Scribd Logo
Upload

Welcome to Scribd!

  • Acdseeprint de Schimb Al Apei Prin Membrana Aceorasi Eritrocite Supuse Sau Nu Actiunli

    Uploaded by

    lenrok4321
    12 views10 pages

    Original Title

    pdfslide.net_acdseeprint-de-schimb-al-apei-prin-membrana-aceorasi-eritrocite-supuse-sau-nu-actiunli

    Copyright

    © © All Rights Reserved

    Available Formats

    PDF or read online from Scribd

    Did you find this document useful?

    Is this content inappropriate?

    Report this Document

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    Download as pdf
    12 views10 pages

    Acdseeprint de Schimb Al Apei Prin Membrana Aceorasi Eritrocite Supuse Sau Nu Actiunli

    Uploaded by

    lenrok4321

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    Download as pdf
    of 10
    INFLUENTA RADIATIILOR NUCLEARE ASUPRA TIMPULUI DE SCHIMB AL APEI PRIN MEMBRANA ERITROCITELOR UMAN: T. Simplaceanw’, C. Bindes', I. Chereji?, V. V. Morariu® LT.IM. Chyj-Napoca Abstract. Studies of the effect of y radiation on the erythrocyte membrane per- meability to water using a N.M.R. technique have been performed. ‘The experiments were carried out “in vitro” using y rays of 662 KeV emittel by 2 Cs!” source and the radiations obtained from 2 Co™ source of 1173 KeV respectively 1337 KeV. Ithas been ascertained that indifferently of the yradietion source used in the experiments, over the physical dosis of $00 cC, the yirradiadion induces the inrease of the permeability for water of the erythrocyte membrane, 1, INTRODUCERE Unul dintre obiectivele importante ale cercetarilor de biofizica fl constituie fenomenele de transport al apei si electrolitilor la nivelul membranelor celulare. Se stie ca apa si continutul de electroliti din celule, organe si organisme, sunt elemente cheie in homeostazia organismelor vii [1], Lucrarea de fat isi propune s& studieze influenta pe care ar putea-o avea radiatiile nucleare asupra timpului de schimb al apei prin membrana eritrocitelor umane. Se stie c& toate membranele biologice sunt mai mult sau mai putin permeabile pentru apa, datorita difuziei prin stratul dublu lipidic. Exista ins& unele celule care sunt excepfional de permeabile, cum sunt eritrocitele gi celulele din epiteliul nefronului, datorita existentei in membrana lor a unui canal pentru epé. [2]. Existé 3 criterii de diferensiere pentru a vedea calea prin care trece apa printr- un canal seu prin stratul dublu lipidic: 1. Raportul permeabilitate osmotica - permeebilitate difwzionala. 2. Energia de activare diferit’ pentru wransportul apei printr-o protein& sau prin stratul lipidic. 3. agentii mercurici care blocheazé transport] apei printr-un canal proteic dar care nu afecteaz’ difuzia prin stratul dublu lipidic al membranei. [3] Transportorul specific al apei, 2 fost postulat cé este responszbil de permeabilitatea crescuté pentru apa a eritrocitelar. Masur&torile privind transportil apei au permis sustinerea ipotezei existenjei unui canal hidrofil, Membranele care poseda acest canal au o valoare mare a raportului difuzie faciliteta - difuzie simpla [4], [5]. Existenta canglului pentru apé in membrana eritrocitar& ii permite apei s& se miste in directia gradientu)ui osmotic (2]. Masuratorile de permesbilitate pentru ap& a membranelor eritrocitare indica existents unei cai de transport facilitet, ce permite traversarea foarte repida 2 membranei de c&tre apa [6]. Proteina trensportor a apei, sau canalul pentru apa din membrana eritrocitard mai este cunoscuté si sub numele de CHIP-28 sau aquaporini, A fost identificata in membrana eritrociter8 si le polul apical al nefrocitelor din epiteliul tubilor contorti proximali, in canaliculele biliere hepatice, in endotelii nefenestrate, dar proteine inrudite au fost identificete gi in diverse jesuturi la organisme diferite. [7] CHIP - 28 este o elicoproteind integral a membranei eritrocitare cu greutatea moleculerd cuprinsé intre 28-30 kDa, ce indeplineste deci functia de canal pentru apa. (2), [4], [5]. [8] Metodele de evaluare a permeabilitatii membraned eritrocitare pertra apa sunt de dou’ tipuri: a. Metode nestationare care au cz principiu aplicarea unui gradient osmotic ce reprezinta de fapt un stres care produce in final hemoliza, Aceste metode evalueaz permeabilitatea osmotica, deci masoard efectiv un flux de epé in una cin cele doud directii, in functie de umilarea sau ratatinarea celulei. [9] b. Metode stationere care nu necesita existenta efectiva a unui flux de apa intr © directie anumita, deci volumul celulei riméne relativ constant. Aceste metode evalueaza permeabilitatea difuzionalé si permit o manipulare mai usoara a celulelor. In aceasté categorie se incadreazi doui tehnici: 1. -radioizotopice (10) 2. - de rezonamté magnetic nucleara {n aceasta Jucrare se vor prezenta rezultatele obfinute in cadrul Colectivului de Biofizicd de la 1.T.1.M. Cluj-Napoca folosind metode RMN. 2. PRINCIPIUL DE MASURARE AL TIMP! APEI PRIN METODA R.M.LN. La baza tehnicii de mésurare a timpului de schimb al apei este folositd metoda ecoului ée spin, procedeu descris de Conlon $i Quthred. [1] Masurarea permeabilitatii apei (deci implicit a timpului de schimb al apei prin membrana) este posibila datorita mai mulior considerente fizice: 2, Protonii apei intra si extra eritrocitare au un timp de relaxare T, mare, de aproximativ 100 ms. b. Pentru a putea face distinctia intre timpul de relaxare al protonilor apei intraeritrocitare (T.,) $i timpul de relaxare al protonilor apei ). in mediul de suspensie se adauga un ion para- UI DE SCHIMB AL 262 magnetic. Se stie c& ionii paramagnetici au proprietatea de a scurta drastic timpul de relaxare al protonilor apei. Astfel prin doparea mediului de suspensie cu ionul paramagnetic Mn™ din MnCl,, se obtine un sistem difazic. c. In aceste conditii timpul de relaxare a) protonilor apei intraeritrocitare (T,,) rimane foarte Jung (presupunénd ca ionii de Mn* nu penetreazi celula) iar timpul de relexare al protonilor apei extraeritrocitare T, scade progresiv pan’ la aproximativ 1 ms datorité doparii cu joni Mn 4. Datorita difuziei apei prin membrana eritrocitara, timpul de relaxare T,, scade progresiv la timpul de relaxare aparent (observat) T’,, e. Se stie din literatura cd intre T’,,, T,, permeabilitatea pentru apa a membranei eritrocitare P exist4 urmatoarea relatie: 1 1 7 P Tac Ts, oP eT, HT as 7 unde: T’,, - timpul de relaxare aparent al H~ T,,* timpul de relaxare aparent al H* intraeritrocitari TE - timpul de selaxare aparent al H* extracritrocitari P= fractia de apa dopatd din solujia de suspensie a eritrocitelor, avand o valoare ée 0,737 T,,- timpul de schimb al apei prin membrana fn final timpul de schimb Te poate fi calculat conform ecuatiei urmatoare: SECS T, Tae Pla, ® unde: T, - timpul de schimb al apei prin membrana Ti, - timpul de relaxare aparent al H~ T’) = timpul de relaxare wrensversald in interiorul celulei Dar intre timpul de relaxare aparent al apei eritrocitare T’,, si permeabilitatea pentry apa P, a membranei, exisi@ un raport de proportionalitate inversé: la 0 permeabilitate mica fi corespunde o valoare mare a timpului de relaxare aperent gi invers. Prin urmare, si intre timpul de schimb al apei prin membrana T, si permeabilitatea pentra apa P, va fi aceeasi relatie de proporfionalitate inversé, con- form ecuatiei urmatoare: Pos Vv A x T (3) unde P - permesbilitatea pentru ap’ a eritrocitului - volumul eritrocitului A aria eritrocitului T, - timpul de schimb al apei prin membran’ 263 magnetic, Se stie c& ionii paramagnetici au proprietatea de a scurta drastic timpul de relaxare al protonilor apei. Astfe) prin doparea mediului de suspensie cu ionul paremagnetic Mn® din MaCl,, se obtine un sistem difazic. c. {n aceste conditii timpul de relaxare al protonilor apei intraeritrocitare Z,,) Famine foarte lung (presupunané c& ionii de Mn* nu penetreaz’ celula) jar timpul de relaxare al protonilor apei extraeritrocitare T, scade progresiv pan3 la aproximativ 1 ms datoriti doparii cu joni Mn*. , Datorita difuziei epei prin membrana eritrocitara, timpul de relaxare T,, scade progresiv la timpul de relaxare aparent (observat) 7’, e. Se stie din literatura cd intre T’,,, T,, permeebilitatea pentru apa a membranei eritrocitare P exist8 urm&ioarea relatie’ 1 1 P. Ty, Ty, ) Pox T, + Typ iN unde: T’,,- timpul de relaxare aperent al H* T,, = timpul de relexare aparent al H* intraeritrocitari Te = timpul de relaxare apasent al H’ extracritrocitari P, = fractia de apa dopata din solutia de suspensie a enitrocitelor, avind o valcare de 0,737 T, - timpul de schimb al apei prin membrana £.In final timpul de schimb Te poate fi calculat conform ecustiei urmétoare I 1 1 tT Te EG e) unde: T, - timpol de schimb al apei prin membrana *. + timpul ée relaxare aparent al H" - timpul ée relaxare transversalé in interiorul celulei Dar intre timpul de relaxare aparent al apei eritrocitare T’,, si permeabilitatea pentru ap& P, a membranci, existé un report de proportionalitate invers&: la 0 permeabilitate mica fi corespunde o valoare mare a timpului de relaxare aparent si invers. Prin urmare. si intre timpul de schimb al pei prin membrana T, $i permeabilitetea pentru apé P, va fi aceeasi relatie de proportionalitate inversa, con- form ecuatiei urmatoare: Po = vu A x T (3) unde: P - permeabilitatea pentru apa a eritrocitului V - yolumul eritrocitului A - aria eritrocitului T, -timpul de schimb al apei prin membrend 264 Din aceste formule se poate constata c4 de fapt componenta lung de relaxare T,, contine in proportie de 90% informatii referitoare la timpul de schimb al apei prin membrana. ‘Avand in vedere faptul cd in aceast& Jucrare s-au facut masuratori relative: timp de schimb al apei prin membrana acelorasi eritrocite supuse sau nu actiunii radiajiilor nucleare, in conditiile metodei mai sus descrise timpul de schimb al apei prin membrana eritrocitara a fost considerat ca fiind aproape identic cu T,, Pentru masuratori s-2 folosit un spectrometru de rezonanja magnetic nuclear’ in impulsuri cu freevempa fix de 25 MHz. Deoarece metoda ecoului de spin necesita prea mult timp pentru acumularea spectrelor, s-a folosit secventa Carr. Purcell-Meiboom Gill. Spectrele obtinute asifel au fost prelucrate folosind unitatea automata de prelucrare numeric a datelor de tip UC-1. Masuratorile au fost efectuate la temperatura camerei succesiv: martor, proba. Deoarece eroarea de masuri este destul de mare, cca. 6%, pentru fiecare determinare s-au facut cel putin céte trei masuratori. 3. MATERIALE $I MOD DE LUCRU S-au recoltat céte 14 ml singe pe citrat de sodiu de la diferiti donatori sanatosi, cantitatea de singe s-a imparyit in dou’ parti egale. O parte a fost supusa actiunii radiatiilor nucleare, iar cealalt jumatate, care constire martorul a fost mentinutd la temperatura camerei acelasi timp cat proba a fost expusé radiatiilor nucleare. Apoi cele dowd cantititi de singe au fost spalate concomitent in felu) urmétor: - s-au centrifugat Ia 4000 rot/min timp de S min., dup’ care s-a inlaturat supematantul; ~ peste eritrocitele ramase s-su adaugat cate 30 ml solutie de sp3lare - s-au centrifugat suspensiile astfel objinute 12 4000 rot/min, timp de 10 minute, dup& care s-a inlaturat supematantul. - apoi din nou s-au adZugat cate 30 ml solutie de spalare si s-au repetat operatiile descrise mai sus. Dupa ultima spalare, din eritrocitele ramase, s-2 facut o suspensie de 75% prin adaugarea solutiei de spalare, Solutia de spalare contine: 75 mmol/MgC!, 85 mmol! ] zaharoz’. 10 mmol/l TRIS $i pH 7.4. Din cele doud suspensii de eritrocite astfel obyinute, s-av Juat cate 1 ml la care s-au adauget céte 0,5 ml solutie de dopa). Solutia de dopaj contine 110 mM/I NaCl si 40 mM/I MnCl,.4H,0. Am obtinut astfel martorul: deci suspensia de eritrocite neexpuse la radiatiile nucleare, si praba propriu zis, adic& suspensia de eritrocite, care au fost expuse actiunii radiatiilor nucleare. in continuare s-2 determinat timpul Ge schimb al apei prin membrana eritrocitard folosind tehnica RMN 265 4. REZULTATE $1] DISCUTIL Pentru primul set de experimente privind influenta radiatiilor nucleare asupra timpului de schimb al apei prin membrana eritrocitelor umane am folosit trei surse identice de Cs!” dispuse in jurul probei la un unghi de 120 intre ele. Astfel eritrocitele au fost supuse iradierii cu radiajii y cu o energie de 662 KeV. Debitul dozei fizice furnizata de cele wei surse astfel dispuse a fost de 250 cGy/h. Nu s-au observat diferente intre timpul de schimb al apei pentru probe iradiate sau nu pani la debitul dozei fizice de 1000 cGy. in Tabelal nr. | s-au trecut valorile medi, AT =T, -T, (4) in funetie de doza fizica de iradiere la care au fost supuse eritrocitele umane. Mentionam c& T, reprezinta valoarea timpului de schimb al apei prin membrana eritrocitelor umane supuse iradierii cu radiatii y de 662 Kev, iar Ty Teprezinta valorile timpilor de schimb a] apei pentru acelezsi eritrocite, nesupuse iradierii (martor), iarn reprezinté numanul de masurdtori efectuate pentru aceeasi proba, iar , reprezinta abaterea standard, In Tabelul ns.2. au fost trecute valorile medii relative ale timpului de schimb al apei prin membrana eritrocitarg, in functic de acccasi sursi de iradiere y (acelasi debit fizic) ca si rezultatele prezentate in Tabelul nr. 1. Semnificatiile notatiilor din acest Tabel sunt identice cu cele din Tabelul nr. 1. cu specificatia c& AF TT ; Ts, 6) Pentru al doilee set de experimente, eriocitele umane au fost supuse iradierii cu radiatie y utilizandu-se o surs8 de Co™. Aceasta emite simultan radiatii y cu energii de 1173 KeV si 1332 KeV. Debitul acestei doze fizice fiind in acest caz de 3000 cGy, In Tabelul nr. 3 s-au trecut valorile medi AT =T, -T, (6) in functie de noua surs& de iradiere y. Jar in Tabelul nr.4. s-au trecut valorile medii relative ale timpului de schimb al apei prin membrana eritrocitaré umand in functie de nova doza fizica furnizata de sursa de Co. Dupa cum se oberva din datele Tebelelor 1, 2, 3, 4 timpul de schimb al apei prin membrana critrocitelor umane expuse radiatiilor y de diferite energii scade fat de timpu] de schimb al apei prin membrana acelorasi eritrocitelor umane neexpuse influenfei radiatiilor nucleare, Pe de alt parte, din analiza atenta a datelor din Tabele, se observi c& de multe ori se obtin valori diferite D T si DT/T pentru acezasi doza fizica de iradiere dati de surse diferite de radiatii y: 266 O explicatie a acestuia consta in faptul c@ din cauza conditiilor experimentale nu s-a putut pistra acelasi unghi solid de expunere intre cazul iradierii cu sursele de Cs"” si sursa de Co®, O alta explicatie ar putea-o constitui faptul c in toate experimentele donatorii de singe au fost diferiti $i cd nu in totdeauna determinarile timpul de schimb al apei prin metoda R.M.N, au avut loc imediat dupa incheierea iradierii Experimentele privind timpul de schimb aparent a] apei prin membrana eritrocitelor umane expuse radiatiilor y, utilizind tehnica R.M.N. au fost efectuate in ipoteza cA ionul paramagnetic Mn* nu patrunde in interiorul eritrocitelor. Cercetarile din ultimul timp efectuate atat de Colectivul de Biofizica de la LT.1.M. Cluj-Napoca cat si de alti cercetBtori arat& faptul c& ionul de Mn intra in eritrocit dar cu o cineticd lent. In aceste conditii ar fi posibil ca rezultatele noastre sa fie afectate de patrunderea Mn* in interjorul erivocitului, chiar dac& s-a incercat ca masurdtorile R.M.N. sé aibé loc imediat dup’ incheierea iradierii. Se stie din literatura [14] si [15] c& prin iradiere, celulele rosii umane devin mei permeabile pentru transportul de cationi. Faptul ca timpul de schimb al apei prin membrana eritrocitara umana este mai scAzut in cazul iradierii fata de martor s-ar explice astfel, stiut fiind ca prin osmoza, apa urmeaza fluxul ionilor. ‘Ase cum s-a aratat in introducere, canalul pentra apé din membrana eritrocitara este glicoproteina CHIP-28. Faptul c, din experimentele noastre rezulta ca prin iradiere, membrana eritrocitaré umand, devine mai permeabila pentru apa, ne face si credem c8, radiate y (indiferent de energie), actioneazé asupra CHIP-ului 28, dar felul in care actioneaza asupra aquaporinei este inca neelucidat. TABELUL I. Valorile medii D Tin functie de doza fizied de iradiere. Nr. Doza aT a oO oy Ims) 1 1500 0.38 3 20.286 2 2000 0.48 4 20:33 3 2000 0318 5 40078 4 2500) 0.337 4 20215 5 2625, 0.636 3 20,297 6 3000) ostt 7 20,298 7 3000) 0.595 4 40,85 8 3500 775 2 20,475 9 4000) 0.602 5 20245 10 4500 057 3 20,128 1" 5500 27 5 20,099 267 Ne. ogy F n oy 1 3500 0266 3 30342 2 2000 005 4 3013 3 2000 0082 5 20013 4 2500 205 4 203 5 2625 008 3 20.008 6 3000 “on26 7 20.035 7 3000 01068 4 20073 8 3500 one 2 30088 8 2000 008 5 20031 10 2500 o0r7 3 0017 1" 5500 1082 5 20015 TABELUL IM. Valorile medii DT tn funetie de doza fi ‘4 de iradiere Ne ‘Deza at e. soy, ea] 1 500 016 3 30.043) 2 4000 034 2 10.13 3 2000 051 Z 44 4 2500 02 2 40.05 5 72500) “0.336 5 032 6 3000) 28 7 20.232 7 3500) “256 3 20.520 8 4000 D555 4 277 ° 4509 “078 3 oe 10 4500 058 2 2015 " 000) “042 2 30436 2 7500 0357 4 20287 3 10500 0.0875 4 30.020 ‘TABELUL IV. Velorile medi relative DT/T in funetie de doza fizied de iradicre Doza oT Ne

    You might also like