Tiểu luận

Kỹ thuật gen:
Gene cloning
and DNA analysis
Tách dòng gene và phân tích DNA
Sixth edition

Part I
The basic principles of gene cloning and
DNA analysis
Phần I
Các nguyên tắc cơ bản của tách dòng gen và phân tích DNA

GVHD: PGS. TS Trần Liên Hà

Nhóm sinh viên thực hiện:
Phạm Thu Hiền 20151399
Nguyễn Tùng Lâm 20152134
Nguyễn Trọng Anh Tuấn 20154115
 MỤC LỤC

Chương 4: Các thao tác với DNA tinh khiết 3

4.1 Phổ enzyme thao tác DNA ........................................................................................ 4
4.1.1 Các nuclease ....................................................................................................... 5
4.1.2 Các enzyme Ligase ............................................................................................. 6
4.1.3 Các enzyme polymerase..................................................................................... 7
4.1.4 Các enzyme biến đổi DNA .................................................................................. 8
4.2 Các enzyme cắt DNA – enzyme cắt giới hạn ................................................................... 9
4.2.1 Sự phát hiện và chức năng của enzyme giới hạn ..................................................... 10
4.2.2 Enzyme giới hạn loại 2 cắt DNA tại những trình tự nucleotide đặc hiệu .................. 10
4.2.3 Đầu bằng và đầu dính ........................................................................................... 11
4.2.4 Tần suất của các trình tự nhận biết trong một phân tử DNA .................................. 12
4.2.5 Quá trình cắt giới hạn trong phòng thí nghiệm....................................................... 13
4.2.6 Phân tích kết quả phân chia bằng các enzyme giới hạn ........................................... 15
4.2.7 Ước lượng kích cỡ của phân tử DNA ..................................................................... 17
4.2.8 Lập biểu đồ về vị trí của các đoạn giới hạn trong một phân tử DNA........................ 18
4.2.9 Phương pháp điện di trên gel đặc biệt để phân tách các phân tử lớn hơn ................ 20
4.3 Ligation – kết hợp các phân tử DNA với nhau ...................................................... 21
4.3.1 Phương thức hoạt động của DNA ligase ........................................................ 22
4.3.2 Các đầu dính làm tăng hiệu quả ligation ......................................................... 22
4.3.3 Tạo các đầu dính cho các phân tử có đầu bằng. ............................................ 23
4.3.4 Nối đầu bằng bằng enzyme DNA topoisomerase ........................................... 27
Chương 4:
Các thao tác với DNA
tinh khiết
Nội dung:
4.1 Phổ enzyme thao tác DNA
4.2 Các enzyme cắt DNA – enzyme cắt giới hạn
4.3 Liên kết – nối liền các phân tử DNA
 Trong một thí nghiệm tách dòng gen, sau khi đã có được các mẫu DNA tinh
khiết ta cần phải tạo được phân tử DNA tái tổ hợp. Để tạo được phân tử DNA tái
tổ hợp, vector và đoạn DNA mong muốn cần phải được cắt tại các vị trí nhất định
và được nối lại một cách có kiểm soát. Cắt và nối chỉ là 2 trong số rất nhiều các
kỹ thuật thao tác với DNA đã được phát triển trong những năm gần đây. Ngoài 2
kỹ thuật trên, DNA còn có thể được làm ngắn, kéo dài, chuyển thành RNA, nhân
lên, và thay đổi bằng cách thêm hoặc bớt một số gốc hóa học nhất định. Các thao
tác này có thể được tiến hành trong ống nghiệm và là nền tảng của việc tách dòng
gene, cũng như nghiên cứu mặt hóa sinh của DNA, cấu trúc gene, và sự điều
khiển biểu hiện gene.

Gần như mọi kỹ thuật thao tác với DNA đều sử dụng các enzyme tinh khiết.
Các enzyme này tham gia vào nhiều quá trình khác nhau trong tế bào như: sao
chép DNA, phiên mã, loại bỏ các DNA ngoại lai hoặc không mong muốn, sửa
chữa các gene bị đột biến, và tái tổ hợp lại các DNA. Sau khi tinh sạch từ dịch tế
bào, nhiều enzyme có thể được thúc đẩy để thực hiện các chức năng vốn có của
nó, hoặc các chức năng tương tự, trong các điều kiện nhân tạo. Mặc dù các phản
ứng enzyme khá là đơn giản, nhưng đa số các phản ứng này lại không thể diễn ra
theo các phương thức hóa học bình thường. Vì vậy, enzyme tinh khiết có vai trò
quan trọng trong kỹ thuật gene và một ngành công nghiệp quan trọng về việc
chuẩn bị, phân loại, và quảng bá chúng đã nổi lên. Các cung cấp thương mại các
enzyme với độ tinh khiết cao cung cấp dịch vụ thiết yếu cho các nhà sinh học
phân tử.

2 thao tác cắt và nối là các thao tác cơ bản trong tách dòng gene và được thực
hiện bởi enzyme cắt giới hạn (để cắt) và ligase (để nối). Phần lớn chương này sẽ
bàn về 2 cách sử dụng của 2 loại enzyme này. Nhưng đầu tiên chúng ta sẽ tìm
hiểu về toàn bộ các loại enzyme được sử dụng trong thao tác với DNA để xem
các loại phản ứng có thể được thực hiện. Nhiều loại enzyme sẽ được nhắc đến ở
các chương sau khi các quá trình mà chúng tham gia được miêu tả.

4.1 Phổ enzyme thao tác DNA

Các enzyme thao tác với DNA có thể được chia thành 4 nhóm chính, tùy thuộc
vào loại phản ứng mà nó xúc tác:
- Nuclease: các enzyme cắt, làm ngắn hoặc phân hủy các phân tử nucleic
acid
- Ligase: nối các phân tử nucleic acid với nhau

- Polymerase: tạo ra các bản sao của DNA

- Enzyme biến đổi: gắn hoặc loại bỏ một số các gốc hóa học
Trước khi đề cập đến cụ thể từng nhóm một thì ta cần chú ý đến 2 điều sau.
Thứ nhất, mặc dù hầu hết các enzyme có thể được phân chia vào một nhóm nhất
định, nhưng vẫn có một số thể hiện đặc tính của 2 hoặc nhiều nhóm. Quan trọng
nhất là nhiều loại polymerase thường có khả năng phân hủy nucleic acid đi kèm
với khả năng tạo ra các phân tử mới của chúng.
Thứ hai, chúng ta nên biết rằng, ngoài các enzyme trong thao tác với DNA,
còn có nhiều enzyme với các chức năng tương tự tác động lên RNA đã được biết.
Enzyme ribonuclease được dùng để loại bỏ RNA ra khỏi DNA trong khi chuẩn
bị (T-30) là một ví dụ về các enzyme đó. Mặc dù một số loại enzyme có tác dụng
với RNA cũng được sự dụng trong quá trình sao chép gene và sẽ được nhắc đến
trong các chương sau, chúng ta sẽ tập trung vào các enzyme có tác động lên DNA.

4.1.1 Các nuclease

Các enzyme nuclease phân hủy DNA bằng cách cắt các liên kết
phosphodiester nối phân tử nucleotit này với phân tử tiếp theo trong một chuỗi
DNA. Có 2 loại DNA khác nhau (hình 4.1):
- Exonuclease: loại bỏ từng nucleotit một từ các đầu của các sợi DNA
- Endonuclease: có thể cắt các liên kết phosphodiester từ bên trong các phân
tử DNA.

Hình 4.1: các phản ứng

được xúc tác bởi 2 loại
enzyme khác nhau.
A) một enzyme exonuclease loại
bỏ nucleotit từ các đầu của sợi
DNA.
B) một endonuclease cắt đứt các
liên kết phosphodiester ở giữa
mạch
Cleavage: vị trí cắt
Hydrogen bond: liên kết hydro
Phosphodiester bond: liên kết
phosphodieste

Điểm khác biệt chính giữa các exonuclease khác nhau là số sợi DNA bị phân
hủy khi một sợi DNA đôi bị tấn công. Enzyme Bal31 (thu được từ vi khuẩn
Alteromonas espejiana) là một exonuclease có khả năng loại bỏ nucleotit của cả
2 sợi đơn của 1 sợi đôi (hình 4.2a). Khoảng thời gian mà Bal31 tác động lên một
nhóm DNA càng lớn thì các đoạn DNA thu được càng ngắn. Trái lại, các enzyme
như E.coli exonuclease III chỉ phân hủy một sợi đơn trong sợi DNA kép và kết
quả là các sợi DNA đơn (hình 4.2b).
 Hình 4.2 Các phản ứng được xúc tác bởi các loại exonuclease khác nhau.
A) Bal31loại bỏ nucleotit từ cả 2 sợi đơn của sợi DNA đôi.
B) E.coli exonuclease III chỉ loại bỏ nucleotit từ đầu 3/ của sợi DNA

Các tiêu chuẩn tương tự cũng có thể được dùng để phân loại endonuclease.
Enzyme S1 endonuclease (thu được từ loài nấm Aspergillus Oryzae) chỉ cắt 1 sợi
đơn (hình 4.3a), trong khi DNase I được thu từ tuyến tụy của bò có thể cắt cả sợi
đơn và đôi (hình 4.3b). DNase I không đặc hiệu vì nó sẽ cắt DNA tại các vị trí
bất kì nên kết quả thu được sau một phản ứng dài với DNase sẽ là các
mononucleotit và các đoạn oligonucleotit ngắn. Trong khi đó, nhóm các enzyme
đặc biệt được gọi là các enzyme cắt giới hạn sẽ cắt các sợi DNA đôi tại một số
lượng có hạn các vị trí nhận biết đặc hiệu (hình 4.3c). Các enzyme quan trọng
này sẽ được miêu tả chi tiết ở trang 50.
Hình 4.3 các phản ứng được
xúc tác bởi các loại
endonuclease khác nhau.
a) S1 nuclease chỉ cắt các sợi đơn
bao gôm cả các đoạn cắt đơn
của các sợi đôi
b) DNase I cắt cả các sợi DNA
đơn và đôi
c) Một enzyme cắt giới hạn cắt
sợi DNA đôi tại những vị trí
nhất định với số lượng có hạn

4.1.2 Các enzyme Ligase

Chức năng của enzyme ligase trong tế bào là để sửa chữa các đoạn DNA đơn
không liên mạch xuất hiện trong các sợi DNA đơn như trong quá trình sao chép
DNA. Các enzyme DNA ligase từ hầu hết các cơ thể sống còn có khả năng nối
những đoạn DNA đôi độc lập (hình 4.4). Vai trò của các enzyme này trong quá
trình tạo DNA tái tổ hợp sẽ được đề cập ở trang 63
 Hình 4.4 2 phản ứng được xúc tác
bởi ligase:
a) Sửa chữa sự ngắt quãng- thiếu đi
một cầu nối phosphodieste trong 1 sợi đơn
của sợi kép
b) Nối 2 phân tử với nhau

4.1.3 Các enzyme polymerase

Các enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp nên các sợi cDNA mới dựa trên
mạch DNA hay RNA khuôn (hình 4.5a). Đa số chúng sẽ chỉ hoạt động nếu mạch
khuôn có những vùng mạch đôi với vai trò như mồi để bắt đầu quá trình tổng hợp.
Có 4 loại polymerase thường được sử dụng trong kỹ thuật gene. Đầu tiên là
DNA polymerase I thường thu được từ E.coli. DNA polymerase I sẽ gắn vào đoạn
sợi đơn (vùng nick) của một sợi đa phân là đôi và sẽ tộng hợp nên một sợi mới
hàn toàn và loại bỏ sợi nucleotit đã tồn tại trên được đi của nó (hình 4.5b). Vì vậy
DNA polymerase I là một ví dụ cho các enzyme với tác dụng kép – kéo dài DNA
và phân hủy DNA
Các hoạt tính polymerase và nuclease của DNA polymerase I được thực hiện
bởi các vùng khác nhau của enzyme. Vùng mang hoạt tính nuclease nằm ở 323
acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptit nên việc loại bỏ vùng này sẽ tạo ra một
enzyme có hoạt tính polymerase nhưng không còn có thể phân hủy DNA. Enzyme
đã được biến đổi này được gọi là mảnh Klenow vẫn có thể tổng hợp lên 1 sợi
cDNA trên một mạch khuôn đơn nhưng sẽ không thể tiếp tục một khi đoạn nick
đã đầy vì không còn hoạt tính nuclease (hình 4.5c). Một số loại polymerase- tự
nhiên và đã được biến đổi- có đặc điểm tương tự như mảnh Klenow. Các enzyme
này được ứng dụng chủ yếu vào việc giải trình tự DNA.
Enzyme Taq DNA polymerase được sự dụng trong chuỗi phản ứng
polymerase (PCR) là enzyme DNA polymerase I của loài vi khuẩn Thermus
aquaticus. Loài vi khuẩn này sống ở các suối nước nóng, và nhiều enzyme của
nó, tính cả taq polymerase, có khả năng chịu nhiệt, nghĩa là chúng có thể chống
lại việc biến tính bởi nhiệt. Đây là điểm đặc biệt đã làm cho nó thích hợp cho quá
tình PCR vì nếu nó không chịu nhiệt thì nó sẽ bị bất hoạt khi ta nâng nhiệt độ lên
94oC để làm biến tính DNA.
Loại DNA polymerase cuối cùng quan trọng trong kỹ thuật gene là reverse
transcriptase (enzyme phiên mã ngược), một loại enzyme tham gia vào quá trình
sao chép của một số loại virus. Điều đặc biệt của enzyme phiên mã ngược là nó
sử dụng mạch khuôn là RNA chứ không phải là DNA (hình 4.5d). Khả năng tổng
hợp lên sợi DNA bổ sung cho mạch khuôn là RNA là tâm điểm của kỹ thuật sao
chép cDNA (T-130).
 Hình 4.5 các phản ứng
được xúc tác bởi DNA
polymerase.
a) Phản ứng cơ bản: sợi
DNA được tổng hợp theo chiều
5/-3/
b) DNA polymerase I ban
đầu là làm đầy đoạn nick nhưng
sẽ tổng hợp lên sợi mới và phân
hủy sợi cũ trong quá trình đó,
c) Đoạn Klenow chỉ làm đầy
các đoạn nick
d) Enzyme phiên mã ngược
sự dụng mạch khuôn là RNA.

4.1.4 Các enzyme biến đổi DNA

Có rất nhiều các enzyme khác nhau làm biến đổi DNA bằng cách thêm vào
hay bớt đi một số các gốc hóa học nhất định. Các loại quan trong nhất là:
- Alkaline phosphatase (từ E.coli, mô ruột bê, hay tôm hồng) loại bỏ gốc
phosphate ở cuối đầu 5/ của sợi DNA (hình 4.6a)
- Polynucleotide kinase (từ E.coli bị nhiễm phage T4) có tác động trái ngược
với alkaline phosphatase là thêm vào các nhóm phosphate vào đầu 5/ (hình
4.6b)
- Terminal deoxynucleotidyl transferase (từ mô tuyến ức của bê) thêm vòa
đầu 3/ của DNA một số deoxyribonucleotit
(hình 4.6c) Hình 4.6 các phản ứng
được xúc tác bởi các enzyme
biến đổi DNA
a) Alkaline phosphatase loại
bỏ các gốc phosphate ở đầu 5/
b) Polynucleotide kinase gắn
thêm các gốc phosphate vào đầu
5/
c) Teminal deoxynucleotidyl
transferase thêm các
deoxyribonucleotit vào đầu 3/ của
hoặc (i) sợi đơn hay (ii) sợi đôi
4.2 Các enzyme cắt DNA – enzyme cắt giới hạn
Tách dòng gen đòi hỏi các phân tử DNA được cắt một cách chính xác và có
thể tái lặp được. Điều này được minh họa thông qua cách cắt các vector trong quá
trình hình thành một DNA tái tổ hợp (Hình 4.7a). Mỗi vector phải được cắt tại
một vị trí duy nhất, để mở vòng tròn giúp DNA mới có thể cài vào: một phân tử
bị cắt nhiều lần sẽ bị vỡ ra thành nhiều mảnh riêng biệt và sẽ không được sử dụng
như một vector tách dòng. Hơn nữa, mỗi vector phải được cắt tại chính xác cùng
một vị trí trên vòng tròn – điều này sẽ được làm rõ ở các chương sau, nên cắt
ngẫu nhiên là không đủ thỏa mãn yêu cầu này. Rõ ràng là cần một loại nuclease
đặc biệt để thực hiện thao tác này.

Hình 4.7 Sự cần thiết về sự

phân cắt có độ chính xác cao
trong một thí nghiệm tách
dòng gên

Thông thường các DNA sẽ được tách dòng cũng cần phải được cắt ra (Hình
4.7b). Có hai lý do cho việc này. Thứ nhất, nếu mục đích là để sao chép một gen
duy nhất, có thể chỉ gồm 2 hoặc 3 kb DNA, thì gen đó phải được tách khỏi các
phân tử DNA có kích thước lớn (lớn hơn 80 kb) thu được bằng cách sử dụng một
cách thuần thục các kỹ thuật tách chiết được miêu tả ở chương 3. Thứ hai, các
phân tử DNA có kích thước lớn phải được cắt nhỏ ra thành các đoạn có kích thước
đủ nhỏ để được mang bởi vector. Hầu hết các vector tách dòng phù hợp với các
đoạn DNA với kích thước cụ thể. Ví dụ: phần lớn vector tách dòng có bản chất
plasmid không hiệu quả khi tách dòng các DNA có kích thước lớn hơn 8 kb.
Các enzyme cắt giới hạn tinh khiết cho phép các nhà sinh học phân tử cắt các
phân tử DNA chính xác và có khả năng tái lặp được cần thiết cho việc tách dòng
gen. Việc tìm ra những enzyme này, dẫn tới giải nobel cho W. Arber, H. Smith,
và D. Nathans năm 1978, là một trong những bước đột phá quan trọng trong sự
phát triển của kĩ thuật gen.
4.2.1 Sự phát hiện và chức năng của enzyme giới hạn
Những quan sát đầu tiên dẫn đến việc tìm ra enzyme giới hạn được thực hiện
vào nhưng năm 1950, khi phát hiện ra một số chủng vi khuẩn có khả năng miễn
dịch với các phage, một hiện tượng gọi là sự hạn chế có kiểm soát của vật chủ.
Cơ chế của quá trình này không quá phức tạp, mặc dù đã phải mất hơn 20 năm
để hiểu được nó một cách đầy đủ. Sự cắt hạn chế này xảy ra khi vi khuẩn tiết ra
một loại enzyme có khả năng phân hủy các DNA của phage trước khi chúng kịp
sao chép và điều hòa việc tổng hợp hình thành các phage mới (Hình 4.8a). DNA
của vi khuẩn vật chủ, thứ mà khi bị phân cắt sẽ dẫn đến sự chết của tế bào, được
bảo vệ khỏi sự phá hủy này vì nó có gắn thêm các nhóm methyl bất hoạt các
enzyme phân hủy này (Hình 4.8b).

Hình 4.8 Chức năng của

enzyme cắt giới hạn trong tế
bào vi khuẩn
a) DNA của phage bị cắt
b) Nhưng DNA của vi khuẩn thì
không

Các enzyme phân hủy này được gọi là enzyme cắt giới hạn và được tổng hợp
bởi nhiều, có thể là mọi loại vi khuẩn khác nhau, hơn 2500 loài khác nhau đã
được phân lập và hơn 300 loại đã có thể sử dụng trong phòng thí nghiệm. Ba
nhóm enzyme giới hạn khác nhau đã được nhận dạng, mỗi loại được phân biệt
bằng những cách thức hoạt động khác nhau. Loại I và III khá là phức tạp và có
một vai trò hạn chế trong kỹ thuật gen. Enzyme giới hạn loại 2 giữ vai trò rất quan
trọng trong kỹ thuật tách dòng gen.
4.2.2 Enzyme giới hạn loại 2 cắt DNA tại những trình tự nucleotide đặc
hiệu
Đặc điểm quan trọng nhất của enzyme giới hạn loại 2 (hay sẽ được gọi là
enzyme giới hạn từ đây) là mỗi enzyme có một trình tự nhận biết đặc hiệu
tại vị trí mà nó cắt phân tử DNA. Mỗi enzyme cụ thể cắt đoạn DNA tại 1 trình tự
nhận biết duy nhất và không cắt tại vị trí khác. Ví dụ, enzyme giới hạn Pvul (phân
lập từ Proteus vulgaris) chỉ cắt DNA ở đoạn hexanucleotide CGATCG. Ngược
lại, một loại enzyme thứ hai của cùng loại vi khuẩn đó, được gọi là PvuII, cắt tại
một đoạn hexanucleotide khác CAGCTG.
Nhiều loại enzyme giới hạn nhận biết các đoạn hexanucleotide, nhưng có
những loại cắt các đoạn bốn, năm, tám hay thậm chí các trình tự nucleotide dài
hơn. Sau3A (từ Staphylococcusaureus chủng 3A) nhận biết GATC, và Alul
(Arthrobacter luteus) cắt tại AGCT. Cũng có những ví dụ về enzyme giới hạn với
các trình tự nhận dạng thoái hóa, có nghĩa là chúng cắt DNA tại các đoạn trong
một họ các trình tự liên quan đến nhau. HinfI (Haemophilus influenzae chủng Rf),
nhận biết GANTC, vì thế cắt tại GAATC, GATTC, GAGTC, và GACTC. Các
trình tự nhận biết của một số loại enzyme giới hạn thường dùng đã được liệt kê ở
bảng 4.1.
Các trình tự được viết
theo chiều 5’-3’.
N thay cho mọi loại
Nucleotide bất kỳ
Chú ý rằng hầu hết
các trình tự đều có
tính đối xứng: 2 sợi là
giống nhau khi đọc
cùng chiều

Bảng 4.1 trình tự nhận biết của một số loại enzyme cắt giới hạn thường được sử
dụng nhất
4.2.3 Đầu bằng và đầu dính
Bản chất của đoạn cắt bởi các enzyme cắt giới hạn giữ vai trò quan trọng trong
việc thiết kế một thí nghiệm tách dòng. Nhiều enzyme giới hạn cắt cả 2 sợi ngay
chính giữa trình tự nhận biết (Hình 4.9a), tạo thành các “đầu cùn” hay còn gọi là
“đầu bằng”. Ví dụ như PvuII và AluI.
Các loại enzyme giới hạn khác cắt theo một cách khác. Các enzyme này cắt
hai đoạn DNA không cùng tại một ví trí. Thay vào đó, chúng cắt lệch thành hai
hoặc bốn đoạn nucleotide, các đoạn DNA có các sợi đơn ngắn ở mỗi đầu (Hình
4.9b). Hay còn gọi là “đầu dính” hoặc “đầu gắn kết”, vì sự bổ sung giữa các cặp
base có thể gắn phân tử DNA lại một lần nữa (đầu dính đã được nhắc tới ở trang
20 trong phần miêu tả sự nhân đôi của λ phage). Một đặc điểm quan trọng của
đầu dính là các enzyme giới hạn có trình tự nhận biết khác nhau có thể tạo ra các
đoạn đầu dính giống nhau. BamHI (nhận biết đoạn GGATCC) và BglII
(AGATCT) đều tạo ra đầu dính GATC (hình 4.9c). Các đoạn đầu dính này cũng
được được tạo ra bởi Sau3A chỉ nhận biết đặc hiệu đoạn tetranucleotide GATC.
Các đoạn DNA được phân chia bởi một trong các loại enzyme này có thể nối lại
với nhau, vì mỗi đoạn đều mang một đoạn đầu dính bổ sung.

Hình 4.9 Các loại đầu được tạo ra

khi cắt DNA với các loại enzyme
giới hạn khác nhau
a) Đầu bằng được tạo bởi AluI
b) Đầu dính được tạo bởi EcoRI
c) Các đầu dính giống nhau được tạo
bởi BamHI, BglII, Sau3A

4.2.4 Tần suất của các trình tự nhận biết trong một phân tử DNA
Số lượng trình tự nhận biết của một enzyme giới hạn trong một phân tử DNA
đã được xác định kích thước có thể được tính toán cụ thể. Một đoạn
tetranucleotide (ví dụ GATC) được nhận biết mỗi 4 mũ 4 = 256 nucleotides, và
một đoạn hexanucleotide (ví dụ GGATCC) được nhận biết mỗi 4 mũ 6 = 4096
nucleotides. Mỗi phép tính này giả sử các nucleotides được sắp xếp theo thứ tự
ngẫu nhiên và 4 loại nucleotides có tỷ lệ bằng nhau (ví dụ hàm lượng GC chiếm
50%). Trên thực tế, cả hai giả định này đều hoàn toàn không có hiệu lực. Ví dụ,
phân tử λ DNA, 49 kb, chứa khoảng 12 vị trí nhận biết các trình tự hexanucleotide.
Trên thực tế, nhiều vị trí nhận biết này được nhận biết với tần suất ít hơn (ví dụ 6
với BglII, 5 với BamHI, và chỉ 2 với SalI), phản ánh thực tế rằng hàm lượng GC
của λ ít hơn 50% (Hình 4.10a).
Hơn nữa, các vị trí giới hạn thường không phân bố đều dọc theo một phân tử
DNA. Nếu chúng có, sẽ bị cắt bởi một enzyme giới hạn thành các đoạn có kích
thước gần bằng nhau. Hình 4.10b chỉ ra rằng các đoạn được tạo ra bởi việc cắt λ
DNA bằng BglII, BamHI, và SalI. Trong mỗi trường hợp có một sự phân bố khá
rộng về kích thước các mảnh, cho thấy rằng trong các λ DNA, nucleotides không
được sắp xếp theo trình tự ngẫu nhiên.
Bài học rút ra từ hình 4.10 là mặc dù biện pháp toán học có thể tính toán số
lượng vị trí giới hạn trong một phân tử DNA nào đó, chỉ có phân tích thực nghiệm
mới có thể đưa ra kết quả chính xác. Do đó chúng ta phải tiếp tục xem xét cách
sử dụng các enzyme giới hạn trong phòng thí nghiệm.
Hình 4.10 Sự phân cắt phân tử λ DNA
a) Vị trí của các trình tự nhận biết của BglII, BamHI, SalI
b) Các mảnh được tạo ra khi cắt bởi mỗi loại enzyme. Các con số là kích thức của mảnh
tính theo bp.
4.2.5 Quá trình cắt giới hạn trong phòng thí nghiệm
Ví dụ, chúng ta xem xét làm thế nào để cắt một mẫu λ DNA (nồng độ 125
mg/ml) bằng BglII.
Đầu tiên, đưa lượng DNA cần thiết vào ống nghiệm. Lượng DNA sẽ bị cắt
giới hạn phụ thuộc vào bản chất của thí nghiệm. Trong trường hợp này chúng ta
sẽ cắt 2 µg λ DNA, được chứa trong 16 µl mẫu (Hình 4.11a). Vì vậy, micropipette
với độ chính xác cao rất cần thiết trong thí nghiệm này.

Hình 4.11 Quy trình thực hiện thí nghiệm phân cắt giới hạn trong phòng TN
Các thành phần quan trọng khác trong phản ứng sẽ là các enzyme giới hạn,
được sản xuất bởi một nhà cung cấp thương mại với độ tinh khiết cao và nồng độ
xác định. Nhưng trước khi bổ sung enzyme, dung dịch có chứa DNA cần phải
được điều chỉnh để tạo các điều kiện nhất định để đảm bảo các enzyme hoạt động
một cách tốt nhất. Hầu hết enzyme giới hạn hoạt động hiệu quả tại pH 7.4, nhưng
những enzyme khác nhau có yêu cầu khác nhau về độ mạnh của ion (thường là
NaCl) và nồng độ Mg2+ (Tất cả các enzyme giới hạn loại 2 đều cần Mg2+ để có
thể hoạt động được). Cũng nên bổ sung thêm một chất khử, ví dụ như
dithiothreitol (DTT), giúp ổn định enzyme và ngăn ngừa sự bất hoạt của nó. Tạo
ra các điều kiện thích hợp cho sự hoạt động của enzyme rất quan trọng – nồng độ
Mg2+ hoặc NaCl không phù hợp không chỉ làm giảm hoạt tính của enzyme giới
hạn, mà còn có thể thay đổi tính đặc hiệu của enzyme, khiến cho sự phân cắt DNA
có thể xảy ra thêm ở các trình tự khác, không đúng tiêu chuẩn.

Bảng 2.2 Một dung dịch đệm với nồng độ 10x thích hợp cho việc cắt giới hạn
DNA bằng BglI
Các thành phần dung dịch đệm phù hợp của BglII đã được liệt kê tại bảng 4.2.
Những chất đệm này với nồng độ gấp 10 lần với nồng độ thực hiện thí nghiệm,
nên cần pha loãng bằng cách thêm vào hỗn hợp phản ứng. Ví dụ, thể tích thích
hợp cho hỗn hợp phản ứng là 20 µl, vì thế chúng ta thêm 2 µl 10 × BglII chất đệm
vào 16 µl DNA (Hình 4.11b).
Bây giờ có thể bổ sung các enzyme giới hạn. Theo quy ước, 1 đơn vị enzyme
được định nghĩa là số lượng cần thiết để cắt 1 µg DNA trong 1 giờ, vì thế chúng
ta cần 2 đơn vị BglII để cắt 2 µg λ DNA. BglII với nồng độ 4 đơn vị/ µl, vì thế 0.5
µl là vừa đủ để phân tách DNA. Các thành phần cuối cùng trong hỗn hợp phản
ứng là 0.5 µl BglII và 1.5 µl nước, với tổng thể tích dung dịch là 20 µl (Hình 4.11c).
Yếu tố cuối cùng cần phải xem xét là nhiệt độ. Phần lớn enzyme giới hạn bao
gồm BglII, hoạt động tốt nhất ở 37 °C, tuy nhiên một số loại khác cần những điều
kiện khác nhau. Ví dụ như TaqI, một loại enzyme giới hạn của Thermus aquaticus
và, như Taq DNA polymerase, hoạt động tốt ở nhiệt độ cao. Quá trình cắt giới
hạn của Taq phải được thực hiện ở nhiệt độ 65 °C để enzyme có thể hoạt động
tốt nhất.
Sự phân tách sẽ hoàn tất sau 1 tiếng (Hình 4.11d). Nếu các đoạn DNA được
phân tách này được sử dụng trong các thí nghiệm về tách dòng gen, enzyme bằng
cách nào đó phải bị phá hủy hoàn toàn để nó không thể vô tình cắt các phân tử
DNA khác được thêm vào ở các giai đoạn sau. Có rất nhiều cách để “giết chết”
các enzyme này. Trong nhiều trường hợp ủ trong thời gian ngắn ở 70 °C là đủ,
đối với một vài trường hợp khác ta sử dụng phenol hoặc bổ sung ethylenediamine
tetraacetate (EDTA) liên kết các ion Mg2+ để bất hoạt các enyme giới hạn (Hình
4.11e).
4.2.6 Phân tích kết quả phân chia bằng các enzyme giới hạn
Kết quả của quá trình cắt giới hạn là các đoạn DNA, với kích thước phụ thuộc
vào vị trí của trình tự nhận biết trong phân tử ban đầu (Hình 4.10). Một phương
pháp để xác định số lượng và kích thước các đoạn DNA là cần thiết nếu các
enzyme giới hạn được sử dụng trong tách dòng gen. Liệu 1 phân tử DNA có được
cắt hay không có thể được xác định dễ dàng bằng cách kiểm tra độ nhớt của dung
dịch. Phân tử DNA lớn hơn tạo cho dung dịch độ nhớt hơn so với các phân tử nhỏ
hơn, do đó sự phân cắt liên quan tới sự giảm độ nhớt. Tuy nhiên việc tính toán cụ
thể số lượng và kích thước của từng đoạn riêng biệt khó khăn hơn nhiều. Trong
thực tế, trong nhiều năm đây là một trong những lĩnh vực tẻ nhạt nhất trong các
thí nghiệm liên quan tới DNA. Cuối cùng thì những vấn đề này được giải quyết
khi kỹ thuật điện di trên gel được phát triển vào những năm 1970.

Hình 4.12
a) Điện di tiêu chuẩn không tách các
mảnh DNA khác kích cỡ
b) Điên di trên gel

Sự phân tách các phân tử băng điện di trên gel

Điện di, giống như sắc ký trao đổi ion (xem trang 30), là một kỹ thuật sử dụng
sự khác nhau về điện tích để phân tách các phân tử trong một hỗn hợp. Các phân
tử DNA mang điện tích âm, khi đặt trong điện trường chúng di chuyển về phía
cực dương (Hình 4.12a). Tốc độ di chuyển của một phân tử phụ thuộc vào 2 yếu
tố, hình dạng và tỉ lệ giữa khối lượng với điện tích. Không may là, phần lớn phân
tử DNA có chung kích thước và có tỉ lệ khổi lượng với điện tích khá giống nhau.
Các đoạn với kích thước khác nhau không thể phân tách bằng các kỹ thuật điện
di thông thường.
 Tuy nhiên kích thước của phân tử DNA trở thành một yếu tố nếu điện di được
thực hiện trên gel. Gel, thường được làm bằng agarose, polyacrylamide, hoặc một
hỗn hợp của 2 chất, bao gồm một mạng lưới phức tạp, qua đó các phân tử DNA
phải di chuyển qua để tới được cực dương. Những phân tử DNA nhỏ di chuyển
qua gel nhanh hơn. Vì vậy, “điện di gel” là kỹ thuật phân tách các phân tử DNA
theo kích thước của chúng (Hình 4.12b).
Trên thực tế, các thành phần của gel sẽ xác định kích thước của phân tử DNA
có thể phân tách. Một tấm dày 0.5 cm với 0.5% agarose, có các lỗ tương đối lớn,
được sử dụng cho các phân tử với kích thước 1-30 kb, cho phép phân biệt rõ ràng
các phân tử với kích thước 10 và 12 kb. Ngược lại, một tấm rất mỏng (0.3 mm)
với 40% polyacrylamide gel, với các lỗ cực kì nhỏ, được sử dụng để tách các
phân tử DNA nhỏ hơn, khoảng từ 1-300 bp, và có thể phân tách với sự khác nhau
về độ dài của các phân tử với chiều dài chỉ bằng 1 nucleotide.

Hình 4.13
Hiển thị băng DNA trong gel agarose
bằng thuốc nhuộm EtBr và tia UV

Hiển thị các phân tử DNA trên gel agarose

Cách dễ nhất để quan sát kết quả của thí nghiệm điện di trên gel là nhuộm màu
gel với một hỗn hợp chất giúp cho DNA có thể quan sát được. Ethidium bromide
(EtBr), đã được miêu tả ở trang 37 được sử dụng như một phương thức để quan
sát DNA trong caesium chloride gradients, cũng được sử dụng để nhuộm DNA
trong agarose and polyacrylamide gels (Hình 4.13). Các đoạn băng hiển thị vị trí
của các đoạn DNA với kích cỡ khác nhau có thể được nhìn thấy rõ dưới tia cực
tím sau khi nhuộm EtBr, với điều kiện là có đủ lượng DNA. Không may là,
phương pháp này rất nguy hiểm bởi vì ethidium bromide là một tác nhân gây đột
biến mạnh. Nhuộm EtBr cũng có độ nhạy giới hạn, và nếu một băng chứa ít hơn
10ng DNA thì nó không thể hiển thị được sau khi nhuộm.
Vì lý do này, những thuốc nhuộm không có tác nhây gây đột biến nhuốm DNA
màu xanh lá cây, đỏ hoặc xanh dương đang được sử dụng nhiều trong phòng thí
nghiệm. Hầu hết các thuốc nhuộm này được sử dụng để nhuộm sau điện di, minh
họa ở hình 4.13 đối với EtBr, còn với các chất khác, bởi vì chúng không độc hại,
có thể đưa vào dung dịch đệm hòa tan agarose or polyacrylamide khi gel được
chuẩn bị. Một vài loại chất nhuộm cần tia cực tím để hiển thị các băng, nhưng
một số loại khác có thể hiển thị được dưới các bước sóng khác, ví dụ như dưới
ánh sáng xanh dương, loại bỏ nguy cơ có thể bị bỏng do tia cực tím. Loại thuốc
nhuộm nhạy nhất có thể phát hiện các băng có chứa ít hơn 1ng DNA.
4.2.7 Ước lượng kích cỡ của phân tử DNA
Điện di trên gel phân tách các phân tử DNA với kích thước khác nhau, với các
phân tử bé nhất di chuyển một khoảng cách xa nhất tới điện cực dương. Nếu có
một vài đoạn DNA với kích cỡ khác nhau (kết quả của quá trình cắt giới hạn
thành công), sau đó một dải các band sẽ xuất hiện trên gel. Làm thế nào để xác
định kích cỡ của các đoạn này?
Phương pháp chính xác nhất là sử dụng các mối liên hệ toán học để liên kết tỷ
lệ di chuyển và khối lượng phân tử. Công thức liên hệ là:
D = a − b(log M)

Hình 4.14 Ước tính kính thước mảnh DNA

trong gel agarose
a) Ước tính thô về kích thước có thể được thực
hiện bằng mắt
b) Kết quả chính xác hơn thu được bằng cách xây
dựng được chuẩn thông qua sự dịch chuyển
của các mạnh HindIII-λ; kích thước của các
mảnh chưa biết có thể được xác định theo
quãng đường mà nó di chuyển

Trong đó D là khoảng cách di chuyển, M là khối lượng phân tử, a và b là các

hằng số phụ thuộc vào điều kiện điện di.
Bởi vì độ chính xác tuyệt đối trong ước lượng kích thước của các đoạn DNA
là không cần thiết, một biện pháp đơn giản và thiếu chính xác hơn được sử dụng
rộng rãi hơn. Một quá trình cắt giới hạn tiêu chuẩn, bao gồm các mảnh DNA với
kích thước xác định, thường được đi kèm với mỗi điện di trên gel được chạy. Quá
trình cắt giới hạn của λ DNA thường được sử dụng theo cách này như một marker.
Ví dụ như HindIII cắt λ DNA thành 8 đoạn, với kích thước nhỏ nhất là 125 bp và
lớn nhất là 23 kp. Khi kích thước của các đoạn trong sự phân chia này được xác
định, kích thước của các đoạn trong thí nghiệm về quá trình cắt giới hạn bằng
cách so sánh vị trí của các band trong 2 dải (Hình 4.14). Hỗn hợp đặc biệt của các
đoạn DNA được gọi là các “DNA ladder”, có kích thước là bội của 100 bp hoặc
1 kb, được sử dụng như những marker. Mặc dù không chính xác, việc ước lượng
kích thước bằng cách so sánh với các DNA marker có sai số khoảng 5%, đây là
1 sai số chấp nhận được cho hầu hết mục đích.
4.2.8 Lập biểu đồ về vị trí của các đoạn giới hạn trong một phân tử DNA
Cho đến nay, chúng ta đã xem xét đến việc xác định số lượng và kích cỡ của
các đoạn DNA được tách ra bởi các enzyme cắt giới hạn. Bước tiếp theo trong
quá trình phân tích là thiết lập một biểu đồ biểu thị vị trí tương đối của phân tử
DNA của việc nhận biết trình tự với một số loại enzyme khác nhau. Chỉ khi có
một biểu đồ như thế này, mới có thể lựa chọn chính xác các loại enzyme cắt giới
hạn cho những thao tác cắt cụ thể (Hình 4.15).

Hình 4.15 Sử dụng bản đổ cắt giới hạn

để quyết định xem loại enzyme cắt giới
hạn nào nên được sử dụng để đạt được
các đoạn DNA chứa các gen riêng biệt

Để thiết lập một biểu đồ như vậy, một loại các quá trình cắt giới hạn phải được
thực hiện. Đầu tiên, số lượng và kích cỡ các đoạn được phân tách bởi các enzyme
giới hạn khác nhau phải được xác định bằng điện di trên gel sau đó so sánh với
các marker (Hình 4.16). Số liệu này phải được bổ sung bằng một chuỗi các quá
trình cắt song song, trong đó DNA được cắt bằng 2 enzyme giới hạn cùng một
lúc. Có thể thực hiện được việc cắt song song trong cùng 1 bước nếu cả hai
enzyme có cùng điều kiện về pH, nồng độ Mg2+, vv. Ngoài ra, hai quá trình phân
cắt này có thể thực hiện lần lượt, điều chỉnh các hỗn hợp phản ứng sau quá trình
đầu tiên để cung cấp những điều kiện cần thiết cho quá trình cắt bằng enzyme thứ
2.
 So sánh kết quả của việc cắt riêng rẽ và song song cho phép biểu thị nhiều vị
trí giới hạn (Hình 4.16) tuy nhiên không phải tất cả. Sự mơ hồ này có thể giải
quyết bằng quá trình “ phân cắt từng phần”, được thực hiện trong điều kiện chỉ
cắt tại một số lượng các vị trí giới hạn nhất định trên bất cứ phân tử DNA nào.
Phân cắt từng phần thường được thực hiện bằng cách giảm thời gian ủ, do đó
enzyme không đủ thời gian để cắt tại tất cả các vị trị giới hạn, hoặc bằng cách ủ
ở nhiệt độ thấp (ví dụ như ở 4 ° C chứ không phải là 37 ° C), làm hạn chế hoạt
động của enzyme.
Kết quả của việc cắt giới hạn là một tổ hợp các band phức tạp trong quá trình
điện di trên gel. Cũng như các đoạn tiêu chuẩn, được phân tách từ quá trình cắt
hoàn toàn, có thể nhìn thấy các đoạn kích cỡ lớn hơn. Đây là những phân tử bao
gồm 2 đoạn giới hạn, được phân cách bởi 1 vị trí chưa bị cắt. Kích cỡ của chúng
cho biết những đoạn giới hạn nào trong quá trình cắt hoàn toàn nằm cạnh nhau
trong một phân tử chưa được cắt (Hình 4.16).

Hình 4.16 Lập bản đồ cắt

giới hạn. Ví dụ cho thấy
cách xác định các vị trí của
các trình tự Xbal, Xhol và
Kpnl trên phân tử λ DNA
4.2.9 Phương pháp điện di trên gel đặc biệt để phân tách các phân tử lớn
hơn
Trong quá trình điện di trên gel agarose, một đoạn DNA di chuyển với tốc độ
tỉ lệ với kích cỡ của nó, nhưng mối liên hệ này không phải mối liên hệ trực tiếp.
Công thức liên hệ tốc độ di chuyển với khối lượng phân tử là một hàm logarith
(trang 59), có nghĩa là sự khác biệt về tốc độ di chuyển giảm dần với các đoạn có
kích cỡ lớn hơn (Hình 4.17). Trong thực tế, phương pháp điện di trên gel thông
thường ít có tác động tới các phân tử với khối lượng lớn hơn 50 kb.
Giới hạn về kích thước này không phải là một vấn đề khi mà các đoạn giới
hạn được nghiên cứu bằng cách cắt DNA bằng các enzyme với trình tự giới hạn
tetranucleotide hoặc hexanucleotide. Phần lớn các đoạn được phân cắt theo cách
này có kích cỡ nhỏ hơn 30 kb và có thể dễ dàng phân tách bằng điện di trên gel
agarose. Tuy nhiên những khó khăn khác có thể nảy sinh, nếu một enzyme với
trình tự nhận biết dài hơn được sử dụng, ví dụ như NotI, cắt thành các các đoạn
8 nucleotide (Bảng 4.1). NotI trung bình cắt một phân tử DNA mỗi 4 mũ 8 =
65536 bp. Vì thế những đoạn được cắt bằng NotI có thể không thể phân tách bằng
điện di trên gel thông thường.

Hình 4.17 Ảnh hưởng của kích thước DNA lên tốc độ di chuyển trong quá trình
điện di thông thường

Hình 4.18 Sự khác nhau

giữa điện di gel thông
thường và OFAGE
 Các hạn chế của điện di trên gel thông thường có thể được khắc phục bằng
cách sử dụng một điện trường phức tạp hơn. Nhiều hệ thống khác nhau đã được
thiết kế, nhưng theo nguyên lí, được minh họa tốt nhất bởi OFAGE (orthogonal
field alternation gel electrophoresis). Thay vì được đặt dọc theo chiều dài của gel,
như phương pháp thông thường (Hình 4.18a), điện trường bây giờ có thể chuyển
đổi giữa 2 cặp điện cực, mỗi cặp được đặt lệch 45 ° so với chiều dọc của gel (Hình
4.18b). Kết quả là một xung điện trường, khiến các phân tử DNA trên gel liên tục
thay đổi hướng theo các xung. Vì 2 điện trường này thay đổi luân phiên nhau liên
tục, sự chuyển động của các phân tử DNA trên gel vẫn là từ đầu này tới đầu kia,
nhưng không còn theo 1 đường thẳng. Tuy nhiên với mỗi lần thay đổi về hướng
của điện trường, mỗi phân tử DNA sắp xếp một góc 90 ° trước khi di chuyển tiếp.
Đây là điểm mấu chốt, bởi vì các phân tử ngắn có thể sắp xếp nhanh hơn phân tử
dài , cho phép phân tử ngắn hơn di chuyển về phần dưới của gel nhanh hơn. Sự
bổ sung này giúp tăng tác động của gel một cách nhanh chóng, do đó các phân tử
lên tới vài ngàn kb có thể được phân tách.
Phạm vi sử dụng của phương pháp này không chỉ áp dụng cho phân tách các
đoạn giới hạn mà còn cho các phân tử nhiễm sắc thể của các sinh vật nhân thực,
bao gồm nấm men, một vài loại nấm sợi quan trọng, và một số động vật nguyên
sinh như ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum. OFAGE và các kỹ thuật
liên quan như CHEF (contour clamped homogeneous electric fields) và điện di
trên gel đảo ngược (FIGE) có thể được sử dụng để biểu hiện các nhiễm sắc thể
khác nhau của sinh vật (Hình 4.18c), cho phép DNA từ những nhiễm sắc thể riêng
rẽ có thể được tinh khiết.

4.3 Ligation – kết hợp các phân tử DNA với nhau

Bước cuối cùng trong việc tạo nên một phân tử ADN tái tổ hợp là sự kết hợp
của phân tử vectơ và DNA được tách dòng. Quá trình này được gọi là nối, và
enzyme xúc tác cho phản ứng này được gọi là DNA ligase.

Hình 4.19 Quá trình nối: bước cuối cùng trong việc tạo thành 1 phân tử DNA tái
tổ hợp
4.3.1 Phương thức hoạt động của DNA ligase
Mọi tế bào sống đều sản xuất enzyme DNA ligase, nhưng loại enzym được sử
dụng trong kỹ thuật di truyền thường được tinh chế từ vi khuẩn E. coli bị nhiễm
phage T4. Trong tế bào, enzym thực hiện chức năng rất quan trọng là sửa chữa
bất kỳ điểm gián đoạn nào có thể phát sinh ở một trong những sợi đơn phân tử
sợi kép (Hình 4.4). Một điểm gián đoạn là vị trí mà liên kết phosphodiester giữa
các nucleotide liền kề bị thiếu (khác với một đoạn nick (đoạn mất DNA ngắn) là
nơi mà một hoặc nhiều nucleotide bị thiếu). Mặc dù các điểm gián đoạn có thể
phát sinh do sự đứt gẫy ngẫu nhiên của các phân tử DNA của tế bào, chúng cũng
là kết quả tự nhiên của các quá trình như sao chép và tái tổ hợp DNA. Do đó
ligase đóng vai trò quan trọng trong tế bào. Trong ống nghiệm, các enzyme DNA
ligase đã tinh chế, ngoài sửa chữa các gián đoạn sợi đơn, cũng có thể kết hợp với
các phân tử DNA riêng lẻ hoặc hai đầu của cùng một phân tử. Phản ứng hóa học
liên quan đến việc ligating hai phân tử giống như với sửa chữa gián đoạn, ngoại
trừ phải tạo hai liên kết phosphodiester, mỗi sợi một liên kết.

Hình 4.20 Các phản ứng

khác nhau được xúc tác bởi
enzyme DNA ligase:
a) Nối các phân tử đầu bằng
b) Nối các phân tử đầu dính

4.3.2 Các đầu dính làm tăng hiệu quả ligation

Phản ứng nối trong Hình 4.20a cho thấy hai mảnh đầu bằng được nối lại với
nhau. Mặc dù phản ứng này có thể được thực hiện trong ống nghiệm, nhưng nó
không thực sự hiệu quả. Điều này là do ligase không thể bám lấy phân tử cần
được nối, và phải chờ sự kết hợp ngẫu nhiên để gắn các đầu vào với nhau. Nếu
có thể, việc nối đầu bằng nên được thực hiện ở nồng độ DNA cao, để tăng cơ hội
nối các phân tử một cách chính xác. Ngược lại, việc nối các đầu dính bổ sung
nhau lại có hiệu quả hơn nhiều. Điều này là do các đầu dính thích hợp với nhau
có thể kết hợp với nhau bằng các liên kết hydro (Hình 4.20b), tạo thành cấu trúc
tương đối ổn định để enzym hoạt động. Nếu liên kết phosphodiester không được
tổng hợp nhanh thì các đầu dính sẽ lại tách nhau ra. Dù vậy, các cấu trúc ngắn có
sự kết cặp base này giúp tăng hiệu quả quá trình nối bằng cách kéo dài thời gian
tiếp xúc của các đầu.
4.3.3 Tạo các đầu dính cho các phân tử có đầu bằng.
Vì những lý do được nêu ở phần trên, người ta mong rằng các phân tử DNA
được nối sẽ có các đầu dính tương thích với nhau trong một thí nghiệm tách dòng
gen. Thường thì các đầu dính này có thể được tạo ra bằng cách cắt cả vectơ và
DNA được tách với cùng một endonuclease giới hạn hoặc với các enzym khác
nhau nhưng tạo ra cùng1 đầu dính, nhưng không phải lúc nào cũng có thể làm
được điều này. Một trường hợp thường gặp là trong khi mà phân tử vectơ có đầu
dính thì các đoạn DNA được tách ra lại có đầu bằng. Trong những trường hợp
này, một trong ba phương pháp có thể được sử dụng để tạo đúng đầu dính cho
đoạn DNA.
Linkers
Phương pháp đầu tiên bao gồm việc sử dụng các linker. Đây là những đoạn
DNA kép ngắn, có một trình tự nucleotide đã biết, được tổng hợp trong ống
nghiệm

Hình 4.21 Linker và cách sử dụng chúng:

a) Cấu trúc của một linker thông thường
b) Quá trình gắn các linker vào một phân tử đầu bằng
Hình 4.21a biểu diễn một cấu trúc của một linker điển hình. Nó có đầu bằng,
nhưng chứa vị trí cắt giới hạn, BamHI trong ví dụ được hiển thị. DNA ligase có
thể gắn linker với đầu bằng của các phân tử ADN lớn hơn. Mặc dù là nối đầu
bằng, phản ứng riêng biệt này có thể được thực hiện rất hiệu quả vì các
oligonucleotides tổng hợp, như các linker, có thể được tạo ra với số lượng rất lớn
và được thêm vào hỗn hợp nối với nồng độ cao. Nhiều liên kết sẽ gắn với mỗi
đầu của phân tử DNA, tạo ra cấu trúc chuỗi thể hiện trong hình 4.21b. Tuy nhiên,
việc cắt sử dụng BamHI cắt các chuỗi ở các trình tự nhận biết, tạo ra một số lượng
lớn các linker bị cắt và đoạn DNA ban đầu, giờ đã được gắn các đầu dính BamHI.
Đoạn DNA đã được sửa đổi này đã sẵn sàng để tham gia quá trình nối vào một
vectơ được cắt bằng BamHI.
Các adaptor
Có một nhược điểm với việc sử dụng các linker. Điều gì sẽ xảy ra nếu phân tử
đầu bằng được thể hiện trong hình 4.21b chứa một hoặc nhiều trình tự nhận diện
BamHI. Nếu đúng như vậy, bước cắt cần thiết để bẻ gãy các linker và tạo ra các
đầu dính cũng sẽ cắt đứt các phân tử đầu bằng (Hình 4.22). Các đoạn thu được sẽ
có các đầu dính chính xác, nhưng không còn ý nghĩa gì nếu gen chứa trong đoạn
đầu bằng đã bị vỡ thành nhiều mảnh.

Hình 4.22 Một vấn đề có thể xảy ra khi

sử dụng các linker.
So sánh với kết quả mong muốn khi cắt bởi
BamHI ở hình 4.21.b

Hình 4.23 Các adaptor và

các vấn đề có thể gặp phải
a) Một adaptor điển hình
b) 2 adaptor có thể nối thành một tạo
thành một phân tử đầu bằng
c) Sau khi được gắn các adaptor thì 1
phân tử vẫn có đầu bằng và vẫn
cần có 1 bước cắt bằng enzyme
giới hạn

Phương pháp thứ hai để gắn các đầu dính vào một phân tử đầu bằng được thiết
kế để tránh vấn đề này. Adaptor, giống như linker, là các oligonucleotides tổng
hợp ngắn. Nhưng không giống như các linker, adaptor được tổng hợp sao cho có
sẵn một đầu dính (Hình 4.23a). Tất nhiên ý tưởng sẽ là nối đầu bằng của adaptor
với đầu bằng của đoạn DNA để tạo ra phân tử mới có đầu dính. Nghe có vẻ là
một phương pháp đơn giản nhưng trong thực tế sẽ phát sinh ra nhiều vấn đề. Các
đầu dính của các phân tử adaptor riêng lẻ có thể kết hợp với nhau để hình thành
các dimer (hình 4.23b), do đó phân tử DNA mới vẫn còn đầu bằng (hình 4.23c).
Các đầu dính có thể được tái tạo bằng cách phân hủy với sự giúp đỡ của
endoglucanase cắt giới hạn, nhưng điều đó sẽ đi ngược lại mục đích của việc sử
dụng adaptors ở bước đầu. Câu trả lời cho vấn đề nằm trong cấu trúc hóa học
chính xác của các đầu phân tử adaptor. Thông thường, hai đầu của một sợi
polynucleotid có sự khác biệt về mặt hoá học, một sự thật thu được từ việc kiểm
tra kỹ lưỡng cấu trúc polyme của DNA (Hình 4.24a). Một đầu, được gọi là đầu
5’, chứa một nhóm phosphat (5'-P); đầu còn lại, đầu 3’, có một nhóm hydroxyl
(3'-OH). Trong đường xoắn kép, hai sợi ngược chiều nhau (hình 4.24b), do đó,
mỗi đầu của một phân tử kép bao gồm một đầu cuối 5'-P và một đầu 3'-OH. Quá
trình nối xảy ra giữa đầu 5'-P và 3'-OH (Hình 4.24c).

Hình 4.24 sự khác biết giữa đầu 5’ và

đầu 3’ của một sợi polynucleotide

Các phân tử adaptor được tổng hợp để đầu bằng giống như DNA“tự nhiên”,
nhưng đầu dính là khác nhau. Đầu cuối 3'-OH của đầu dính cũng giống như thông
thường, nhưng đầu cuối 5'-P được sửa đổi: nó thiếu nhóm phosphate, và thực ra
là một đầu 5'-OH (Hình 4.25a). DNA ligase không thể tạo thành cầu nối
phosphodiester giữa 5'-OH và 3'-OH. Kết quả là, mặc dù sự bắt cặp ba zơ luôn
xảy ra giữa các đầu dính của các phân tử adaptor, nhưng sự kết hợp này không
bao giờ được ổn định bằng việc nối (hình 4.25b).

Vì thế, các adaptor có thể gắn kết với một phân tử DNA đầu bằng nhưng không
phải với chính nó. Sau khi gắn adaptor, điểm cuối 5'-OH bất thường được chuyển
đổi sang dạng tự nhiên 5'-P bằng cách xử lý với enzyme polynucleotide kinase
(trang 50), tạo ra một đoạn có đầu dính có thể được chèn vào một vector thích
hợp.
 Hình 4.25 Cách sử dụng
adaptor:
a) Cấu trúc thực tế của một adaptor,
với đầu 5’-OH
b) Sự thay đổi tư đầu bằng sang đầu
dính bằng cách gắn các adaptor

Tạo các đầu dính bằng việc gắn đuôi homopolymer

Hình 4.16 Quá trình gắn đuôi

a) Quá trình tổng hợp 1 đuôi homopolymer
b) Tạo một phân tử DNA tái tổ hợp từ một vecto đã
gắn đuôi và một DNA đã gắn đuôi
c) Sửa chữa phân tử DNA tái tổ hợp
 Kỹ thuật gắn đuôi homopolymer cho chúng ta một hướng tiếp cận hoàn toàn
khác để tạo các đầu dính trên một phân tử DNA đầu bằng. Một homopolymer là
một polymer mà trong đó tất cả các tiểu đơn vị là như nhau. Một sợi DNA được
tạo thành hoàn toàn từ deoxyguanosine là một ví dụ của một homopolymer, và
được gọi là polydeoxyguanosine hoặc poly (dG).
Việc gắn đuôi bao gồm việc sử dụng enzyme terminal deoxynucleotidyl
transferase (trang 50) để thêm một loạt các nucleotide vào đầu 3'-OH của phân tử
ADN sợi kép. Nếu phản ứng này được thực hiện với sự có mặt của 1
deoxyribonucleotide thì một đuôi homopolymer sẽ được tạo ra (hình 4.26a). Tất
nhiên, để có thể nối 2 phân tử được gắn đuôi, các homopolymers phải bổ sung
cho nhau. Thường poly deoxycyexin (poly (dC)) đuôi được gắn vào vector và
poly (dG) vào DNA để tách dòng. Sự ghép nối các ba zơ sẽ xảy ra khi các phân
tử DNA được trộn lẫn (Hình 4.26b).
Trong thực tế, các đuôi poly (dG) và poly (dC) thường không có cùng độ dài,
và các phân tử được tái tổ hợp dựa vào ba zơ sẽ có các đoạn nicks và các điểm
gián đoạn (hình 4.26c). Do đó, việc sửa chữa sẽ cần có hai bước, sử dụng Klenow
polymerase để điền vào các nicks theo sau là DNA ligase để tạo các liên kết
phosphodiester cuối cùng. Phản ứng sửa chữa này không phải lúc nào cũng phải
thực hiện trong ống nghiệm. Nếu đuôi homopolymer bổ sung dài hơn khoảng 20
nucleotide, thì các liên kết bổ sung khá ổn định sẽ được hình thành. Một phân tử
ADN tái tổ hợp, được giữ lại với nhau bằng cặp base dù không hoàn toàn được
nối với nhau, nhưng thường đủ ổn định để được đưa vào tế bào chủ trong giai
đoạn tiếp theo của thí nghiệm tách dòng(xem hình 1.1). Một khi bên trong máy
chủ, DNA polymerase và DNA ligase của chính tế bào sẽ sửa chữa phân tử ADN
tái tổ hợp, hoàn thành quá trình được bắt đầu trong ống nghiệm.
4.3.4 Nối đầu bằng bằng enzyme DNA topoisomerase
Một cách tinh vi hơn, nhưng dễ dàng hơn và hiệu quả chung cao hơn để thực
hiện nối đầu bằng, là sử dụng một loại enzym đặc biệt gọi là DNA topoisomerase.
Trong tế bào, enzyme DNA topoisomerase tham gia vào các quá trình liên quan
đến việc loại bỏ hoặc thêm vào một phân tử DNA kép một số vòng xoắn. Các
vòng xoắn được loại bỏ trong quá trình sao chép DNA để tháo xoắn và cho phép
mỗi polynucleotide được nhân đôi và được thêm vào các phân tử tròn mới tổng
hợp để tạo ra cấu trúc siêu xoắn. DNA topoisomerases có thể tách hai sợi của một
phân tử DNA mà không cần phải quay vòng xoắn kép. Chúng đạt được điều này
bằng cách tạo ra một đoạn đứt gãy trên 1 sợi hoặc cả 2 trong khung xương của
DNA (Hình 4.27). Vì vậy, DNA topoisomerases có cả hoạt tính của nuclease và
ligase.
 Hình 4.27 Phương thức làm
việc của DNA topoisomerase
loại 1. Chúng tháo hoặc thêm
một số vòng xoắn vào cấu trúc
xoắn kép bằng cách tạo ra một
điểm đứt gãy trên 1 trong 2 sợi

Hình 4.28 Nối đầu bằng sử

dụng DNA topoisomerase:
a) Phân cắt vector với
topoisomerase tạo thành các đầu
5’-0H và 3’-P
b) Đoạn được tách cần phải được xử
lý với alkaline phosphatase để
chuyển từ đầu 5’-P thành 5’-OH
c) Topoisomerase nối đầu 3’P với
đầu 5’OH tạo thành phân tử sợi
kép với 2 điểm gián đoạn sẽ được
sửa với các enzyme trong tế bào
khi được đưa vào trong vật chủ

Để thực hiện việc nối đầu bằng xử dụng DNA topoisomerase, phải sử dụng q
loại vector tách dòng đặc biệt. Đây là một plasmid đã được duỗi thằng bởi hoạt
tính nuclease của DNA topoisomerase từ virus vaccinia. Enzyme topoisomerase
của vaccinia phân cắt DNA ở vị trí CCCTT, chỉ xuất hiện duy nhất một chỗ trong
plasmid. Sau khi cắt plasmid, các enzyme topoisomerase vẫn gắn kết bằng các
liên kết cộng hóa trị với các đầu bằng thu được. Phản ứng có thể được dừng lại
tại thời điểm này, cho phép vector được lưu trữ cho đến khi cần thiết.
Sự phân cắt bởi topoisomerase dẫn đến các đầu 5'-OH và 3'-P (Hình 4.28a).
Nếu các phân tử được tách có đầu bằng đã được tạo ra từ một phân tử lớn hơn
bằng cách phân cắt với một enzyme hạn chế, thì chúng sẽ có các đầu 5'-P và 3'-
OH. Trước khi trộn những phân tử này với vector, các gốc phosphate cuối cùng
của chúng phải được loại bỏ để tạo ra các đầu 5'-OH có thể ligate tới đuôi 3'-P
của vector. Do đó những phân tử này được xử lý bằng alkaline phosphatase (Hình
4.28b).
Thêm các phân tử được loại bỏ gốc phosphat vào vector sẽ tái hoạt hóa các
topoisomerases bị ức chế tiến tới giai đoạn nối của chúng. Quá trình nối xảy ra
giữa các đầu 3'-P của vectơ và các đầu 5'-OH của các phân tử đã được loại bỏ gốc
phosphat. Từ đó, các phân tử có đầu bằng được đưa vào các vectơ. Chỉ có một
sợi được nối vào mỗi điểm nối (hình 4.28c), nhưng đây không phải là vấn đề bởi
vì các điểm gián đoạn sẽ được sửa chữa bởi các enzyme tế bào sau khi các phân
tử tái tổ hợp đã được đưa vào vi khuẩn chủ.