Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance
Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid
Chromatography).

1. Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở
phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp
chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được
phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay
một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương
pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao,
khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy
nhiệt.

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc
trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược
phẩm, môi trường…

2. Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC
thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).

 Sắc ký phân bố (partition chromatography).

 Sắc ký ion (ion chromatography).

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được
những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có
khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha
động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo –
SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ
có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có
độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động.
Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu
hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích
bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung
môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều
và phổ biến hơn SKPT.

3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất
mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

 Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký
lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase
chromatography)
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu
điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị
mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất
phân tích.

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta
không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn
các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.

Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý
(thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra
những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):
 Hình 1. Bề mặt silica đã thủy phân

Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các
organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất
phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.

Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica

Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2 bề mặt bị
silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài nhóm Cl
người ta còn sử dụng –OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác
khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít
phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là
ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có
cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người
ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là
loại được sử dụng nhiều nhất.

Hình 3: Cấu trúc của cột ODS

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa
phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích.

Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra
khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác
tốt với pha tĩnh nữa.

Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan (SiO2
thành silicat), hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng ra và thời
gian lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như
trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương
tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có loại cột ít
tương tác với chất phân tích có tính baz (cột LC-DB của hãng SUPELCO).

Hình 4. Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác
với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn
như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của
nhóm –OH với chất cần phân tích.

Hình 5: Cấu trúc cột có gốc isopropyl

Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của
dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực
mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity).

Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren
(Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 –
13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và baz mạnh.

4. Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

 Hòa tan mẫu phân tích.

 Phù hợp với đầu dò.

 Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.

 Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.

 Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta
có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol
(MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là
một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.

Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive
index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index),
độ rửa giải (eluent strength)…

Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các
mũi sắc ký.
 Bảng 1: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng

Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số
dung lượng K’, độ chọn lọc α . Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại
kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng
dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động
phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính baz (nhận
proton) của dung môi.

Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm
với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là một
dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực
trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm
nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ.

Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp
suất cột.

Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC

Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho
những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi
MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn hợp chất phân tích
phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải
chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng.

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ
isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien
dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.

5. Mô tô số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký

5.1. Hệ số phân bố

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như
sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố
(partition coefficient) và được tính như sau:

Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.

CM : nồng độ cấu tử trong pha động.

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.

5.2. Thời gian lưu:

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột.
tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là
thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết.
tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.
 Hình 7. Thời gian lưu của cấu tử phân tích

5.3. Hệ số dung lượng k’

k’ được định nghĩa theo công thức sau:

Với VS : thể tích pha tĩnh

VM : thể tích pha động

Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại.

Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu,
mũi có khả năng bị tù.

Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp
nhận trong khoảng rộng 1-20.

5.4. Hiệu năng

Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của
các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.

Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được:
Hay

Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)
W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)

5.5. Độ chọn lọc

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.

5.6. Độ phân giải:

Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và
hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:

Hay

Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6).

Nguồn: Phòng Phân tích Sắc Ký (CASE)

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High Performance Liquid
Chromatography )
Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận cơ bản như sau:

1. Sơ lược về hệ thống HPLC

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau:

Hình 1: Sơ đồ hệ thống HPLC

Trong đó:

1: Bình chứa pha động.

2: Bộ phận khử khí
3: Bơm cao áp
4: Bộ phận tiêm mẫu
5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)
6: Đầu dò
7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ
thống.
8: In dữ liệu.

1.1. Bình chứa pha động :

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử
dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ
lệ của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà
thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất
hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải.

Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng cho
HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất
tích khiết dùng cho phân tích.

Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo
nên các peak tạp trong quá trình phân tích.

1.2. Bộ khử khí Degases

Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi
pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:

 Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của
peak thay đổi.

 Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì
bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và
hoạt động của cả hệ thống HPLC.

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.

1.3. Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt
được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến
10ml/phút.

1.4. Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi.
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động
(autosamper).

1.5. Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm
đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…
Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.

1.6. Đầu dò

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký
đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà
người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp
.
Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ
điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dò sau:

- Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV

- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất
hấp thụ quang. Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất.
- Đầu dò hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên
và các dẫn suất có huỳnh quang.
- Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các
chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.
- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường.
- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn.
- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…

1.7. Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hệiu do đầu dò phát hiện.

Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi
nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng,
hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân
tich.

1.8. In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài
phần mềm điều khiển.

2. Một số hệ thống HPLC tại CASE

Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích
định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược phẩm, thực phẩm, môi
trường, hóa chất,… Thiết bị HPLC cũng ngày càng phát triển và hiện đại hơn nhờ sự
phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo và sản xuất thiết bị phân tích.

Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác
nhau, đáp ứng được nhu cầu phân tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu tư
các hệ thống HPLC hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất thiết bị
phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate
3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang phổ tử ngoại khả kiến
(UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ
(MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng
cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu.

Một vài hình ảnh thiết bị HPLC tại CASE:

Hệ thống HPLC 10A :

Hệ thống HPLC 20A:
3. Ứng dụng HPLC phân tích mẫu tại CASE

Phân tích đa lượng vitamin, kháng sinh, kháng khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực
phẩm, các loại đường,… trong thực phẩm, dược liệu, hóa chất, phân bón, thức ăn gia
súc,…

Phân tích vi lượng các vitamin trong trái cây, sữa, bánh kẹo, nước, thủy hải sản.

Phân tích dộc tố sinh học biển trong nghêu (ASP).

Phân tích các hoạt chất, tạp chất trong dược phẩm theo các dược điển BP, USP, EP, JP,
…

Phân tích các acid hữu cơ.

Đặc biệt, hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang có độ nhạy và tính chọn lọc cao có
thể phân tích các độc tố Mycotoxin trong thực phẩm, nguyên liệu chế biến và thức ăn
gia súc như Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone,…