měření vezmeme 100 ml filtrátu, ponoříme elektrodu (viz níže) vložíme míchadlo
a zapneme míchačku. Přidáme 3 ml NaOH c=10 mol/l. Během 1 až 2 minut se ustálí potenciál
na elektrodě a tento odečteme.
Pokud se potenciál začne vracet do původní hodnoty, znamená to, že měření už trvá moc
dlouho a amoniak se uvolňuje z pufru.
Pozor: Zásadně se nedotýkat prsty membrány elektrody!
22
Práce s elektrodou:
Elektrodu rozšroubujeme, vyjmeme z teflonového obalu skleněnou elektrodu a opláchneme
destilovanou vodou. Do teflonového obalu napipetujeme ve svislé poloze 2 ml žlutého pufru
a zašroubujeme elektrodu. Poté je elektroda připravena k měření. Elektrodu ponoříme
maximálně po první bílé těsnění a kontrolujeme, jestli není na membráně bublinka.
Mezi jednotlivými měřeními elektrodu opláchneme a ponoříme na chvíli do destilované vody.
Zhotovení kalibrační křivky:

Ze zásobního standardního roztoku NH4Cl c=0,1 mol/l naředíme pomocí HClO4 6 pracovních
standardních roztoků tak, aby pokryly rozmezí koncentrací 1.10-4 mol/l až 1.10-3 mol/l.
Při měření postupujeme stejně, jako u vzorku.
Výpočet:
Z výsledků sestrojíme kalibrační křivku závislosti potenciálu E [mV] na logaritmu
koncenrace [log c] stanovované látky. Z kalibrační křivky stanovíme množství amoniaku
ve filtrátu vzorku a pomocí přípravy vzorku a navážky přepočítáme na množství anoniaku
v původním vzorku.
Poznámka: Po skončení měření elektrodu rozšroubujeme, vnitřní roztok vylejeme a teflonové

pouzdro i skleněnou elektrodu opláchneme destilovanou vodou. Poté elektrodu opět
zkompletujeme.
23
3.8 STANOVENÍ AMONIAKU V MASE SPEKTROFOTOMETRICKY
Princip:
Amoniak tvoří s Nesslerovým činidlem intenzivně zbarvený komplex, který se stanoví
spektrofotometricky.
• kyselina trichloroctová, CCl3COOH 20%
• Nesslerovo činidlo (alkalický roztok HgI42-)
• standardní roztok chloridu amonného, NH4Cl c = 3,1411 g/l
• mlýnek na maso
• mixér
• váhy
• spektrofotometr
• sklo; filtrační papír
Postup:
Maso pomeleme a navážíme 10, 0 g. Zhomogenizujeme v mixeru s 80 ml destilované vody.
Přelejeme do kádinky, mixer vypláchneme 20 ml destilované vody a přidáme k ostatnímu.
Potom homogenát vyčeříme 60 ml 20% kyseliny trichloroctové. Zamícháme a necháme
10 min stát. Poté roztok zfiltrujeme nejprve přes vatu a podle potřeby přes střední filtrační
papír do 200 ml odměrné baňky. Za promývání filtru destilovano vodou doplníme baňku
po rysku. Ke stanovení napipetujeme 2 ml filtrátu do 50ml odměrné baňky, přidáme 10 ml
destilované vody, 5 ml Nesslerova činidla, promícháme a doplním destilovanou vodu
po rysku.
Měření se provede na Spekolu při vlnové délce 400 nm, proti kompenzačnímu roztoku,
připravenému z 5 ml Nesslerova činidla a 45 ml destilované vody.
Zhotovení kalibrační křivky:

Zásobní standardní roztok NH4Cl se naředí 100 krát, tzn., že v 1 ml tohoto naředěného
standardu je obsažen 0,01 mg NH3. Kalibrační křivku zhotovíme z 5 roztoků získaných
24
ředěním od 0,5 – 7 ml tohoto pracovního standardu do 50 ml odměrných baněk. Po přidání
10 ml destilované vody vybarvíme roztoky stejným množstvím Nesslerova činidla jako
u vzorku. Doplníme destilovanou vodou opět po rysku.
Výpočet:
Vyhodnocení se provede pomocí kalibrační křivky a přepočítá se na (mg/kg) amoniaku
v mase.
25
3.9 STANOVENÍ KONCENTRACE KYSELINY MLÉČNÉ V MASE
Princip:
Kyselina mléčná je oxidována koenzymem NAD+ za katalýzy laktátdehydrogenázy
na pyruvát a NADH. Při reakci vzniklé množství NADH je ekvivalentní množství kyseliny
mléčné. Hladina NADH je měřena při 340 nm
Reakce: L-LDH
(1) L-LAKTÁT + NAD+ → PYRUVÁT + NADH + H+
GPT
(2) PYRUVÁT + L-GLUTAMÁT → L-ALANIN + α-KETOGLUTARÁT
Poznámka:
Za účelem posunutí chem. rovnováhy na stranu pyruvátu a NADH je pyruvát v další reakci
pomocí GPT (glutamát-pyruvát transaminázy) a kys. glutamové převáděn na alanin
a kys. α-ketoglutarovou.
• ROZTOK 1: glycyl-glycinový pufr- pH 10 c = 0,5 mol/l, D-glutamová kyselina
c = 0,5 mol/l, azid sodný 0,05%
• ROZTOK 2: NAD+ - lyofilizát, 210 mg
• ROZTOK 3: Glutamát-pyruvát-transaminasa (GPT), c = 1,100 U/ml
• ROZTOK 4: L-laktátdehydrogenasa (LDH), c = 2,000 U/ml
• kyselina chloristá, HClO4 70%
• hydroxid sodný, KOH c = 2 mol/l
• pufry pH 7 a 10
• homogenizátor
• pH-metr a kombinovaná skleněná elektroda
• spektrofotometr UV/VIS
• laboratorní sklo, filtrační papír
26
Postup:
Svalovinu zbavenou povázek, šlach a tukové tkáně naškrábeme (zmražené maso nebo maso
v rigoru mortis nakrájíme na malé kousky) a navážíme 10,00 g. Přeneseme do čistého mixeru
a zhomogenizujeme s 60 ml vychlazené HClO4 c = 1 mol/l 5 minut při 5 000 ot./min. Potom
homogenát přelejeme do kádinky na 250 ml. Do mixeru odměříme 100 ml destilované vody
a zapnutím důkladně propláchneme a přidáme k homogenátu. Dalšími 20 ml dest. vody
vypláchneme naposled mixér a přidáme k předcházejícímu. Pomocí pH-metru, kombinované
skleněné elektrody, za stálého míchání a KOH c= 2,0 mol/l homogenát zneutralizujeme
a nastavíme pH na 10 - 11. Poté homogenát přepravíme kvantitativně do odměrné baňky
na 250 ml, doplníme destilovanou vodou po rysku a promícháme. Pro odloučení tuku
necháme 15 minut stát v chladu (lednička, ledová tříšť). Potom zfiltrujeme přes hustý
skládaný filtr do čisté, suché zkumavky.
První ml filtrátu vylijeme a z dalších bereme ke stanovení:
Slepá zkouška Vzorek
Destilovaná voda 1,6 ml 1,5 ml
Filtrát vzorku - 0,1 ml
ROZTOK 1 0,5 ml 0,5 ml
Zkumavky promícháme a po 5 min změříme absorbanci (A1). Při měření roztoky naléváme
zpátky do zkumavek. Potom přidáme:
Promícháme a po 10 minutách změřímě extinkci (A2).
27
Výpočet:
U slepé zkoušky i u vzorku vypočítáme rozdíl absorbancí:
B" = (" − " ) #$ − (" − " )%&
Přepočet pro stanovení koncentrace laktátu v roztoku:
∙ CD
! = ∙ B" [//,]
E∙ ∙ ∙ 1000
V konečný objem roztoku v kyvetě [ml]

v objem použitého filtrátu vzorku [ml]
MG molekulová hmotnost stanovovaného substrátu [g]
d šířka kyvety [cm]
ε extinkční molární koeficient NADH při 340 nm [6,3 l/mmol/cm]
Poznámka: Přepočítáním výsledku ředěním vzorku se stanoví koncentrace kyeliny mléčné

v původním vzorku (g/kg a µmol/g).
28
3.10 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY POUŽÍVANÉ K ODLIŠENÍ JAKOSTNÍCH
ODCHYLEK MASA
3.10.1 Stanovení pH elektrometricky
Princip:
Stanovení pH spočívá v měření potenciálu vznikajícího na rozhraní dvou fází (elektrolytu)
oddělených membránou měřící skleněné elektrody, ponořené do vyšetřovaného extraktu
nebo vzorku. Tento potenciál se snímá v porovnání s konstantním potenciálem druhé -
referentní elektrody. Jako referentní se nejčastěji používá elektroda kalomelová nebo
argentochloridová.
• pufry Ph = 7 a 4 (komerční roztoky)
• ethanol 95%
• pH metr
• kombinovaná vpichová elektroda
Postup:
Na cvičeních budeme používat vpichovou kombinovanou skleněnou elektrodu. Nejprve
se provede kalibrace pH metru s elektrodou pomocí pufrů (pH 7 a 4). Pokud není k dispozici
pH-metr s korekcí teploty, je třeba, aby teplota měřených pufrů i vzorků byla 20 ± 2 °C.
Před ponořením do pufru se elektrody několikrát opláchnou destilovanou vodou a lehce
se osuší buničitou vatou. Při vlastním stanovení se elektroda ponoří do vzorku a odečte se pH
na displeji.
29
3.10.1.1 Měření pH ve výluhu masa
Postup:
Při stanovení pH se obvykle používá vodního 10% výluhu. Ze vzorku odpreparujeme tukové
vazivo a šlachy. Z 30-40 g svaloviny se rozemletím připraví masová měl. Odváží se 10 g
rozmělněného masa do kádinky o objemu 250 ml, zalije se 100 ml destilované vody (zbavené
oxidu uhličitého převařením) a nechá se 15 minut stát za občasného míchání. Získaný výluh
se zfiltruje.
Měření pH se provede u každého výluhu jedenkrát.
3.10.1.2 Měření pH vpichem
Vpichovou kombinovanou elektrodou je možno měřit pH přímo ve svalové tkáni. Měříme-li

vzorek tuhé konzistence, je třeba nejprve do něj udělat přiměřený vpich (teflonovým
bodcem), do kterého pak elektrodu zasuneme. Přímé měření pH vzorku bez přípravy extraktu
vpichovou kombinovanou elektrodou opakujte 10krát, přičemž elektrodu zapíchneme vždy
do jiného místa (vyhodnoťte pomocí základní statistiky).
Čištění a uchovávání elektrody:

Po ukončení měření se elektroda opláchne ethanolem a poté destilovanou vodou. Elektroda
se uchovává v úchovném roztoku dle doporučení výrobce, většinou v pufru pH 7,0.
Upozornění: S elektrodou je nutno pracovat velmi opatrně a citlivě, protože hrot elektrody
je velmi náchylný k mechanickému poškození. Zvláště při měření pH masa v období rigoru
mortis je nebezpečí poškození elektrody díky tuhosti tkáně, a proto je použití teflonového
bodce nezbytné.
30
3.10.2 Stanovení volné vody
Princip:
Za definovaných podmínek je rozdíl hmotností vzorku masa před a po kompresi kousku
svaloviny, úměrný množství volné vody.
• váhy
• laboratorní potřeby
• exikátor s nasyceným roztokem KCl s chromatografickým papírem Whatman,
• skleněné desky
• závaží
Postup:
Ze středu části vzorku se vyřízne kousek masa o hmotnosti 300 mg, zváží se s přesností
na 0,001 g a položí se na chromatografický papír konstantní vlhkosti, přechovávaný
v exikátoru nad nasyceným roztokem KCl. Vzorek se vloží mezi dvě desky a zatíží závažím
o hmotnosti 1 kg. Po pěti minutách se závaží odstraní, horní deska se opatrně odstraní
a vzorek se znovu zváží.
Výpočet:
Úbytek hmotnosti se vyjádří v procentech jako volná voda.
Poznámka: Vyhodnocení je možno provést i výpočtem koeficientu Q, což je poměr skvrny

masa ku skvrně celkové po kompresi, odečtené pomocí šablony. Tento způsob vyhodnocení
je však zatížen hrubou chybou, kromě jiného i vzhledem k používaným kruhovým otvorům
v šabloně.
31
3.10.3 Stanovení ztráty masné šťávy odkapáním
Princip:
Za definovaných podmínak je určeno množství masové šťávy uvolněné vzorkem masa.
• váhy
• chladnička
• laboratorní potřeby
Postup:
Vzorek svaloviny cca 150 g bez viditelných povázek, šlach a tukové tkáně se odváží na dvě
desetinná místa a vloží se do sáčku z plastu, zataví a uloží po dobu 24 hodin do chladničky
při teplotě 4-6 °C. Poté se sáček otevře, vzorek osuší válením po filtračním papíru a znovu
zváží.
Výpočet:
Ztráta odkapáním se vyjadřuje jako procentuální podíl hmotnosti odkapané šťávy z celkové
hmotnosti vzorku.
32
3.10.4 Stanovení barvy masa remisní kolorimetrií
Princip:
Je měřen barevný jas masa, na základě jeho odrazivosti R, tj. poměru intenzit odraženého
záření a záření dopadajícího na povrch vzorku.
• spektrofotometr Spekol 11
• remisní nástavec R 45/0
• bílý standard BaO nebo BaSO4
• černý standard - černé duté těleso
• prkénko, nůž
Postup:
• Spekol 11 zapneme do sítě a necháme 15 minut zahřát
• nastavíme vlnovou délku 546 nm
• levou dolní páčku (intenzita dopadajících paprsků) nastavíme na spodní polohu
• zmáčkneme tlačítko FL- bliká dioda Z-FL a FAKT
• přítlačný talíř na vzorky stlačíme dolů a umístíme na něj černé duté těleso (černý standard)
a opatrně pomocí zpětné pružiny přitlačíme na měřící otvor
• zmáčkneme tlačítko Z-FL. Tím následuje vynulování přístroje na černý standard. Zhasne
dioda Z-FL, bliká FAKT a R.
• černý standard odstraníme a na talíř položíme pomocný talíř s černým filcovým povrchem.
Na něj položíme bílý standard a přitlačíme k měřícímu otvoru.
• stlačíme tlačítko FAKT, dioda R zhasne. Pomocí tlačítka POS (nastavovaná hodnota)
a tlačítka INC (číselná hodnota) nastavíme hodnotu remise přiloženého normálu – 100 %.
• znova zmáčkneme tlačítko FAKT, dioda FAKT zhasne; dioda R bliká.
• stlačíme tlačítko R, zhasne dioda R, na ukazateli se objeví příslušná hodnota remise.
• odděláme normál a na pomocný příložný talíř položíme mističku se vzorkem a přitlačíme
na měřící otvor. Na ukazateli se objeví příslušná hodnota remise.
33
Příprava vzorku svaloviny k měření:
Maso, zbavené vazivové tkáně, tukové tkáně a bez potřísnění krví, řežeme napříč svalových
vláken. Tloušťka vzorku je dána výškou černé mističky, kterou nesmí přesahovat, tvar taktéž.
Horní plocha vzorku musí být rovná a hladká.
Pozor! S příložnými standardy pracujte opatrně, chraňte před znečištěním a poškrabáním.
34
3.11 STANOVENÍ HISTAMINU V RYBÁCH
Princip:
Po provedené extrakci vzorku se filtrát i standard vyvíjejí pomocí tenkovrstvé chromatografie
a po následné detekci chromatogramu se semikvantitativně stanoví obsah histaminu,
porovnáním intenzity barevných skvrn vzorku a standardu.
• kyselina chlorovodíková, HCl c = 6 mol/l
• vyvíjecí směs: aceton-hydroxid amonný (čerstvý) 95:5
• ninhydrin, 0,2% roztok v ethanolu (stačí připravit 25 ml roztoku)
• methylalkohol
• standard: histamin dihydrochlorid, c = 10 mg/100ml a 20 mg/100ml
• mixér
• chromatografická deska Silufol
• nanášecí zařízení pro chromatografii
• chromatografická skleněná kyveta
• vysoušeč vlasů
• laboratorní sušárna
• fixírka
Postup:
Zpracování vzorku:
A. Při stanovení histaminu u ryb s nižším obsahem tuku: K 10 g rybí svaloviny zbavené kůže
a kostí se přidá 25 ml destilované vody a 5 ml HCl (c=6 mol/l) a vše se homogenizuje
v mixeru po dobu 120 sec. Homogenát se přepraví do kádinky a zfiltruje. Poté se 30 µl
filtrátu nanese na start chromatogramu.
B. Při stanovení histaminu u ryb s vysokým obsahem tuku je lépe než kyselou extrakci zvolit
extrakci do methylalkoholu podle následujícího postupu: 20 g rybí svaloviny zbavené
kůže a kostí se homogenizuje v mixeru s 80 ml methylalkoholu po dobu 120 s.
Homogenát se přepraví do kádinky a zfiltruje. Poté se 40 µl filtrátu nanese na start
35
chromatogramu. Start se vyznačí čarou 2 cm od spodního okraje chromatogramu,
na kterou označíme místa nanášení. Nanášení se provádí postupně po malých dávkách
pomocí chromatografické jehly s následným vysušením.
Příprava standardu:
• pro vzorek zpracovaný kyselou extrakcí: Naváží se 20 mg standardu, kvantitativně
se převede do 100 ml odměrné baňky a doplní destilovanou vodou po rysku. Do další
baňky se z tohoto roztoku připraví roztok 10 mg/100ml. Poté se 10 µl standardů nanese
na chromatogram vedle vzorku.
• pro vzorek zpracovaný extrakcí do methanolu: Příprava je stejná, jen doplnění na konečný
objem v odměrné baňce se provede methylalkoholem.
Nanášení, vyvíjení a detekce:

Po nanesení vzorku i standardů a po vysušení skvrn, se deska vloží do chromatografické
komory a nechá se vyvíjet tak dlouho, až čelo rozpouštědla vyvíjecí směsi dosáhne 1 cm
pod horní okraj chromatogramu. Deska se po vyjmutí usuší a provede se postřik roztokem
ninhydrinu. Zviditelnění skvrn se provede zahřátím v sušárně (60 °C) po dobu 10 min.
Posouzení:
Skvrna histaminu je červenofialové barvy. Histidin zůstává na startu. Intenzita barevné skvrny
vzorku se porovná se skvrnami standardů a provede se semikvantitativní vyhodnocení: Obsah
histaminu méně než 100 mg/kg, případně méně než 200 mg/kg.
36
MASNÝCH VÝROBKŮ
4.1 STANOVENÍ OBSAHU VOLNÉHO TUKU (ČSN ISO 1444)
Princip:
Metoda je založena na extrakci tuku ze vzorku pomocí nepolárních rozpouštědel, odstranění
rozpouštědla odpařením, sušením a vážením (gravimetricky).
• extrakční rozpouštědlo (n-hexan nebo extrakční benzín)
• mlýnek na maso
• extrakční přístroj (Soxhletův nebo Soxtec)
• písková nebo vodní lázeň
• sušárna
• exsikátor
• extrakční patrona
Postup:
Vzorek po stanovení vody sušením se kvantitativně převede do extrakční patrony. Vatou
navlhčenou rozpouštědlem se vytřou zbytky vzorku z misky a vata se vloží do extrakční
patrony. Patrona se vloží do extrakčního přístroje. Do baňky extrakčního přístroje, která byla
předtím s několika varnými kuličkami vysušena 1 h při 103 °C, ochlazena v exsikátoru
na teplotu místnosti a zvážena s přesností na 0,001 g (m1), se naleje rozpouštědlo. Množství
rozpouštědla musí mít nejméně 1,5 – 2násobnou kapacitu extrakční trubice přístroje. Baňka
se upevní do extrakčního přístroje a zahřívá nejméně 6 hod na pískové nebo vodní lázni podle
rychlosti extrakce a použitého přístroje (u přístroje Soxtec musí být doba zahřívání nejméně
2 hod). Po extrakci se vyjme extrakční baňka obsahující rozpouštědlo a rozpouštědlo
37
se oddestiluje na pískové nebo vodní lázni. Potom se extrakční baňka suší v sušárně 1 hod
při 103 °C, nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží s přesností na 0,001 g. Tento postup
se opakuje do konstantní hmotnosti vzorku (m2).
Výpočet:
Obsah volného tuku (w) se vypočítá podle uvedeného vzorce:
( − )
= ∙ 100 [%]
m0 hmotnost vzorku odebraného pro sušení [g]

m1 hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami [g]
m2 hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami a tukem po vysušení [g]
Poznámka:Výsledek zaokrouhlíme na jedno desetinné místo.
38
4.2 STANOVENÍ OBSAHU SUŠINY
4.2.1 Stanovení vody v mase a masných výrobcích – referenční metoda (ČSN 57 6021)
Princip:
Obsah vody se zjistí z rozdílu hmotností vzorku před sušením a po sušení za podmínek
metody.
• mořský písek
• ethanol
• mlýnek
• sušárna
• exsikátor
• hliníková miska
Postup:
Hliníková miska s 20 – 30 g mořského písku a skleněnou tyčinkou se vysuší za občasného
promíchání při teplotě 103 °C ± 2 °C do konstantní hmotnosti (1 – 2 hod). Miska se ochladí
v exsikátoru, zváží s přesností na 0,001 g, naváží se do ní 5-10 g pomletého vzorku a zváží
se podruhé se stejnou přesností.
Vzorek se skropí několika kapkami ethanolu a promíchá. Poté se suší v pootevřené sušárně
při teplotě 60 °C ± 2 °C po dobu 1 hod a pak se dosouší do konstantní hmotnosti
při 103 ± 2 °C. Za výsledek se považuje nejnižší zjištěná hmotnost, jež se od předchozí
hmotnosti neliší více jak o 0,002 g. Poprvé se úbytek kontroluje po třech hodinách a poté
každou hodinu.
39
Výpočet:
Obsah vody ve vzorku (x) se vypočte:
( − F)
= ∙ 100 [%]
( − )
m1 hmotnost misky s pískem a tyčinkou před sušením [g]

m2 hmotnost misky se vzorkem, pískem a tyčinkou před sušením [g]
m3 hmotnost misky se vzorkem, pískem a tyčinkou po sušení [g]
Výsledek se uvádí jako průměr dvou souběžných stanovení, jež se nemají vzájemně lišit
o více než 0,3 %. Vysušený obsah misky je možné použít ke stanovení tuku.
Sušinu stanovíme výpočtem:
ℎ šH80[%] = 100 − ℎ 0 %
40
4.2.2 Stanovení obsahu vody v mase a masných výrobcích – zkrácená metoda
(ČSN 57 0185)
Princip:
Obsah vody se zjistí z rozdílu hmotnosti vzorku před sušením a po sušení za definovaných
podmínek (170 °C 40 minut).
• ethanol
• mlýnek
• sušárna
• exsikátor
• hliníková miska
Postup:
Do suché hliníkové misky se vloží skleněná tyčinka. Naváží se do ní 10 g homogenizovaného
vzorku s přesností na 0,01 g. Vzorek se zvlhčí malým množstvím ethanolu a pomocí tyčinky
rovnoměrně rozetře po dně misky. Ze začátku se misky suší s pootevřenými dveřmi sušárny.
Po odpaření ethanolu se sušárna uzavře a misky se suší při 170 °C po dobu 40 minut.
Po vychladnutí v exsikátoru se miska zváží.
41
Výpočet:
Obsah vody ve vzorku (x) se vypočte:
( − F)
= ∙ 100 [%]
( − )
m1 hmotnost misky s pískem a tyčinkou před sušením [g]

m2 hmotnost misky se vzorkem, pískem a tyčinkou před sušením [g]
m3 hmotnost misky se vzorkem, pískem a tyčinkou po sušení [g]
Výsledek se uvádí jako průměr dvou souběžných stanovení, jež se nemají vzájemně lišit
o více než 0,3 %.
Sušina se stanoví výpočtem:
ℎ šH80[%] = 100 − ℎ 0 %
42
4.3 STANOVENÍ DUSITANŮ
4.3.1 Stanovení dusitanů v mase a masných výrobcích - referenční metoda (ISO 2918)
Princip:
Po předchozí úpravě vzorku (extrakci horkou vodou, precipitaci proteinů a filtraci) reagují
přítomné dusitany se sulphanilamidem a N-1-naphtylethylendiamin dihydrochloridem
za vzniku červeného zbarvení, vhodného ke spektrofotometrickému stanovení při 538 nm.
• činidlo I
(106 g ferrokyanidu draselného K4[Fe (CN)6].3H2O se doplní na objem 1000 ml)
• činidlo II
(220 g octanu zinečnatého Zn (CH3COO)2.2H2O a 30 ml ledové kyseliny octové se doplní
na objem 1000 ml)
• borax (nasycený roztok)
(50 g tetraboritanu disodného Na2B4O7.10H2O se rozpustí ve vlažné vodě a doplní
na 1000 ml)
• standardní roztok dusitanu sodného
Základní standard je 1,000 g dusitanu sodného (NaNO2) se naředí do 100 ml odměrné
baňky
Pracovní standardy: 0,05 g/l (ředí se každý den čerstvý)
Kalibrační roztoky: 5 roztoků o koncentraci 2,5 - 10,0 µg/ml
• Barvicí roztoky
Roztok I
Ve vodní lázni se rozpustí 2 g sulphanilamidu NH2C6H4SO2NH2 v 800 ml destilované
vody. Ochladí se, jestliže je to nutné, filtruje se. Přidá se za stálého míchání 100 ml
koncentrované kyseliny chlorovodíkové (ρ 1,19 g/ml) a doplní se na 1000 ml destilovanou
vodou.
43
Roztok II
Rozpustí se 0,25 g N-1-naphthylethylenediaminu C10H7NHCH2CH2NH2.2HCl ve vodě.
Naředí se na objem 250 ml. Roztok se skladuje v dobře uzavřené hnědé lahvi, v lednici,
ne déle než jeden týden.
Roztok III
Naředí se 445 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (ρ 1,19 g/ml) na objem 1000 ml.
• mlýnek
• vodní lázeň
• spektrofotometr
• laboratorní sklo a filtrační papír
Postup:
Vzorek se zhomogenizuje pomletím a naváží se 10 g vzorku s přesností na 0,001g. Přepraví
se do Erlenmayerovy baňky, přidá se 5 ml nasyceného roztoku boraxu a 100 ml destilované
vody o teplotě alespoň 70 °C. Baňka se nechá ve vroucí vodní lázni 15 minut za opakovaného
promíchání. Poté se baňka ochladí na teplotu místnosti a pomalu se přidají 2 ml činidla
I a 2 ml činidla II (po každém přídavku se obsah dobře promíchá). Obsah se přepraví
do 200 ml odměrné baňky, doplní po rysku a nechá stát 30 minut při pokojové teplotě. Tekutý
supernatant se opatrně přefiltruje přes filtrační papír.
Barevná reakce:
1. Napipetuje se alikvotní díl filtrátu (ml), ale ne více než 25 ml do 100 ml odměrné baňky
a přidá se voda na objem asi 60 ml.
2. Přidá se 10 ml roztoku I a následně 6 ml roztoku III, zamíchá se a nechá 5 minut stát
v temnu při pokojové teplotě.
3. Pak se přidají 2 ml roztoku II, roztok se zamíchá a nechá stát 3-10 minut v temnu
při pokojové teplotě. Poté se naředí po značku destilovanou vodou.
4. Změří se absorbance při 538 nm.
44
Kalibrační křivka:
Do 100 ml odměrných baněk se napipetuje 10 ml destilované vody a 10 ml od každého
kalibračního roztoku. Objem v odměrných baňkách se upraví asi na 60 ml. Potom
se postupuje stejně jako u vzorku a to od bodu 2.
Výpočet:
Na základě vyhodnocení kalibrační křivky se stanoví obsah dusitanu sodného ve vzorku.
2000
I IJ = ! ∙ [mg/kg]
∙
c koncentrace dusitanu sodného odečtená z kalibrační přímky [µg/ml]
m hmotnost vzorku [g]

V objem filtrátu, vzatý do práce [ml]
45
4.3.2 Stanovení dusitanů spektrofotometricky
Princip:
Dusitany obsažené ve filtrátu vzorku po vysrážení bílkovin se stanovují diazotační reakcí
s kyselinou sulfanilovou a následnou kopulací s alfa-naftolem za vzniku oranžového
azobarviva vhodného ke spektrofotometrickému stanovení.
• DIAZO-1 – 25 mg alfa-naftolu se rozpustí 20 ml kyseliny octové a doplní se destilovanou
vodou na celkový objem 100 ml.
• DIAZO-2 – 500 mg kyseliny sulfanilové se rozpustí za horka zhruba v 50 ml destilované
vody a po přidání 20 ml kyseliny octové se v odměrné baňce doplní destilovanou vodou
na celkový objem 100 ml.
• síran zinečnatý, ZnSO4 roztok 30%
• standardní roztok dusičnanu sodného, NaNO2 c = 1 g/l
• borax, Na2B4O7 nasycený roztok
• mlýnek na maso
• vodní lázeň
• spektrofotometr, kyveta 1 cm
• třepačka na zkumavky
• stojánek na zkumavky
• stojan + kruhy na filtraci
• laboratorní sklo a pomůcky, obvazová vata
Postup:
Naváží se 10,0 g 3 krát pomletého vzorku, přidá se 150 ml destilované vody a nechá se vařit
ve vodní lázni 45 minut. Potom se přidá 10 ml nasyceného roztoku Na2B4O7 a nechá se vařit
ještě 15 minut. Pomalu po kapkách za stálého míchání se přidává ZnSO4 do celkového
objemu 4 ml. Nechá se 15 minut stát, zfiltruje přes vatu a poté přes filtr do 200 ml odměrné
46
baňky. Za stálého promývání vaty destilovanou vodou se doplní odměrná baňka po rysku.
Je li roztok zakalený, přefiltruje se přes filtrační papír.
Diazotační a kopulační reakce:

Činidla DIAZO I a DIAZO II se smíchají ve zkumavkách v poměru 1 : 1 (1 ml + 1 ml)
a přidají se 2 ml filtrátu vzorku, respektive kalibračních roztoků, které se připraví, dle návodu
viz níže. Zkumavky se protřepáním zamíchají a nechají se 30 minut vybarvovat
při laboratorní teplotě. Potom se změří absorbance vzorků proti slepé zkoušce při 520 nm.
Příprava kalibračních roztoků:

Ze zásobního standardního roztoku NaNO2 (c = 1 g/l) se odpipetuje do 100 ml odměrné
baňky 10 ml a doplní destilovanou vodou po rysku. Z tohoto roztoku se naředí 5 pracovních
standardních roztoků o koncentraci 0,1-0,5 mg/100 ml.
Výpočet:
Vyhodnocení se provede metodou kalibrační přímky. Z grafu se odečte koncentrace dusitanů
v mg/100 ml. Po zohlednění navážky a ředění se vyjádří jako mg dusitanů na 1 kg výrobku.
47
4.4 STANOVENÍ OBSAHU CHLORIDŮ
4.4.1 Stanovení obsahu chloridů v mase a masných výrobcích – Volhardova metoda

(ČSN ISO 1841-1)
Princip:
Vzorek je po extrakci horkou vodou a vysrážení bílkovin zfiltrován. Po okyselení je stanoven
přebytek přídavku dusičnanu stříbrného roztokem thiokyanatanu draselného.
• nitrobenzen nebo nonan-1-ol
• kyselina dusičná, HNO3 c = 4 mol/l
• dusičnan stříbrný, AgNO3 c = 0,1 mol/l
• thiokyanatan draselný, KSCN c = 0,1 mol/l
• síran železito-amonný (NH4)Fe (SO4)2.12H2O (nasycený roztok)-indikátor
• činidlo A - rozpustí se 106 g trihydrátu hexakyanoželeznatanu draselného
K4Fe(CN)6.3H2O ve vodě. Převede se kvantitativně do odměrné baňky na 1000 ml
a doplní vodou po značku.
• činidlo B - rozpustí se 220 g dihydrátu octnu zinečnatého Zn (CH3COO)2.2H2O ve vodě
a přidá se 30 ml ledové kyseliny octové. Převede se kvantitativně do odměrné baňky
na 1000 ml a dolní vodou po značku.
• mlýnek na maso
• vodní lázeň
• odměrné sklo (odměrné baňky 1000 a 200 ml, byreta na 25 ml, pipeta 20 ml)
• konické baňky na 250 ml
• filtrační papír
48
Postup:
Do konické baňky se naváží 10 g dobře zhomogenizovaného vzorku (3x pomletého)
s přesností na 0,001 g. Přidá se 100 ml horké destilované vody a baňka se zahřívá 15 minut
ve vroucí vodní lázni. Obsah se občas promíchá. Poté se baňka nechá vychladnout na teplotu
místnosti. Přidají se 2 ml činidla A a 2 ml činidla B. Po každém přídavku se důkladně
promíchá. Baňka se nechá stát 30 minut při teplotě místnosti a následně se obsah převede
kvantitativně do odměrné baňky na 200 ml a doplní destilovanou vodou po rysku. Obsah
se promíchá a zfiltruje přes skládaný filtr.
Do konické baňky se převede 20 ml filtrátu a přidá 5 ml zředěné kyseliny dusičné a 1 ml
síranu železito-amonného. Přidá se 20 ml roztoku dusičnanu stříbrného a 3 ml nitrobenzenu
(nebo nonal-1-olu) a baňka se intenzivně protřepává, aby došlo ke zkoagulování sraženiny.
Potom se titruje obsah baňky thiokyanatanem draselným do stálého růžového zbarvení. Stejně
se provede i stanovení slepého pokusu.
Výpočet:
Obsah chloridů ( ) v hmotnostních procentech (vyjádřený jako chlorid sodný) ve vzorku

se vypočítá s použitím následující rovnice:
200 100 ( 2 − 1) ∙ !
= 0,05844 ∙ ( 2 − 1) ∙ ∙ ∙ ! = 58,44 ∙ [%]
20
w obsah chloridů, vyjádřený jako chlorid sodný v hmotnostních procentech [%]
V1 objem roztoku thiokyanatanu draselného [ml]

V2 objem roztoku thiokyanatanu draselného použitého při slepém pokusu [ml]
c koncentrace roztoku thiokyanatanu draselného [mol/l]
m hmotnost vzorku [g]
Poznámka: Výsledek se udává s přesností na dvě desetinná místa.
49
4.4.2 Stanovení obsahu chloridů v mase a masných výrobcích – Potenciometrická
metoda (ČSN ISO 1841-2)
Princip:
Ve vzorku (po předchozí dispergaci ve vodě) je obsah chloridů stanoven potenciometrickou
titrací roztokem dusičnanu stříbrného s použitím stříbrné elektrody.
• kyselina dusičná, HNO3, ředěná 1 : 49 (v/v)
• chlorid stříbrný AgCl, standardní odměrný roztok c = 0,0856 mol/l
• mlýnek na maso,
• laboratorní mixér
• magnetické míchadlo
• pH/mV metr, elektrody (kombinovaná stříbrná nebo indikační stříbrná a referentní)
• odměrné sklo (pipeta 50 ml)
Postup:
Naváží se 50,0 g dobře homogenizovaného vzorku (3x pomletého) s přesností na 0,1 g
a převede kvantitativně do mixeru. Přidá se 450 ml vody a mixer se uzavře. Zpočátku
se mixuje při nízké frekvenci, později při vysoké frekvenci otáček 1 až 2 minuty.
Potom se 50 ml pomixovaného vzorku napipetuje do 250 ml vytárované kádinky a stanoví
se přesná hmotnost zkoumaného vzorku. K této navážce se přidá 50 ml kyseliny dusičné
a titruje za konstantního míchání roztokem dusičnanu stříbrného tak, že celkový přídavek činí
celkem 50 ml.
Slepý pokus se provede stejným způsobem, pouze homogenát se nahradí destilovanou vodou.
50
Výpočet:
Výpočet chloridů (w), vyjádřený jako chlorid sodný v hmotnostních procentech ve vzorku
se vypočte s použitím následující rovnice:
( 2 − 1) ∙ ! ∙ 50 ∙ 58,44
= [%]
1 ∙
w obsah chloridů, vyjádřený jako chlorid sodný v hmotnostních procentech [%]
V1 objem roztoku dusičnanu stříbrného použitého při stanovení [ml]

V2 objem roztoku dusičnanu stříbrného použitého při slepém pokusu [ml]
c koncentrace roztoku dusičnanu stříbrného [mol/l]
m1 hmotnost zkušebního vzorku [g]
Poznámka: Výsledek udáváme s přesností na jedno desetinné místo.
51
4.4.3 Potenciometrické stanovení chloridů v masných výrobcích (z popela)
Princip:
Chloridové ionty přítomné ve filtrátu vzorku reagují s AgNO3 za vzniku nerozpustného AgCl.
Nadbytečné množství stříbrných iontů se projeví náhlou změnou potenciálu, která se indikuje
potenciometricky.
• dusičnan hořečnatý, Mg(NO3)2
• elektrický vařič
• muflová spalovací pec
• elektromagnetická míchačka
• potenciometr
• váhy s přesností 0,1 g
• měrná stříbrná elektroda
• referentní kalomelová elektroda se solným můstkem
• exsikátor
• porcelánová spalovací miska
• stojan + kruh na filtraci
• stojan + úchyty na byretu
• magnetické míchadlo + pinzeta + magnetická tyčinka
Postup:
10,0 g jemně (3 krát) pomletého salámu se přesně odváží a převede do porcelánové spalovací
misky. Přidá se 0,5 g Mg(NO3)2, promíchá se tyčinkou a za stálého míchání se obsah
zuhelnatí na elektrickém vařiči. Zuhelnatělý odparek se vloží do muflové pece a zpopelňuje
při teplotě 500 °C po dobu minimálně 3 hodin.
Popel se vylouží horkou vodou (80 °C), přefiltruje do odměrné baňky na 100 ml a doplní
destilovanou vodou po rysku. 10 ml vzorku se odpipetuje do kádinky o obsahu 150 ml.
52
Doplní se libovolným množstvím destilované vody tak, aby elektrody byly ponořeny.
Za použití výše popsaných elektrod a potenciometru se za stálého míchání provede titrace
roztokem AgNO3. Během titrace se potenciál prakticky nemění nebo jen zvolna stoupá.
Teprve před bodem ekvivalence je patrnější nárůst potenciálu. Od tohoto okamžiku
se přidávává odměrný roztok po kapkách (po 0,1 ml). V bodě ekvivalence nastane prudký
potenciálový skok. Přetitruje se asi o 2 ml odměrného činidla a titrace se ukončí.
Výpočet:
Sestrojí se potenciometrická křivka, zjistí inflexní bod a odpovídající spotřeba odměrného
činidla se použije k výpočtu.
1 ml AgNO3 0,1 mol/l odpovídá 3,55 mg Cl- nebo 5,84 mg NaCl
Poznámka: Výsledek se přepočítá pomocí navážky na hmotnostní koncentraci. Výsledek

se uvede s přesností na jedno desetinné místo.
53
4.5 PRŮKAZ POLYFOSFÁTŮ V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH (ISO 5553)
Princip:
Po extrakci masa nebo masných výrobků kyselinou trichloroctovou a vyčeření vzorku pomocí
směsi ethanol/diethylether, je provedena separace fosfátů pomocí tenkovrstvé chromatografie
a detekce polyfosfátů pomocí činidla za vzniku barevných sloučenin.
• kyselina trichloroctová, CCl3COOH
• diethylether
• ethanol, 95% (v/v)
• standardní směs – ve 100 ml destilované vody se rozpustí 200 mg NaH2PO4.H2O, 300 mg
Na4P2O7.10H2O, 200 mg Na5P3O10, 200 mg (NaPO3) x [x > 10]. Roztok je stabilní
při 4 °C nejdéle čtyři týdny.
• vyvíjecí směs - 140 ml izopropylalkoholu, 40 ml roztoku kyseliny trichloroctové (135 g/l)
a 0,6 ml hydroxidu amonného NH4OH , cca 25% roztoku
• detekční činidlo I - stejným dílem se smísí roztok tetrahydrátu molybdenanu amonného
75 (g/l) [(NH4)6Mo7O24.4H2O] a koncentrovaná kyselina dusičná HNO3 (ρ = 1,40 g/ml)
a ve 100 ml této směsi se rozpustí 10 g kyseliny vinné. Směs se připravuje v den použití.
• detekční činidlo II - rozpustí se 0,5 g 1-amino-2-naphtol-4-sulphonové kyseliny ve směsi
195 ml roztoku disiřičitanu sodného Na2S2O5 (150 g/l) a 5 ml siřičitanu sodného Na2SO3
(200 g/l). V této směsi se rozpustí 40 g trihydrátu octanu sodného NaOOCCH3.3H2O.
Roztok vydrží v hnědé láhvi v chladničce 1 týden.
• laboratorní mixer
• exsikátor
• skládaný filtrační papír
• mikrodávkovač (1 µl)
• skleněná chromatografická kyveta
• vysoušeč na vlasy
• rozprašovač
54
• sušárna
• tenkovrstvá deska, tloušťka 0,25 mm z celulosy s použitím škrobu jako pojiva
• váhy
Postup:
Do kádinky se naváží 50 g pomletého a v mixeru homogenizovaného vzorku. Přidá se 15 ml
vody o teplotě 40 – 60 °C a tyčinkou dobře promíchá. Přidá se 10 g kyseliny trichloroctové
a po dobrém promíchání umístí na 1 h do chladničky. Poté se supernatant zfiltruje přes
skládaný filtr.
Vlastní chromatografické stanovení:

Alespoň 30 min před vlastním stanovením se naplní chromatografická komora vyvíjecí směsí
tak, aby její výška ode dna činila 5 – 10 mm a uzavře víkem.
Na celulosovou desku se nanesou 3 µl filtrátu vzorku a 3 µl filtrátu standardní směsi 2 cm
od spodního okraje desky tak, aby byly od sebe vzdáleny 1 – 1,5 cm. Současně se provádí
vysoušení pomalu nanášených roztoků pomocí tepelného proudu vzduchu.
Deska se vloží do chromatografické kolony a opět rychle uzavře. Po doběhnutí čela vyvíjecí
směsi asi 10 cm od startu se deska vyjme a suší 10 minut při 60 °C nebo 30 minut při okolní
teplotě nebo proudem studeného vzduchu.
Provede se postříkání chromatogramu detekčním činidlem I. Žluté skvrny se objeví okamžitě.
Deska se usuší horkým vzduchem pomocí vysoušeče a nechá nejméně (pokud následně není
cítit kyselina dusičná) 1 h při 100 °C k odstranění zbytků kyseliny dusičné.
Po vychladnutí desky na teplotu místnosti se provede detekce detekčním činidlem II. Stejným
způsobem, jako viz výše. Modré skvrny se objeví okamžitě.
55
Výpočet:
Vyhodnocení se provede porovnáním hodnoty RF u vzorků a standardní směsi:
orthofosfáty 0,8 - 0,9
difosfáty (pyrofosfáty) 0,5 - 0,6

trifosfáty 0,25 - 0,35
hexametafosfáty 0,0
56
4.6 STANOVENÍ ŠKROBU V MASNÝCH VÝROBCÍCH – ENZYMOVÁ METODA
Princip:
Škrob je štěpen pomocí enzymu amyloglukosidasy (AMG) při pH 4,6 na glukosové
jednotky (1):
AMG
(1) Škrob + (n-1) H2O → n D-glukóza
Vzniklá D-glukóza je při pH 7,6 pomocí enzymu hexokinasy (HK) a glukoso-6-phosphat-

dehydrogenasy (G6P-DH) v následujících dvou reakcích (2,3) postupně zoxidována
na kyselinu D-glukonovou. Množství v reakci (3) vzniklého NADPH je stanoveno
spektrofotometricky při 340 nm a je ekvivalentní množství přítomného škrobu. Výsledky
se vyjadřují jako obsah škrobu v g/100 g.
HK
(2) D-glukóza + ATP → G-6-P + ADP
G6P-DH
+
(3) G-6-P + NADP → D-gluconat-6-P + NADPH + H+
• test Megazyme
• redestilovaná voda
• dimethylsulfoxid (DMSO)
• hydroxid sodný, NaOH c = 8 mol/l
• hydroxid sodný, NaOH c = 0,5 mol/l
• kyselina chlorovodíková, HCl c = 8 mol/l
• citrátový pufr, pH = 4 (kyselina citronová 0,112 mol/l; citrát sodný 0,112 mol/l)
• roztok 1 - 100 mg lyofilizátu citrátového pufru, pH = 4,6; amyloglukosidasa, ca 84 U, 6 ml
redestilované vody
• roztok 2 - 5 g práškové směsi – triethanolamin pufr, pH = 7,6; NADP; ATP; síran
hořečnatý. Obsah se rozpustí ve 27 ml redestilované vody.
57
• roztok 3 - 0,7 ml suspenze (hexokinasa, ca 200 U; glukoso-6-phosphat dehydrogenasa,
ca 100 U). Používá se nezředěný.
• roztok 4 - standard škrobu. Navážka 10 – 50 mg/100 ml.
• vodní lázeň s termostatem a možností míchání
• spektrofotometr UV/VIS, 1 cm kyveta
• sklo
• analytická váha
• homogenizátor
• pH-metr, kombinovaná skleněná elektroda, pufry
• magnetická míchačka
Postup:
Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 100-500 mg dobře homogenizovaného vzorku a přidá
20 ml DMSO a 5 ml HCl (8 mol/l). U vzorků tučných se nejdříve přidá DMSO, u vzorků
netučných se nejdříve přidá HCl. Odměrka se zavře parafilmem a alobalem a nechá inkubovat
cca 1 h ve vodní lázni s mícháním při 60 °C (rozpuštění škrobu). Roztok se ochladí na teplotu
místnosti přidáním 5 ml NaOH (8 mol/l) a baňka se doplní na 100 ml citrátovým pufrem.
Roztok vzorku má mít pH = 4. Roztok se filtruje a vezme ke stanovení.
Schéma pipetování do zkumavek:
Slepá zkouška
vzorku
ROZTOK 1 0,2 ml 0,2 ml -
Redestilovaná voda 0,1 ml - -
Filtrát vzorku - 0,1 ml 0,1 ml
58
Zkumavky se promíchají a 15 min inkubují ve vodní lázni při 60 °C. Kyvety musí být
zavřeny. Potom se přidá:
Slepá zkouška Vzorek Slepá zkouška

vzorku
ROZTOK 2 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Destilovaná voda 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Zkumavky se promíchají a po 3 minutách se změří absorbance (A1). Potom se přidá:
Slepá zkouška Vzorek Slepá zkouška

vzorku
ROZTOK 3 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml
Promíchá se a po 15 minutách změří absorbance A2.
Výpočet:
U slepé zkoušky i u vzorku se vypočítá rozdíl absorbancí:
B" = (" − " ) #$ − (" − " )%&
Přepočet pro stanovení koncentrace škrobu v roztoku:
∙ CD
! = ∙ B" [g/l]
E∙ ∙ ∙ 1000
e extinkční molární koeficient NADH při 340 nm [6,3 l/mmol/cm]
MG molární hmotnost glukózy ve škrobu -162,1 [g/mol]
Poznámka: Přepočítáním výsledku ředěním vzorku se stanoví koncentrace škrobu v původním

vzorku [g/kg].
59
MLÉKA
5.1 STANOVENÍ BÍLKOVIN
5.1.1 Stanovení obsahu celkového dusíku a bílkovin podle Kjeldahla – rozhodčí

metoda (ČSN EN ISO 8968-1)
Princip:
Celkový obsah dusíku v mléce je množství dusíku bílkovinné i nebílkovinné povahy
vyjádřené v g ve 100 g mléka. Zkušební vzorek se mineralizuje směsí koncentrované kyseliny
sírové a síranu draselného za použití síranu měďnatého jako katalyzátoru, přičemž
se přítomný organický dusík převede na síran amonný. Síran draselný se přidává ke zvýšení
bodu varu kyseliny sírové a k zesílení oxidačního účinku směsi pro mineralizaci.
Dusík ve vzniklém síranu amonném se stanovuje destilační metodou. Po zchladnutí
mineralizátu se přidá v nadbytku roztok NaOH a uvolní se NH3 podle reakce:
(1) (NH4)2 SO4 + 2 NaOH = 2 NH3+ 2 H2O + Na2SO4
Reakce při teplotách okolo bodu varu probíhá kvantitativně. Uvolněný NH3 se předestiluje
s vodní parou, jímá do předlohy se známým nadbytečným množstvím standardního roztoku
kyseliny borité, se kterou reaguje podle rovnice:
(2) 2 NH3 + 2 H3BO3 = 2 NH4H2BO3
vzniklý boritan amonný se titruje standardním roztokem HCl:
(3) 2 NH4H2BO3 + 2 HCl = 2 NH4Cl+ 2 H3BO3
1 mol HCl = 1 mol N = 14 g N

1 ml 0,1 M HCl = 0,0014 g N
60
• síran draselný, K2SO4, prostý dusíku
• roztok síranu měďnatého, CuSO4.5 H2O c = 5,0 g/100 ml
• kyselina sírová, H2SO4 ρ20 = 1,84 g.cm-3, prostá dusíkatých látek
• roztok hydroxidu sodného, NaOH alkalizační roztok s hmotnostním podílem 50 g
hydroxidu sodného v 100 g roztoku.
• roztok kyseliny borité, H3BO3 c = 40,0 g/l
• standardní odměrný roztok kyseliny chlorovodíkové, HCl c = 0,1 ± 0,0005 mol/l
• indikátorový roztok, příprava: (0,1 g sodné soli methylčerveně se rozpustí v 95% ethanolu,
zředí se ethanolem na 50 ml a promíchá; 0,5 g bromkresolové zeleně se rozpustí v 95%
ethanolu, zředí se ethanolem na 250 ml a promíchá), 1 díl roztoku methylčerveně
se smíchá s pěti díly roztoku bromkresolové zeleně nebo se oba roztoky slijí dohromady
a promíchají).
• síran amonný, (NH4)2 SO4 o čistotě nejméně 99,9 %
• Kjeldahlovy baňky na 500 nebo 800 ml
• vodní lázeň
• analytické váhy s odečtem na 0,1 g
• mineralizační aparatura
• aparatura pro destilaci s vodní parou (destilační přístroj podle Markhama)
• byreta
• titrační baňky, odměrné válce, pipety
• automatický titrační přístroj vybavený pH metrem,
• pomocný varný materiál (varné kaménky).
Postup:
Do Kjeldahlovy baňky se přidá 5 až 10 varných kaménků, 15,0 g K2SO4, 1,0 ml roztoku
síranu měďnatého, 5,0 ± 0,1 g vzorku s odečtem na 0,1 mg a přidá se 25 ml kyseliny sírové.
Baňka se umístí nad mírný plamen a opatrně se zahřívá, aby obsah nevypěnil, přibližně
20 minut. Pak se zvýší plamen, zahřívá se dalších asi 15 minut. Poté se ohřev zvýší
na maximum a zahřívá se tak dlouho, dokud se veškeré organické látky nespálí, což se projeví
vyčeřením kapaliny. Po vyjasnění vzorku se pokračuje v zahřívání asi 1 – 1,5 hodiny.
61
Po vychladnutí na pokojovou teplotu se obsah baňky mírně zředí. Používá-li se Kjeldahlova
baňka na 500 ml, přidává se 300 ml vody. Obsah baňky se důkladně promíchá a přidá
se opatrně 75 ml roztoku NaOH tak, aby vytvořil na dně baňky vrstvu. Baňka se připojí
na destilační přístroj. Konec chladiče je ponořen do titrační baňky s 50 ml roztoku kyseliny
borité. Obsah baňky se otáčením důkladně promíchá a baňka se umístí na zdroj ohřevu. Ohřev
se nastaví tak vysoko, aby směs vřela. Uvolněný amoniak se destiluje přeháněním vodní
parou a jímá v roztoku kyseliny borité. V destilaci se pokračuje do té doby, než začne obsah
nepravidelně vřít. Chlazení musí být účinné, aby se zabránilo zahřátí roztoku kyseliny borité
nedostatečně zchlazeným destilátem. Pak se předloha s kyselinou sníží tak, aby konec trubice
chladiče nebyl ponořen do kyseliny, a destilace se nechá probíhat ještě asi 5 minut. Konec
trubice se opláchne destilovanou vodou do předlohy. Obsah předlohy se titruje 0,1 N HCl
za přídavku indikátoru do změny zabarvení. Bodem přechodu je první známka změny
zabarvení do růžova. Spotřeba na byretě se odečte nejméně na 0,05 ml. Stejným způsobem
se provede slepý pokus. Při provádění slepého pokusu se místo vzorku použije 5 ml vody
s přídavkem 0,85 g sacharózy. Správnost metody je nutné pravidelně přezkušovat podle
prováděných zkoušek výtěžnosti.
Výpočet:
Obsah N v analytickém vzorku wN se vypočítá podle následující rovnice:
1,4007 . ( _ − ` ). Ca
w^ =
wN obsah dusíku ve vzorku uváděný jako hmotnostní podíl v procentech

VS numerická hodnota objemu kyseliny chlorovodíkové spotřebované při stanovení
v mililitrech, uváděná v zaokrouhlení nejméně na 0,05 ml
Vb numerická hodnota objemu kyseliny chlorovodíkové spotřebované při slepém
pokusu v mililitrech, uváděná v zaokrouhlení nejméně na 0,05 ml
Mr numerická hodnota přesné molarity kyseliny chlorovodíkové uváděna
na 4 desetinná místa
m numerická hodnota hmotnosti zkušebního vzorku v gramech, uváděná
v zaokrouhlení na 0,1 mg
62
Výpočet obsahu hrubých bílkovin:
Obsah hrubých bílkovin analytického vzorku wp se vypočítá podle následující rovnice:
b = c ∙ 6,38
wp obsah hrubých bílkovin ve vzorku, uváděný jako hmotnostní podíl

v procentech
wN
obsah dusíku ve vzorku uváděný jako hmotnostní podíl v procentech na čtyři
desetinná místa
6,38
obecně uznávaný faktor pro násobení obsahu dusíku, má-li se uvádět
v přepočtu na obsah hrubých bílkovin
Metoda byla vypracována v makro i mikro provedení. Metoda slouží jako referenční
a současně jako metoda pro kalibraci přístrojů pro automatické stanovení bílkovin.
63
5.1.2 Stanovení bílkovin roztokem amidočerni 10 B (provozní metoda
podle ČSN 57 0530)
Princip:
Bílkoviny reagují s roztokem organického barviva amidočerni 10 B, výsledkem je vytvoření
nerozpustného komplexu bílkovina - barvivo. Po odstranění nerozpustného komplexu
odstředěním (nebo filtrací) se obsah bílkovin stanoví na základě absorbance roztoku
obsahujícího přebytek barviva. Množství bílkovin se odečte z kalibrační křivky, která
se sestrojí vynesením závislosti úbytku zabarvení roztoku amidočerni 10 B na stoupajícím
obsahu bílkovin stanovených výše uvedeným způsobem a metodou podle Kjeldahla. Obsah
bílkovin se vyjádří v g na 100 g mléka.
• kyselina citronová, c = 0,3 mol.l-1 (57,638 g kyseliny citronové rozpustit a doplnit
na 1000ml)
• roztok amidočerni 10B, 0,616 g rozpustit v 1000 ml roztoku 0,3 mol/l kyseliny citronové
• spektrofotometr Spekol 11
• váhy
• odměrné baňky 100 a 1000 ml
• pipety
• odstředivka
• zkumavky
Postup:
Do odměrné baňky na 100 ml se odměří 5 ml mléka, doplní se destilovanou vodou po značku
a obsah se důkladně promíchá. Ke 2,5 ml takto zředěného roztoku v kónické odstřeďovací
zkumavce se přidá 5 ml barviva amidočerni 10 B, promíchá se a nechá stát 10 minut
při laboratorní teplotě. Vzniklá sraženina se odstřeďuje 5 minut při 2500 ot./min. Do odměrné
baňky na 100 ml se odpipetují 3 ml supernatantu a doplní se destilovanou vodou po značku.
Dobře se promíchá protřepáním a odečte se absorbance při 615 nm proti destilované vodě
v 1 cm kyvetě.
64
Výpočet:
Obsah bílkovin se odečte z kalibrační křivky. Kalibrační křivka se získá vynesením
absorbance proti obsahu bílkovin ve vzorku stanovenému Kjeldahlovou metodou. Pro každý
druh mléka (syrové, pasterované, homogenizované, obnovené) musí být sestrojena zvlášť.
65
5.1.3 Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza
na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného)
Princip:
Metoda je založena na elektroforéze komplexů denaturovaných polypeptidů s anionickým
detergentem dodecylsulfátem sodným (SDS). Navázáním SDS se nábojové rozdíly mezi
různými proteiny téměř úplně potlačí, komplexy protein – SDS jsou v neutrálním
a alkalickém prostředí silně negativně nabité a putují k anodě. Procházejí-li gelem o vhodné
porozitě, je jejich pohyblivost dána téměř výhradně velikostí molekuly. Srovnáním
s pohyblivostí standardů o známé molekulové hmotnosti lze tak snadno a relativně přesně
určovat molekulové hmotnosti proteinů, resp. jejich podjednotek.
• akrylamid pro elektroforézu
• N, N´-bisakrylamid pro elektroforézu
• peroxodisíran amonný (persíran amonný) pro elektroforézu
• TEMED pro elektroforézu
• bromfenolová modř pro elektroforézu
• glycin
• Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) pro elektroforézu
• 2-merkaptoethanol pro elektroforézu
• Coomasie brilliant blue R-250 pro elektroforézu
• glycerol
• kyselina octová, CH3COOH
• kyselina chlorovodíková, HCl
• kyselina chromsírová
• dichlormethan, CH2Cl2
• isobutylalkohol, C4H10O
• ethanol
• standardy bílkovin
• Tris pH 6,8 (0,25 mol/l) – 3 g Tris rozpustit v 50 ml vody, dotitrovat konc. HCl
na pH 6,8 a doplnit do 100 ml vodou
66
• redukující pufr – 2,4 ml Tris pH 6,8, 2 ml 10 % SDS (w/v), 1 ml glycerol, 0,5 ml
2–merkaptoethanol, 4 ml destilované vody, 0,1 ml bromfenolová modř (10 mg
bromfenolové modři rozpustit v 1 ml Tris pH 6,8)
• Tris pH 8,8 (0,75 mol/l) - 9,1 g Tris rozpustit v 50 ml vody, dotitrovat konc. HCl na pH
8,8 a doplnit do 100 ml vodou
• 30% roztok akrylamidu – 30 g akrylamid (99,9 %), 0,8 g N, N-methylenbisakrylamid,
doplnit do 100 ml destilovanou vodou (lze zamrazit do zásoby po 20 – 30 ml)
• směs na separační gel (15 % T, 2,6 % C) – základ směsi: 14,4 ml 30% roztok akrylamidu,
15 ml Tris (pH 8,8), 0,3 ml SDS (základ směsi uchovávat zamrazený). Ke 5 ml základu
směsi se přidá 20 µl 10% TEMEDu (0,1 ml TEMED, 0,9 ml destilovaná voda) a 55 µl
čerstvého roztoku persíranu amonného (0,1 g persíran amonný, doplnit na 1 g
destilovanou vodou)
• směs na zaostřovací gel (3 % T, 2,6 % C) – základ směsi: 1 ml 30% roztok akrylamidu,
5 ml Tris (pH 6,8), 0,1 ml SDS, 3,8 ml destilované vody (základ směsi uchovávat
zamrazený). Ke 2 ml základu směsi se přidá 10 µl 10% TEMEDu a 30 µl čerstvého
roztoku persíranu amonného
• ekvilibrační roztok – 50 ml Tris (pH 8,8), 1 ml SDS, 49 ml destilované vody
• koncentrovaný elektrodový pufr – 30,3 g Tris, 144 g glycinu, 10 g SDS, doplnit do 1 litru
destilovanou vodou
• elektrodový pufr – 100 ml koncentrovaného elektrodového pufru a 900 ml destilované
vody
• barvící roztok – 0,5 g Coomasie brilliant blue R-250, 450 ml ethanol, 100 ml kyselina
octová, 450 ml destilovaná voda
• odbarvovací roztok – 250 ml ethanol, 100 ml kyselina octová, 650 ml destilovaná voda
• sušící roztok – 250 ml ethanol, 30 ml glycerol, doplnit do 1 litru destilovanou vodou
Poznámka: Akrylamid a N, N´-metylenbisakrylamid jsou neurotoxické látky. Roztoky

nepipetovat ústy a pracovat v rukavicích!!!
• odstředivka, mikrocentrifuga, lyofilizátor, pH metr, elektromagnetická míchačka
• analytické váhy, termoblok, elektroforéza Mini-Protean III Cell Electrophoresis apparatus
• třepačka, scanner, vyhodnocovací program ElfoMan 2.6, laboratorní potřeby
67
Postup:
Mléko
Vzorky mléka se odstředí při 10 000 g po dobu 30 min a naředí destilovanou vodou
dle potřeby. Přidá se redukující pufr v poměru 1:1. Vzorky se vaří 2 min ve vodní lázni
a nanesou na elektroforetický gel. Např. (10 µl mléka + 240 µl destilované vody) + 250 µl
redukujícího pufru.
Kasein
Vzorky mléka se vysráží 10% kyselinou octovou na pH 4,6. Zbylý tuk se odstraní
z kaseinového precipitátu promytím v roztoku dichlormethan-voda (1:1) s následným
odstředěním při 4500 g po 15 min. Opakuje se 3 krát. Finální kaseinový precipitát
se lyofilizuje. 80 mg lyofilizovaného kaseinu se rozpustí v 10 ml 0,25 M Tris pH 6,8. Vzorky
se odstředí při 10 000 g po dobu 30 min. Ke 40 µl odstředěného vzorku se přidá 70 µl Tris
pH 6,8 a 110 µl redukujícího pufru. Takto připravené vzorky se vaří po dobu 2 min ve vodní
lázni. Vzorky se mohou uchovávat zamrazené při – 20 °C.
Do stojánku pro elektroforézu se upevníme skla (skla se předem zbaví bílkovin ponořením
do kyseliny chromsírové, opláchnou destilovanou vodou, odmastí denaturovaným lihem
a osuší). Asi 2 cm pod horní okraj menšího ze skel se aplikuje pomocí pipety směs
na separační gel (bez bublin), která se převrství isobutylalkoholem na 30 min. Během této
doby dojde k polymeraci gelu. Pomocí injekční stříkačky s jehlou se odsaje isobutylalkohol
a gel se převrství na 30 min ekvilibračním roztokem. Poté se ekvilibrační roztok odsaje, naleje
se směs zaostřovacího roztoku a zasune plastový „hřeben“ na vytvoření jamek pro vzorky tak,
aby nedošlo ke vzniku bublin. Po polymeraci zaostřovacího gelu (30 min) se hřeben vyndá.
K separaci kaseinových frakcí se používá elektroforéza Mini-Protean III Cell Electrophoresis
apparatus (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Připravená skla s gely se upevní do stojanů
a vloží do kyvety. Anodový i katodový prostor kyvety se naplní elektrodovým pufrem tak,
aby byly elektrody ponořeny. V katodovém prostoru je nutné použít vždy čerstvý pufr.
Vzorky o objemu 1 - 25 µl (záleží na koncentraci bílkovin) se nanáší pomocí mikrodávkovače
typu Hamilton podvrstvením pod elektrodový pufr do jamek pro vzorky. Po nanesení vzorků
se elektroforéza připojí ke zdroji Power Pac 300 (Bio-Rad laboratories, Richmond, CA).
Vlastní elektroforéza probíhá v poli stejnosměrného elektrického proudu při napětí
110 V při pokojové teplotě, dokud ostrá zóna bromfenolové modři nedosáhne ke spodnímu
okraji gelu (cca 2 hod). Po skončení elektroforézy se skla s gely vyndají z pufru a odstraní
zbytky zaostřovacího gelu. Separační gely se dále barví.
68
Separační gely se barví na Petriho miskách v barvícím roztoku s Comassie brilliant blue
R-250 1 hod. Přebytek barviva se odstraní několikanásobným vymytím v odbarvovacím
roztoku, dokud se neodbarví pozadí gelu a jednotlivé frakce nejsou od sebe zřetelně
odlišitelné. V další fázi se gely přemístí na Petriho misky se sušícím roztokem na dobu
20 min. Barvení, odbarvování a sušení gelů probíhá za stálého třepání. Ukázka barveného
gelu Coomassie brilliant blue R-250 je na obrázku 1.
Po uplynutí této doby se gely suší mezi dvěma celofánovými foliemi v jednoduchém zařízení
sestávajícím se ze dvou rámečků, upevněných svorkami, při pokojové teplotě.
Suché gely se naskenují a vyhodnotí pomocí počítačového programu ElfoMan 2.6 (Servis
a prodej laboratorních přístrojů, ČR).
Obrázek 1: Gel barvený Coomassie brilliant blue R
laktoferin
BSA
αS2-CN
αS1-CN
β-CN
κ-CN
β-LG
α-LA
Autor: Králová
Popis: BSA – bovinní sérový albumin, CN – kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin
Graf 1: Vyhodnocení gelů pomocí programu ElfoMan 2.6 – vzorek mléka
69
5.2 STANOVENÍ MLÉČNÉHO TUKU
5.2.1 Stanovení tuku podle Röse-Gottlieba (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530)
Princip:
Obsah tuku je podíl extrahovaný za podmínek metody. Po rozpuštění bílkovin amoniakem
se za přídavku ethanolu extrahuje tuk směsí étheru a petrolétheru. Vyjadřuje se v g tuku
ve 100 g mléka.
• amoniak, NH3, roztok asi 25 %, ρ = 0,907 g.cm-3
• ethanol 96 ± 2 % obj., může být i ethanol denaturovaný 1 % benzínu
• ethyléther peroxidu prostý, bod varu 34 až 35 °C. Zkouška na přítomnost peroxidů:
k 10 ml etheru se ve válci se zabroušenou zátkou přidá 1 ml čerstvě připraveného 10%
roztoku jodidu draselného a protřepe se. Po 1 minutě stání se nesmí objevit žluté
zabarvení. Odstranění peroxidů: k 1000 ml étheru se v zabroušeném válci přidá asi 80 cm2
zinkové fólie, nastříhané na proužky tak dlouhé, aby dosahovaly nejméně do poloviny
válce, zinkové fólie se předem ovlhčí a celé se na 1 minutu ponoří do zředěného
okyseleného roztoku síranu měďnatého a pak se opláchnou vodou
• petroléther, frakce destilující v rozmezí 40 až 60 °C, čerstvě předestilovaný nejlépe
za přítomnosti asi 500 mg máselného tuku na 100 ml petrolétheru. Ethanol a ethery
nesmějí zanechat po odpaření žádný zbytek
• neporézní materiál k usnadnění destilace etheru.
Přístroje a potřeby:
• extrakční přístroj (sifonový nebo Röhringův, opatřený zabroušenou skleněnou zátkou
nebo korkovou zátkou zbavenou tuku tím, že se před použitím extrahuje etylétherem
a petrolétherem, ponechá 20 minut ve vodě při nejméně 60 °C a pak se ve vodě ochladí,
aby byla při použití nasycena)
• pipety
• exsikátor
70
Postup:
Do extrakčního přístroje se diferenčně naváží 10 až 11 g mléka s přesností na 0,0002 g, přidá
se 1,4 ml amoniaku a dobře se promíchá. Pak se přidá 10 ml ethanolu a opět se mírně,
ale důkladně promíchá. Následuje přídavek 25 mol ethylétheru, přístroj se uzavře zátkou,
protřepává a převrací 1 minutu. Po ochlazení přístroje vodou se přidá 25 ml petrolétheru tak,
že prvními několika mililitry se opláchne zátka přístroje dovnitř. Opakuje se protřepávání
1 minutu. Přístroj se nechá v klidu nejméně 2 hodiny, dokud se neoddělí horní vrstva
od spodní. Zátka přístroje se opláchne směsí rozpouštědel dovnitř a převede horní vrstva
opatrně do baňky, která byla 1 hod sušena při 102 ± 2 a zvážena s přesností na 0,0001 g.
Převádění se provede podle typu extrakčního přístroje buď přefouknutím, nebo u Röhringova
přístroje se roztok étheru vypustí postranním kohoutem. Používá-li se přefukovacího zařízení,
opláchne se 2 x do přístroje a vrstva se převede znovu do baňky. Potom se opakuje extrakce
za použití 25 ml ethylétheru a 25 petrolétheru stejným způsobem a ještě potřetí se extrahuje
směsí obou etherů (15+15 ml). Směs rozpouštědel se oddestiluje z baňky. Baňka se pak 1 hod
suší při 102 ± 2 °C položená na bok a váží s přesností na 0,0001 g po vychladnutí
v exsikátoru. Sušení se opakuje, až se dosáhne minimální váhy (vážení, kdy se váha zvýšila,
se nepočítá). Jestliže zůstane jakýkoliv netukový podíl, tuk v baňce se rozpustí v 15 ml
petrolétheru, nerozpuštěný zbytek se nechá usadit a roztok se opatrně dekantuje. Celý postup
se opakuje několikrát, až je tuk z baňky kvantitativně odstraněn. Nakonec se 3 x opláchne
menším množstvím petrolétheru hrdlo baňky zvenčí. Baňka se suší 1 hod při 102 ± 2 °C
a zváží se. Stejným způsobem se provede slepý pokus s používanými chemikáliemi a 10 ml
vody.
71
Výpočet:
[( – ) − (! – ! )] . 100
=
a navážený podíl mléka [g]

b1 hmotnost baňky – vyextrahovaného tuku [g]
b hmotnost baňky po vyjmutí vyextrahovaného tuku petrolétherem [g]
c1 hmotnost baňky po provedení slepého pokusu [g]
c hmotnost baňky po provedení slepého pokusu a extrakci případného zbytku
petrolétherem [g]
Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 0,03%, u odtučněného mléka 0,01 %. Shodnost

0,05 %, u odtučněného mléka 0,015 %.
72
5.2.2 Stanovení tuku acidobutyrometrickou metodou (provozní metoda
podle ČSN 57 0530)
Princip:
Obsah tuku je podíl tuku, který se oddělí v butyrometru odstředěním po rozpuštění bílkovin
kyselinou sírovou za přídavku amylalkoholu. Obsah tuku odečtený na stupnici butyrometru
se vyjádří v g na 100 ml mléka, nebo po přepočtu v g/100 g mléka.
• Gerberova kyselina sírová, H2SO4 ρ = 1,817 ± 0,003 g.cm-3
• amylalkohol, ρ= 0,818 g.cm-3 až 0,818 g.cm-3
• butyrometr podle ČSN 25 7631
• pipeta podle ČSN 704121 na 11 ml mléka
• automatická pipeta na kyselinu sírovou, 10 ± 0,2 ml
• automatická pipeta na amylalkohol, 1 ± 0,05 ml
• odstředivka na butyrometry
• vyhřívací lázeň na butyrometry
Postup:
Do butyrometru se odměří automatickou pipetou 10 ml kyseliny sírové a mléčnou pipetou
11 ml mléka vytemperovaného na 20 ± 2 °C, které se opatrně navrství na kyselinu tak,
aby se obě kapaliny nepromísily. Pipeta se drží ve svislé poloze a obsahová ryska ve výši očí.
Při odměřování mléka se odečítá horní meniskus. Při vypouštění mléka se pipeta drží pod
úhlem asi 45 °C. Špička pipety se přiloží ke stěně butyrometru v místě, kde hrdlo přechází
v rozšířenou část tak, aby se nesmočilo hrdlo. Po vypuštění mléka z pipety se počká
asi 3 vteřiny. Pipeta se od stěny butyrometru odtrhne a zbytek mléka se z pipety nevyfukuje.
Mléko se převrství 1 ml amylalkoholu, butyrometr se zazátkuje pryžovou zátkou a obsah
se prudce protřepe. Obsah butyrometru se promísí převracením a posunutím zátky se upraví
hladina na stupnici tak, aby sahala až k nejvyššímu dílku stupnice. Po protřepání
se butyrometry ještě horké ihned odstřeďují při předepsané rychlosti. Klesne-li teplota
v butyrometrech před odstředěním pod 65 °C, je nutné je předehřát v lázni na teplotu
73
65 – 68 °C a pak odstředit. Po odstředění se butyrometry vloží do vodní lázně o teplotě
65 - 68 °C, hladina vody v lázni musí sahat nad horní okraj tukového sloupce. Butyrometry
se temperují 3-5 minut a pak se odečte obsah tuku. Spodní konec tukového sloupce
se pohybem zátky posune tak, aby se kryl s nejbližší ryskou označující celé procento, a odečte
se nejnižší bod menisku tukového sloupce. Při odečítání se butyrometr drží ve svislé poloze
a meniskus, kde se tuk odečítá, musí být ve výši očí. Odečítá se s přesností na polovinu
nejmenšího dělení stupnice a výsledek se zaokrouhlí na dvě desetinná místa.
Výpočet:
Obsah tuku v g ve 100 ml mléka (x) se vypočte podle vzorce:
= −
a procento tuku odpovídající dolní hladině tukového sloupce na butyrometru

b procento tuku odpovídající spodnímu menisku horní hladiny tukového sloupce
na butyrometru
Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 0,05%, shodnost 0,1 %
Obsah tuku stanovený acidobutyrometrickou metodou s 11 ml mléka (x) se převede na obsah

tuku v g na 100 g mléka (y) podle vzorce:
− 0,04
y =
1,04
74
5.2.3 Stanovení látkového obsahu volných mastných kyselin (podle ČSN 57 0533)
Metoda je určena pro stanovení veškerých extrahovatelných volných mastných kyselin.

Metoda se používá pro výběr vhodného syrového mléka nebo mlékárensky ošetřeného mléka
s titrační kyselostí do 9 ml NaOH/100 ml a smetany pro výrobu másla.
Princip:
Mléčný tuk se extrahuje ve směsi izopropylalkoholu a petrolétheru v kyselém prostředí.
Při extrakci přecházejí do nevodné fáze volné mastné kyseliny, vzniklé lipolýzou máselného
tuku a část přítomné kyseliny mléčné. V alikvotním podílu nevodné fáze se titrují odměrným
roztokem hydroxidu veškeré přítomné kyseliny.
• izopropylalkohol, C3H8O
• petroléther
• kyselina sírová, H2SO4 c = 2 mol/l
• směsné extrakční činidlo (izopropylalkohol, petrolether a kyselina sírová, H2SO4
c = 2 mol/l se smíchají v poměru objemů 40+10+1)
• methanol, CH3OH c = 95%
• indikátor fenolftalein, 1% roztok v methanolu
• hydroxid draselný, KOH c = 0,02 mol/l v methanolu
• mikrobyreta na 2 ml s hodnotou dílku 0,01 ml
• pipeta dělená na 5 ml s hodnotou dílku 0,05 ml
• nedělená pipeta na 5 ml
• titrační baňky na 25 ml a 50 ml
• extrakční zkumavky se zabroušenou zátkou nebo zátkou z plastu, nejméně na 30 ml
Postup:
Před analýzou se vzorek mléka důkladně promíchá a ohřeje se na teplotu 30 °C. Ze vzorku
se odebere 3 ml do extrakční zkumavky. Pipetou se přidá 10 ml směsného extrakčního
75
činidla, 6 ml petrolétheru a 4 ml destilované vody, uzavře se zátkou a obsah se intenzívně
protřepe po dobu 15-30 s a nechá se v klidu při pokojové teplotě stát 10 minut. Po oddělení
vrstev se z horní nevodné vrstvy odpipetuje 5 ml do malé titrační baňky, přidá se 6 kapek
indikátoru a titruje se odměrným roztokem KOH do růžového zabarvení, stejně
jako při slepém pokusu. Souběžně se provede stejným způsobem slepý pokus, se stejným
množstvím činidel, pouze místo zkušebního vzorku (mléka) se odpipetují 3 ml vody.
Výpočet:
Látkový obsah volných mastných kyselin v mmol/kg tuku (s) se vypočítá podle vzorce:
(V − V ) . !(KOH) . 10h
s =
. 1i . j
V1 spotřeba odměrného roztoku KOH při titraci odpipetovaného podílu

extraktu [ml]
V0 spotřeba odměrného roztoku KOH při titraci slepého vzorku [ml]
c (KOH) přesná koncentrace odměrného roztoku KOH [mol/l]
V objem zkušebního vzorku [ml]
rt hmotnostní koncentrace tuku ve zkoušeném mléce, vypočtená z výsledku
acidobutyrometrického stanovení [g/l]
K konstanta hodnoty 0,628; vypočtená z poměru odpipetovaného podílu
nevodné fáze k celkovému objemu nevodné fáze (5/7,96)
Poznámka: Opakovatelnost - rozdíl dvou souběžných stanovení nemá být větší než 5 mmol/kg.
76
5.2.4 Stanovení mastných kyselin metodou plynové chromatografie
Princip:
Lipidy a složky rozpustné v mléčném tuku jsou z mléka izolovány metodou dvojí
centrifugace. Triacylglyceroly získaného mléčného tuku jsou po zmýdelnění reesterifikovány
methanolem na methylestery mastných kyselin a následně stanoveny metodou plynové
chromatografie s plamenově ionizační detekcí.
• hydroxid draselný, KOH Mr = 56,11 g/mol
• methanol LiChrosolv
• methyloranž Mr = 327,24 g/mol
• kyselina sírová, H2SO4 p.a. 96%, Mr = 98,08
• n-hexan pro kapalinovou chromatografii
• vyžíhaný síran sodný 99%, Mr = 142,04 g/mol
• směs methylesterů mastných kyselin SupelcoTM 37 Component FAME Mix
• hydromatrix PSE – Spe-ed PSE Matrix
• petrolether bod varu 40–60 °C pro organické stopové analýzy UniSolv
• isopropylalkohol p.a.
• aceton LiChrosolv
• ethanol
• mořský písek praný
• voda neionizovaná
• plyny (dusík 5.0, vodík 3.0, vzduch syntetický)
• extrakční rozpouštědlo (petrolether, izopropylalkohol a aceton v poměru 3:2:1)
• ethanolický roztok methyloranže (100 mg methyloranže se rozpustí v malém množství
deionizované vody a poté doplní ethanolem na konečný objem 100 ml)
• FAME Mix o koncentraci 0,5 mg/ml (0,5 ml FAME Mix o koncentraci 10 mg/ml doplnit
hexanem na celkový objem 10 ml)
• vodní lázeň, analytické váhy, odstředivka na zkumavky a mikrozkumavky
• varná deska, magnetická míchačka, třepačka, vakuová rotační odparka
77
• one PSE extraktor, plynový chromatograf, plamenově ionizační detektor
• kapilární kolona, software pro vyhodnocování chromatogramů
• laboratorní pomůcky (zkumavky centrifugační, mikrozkumavky Eppendorf, varné baňky
s rovným dnem a zábrusem, odměrné baňky, odměrné válce, pipety, zpětné chladiče,
skleněné kuličky, dělící nálevky, gumičky, filtrační papír KA2, stojan + kruhy na filtraci,
vialky, stojan na vialky, třecí misky s tloučky, patrony PSE)
Postup:
Izolace tuku – mléko:
Vzorek mléka se vytemperuje ve vodní lázni na 40 °C, promíchá, rychle ochladí na 20 °C
a znovu důkladně promíchá. Poté se odměří asi 10 ml zhomogenizovaného mléka
do centrifugační zkumavky a odstředí při 3000 otáčkách/min po dobu 10 minut. Získaná
tuková vrstva se přenese do 1,5 ml mikrozkumavek a odstředí při pokojové teplotě, 13 000
otáčkách/min po dobu 20 minut. Výsledkem poslední centrifugace, je rozdělení vzorku do tří
vrstev viz obrázek 2. Horní vrstva tuku se použije pro následnou přípravu esterů mastných
kyselin.
Obrázek 2:Rozdělení vzorku do tří vrstev
tuk
bílkoviny, tuk a ve vodě nerozpustné pevné látky
voda
Foto: Králová
Izolace tuku – sýry:

Do třecí misky se dají 4 g sýru. Přidá se 4 – 5 lžic hydromatrixu PSE, aby směs byla sypká.
Přidá se malá lžička skleněných kuliček pro extrakci vzorku. Směs se kvantitativně převede
do patrony PSE a přidá dle potřeby mořský písek viz. obrázek 3.
78
Obrázek 3: Patrona PSE
vnitřní okraj
písek
směs vzorek + hydromatrix
frita filtrační papír

uzavírací šroub
Foto: one PSE Operační manuál
Extrahuje se na přístroji one PSE extraktor (Applied Separations, Inc., USA) s extrakčním
rozpouštědlem za podmínek:
• 100 °C
• 100 bar
• čas 1 minuta
• 3 cykly
Po extrakci se vzorek přefiltruje přes vyžíhaný bezvodý síran sodný a filtr KA2 do baňky
se zábrusem o objemu 250 ml a odpaří na vakuové rotační odparce právě do sucha.
Příprava methylesterů mastných kyselin:

Do 100 ml varné baňky se zábrusem se naváží asi 100 mg vzorku tuku, přidá 15 ml 0,5 mol/l
methanolického roztoku hydroxidu draselného a skleněné kuličky. Vzorek se zmýdelňuje
při teplotě 130 – 150 °C (na varné desce nastavit na č. 12) po dobu 30 minut pod zpětným
chladičem. Po ochlazení se směs zneutralizuje koncentrovanou kyselinou sírovou
na methyloranž do růžového zbarvení. Přidá se jedna kapka kyseliny navíc a směs se poté
při zahřívání reesterifikujeme dalších 30 minut. Po ochlazení se směs převede do 250 ml
dělící nálevky, přidá 15 ml hexanu a vytřepává po dobu 15 minut. Po oddělení fází
se přefiltruje horní organická vrstva přes filtr KA2 a bezvodý síran sodný. Získaný čistý
supernatant si napipetujeme do vialky.
79
Chromatografické stanovení:
Získané vzorky ve vialkách se proměří na plynovém chromatografu s automatickým
dávkovačem vzorků a plamenově ionizační detekcí. Do autosampleru se umístí vialky
s hexanem, kalibračním roztokem a vzorky. Řízení plynového chromatografu i autosampleru,
sběr a zpracování dat se provádí pomocí počítače s chromatografickým softwarem Clarity
(DataApex, ČR). Validační parametry byly stanoveny pomocí softwaru Effi Validation 3.0.
Výpočet:
Identifikaci a kvantifikaci mastných kyselin se provádí na základě srovnání se standardem
37 mastných kyselin FAME MIX 37 (Supelco). Vyhodnocení se provádí metodou kalibrační
křivky.
Ve výpočtu konečného množství jednotlivých methylesterů mastných kyselin se zohlední
celkový objem použitého hexanu.
klmno (pq)
Výpočet multiplikačního koeficientu (multiplier): onrážsn rtuvsw (x) × 1 / 3
Poznámka: Při kvalitativní analýze se identifikace provádí srovnáním retenčních časů analytu
a standardu. Kvantitativní analýza je založena na měření plochy píku nad základní linií, která
je úměrná množství dané látky.
80
5.3 STANOVENÍ CHOLESTEROLU V MLÉCE A MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH
METODOU HPLC
Princip:
Po alkalické hydrolýze vzorku methanolickým roztokem hydroxidu draselného je cholesterol
z reakční směsi extrahován do n-hexanu a extrakt promyt vodou do neutrální reakce. Finální
stanovení celkového cholesterolu je provedeno kapalinovou chromatografií na reversní fázi.
• cholesterol
• stigmasterol
• hydroxid draselný, p.a.
• 10 mol/l roztok KOH připravíme rozpuštěním 56,1 g KOH ve 100 ml vody
• methanol, p.a.
• methanol pro HPLC
• n-hexan, min. čistoty p.a.
• síran sodný, Na2SO4 bezvodý, vyžíhaný
• chlorid sodný, NaCl p.a.
• fyziologický roztok - připravíme rozpuštěním 9 g NaCl v 1 l deionizované vody
• ethanol, 96%.
• fenolftalein, 1% roztok v 96% ethanolu
• deionizovaná voda
• standardní a pracovní roztoky cholesterolu - zásobní roztoky o koncentraci 1000 mg/l
se připraví rozpuštěním 100 mg pevného standardu cholesterolu ve 100 ml methanolu.
Příslušným ředěním tohoto zásobního roztoku methanolem se získají pracovní roztoky
v koncentračním rozmezí 10 - 1000 mg/l.
• roztok vnitřního standardu stigmasterolu - 0,1% roztok stigmasterolu se připraví
navážením 0,025 g pevného stigmasterolu ve směsi n-hexanu a methanolu (1:10 v/v)
• membránové filtry nylonové, 45µm
• injekční stříkačky 2 – 5 ml
81
• automatické pipety
• Pasteurovy pipety
• varná deska
• laboratorní třepačka
• předvážky
• rotační vakuová odparka
• kapalinový chromatograf s UV detektorem
• baňky 50 ml s plochým dnem a zábrusem, odměrné baňky 10 - 100 ml ,skleněné zátky,
odměrný válec 10 ml, dělící nálevky 100 ml, separační nástavec, zpětný chladič,
zkumavky 10 ml se zábrusem a zátkou, vialky pro HPLC
Postup:
Příprava vzorku:
Do zábrusové baňky 50 ml dáme 1 g vzorku (mléko, mlezivo, sýr), 0,3 ml roztoku vnitřního
standardu stigmasterolu (0,1%), 9 ml methanolu a 1 ml 10 mol/l hydroxidu draselného.
Za stálého míchání při teplotě 65 °C pod zpětným chladičem po dobu 30 minut provedeme
alkalickou hydrolýzu. Po ochlazení sejmeme baňku z chladiče, přidáme 5 ml deionizované
vody a 10 ml n-hexanu. Baňku opatříme zátkou, zajistíme a na laboratorní třepačce intenzivně
třepeme 10 minut. Pomocí separačního nástavce odebereme hexanový podíl do dělící
nálevky, ve které je asi 10 ml deionizované vody s kapkou roztoku fenolftaleinu pro kontrolu
pH. Obsah dělící nálevky protřepeme, po oddělení vrstev odpustíme spodní vodnou vrstvu
a hexanový roztok v dělící baňce opakovaně promyjeme 5 ml vody do neutrální reakce
(asi 2x, zmizí fialové zbarvení fenolftaleinu). Hexanový podíl přemístíme do zkumavky
se zábrusem, pro vysušení přidáme asi 0,5 g vyžíhaného bezvodého síranu sodného,
zazátkujeme a necháme 15 minut stát v chladnu a temnu. Odebereme hexanový podíl,
(asi 5 – 8 ml, podle povahy extraktu) do 50 ml zábrusové baňky a na rotační vakuové odparce
odpaříme právě dosucha. Teplota lázně je 60 °C, tlak 360 bar. K odparku v baňce přidáme
2 ml methanolu, rozpustíme, zfiltrujeme pře 0,45 µm nylonový filtr do vialky pro HPLC
stanovení.
82
Slepý vzorek:
Pracujeme podle stejného postupu jako se vzorkem, namísto 1 g vzorku použijeme 1 ml
deionizované vody.
Podmínky HPLC stanovení:

Pro analýzu použijeme kapalinový chromatograf, skládající se z čerpadla, zásobníku
mobilních fází, UV detektoru nebo detektoru s diodovým polem, autosampleru, kolonového
termostatu.
Pro dělení použijeme chromatografickou kolonu s reverzní fází C8, např. Zorbax Eclipse
XDB C8 150x4,6 mm o velikosti částic 5µm (Agilent, USA).
Detekce se provádí při vlnové délce 205 nm, teplota kolony je 35 °C, velikost nástřiku 20 µl.
Mobilní fáze je binární směs voda/methanol 5:95, analýza se provádí v izokratickém
uspořádání, průtok je 1 ml/min.
Sběr a vyhodnocování dat je provedeno softwarem Empower 2 nebo Breeze (fy Waters).
Pro kvantifikaci použijeme metody vnitřního standardu.
Výpočet:
Analýzou roztoků cholesterolu o koncentracích v rozmezí 10 – 1000 mg/l vytvoříme
kalibrační přímku v příslušné procesní metodě chemického programu, ze které pak stanovíme
koncentraci cholesterolu v analyzovaném vzorku (mg/l), kterou pak převedeme na hmotnostní
koncentraci.
83
5.4 STANOVENÍ SACHARIDŮ
5.4.1 Stanovení mléčného cukru polarimetricky (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530)
Princip:
Obsah mléčného cukru se stanoví polarimetricky ve filtrátu získaném z mléka vyčeřením
za podmínek metody.
• ferrokyanid draselný, K4[Fe (CN)6].3H2O roztok c = 150 g/l
• síran zinečnatý, ZnSO4.7H2O roztok c = 300 g/l
• kruhový polarimetr se sodíkovým světlem
• váhy
• polarimetrická trubice délky 200 mm
• odměrné sklo
Postup:
Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 50 g mléka s přesností na 0,005 g. K mléku přidáme
za stálého míchání postupně 5 ml ferrokyanidu draselného a promícháme. Po promíchání
přidáme po kapkách za stálého míchání 5 ml roztoku ZnSO4.7H2O. Obsah se důkladně
promíchá, doplní se destilovanou vodou při 20 °C po značku a nechá se stát při laboratorní
teplotě 20 minut. Poté se obsah promíchá a zfiltruje suchým skládaným filtrem do suché
kádinky. První podíly filtrátu se odstraní. Čirým filtrátem vytemperovaným na 20 °C
se naplní polarizační trubice délky 200 mm a polarizuje se při 20 °C. Na polarimetru
se odečte úhel otočení α.
84
Výpočet:
Podle stupnice polarimetru se obsah monohydrátu laktózy v % vypočítá podle níže uvedených
vzorců. Je-li pro speciální účely nutné vyjádřit obsah laktózy bezvodé, jsou uvedeny vzorce
s označením pro procento bezvodé laktózy (x). Při použití polarimetru s kruhovou stupnicí:
0,9518 . = . 100 . |
x =
a navážka vzorku [g]

p1 kruhové stupně odečtené na polarimetru
F faktor pro objemovou korekci na sraženinu vzniklou vyčeřením
Pro navážku přesně 50 g a průměrné složení mléka se za F dosadí přímo tyto hodnoty:
Pro plnotučné kravské mléko 0,954
Pro mléko s 2 % tuku 0,965
Pro mléko odstředěné 0,976
Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 0,1 %, shodnost 0,15 %.

Poznámka: Vzorce jsou sestaveny podle specifické otáčivosti monohydrátu laktózy
52,53 kruhových stupňů při 20 °C. Při stanovení laktózy v mléce jiného složení (ovčí, kozí,
buvolí) nebo v mléčných výrobcích se zjistí objem sraženiny a vypočítá příslušný faktor podle
vzorce:
−
F =
V objem, na který bylo navážené množství vzorku zředěno

v 8 áž . (% 3 .1,08 + % í, H8 .1,55)
100
Při stanovení laktózy v těchto případech je třeba při udávání výsledku uvést faktor
pro objemovou korekci na sraženinu.
85
5.4.2 Stanovení laktulosy enzymovou metodu
Princip:
V přítomnosti vody a enzymu β-galaktosidasy je laktulosa hydrolyzována na D-galaktosu
a D-fruktosu a laktosa je současně hydrolyzována na D-glukosu a D-galaktosu (1,2).
β-galaktosidasa
(1) laktulosa + H2O → D-fruktosa + D-galaktosa
β-galaktosidasa
(2) laktosa + H2O → D-galaktosa + D-glukosa
Množství uvolněné D-fruktosy odpovídá množství laktulosy. Množství laktosy je výrazně

vyšší než množství laktulosy. D-glukosa, která se uvolní z laktosy, interferuje se stanovením
D-fruktosy vzniklé z laktulosy. Proto je nezbytné, aby bylo co nejvíce D-glukosy odstraněno.
V přítomnosti enzymu glukoso-oxidasy (GOD) a O2 je D-glukosa oxidována na D-glukonát
(3).
glukoso-oxidasa
(3) D-glukosa + H2O + O2 → D-glukonát + H2O2
Přebytek H2O2 je rozložen katalasou (4)
katalasa
(4) 2 H2O2 → 2 H2O + O2
Reziduální D-glukosa, která není oxidována, a D-fruktosa, která vzniká hydrolýzou laktulosy,
jsou fosforylovány za přítomnosti enzymu hexokinasy a ATP na D-glukoso-6-fosfát (G-6-P)
a D-fruktoso-6-fosfát (F-6-P) za současného vzniku ADP (5,6).
hexokinasa
(5) D-glukosa + ATP → G-6-P + ADP
86
hexokinasa
(6) D-fruktosa + ATP → F-6-P + ADP
V přítomnosti enzymu glukoso-6-fosfat dehydrogenasy je G-6-P oxidován NADP+, vzniká

D-glukonát-6-fosfát a NADPH (7).
G-6-P-DH
(7) G-6-P + NADP+ → D-glukonát-6- fosfát + NADPH + H+
6-GPDH
+
(8) D-glukonát-6-fosfát + NADP → R-5-P + CO2 + NADPH + H+
Glukoso-6-fosfát je konvertován na D-ribulosu-5-fosfát (R-5-P), oxid uhličitý (CO2) a další

molekulu NADPH za přítomnosti enzymu 6-fosfoglukonát-dehydrogenasy (8).
Množství NADPH vzniklé při reakci je přímo úměrné množství D-glukosy, které nebylo
oxidováno. V závěru reakce je F-6-P konvertován na G-6-P za přítomnosti fosfoglukoso-
isomerasy (PGI) (9).
PGI
(9) F-6-P → G-6-P
G-6-P reaguje s NADP za vzniku D-glukonát-6-fosfátu a NADPH. Množství NADPH

je přímo úměrné množství D-fruktosy a proto i množství laktulosy. Zvýšení NADPH
je stanoveno na základě měření absorbance při vlnových délkách 340 nm.
• β-galaktosidasa, suspenze
• glukoso-oxidasa a katalasa
• pufr (6 ml, pH 7,6) a azid sodný (0,02 w/v)
• NADP+
• hexokinasa a glukoso-6-fosfatát dehydrogenasa
• 6-fosfoglukonát dehydrogenasa, suspenze
87
• fosfoglukoso isomerasa, suspenze
• standardní roztok laktulosy (c = 0,1 mg/ml) a D-fruktosy (c = 0,05 mg/ml)
• fosfátový pufr, c = 0,4 mol/l, pH 7,6 se síranem hořečnatým MgSO4.7H2O
• octanový pufr, c = 2 mol/l, pH 4,5
• TEA pufr, c = 1 mol/l, pH 7,6 se síranem hořečnatým c = 10 mmol/l
• Carrezův roztok I, hexakyanoželeznatan draselný, K4[Fe (CN)6] roztok c = 150 g/l
• Carrezův roztok II, síran zinečnatý, ZnSO4.7H2O roztok c = 300 g/l
• hydroxid sodný, NaOH roztoky c = 0,33 mol/l
• oktanol, ~ 99 % (v/v)
• peroxid vodíku, H2O2 ~ 30% (v/v)
• UV/VIS spektrofotometr
• vortex
• vodní lázeň
• odstředivka na Eppendorfky
• stopky
• 1 cm široká kyveta do UV
• filtry
• odměrné baňky, kádinky, pipety
• zkumavky Eppendorf na 1,5 ml
• zkumavky na 13 ml
88
Postup:
Příprava vzorku:
Do zkumavek typu Eppendorf se pipetují roztoky dle tabulky viz níže. Po každém přidání
roztoku promíchat. Absorbance se měří při 340 nm.
Schéma pipetování do zkumavek typu Eppendorf:
Roztok v kyvetě objem
fosfátový pufr (c = 0,4 mol/l) 0,20 ml
destilovaná voda 0,70 ml
vzorek mléka 0,50 ml
Carrezův roztok II 0,05 ml
Carrezův rotok I 0,05 ml
Promíchá se na vertexu a odstředí při 13000 ot. po dobu 10 min. Čirý supernatant se pečlivě
odpipetuje do 1,5 ml Eppendorfek.
Roztok v kyvetě Vzorek Slepá zkouška
supernatant 0,50 ml 0,50 ml
octanový pufr 0,10 ml 0,10 ml
destilovaná voda - 0,05ml
suspenze 1 (β-galaktosidasa) 0,05 ml -
Promíchá se na vertexu a inkubuje se ve vodní lázni při 40 °C 1 hod.
TEA pufr (1 M)/MgSO4 0,50 ml 0,50 ml

(10mM)
hydroxid sodný (0,33 M) 0,05 ml 0,05 ml
Oktanol (99 % v/v) 0,01 ml 0,01 ml
Suspenze 2 (GOX/katalasa) 0,05 ml 0,05 ml
Peroxid vodíku (30 % v/v) 0,02ml 0,02ml
89
Okamžitě se zkumavky uzavřou a inkubují se ve vodní lázni při 40 °C 15 min. Po 15 min
se odstředí při 13000 ot. 10 min. Pomalu se uvolní víčko a pipetuje se 1,0 ml čirého
supernatantu.
Roztok vzorku 1,00 ml 1,00 ml
Roztok 3 pufr 0,05 ml 0,05 ml
Roztok NADP + ATP 0,05 ml 0,05 ml
Obsah kyvety promícháme a po 3 minutách změříme absorbanci roztoku A1. Potom přidáme:
Suspenze 5 (HK/G-6-PDH) 0,02 ml 0,02 ml
Suspenze 6 (6-PGDH) 0,02 ml 0,02 ml
Po promíchání necháme proběhnout reakci a po 10 minutách změříme absorbanci A2.

Do kyvety přidáme:
Suspenze 7 (PGI) 0,02 ml 0,02 ml
Obsah kyvety promícháme a po 10-15 minutách odečteme absorbanci vzorku A3.
90
Výpočet:
∆"€•‚aƒ„ = ("F − " )€•‚aƒ„
∆"_…ƒbý €•‚aƒ„ = ("F − " )_…ƒbý €•‚aƒ„
∆"…†„i‡…‚_† = ∆"€•‚a„‡ − ∆"_…ƒbé‰‚ €•‚a„‡
∙ CŠ ∙ |
c = ∙ ∆ " [g/l]
E ∙ ∙ ∙ 2
MW molekulární hmotnost testované látky 342,3 [g/mol]
F faktor ředění 7,68
ε extinkční molární koeficient NADH při 340 nm [6300 l/mol/cm]

2 2 moly NADPH vytvořené na každý 1 mol laktulosy
!…†„i‡…‚_† [//,]
ℎ , 3 , 0 = ∙ 100 [g/100 g mléka]
8 áž €•‚a„‡ [//,]
91
5.5 STANOVENÍ BODU MRZNUTÍ
5.5.1 Sstanovení bodu mrznutí mléka pomocí mléčných kryoskopů (ČSN 57 0538)
Princip:
Metoda používá ke stanovení bodu mrznutí mléka přístroj (termistorový mléčný kryoskop),
v němž je termostaticky kontrolována lázeň, chlazena elektrickým chlazením a místo
teploměru je použito termistorové čidlo. Podstata metody spočívá v podchlazení zkoušeného
vzorku mléka na vhodnou teplotu v závislosti na přístroji a vyvolání krystalizace
mechanickou vibrací, která způsobí, že teplota rychle vystoupí na hladinu, která odpovídá
bodu mrznutí mléka.
Metoda se využívá:
• pro syrové kravské mléko, jeho jakostní hodnocení a proplácení zemědělským výrobcům,
• pro mlékárensky ošetřené mléko za předpokladu, že mléko vykazuje hodnotu titrační
kyselosti maximálně 8 ml NaOH/100 ml.
• termistorový mléčný kryoskop
• nádoby
• baňky
• vzorkovnice
• filtry
• vodní lázeň
Složení kryoskopu:
• chladící lázeň, která slouží ke zchlazení vzorku mléka a je kontrolována čidlem teploty
• automatické vibrační míchadlo k zahájení krystalizace
• termistorové měřící čidlo (polovodičový odporový teploměr) s galvanometrem a měřícími
okruhy,
• zkumavky na vzorek jsou skleněné s ryskou
• zdroj napětí
• čtecí zařízení s rozlišovací schopností nejméně 0,001 °C v rozmezí od 0 °C do -1°C.
92
• používaný přístroj pracuje na principu vyhledávání části křivky bodu mrznutí, na které
zůstává poprvé teplota konstantní nejméně 20 sekund v rozmezí ± 0,001°C (výdrž, plato)
Kalibrace přístroje:
Kalibrace přístroje se provádí každý den před začátkem měření. Seřízení přístroje se provádí
na dva kalibrační standardní roztoky s hodnotami bodu mrznutí -0,408 °C a -0,6000 °C.
Kalibrace se provádí podle doporučení výrobce takovým způsobem, aby bylo čtení
na kryoskopu shodné s bodem mrznutí standardu ± 0,002 °C. Zkumavky používané k měření
standardních roztoků musí být ze stejného skla jako při měření vzorků mléka. Teplota
standardních roztoků musí být stejná jako při měření mléka. Před použitím kalibračních
roztoků se láhev jemně převrátí, aby se promíchal obsah. Nesmí se třepat, vzniklé vzduchové
bublinky by mohly ovlivnit měření. Kalibrační roztoky se uchovávají při teplotě 4 °C
až 30 °C, po otevření se uchovávají při teplotě + 5 °C, nemají se používat déle než 2 měsíce.
Příprava vzorků:
• Nekonzervované vzorky:
Vzorky syrového kravského mléka by měly být doručeny do laboratoře při teplotě do 5 °C
do 24 hodin, nebo při teplotě -18 °C pro zpracování do 12 týdnů. Připouští se i zchlazení
nekonzervovaných vzorků do 10 °C a jejich zpracování do 36 hodin, titrační kyselost vzorku
před měřením nesmí být vyšší než 8 SH.
• Konzervované vzorky:
Vzorky mléka mohou být konzervovány dichromanem draselným nebo kombinovaným
činidlem s azidem sodným. V tomto případě se uplatňuje korekční faktor. Konzervační
činidlo se musí přesně dávkovat, nedodržení přesné koncentrace konzervačního činidla vede
ke změně hodnoty bodu mrznutí vzorku. Ze vzorku se před měřením musí odstranit
mechanické nečistoty nebo vrstva tuku. Podle potřeby se vzorek mléka může přefiltrovat
a následně promíchat. Vzorky mléka musí mít při měření stejnou teplotu jako standardní
(kalibrační roztoky).
Postup:
Kontrola přístroje:
Před stanovením se provede kontrola přístroje. Kontroluje se hladina chladicí kapaliny,
poloha termistorového čidla, teplota chladící lázně po nahřátí přístroje, amplituda vibrace
93
míchadla ve zkumavce. Před každou sérií měření se měří bod mrznutí standardního roztoku
o bodu mrznutí -0,512 °C, až se dvě následující měření neliší o více než 0,002 °C.
Vlastní měření:
Po důkladném promíchání (nesmí se třepat) se mléko pipetuje do suchých čistých
kryoskopických zkumavek. Naplněné zkumavky se vloží do přístroje, zasune se čidlo
s míchadlem a výsledek měření se přečte na displeji přístroje. Opakovaná měření se nesmí
lišit o více než 0,004 °C. Jako výsledek se bere průměr měření zaokrouhlený na nejbližší
desetinné místo. Opakovatelnost metody je 0,004 °C, reprodukovatelnost je 0,005 °C.
94
5.6 STANOVENÍ SUŠINY
5.6.1 Stanovení obsahu celkové sušiny (rozhodčí metoda podle ČSN ISO 6731)
Princip:
Obsah celkové sušiny: hmotnostní podíl látek, zbývající po úplném vysušení vzorku,
stanovený postupem specifikovaným v této normě. Vyjadřuje se v % hmotnosti. Postup
zahrnuje předsušení zkušebního vzorku ve vroucí vodní lázni a následně odpaření vody
v sušárně při teplotě 102 ± 2 °C.
• vysoušečka – miska s rovným dnem z nekorodujícího kovu (korozivzdorné oceli, niklu,
hliníku) výšky 20-25 mm a průměru 50-75 mm, s dobře přiléhajícím a snadno
odnímatelným víčkem
• skleněná tyčinka na jednom konci zploštělá, která se vkládá do vysoušečky, suší-li
se mléko s pískem. Horní konec tyčinky smí sahat jen málo pod okraj vysoušečky,
aby se dala víčkem uzavřít
• exsikátor s účinným vysoušedlem
• vroucí vodní lázeň opatřená otvory s nastavitelným průměrem
• vodní lázeň
• sušárna s elektrickým ohřevem schopná udržovat teplotu 102 ± 2 °C v celém pracovním
prostoru
• homogenizátor
Postup:
Příprava vzorku:
Vzorek zahřátý na teplotu 20 - 25 °C se pečlivě promíchá, až je tuk rovnoměrně rozptýlen
v celém obsahu vzorku. Vzorek se nemíchá příliš silně, aby nedošlo k napěnění vzorku nebo
ke stloukání tuku. Při nedostatečném rozptýlení tukové vrstvy se vzorek ohřeje na 35 – 40 °C
ve vodní lázni, pečlivě se promíchá, aby se tuková vrstva rovnoměrně rozptýlila. Potom
se vzorek rychle ochladí na 20 - 25 °C.
95
Miska (vysoušečka) se suší při teplotě 102 ± 2 °C v sušárně po dobu 60 minut. Víčko
se umístí v sušárně vedle misky. Potom se miska přikryje víčkem a vloží do exsikátoru.
Po vychladnutí v exsikátoru na teplotu místnosti (asi za 30 minut), se zváží s přesností
na 0,1 mg. Do připravené misky se rychle odpipetuje 1-5 g mléka (podle očekávaného obsahu
sušiny), miska se uzavře a zváží s přesností 0,1 mg. Vzorek mléka se rozleje po celém dně
misky. Miska se vzorkem se bez víčka umístí na silně vroucí vodní lázni tak, že se maximum
plochy dna misky vystaví přímému působení páry po dobu 30 minut. Pak se dno misky osuší
a miska se umístí do sušárny vyhřáté na 102 ± 2 °C. Víčko se umístí v sušárně vedle misky.
Suší se 2 hodiny. Po uplynutí doby se miska uzavře víčkem a po vychladnutí v exsikátoru
(nejdéle 30 minut) se zváží s přesností na 0,1 mg. Miska se znovu suší v sušárně s víčkem
položeným vedle misky po dobu 1 hod. Pak se miska uzavře víčkem a okamžitě se vloží
do exsikátoru, nechá se vychladnout a zváží s přesností na 0,1 mg. Postup se opakuje
tak dlouho, až rozdíl hmotností dvou po sobě následujících vážení nebude větší než 1 mg.
Nejnižší hmotnost se zaznamená.
Výpočet:
Obsah celkové sušiny vyjádřený v % hmotnosti (x) se vypočítá podle následujícího vztahu:
−
= ∙ 100
−
m0 hmotnost misky s víčkem [g]

m1 hmotnost misky s víčkem a zkušebním vzorkem [g]
m2 hmotnost misky s víčkem a vysušeným podílem zkušebního vzorku [g]
Poznámka: Výsledek se zaokrouhlí na 0,01 %.
96
5.6.2 Stanovení sušina vážkově s použitím písku (ČSN 57 0530)
• křemenný písek, praný kyselinou chlorovodíkovou, vodou a vyžíhaný
• vysoušečka – miska s rovným dnem z nekorodujícího kovu (korozivzdorné oceli, niklu,
hliníku) výšky 20-25 mm a průměru 50-75 mm, s dobře přiléhajícím a snadno
odnímatelným víčkem
• skleněná tyčinka na jednom konci zploštělá, která se vkládá do vysoušečky, suší-li
se mléko s pískem; horní konec tyčinky smí sahat jen málo pod okraj vysoušečky, aby
se dala víčkem uzavřít
• exsikátor s účinným vysoušedlem
• sušárna s elektrickým ohřevem schopná udržovat teplotu 102 ± 2 °C v celém pracovním
prostoru
Postup:
Do vysoušečky s vloženou skleněnou tyčinkou se nasype asi 20 g křemenného písku
a 30 minut se suší v sušárně při 102 ± 2 °C. Víčko se umístí v sušárně vedle misky.
Pak se vysoušečka s pískem vloží do exsikátoru a uzavře víčkem. Po vychladnutí se zváží
s přesností na 0,0001 g. Do vysoušečky se odpipetuje asi 5 ml vzorku, vzorek se opatrně
promíchá s pískem. Miska se uzavře víčkem a zváží s přesností na 0,0002 g. Miska se umístí
do sušárny vyhřáté na 102 ± 2 °C. Víčko se umístí v sušárně vedle misky. Během vysoušení
se obsah tyčinkou několikrát opatrně promíchá, aby se nevytvořil na povrchu pevný povlak.
Suší se 2 hodiny. Po uplynutí doby se miska uzavře víčkem a po vychladnutí v exsikátoru
(nejdéle 30 minut) se zváží s přesností na 0,1 mg. Sušení se opakuje po 1 h intervalech
do dosažení konstantní hmotnosti.
97
Výpočet:
Obsah celkové sušiny v % (x) se vypočítá podle vzorce:
!−
x = ∙ 100
−
a hmotnost vysoušečky s pískem + navážený vzorek mléka [g]

b hmotnost vysoušečky s pískem [g]
c hmotnost vysoušečky s pískem + vysušený podíl mléka [g]
Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 0,1 % a shodnost 0,2 %.

Metoda je spolehlivá u mléka s titrační kyselostí do 9 ml NaOH/100 ml.
98
5.6.3 Stanovení sušiny mléka výpočtem z hustoty a obsahu tuku (provozní metoda
podle ČSN 57 0530)
Princip:
Sušina mléka stanovená výpočtem je podíl všech složek mléka kromě volné vody, zjištěný
výpočtem z hustoty a obsahu tuku. Vyjadřuje se v g na 100 g mléka.
Postup:
Obsah tuku se stanoví acidobutyrometricky a přepočte se na hmotnostní procenta. Stanoví
se hustota mléka.
Výpočet:
Obsah celkové sušiny v % (x) se vypočítá podle vzorce:
x = 1,21 ∙ t + 0,25 ∙ L + 0,82
t tuk [g/100 g]
L20 laktodensimetrické stupně při 20 °C
Poznámka: spolehlivost - přesnost 0,15 % a shodnost 0,25 %.

Výsledek se uvádí zaokrouhlen na 0,05 %.
99
5.7 STANOVENÍ MINERÁLNÍCH LÁTEK
5.7.1 Stanovení vápníku v mléce – titrační metoda (rozhodčí metoda podle ISO 12081)
Princip:
Obsah vápníku v mléce je hmotnostní podíl látek stanovených za podmínek metody vyjádřený
% hmotnosti. Proteiny ve vzorku jsou vysráženy kyselinou trichloroctovou a odděleny filtrací.
Vápník obsažený ve filtrátu je vysrážen jako šťavelan vápenatý a separován odstředěním.
Po promytí a rozpuštění sraženiny je vápník stanoven titrací roztokem manganistanu
draselného.
• kyselina trichloroctová, CCl3COOH roztok I. c = 200 g/l
• kyselina trichloroctová, CCl3COOH roztok II. c = 120 g/l
• šťavelan amonný, (NH4)2C2O4.H2O roztok III., za studena nasycený roztok
• roztok methyloranže, příprava: 0,05 g se rozpustí ve 100 ml ethanolu (96 %)
• kyselina octová, CH3COOH roztok V., 20 % (v/v)
• roztok amoniaku, roztok VI., (smícháním stejných objemů roztoku amoniaku 25 % m/m
a vody)
• roztok amoniaku, roztok VII. (2 ml roztoku amoniaku VI. doplnit do 100 ml vodou)
• kyselina sírová, H2SO4 roztok VIII. (přidáním 20 ml roztoku kyseliny sírové 98 m/m
k 80 ml vody)
• standardní roztok manganistanu draselného, KMnO4 roztok IX.
c = 0,004 mol/l ± 0,0001 mol/l
• kyselina šťavelová, C2H2O4 roztok X. c = 0,002 mol/l (0,0631 g na 250 ml destilované
vody)
• odstředivka
• vodní lázeň
• stojan
100
• byreta dělená po 0,02 ml
• filtrační papír pro pomalou filtraci
• pipety (5 ml, 2 ml a 10 ml)
• centrifugační zkumavky objem 30 ml
• odměrná baňka o objemu 50 ml
• skleněné nálevky
• kádinky 100 ml
• titrační baňky 100 ml
Postup:
Do 50 ml odměrné baňky se na analytických vahách naváží 20 g mléka (s přesností
na 0,0001 g) a doplní po rysku roztokem I., protřepe se a nechá stát 30 minut. Poté se roztok
přefiltruje do kádinky. Do centrifugační zkumavky se postupně napipetuje 5 ml filtrátu, 5 ml
roztoku II., 2 ml roztoku III., 2 kapky roztoku IV., 2 ml roztoku V. a celý obsah se zamíchá
skleněnou tyčinkou. Potom se po kapkách přidává roztok VI. do žlutého zabarvení a roztok
V. do slabě růžového zabarvení. Obsah se nechá stát 4 hodiny. Pak se obsah zředí
destilovanou vodou a odstřeďuje se při 1400 otáčkách 10 minut. Supernatant se opatrně
odsaje, stěny zkumavky se omyjí 5 ml roztoku VII., odstředí se při 1400 otáčkách 10 minut
a ještě jednou se postup zopakuje. Potom se k supernatantu přidají 2 ml roztoku VIII. a 5 ml
destilované vody, ve vařící (100 °C) vodní lázni se sraženina nechá rozpustit a titruje
se roztokem IX. do postřehnutelného růžového zabarvení, které vydrží 30 s.
101
Výpočet:
1000 − ? ?
w = 0,0004 ∙ (V − V ) ∙ = 0,4 ∙ ( − )∙
w obsah vápníku [%]

V objem roztoku manganistanu draselného spotřebovaného k titraci
vzorku [ml]
V0 objem roztoku manganistanu draselného spotřebovaného k titraci slepého
vzorku [ml]
f korekce pro objem sraženiny
Obsah tuku ve vzorku [%] Korekce f

3,5 – 4,5 f =0,972
3 f = 0,976
2 f = 0,980
1 f = 0,985
< 0,1 f = 0,989
102
5.7.2 Stanovení vápníku komplexonem (provozní metoda podle ČSN 57 0530)
Princip:
Vápník se stanoví přímo v mléce zalkalizovaném 4 N roztokem hydroxidu sodného titrací
roztokem komplexonu III za použití vhodného indikátoru. Obsah vápníku se vyjádří v mg
na 100 g mléka.
• komplexon III, c = 0,01 mol/l, (3,725 g komplexonu III se doplní vodou na 1000 ml),
faktor se stanoví pomocí 0,01 M roztoku CaCl2 v němž byl vápník stanoven
manganometricky
• směsný indikátor, příprava: 0,95 fluorexonu se smísí s 0,05 g fenolfltaleinu a 100 g NaCl
a dokonale rozetře v třecí misce, nebo se 1 g murexidu smíchá se 100 g NaCl a dokonale
rozetře v třecí misce
• hydroxid sodný, NaOH, roztok c = 4 mol/l
• odměrná baňka 250 ml
• titrační baňka 250 ml
• pipety 5 ml
• váhy
• byreta
Postup:
10 g vzorku se v odměrné baňce na 250 ml doplní vodou po značku a promíchá. 50 ml
naředěného vzorku mléka se odpipetuje do titrační baňky, zředí se 100 ml vody, přidá se 5 ml
roztoku NaOH a 0,2 g indikátoru. Rychle se titruje roztokem komplexonu III až do přechodu
zelené fluorescence v světle růžové zabarvení při použití fluorexonového indikátoru,
nebo z růžově fialového zabarvení do fialovomodrého, při použití murexidového indikátoru.
Slepý pokus se provede s vodou.
103
Výpočet:
Obsah vápníku v mg (x) ve 100 g mléka se vypočítá podle vzorce:
0,40 . 100 . ( − !)
=
a navážka vzorku v odpipetovaném podílu [g]

b množství roztoku 0,01 mol/l komplexonu, spotřebované při titraci vzorku [ml]
c množství roztoku 0,01 mol/l komplexonu, spotřebované při titraci slepého
vzorku [ml]
Poznámka:1 ml 0,01 mol/l komplexonu III = 0,40 mg vápníku

Spolehlivost zkoušky - přesnost 5 mg % vápníku a shodnost 8 mg % vápníku.
104
5.7.3 Stanovení chloridových iontů (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530)
Princip:
Chloridové ionty se v mléce stanoví po přídavku kyseliny dusičné argentometrickou titrací.
Chloridy se vysráží přebytkem roztoku 0,1 N dusičnanu stříbrného a k zpětné titraci
se použije 0,1 N roztoku rhodanidu amonného. Výsledek se vyjádří v mg chloridů ve 100 g
mléka.
• kyselina dusičná, HNO3, roztok 25%
• thiokyanatan amonný, NH4SCN roztok c = 0,1 mol/l
• dusičnan stříbrný, AgNO3 roztok c = 0,1 mol/l
• síran železitoamonný, NH4Fe(SO4)2.12 H2O, roztok nasycený za studena
Pomůcky:
• byreta dělená po 0,05 ml
Postup:
Do titrační baňky asi 100 ml se přidá několik skleněných kuliček a odváží se 10 g mléka
s přesností na 0,0002 g. Pak se přidá 5 ml 25% kyseliny dusičné a 1 ml roztoku síranu
železitoamonného. Po promíchání se přidá 10 ml roztoku 0,1 M AgNO3 a za stálého míchání
se titruje roztokem 0,1 M NH4SCN do prvního červenohnědého zabarvení, které vydrží 30 s.
Průběh titrace má být rychlý, aby byl přechod barvy dostatečně ostrý.
Výpočet:
Obsah chloridového iontu (x) v mg ve 100 g mléka se vypočte podle vzorce:
(10 − ∙ 3,546 ∙ 100

=
a navážka mléka [g]

b množství roztoku 0,1 M NH4CNS spotřebované při zpětné titraci vzorku [ml]
Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 2 mg % chloridů a shodnost 3 mg % chloridů.

105
6 STANOVENÍ CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MLÉČNÝCH
VÝROBKŮ
6.1 STANOVENÍ MĚDI V MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH (SUŠENÉ MLÉKO)
Princip:
Po mineralizaci vzorku na suché cestě se měď stanoví reakcí s kupralem
(diethyldithiokarbamidan sodný). Vzniklý měďnatý komplex je vhodný
k spektrofotometrickému stanovení metodou kalibrační přímky.
• kyselina chlorovodíková, HCl 12%
• kyselina vinná 30%
• fenolftalein, 1% roztok v 50% ethanolu obj.
• hydroxid amonný, NH4OH, c = 5mol/l
• chloroform (trichlormethan), CCl3H)
• chloroformový roztok kupralu - k 0,2 g octanu olovnatého (CH3COO)2Pb rozpuštěnému
ve vodě (zhruba 100 ml) se přidá 10 ml 10% vínanu sodno-draselného, roztok KOH
do alkalické reakce (pH 10 a víc, nebo růžové zabarvení při použití fenolftaleinu jako
indikátoru) a 10 ml 10% KCN. Pak se přidá roztok připravený z 0,25 g kupralu
(diethyldithiokarbamidan sodný C5H10NNaS2.5 H2O) a 100 ml vody. Vzniklá bílá
sraženina se vytřepe do 500 ml chloroformu v dělící nálevce, chloroformová vrstva
se oddělí, několikrát protřepe s vodou a po filtraci se doplní chloroformem na celkový
objem 2000 ml. Vzniklý roztok je třeba uchovávat v hnědé zábrusové lahvi v chladnu
a temnu.
• základní standardní roztok Cu - 3,9290 g CuSO4.5 H2O se po rozpuštění ve vodě doplní
na 100 ml destilovanou vodou. V 1 g roztoku je pak 1 mg Cu.
• muflová pec
• spektrofotometr
• laboratorní sklo
106
Postup:
10 g vzorku – sušeného mléka – se zuhelnatí na porcelánové misce za stálého míchání.
Poté se žíhá v muflové peci při 550 °C 2 h a poté při 650 °C 1 h. Získá se bílý popel. Popel
se rozpustí v 15 ml 12% HCl, kvantitativně se převede do odměrné baňky o objemu 25 ml
a doplní se po rysku. 20 ml tohoto mineralizátu se převede do 100 ml dělící nálevky, přidají
se 2 ml 30% kyseliny vinné, 1-2 kapky roztoku fenolftaleinu a roztok se titruje roztokem 5 M
NH4OH do červeného zbarvení (pH = 8,5-9,0). K roztoku v dělící nálevce se přidá 10 ml
chloroformového roztoku kupralu a obsah dělící nálevky se třepe 2 minuty – chloroformová
vrstva se zbarví žlutě až žlutohnědě, a to podle obsahu Cu. Po dokonalém rozdělení fází
se spodní chloroformová vrstva vypustí do odměrné baňky na 50 ml tak, aby vodní fáze
nevnikla do trubičky kohoutu. Potom se do dělící nálevky přidá 10 ml chloroformu a směs
se intenzivně protřepe. Po rozdělení fází se spodní chloroformová vrstva převede do odměrné
baňky k prvnímu podílu, doplní se po značku chloroformem a proměří při vlnové délce
430-435 nm na spektrofotometru.
Sestrojení kalibrační křivky:

Do kalibrovaných zkumavek se mikropipetou postupně odměří 0,05 – 0,1 – 0,2 – 0,3 – 0,5 ml
čerstvě 10 x zředěného základního standardního roztoku Cu, přidá se 1,5 ml 12% HCl
a objem se doplní na 10 ml destilovanou vodou. Potom se přidají 2 ml kyseliny vinné a obsah
zkumavek se přeleje do označených dělících nálevek. Dále se postupuje, jak je uvedeno výše
u analýzy vzorků. Zároveň se zpracovává slepá zkouška.
Výpočet:
Koncentrace Cu ve výrobku c se vypočítá podle vzorce:
•
!=! ∙ ∙ 1000 [ // /]
• ∙8
c0 koncentrace mineralizátu odečtená z kalibrační křivky [mg Cu]

Vc celkový objem mineralizátu [ml]
Vz objem mineralizátu vzatý do práce [ml]
n navážka [g]
107
6.2 STANOVENÍ OBSAHU SACHARÓZY VE SLAZENÉM ZAHUŠTĚNÉM MLÉCE –
POLARIMETRICKÁ METODA PODLE ČSN ISO 2911
Princip:
Působí se amoniakem tak, aby bylo dosaženo konečného rovnovážného stavu mutarotací
laktózy. Neutralizace. Vyčiří se přídavkem octanu zinečnatého a ferrokyanidu draselného
s následnou filtrací. Stanovení optické otáčivosti v jedné části filtrátu. Inverze druhé části
filtrátu pomocí slabé kyselé hydrolýzy sacharózy, která laktózu a ostatní cukry téměř
nerozkládá. Stanovení optické otáčivosti po inverzi. Výpočet obsahu sacharózy ze změny
optické otáčivosti před a po inverzi.
• octan zinečnatý, Zn (C2H3O2)2.2H2O roztok c = 2,0 mol/l
• ferrokyanid draselný, K4[Fe (CN)6].3H2O roztok c = 1,0 mol/l
• kyselina chlorovodíková, HCl, c = 6,35 mol/l (roztok 20-22% m/m)
• amoniak, roztok c = 2,0 mol/l (3,5% m/m)
• kyselina octová, CH3COOH c = 2,0 mol/l (12% m/m)
• polarimetr se sodíkovou výbojkou, polarimetrická trubice 2 dm dlouhá
• laboratorní odměrné sklo
• vodní lázeň
Postup:
Do kádinky se naváží přibližně 40 g dobře promíchaného vzorku s přesností na 0,01 g. Přidá
se 50 ml horké vody (80-90 °C) a promíchá se. Směs se kvantitativně převede do odměrné
baňky na 200 ml a kádinka se postupně vyplachuje 60 °C teplou vodou, dokud se nedosáhne
celkového objemu 120-150 ml. Pak se promíchá a ochladí na teplotu 20 ± 2 °C (teplota
místnosti). Přidá se 5 ml amoniaku, opět se promíchá a ponechá stát při teplotě místnosti.
Za mírného míchání otáčením nakloněné baňky se přidá 12,5 ml octanu zinečnatého a 12,5 ml
ferrokyanidu draselného (dbát na to, aby se netvořily bubliny). Obsah baňky se doplní
po rysku vodou o teplotě 20 ± 2 °C. Baňka se uzavře zátkou a silným třepáním promíchá.
108
Sraženina se ponechá několik minut usadit a pak se roztok zfiltruje přes suchý filtrační papír.
Prvních 25 ml filtrátu se vrací. Stanoví se optická otáčivost filtrátu při 20 ± 2 °C.
Inverze:
Do 50 ml odměrné baňky se napipetuje 40 ml filtrátu, přidá se 6,0 ml kyseliny
chlorovodíkové. Pak se baňka ponoří až po základnu hrdla na 15 minut do vodní lázně
o teplotě 60 ± 1 °C. Prvních 5 minut se baňkou otáčí, aby se obsah promíchal a dosáhl v této
době teploty vodní lázně. Po 15 minutách se ochladí na 20 °C a doplní k rysce vodou o teplotě
20 °C. Promíchá se a ponechá stát při této teplotě 1 hodinu.
Polarizace invertovaného roztoku:

Roztokem se naplní polarizační trubice a stanoví se optická otáčivost invertovaného roztoku
při 20 ± 2 °C.
109
Výpočet:
Obsah sacharózy ve vzorku vyjádřený v hmotnostních procentech se vypočte:
" − 1,25• −∆
Ž= ∙ ∙ [%]
• ‘∙
m hmotnost zkušebního vzorku [g]

A odečet přímé polarizace před inverzí
B odečet přímé polarizace po inverzi
L délka polarimetrické trubice [dm]
Q faktor pro inverzi (Q = 0,8825+0,0006 (C-9)-0,0033 (t-20)
V objem vzorku před filtrací [ml]
∆V korekce na objem sraženiny vzniklé při čiření [ml],
∆ = ∙ (1,08| + 1,55’)
100•
F procento tuku ve vzorku
P procento bílkovin ve vzorku
C procento veškerých cukrů v invertovaném roztoku dle polarimetrického odečtu
t teplota invertovaného roztoku [°C]
Poznámka: pro naše podmínky při navážce přesně 40,0 g slazeného zahuštěného mléka
se použije vzorec:
“ = (" − 1,25•) ∙ (2,833 − 0,00612| − 0,00878’)
110
6.3 STANOVENÍ OBSAHU VODY, SUŠINY TUKUPROSTÉ A TUKKU V MÁSLE
Z JEDNOHO ZKUŠEBNÍHO VZORKU – PODLE ČSN EN ISO 3727
Princip:
Stanovení obsahu vody
Vzorek másla se suší při 102 ± 2 °C a vážením se zjistí úbytek hmotnosti.
Stanovení obsahu sušiny tukuprosté
Z vysušeného podílu vzorku másla se extrahuje tuk petrolétherem nebo n-hexanem a zbytek
se zváží.
Stanovení obsahu tuku
Obsah tuku se vypočte z rozdílu.
• n-hexan popřípadě petroléther s bodem varu v rozmezí 30-60 °C
• sušárna
• laboratorní sklo a pomůcky (misky skleněné, porcelánové či kovové, vysoké
nejméně 25 mm, v průměru nejméně 50 mm, filtrační kelímky, tyčinka
na míchání)
• exsikátor
Postup:
Vzorek másla se zahřeje v původní neotevřené vzorkovnici na teplotu, při níž změkne tak,
aby se promícháním dosáhlo jeho homogenity, přičemž nesmí dojít k porušení emulze
(max 35 °C). Vzorek se ochladí na pokojovou teplotu, neustále se míchá.
Stanovení obsahu vody:

Miska se suší v sušárně při 102 ± 2 °C nejméně 1 h, poté se ochladí v exsikátoru na teplotu
místnosti a zváží s přesností na 0,1 mg. Do misky se z analytického vzorku naváží 2 až 6 g
zkušebního vzorku s přesností na 1 mg. Miska se suší 2 h v sušárně nastavené na 102 ± 2 °C.
Poté se miska se vzorkem ochladí v exsikátoru na teplotu místnosti a zváží s přesností
111
na 0,1 mg. Znovu se suší 1 h a dále vždy po 30ti minutách, přičemž se pokaždé ochladí
a zváží, dokud se nedosáhne konstantní hmotnosti (změna nepřesahuje 0,5 mg).
Stanovení obsahu sušiny tukuprosté:

Filtrační kelímek se suší v sušárně při 102 ± 2 °C nejméně 1 h, poté se ochladí v exsikátoru
na teplotu místnosti a zváží s přesností na 0,1 mg.
Do misky obsahující vysušený podíl po stanovení vody se přidá 10 až 15 ml teplého
n-hexanu nebo petrolétheru, aby se rozpustil tuk (v případě n-hexanu nebo petrolétheru
s počátečním bodem varu 40 °C nebo vyšším se zahřívá na 35 °C; v případě n-hexanu
nebo petrolétheru s počátečním bodem varu pod 40 °C nebo vyšším se zahřívá na 25 °C).
Tyčinkou na míchání se odstraní pokud možno veškerý sediment ulpívající na misce a obsah
se kvantitativně převede koncem tyčinky do zváženého filtračního kelímku. Opakuje se 5x.
Pak se sediment v kelímku promyje 25 ml teplého n-hexanu nebo petrolétheru. Miska
a kelímek se suší v sušárně 30 min při 102 ± 2 °C, poté se vychladí v exsikátoru na teplotu
místnosti a zváží s přesností na 0,1 mg. Sušení a vážení se opakuje do dosažení konstantní
hmotnosti (změna nepřesahuje 0,5 mg).
Z jednoho analytického vzorku se provedou dvě souběžná stanovení.
Výpočty:
Výpočet obsahu vody: pro každý ze dvou zkušebních vzorků se vypočte obsah vody E jako
hmotnostní %.
−
”= ∙ 100 [%]
−
E obsah vody [% hm]

m0 hmotnost prázdné misky [g]
m1 hmotnost misky a zkušebního vzorku před sušením [g]
m2 hmotnost misky a zkušebního vzorku po vysušení [g]
112
Výpočet obsahu sušiny tukuprosté: pro každý ze dvou zkušebních vzorků se vypočte obsah
sušiny tukuprosté S jako hmotnostní %.
( • − F +( – −
“= ∙ 100 [%]
−
S obsah sušiny tukuprosté [% hm]

m3 hmotnost prázdného filtračního kelímku [g]
m4 hmotnost kelímku se sedimentem [g]
m5 konečná hmotnost misky [g]
Výpočet obsahu tuku:

— = 100 − (” + “) [%]
T obsah tuku [% hm]

E obsah vody [% hm]
S obsah sušiny tukuprosté [% hm]
Poznámka: Výsledky výpočtů se vyjádří s přesností na jedno desetinné místo. Rozdíly výsledků
dvou stanovení prováděných souběžně nebo bezprostředně za sebou jedním analytikem nesmí
být větší než 0,1 g na 100 g vzorku.
113
6.4 STANOVENÍ CHLORIDU SODNÉHO V SÝRECH – ROZHODČÍ METODA PODLE
ČSN 57 0107
Princip:
Chlorid sodný se srazí přidáním přesně odměřeného množství roztoku 0,1 mol/l dusičnanu
stříbrného, jehož přebytek se po rozpuštění v koncentrované kyselině dusičné a manganistanu
draselného stanoví titrací roztokem rhodanidu draselného.
• kyselina dusičná, HNO3 koncentrovaná
• manganistan draselný, KMnO4 nasycený roztok
• síran železitoamonný Fe (NH4).(SO4)2.12H2O nasycený roztok (indikátor)
• thiokyanatan amonný, NH4SCN c = 0,1 mol/l
• glukóza, 10% roztok
• digestoř
• laboratorní sklo a pomůcky (stojan, nůž, alobal)
Postup:
Do kuželové baňky se naváží 2 g vzorku jemně nastrouhaného sýra s přesností na 0,001 g.
Přidá se pipetou 20 ml roztoku AgNO3, odměrným válcem 25 ml HNO3 a zahřívá
se za míchání k varu (v digestoři). Pak se přidá 30 ml KMnO4 a udržuje se za mírného varu
10 min. Změní-li roztok barvu, přidá se ještě 5-10 ml KMnO4 a krátce se povaří. Přebytek
KMnO4 se odstraní přidáním malého množství glukózy do odbarvení roztoku. Pak se přidá
100 ml destilované vody a 2 ml Fe (NH4).(SO4)2.12H2O. Přebytek AgNO3 se ihned titruje
roztokem NH4SCN do prvního světlého červenohnědého zabarvení, které vydrží 30 s.
114
Výpočet:
1 ml AgNO3 odpovídá 5,85 mg NaCl
Výsledek se přepočítá pomocí navážky a vyjádří v % NaCl ve výrobku.
100 ∙ 0,00585 ∙ ( −
= ∙ 100 [%]
8
x obsah NaCl [%]

a přidaný roztok AgNO3 [ml]
b spotřeba NH4CSN [ml]
n navážka [g]
115
6.5 STANOVENÍ SUŠINY V MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH – ROZHODČÍ METODA
Princip:
Obsah celkové sušiny je hmotnostní podíl látek zbývající po úplném vysušení vzorku,
vyjadřuje se v % hmotnosti. Vzorky mléčných výrobků se vysoušejí do konstantní hmotnosti
při 102 ± 2 °C.
• mořský písek
• sušárna s regulovatelnou teplotou
• exsikátor s náplní silikagelu
• hliníková nebo nerezová vysoušecí misky s víčkem
• kleště, laboratorní sklo (při stanovení sušiny u některých druhů výrobků skleněná tyčinka)
Postup:
Do vysoušecí misky se naváží asi 25 g písku a miska se suší v sušárně při 102 ± 2 °C nejméně
1 h, poté se ochladí v exsikátoru na teplotu místnosti a zváží na analytických vahách
s přesností na 0,1 mg. Vzorek konkrétního mléčného výrobku se upraví podle příslušné
zkušební normy. Do označené misky se z analytického vzorku naváží 2 až 6 g zkušebního
vzorku s přesností na 0,001 g (pokud se vzorek při sušení promíchává, je součástí navážky
i skleněná tyčinka). Otevřená miska se suší v sušárně nastavené na 102 ± 2 °C, víčko leží
vedle misky. Podle charakteru vzorku se sušený vzorek několikrát promíchá (tyčinka
se ponechává při sušení i vážení ve vysoušecí misce). Po 2 hodinách (dle druhu vzorku
příslušné normy) se miska se vzorkem ochladí v exsikátoru na teplotu místnosti a zváží
s přesností na 0,1 mg. Znovu se suší 1 h a dále vždy po 30ti minutách, přičemž se pokaždé
ochladí a zváží, dokud se nedosáhne konstantní hmotnosti (změna nepřesahuje 0,5 mg).
116
Výpočet:
Pro každý ze dvou zkušebních vzorků se vypočte obsah sušiny (S) jako hmotnostní %.
Výsledek se zaokrouhlí na 0,01 %.
( −
“= ∙ 100 [%]
( −
S obsah sušiny [% hm]

m0 hmotnost prázdné misky (s pískem a příp. také se skleněnou tyčinkou [g]
m1 hmotnost misky s víčkem (příp. tyčinkou) a zkušebním vzorkem před sušením
[g]
m2 hmotnost misky s víčkem (příp. tyčinkou) a zkušebním vzorkem po vysušení [g]
117
VAJEC
7.1 STANOVENÍ CHOLESTEROLU
7.1.1 Stanovení cholesterolu ve vejcích metodou HPLC
Princip:
Po alkalické hydrolýze vzorku methanolickým roztokem hydroxidu draselného je cholesterol
z reakční směsi extrahován do n-hexanu a extrakt promyt vodou do neutrální reakce. Finální
stanovení celkového cholesterolu je provedeno kapalinovou chromatografií na reversní fázi.
• cholesterol
• stigmasterol
• hydroxid sodný, KOH roztok c = 10 mol/l (56,1 g KOH rozpustíme ve 100 ml vody)
• methanol, p.a.
• n-hexan, min. čistoty p.a.
• síran sodný, NaSO4 bezvodý, vyžíhaný
• chlorid sodný, NaCl
• ethanol, 96%.
• fenolftalein, 1% roztok v 96 % ethanolu
• příprava standardních a pracovních roztoků cholesterolu - zásobní roztoky o koncentraci
1000 mg/l se připraví rozpuštěním 100 mg pevného standardu cholesterolu ve 100 ml
methanolu. Příslušným ředěním tohoto zásobního roztoku methanolem se získají pracovní
roztoky v koncentračním rozmezí 10 - 1000 mg/l.
• příprava roztoku vnitřního standardu stigmasterolu - 0,1% roztok stigmasterolu se připraví
navážením 0,025 g pevného stigmasterolu ve směsi n-hexanu a methanolu (1:10 v/v)
118
• membránové filtry nylonové, 45 µm
• varná deska
• laboratorní třepačka
• předvážky
• rotační vakuová odparka
• baňky 50 ml s plochým dnem a zábrusem
• skleněné zátky
• odměrný válec 10 ml
• dělící nálevky 100 ml
• separační nástavec
• zpětný chladič
• zkumavky 10 ml se zábrusem a zátkou
• vialky pro HPLC
Postup:
Příprava vzorku:
Oddělíme bílek a žloutek a obojí zvážíme. Žloutek naředíme v poměru 1:10 fyziologickým
roztokem, např. 10 g žloutku doplníme ve 100 ml odměrné baňce po rysku a promícháme.
Do zábrusové baňky 50 ml dáme 1 g takto naředěného žloutku, 0,3 ml roztoku vnitřního
standardu stigmasterolu (0,1%), 9 ml methanolu a 1 ml 10 mol.l-1 hydroxidu draselného.
Za stálého míchání při teplotě 65 °C pod zpětným chladičem po dobu 30 minut provedeme
alkalickou hydrolýzu. Po ochlazení sejmeme baňku z chladiče, přidáme 5 ml deionizované
vody a 10 ml n-hexanu. Baňku opatříme zátkou, zajistíme a na laboratorní třepačce intenzivně
třepeme 10 minut. Pomocí separačního nástavce odebereme hexanový podíl do dělící
nálevky, ve které je asi 10 ml deionizované vody s kapkou roztoku fenolftaleinu pro kontrolu
pH. Obsah dělící nálevky protřepeme, po oddělení vrstev odpustíme spodní vodnou vrstvu
a hexanový roztok v dělící baňce opakovaně promyjeme 5 ml vody do neutrální reakce
119
(asi 2x, zmizí fialové zbarvení fenolftaleinu). Hexanový podíl přemístíme do zkumavky
se zábrusem, pro vysušení přidáme asi 0,5 g vyžíhaného bezvodého síranu sodného,
zazátkujeme a necháme 15 minut stát v chladnu a temnu. Odebereme hexanový podíl,
(asi 5 – 8 ml, podle povahy extraktu) do 50 ml zábrusové baňky a na rotační vakuové odparce
odpaříme právě dosucha. Teplota lázně je 60 °C, tlak 360 bar. K odparku v baňce přidáme
2 ml methanolu, rozpustíme, zfiltrujeme přes 0,45 µm nylonový filtr do vialky pro HPLC
stanovení.
Slepý vzorek:
Pracujeme podle stejného postupu jako se vzorkem, na místo 1 g vzorku použijeme 1 ml
deionizované vody.

mobilních fází, UV detektoru nebo detektoru s diodovým polem, autosampleru a kolonového
termostatu.
Sběr a vyhodnocování dat je provedeno softwarem Empower 2 nebo Breeze (Waters).
Výpočet:
Analýzou roztoků cholesterolu o koncentracích v rozmezí 10 – 1000 mg/l vytvoříme
kalibrační přímku v příslušné procesní metodě chemického programu, ze které pak stanovíme
koncentraci cholesterolu v analyzovaném vzorku (mg/l)), kterou pak převedeme
na hmotnostní koncentraci a přepočítáme na 1 vejce nebo 100 g vaječné hmoty.
120
7.1.2 Stanovení cholesterolu ve vejcích enzymovou metodou
Princip:
Estery cholesterolu se rozštěpí cholesterolesterasou, uvolněný cholesterol se oxiduje pomocí
cholesteroloxidasy, vznikající peroxid vodíku se stanoví oxidační kopulací fenolu
s 4-aminoantipyrinem za pomocí enzymu peroxidasy.
• enzymatická souprava pro stanovení cholesterolu (Dilab, ČR) skládající se z činidel R1A
a R1B
• příprava pracovního činidla R1 - rozpuštění 1 lahvičky práškového činidla R1B v jedné
lahvičce (1000 ml) činidla R1A. Pracovní činidlo R1 je stabilní po dobu minimálně
2 měsíců při teplotách 2 – 8 °C
• cholesterol, standardní roztok
• chlorid sodný, NaCl p.a.
• fyziologický roztok
• automatické pipety 0,01 a 1,0 ml
• předvážky
• spektrofotometr
• vodní lázeň
• kádinky
• odměrná baňka 100 ml
Postup:
Příprava vzorku:
Oddělíme bílek a žloutek a obojí zvážíme. Žloutek rozmícháme s 50 ml fyziologického
roztoku, kvantitativně přeneseme do 100 ml odměrné baňky, doplníme fyziologickým
roztokem po rysku a promícháme a pipetujeme do zkumavek podle následujícího schématu.
121
Slepá zkouška Standard Vzorek
Destilovaná voda 0,01 ml - -
Standard - 0,01 ml -
Vzorek - - 0,01 ml
Činidlo R1 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml
Obsah zkumavek se promíchá a inkubuje 10 minut při teplotě 37 °C. Měří se absorbance
vzorku (Avz) a absorbance standardu (Ast) proti slepé zkoušce.
Měření se provádí při 500 nm.
Koncentraci cholesterolu (x) v g/l ve vzorku vypočteme podle vztahu:
" 2
= ∙ ! [//,]
" 3 _i
Avz absorbance vzorku

Ast absorbance standardu
Cst koncentrace standardu cholesterolu [g/l]
Výpočet:
Získanou hodnotu převedeme na mg/l a přepočteme na koncentraci mg cholesterolu
na 1 vejce nebo 100 g vaječné hmoty.
122
7.2 STANOVENÍ KYSELINY MLÉČNÉ, JANTAROVÉ A D-3-HYDROXYMÁSELNÉ
VE VEJCÍCH A VAJEČNÝCH VÝROBCÍCH
7.2.1 Stanovení kyseliny mléčné
Princip:
Kyselina mléčná je oxidována koenzymem NAD+ za katalýzy laktátdehydrogenázy
na pyruvát a NADH. Při reakci vzniklé množství NADH je ekvivalentní množství kyseliny
mléčné. Hladina NADH je měřena při 340 nm.
Reakce: L-LDH
(1) L-LAKTÁT + NAD+ → PYRUVÁT + NADH + H+

GPT
(2) PYRUVÁT + L-GLUTAMÁT → L-ALANIN + α - KETOGLUTARÁT
Poznámka:
Za účelem posunutí chemické rovnováhy na stranu pyruvátu a NADH je pyruvát v další reakci
pomocí GPT (glutamát-pyruvát transaminázy) a kys. glutamové převáděn na alanin
a kys. α-ketoglutarovou.
• roztok Carrez I.: 150 g/l K4[Fe(CN)6].3 H2O
• roztok Carrez II.: 300 g/l ZnSO4.7 H2O
• hydroxid sodný, NaOH roztok c = 1,0 mol/l
• ROZTOK 1: glycyl-glycinový pufr- pH 10, L-glutamová kys. - 440 mg, stabilizátor
• ROZTOK 2: NAD+ - lyofilizát, 210 mg
• ROZTOK 3: Glutamát-pyruvát-transaminasa (GPT) - 1100 U
• ROZTOK 4: L-laktátdehydrogenasa (LDH) - 3800 U
• kyselina chloristá, HClO4 70% p.a.
• hydroxid draselný, KOH p.a.
123
• pufry
• homogenizátor
• pH-metr a komb. skleněná elektroda
• spektrofotometr UV-VIS
• laboratorní potřeby, sklo, filtry
• magnetická míchačka
• chladnička
• vodní lázeň
• centrifuga
Postup:
Z homogenního vzorku se odeberou do kádinky tyto navážky: cca 20 g tekutého žloutku
(resp. cca 5 g sušeného žloutku). Ke vzorku se přidá 40 ml vody a 2 kapky n-oktanolu.
Roztok je míchán, dokud nevznikne homogenní roztok. Poté je kádinka uzavřena a zahřívána
ve vodní lázni 20 minut při 95 – 100 °C, do ještě horkého roztoku se za stálého míchání
na elektromagnetické míchačce napipetuje 4,0 ml roztoku Carrez I. Směs se intenzivně míchá
5-10 s a poté se přidá za stálého míchání 4,0 ml roztoku Carrez II. Směs se intenzivně míchá
5-10 s. Potom se u roztoku nastaví pH na 7,5 až 8,5 pomocí asi 6 až 10 ml NaOH
(c = 1,0 mol/l) a elektrody s pH-metrem a dobře zamíchá. Obsah se přeleje do odměrné baňky
na 100 ml a doplní po rysku destilovanou vodou. Po zamíchání se zfiltruje, první podíly
filtrátu se odstraní. Pokud není filtrát dostatečně čirý, je nutné roztok centrifugovat
(10 000 m.s-2.)
Poté se pipetuje do zkumavek podle následujícího schématu.

Destilovaná voda 1,6 ml 1,1 ml*
Filtrát vzorku - 0,5 ml*
124
*Postup v tabulce je uveden pro čerstvá vejce a sušený vaječný prášek. Pokud budou
vyšetřena vejce kontaminovaná, inkubovaná nebo sušený vaječný prášek horší kvality,
pak se bere objem filtrátu vzorku 0,1 ml a destilované vody 1,5 ml.
Zkumavky promícháme a po 5 min zmeříme absorbanci (A1). Při měření roztoky naléváme
zpátky do zkumavek. Potom přidáme:
Promícháme a po 10 minutách změřímě extinkci (A2).
Výpočet:
B" = (" − " ) #$ − (" − " )%&
∙ CD
= ∙ B" [//,]
E∙ ∙ ∙ 1000

Poznámka: Přepočítáním výsledku ředěním vzorku se stanoví koncentrace kyeliny mléčné

v původním vzorku (g/kg).
125
7.2.2 Stanovení kyseliny jantarové
Princip:
Kyselina jantarová je v první reakci pomocí Adenosin-5´-trifosfátu (ATP), CoA a enzymu

succinyl-CoA-synthetasy (SCS) převedena na succinyl-CoA, fosfát a Adenosin-5´-difosfát
(ADP):
SCS
(1) Kyselina jantarová + ATP + CoA → ADP + Succinyl-CoA + Fosfát
V další reakci je Adenosin-5´-difosfát (ADP) po reakci s fosfoenolpyruvátem (PEP)

za katalýzy enzymem pyruvátkinasa (PK) fosforylován na ATP a vzniká pyruvát:
PK
(2) ADP + PEP → ATP + Pyruvát
V poslední reakci je pyruvát pomocí NADH a laktátdehydrogenasy (L-LDH) redukován

na laktát:
L-LDH
(3) Pyruvát + NADH + H+ → L-Laktát + NAD+
Spotřeba NADH je měřena jako snížení absorbance, které je ekvivalentní množství přítomné
kyseliny jantarové.
• roztok Carrez I.: 150 g/l K4[Fe (CN)6].3H2O
• roztok Carrez II.: 300 g/l ZnSO4.7H2O
• ROZTOK 1: pufr- pH 8,4, azid sodný (0,02 % w/v)
• ROZTOK 2: NADH
• ROZTOK 3: ATP, fosfoenolpyruvát, CoA
126
• ROZTOK 4: pyruvátkinasa
• ROZTOK 5: succinyl-CoA synthetasa, suspenze
• n-oktanol
• váhy
• vodní lázeň
• spektrofotometr
Postup:
Vejce:
Z homogenního vzorku se odebere do odměrné baňky o objemu 50 ml navážka 5 g.
Ke vzorku se přidá 25 ml destilované vody a 1 kapka n-oktanolu. Roztok je míchán, dokud
nevznikne homogenní roztok. Poté je vzorek zahříván na vodní lázni 15 minut
při 95 – 100 °C. Po zchlazení na 20 – 25 °C se napipetuje ke vzorku 5,0 ml roztoku Carrez I,
5,0 ml roztoku Carrez II a 10 ml 0,1 M NaOH. Vzorek se intenzivně míchá 5-10 s po každém
přídavku. Poté se doplní po rysku destilovanou vodou. Po doplnění a opětovném promíchání
se zfiltruje a první podíly filtrátu se odstraní. Poté se pipetuje do zkumavek podle níže
uvedeného schématu.
Sušená vaječná hmota:

Z homogenního vzorku sušené vaječné hmoty (žloutek + bílek) se odebere do odměrné baňky
o objemu 50 ml navážka 1 g. Ke vzorku se přidá 30 ml destilované vody a 1 kapka
n-oktanolu. Roztok je míchán, dokud nevznikne homogenní roztok. Poté je vzorek zahříván
na vodní lázni 15 minut při 95 – 100 °C. Po zchlazení na 20 – 25 °C se napipetuje ke vzorku
5,0 ml roztoku Carrez I, 5,0 ml roztoku Carrez II a 10 ml 0,1 M NaOH. Vzorek se intenzivně
míchá 5-10 s po každém přídavku. Poté se doplní po rysku destilovanou vodou. Po doplnění
a opětovném promíchání se zfiltruje a první podíly filtrátu se odstraní. Poté se pipetuje
do zkumavek podle níže uvedeného schématu.
127
Destilovaná voda 2,1 ml 0,9 ml
Filtrát vzorku - 0,2 ml
Zkumavky promícháme a přibližně po 3 minutách změříme absorbanci (A1) při vlnové délce
340 nm. Další reakci odstartujeme přidáním:
Promícháme a přibližně po 6 minutách změříme absorbanci (A2). Jestliže reakce probíhá

i po šesti minutách, provádí se odečet absorbancí ve dvouminutových intervalech, dokud
se pokles hodnot nezastaví, nebo nedochází ke konstantnímu úbytku absorbance.
Výpočet:
U slepé zkoušky i u vzorku vypočítáme rozdíl extinkcí:
B" = (" − " ) #$ − (" − " )%&
Koncentrace kyseliny jantarové v g/l se vypočítá podle vzorce:
∙ CD
= ∙ B" [//,]
E∙ ∙
128

Koncentrace kyseliny jantarové v g/100 g se vypočítá podle vzorce:
! ∙ 100
= [//100 /]
∙ 20
c koncentrace kyseliny jantarové [g/l]

w navážka vzorku [g]
129
7.2.3 Stanovení kyseliny D-3-hydroxymáselné
Princip:
Kyselina D-3-hydroxymáselná je pomocí NAD a enzymu 3-hydroxybutyrátdehydrogenasy

(3-HBDH) oxidována na acetoacetát a NADH:
3-HBDH
(1) D-3-hydroxybutyrát + NAD +

→ Acetoacetát + NADH + H+
Protože rovnováha reakce leží na straně D-3-hydroxybutyrátu, je rovnováha pomocí další

reakce posunuta na pravou stranu. Při reakci vzniká sloučenina (formazan
jodnitrotetrazoliumchloridu-INT-formazan) vhodná k spektrofotometrickému stanovení
(492 nm) a množstvím ekvivalentní původně přítomnému množství kyseliny
D-3-hydroxymáselné:
Diaphorasa
(2) NADH + INT + H +

→ NAD+ + INT-Formazan
• roztok Carrez I.: 150 g/l K4 [Fe(CN)6].3H2O
• roztok Carrez II.: 300 g/l ZnSO4.7H2O
• ROZTOK 1: pufr- pH 8,6, azid sodný (0,02 % w/v)
• ROZTOK 2: NAD+ a INT
• ROZTOK 3: diaphorasa, suspenze
• ROZTOK 4: 3-hydroxybutyrát-dehydrogenasa
• ROZTOK 5: kyselina D-3-hydroxymáselná, standardní roztok
• n-oktanol
• váhy
• vodní lázeň
130
• spektrofotometr
Postup:
Vejce:
nevznikne homogenní roztok. Poté je vzorek zahříván na vodní lázni 15 minut při 100 °C.
Po zchlazení na 20 – 25 °C se napipetuje ke vzorku 1,0 ml roztoku Carrez I, 1,0 ml roztoku
Carrez II a 2 ml 0,1 M NaOH. Vzorek se intenzivně míchá 5-10 s po každém přídavku.
Poté se doplní po rysku destilovanou vodou. Po doplnění a opětovném promíchání se zfiltruje
a první podíly filtrátu se odstraní. Poté se pipetuje do zkumavek podle níže uvedeného
schématu.
Sušená vaječná hmota:

nevznikne homogenní roztok. Poté je vzorek zahříván na vodní lázni 15 minut při 100 °C.
Po zchlazení na 20 – 25 °C se napipetuje ke vzorku 1,0 ml roztoku Carrez I, 1,0 ml roztoku
Carrez II a 2 ml 0,1 M NaOH. Vzorek se intenzivně míchá 5-10 s po každém přídavku.
Poté se doplní po rysku destilovanou vodou. Po doplnění a opětovném promíchání se zfiltruje
a první podíly filtrátu se odstraní. Poté se pipetuje do zkumavek podle níže uvedeného
schématu.
Destilovaná voda 2,1 ml viz poznámka
Filtrát vzorku - viz poznámka
131
Poznámka:
Destilovaná voda Filtrát vzorku
Oplodněná vejce 2,0 ml 0,1 ml
Neoplodněná vejce 1,1 ml 1,0 ml
Sušená vaječná hmota 0,9 ml 0,2 ml
Zkumavky promícháme a po 2 min změříme absorbanci (A1). Měření opakujte po dalších

dvou minutách. Pokud je rozdíl mezi měřeními větší než 0,010, musí být vzorek upraven tak,
aby nedocházelo k interferencím. Další reakci odstartujeme přidáním:
Promícháme a přibližně po 6 minutách změříme absorbanci (A2). Jestliže reakce probíhá

i po šesti minutách, provádí se odečet absorbancí ve dvouminutových intervalech, dokud
se růst hodnot nezastaví, nebo nedochází ke konstantnímu přírústku absorbance.
Výpočet:
B" = (" − " ) #$ − (" − " )%&
Koncentrace kyseliny j D-3-hydroxymáselné v g/l se vypočítá podle vzorce:
∙ CD
= ∙ B" [//,]
E∙ ∙

MG molekul. hmotnost stanovovaného substrátu 104,1 [g/mol]
ε extinkční molární koeficient INT-formazanu při 492 nm [19,9 l/mmol/cm]
132
Koncentrace kyseliny jantarové v g/100 g se vypočítá podle vzorce:
! ∙ 100
= [//100 /]
∙ 40
c koncentrace kyseliny jantarové [g/l]

w navážka vzorku [g]
133
MEDU
Fyzikálně-chemické vyšetřování medu je prováděno dle metod popsaných v Harmonised

methods of the International Honey Commission (2002), které byly vydány jako internetová
publikace za účelem zpřístupnění harmonizovaných metod dle potřeby všem lidem ve všech
zemích (jak píše autor Stefan Bogdanov). Některé z metod doznaly drobných změn
či doplnění od originálního vydání v roce 1997 (Harmonised methods of the European Honey
Commission).
Příprava vzorků medů:

Vzorek určený k analýze musí být reprezentativní. Vzorky medu se před analýzou připraví
následujícím postupem:
• Tekuté nebo zkrystalizované medy bez pevných částic:
Laboratorní vzorek se dobře promíchá (nejméně 3 minuty). Je třeba dávat pozor
na možnost vzniku malých vzduchových bublin v medu, zvláště při následném stanovení
HMF. Pokud je med díky krystalizaci velmi tuhý, je možné jej zahřát v termostatu
či vodní lázni, ovšem teplota nesmí přesáhnout 40 °C.
• Tekuté nebo zkrystalizované medy obsahující pevné částice:
Odstraní se hrubé částice, následně se med při pokojové teplotě promíchá a přecedí
přes síto s oky o velikosti 0,5 mm. Krystalický med se přes síto jemně propasíruje pomocí
špachtle nebo lžičky.
• Plástečkový med:
Plásty se odvíčkují, pokud jsou zavíčkované. Plást se bez zahřívání mačká na sítu s oky
o velikosti 0,5 mm za účelem oddělení medu od plástu.
134
8.1 STANOVENÍ OBSAHU VODY V MEDU REFRAKTOMETRICKY
Princip:
Pomocí refraktometru se zjistí index lomu a k němu se vyhledá v tabulce odpovídající obsah
vody.
• refraktometr se stupnicí indexu lomu (eventuelně s termostatem)
• teploměr (pokud refraktometr není vybaven termostatem)
Postup:
Na matový hranol refraktometru se nanese tyčinkou z plastické hmoty nebo opatrně
keramickou špachtlí malé množství medu z připraveného laboratorního vzorku, hranoly
se uzavřou a asi po 1 minutě se odečte index lomu s přesností na 4 desetinná místa. Čtení
indexu lomu se provádí třikrát a z výsledků se počítá aritmetický průměr.
Výpočet:
Ke zjištěnému indexu lomu se vyhledá v tabulce odpovídající množství vody. V případě,
že stanovení bylo provedeno při jiné teplotě než 20 °C, je třeba:
• u teplot nad 20 °C - přičíst k indexu lomu 0,00023 na každý °C,
• u teplot pod 20 °C - odečíst od indexu lomu 0,00023 na každý °C.
Výsledek obsahu vody se uvádí na jedno desetinné místo.
135
Refraktometrické stanovení obsahu vody při 20 °C.
Index lomu Obsah vody [%] Index lomu Obsah vody [%]
1,5044 13,0 1,4885 19,2
1,5038 13,2 1,4480 19,4
1,5033 13,4 1,4875 19,6
1,5028 13,6 1,4870 19,8
1,5023 13,8 1,4865 20,0
1,5018 14,0 1,4860 20,2
1,5012 14,2 1,4855 20,4
1,5007 14,4 1,4850 20,6
1,5002 14,6 1,4845 20,8
1,4997 14,8 1,4840 21,0
1,4992 15,0 1,4835 21,2
1,4987 15,2 1,4830 21,4
1,4982 15,4 1,4825 21,6
1,4976 15,6 1,4820 21,8
1,4971 15,8 1,4815 22,0
1,4966 16,0 1,4810 22,2
1,4961 16,2 1,4805 22,4
1,4956 16,4 1,4800 22,6
1,4951 16,6 1,4795 22,8
1,4946 16,8 1,4790 23,0
1,4940 17,0 1,4785 23,2
1,4935 17,2 1,4780 23,4
1,4930 17,4 1,4775 23,6
1,4925 17,6 1,4770 23,8
1,4920 17,8 1,4765 24,0
1,4915 18,0 1,4760 24,2
1,491 18,2 1,4755 24,4
1,4905 18,4 1,4750 24,6
1,4900 18,6 1,4745 24,8
1,4895 18,8 1,4740 25,0
1,4890 19,0
136
8.2 STANOVENÍ ELEKTRICKÉ VODIVOSTI MEDU
Princip:
Vodivost medu je stanovena u roztoku medu obsahujícího 20 % sušiny medu ve 100 ml
destilované vody a měřena pomocí konduktometru a vodivostní cely. Stanovení vodivosti
je založeno na měření elektrického odporu, ke kterému je konduktivita reciproční veličinou.
• konduktometr vybavený teploměrem nebo termostatem
• vodivostní platinová cela
• odměrná baňka na 100 ml
• kádinky
Postup:
V čerstvě destilované vodě se rozmíchá množství medu ekvivalentní 20 g sušiny medu,
kvantitativně se přepraví do 100 ml odměrné baňky a doplní se destilovanou vodou po rysku.
40 ml takto připraveného roztoku se přelije do kádinky. Zbytkem medového roztoku
se opláchne vodivostní cela. Poté se cela ponoří do roztoku v kádince a odečte se hodnota
vodivosti. Jestliže cela není termostatována, zjistí se i teplota roztoku medu.
Poznámka: Díky možnému polarizačnímu efektu je nutné provést měření v nejkratším čase.
Výpočet:
Jestliže cela není termostatována, musí se hodnota vodivosti upravit zohledněním korekčního
faktoru:
• u teplot nad 20 °C - od hodnoty vodivosti odečíst 3,2 % na každý °C,
• u teplot pod 20 °C - k hodnotě vodivosti přičíst 3,2 % na každý °C.
137
8.3 STANOVENÍ TITRAČNÍ KYSELOSTI MEDU
Princip:
Med se rozpustí v destilované vodě prosté CO2 a ihned se ztitruje roztokem 0,1 mol/l NaOH
do bodu ekvivalence (pH 8,3). Titrace musí být skončena do 120 sekund.
• hydroxid sodný, NaOH c = 0,1 mol/l, prostý uhličitanu.
• pufry – pH 7 a 10.
• destilovaná voda zbavená CO2 varem a následným zchlazením
• pH metr se skleněnou elektrodou
• elektromagnetická míchačka
• váhy
• odměrné sklo
Postup:
K 10 g medu se přidá 75 ml destilované vody a rozmíchá se tyčinkou. Titruje se roztokem
0,1 M NaOH za použití skleněné elektrody a elektromagnetické míchačky do pH 8,3. Titrace
má být skončena do 120 sekund od započetí titrace, neboť se v roztoku postupně uvolňují
laktony, které s časem zvyšují kyselost.
Výpočet:
Kyselost je vyjádřena jako počet miliekvivalentů nebo milimolů kyseliny na 1 kg medu
a vypočítá se: spotřeba ml 0,1 M NaOH x 10.
Výsledek se uvádí s přesností na 1 desetinné místo.
138
8.4 DŮKAZ PORUŠENÍ MEDU ŠKROBOVÝM SIRUPEM, ŠKROBOVÝM CUKREM
A SLADOVÝMI VÝTAŽKY (FIEHEHO REAKCE II)
Princip:
Dextriny obsažené ve škrobovém sirupu, cukru a sladových výtažcích se srážejí ethanolem
v kyselém prostředí upraveném kyselinou chlorovodíkovou, kdežto dextriny přítomné v medu
se za stejných podmínek nesrážejí.
• kyselina chlorovodíková, HCl koncentrovaná (ρ=1,18 g.cm-3 )
• ethanol 96%
• tanin (prášek).
• vodní lázeň
• váhy
• sklo
• filtrační papír.
Postup:
Ze zkoušeného medu se připraví vodný roztok ve váhovém poměru 1+2 (např. 2 g medu
a 4 ml destilované vody). K medovému roztoku ve zkumavce se přidá na špičku nože tanin,
obsah se promíchá a zahřeje se ve vroucí vodní lázni, až se srazí bílkoviny. Pak se obsah
ochladí a zfiltruje přes středně hustý filtr tak, aby filtrát byl čirý. Ke 2 ml filtrátu se přidá
kapka kyseliny chlorovodíkové, obsah se promíchá a po stěně doplní 4 ml ethanolu.
Při porušení medu uvedenými látkami vzniká na rozhraní vodní a alkoholové fáze bílý zákal
(kroužek) sražených dextrinů. Čím je intenzivnější a širší, tím lze usuzovat na vyšší obsah
cizích látek v medu. V pravém včelím medu se při stejném postupu zkoušky zákal netvoří.
Opalescence alkoholové vrstvy u medovicových medů se nepovažuje za pozitivní reakci.
Poznámka: Zkouška bezpečně prokáže 2% přídavek škrobového sirupu a sladových výtažků
ve včelím medu, 1% koncentrace bývá nepatrná.
139
8.5 STANOVENÍ HYDROXYMETHYLFURFURALU PODLE WINKLERA
Princip:
Roztok zkoušeného medu po reakci s p-toluidinem a kyselinou barbiturovou dává vínově
červeně zbarvenou sloučeninu, vhodnou ke spektrofotometrickému stanovení.
• kyselina barbiturová, roztok 0,5%: 500 mg kyseliny barbiturové vysušené při 105 °C
se spláchne asi 70 ml destilované vody do odměrné baňky na 100 ml a rozpustí
se zahřátím na vodní lázni. Po ochlazení a vytemperování na 20 °C se doplní vodou
ke značce. Roztok vydrží delší čas uložený v chladničce. V případě vykrystalizování
se opět rozpustí na vodní lázni vytemperované na 60 °C. Baňka musí být zazátkovaná
lehce vloženou zátkou.
• paratoluidinové činidlo, roztok 10% v isopropanolu: 10 g p-toluidinu se spláchne pomocí
50 ml isopropylalkoholu do 100 ml odměrné baňky, rozpustí se 10 ml přidané kyseliny
octové ledové, vytemperuje se na 20 °C a doplní isopropanolem ke značce. Činidlo
uchováváme v hnědé lahvi v chladničce (vydrží 1 měsíc). Lze jej použít
až po 24 hodinách.
• Carresův roztok I: hexakyanoželeznatan draselný trihydrát, K4[Fe (CN)6].3H2O 15%
roztok: 15 g se doplní na 100 ml destilovanou vodou
• Carresův roztok II: heptahydrát síranu zinečnatého, ZnSO4.7H2O cca 20% roztok: 20,4 g
se doplní na 100 ml destilovanou vodou
• spektrofotometr pracující při vlnové délce 550 nm
• váhy
• odměrné sklo
• filtrační papír
Postup:
2 g medu se odváží v 25 ml kádince a několika ml čerstvě převařené destilované vody
(zchlazené na pokojovou teplotu) se kvantitativně převede do kalibrované zkumavky a doplní
převařenou destilovanou vodou na celkový objem 10 ml.
140
Kalné roztoky se před provedením zkoušky vyčeří Carresovýn činidlem: 2 g medu se odváží
v 25 ml kádince a několika ml čerstvě převařené destilované vody (zchlazené na pokojovou
teplotu) se kvantitativně převede do kalibrované zkumavky, přidají se 2 kapky roztoku I,
důkladně se promíchá, poté se přidají 2 kapky roztoku II a doplní převařenou destilovanou
vodou na celkový objem 10 ml. Po důkladném promíchání se obsah přefiltruje přes skládaný
filtr (červené značení) nebo za vakua přes fritu S4. Ve filtrátu se stanoví HMF.
Příprava kalibračních roztoků:

Z čerstvě připraveného základního standardního roztoku HMF 100 mg.(100ml)-1 (stačí
připravit 25 ml) se ředěním připraví koncentrace pracovních standardních roztoků HMF
o koncentracích: 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg/100ml.
Postup zkoušky:
Vzorek:
Do dvou zkumavek se zabroušenými zátkami se odpipetuje po 2 ml filtrátu medu a smísí
se s 5 ml p-toluidinového činidla. Do prvé zkumavky, která je pro slepý pokus, se přidá 1 ml
destilované vody a dobře promíchá. Obsahem se naplní kyveta a spektrofotometr se vynuluje
na slepý vzorek (měření se provádí při vlnové délce 550 nm).
Nejpozději do dvou minut se do druhé zkumavky přidá 1 ml kyseliny barbiturové, opět
se promíchá, vpraví se do druhé kyvety a změří se absorbance. Hodnota absorbance zpočátku
roste. Maxima, které odečítáme, je dosaženo mezi 2 min 30 s až 2 min 40 s od přidání
kyseliny barbiturové. Poté začne absorbance rychle klesat.
Standardní roztoky:
2 ml pracovních standardních roztoků se odpipetují do zkumavek se zabroušenými zátkami
a smísí se s 5 ml p-toluidinového činidla. Poté se nejpozději do dvou minut přidá 1 ml
kyseliny barbiturové a po promíchání se změří absorbance. Pro její odečítání platí stejná
pravidla jako u vzorku.
Slepý vzorek ke standardním roztokům:

3 ml destilované vody + 5 ml p-toluidinového činidla.
141
Upozornění: Vzhledem k charakteru p-toluidinového činidla je třeba jej přidávat v digestoři
a žádné z činidel nepipetovat ústy
Poznámky:
• Přesnost (10 % z výsledku) a shodnost (30 %) je dodržena za těchto předpokladů:
• Ředění medu je provedeno těsně před stanovením.
• Toluidinový roztok musí být použit až 24 h po přípravě; nesmí být zbarven hnědě
- zkreslování výsledků.
• Barevná reakce probíhá optimálně při 20 °C.
• Každý krok, který zdržuje stanovení (včetně pomalé filtrace při deproteinaci) je na úkor
přesnosti.
142
8.6 STANOVENÍ HYDROXYMETHYLFURFURALU
8.6.1 Stanovení hydroxymethylfurfuralu podle Whita
Princip:
Stanovení obsahu HMF je založeno na měření absorbance při vlnové délce 284 nm.
Za účelem vyloučení interference ostatních složek při této vlnové délce se stanoví rozdíl mezi
absorbancí čistého vodného roztoku medu a toho stejného roztoku po přidání bisulfitu. Obsah
HMF je vypočítán po odečtení absorbance pozadí při 336 nm.
• Carresův roztok I: hexakyanoželeznatan draselný trihydrát, K4[Fe(CN)6].3H2O 15%
roztok: 15 g se rozpustí v destilované vodě a doplní na 100 ml.
• Carresův roztok II: Dihydrát octanu zinečnatého, Zn (CH3COO)2.2H2O 30% roztok: 30 g
se doplní na 100 ml destilovanou vodou.
• bisulfit sodný, roztok 0,2%: 0,20 g pevného hydrogensiřičitanu sodného NaHSO3
(metabisulfit Na2S2O5) se rozpustí v destilované vodě a doplní na 100 ml. Připravuje
se denně čerstvý.
• spektrofotometr pracující při vlnové délce 284 a 336 nm
• kyvety šířky 1 cm
• míchačka
• odměrné sklo, filtrační papír
Postup:
Naváží se 5 g medu do 50 ml kádinky, rozpustí se pomocí cca 25 ml destilované vody
a kvantitativně se převede do 50 ml odměrné baňky. Přidá se 0,5 ml Carresova roztoku I
a promíchá. Poté se přidá 0,5 ml Carresova roztoku II, promíchá se a doplní se destilovanou
vodou na 50 ml (kapka ethanolu může být přidána k potlačení pěnění). Roztok se přefiltruje
přes filtrační papír, prvních 10 ml filtrátu se vylije. Ze zbylého množství filtrátu se napipetuje
5,0 ml do každé ze dvou zkumavek (18 x 150 mm). Do jedné zkumavky se přidá 5,0 ml
143
destilované vody a dobře promíchá (roztok vzorku). Do druhé zkumavky se přidá 5,0 ml
roztoku bisulfitu sodného a dobře promíchá (referenční roztok).
Změří se absorbance roztoku vzorku proti referenčnímu roztoku při 284 a 336 nm v 1 cm
kyvetách do jedné hodiny. Pokud absorbance při 284 nm překročí hodnotu 0,6, je třeba
z důvodu přesnosti roztok vzorku naředit destilovanou vodou a referenční roztok roztokem
bisulfitu sodného na stejný objem, aby výsledná absorbance byla nižší.
Pokud je ředění nutné, určí se faktor ředění podle vzorce:
D = konečný objem roztoku vzorku / 10.
Výpočet:
Dosazením do vzorce se vypočítá koncentrace hydrohymethylfurfuralu (c) v mg/kg:
™
! = (" ˜• − "FFh ) ∙ 149,7 ∙ 5 ∙ [ // /]
Š
A284 absorbance při 284 nm
A336 absorbance při 336 nm
126 ⋅ 1000 ⋅ 1000

konstanta 149,7 =
16830 ⋅ 10 ⋅ 5
126 molekulová hmotnost HMF
16830 molární absorptivita ε HMF při 284 nm
1000 převod z g na mg
10 převod 5 na 50 ml
1000 převod z g medu na kg
5 teoretická nominální hmotnost vzorku
D faktor ředění v případě, že je ředění nutné
W hmotnost vzorku medu v [g]
Poznámka: Výsledky se vyjadřují v mg/kg na 1 desetinné místo.
Poznámka: Některé medy (např. lipový) mohou vykazovat velmi vysokou absorbanci
zapříčiněnou interferujícími látkami. Pokud takové medy vykazují při 336 nm absorbanci
144
rozdílnou od absorbance při 284 nm, nejsou výsledky správné. Tento problém se odstraní
použitím dvojpaprskového spektrofotometru. Pokud takový přístroj není k dispozici, je možné
využít ředění vzorku. V takovém případě musí být ředění zohledněno při výpočtu výsledku.
Pokud je však nutné příliš velké ředění, je lepší využít alternativní metodu stanovení HMF.
145
8.6.2 Stanovení hydroxymethylfurfuralu metodou HPLC
Princip:
Vzorek medu je rozpuštěn v deionizované vodě, zfiltrován a analyzován kapalinovou
chromatografií na reversní fázi s detekcí v UV oblasti.
• hydroxymethylfurfural (HMF)
• standardní a pracovní roztoky hydroxymethylfurfuralu (HMF): zásobní roztoky
o koncentraci 1000 mg/l se připraví rozpuštěním 100 ml pevného standardu HMF
ve 100 ml neionizované vody. Příslušným ředěním tohoto zásobního roztoku vodou
se získají pracovní roztoky v koncentračním rozmezí 1 - 1000 mg/l.
• membránové filtry nylonové, 45um
• laboratorní sklo (kádinky 50 ml, skleněné tyčinky, odměrné baňky 25 ml, vialky
pro HPLC)
Postup:
Příprava vzorku:
Do kádinky o objemu 50 ml navážíme 5 g medu, rozmícháme tyčinkou v minimálním
množství vody, kvantitativně přeneseme do odměrné baňky 25 ml, doplníme po rysku vodou
a promícháme. Roztok zfiltrujeme přes membránový filtr o velikosti pórů 45 µm.
146
mobilních fází, UV detektoru nebo detektoru s diodovým polem, autosampleru a kolonového
termostatu.
Sběr a vyhodnocování dat je provedeno softwarem Empower 2 nebo Breeze (Waters).
Výpočet:
Analýzou roztoků HMF o koncentracích v rozmezí 1 – 500 mg/l vytvoříme kalibrační přímku
v příslušné procesní metodě chemického programu, ze které pak stanovíme koncentraci HMF
v analyzovaném vzorku (mg/l), kterou pak převedeme na hmotnostní koncentraci.
147
8.7 STANOVENÍ DIASTATICKÉ AKTIVITY PODLE SCHADEHO
Princip:
Jednotky diastatické aktivity, Goethovy jednotky, jsou definovány jako množství enzymu,
které může konvertovat 0,01 g škrobu za 1 hodinu při 40 ºC za podmínek testu. Výsledky jsou
přepočítány v Goethových jednotkách (nebo Schadeho jednotkách) na gram medu.
Standardní roztok škrobu, který je schopný tvořit s jodem zbarvení určité intenzity,
je hydrolyzován pomocí enzymu ze vzorku medu za standardních podmínek. Pokles modrého
zbarvení je měřen v intervalech. Změny absorbance vzhledem k času nebo regresní rovnice
se použije ke stanovení času tx potřebného k dosažení specifické absorbance 0,235 (německá
norma DIN používá faktor 0,301). Diastatická aktivita se vypočítá jako podíl 300 časem tx.
• roztok NaCl: 2,9 g NaCl se rozpustí v destilované vodě a doplní na l00 ml.
• acetátový pufr (pH 5, 3): 43,5 g acetátu sodného (CH3COONa.3H2O) se rozpustí
v destilované vodě, pH se upraví na 5,3 pomocí asi 5 ml ledové kyseliny octové a objem
se doplní na 250 ml destilovanou vodou.
• škrobový roztok:
1. Vysušení škrobu: Na dno zvážené váženky (o průměru 5 cm a výšce 3 cm) s víčkem
se rozprostře v tenké vrstvě něco přes 2 g suchého škrobu. Zváží se s přesností na 0,1 mg
a suší se 90 minut při 130 °C. Otevření je možné až po zchlazení 1 h v exsikátoru
a opětném přesném zvážení.
2. Příprava škrobového roztoku: Do 250 ml skleněné sklenice se naváží 2,000 g
vysušeného škrobu. Přidá se 90 ml destilované vody, vírem se promíchá a rychle
se přivede k varu. Za stálého míchání se vaří 3 min. Okamžitě se ještě horký roztok
přepraví do 100 ml odměrné baňky, rychle se zchladí na pokojovou teplotu a za stálého
míchání se doplní vodou po rysku. Roztok musí být připraven v den použití.
• roztok jodu:
1. Zásobní roztok jodu: rozpustí se 11,0 g dvakrát sublimovaného jodu a 22,0 g jodidu
draselného (KI) v 30-40 ml destilované vody a doplní na 500 ml. Zásobní roztok může být
skladován 1 rok v uzavřené, tmavé lahvi.
2. Ředěný roztok jodu: rozpustí se 20,0 g jodidu draselného ve vodě a přidá se 2 ml
zásobního roztoku jodu a doplní se na objem 500 ml destilovanou vodou. Tento roztok
148
se ředí až v den použití, musí být chráněn před vzduchem a po použití co nejdříve
uzavřen.
• termostatovaná vodní lázeň na 40 °C (povolená diference 0,2 ºC)
• exsikátor
• míchačka
• stopky
Poznámka: všechny pomůcky a sklo musí být bez detergentů.
Postup:
Naváží se 10,0 g medu do kádinky a kompletně se rozpustí v 15 ml vody a 5 ml acetátového
pufru (bez zahřátí). Roztok se kvantitativně přepraví do 50 ml odměrné baňky obsahující 3 ml
roztoku NaCl a doplní se destilovanou vodou po rysku.
Poznámka: Je nezbytně nutné, aby byl med pufrován dříve, než přijde do kontaktu s NaCl,
protože pH po přídavku NaCl by silně redukovalo diastatickou aktivitu. Výše uvedené operace
je nutno provést bezprostředně před stanovením.
Kalibrace škrobového roztoku:

Tato procedura se provede proto, aby se stanovilo množství vody, které je nutno přidat
do reakční mixtury, aby se hodnota absorbance jodového škrobového roztoku pohybovala
v rozmezí 0,745 - 0,770.
Do šesti vhodných skleněných zkumavek nebo baněk se napipetuje 20, 21, 22, 23, 24 a 25 ml
vody a 5 ml ředěného roztoku jodu.
Začne se první zkumavkou, přídavkem 0,5 ml mixtury, obsahující 10 ml vody a 5 ml
škrobového roztoku. Dobře se promíchá a okamžitě se odečte absorbance při 660 nm proti
destilované vodě v 1 cm kyvetě.
Tento postup se opakuje se všemi zkumavkami, dokud nedosáhneme absorbance
v požadovaném rozmezí 0,770 - 0,745. Množství vody stanovené touto cestou je standardním
ředěním pro všechna stanovení s roztokem škrobu.
149
Poznámka: Protože je intenzita zbarvení závislá na čase, je nutné, aby čas od přídavku
škrobového roztoku po stanovení byl konstantní i u vzorků i při kalibraci.
Jestliže je absorbance u prvního ředícího kroku (20 ml) nižší než 0,745 a nebo u posledního
ředění (25 ml) vyšší než 0,770, je škrob nevhodný pro stanovení diastatické aktivity.
Stanovení u vzorku:
Do 50 ml baňky se napipetuje 10 ml roztoku vzorku medu a umístí se do vodní lázně
vytemperované na 40 ºC. Do této lázně se umístí také druhá baňka s 10 ml škrobového
roztoku. Po 15 minutách se napipetuje 5 ml roztoku škrobu k roztoku medu, zamíchá
se a začne se měřit čas. V intervalech pěti minut se odebere aliquot 0,5 ml a přidá se rychle
5 ml ředěného jodového roztoku. Rychle se přidá množství vody stanovené viz výše
při kalibraci škrobového roztoku, dobře zamíchá a okamžitě se změří absorbance jednotlivých
roztoků za stejných podmínek jako u standardů.
Poznámka: Když je absorbance roztoku po prvním odběru (v prvních pěti minutách) nižší
než 0,350, je třeba čas prvního odběru a dále mezi jednotlivými odběry přiměřeně zkrátit.
Slepý vzorek:
K 5 ml vody se přidá 10 ml roztoku vzorku medu a dobře promíchá. Tohoto roztoku
se odebere 0,5 ml a přidá se 5 ml ředěného roztoku jodu. Přidá se stejné množství vody
jako u vzorků, dobře zamíchá a okamžitě odečte absorbance proti vodě.
Výpočet:
Diastatická aktivita se vypočítá jako diastatické číslo (DN) následovně:
60 H8 0,10 1,0 300

™I = ∙ ∙ =
3š 0,01 2,0 3š
Stanovení tx pro absorbanci 0,235 je nejlepší stanovit na základě rovnice lineární regrese.
150
8.8 STANOVENÍ INVERTÁZOVÉ AKTIVITY
Princip:
Invertázová aktivita je vyjadřována v mezinárodních jednotkách (označených U), kdy jedna
jednotka je definována jako množství substrátu v mikromolech rozloženého za minutu
a přepočítaného na kilogram medu.
Jako substrát pro stanovení invertázové aktivity v medu je použit p-nitrophenyl-α-D-
glucopyranosid (pNPG), který je pomocí invertázy štěpen na glukózu a p-nitrophenol.
Upravením pH na 9,5 je enzymatická reakce zastavena a v tomtéž čase je nitrophenol
transformován na nitrophenolátový anion, který je ekvivalentní přeměněnému substrátu
a je stanoven spektrofotometricky při 400 nm.
• roztok pufru (0,1 M; pH 6,0): 11,66 g dihydrogenfosforečnanu draselného KH2PO4
a 2,56 g hydrogenfosforečnanu disodného Na2HPO4.2H2O se rozpustí v destilované vodě
a doplní na 1000 ml.
• roztok substrátu (p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG), (0,02 M): 6,0252 g pNPG
se rozpustí v roztoku pufru a doplní na 1000 ml. pNPG je málo rozpustný ve vodě a roztok
není příliš stabilní. Proto se rozpouští v zahřátém roztoku pufru, jehož teplota však nesmí
překročit 60 °C. Roztok se ochladí, jakmile je kompletní. Roztok může být skladován
v tmavé lahvi v chladničce nejdéle 1 měsíc.
• reakci-ukončující roztok (3 M, pH 9,5): 363,42 g tris-(hydroxymethyl)aminomethanu
se rozpustí v destilované vodě a doplní na 1000 ml. pH se nastaví na 9,5 pomocí 3 M
kyseliny chlorovodíkové HCl.
• termostatovaná vodní lázeň na 40 °C (povolená diference 0,5 ºC)
• pH metr a kombinovaná pH elektroda
• míchačka
• stopky
• sklo
151
Postup:
Příprava roztoku medu:
5,00 g medu se pomocí pufru kvantitativně přepraví do 25 ml odměrné baňky a doplní
po rysku. Tento roztok se ponechá 1 den v chladničce.
Stanovení:
5,0 ml roztoku substrátu se napipetuje do zkumavky a nechá ve vodní lázni při 40 °C 5 minut
před přídavkem roztoku medu. Po uplynutí 5 minut se přidá 0,5 ml roztoku medu (startovací
čas). Krátce se zamíchá mixerem a inkubuje při 40 °C. Přesně po 20 minutách se přidá 0,5 ml
reakci-ukončujícího roztoku a zamíchá mixerem.
Slepý vzorek:
5,0 ml roztoku substrátu se inkubuje při 40 °C 5 minut. Potom se přidá 0,5 ml reakci
- ukončujícího roztoku, zkumavka se uzavře zátkou a dobře zamíchá, a pak se přidá 0,5 ml
roztoku medu. Slepý vzorek se připravuje pro každý roztok medu.
Měření absorbance: Roztok se vytemperuje na teplotu místnosti a rychle, jak jen je to možné,
se změří absorbance roztoku vzorku a slepého vzorku v 1 cm kyvetě při 400 nm. Odečtení je
třeba udělat v čase okolo 15 minut, v každém případě do 1 hodiny. Absorbance slepého
vzorku se odečte od absorbance roztoku vzorku (= ∆A).
Výpočet:
Množství p-nitrophenolu v µM vyprodukovaného během testu odpovídá množství využitého
substrátu v µM.
Aktivita medné invertázy může být vypočítána z naměřené absorbance při 400 nm a vyjadřuje
se v jednotkách na kg (U/kg):
1 › ,(= − I’D)
3H H3 6 8é H8 613á20 = [œ/ /]
H8 ∙ /( 6 )
152
Aktivita invertázy je pak vypočítána pomocí vztahu:
H8 613á2 = 6 ∙ 0,05 ∙ 0,05298 ∙ 10• ∙ ∆" = 158,94 ∙ ∆" [œ/ /]
U mezinárodní jednotka s definovanou utilizací 1 µM za minutu
6 faktor pro mililitry použitého roztoku vzorku (celkový objem)
0,05 konvertovaný (přepočítaný) reakční čas z 20 na 1 minutu
104 přepočítaný obsah odebraného medu (0,1 g v 0,5 ml) na 1 kg
0,05298 přepočítávací faktor pro µg na µM na ml substrátu
153
8.9 STANOVENÍ REDUKUJÍCÍCH CUKRŮ PODLE LANA A EYNONA UPRAVENÉ
SOXHLETEM - ROZHODČÍ METODA
Princip:
Redukující cukry v medu se zjistí oxidoredukční titrací za použití Fehlingova roztoku
a methylenové modři jako indikátoru. Vroucí alkalický roztok měďnaté soli se titruje
medovým roztokem za vzniku oxidu měďnatého (Cu2O), až zmizí zabarvení titrovaného
roztoku.
• Fehlingův roztok I: 69,28 g krystalického síranu měďnatého (CuSO4.5H2O) se rozpustí
v destilované vodě a doplní vodou na 1 l. Používá se až 24 hod. po přípravě.
• Fehlingův roztok II: 346 g vinanu sodnodraselného (KNaC4H4O6.4H2O) a 100 g NaOH
se rozpustí v destilované vodě a doplní vodou na 1 l. Po 48 hod. se přefiltruje upraveným
azbestem nebo fritou hustoty S4.
• standardní roztok invertního cukru 1%: Odváží se 9,5 g čisté sacharózy, přidá se 5 ml HCl
(1,18 g.cm-3) a zředí vodou asi na 100 ml. Tento okyselený roztok se uloží na několik dní
při pokojové teplotě (asi 7 dnů při 12 až 15 °C nebo 3 dny při 20 až 25 °C) a pak se doplní
na 1 l. Takto připravený roztok invertního cukru zůstane stálý několik měsíců.
• zředěný roztok invertního cukru (2 g/l): Potřebné množství tohoto roztoku se připraví
neutralizací 5krát menšího množství standardního roztoku invertního cukru roztokem 1 N
NaOH bezprostředně před použitím a doplněním vodou na příslušný objem (např. 20 ml
1% roztoku invertního cukru se neutralizuje a doplní na 100 ml). Neutralizuje
se na bromthymolovou modř (nakápnutý indikátor se barví výrazně zeleně).
• methylenová modř - indikátorový roztok 0,2%: 2 g methylenové modře se rozpustí
v destilované vodě a doplní na 1 l.
• stanovení faktoru Fehlingova roztoku: Do kuželové baňky na 250 ml se odpipetuje
po 5 ml Fehlingova roztoku I a II. Z byrety se přidá 24,5 až 25 ml zředěného roztoku
invertního cukru, načež se obsah baňky přivede k mírnému varu a vaří se přesně 2 minuty.
Směs je slabě namodralá. Pak se přidá 1 ml methylenové modře a během jedné minuty
se titrace dokončí. Je důležité, aby se var roztoku nepřerušil. Titrace se opakuje asi 2krát.
Při druhé a další titraci se volí přídavek zředěného roztoku z byrety tak, aby se dotitrovalo
jen 0,5 až 1 ml. Při titraci se má spotřebovat 25,64 ml zředěného roztoku invertního cukru.
154
Pokud je spotřeba jiná, je nutno upravit titr Fehlingova roztoku I nebo do práce použít
alikvotní množství tohoto roztoku, které se vypočítá tak, že 5 ml se násobí vypočítaným
faktorem.
• suspenze hydroxidu hlinitého: Připraví se nasycený roztok kamence hlinito-draselného
(KAl(SO4)2.12H2O) ve vodě za studena. Přidá se za stálého míchání hydroxid amonný,
až je roztok na lakmus nebo bromthymolovou modř alkalický. Vzniklá sraženina
hydroxidu hlinitého se promývá opakovanou dekantací vodou tak dlouho, až promývající
voda nereaguje na sírany (s 12% roztokem chloridu barnatého) a ani na amoniak
(s Nesslerovým činidlem). Pak se nechá roztok 2 hod usadit a přebytečná voda se odlije.
Zbývající suspenze se uchovává v zazátkované láhvi. Před použitím se suspenze
promíchá.
• bromthymolová modř - indikátor: 0,1 g bromthymolové modře + 16 ml 0,01 M NaOH
se doplní destilovanou vodou na 250 ml.
• křemelka nebo pemza v prášku.
• odměrné sklo
Postup:
Příprava vzorku:
a) U medů, které jsou zakalené, tj. obsahují sedliny: 25 g homogenizovaného medu
se rozmíchá s malým množstvím vody a kvantitativně se vpraví do 100 ml odměrné
baňky. Přidá se 5 ml suspenze hydroxidu hlinitého, promíchá a doplní destilovanou vodou
při 20 ºC po značku. Pak se přefiltruje přes skládaný filtr. 10 ml přefiltrovaného roztoku
medu se v odměrné baňce zředí destilovanou vodou na 500 ml.
b) U ostatních medů: 2 g homogenního vzorku se rozpustí v destilované vodě a vpraví
se kvantitativně do 200 ml odměrné baňky. Doplní se vodou při 20 ºC k rysce. 50 ml
roztoku medu se zředí v odměrné baňce na 100 ml.
a) Předběžná titrace:
Při titraci musí být celkový objem přidávané reagující směsi (tj. Fehlingovy roztoky
+ zředěný roztok medu + voda) 35 ml. Toho se docílí přidáním příslušného objemu vody
155
před vlastní titrací. Toto množství vody se vypočítá odečtením objemu rozředěného
roztoku medu, spotřebovaného při předběžné titraci, od 25 ml.
Odpipetuje se 5 ml Fehlingova roztoku I do 250 ml kuželové baňky a přidá se přibližně
5 ml Fehlingova roztoku II. Pak se přidá ještě 7 ml destilované vody, trochu práškové
pemzy nebo jiné vhodné látky působící proti pěnění a 15 ml zředěného roztoku medu
z byrety. Směs se zahřeje k bodu varu. Mírný var se udržuje přesně 2 minuty. Pak se přidá
1 ml 0,2% roztoku methylenové modře a za stálého mírného varu se dokončí titrace
zředěným roztokem medu během jedné minuty tak, až se modrý indikátor odbarví,
tj. titrovaná směs se zbarví cihlově červeně vyredukovaným oxidem měďným.
Při dotitrování se kuželovou baňkou za stálého varu jen mírně míchá, aby se roztok medu
stejnoměrně vmísil do reagující směsi a tak se upřesnil bod změny indikátoru (velmi
intenzívní míchání je na úkor přesnosti). Při titraci se pozoruje zejména horní vrstva
titrované tekutiny. Spotřeba zředěného roztoku v ml se zaznamenává.
Poznámka: K dosažení přesnosti a reprodukovatelnosti stanovení je nezbytné, aby objem

vody, potřebný k doplnění reagující směsi na celkový objem 35 ml, byl stanoven pro každý
individuální roztok zvlášť. Proto se uvádějí různé objemy vody, které lze vzít v úvahu
pro předběžnou titraci za předpokladu různého obsahu invertního cukru v medu.
Množství vody, které je nutno přidat při předběžné titraci
Předpokládaný obsah invertního cukru Destilovaná voda, kterou je nutno přidat

[%] [ml]
60 8,3
65 9,6
70 10,7
75 11,6
b) Vlastní titrace:
Nejprve se od 25 ml odečte množství spotřebovaného zředěného roztoku medu
při předběžné titraci a získá se množství destilované vody v ml, které je třeba přidat
k titraci vlastní (x ml). Odpipetuje se znovu 5 ml Fehlingova roztoku I a II do kuželové
baňky, přidá se x ml destilované vody, trochu práškové pemzy a z byrety tolik ml
156
zředěného roztoku medu, které bylo zjištěno při předběžné titraci, snížené asi o 1,5 ml.
Studená směs se zahřeje k bodu varu a mírný var se udržuje zase 2 minuty. Pak se přidá
1 ml 0,2% roztoku methylenové modře a za stálého varu se dokončí titrace během 1 min.
Modře zbarvený roztok se odbarví a přejde do cihlově červené barvy, kterou tvoří
vyredukovaný oxid měďný (viz předběžná titrace). Počet ml zředěného roztoku medu
se zaznamená (y ml). Doporučuje se provést ještě další titrace. Mezi paralelními titracemi
nemá být větší odchylka než 0,1 ml.
Výpočet:
Obsah redukujících cukrů v % invertního cukru (x) se vypočítá podle vzorce:
500
= [%]
!∙0
y množství zředěného roztoku medu spotřebovaného při stanovení [ml]
c koncentrace zředěného roztoku medu v g medu/100ml roztoku, přičemž platí:
pro první postup přípravy vzorku c = n1/50
pro druhý postup přípravy vzorku c = n2/4
n1, n2 jsou původní navážky vzorku v [g]
157
8.10 STANOVENÍ SACHAROSY DLE LANA A EYNONA - ROZHODČÍ METODA
Princip:
Základem této metody je Walkerova inversní metoda. Zjistí se obsah redukujících cukrů
před inversí a veškerých cukrů po inversi titrační oxidoredukční metodou na methylenovou
modř a z rozdílu se vypočítá obsah sacharosy násobením faktorem 0,95.
• chemikálie pro předběžnou a vlastní titraci (viz předchozí úloha):
• Fehlingův roztok I
• Fehlingův roztok II
• standardní roztok invertního cukru 1%
• zředěný roztok invertního cukru (2 g.l-1)
• methylenová modř-indikátorový roztok, 0,2%
• kyselina chlorovodíková, HCl roztok 6,34 mol/l
• hydroxid sodný, NaOH roztok 5 mol/l
• hydroxidu hlinitého, Al(OH)3 suspenze
• bromthymolová modř-indikátor
• křemelka nebo pemza v prášku
• viz předchozí úloha
Postup:
Příprava roztoku medu:
a) U medů, které jsou zakalené, tj. obsahují sedlinu: 25 g homogenizovaného medu
se rozmíchá s malým množstvím vody a kvantitativně se vpraví do 100 ml odměrné
baňky. Přidá se 5 ml suspenze hydroxidu hlinitého, promíchá a doplní destilovanou vodou
při 20 °C po značku. Pak se přefiltruje přes skládaný filtr, 10 ml tohoto filtrátu se zředí
destilovanou vodou do 250 ml odměrné baňky a dobře promíchá.
b) U ostatních medů: 2 g homogenizovaného vzorku se rozpustí v destilované vodě a vpraví
se kvantitativně do odměrné baňky na 200 ml. Doplní se vodou při 20 °C k rysce.
158
Vlastní stanovení:
Inverse zkoušeného vzorku:
a) 50 ml roztoku medu se odpipetuje do odměrné baňky na 100 ml, přidá se 25 ml
destilované vody a zahřeje se na 65 °C ve vodní lázni. Pak se přidá 10 ml roztoku kyseliny
chlorovodíkové, baňka se vyjme z lázně a nechá se postupně chladnout 15 minut
při laboratorní teplotě. Vychladí se na teplotu 20 °C a neutralizuje roztokem hydroxidu
sodného za použití lakmusu nebo bromthymolové modře jako indikátoru. Baňka
se vytemperuje na 20 °C a doplní vodou na 100 ml.
b) Předběžná a vlastní titrace: stejná jako v předchozí úloze.
Výpočet:
Obsah sacharosy v % se vypočte podle vzorce:
= ( − ) ∙ 0,95 [%]
a množství invertního cukru po inverzi [%]
b množství invertního cukru před inverzí [%]
Obsah invertního cukru po inverzi v % se vypočítá podle vzorce:
500
= [%]
!∙0
y množství zředěného roztoku medu v g medu/100 ml roztoku, přičemž platí:
pro 1. postup přípravy vzorku: c1 = n1/50
pro 2. postup přípravy vzorku: c2 = n2/4
n1, n2 jsou původní navážky vzorku [g]
159
8.11 STANOVENÍ OBSAHU POPELA
Princip:
Popel je zbytek po spálení vzorku medu za podmínek stanovených vyšetřovací metodou.
• bezpopelný olivový olej
• křemenná nebo platinová miska
• plynový kahan nebo elektrický vařič
• muflová pec
• exsikátor
Postup:
Křemenná nebo platinová miska se vyžíhá na teplotu stanovení popela v muflové peci a nechá
se vychladit v exsikátoru. Poté se miska zváží s přesností na 0,001 g a hmotnost se označí m2.
Do takto připravené misky se naváží 5-10 g vzorku s přesností na 0,001 g a navážka se označí
m0. Pak se přidají 2 kapky olivového oleje, hmota se zahřeje na teplotu 350 – 400 °C
nad plynovým kahanem nebo na elektrickém vařiči. Následně se miska vloží do předehřáté
muflové pece na 600 °C (± 25 °C) nejméně na 1 hodinu. Poté se miska ochladí v exsikátoru
a zváží (hmotnost se označí ml). Tento postup zpopelňování v muflové peci se opakuje
do konstantní hmotnosti.
160
Výpočet:
Množství popela v g/100 g medu se vypočte dle vztahu:
−
Š' = ∙ 100 [//100 /]
m1 váha misky s popelem [g]
m2 váha misky [g]
m0 navážka medu [g]
161
8.12 STANOVENÍ OBSAHU PEVNÝCH LÁTEK VE VODĚ NEROZPUSTNÝCH
Princip:
Metoda vážkově stanoví obsah pevných látek ve vodě nerozpustných.
• skleněný kelímek s fritou (S3 nebo G3, velikost pórů 15-40 µm)
• vývěva
• sušárna
• exsikátor
• váhy
• sklo
Postup:
20 g medu se odváží s přesností na 0,1 mg a rozpustí v přiměřeném množství destilované
vody (cca 200 ml) a dobře se promíchá. Přefiltruje se předem vysušeným a zváženým
skleněným kelímkem s fritou (S3 nebo G3, velikost pórů 15-40 µm) a promyje se důkladně
horkou vodou (80 °C), až se zbaví veškerých cukrů. Kelímek se pak suší 1 h při 135 °C,
vychladí se v exsikátoru a zváží se s přesností na 0,1 mg. Rozdíl kelímku s fritou
před a po filtraci vyjadřuje množství pevných, ve vodě nerozpustných látek ve 20 g medu.
Výpočet:
Obsah pevných ve vodě nerozpustných látek v % (x) se vypočte dle vzorce:
8
= ∙ 100 [%]
n hmotnost pevných ve vodě nerozpustných látek [g]
m med navážený k rozboru [g]
Poznámka: Včelí med může obsahovat maximálně 0,1 % látek ve vodě nerozpustných,
lisovaný med maximálně 0,5 %.
162
9 LITERATURA
BOEHRINGER MANNHEIM. Methods of enzymatic bioanalysis and food analysis.

Mannhein, 1995, 157 p.
BOGDANOV, S. Harmonised methods of the International honey commission. International
Honey Commission, 2002, p. 1- 62.
BOGDANOV, S., MARTIN, P., LÜLLMANN, C. Harmonised methods of the European
honey commission. Apidologie (Extra issue), 1997, p. 1-59.
ČSN 57 0107-12 (570107) Metody zkoušení přírodních a tavených sýrů. Stanovení obsahu
chloridu sodného. Praha: Český normalizační institut, 1982, 8 s.
ČSN 57 0185 (570185) Zkoušení masa, masných výrobků a masných konzerv a hotových jídel
v konzervách. Chemické a fyzikální metody. Praha: Český normalizační institut, 1962, 24 s.
ČSN 57 0533 Mléko - Stanovení látkového obsahu volných mastných kyselin. Praha: Český
normalizační institut, 1982, 8 s.
ČSN 57 0538 Stanovení bodu mrznutí mléka pomocí mléčných kryoskopů. Praha: Český
ČSN 57 6021 (576021) Metody zkoušení výrobků z masa a sterilovaných pokrmů
v konzervách - Stanovení obsahu vody (Referenční metoda). Praha: Český normalizační
institut, 1999, 8 s.
ČSN 570530 (570530) Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků. Praha: Český
ČSN EN ISO 3727-1 (571603) Máslo – Stanovení obsahu vody, sušiny tukuprosté a tuku Část
1: Stanovení obsahu vody (referenční metoda). Praha: Český normalizační institut, 2003, 12 s.
ČSN EN ISO 3727 (571603) Máslo - Stanovení obsahu vody, tukuprosté sušiny a tuku - Část
2: Stanovení obsahu tukuprosté sušiny (Referenční metoda). Praha: Český normalizační
institut, 2003, 11 s.
ČSN EN ISO 5509 (588767) Živočišné a rostlinné tuky a oleje – Příprava methylesterů
mastných kyselin. Praha: Český normalizační institut, 2001, 40 s.
ČSN EN ISO 5534 (571003) Sýry a tavené sýry - Stanovení obsahu celkové sušiny
(Referenční metoda). Praha: Český normalizační institut, 2005, 12 s.
ČSN EN ISO 8968-1 (57 0528) Mléko - Stanovení obsahu dusíku -Část 1: Metoda dle
Kjeldahla. Praha: Český normalizační institut, 2002, 15 s.
163
ČSN ISO 13580 (571422) Jogurt - Stanovení obsahu celkové sušiny (Referenční metoda).
Praha: Český normalizační institut, 2008, 12 s.
ČSN ISO 1444 (57 6020) Maso a masné výrobky – Stanovení obsahu volného tuku. 2. vydání.
Praha: Český normalizační institut, 1997, 8 s.
ČSN ISO 1841-1 (57 6022) Maso a masné výrobky – Stanovení obsahu chloridů – část 1:
Volhardova metoda. Praha: Český normalizační institut, 1999, 8 s.
ČSN ISO 1841-2 (57 6022) Maso a masné výrobky – Stanovení obsahu chloridů – část 1:
Potenciometrická metoda. Praha: Český normalizační institut, 1999, 8 s.
ČSN ISO 2911 (570730) Slazené zahuštěné mléko - Stanovení obsahu sacharózy -
Polarimetrická metoda. Praha: Český normalizační institut, 2011, 12 s.
ČSN ISO 57 0107 (570107) Metody zkoušení sýrů, tvarohů, krémů a pomazánek. Praha:
Český normalizační institut, 1966, 34 s.
ČSN ISO 57 0107-3 Metody zkoušení přírodních a tavených sýrů. Stanovení obsahu vody
a sušiny. Praha: Český normalizační institut, 1982, 8 s.
ČSN ISO 6731 (570535) Mléko, smetana a zahuštěné neslazené mléko - Stanovení obsahu
celkové sušiny (Referenční metoda). Praha: Český normalizační institut, 1998, 8 s.
ČSN ISO 6734 (570531) Zahuštěné slazené mléko - Stanovení obsahu celkové sušiny
(Referenční metoda). Praha: Český normalizační institut, 1997, 6 s.
Dilab. Cholesterol (návod). Vydala firma Dilab, 2 s.
DRAČKOVÁ, M. Hodnocení proteolytické aktivity sporotvorných mikroorganismů v tepelně
ošetřeném mléce. Doktorská dizertační práce. Brno: VFU Brno, 2005, 116 s.
FENG, S., LOCK, A. L., GARNSWORTHY, P. C. A rapid lipid separation method
for determining fatty acid composition of milk. Journal of Dairy Science, 2004, vol. 87,
no. 11, p. 3785-3788.
GARFIN, D. E. Electrophoretic methods. (Courtesy of Bio-Rad Laboratories). Academic
Press, inc., 2000, p. 53-109.
ISO 2918. Meat and meat products – Determination of nitrite content - Reference method.
(Stanovení dusitanů v mase a masných výrobcích - referenční metoda). Switzerland:
International Organization for Standardization, 1975, 3 p.
ISO 5553. Meat and meat products – Detection of polyphosphates. (Maso a masné výrobky –
Stanovení polyfosforečnanů. Switzerland: International Organization for Standardization,
1980, 3 p.
ISO 12081. Milk Determination of calcium content. Titrimetric method. IDF: 2010, 12 s.
164
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, no. 259, p. 680-685.
LÓPEZ–FANDIÑO, R., OLANO, A., CORZO, N., RAMOS, M. Proteolysis during storage
of UHT milk: differences between whole and skim milk. Journal of Dairy Research, 1993,
vol. 60, no. 3, p. 339-347.
Megazyme. D-3-hydroxybutyric acid. Assay procedure. Bray: Megazyme International
Ireland LtD., 2011, 11 s.
Megazyme. L-Lactic acid (L-lactate). Assay procedure. Bray: Megazyme International
Ireland LtD., 2006, 11s.
Megazyme. Lactulose. Assay procedure. Bray: Megazyme International Ireland LtD., 2012,
15 s.
Megazyme. Succinic acid. Assay procedure. Bray: Megazyme International Ireland LtD.,
2012, 11 s.
one PSE Operační manuál. Applied Separations, Inc. www.appliedseparations.com.
RICHARDSON, R. K. Determination of fat in dairy products using pressurized solvent
extraction. Journal of AOAC International, 2001, vol. 8, no. 5, p. 1522-1533.
VORLOVÁ, L. Chemie potravin. Návody k praktickým cvičením. 1. vyd. Brno: VFU Brno,
2001, 84 s. ISBN 80-7305-411-6.
165

Chemie-Potravin VFU PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Chemie-Potravin VFU PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO

FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE

Prof. MVDr. Lenka Vorlová, Ph.D.

1 ZÁSADY PRÁCE V LABORATOŘI .................................................................................. 4

2 VEDENÍ LABORATORNÍCH ZÁZNAMŮ ........................................................................ 6

3 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MASA .............................. 7

3.10 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY POUŽÍVANÉ K ODLIŠENÍ JAKOSTNÍCH ODCHYLEK MASA ..................... 29

4 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MASNÝCH VÝROBKŮ 37

4.2 STANOVENÍ OBSAHU SUŠINY ........................................................................................................................ 39

6 STANOVENÍ CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MLÉČNÝCH VÝROBKŮ................... 106

7 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ VAJEC ......................... 118

8 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MEDU .......................... 134

9 LITERATURA .................................................................................................................. 163

Nezbytnou podmínkou úspěšné práce v laboratoři je dobrá teoretická příprava posluchače.

1.1 BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI

Bezpečná práce v chemické laboratoři předpokládá dodržování následujících zásad:

Dosažení spolehlivých výsledků vyžaduje nejen pečlivé dodržování všeobecných zásad

Naměřené výsledky je nezbytné pečlivě zapisovat, vypočítat a zhodnotit v protokolech, které

Protokol o laboratorním vyšetření

3.1 STANOVENÍ DUSÍKU V MASE - KLASICKÝ POSTUP PODLE KJELDAHLA

(1) (NH4)2SO4 + 2 NaOH = 2 NH3 + 2 H2O + Na2SO4

(2) 2 NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4

Nespotřebované množství kyseliny v předloze se zjistí zpětnou titrací standartním roztokem

V objem kyseliny sírové (nebo kyseliny chlorovodíkové) spotřebované při titraci

V1 objem kyseliny sírové (nebo kyseliny chlorovodíkové) spotřebované při titraci

Obsah bílkovin % se vypočítá:

obsah dusíku v % obsah dusíku vypočítaný viz výše

Vlastní stanovení - vzorku:

Vlastní stanovení - standardů:

(ČSN ISO 1444)

m0 hmotnost naváženého vzorku [g]

Schema pipetování do zkumavek:

Vzorek Slepý vzorek AMG

KOH (c = 5,4 mol/l) 0,02 ml 0,02 ml

AMG (100 U/ml v pufru pH=4,8) 2,0 ml 2,0 ml

Destilovaná voda - 0,2 ml

Zkumavky se řádně promíchájí, uzavřou a nechají se inkubovat 1 h při 45 °C za občasného

Vzorek Slepý vzorek AMG

HClO4 (c = 0,6 mol/l) 1,0 ml 1,0 ml

KOH (c = 5,4 mol/l) 0,13 ml 0,13 ml

Vzorek Slepý vzorek Standard Slepý vzorek

Supernatant vzorku 0,3 ml - - -

Supernatant AMG - 0,3 ml - -

Standard glukosy - - 0,3 ml -

Destilovaná voda - - - 0,3 ml

Glukosové činidlo 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml

c = c ∙ 0.18 ∙ ř6 ě8í (!6, ý :6 /8 áž ) ∙ =ř6= čí3 !í ? 3 1 [g/kg]

Výpočet koncentrace (c) glukosy:

! = ! ∙ 0,18 ∙ ř6 ě8í (!6, ý :6 /8 áž ) glukosy [g/kg]

AVZ absorbance vzorku

a hmotnost navážky [g]

a spotřeba odměrného roztoku kyseliny sírové [ml]

Zhotovení kalibrační křivky:

Poznámka: Po skončení měření elektrodu rozšroubujeme, vnitřní roztok vylejeme a teflonové

Zhotovení kalibrační křivky:

Schema pipetování do zkumavek:

Slepá zkouška Vzorek

Destilovaná voda 1,6 ml 1,5 ml

Filtrát vzorku - 0,1 ml

ROZTOK 1 0,5 ml 0,5 ml

ROZTOK 2 0,1 ml 0,1 ml

ROZTOK 3 0,02 ml 0,02 ml

Slepá zkouška Vzorek